JP6188577B2

JP6188577B2 - 粒子凝集測定用ラテックス粒子

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Publication number: JP6188577B2
Application number: JP2013551865A
Authority: JP
Inventors: 北原　慎一郎; 慎一郎北原; 由紀高橋
Original assignee: Sekisui Medical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Medical Co Ltd
Priority date: 2011-12-28
Filing date: 2012-12-28
Publication date: 2017-08-30
Anticipated expiration: 2032-12-28
Also published as: US9939433B2; WO2013100146A1; US20140377881A1; EP2799874A1; EP2799874A4; JPWO2013100146A1

Description

本発明は、非特異的反応を高度に抑制しながら、高感度測定が可能な粒子凝集測定用ラテックス粒子および該粒子を用いた粒子凝集測定試薬に関する。

臨床検査の分野において検体中の微量物質を定量する方法として、抗原抗体反応を利用した免疫測定法が広く行われている。中でも抗体等を担持させたラテックス粒子（以下、感作ラテックス粒子ということがある）を用いたラテックス免疫比濁法は操作が簡便で、かつ測定時間が短いことから、広く臨床検査室等で用いられている。ラテックス免疫比濁法による検体中の抗原または抗体の定量は、抗原と抗体による免疫複合体の形成に伴う感作ラテックス粒子の凝集による吸光度変化を光学的に検出することにより行われる。この吸光度の変化は、感作ラテックス粒子の凝集による見かけの粒径変化に基づくものである。

従来、ラテックス免疫比濁法には、特許文献１に見られるように、検出対象物質と特異的に反応する抗原または抗体の固定化（感作）が容易であり、比較的安価で、かつ重合反応も制御しやすいことからポリスチレンを主成分とするポリスチレン系ラテックス粒子が用いられてきた。しかし、ポリスチレンを主成分とするラテックス粒子は、抗原や抗体を物理的に吸着（感作）できるメリットがある一方、検体中の非検出対象タンパク質等をも吸着する為、抗原抗体反応による特異的反応に基づかない感作ラテックス粒子の凝集反応、いわゆる非特異的反応を引き起こすことがあり、この非特異的反応を抑制することが従来からの課題であった。

また、非特異的反応を抑制する為に、抗原や抗体を感作したラテックス粒子を牛血清アルブミン（以下、ＢＳＡということがある）などでブロッキングする試みがなされているが、十分な非特異的反応の抑制効果を得られないことも多く、その場合、高いバックグラウンド値をあたえることから、高感度測定が可能な試薬を作製する上での大きな課題であった。

そこで、特許文献２では、抗原や抗体をラテックス粒子に感作する際に、ブロッキング用緩衝液中に非イオン性界面活性剤を添加し、さらに測定試薬中にも非イオン界面活性剤を添加することで、非特異的反応の抑制を試みている。しかし、粒子表面だけでなく、測定試薬中にも非イオン性界面活性剤が存在することから、免疫反応を阻害するなどして感度が低下することがあるため、ラテックス粒子自体を工夫することで、非特異的反応を抑制する方法の開発が望まれていた。

特許文献３では、粒子自体に非特異的反応抑制の工夫をした、簡便に作製できるラテックス粒子として、乳化剤として非イオン性界面活性剤や陰イオン性界面活性剤を用いた乳化重合により作製したラテックス粒子が提案されている。しかしながら、これら特許文献３のラテックス粒子を調製する際、水性媒体に対して０．０５重量％以上の該乳化剤を用いているため、残留する該乳化剤の影響により得られたラテックス粒子を使用しても十分な感度を得られないことがあった。

特許第３７０８９４２号特開２０００−１４６９７４号特開２０００−３５５５５４号

本発明は、非特異的反応を高度に抑制しながら、高感度測定が可能な粒子凝集測定用ラテックス粒子および該粒子を用いた粒子凝集測定試薬を簡便に作製することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、本発明の粒子凝集測定用ラテックス粒子を作製するに至った。すなわち、本発明は、以下のものである。
［１］フェニル基を有する重合性単量体、及び、フェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体を成分とし、かつ非イオン性界面活性剤を水性媒体に対する重量％濃度で、０．００５〜０．０２％とした反応系で乳化重合したラテックスであって、平均粒子径が０．００５〜１．０μｍであることを特徴とする粒子凝集測定用ラテックス粒子。
［２］非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー又はポリオキシアルキレンアルキルエーテル類である、上記［１］に記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
［３］ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマーが、下記式（Ｉ）に示す構造を有し、重量平均分子量が１０００〜１５０００であり、かつＥＯ（エチレンオキサイド、以下同様）含有率が５〜９０％である、上記［２］に記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
ＨＯ（Ｃ₂Ｈ₄Ｏ）_a−（Ｃ₃Ｈ₆Ｏ）_b−（Ｃ₂Ｈ₄Ｏ）_cＨ（Ｉ）
（式中、ａ，ｂ，ｃは任意の整数を表し、ａ＋ｂ＋ｃが１７〜３００単位となることを限度として、ａ＋ｃは２〜２７０単位の平均重合度のオキシエチレンとなるよう決定され、かつｂは１５〜４０単位の平均重合度のオキシプロピレンとなるよう決定される。）
［４］ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマーが、（１）〜（４）よりなる群より選ばれるものである、上記［３］に記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
（１）重量平均分子量１３３３、ＥＯ含有率１０％、
（２）重量平均分子量２２２２、ＥＯ含有率１０％、
（３）重量平均分子量８０００、ＥＯ含有率８５％、
（４）重量平均分子量１３３３３、ＥＯ含有率８５％。
［５］ポリオキシアルキレンアルキルエーテル類が、下記式（II）に示す構造を有し、ＨＬＢ値が、５．０〜１９．３の範囲にある、上記［２］に記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
Ｒ¹Ｏ（ＡＯ）_n−Ｈ（II）
（式中、Ｒ¹は、炭素数８〜２２の範囲にあるアルキル基またはアルケニル基を示し、ＡＯはオキシアルキレン基を示し、Ａは炭素数２〜４のアルキル基を示す。ｎはＡＯが示すオキシアルキレン基の平均付加モル数を示し、ｎは２〜１５の整数である。）
［６］ポリオキシアルキレンアルキルエーテル類が、（１）〜（３）よりなる群より選ばれるものである、上記［２］に記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
（１）ポリオキシエチレントリデシルエーテル（ＨＬＢ１０．５）、
（２）ポリオキシエチレンラウリルエーテル（ＨＬＢ９．５）、
（３）ポリオキシエチレン２-エチルヘキシルエーテル（ＨＬＢ１４．６）。
［７］フェニル基を有する重合性単量体がスチレン、フェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体がスチレンスルホン酸ナトリウムであることを特徴とする上記［２］に記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
［８］上記［１］〜［７］のいずれかに記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子を用いる粒子凝集測定試薬。
［９］抗原または抗体を物理吸着により担持する上記［１］〜［７］のいずれかに記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子を用いる粒子凝集測定試薬。

本発明の粒子凝集測定用ラテックス粒子および粒子凝集測定試薬を用いることにより、非特異的凝集反応を引き起こす検体中の非検出対象タンパク質等を該ラテックス粒子に吸着させず、目的とする特異的凝集反応のみを惹起させる為、従来よりも高感度な粒子凝集測定試薬を得ることが可能である。
また、一段階での重合反応によりラテックス粒子を作製できるため、非常に簡便な方法でラテックス粒子を得ることができ、かつ抗原や抗体の感作も物理吸着で行うよう設計されているため、容易に高感度な粒子凝集測定試薬を製造することが可能である。

図１は、抗Ｄダイマー抗体を感作した、実施例１〜６および比較例１〜３のラテックス粒子を用いて、Ｄダイマー標準抗原を測定した検量線である。図２は、抗Ｄダイマー抗体を感作した、実施例１〜６および比較例１〜３のラテックス粒子を用いて、Ｄダイマー乖離検体１（ＲＦ０８ＦＤ１８３２）を測定し、図１で得られた検量線に基づき濃度換算したグラフである。図３は、抗Ｄダイマー抗体を感作した、実施例１〜６および比較例１〜３のラテックス粒子を用いて、Ｄダイマー乖離検体２（ＲＦ０８ＦＤ１８３６）を測定し、図１で得られた検量線に基づき濃度換算したグラフである。図４は、抗Ｄダイマー抗体を感作した、実施例７〜９および比較例４〜５のラテックス粒子を用いて、Ｄダイマー標準抗原を測定した検量線である。図５は、抗Ｄダイマー抗体を感作した、実施例７〜９および比較例４〜５のラテックス粒子を用いて、Ｄダイマー乖離検体１（ＲＦ０８ＦＤ１８３２）を測定し、図４で得られた検量線に基づき濃度換算したグラフである。図６は、抗Ｄダイマー抗体を感作した、実施例７〜９および比較例４〜５のラテックス粒子を用いて、Ｄダイマー乖離検体２（ＲＦ０８ＦＤ１８３６）を測定し、図４で得られた検量線に基づき濃度換算したグラフである。

以下、本発明をさらに詳説する。本発明に用いられるフェニル基を有する重合性単量体としては、特に限定されず、例えば、スチレン、ｏ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、ｐ−クロロスチレン、４−ビニル安息香酸などが挙げられる。これらは単独で用いても良く、２種以上が混合されていても良い。なかでもスチレンが好ましく用いられる。

フェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体としては、重合後のラテックス粒子表面にスルホン酸基を含有させることができる単量体であれば特に限定されず、例えば、スチレンスルホン酸塩、ジビニルベンゼンスルホン酸塩、ｏ−メチルスチレンスルホン酸塩、ｐ−メチルスチレンスルホン酸塩などが挙げられる。また、この場合の塩としても、特に限定されず、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。これらは単独で用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。なかでも、スチレンスルホン酸塩が好ましく、スチレンスルホン酸ナトリウムが更に好ましく用いられる。

本発明のラテックス粒子は、上記フェニル基を有する重合性単量体と上記フェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体とを、水性媒体に対し非イオン性界面活性剤０．００５〜０．０２重量％含有した反応系で乳化重合することにより得られる。なお、本発明の「乳化重合」とは、重合開始時点で、乳化剤としての界面活性剤を反応系に全く添加しない「ソープフリー重合」以外の重合方法であって、重合開始時点で反応系にごく微量（前記した濃度範囲）の界面活性剤を外因的に添加共存させて行う重合方法のすべてを指す。本発明における界面活性剤は、従来の乳化剤用途での使用と異なり、界面活性剤それ自体が重合反応の成分を乳化させている必要はない。本発明において添加する界面活性剤は、それ自体により、重合反応の成分を実際に乳化していても、していなくてもよく、乳化していることは必須ではない。

上記乳化重合の方法としては、従来公知の方法を用いることができ、例えば、非イオン性界面活性剤を０．００５〜０．０２重量％含む水性媒体が仕込まれた反応容器内に、上記フェニル基を有する重合性単量体、上記フェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体、重合開始剤を添加し、窒素雰囲気下で攪拌しながら加熱する方法等が挙げられる。この場合、重合温度としては５０〜１００℃が好ましく、より好ましくは６０〜８５℃である。また、重合時間としては、重合性単量体の組成、濃度、及び、重合開始剤等の条件にもよるが、通常５〜５０時間である。

上記水性媒体としては、水（脱イオン水）単独、もしくは水および水と相溶するアルコールなどの水溶性溶媒の混合溶媒を使用することが好ましく、例えば水とエタノールなどのアルコールとの混合溶媒を使用することが好ましい。中でも水単独を用いることがより好ましい。

上記水性媒体に溶解させる非イオン性界面活性剤としては、公知の非イオン性界面活性剤を用いることができる。本発明に好適な非イオン性界面活性剤は、大きく以下の群に分けることができる。一つはポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマーであり、もう一つはポリオキシアルキレンアルキルエーテル類である。

本発明のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマーは、下記式（Ｉ）に示す構造を有し、重量平均分子量が１０００〜１５０００であり、かつＥＯ含有率が５〜９０％である。

ＨＯ（Ｃ₂Ｈ₄Ｏ）_a−（Ｃ₃Ｈ₆Ｏ）_b−（Ｃ₂Ｈ₄Ｏ）_cＨ（Ｉ）
（式中、ａ，ｂ，ｃは任意の整数を表し、ａ＋ｂ＋ｃが１７〜３００単位となることを限度として、ａ＋ｃは２〜２７０単位の平均重合度のオキシエチレンとなるよう決定され、かつｂは１５〜４０単位の平均重合度のオキシプロピレンとなるよう決定される。）

本発明のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマーは、上述のように疎水性のポリオキシプロピレンブロックポリマーが、２つの親水性のポリオキシエチレンブロックポリマーにより挟まれた構造より成り、非イオン性界面活性剤として挙動する。

本発明において使用するポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含有する市販品の具体的な例としては、「エパン（登録商標）」の名称で第一工業製薬社より販売されている非イオン性界面活性剤や「プルロニック（登録商標）」の名称でアデカ社より販売されている非イオン性界面活性剤を挙げることができる。
なお、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマーの成分としての表記は数種類存在し、各表記間で相互に同一性、類似性を確認できるが、同一名称の市販品であっても各表記間での数値が完全に一致しない場合がある。これらは重合性高分子に特有のものであり当業者は当然に理解しうる。

本発明において使用するポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマーの、より具体的な市販品の例を以下に挙げる。
「エパン（登録商標）」の名称で第一工業製薬社より販売されている非イオン性界面活性剤としては、以下が挙げられる。
エパン４１０：重量平均分子量１３３３、ＥＯ含有率１０％、
エパン７１０：重量平均分子量２２２２、ＥＯ含有率１０％、
エパン４８５：重量平均分子量８０００、ＥＯ含有率８５％、
エパン７８５：重量平均分子量１３３３３、ＥＯ含有率８５％、
エパン７５０：重量平均分子量４０００、ＥＯ含有率５０％、
エパン４２０：重量平均分子量１５００、ＥＯ含有率２０％、
エパン４５０：重量平均分子量２４００、ＥＯ含有率５０％、
エパン６１０：重量平均分子量２０００、ＥＯ含有率１０％、
エパン６８０：重量平均分子量８８００、ＥＯ含有率８０％、
エパン７４０：重量平均分子量３３００、ＥＯ含有率４０％、
エパン７２０：重量平均分子量２５００、ＥＯ含有率２０％、
これらのうち、エパン４１０、エパン７１０、エパン４８５、エパン７８５を使用することが本発明には好ましい。

「プルロニック（登録商標）」の名称でアデカ社より販売されている非イオン性界面活性剤としては、以下が挙げられる。なお下記でＰＰＧはポリプロピレングリコール（前出のポリオキシプロピレンと同義）を意味する。
プルロニックＬ−４２：ＰＰＧ分子量１，２００、ＥＯ含有率２０％
プルロニックＬ−４３：ＰＰＧ分子量１，２００、ＥＯ含有率３０％
プルロニックＬ−４４：ＰＰＧ分子量１，２００、ＥＯ含有率４０％
プルロニックＬ−６１：ＰＰＧ分子量１，７５０、ＥＯ含有率１０％
プルロニックＬ−６２：ＰＰＧ分子量１，７５０、ＥＯ含有率２０％
プルロニックＬ−６４：ＰＰＧ分子量１，７５０、ＥＯ含有率４０％
プルロニックＰ−６５：ＰＰＧ分子量１，７５０、ＥＯ含有率５０％
プルロニックＦ−６８：ＰＰＧ分子量１，７５０、ＥＯ含有率８０％

本発明のポリオキシアルキレンアルキルエーテル類は、下記式（II）に示す構造を有し、ＨＬＢ値が、５．０〜１９．３の範囲にある。
Ｒ¹Ｏ（ＡＯ）_n−Ｈ（II）
（式中、Ｒ¹は、炭素数８〜２２の範囲にあるアルキル基またはアルケニル基を示し、ＡＯはオキシアルキレン基を示す。ｎはＡＯが示すオキシアルキレン基の平均付加モル数を示し、ｎは２〜１５の整数である。）

Ｒ¹が示す炭素数８〜２２の範囲にあるアルキル基またはアルケニル基の具体例としては、オクチル基（炭素数８）、２−エチルヘキシル基（炭素数８）、デシル基（炭素数１０）、イソデシル基（炭素数１０）、ラウリル（ドデシル）基（炭素数１２）、トリデシル基（炭素数１３）、セチル基（炭素数１６）、オクタデシル基（炭素数１８）、オレイル基（炭素数１８）等を挙げることができる。ここで、Ｒ¹が示す炭素数８〜２２の範囲にあるアルキル基またはアルケニル基は、上記に例示したように直鎖であっても分岐鎖であってもよく、一以上の不飽和結合を有していてもよい。

ＡＯが示す炭素数２〜４のオキシアルキレン基の具体例としては、オキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシブチレン基が挙げられる。当該オキシアルキレン基は直鎖であっても分岐鎖であってもよい。

本発明において使用するポリオキシアルキレンアルキルエーテル類のより具体的な市販品の例を以下に挙げる。
ポリオキシエチレン２-エチルヘキシルエーテル（ニューコール１００８：日本乳化剤社製など）、ポリオキシアルキレン分岐デシルエーテル（ノイゲンＸＬ：ポリオキシアルキレン部分はポリオキシ短鎖アルキレンとポリオキシエチレンの重合体よりなる。第一工業製薬社製など）、ポリオキシエチレンイソデシルエーテル（ノイゲンＳＤ：第一工業製薬社製など）、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（ＤＫＳＮＬ：第一工業製薬社製など）、ポリオキシエチレントリデシルエーテル（ノイゲンＴＤＳ：第一工業製薬社製など）、ポリオキシアルキレントリデシルエーテル（ノイゲンＴＤＸ：ポリオキシアルキレン部分はポリオキシプロピレンとポリオキシエチレンの重合体よりなる。第一工業製薬社製など）、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル（ノイゲンＬＦ：第一工業製薬社製など）、ポリオキシエチレンセチルエーテル（ニューコール１６０６：日本乳化剤社製など）、ポリオキシエチレンオレイルエーテル（ニューコール１２０４：日本乳化剤社製など）、などが挙げられる。
これらのうち、ノイゲンＴＤＳ−５０（ポリオキシエチレントリデシルエーテル。ＨＬＢ１０．５）、ＤＫＳＮＬ４０（ポリオキシエチレンラウリルエーテル。ＨＬＢ９．５）、ニューコール１００８（ポリオキシエチレン２-エチルヘキシルエーテル。ＨＬＢ１４．６）を使用することが本発明には好ましい。

本発明において表示されるＨＬＢ値は、下記式（III）を用いる、いわゆるグリフィン法により算出することができる。
ＨＬＢ値＝２０ｘ親水部の式量の総和／分子量（III）
本発明においてＨＬＢ値は、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル類の構造を特定する上で有用な情報である。例えば、ノイゲンＴＤＳ−５０（ポリオキシエチレントリデシルエーテル。ＨＬＢ１０．５）であれば、ＨＬＢ値＝ポリオキシエチレンの式量の総和／（トリデシルエーテル部分の分子量＋ポリオキシエチレンの式量の総和）より、１０．５＝（４４ｎ）／（１９９＋４４ｎ）を代入することで、ポリオキシエチレン付加モル数ｎを、約５と見積もることができる。

これらの非イオン性界面活性剤を、水性媒体に対する重量％濃度で、０．００５〜０．０２％用いることが本発明に該当する。０．００５％未満であると本発明の非イオン性界面活性剤の効果が十分に得られない。０．０２％超であると、非特異的反応も抑制するが、検出対象物質と特異的に反応する物質（抗原や抗体）を粒子表面に物理的に吸着しにくくなり、その結果、感度が低下するため好ましくない。尚、これらの非イオン性界面活性剤は、単独で用いても良いし、２種以上を混合して用いてもよいが、混合する場合は、その合計量が０．００５〜０．０２％の範囲となるように調製する必要がある。

上記重合開始剤としては、公知のラジカル開始剤を用いることができる。例えば、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウム等の過硫酸塩、２，２'−アゾビスイソブチロニトリル、２，２'−アゾビス（４−メトキシ−２，４−ジメチルバレロニトリル）、２，２'−アゾビス−２，４−ジメチルバレロニトリル等のアゾ化合物、ベンゾイルパーオキサイド、ジ−ｔ−ブチルパーオキサイド、ラウロイルパーオキサイド、ｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート等の有機過酸化物を挙げることができる。なかでも過硫酸塩が好ましく、より好ましくは、過硫酸カリウムが用いられる。上記重合開始剤の使用量としては特に限定されないが、通常は重合性単量体量に対して０．０１〜５重量％の範囲で用いる。

また、本発明のラテックス粒子の用途によっては、上記重合の際に、更に重合性不飽和単量体を添加してもよい。上記重合性不飽和単量体としては通常のラジカル重合に使用可能なものであれば特に限定されず、例えば、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸エステル、スチレン誘導体、（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクリル酸アミド、ハロゲン化ビニル、ビニルエステル、（メタ）アクロレイン、マレイン酸誘導体、フマル酸誘導体等が挙げられる。なお、本発明において（メタ）アクリル酸とは、アクリル酸またはメタクリル酸を意味する。

上記ラテックス粒子の平均粒子径は、０．００５〜１．０μｍである。０．００５μｍ未満であると、凝集による光学的変化量が小さすぎて測定に必要な感度が得られず、また、試薬調製時の遠心分離の際に多くの時間がかかり試薬コストが高くなる。１．０μｍを超えると、被検物質が高濃度であるときにラテックス粒子の凝集による光学的変化量が測定可能領域を越えてしまい、被検物質の量に応じた光学的変化量が得られない。試薬用ラテックス粒子を使用する測定方法、測定機器によって異なるが、好ましくは０．０５〜０．７μｍ、より好ましくは０．０５〜０．４μｍである。

上記ラテックス粒子の粒子径の変動係数（ＣＶ値）は、２０％以下であることが好ましい。２０％を超えると、試薬調製時のロット再現性が悪く、測定試薬の再現性が低下することがある。より好ましくは１５％以下である。尚、上記粒子径の変動係数は、次の式により算出される。
粒子径の変動係数（ＣＶ値）＝粒子径の標準偏差／平均粒子径

本発明のラテックス粒子は、水等の水性媒体に懸濁した状態で得られる。粒子濃度としては特に限定されないが、通常は１〜２０重量％であることが好ましい。１重量％未満であると、試薬調製時に濃縮する必要があり、２０重量％を超えると、凝集してしまうことがある。

検出対象物質と特異的に反応する物質が物理的に吸着して担持されたラテックス粒子（感作ラテックス）および該ラテックス粒子を含む粒子凝集測定試薬も本発明の１つである。上記「検出対象物質と特異的に反応する物質」としては、免疫血清学的検査試薬（免疫学的凝集反応及び凝集阻止反応において使用されるもの）、生化学測定法として通常使用される生理活性物質であれば特に限定されないが、なかでも、抗原抗体反応に利用できるものが好適である。

上記抗原抗体反応に利用できるものとしては、例えば、タンパク質、核酸、核タンパク質、エストロゲン脂質等の抗原又は抗体が挙げられる。抗原としては、例えば、各種抗原、レセプター、酵素等が挙げられ、β２マイクログロブリン、Ｃ−反応性蛋白質（ＣＲＰ）、インスリン、ヒトフィブリノーゲン、フェリチン、リウマチ因子（ＲＡ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、マイコプラズマ抗原、ＨＢｓ抗原等が挙げられる。また、抗体としては、例えば、各種の毒素や病原菌等に対する抗体が挙げられ、抗ストレプトリジンＯ抗体、抗エストロゲン抗体、抗β２マイクログロブリン抗体、抗梅毒トレポネーマ抗体、梅毒脂質抗原に対する抗体、抗ＨＢｓ抗体、抗ＨＢｃ抗体、抗ＨＢｅ抗体、抗ＰＳＡ抗体、抗ＣＲＰ抗体、抗インスリン抗体、抗Ｄダイマー抗体等が挙げられる。なお、抗体としては、免疫グロブリン分子自体の他、例えば、Ｆ（ａｂ'）２のような断片であってもよい。更に抗体としてはポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらを用いてもかまわない。

上記ラテックス粒子に検出対象物質と特異的に反応する物質を担持（感作）させる方法としては、物理的な吸着方法であれば、特に限定されず、従来公知の方法により担持させればよい。

また、担持後には、必要に応じて牛血清アルブミン等でブロック処理を施し、適当な緩衝液に分散して感作ラテックス分散液を作製することができる。この感作ラテックス分散液に、測定に用いる緩衝液および標準物質等を組み合わせて、粒子凝集測定用試薬（キット）として用いることができる。

上記検出対象物質と特異的に反応する物質がラテックス粒子に担持される量は、用いられる被検物質と特異的に反応する物質の種類により異なり、特に限定されない。

抗原や抗体などを担持する上記ラテックス粒子を含む測定試薬を使用するにあたっては、測定感度の向上や抗原抗体反応の促進のために種々の増感剤を含有してもよい。上記増感剤としては、メチルセルロース、エチルセルロース等のアルキル化多糖類、プルラン、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。

本発明のラテックス粒子を用いることで、高度に非特異的反応が抑制されるが、検体中に存在する他の物質により引き起こされる非特異的反応を更に抑制するため、又は、試薬の保存安定性を高めるために、アルブミン（牛血清アルブミン、卵性アルブミン）、カゼイン、ゼラチン等のタンパク質やその分解物あるいはペプチド、アミノ酸又は界面活性剤等ラテックス粒子を使用した免疫学的測定方法、試薬の分野で公知の成分を含有してもよい。

また、検出対象物質は、適当な希釈液で希釈してもよい。上記希釈液としてはｐＨ５．０〜９．０の緩衝液であればどのようなものでも用いることができ、たとえば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液等が挙げられる。

本発明の抗原や抗体などを担持する上記ラテックス粒子を含む測定試薬を用いれば、検体中の検出対象物質と、ラテックス粒子に担持された検出対象物質に特異的に反応する物質との反応により生じるラテックス粒子の凝集の度合いを光学的に測定することにより、検体中の検出対象物質の反応量を測定することができる。上記光学的測定には、散乱光強度、透過光強度、吸光度等を検出できる光学機器、またはこれらの検出方法を複数備えた光学機器などに代表される一般の生化学自動分析機であればいずれも使用することができる。

上記凝集の度合いを光学的に測定する方法としては従来公知の方法が用いられ、例えば、凝集の形成を濁度の増加としてとらえる比濁法、凝集の形成を粒度分布又は平均粒径の変化としてとらえる方法、凝集の形成による前方散乱光の変化を積分球を用いて測定し透過光強度との比を比較する積分球濁度法等が挙げられる。

また、凝集度合いの変化量の測定法としては、例えば、異なる時点で少なくとも２つの測定値を得、これらの時点間における測定値の増加分（増加速度）に基づき凝集の程度を求める速度試験（レートアッセイ）、ある時点（通常は反応の終点と考えられる時点）で１つの測定値を得、この測定値に基づき凝集の程度を求める終点試験（エンドポイントアッセイ）等が挙げられる。なかでも、測定の簡便性、迅速性の点から比濁法による終点試験が好適である。

以下、本発明を実施例によりさらに詳しく説明する。尚、得られたラテックス粒子の粒径は下記のように測定した。
ラテックス粒子の粒径測定
ラテックス粒子を常法に従ってコロジオン膜状に載せ、透過型電子顕微鏡により粒子画像を撮影し、画像上の粒子径（１００個以上）を計測することにより平均粒子径及び標準偏差を求めた。

［実施例１］
攪拌機、還流用冷却器、温度検出器、窒素導入管及びジャケットを備えたガラス製反応容器（容量２Ｌ）に、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー（エパン４１０：分子量１３３３、ＥＯ含有率１０％、第一工業製薬社製）０．１０ｇを超純水１０００ｇに溶解させた溶液、及びスチレンモノマー１５０ｇ、スチレンスルホン酸ナトリウム０．８０ｇ、過硫酸カリウム０．７２ｇを添加し、容器内を窒素ガスで置換した後、７０℃、２１０ｒｐｍの速度で攪拌しながら２４時間重合を実施した。
重合終了後、上記溶液をろ紙にてろ過処理し、ラテックス粒子を取り出した。その後、透析膜にて４８時間透析処理を行い、精製されたラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は、０．１１４μｍ（ＣＶ１０．４％）であった。

［実施例２］
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー（エパン４１０：第一工業製薬社製）０．１０ｇをポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー（エパン７１０：分子量２２２２、ＥＯ含有率１０％、第一工業製薬社製）０．１０ｇに変更したこと以外は実施例１と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は、０．１１６μｍ（ＣＶ９．６％）であった。

［実施例３］
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー（エパン４１０：第一工業製薬社製）０．１０ｇをポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー（エパン４８５：分子量８０００、ＥＯ含有率８５％、第一工業製薬社製）０．１０ｇに変更したこと、及びスチレンスルホン酸ナトリウム０．８０ｇを２．００ｇに変更したこと以外は実施例１と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は、０．０９３μｍ（ＣＶ９．５％）であった。

［実施例４］
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー（エパン４１０：第一工業製薬社製）０．１０ｇをポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー（エパン７８５：分子量１３３３３、ＥＯ含有率８５％、第一工業製薬社製）０．１０ｇに変更したこと、及びスチレンスルホン酸ナトリウム０．８０ｇを２．００ｇに変更したこと以外は実施例１と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は、０．１０８μｍ（ＣＶ６．６％）であった。

［実施例５］
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー（エパン４１０：第一工業製薬社製）０．１０ｇを０．０５ｇに変更したこと以外は実施例１と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は、０．１１０μｍ（ＣＶ１０．９％）であった。

［実施例６］
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー（エパン４１０：第一工業製薬社製）０．１０ｇを０．２０gに変更したこと以外は実施例１と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は、０．１０４μｍ（ＣＶ１１．２％）であった。

［実施例７］
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー（エパン４１０：第一工業製薬社製）０．１０ｇをポリオキシアルキレンアルキルエーテル類であるポリオキシエチレントリデシルエーテル（ノイゲンＴＤＳ−５０：第一工業製薬社製、ＨＬＢ１０．５）０．１０gに変更したこと以外は実施例１と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は、０．１０１μｍ（ＣＶ１０．２％）であった。

［実施例８］
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー（エパン４１０：第一工業製薬社製）０．１０ｇをポリオキシアルキレンアルキルエーテル類であるポリオキシエチレンラウリルエーテル（ＤＫＳＮＬ−４０：第一工業製薬社製、ＨＬＢ９．５）０．１０gに変更したこと以外は実施例１と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は、０．１０２μｍ（ＣＶ１０．５％）であった。

［実施例９］
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー（エパン４１０：第一工業製薬社製）０．１０ｇをポリオキシエチレン２-エチルヘキシルエーテル（ニューコール１００８：日本乳化剤社製、ＨＬＢ１４．６）０．１０gに変更したこと以外は実施例１と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は、０．１０７μｍ（ＣＶ１１．１％）であった。

［比較例１］
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー（エパン４１０：第一工業製薬社製）を用いなかったこと以外は実施例１と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は、０．０９９μｍ（ＣＶ１１．１％）であった。

［比較例２］
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー（エパン４１０：第一工業製薬社製）０．１０ｇを１．００ｇに変更したこと以外は実施例１と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は、０．１０５μｍ（ＣＶ９．８％）であった。

［比較例３］
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー（エパン４１０：第一工業製薬社製）０．１０ｇをポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー（エパン７１０：第一工業製薬社製）１．００ｇに変更したこと以外は実施例１と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は、０．１０７μｍ（ＣＶ８．６％）であった。

［比較例４］
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー（エパン４１０：第一工業製薬社製）０．１０ｇを０．０４ｇに変更したこと以外は実施例１と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は、０．１０２μｍ（ＣＶ９．９％）であった。

［比較例５］
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー（エパン４１０：第一工業製薬社製）０．１０ｇを０．３０ｇに変更したこと以外は実施例１と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は、０．１０１μｍ（ＣＶ１０．８％）であった。

［適用例１］
用いた試薬及び材料は以下の通りである。
＜試薬及び材料＞
・抗Ｄダイマー抗体
・抗体感作ラテックス調製用緩衝液：２０mM Tris-HCl（pH８．０）を用いた。
・ブロッキング用緩衝液：２％ＢＳＡを含む２０mM Tris-HCl（pH８．０）を用いた。
・検体希釈用緩衝液：０．１５％ＢＳＡを含む３０mM Tris-HCl（pH８．５）を用いた。

＜Ｄダイマー測定用試薬の調製＞
実施例１〜６、比較例１〜３で得られたラテックス粒子を遠心分離で精製した後、５％（ｗ／ｖ）となるよう抗体感作ラテックス調製用緩衝液にて希釈して、希釈ラテックス液を調製した。
一方、抗Ｄダイマー抗体を濃度１ｍｇ／ｍＬとなるよう抗体感作ラテックス調製用緩衝液にて希釈して、希釈抗体溶液を調製した。
上記希釈ラテックス液１容を攪拌しながら上記希釈抗体溶液１容を添加・混合し、更に攪拌した。その後、ブロッキング用緩衝液２容を追加添加し、攪拌を続けた。その後、これを回収し、緩衝液を用いて０．５％（ｗ／ｖ）に調整して、抗体感作ラテックス分散液とした。該抗体感作ラテックス分散液を用い、Ｄダイマー抗原標準液にて検量線を作成した。
装置：日立７１７０型自動分析装置
使用波長：５７０／８００ｎｍ、測定温度：３７℃
被検査物質（０〜５８μｇ／ｍＬのＤダイマー標準液）：１２μＬ
第１試薬（０．１５％ＢＳＡを含む３０mM Tris-HCl（pH８．５））：１００μＬ
第２試薬（抗体感作ラテックス（０．５％（ｗ／ｖ））分散液）：１００μＬ
測光ポイント：１８−３４

［測定例１］
実施例１〜６および比較例１〜３のラテックス粒子に抗Ｄダイマー抗体を感作した、抗体感作ラテックス（０．５％（ｗ／ｖ））分散液を用いて、上記測定方法に従い測定し、検量線を作成した（図１）。実施例１〜６のラテックス粒子を用いた場合は高感度の測定が可能であった。一方、比較例１〜３のラテックス粒子を用いた場合は、実施例１に比較して低い感度しか得られなかった。

［測定例２］
実施例１〜６および比較例１〜３のラテックス粒子に抗Ｄダイマー抗体を感作した、抗体感作ラテックス粒子（０．５％（ｗ／ｖ））分散液とＤダイマー乖離検体（２種）を用いて、上記測定方法に従い測定し、その値を測定例１によって求めた検量線からそれぞれ濃度換算を行った。ここで、Ｄダイマー乖離検体とは、従来のＤダイマー免疫比濁測定系で非特異的凝集反応が観察された検体をいう。その結果を図２及び図３に示す。実施例１〜６のラテックス粒子を用いた場合は、非イオン性界面活性剤を用いなかった比較例１に対して、乖離検体の非特異的凝集反応を高度に抑制することが認められた。また、比較例２〜３のラテックス粒子を用いた場合は、実施例１〜６よりも高度に乖離検体の非特異的凝集反応を抑制することが認められたが、感度が大幅に低下していることから、抗体がラテックス粒子表面に十分に吸着（感作）しなかったと考えられる。

［適用例２］
用いた試薬及び材料は以下の通りである。
＜試薬及び材料＞
適用例１に同じ。

＜Ｄダイマー測定用試薬の調製＞
実施例７〜９、比較例４〜５で得られたラテックス粒子を用いた以外は、適用例１と同様の操作にて抗体感作ラテックス分散液を調整した。
該抗体感作ラテックス分散液を用い、Ｄダイマー抗原標準液にて検量線を作成した。
装置：日立７１７０型自動分析装置
使用波長：５７０／８００ｎｍ、測定温度：３７℃
被検査物質（０〜５８μｇ／ｍＬのＤダイマー標準液）：１２μＬ
第１試薬（０．１５％ＢＳＡを含む３０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５））：１００μＬ
第２試薬（抗体感作ラテックス（０．５％（ｗ／ｖ））分散液）：１００μＬ
測光ポイント：１８−３４

［測定例３］
実施例７〜９および比較例４〜５のラテックス粒子に抗Ｄダイマー抗体を感作した、抗体感作ラテックス（０．５％（ｗ／ｖ））分散液を用いて、上記測定方法に従い測定し、検量線を作成した（図４）。実施例７〜９のラテックス粒子を用いた場合は高感度の測定が可能であった。一方、比較例４〜５のラテックス粒子を用いた場合は、実施例７〜９に比較して低い感度しか得られなかった。

［測定例４］
実施例７〜９および比較例４〜５のラテックス粒子に抗Ｄダイマー抗体を感作した、抗体感作ラテックス粒子（０．５％（ｗ／ｖ））分散液と、適用例１と同じＤダイマー乖離検体（２種）を用いて、上記測定方法に従い測定し、その値を測定例３によって求めた検量線からそれぞれ濃度換算を行った。その結果を図５及び図６に示す。実施例７〜９のラテックス粒子を用いた場合は、非イオン性界面活性剤を用いる濃度が低い比較例４に対して、乖離検体の非特異的凝集反応を高度に抑制することが認められた。また、比較例５のラテックス粒子を用いた場合は、実施例７〜９よりも乖離検体の非特異的凝集反応を抑制することが認められたが、感度が大幅に低下していることから、抗体がラテックス粒子表面に十分に吸着（感作）しなかったと考えられる。

本発明の粒子凝集測定用ラテックス粒子は、抗原抗体反応を利用した免疫測定法、中でもラテックス粒子を用いたラテックス免疫比濁法に用いることができる。検出対象物質と特異的に反応する物質としては、免疫血清学的検査試薬（免疫学的凝集反応及び凝集阻止反応において使用されるもの）、生化学測定法として通常使用される生理活性物質であれば特に限定されずに利用できる。

Claims

フェニル基を有する重合性単量体、及び、フェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体を成分とし、かつ非イオン性界面活性剤を水性媒体に対する重量％濃度で、０．００５〜０．０２％とした反応系で乳化重合したラテックスであって、
平均粒子径が０．００５〜１．０μｍであり、
上記非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー又はポリオキシアルキレンアルキルエーテル類である粒子凝集測定用ラテックス粒子。
上記ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマーが、下記式（Ｉ）に示す構造を有し、重量平均分子量が１０００〜１５０００であり、かつＥＯ含有率が５〜９０％である請求項１に記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
ＨＯ（Ｃ₂Ｈ₄Ｏ）a−（Ｃ₃Ｈ₆Ｏ）b−（Ｃ₂Ｈ₄Ｏ）cＨ（Ｉ）
（式中、ａ，ｂ，ｃは任意の整数を表し、ａ＋ｂ＋ｃが１７〜３００単位となることを限度として、ａ＋ｃは２〜２７０単位の平均重合度のオキシエチレンとなるよう決定され、かつｂは１５〜４０単位の平均重合度のオキシプロピレンとなるよう決定される。）
上記ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマーが、（１）〜（４）よりなる群より選ばれるものである請求項２に記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
（１）重量平均分子量１３３３、ＥＯ含有率１０％、
（２）重量平均分子量２２２２、ＥＯ含有率１０％、
（３）重量平均分子量８０００、ＥＯ含有率８５％、
（４）重量平均分子量１３３３３、ＥＯ含有率８５％。
上記ポリオキシアルキレンアルキルエーテル類が、下記式（II）に示す構造を有し、ＨＬＢ値が、５．０〜１９．３の範囲にある請求項１に記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
Ｒ₁Ｏ（ＡＯ）n−Ｈ（II）
（式中、Ｒ₁は、炭素数８〜２２の範囲にあるアルキル基またはアルケニル基を示し、ＡＯはオキシアルキレン基を示し、Ａは炭素数２〜４のアルキル基を示す。ｎはＡＯが示すオキシアルキレン基の平均付加モル数を示し、ｎは２〜１５の整数である。）
上記ポリオキシアルキレンアルキルエーテル類が、（１）〜（３）よりなる群より選ばれるものである請求項１に記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
（１）ポリオキシエチレントリデシルエーテル（ＨＬＢ１０．５）、
（２）ポリオキシエチレンラウリルエーテル（ＨＬＢ９．５）、
（３）ポリオキシエチレン２-エチルヘキシルエーテル（ＨＬＢ１４．６）。
上記フェニル基を有する重合性単量体がスチレン、フェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体がスチレンスルホン酸ナトリウムである請求項１に記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
上記請求項１〜６のいずれかに記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子を用いる粒子凝集測定試薬。
抗原または抗体を物理吸着により担持する上記請求項１〜６のいずれかに記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子を用いる、粒子凝集測定試薬。