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JP6038248B2 - プロリン／アラニンランダムコイルポリペプチドの生合成およびその使用 - Google Patents

プロリン／アラニンランダムコイルポリペプチドの生合成およびその使用 Download PDF

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エクスエル‐プロテイン ゲーエムベーハー
エクスエル‐プロテイン ゲーエムベーハー
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Description

本発明は、生合成ランダムコイルポリペプチドまたは生合成ランダムコイルポリペプチ
ドセグメントもしくはコンジュゲート、少なくとも約５０個のプロリン（Ｐｒｏ）および
アラニン（Ａｌａ）アミノ酸残基からなる、もっぱら（solely）プロリンおよびアラニン
アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む前記生合成ランダムコイルポリペプチドまたは
生合成ランダムコイルポリペプチドセグメントもしくはコンジュゲートに関する。前記少
なくとも約５０個のプロリン（Ｐｒｏ）およびアラニン（Ａｌａ）アミノ酸残基は、異種
ポリペプチドまたは異種ポリペプチド構築物の構成要素（単数または複数）であり得る。
また、これらの生合成ランダムコイルポリペプチド、前記ポリペプチドセグメントまたは
前記コンジュゲートの使用および使用方法が記載されている。使用は、とりわけ、医学的
使用、診断的使用または食品産業における使用ならびに製紙業において、油回収において
などのようなその他の産業的利用を含み得る。本発明は、本明細書に提供される生合成ラ
ンダムコイルポリペプチドまたは生合成ランダムコイルポリペプチドセグメントもしくは
コンジュゲート、もっぱらプロリンおよびアラニンアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を
含む前記生合成ランダムコイルポリペプチドまたは生合成ランダムコイルポリペプチドセ
グメントもしくはコンジュゲートの特定の使用（単数または複数）にも関する。本明細書
に提供される生合成ランダムコイルポリペプチドまたは生合成ランダムコイルポリペプチ
ドセグメントのアミノ酸配列は、少なくとも約５０個の、少なくとも約１００個の、少な
くとも約１５０個の、少なくとも約２００個の、少なくとも約２５０個の、少なくとも約
３００個の、少なくとも約３５０個の、または少なくとも約４００個のプロリン（Ｐｒｏ
）およびアラニン（Ａｌａ）アミノ酸残基からなる。前記少なくとも約５０個の、少なく
とも約１００個の、少なくとも約１５０個の、少なくとも約２００個の、少なくとも約２
５０個の、少なくとも約３００個の、少なくとも約３５０個の、または少なくとも約４０
０個のプロリン（Ｐｒｏ）およびアラニン（Ａｌａ）アミノ酸残基は、好ましくは、（ａ
）異種ポリペプチドまたは異種ポリペプチド構築物の構成要素であり、好ましくは、（ｂ
）薬物コンジュゲートのような、食品もしくは化粧品成分もしくは添加物とのコンジュゲ
ートのような、生物学的に活性な化合物とのコンジュゲートのような、または分光学的に
活性な化合物とのコンジュゲートのようなコンジュゲートの構成要素である。特に、少な
くとも２つのドメインを含み、前記少なくとも２つのドメインの第１のドメインが、生物
学的活性のような活性を有するおよび／または媒介するアミノ酸配列を含み、前記少なく
とも２つのドメインの第２のドメインが、本発明の生合成ランダムコイルプロリン／アラ
ニンポリペプチドまたはプロリン／アラニンポリペプチドセグメントを含む異種タンパク
質が、本明細書において提供される。本発明は、特に、（ｉ）少なくとも５０個のプロリ
ン（Ｐｒｏ）およびアラニン（Ａｌａ）アミノ酸残基からなる、もっぱらプロリンおよび
アラニンアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む生合成ランダムコイルポリペプチドま
たはポリペプチドセグメントと、（ｉｉ）（ａ）生物学的に活性なタンパク質、または生
物学的活性を有するもしくは媒介するアミノ酸配列を含むか、もしくは生物学的活性を有
するもしくは媒介するアミノ酸配列であるポリペプチドと、（ｂ）小分子薬とからなる群
から選択される薬物とを含む薬物コンジュゲートに関する。本発明のさらなる主題は、本
明細書において提供される生合成ランダムコイルプロリン／アラニンポリペプチドまたは
プロリン／アラニンポリペプチドセグメントと、さらに、前記生合成ランダムコイルプロ
リン／アラニンポリペプチドまたはプロリン／アラニンポリペプチドセグメントに連結さ
れた、および／またはカップリングされた、（ａ）小分子、ペプチドまたは生体高分子（
タンパク質、核酸、炭水化物、脂質小胞など）のような薬学的にまたは医学上有用な分子
などとを含む薬物コンジュゲートである。さらに、生合成ランダムコイルポリペプチドま
たはポリペプチドセグメントおよび／または生物学的に活性な異種タンパク質をコードす
る核酸分子ならびに前記核酸分子を含むベクターおよび細胞が開示される。さらに、本明
細書において記載される本発明の生合成ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチド
セグメントおよび対応する薬物もしくは食品コンジュゲート、すなわち、本明細書におい
て定義される生合成ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントと、食品
成分もしくは食品添加物とを含むコンジュゲートを製造する方法が開示される。また、と
りわけ、化粧品成分または添加物または生物学的もしくは分光学的に活性な化合物を含む
、対応するコンジュゲート（１種の構成要素として、本明細書に開示される生合成ランダ
ムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントを含む）も開示される。さらに、本
発明は、本発明の化合物（すなわち、もっぱらプロリンおよびアラニンアミノ酸残基から
なるアミノ酸配列を含む本明細書に開示されるランダムコイルポリペプチドまたはランダ
ムコイルポリペプチドセグメントならびにそれらをコードする核酸分子）を含む組成物な
らびに前記ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントの特定の使用、前
記ランダムコイルポリペ（polype）ランダムコイルポリペプチドまたはランダムコイルポ
リペプチドセグメントプチド（ptides）またはランダムコイルポリペプチドセグメントを
含む生物学的に活性なタンパク質の特定の使用、本発明の薬物コンジュゲート、食品コン
ジュゲートまたは核酸分子、ベクターおよび細胞を提供する。また、本発明の生合成ラン
ダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントを製造する方法および／または得
る方法ならびに本発明の生物学的に活性な、異種タンパク質および／またはポリペプチド
構築物もしくは薬物コンジュゲートを製造する方法および／または得る方法が提供される
。さらに、本明細書において定義される、もっぱらプロリンおよびアラニンアミノ酸残基
からなるアミノ酸配列を含む生合成ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグ
メントの（またはそれらを含む分子およびコンジュゲートの）医学的使用、薬学的使用な
らびに診断的使用が本明細書において提供される。このような医学的使用または薬学的使
用は、血漿増補液などとしての前記生合成ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチ
ドセグメントの使用を含み得る。しかし、本明細書に提供される手段および方法は、薬学
的使用、医学的使用および生物学的使用に制限されず、製紙業において、油回収において
などその他の産業領域において使用され得る。
腎濾過によって血液循環から迅速にクリアランスされることは、小分子（小タンパク質
およびペプチドを含める）のもつ通常の特性である。しかし、見かけの分子寸法を、腎臓
糸球体のポアサイズを超えるほどに大きくすることによって、治療タンパク質の血漿半減
期が、数日という医学上有用な範囲に延長され得る。このような効果を達成するための１
つの戦略は、生物製剤を合成ポリマーポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と化学的にコン
ジュゲートさせることである。これは、いくつかの承認薬、例えば、ＰＥＧ−インターフ
ェロンα２ａ（Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標））、ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｌａｓｔａ
（登録商標））および最近の、ＰＥＧ化αＴＮＦ−Ｆａｂ断片（Ｃｉｍｚｉａ（登録商標
））につながっている。それにもかかわらず、「ＰＥＧ化」技術は、いくつかの欠点を有
する：臨床等級のＰＥＧ誘導体が高価であり、組換えタンパク質とのその共有結合には、
さらなる下流の処理および精製ステップが必要であり、従って、収率が低下し、費用が上
がる。さらに、ＰＥＧは、生分解性ではなく、連続治療の際の腎臓上皮の空胞化などの副
作用を引き起こし得る；例えば、Gaberc-Porekar (2008年) Curr Opin Drug Discov Deve
l 11:242〜50頁; Knop (2010年) Angew Chem Int Ed Engl 49:6288〜308頁またはArmstro
ng in: Veronese (編)、「PEGylated Protein Drugs: Basic Science and Clinical Appl
ications」; Birkhauser Verlag, basel 2009参照のこと。
ＰＥＧ技術の欠点の一部を克服するために、当技術分野では特定の組換えポリペプチド
ミメティックが提供されており、その一部は、天然に存在するアミノ酸配列または合成ア
ミノ酸ストレッチに基づいている。
ほとんどの天然アミノ酸配列は、フォールディングされたコンホメーション（二次構造
）をとりやすいか、またはフォールディングされていない場合には、それらは普通、不溶
性であり、凝集体を形成するかのいずれかのために、生理学的溶液中で理想的なランダム
鎖のようには挙動しない。実際、ポリペプチドのランダム鎖挙動を調査するため伝統的な
実験のほとんどは、変性条件下で、すなわち、尿素または塩化グアニジウムのような化学
的変性剤の存在下で実施された（例えば、Cantor (1980年) Biophysical Chemistry. W.H
. Freeman and Company, New York参照のこと）。したがって、このような技術は、一般
に、フォールディング、凝集および非特異的吸着に抵抗し、それにより、フォールディン
グされる治療タンパク質ドメインに遺伝的に融合されている場合でさえも生理学的バッフ
ァー条件および温度下で安定なランダム鎖を提供する独特のアミノ酸配列に基づく。これ
らの状況下で、このような組換えＰＥＧミメティックは、その分子量のみに基づいて普通
予想されるものよりもかなり大きなサイズの増大を与えることができ、これは、最終的に
は、腎臓濾過を遅延し、付着された生物製剤の血漿半減期を相当な倍率で効果的に延長す
る。
しかし、これらの技術の多くは、さらなる警告および不都合を有する。
例えば、天然に存在する反復アミノ酸配列が、医学における、および薬剤アプローチに
おけるその有用性について調べられている。これらのアプローチのうち１つは、クルーズ
トリパノソーマ（Trypanosoma cruzi）のトランスシアリダーゼに関する。このトランス
シアリダーゼは、可変数の１２マーのアミノ酸リピートを含む、「ｓｈｅｄ急性期抗原（
shed acute phase antigen）」（ＳＡＰＡ）と呼ばれる、６８０個のアミノ酸残基触媒ド
メインと、それに続くＣ末端反復ドメインとを含有する。天然配列ＤＳＳＡＨＳＴＰＳＴ
ＰＡを有する１３個の親水性かつ（生理学的ｐＨで）負荷電の対応するアミノ酸リピート
を含有するトランスシアリダーゼの、マウスにおける薬物動態（ＰＫ）研究は、Ｃ末端反
復配列が欠失している組換え酵素と比較して５倍長い血漿半減期を示した（Buscaglia (1
999年) Blood 93 :2025〜32頁）。同様の半減期延長効果は、同じトランスシアリダーゼ
、すなわち、その７６ｋＤａの触媒ドメインと、クルーズトリパノソーマ（Trypanosoma
cruzi）タンパク質抗原１３に見出された配列ＥＰＫＳＡの１３個の荷電アミノ酸リピー
トとの融合後に観察された。ＳＡＰＡに由来するリピートおよび抗原１３に由来するリピ
ートは両方とも、日本住血吸虫（Schistosoma japonicum）に由来する異種タンパク質グ
ルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の血漿半減期を、このホモ二量体酵素の両
Ｃ末端と遺伝的に融合した後に７〜８倍延長できた（Buscaglia、同著）。それにもかか
わらず、ヒト病原体に由来するこれらの天然に存在する反復アミノ酸配列は、原則として
、治療タンパク質の薬物動態を最適化するのに魅力的であると考えられ得るが、それらは
高度に免疫原性であることがわかっている（Affranchino (1989年), Mol Biochem Parasi
tol 34:221〜8頁またはBuscaglia (1998年), J Infect Dis 1998;177:431〜6頁参照のこ
と）。
別のアプローチは、ゼラチンの使用に関する。加水分解され、変性した動物コラーゲン
であるゼラチンは、Ｇｌｙ−Ｘａａ−Ｙａａリピートの長いストレッチを含有し、ここで
、ＸａａおよびＹａａは、たいていは、それぞれ、プロリンおよび４−ヒドロキシプロリ
ンを構成する。主に、天然に散在するリシン側鎖のε−アミノ基によるゼラチンのサクシ
ニル化は、この生体高分子の親水性を高め、その等電点（ｐＩ）を低下させる。修飾され
た側鎖の負荷電カルボン酸基間の分子内電気的反発は、おそらくは、分子を多かれ少なか
れ拡張されたコンホメーションに広げる。その結果得られる拡大された容積が、サクシニ
ル化ゼラチンを、ヒトにおいて血漿増補液（plasma expander）として使用するための高
分子にし、とりわけ、Ｖｏｌｐｌｅｘ（登録商標）（Ｂｅａｃｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕ
ｔｉｃａｌｓ Ｌｔｄ）またはＧｅｌｏｆｕｓｉｎｅ（登録商標）（Ｂ． Ｂｒａｕｎ
Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ ＡＧ）として販売されている。さらに、半減期延長効果は、顆粒球
コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）の人工ゼラチン様ポリペプチドとの遺伝子融合によって
達成された（Huang (2010年) Eur J Pharm Biopharm 74:435〜41頁）。この目的を達成す
るために、天然ゼラチン中のすべての疎水性側鎖が親水性残基によって交換され、その結
果、アミノ酸Ｇ、Ｐ、Ｅ、Ｑ、Ｎ、ＳおよびＫを変動する順序で含む１１６個のアミノ酸
のゼラチン様タンパク質（ＧＬＫ）が得られた。Ｇ−ＣＳＦは、そのＮ末端で、このＧＬ
Ｋ配列の４コピーと融合され、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）中に分泌された
。ピキア・パストリス（Pichia pastoris）は、ＧＬＫ融合タンパク質の好ましい製造生
物と思われるが、ＧＬＫがその他の生物においても製造され得るかどうかは、例えば、Ol
sen (2003年), Adv Drug Deliv Rev 55:1547〜67頁に示されるように、組換えゼラチン断
片が大腸菌（E.coli）において低率でしか発現され得ないことがわかっているのでまだ決
定されていない。
エラスチンは、多数の組織における細胞外マトリックスの成分であり、親水性Ｌｙｓ／
Ａｌａリッチドメインおよび反復配列を有する疎水性のエラストマードメインからなる可
溶性前駆体トロポエラスチンから形成される。親水性ドメイン内のリシン側鎖の酵素的架
橋は、不溶性エラスチン形成につながる。エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）は、人工
的に（artifically）設計された、トロポエラスチンの疎水性ドメインに由来する反復ア
ミノ酸配列である。ＥＬＰの最もよく見られる反復配列モチーフは、Ｖ−Ｐ−Ｇ−Ｘ−Ｇ
であり、ここで、「Ｘ」は、Ｐｒｏを除く任意のアミノ酸であり得る（MacEwan (2010年)
Biopolymers 94:60〜77頁; Kim (2010年) Adv Drug Deliv Rev 62:1468〜78頁）。適し
たＥＬＰは、治療タンパク質と融合され、大腸菌（E. coli）において産生され得る。結
果として、ＥＬＰの注射後にゲル様貯蔵物を形成する能力は、付着された生物製剤のｉｎ
ｖｉｖｏ半減期を、その他の構築されていないポリペプチドとは異なる機序によってで
はあるが、大幅に延長し得る。しかし、ＥＬＰ付着は、ＩＬ−１誘発性リンパ球増殖バイ
オアッセイにおけるインターロイキン−１受容体アンタゴニストについて実証されるよう
に（Shamji (2007) Arthritis Rheum. 11:3650〜3661頁）、融合パートナーの生物活性を
妨害し得る。さらに、ＥＬＰは、コラゲナーゼなどの内因性プロテアーゼによる分解に付
される。また、凝集されたタンパク質は、一般に、免疫原性に対してより感受性である。
さらなるアプローチは、ポリアニオン性ポリマーの使用に関する。例えば、ポリグルタ
ミン酸（ＰＧ）は、癌治療のための難溶性細胞傷害性小分子薬に化学的にカップリングさ
れている。対応する製剤は、Ｏｐａｘｉｏ（商標）、現在第ＩＩＩ相臨床試験中であるパ
クリタキセル薬物コンジュゲートであろう。パクリタキセルＰＧコンジュゲートの半減期
は、修飾されていない化合物と比較して３〜１４倍延長された（Singer (2005年) J Cont
rol Release 109:120〜6頁）。さらなる融合タンパク質、例えば、そのＮ末端で１７５個
の連続Ｇｌｕ残基のストレッチと融合しているＧ−ＣＳＦ、またはそのＣ末端に８４個の
残基のＰＧテールを保持するＩＦＮ−α２が、大腸菌（E. coli）の細胞質において可溶
性状態で製造された（ＷＯ２００２／０７７０３６参照のこと）。効率的な翻訳のために
、Ｎ末端融合物には、リーダーペプチドが必要であり、これは、後にタバコエッチウイル
ス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断によって除去された。Ｇ−ＣＳＦおよびＩＮＦα２のポリ
グルタミン酸融合は、細胞培養アッセイにおいて生物活性を示したが、これまでに、これ
らのＰＧ融合物の薬物動態データは報告されていない。また、ＰＧ融合物が高度に負荷電
であることは、人工静電気引力または反発効果のため、生体分子相互作用（例えば、標的
受容体または可溶性因子の結合）に関して、一般的な不利点である。
ＷＯ２００６／０８１２４９には、３〜６個のアミノ酸の約２〜５００の反復ユニット
を有するポリペプチド配列が記載されており、これでは、Ｇ、ＮまたはＱが、主要な構成
要素を表すのに対し、微量の構成要素は、Ａ、Ｓ、Ｔ、ＤまたはＥであり得る。このアミ
ノ酸組成によって、真核細胞発現系におけるＡｓｎ側鎖のＮ結合型グリコシル化のための
グリコシル化シークオンＡｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（式中、Ｘａａは、Ｐｒｏを除
く任意のアミノ酸である）の組み込みが可能となる。嵩高く溶媒和された炭水化物構造で
の翻訳後修飾を含む、得られた融合タンパク質の増大した高分子の大きさが、遺伝的にコ
ンジュゲートされたタンパク質の薬物動態を延長し得る。このようなオリゴ糖付着（「糖
質工学」）は、一般に、タンパク質分解に対する感受性を低減させ、流体力学的容積を増
大させ得る（Sinclair (2005年) J Pharm Sci 94:1626〜35頁）。不利点は、グリコシル
化生体高分子の内因的な分子の不均一性であり、これが、生物工学的製造および品質管理
の際にさらなる労力を引き起こす。
ＷＯ２０１０／０９１１２２（およびＷＯ２００７／１０３５１５）およびSchellenbe
rger (2009年) Nat Biotechnol 27:1186〜90頁には、残基Ｐ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、ＡおよびＧを
包含し、かつ含む、構造化していない非反復アミノ酸ポリマーが開示されている。さらに
先に記載されたＰＳＴＡＤリピートと大きく異ならない組成を示すこのアミノ酸のセット
は、凝集を生じさせ得、ＨＬＡ／ＭＨＣ−ＩＩ媒介性免疫応答を引き起こし得る疎水性側
鎖−特に、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、ＶおよびＷを避けることによって、生物薬剤開発に適した、
大きな分子量を有する溶媒和されたポリペプチドをもたらす配列を求めて体系的にスクリ
ーニングされた。また、架橋する可能性があるＣｙｓ残基、負荷電の細胞膜と相互作用し
得るカチオン性アミノ酸Ｋ、ＲおよびＨならびに加水分解しやすい可能性があるＮおよび
Ｑのアミド側鎖が排除された（Schellenberger (2009年)同著参照のこと）。緑色蛍光タ
ンパク質（ＧＦＰ）に融合されたＰＥＳＴＡＧセットの残基を含む非反復配列をコードす
る合成遺伝子ライブラリーが、大腸菌（E. coli）において可溶性発現レベルに関してス
クリーニングされ、得られたサブセットは、遺伝子の安定性、タンパク質溶解度、熱安定
性、凝集傾向および汚染プロフィールについてさらに調べられた。最終的に、２１６個の
Ｓｅｒ残基（２５．０モル％）、７２個のＡｌａ残基（８．３モル％）およびＰｒｏ、Ｔ
ｈｒ、ＧｌｕおよびＧｌｙ各々の１４４個のアミノ酸（１６．７モル％）を含有する８６
４個のアミノ酸配列が、ＧＬＰ−１受容体アゴニストエキセンディン−４（Ｅ−ＸＴＥＮ
）およびいくつかのその他の生物薬剤との融合についてさらに試験された。一般に、後に
切断除去されるセルロース結合ドメインを保持する融合タンパク質が、大腸菌（E. coli
）の細胞質において可溶性状態で産生され、単離された。円二色性（ＣＤ）分光法による
Ｅ−ＸＴＥＮの調査によって、二次構造の欠如が示されたのに対し、サイズ排除クロマト
グラフィー（ＳＥＣ）の際には、融合タンパク質が、８４ｋＤａのタンパク質に対して予
想されるものよりも実質的に短い保持を示し、従って、流体力学的容積の増大を実証した
（Schellenberg (2009年)同著）。開示されたＰＥＳＴＡＧポリペプチドの構造および関
連する流体力学的半径の増大は、ＸＴＥＮ配列中に分散された高い正味の負の電荷を保持
するアミノ酸間の静電気的反発によって支持され得る（ＷＯ２０１０／０９１１２２参照
のこと）。しかし、さらなる研究Geething (2010年) PLoS One 2010年;5:e10175によって
、ＸＴＥＮはその治療用融合パートナーの効力を低下させるということが実証された。細
胞培養アッセイでは、グルカゴンＸＴＥＮ融合物は、修飾されていないペプチドの１５％
の生物活性しか示さなかった。ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のＸＴＥＮ融合物について、
受容体親和性のさらに強力な喪失（１７倍増大したＥＣ５０）が記載された；ＷＯ２０１
０／１４４５０２参照のこと。
また、最小の構造的に最も簡単なアミノ酸としてグリシンが、理論的基礎に基づいてコ
ンホメーション的に最も順応性があるアミノ酸として考えられてきた；例えば、Schulz G
E、Schirmer RH, Principles of Protein Structure. Springer, New York 1979年を参照
のこと。さらに、コンピュータシミュレーションによって、Ｇｌｙポリマーが、二次構造
を欠き、溶液中でランダムコイルを形成する可能性があることが示された；Shental-Bech
or (2005年) Biophys J 88:2391〜402頁参照のこと。化学的観点から、ポリグリシンは、
両者が、鎖に沿って多数の回転自由度を有する本質的に１次元の高分子である限りにおい
て、ポリエーテルＰＥＧと特定の類似性を示す直鎖非分岐ポリアミドであり、水素結合お
よび高度に溶媒和された極性基によって規則的に中断されている反復された短い炭化水素
ユニットからなる。結果として、ポリグリシンは、治療タンパク質の血漿半減期の延長を
念頭においた、最も単純な遺伝的にコードすることができるＰＥＧミメティックを構成す
るはずである。この概念は、それぞれ、「ホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）」の形態で、
またはグリシンリッチ配列（ＧＲＳ）として使用された；Schlapschy (2007年) Protein
Eng Des Sel 20:273〜84頁；ＷＯ２００７／１０３５１５参照のこと。しかし、化学的に
合成されたＧｌｙの純粋なポリマーは、水への低い溶解度を示すことが長年知られている
；とりわけ、Bamford CHらにおける、Synthetic Polypeptides- Preparation，Structure
, and Properties. Academic Press, New York 1956年参照のこと。したがって、水素結
合するセリンアルコール側鎖（ＷＯ２００７／１０３５１５ならびにSchlapschy (2007年
)同著）または、さらに、負荷電のグルタミン酸残基（ＷＯ２００７／１０３５１５）を
導入することのいずれかによって、親水性を高めるために種々の試みがなされた。融合タ
ンパク質中のドメインを柔軟な形で連結するために、組成（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを有する
ペプチドスペーサーが当技術分野ですでに記載されていることは注目すべきことである。
分析用ＳＥＣにおいて、これらの融合タンパク質について流体力学的容積の大幅な増大が
検出された。２００個の残基のＨＡＰ版の場合には、見かけのサイズの増大は、融合して
いないＦａｂ断片と比較して１２０％であったのに対し、真の質量は、２９％大きかった
だけであり、従って、ポリグリシンタグの溶媒和されたランダムコイル構造による増大さ
れた流体力学的容積の効果を示す。さらに、ＣＤ差スペクトルは、ＨＡＰ部分の不規則な
二次構造に特徴的であった。最後に、マウスにおける２００個の残基のＨＡＰを保持する
Ｆａｂ断片の末端血漿半減期は、およそ３倍延長された。中程度ではあるが、この効果は
、ｉｎ ｖｉｖｏイメージングなどの特定の（特殊化した）診断的適用にとって適当なも
のであり得る；Schlapschy (2007);同著。残念ながら、長い（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎリピー
ト配列を有する融合タンパク質の製造は、凝集体を形成し、ひいては、ＰＥＧミメティッ
クとしての、程度の差はあるが純粋なグリシンポリマーの使用に対する起こるべくして起
こる制限を提示する傾向の増大のためにあまり実行可能ではない。
ＷＯ２００８／１５５１３４には、Ｐｒｏ、ＡｌａおよびＳｅｒ（すなわち、ＰＡＳ）
残基の適当な混合物を有する配列は、その独特の二次構造の優先度の相互消去につながり
、ひいては、安定に無秩序なポリペプチドをもたらすと開示されている。しかし、ＷＯ２
００８／１５５１３４はまた、もっぱらセリンおよびアラニン（ＳＡ）残基からなるドメ
イン、すなわち、２種類のみのアミノ酸を含むドメインを有する融合タンパク質は、ラン
ダムコイルを形成しないが、代わりに、β−シート構造を形成することを実証している。
ポリペプチドの化学的合成は、周知であり、当技術分野で記載されている。Izukaは、
プロリンを含有するポリペプチドの化学的合成を開示している（Izuka (1993年), Bull.
Chem. Soc. Jpn 66, 1269〜1272頁）。これらのコポリペプチドは、それぞれ、プロリン
と、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−α−アミノ酪酸（Ａｂｕ）、Ｌ−ノルバリン（Ｎｖａ
）またはＬ−ロイシンのいずれかとのランダム配列を含有し、化学的共重合によって合成
される。Izukaは、このようなコポリペプチドがほとんど、定義されたコラーゲン様コン
ホメーションを有することを開示している。さらに、この刊行物には、プロリンおよびア
ラニン（またはプロリンおよびＬ−α−アミノ酪酸）のコポリペプチドは、水に部分的に
可溶性であるのに対し、その他のコポリペプチドは完全に不溶性であったということが記
載されている。Izukaでは、プロリン／アラニンコポリペプチドは、部分的に無秩序なコ
ンホメーションを有し得ると推測されている。Izukaは、ランダムプロリン/アラニン配列
を有する化学的に合成されたポリペプチドは、コラーゲン様コンホメーションで、すなわ
ち、構築されたコンホメーションで主に生じると強調している。
したがって、本発明の根底にある技術的問題は、真のランダムコイルコンホメーション
を有する大きなポリペプチドを提供することである。技術的問題は、特許請求の範囲にお
いて特徴付けられる、本明細書に提供される実施形態の提供によって解決される。
したがって、本発明は、少なくとも約５０個の、特に、少なくとも約１００個の、特に
、少なくとも約１５０個の、特に、少なくとも約２００個の、特に、少なくとも約２５０
個の、特に、少なくとも約３００個の、特に、少なくとも約３５０個の、特に、少なくと
も約４００個のプロリンおよびアラニンアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む生合成
ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントの提供および使用に関する。
したがって、本発明は、もっぱらプロリンおよびアラニンアミノ酸残基からなり、少なく
とも１個のプロリンと、少なくとも１個のアラニンとを含む、少なくとも５０個のアミノ
酸残基のアミノ酸配列を含む生合成ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグ
メントの提供に関する。本発明はまた、（ｉ）少なくとも５０個のプロリン（Ｐｒｏ）お
よびアラニン（Ａｌａ）アミノ酸残基からなる、もっぱらプロリンおよびアラニンアミノ
酸残基からなるアミノ酸配列を含む生合成ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチ
ドセグメントと、（ｉｉ）（ａ）生物活性を有する、もしくは媒介するアミノ酸配列を含
むか、または生物活性を有する、もしくは媒介するアミノ酸配列である生物学的に活性な
タンパク質またはポリペプチドと、（ｂ）小分子薬とからなる群から選択される薬物とを
含む薬物コンジュゲートを提供する。本明細書において提供される、真のランダムコイル
コンホメーションを有するポリペプチドおよび真のランダムコイルコンホメーションを有
するポリペプチドセグメントはまた、化粧品的使用ならびに食品産業および飲料の製造に
おける使用との関連でも有用である。真のランダムコイルコンファーメーション（confir
mation）を示す本明細書に提供される大きなポリペプチドは、もっぱら（soley）、プロ
リン（Ｐ、Ｐｒｏ）およびアラニン（Ａ、Ａｌａ）残基からなり、少なくとも５０個のア
ミノ酸、特に、少なくとも約１００個、特に、少なくとも約１５０個、特に、少なくとも
約２００個、特に、少なくとも約２５０個、特に、少なくとも約３００個、特に、少なく
とも約３５０個、特に、少なくとも約４００個を超えるプロリンおよびアラニンアミノ酸
残基を含む。アミノ酸、ＰおよびＡの両方とも、本明細書において提供される真のランダ
ムコイルコンホメーションを有する大きなポリペプチドおよび真のランダムコイルコンホ
メーションを有するポリペプチドセグメント中に存在することを必要とする。また、本明
細書において開示された生合成ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメン
トならびに前記生合成ランダムコイルポリペプチドもしくはポリペプチドセグメントと、
（共有結合されている）生物学的に活性なタンパク質のような注目されるタンパク質とを
含む薬物または食品コンジュゲートをコードする核酸分子も本明細書において提供される
。
本明細書において記載され、本明細書において提供される、薬物または食品コンジュゲ
ートにおいて使用されるべき、少なくとも約５０個、少なくとも約１００個、少なくとも
約１５０個、少なくとも約２００個、少なくとも約２５０個、少なくとも約３００個、少
なくとも約３５０個、少なくとも約４００個のプロリン（Ｐ）およびアラニン（Ａ）アミ
ノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む、生合成ランダムコイルポリペプチドまたは生合成
ランダムコイルポリペプチドセグメントは、とりわけ、異種の状況で、すなわち、生物学
的に活性な異種タンパク質、タンパク質構築物で、および／または前記生合成ランダムコ
イルポリペプチドもしくはポリペプチドセグメントと、小分子、ペプチドもしくはタンパ
ク質、核酸、炭水化物、脂質小胞などといった生体高分子のような薬学的にもしくは医学
上有用な分子とを含む薬物コンジュゲートで使用されるべきである。添付の実施例に示さ
れるように、発明者らは、本明細書において定義される真のランダムコイルポリペプチド
と、生物学的に活性なタンパク質またはタンパク質ストレッチからなる薬物コンジュゲー
トならびにもっぱらプロリンおよびアラニンアミノ酸残基（すなわち、アミノ酸Ｐおよび
Ａの両方）からなる本明細書において記載されるランダムコイルポリペプチドを含む、お
よび／またはそれと連結している小分子または小分子薬からなる薬物コンジュゲートを成
功裏に提供することができた。
したがって、本発明は、とりわけ、少なくとも２つのドメインを含む生物学的に活性な
、異種タンパク質を提供し、ここで、（ａ）前記少なくとも２つのドメインの第１のドメ
インが、前記生物活性を有する、および／または媒介するアミノ酸配列を含み；（ｂ）前
記少なくとも２つのドメインの第２のドメインが、少なくとも約５０個、少なくとも約１
００個、少なくとも約１５０個、少なくとも約２００個、少なくとも約２５０個、少なく
とも約３００個、少なくとも約３５０個、少なくとも約４００個のプロリンおよびアラニ
ンアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる生合成ランダムコイルポリペプチドまたは
ポリペプチドセグメントを含む。本発明に従って、前記「第１のドメインおよび前記「第
２のドメイン」は、天然（すなわち、天然に存在する）タンパク質またはオープンリーデ
ィングフレームなどのような天然に存在するコーディング核酸配列から推定される仮説上
のタンパク質のいずれかには含まれない。
さらに、本発明は、少なくとも約５０個、少なくとも約１００個、少なくとも約１５０
個、少なくとも約２００個、少なくとも約２５０個、少なくとも約３００個、少なくとも
約３５０個、少なくとも約４００個のプロリンおよびアラニンアミノ酸残基からなるアミ
ノ酸配列を含む生合成ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントと、前
記生合成ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントとコンジュゲートし
ている、小分子（単数または複数）、ペプチド（単数または複数）またはタンパク質（単
数または複数）、核酸（単数または複数）、炭水化物（単数または複数）、脂質小胞（単
数または複数）などの生体高分子（単数または複数）などのような薬学的、治療上および
／または医学上有用な分子（単数または複数）とからなる薬物コンジュゲートを提供する
。やはり、本明細書において開示されるコンジュゲートとの関連で、用語「生物学的に活
性な」とは、純粋に生体分子に限定されず、医学上活性な、治療上活性な、薬学的に活性
な分子などを含むということは注目すべきことである。本明細書において提供される手段
および方法は、薬学的使用および医学的使用に制限されず、それだけには限らないが、化
粧品、食品、飲料および栄養技術、油産業、製紙業などを含めたさまざまな技術において
使用され得るということは当業者には明らかである。
化学的に合成されたコポリペプチド（Izuka、同著におけるような）とは対照的に、本
明細書において提供されるランダムコイルポリペプチドは、生合成によって製造される。
本明細書において、用語「生合成の」とは、バイオテクノロジー的方法による（化学的合
成とは対照的に）合成を指す。このようなバイオテクノロジー的方法は、当技術分野で周
知であり、本明細書においてもさらに以下に記載されている。本発明のランダムコイルポ
リペプチドの生合成によって、プロリンおよびアラニン残基の定義された配列、定義され
た長さおよび／またはプロリンおよびアラニン残基の定義された比を有するポリペプチド
の製造が可能となる。さらに、本発明において提供されるポリペプチドは、実質的に純粋
である、すなわち、製造されたポリペプチドは、本質的に均一であり、上記の特徴（すな
わち、定義された配列、定義された長さおよび／または定義されたアミノ酸比）を共有す
る。少なくとも約５０個、特に、少なくとも約１００個、特に、少なくとも約１５０個、
特に、少なくとも約２００個、特に、少なくとも約２５０個、特に、少なくとも約３００
個、特に、少なくとも約３５０個、特に、少なくとも約４００個のプロリンおよびアラニ
ンアミノ酸残基からなるランダムコイルポリペプチドは、本発明に従い、例えば、生物学
的に活性な、異種ポリペプチド／ポリペプチド構築物中に、および／または薬物もしくは
食品コンジュゲート中に、ならびに、それだけには限らないが、製紙業、油産業などのよ
うな、さらなる産業領域において有用なその他のコンジュゲート中に含まれる。
全体として、本発明のポリペプチドの上記の特徴によって、ポリペプチドの安定なラン
ダムコイルの形成が可能となり、これらのランダムコイルポリペプチドは、驚くべき有利
な特性を有する。例えば、本発明のポリペプチドは、水性溶液に完全に可溶性であり、増
大した流体力学的容積を有する。予想外なことに、本明細書に定義されるランダムコイル
ポリペプチドはまた、増大したｉｎ ｖｉｖｏ（イン ビボ）／ｉｎ ｖｉｔｒｏ（イン
ビトロ）安定性を付与できる。これは、特に、医学的適用にとって、例えば、生物学的に
活性なタンパク質または本発明のランダムコイルポリペプチドを含む薬物コンジュゲート
にとって重要である。しかし、本発明のランダムコイルポリペプチドの多数の有利な特性
は、医療分野におけるその使用を可能にするだけでなく、化粧品／美容的処理において、
または栄養および食品技術においてのように、乳業においてまたは食肉加工においてのよ
うにその他の分野においても可能にする。食品産業などにおいて有用なコンジュゲートの
例として、もっぱらプロリンおよびアラニンアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む、
本明細書に開示されるランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントと、例
えば、乳化剤として使用される非イオン性界面活性剤であるポリオキシプロピレンまたは
ポリオキシエチレンポリマーのような、これらの技術において有用である化合物とを含む
コンジュゲートがある。また、生化学的方法における、および紙製造、油回収などといっ
た技術過程における本明細書において定義される生合成ランダムコイルポリペプチドの使
用が、本明細書において予想される。本明細書において提供される（また、前記生合成の
、真のランダムコイルポリペプチドを含む薬物または食品コンジュゲート／構築物のよう
な、本明細書に開示されるコンジュゲートおよび構築物の）もっぱらプロリンおよびアラ
ニン残基からなる生合成ランダムコイルポリペプチドの驚くべき、有利な特徴を以下に詳
細に記載する。さらに、これらの発明の生合成ランダムコイルポリペプチドを使用する例
示的使用および手段および方法を以下に提供する。また、このような生合成ランダムコイ
ルポリペプチドならびに生物学的に活性な、異種ポリペプチドまたはポリペプチド構築物
の、また前記ランダムコイルポリペプチドを含む薬物構築物のような、本明細書に開示さ
れるコンジュゲートおよび構築物を製造するための手段および方法を本明細書において提
供する。
本発明との関連で、驚くべきことに、均一な組成を有するプロリン−アラニンポリマー
／ポリペプチドが安定なランダムコイルコンホメーションを形成することを見出した。ま
た、これはまた、添付の実施例においても実証され、生合成プロリン／アラニン（co）−
ポリマー／ポリペプチドのランダムコイル構造が、円二色性（ＣＤ）分光法によって確認
される。図７に示されるように、確立されたチョウ−ファスマン法（Chou and Fasman (1
974年), Biochemistry 13, 223〜245頁）によっては、プロリンおよびアラニンからなる
ポリマー／ポリペプチド（またはそのセグメント）の１００％のα−ヘリックス二次構造
が予想されるので、このような生合成の、真のランダムコイルポリペプチド／ポリマーを
獲得および使用することは驚くべきことであった。しかし、本明細書において、驚くべき
ことに、均一な組成を有するプロリン−アラニンポリマー／ポリペプチドが安定なランダ
ムコイルコンホメーションを形成することが見いだされ、実験的に示される。これはまた
、添付の実施例においても実証され、プロリン／アラニン（co）−ポリマー／ポリペプチ
ドのランダムコイル構造が、円二色性（ＣＤ）分光法およびサイズ排除クロマトグラフィ
ー（ＳＥＣ）のような実験技術によって確認される。
本発明のポリペプチド／ポリマーとは対照的に、例えば、Izuka (1993年)，同著に記載
される化学合成されたポリペプチドは、任意の／定義されていない、確率的配列および多
様な長さを有する。したがって、化学的に合成されたポリペプチドは、種々のプロリン／
アラニン比、長さなどを有する完全に異なるペプチドの混合物を含む。Izukaにおいて言
及されるように、このような混合物の化学的に合成されたポリペプチドは、ランダムコイ
ルを形成せず（または部分的にしか形成せず）、したがって、以下で本明細書において提
供され、記載される生合成ポリペプチドの有利な特性のいずれも有さない。したがって、
本発明は、本明細書に開示され、とりわけ、もっぱら、プロリンおよびアラニン残基を含
むその配列によって定義される本発明の生合成ランダムコイルポリペプチド/ポリマーを
含む組成物を含み、組成物に関する。特定の一実施形態では、本発明は、１つの構成要素
として、本明細書に開示されるこれらのランダムコイルポリペプチド/ポリマーを含む、
薬物または食品コンジュゲートのようなコンジュゲートに関する。前記組成物中に含まれ
るこれらの発明の生合成ランダムコイルポリペプチド/ポリマーは、一実施形態では、均
一な長さのものである。
上記のように、もっぱら、プロリンおよびアラニン残基からなる本発明の生合成ランダ
ムコイルポリペプチド（またはランダムコイルポリペプチドセグメント）は、予想外なこ
とに、安定なランダムコイルコンホメーションを形成する。本明細書において、用語「ラ
ンダムコイル」とは、概して、アミノ酸ポリマー／アミノ酸配列／ポリペプチドを始めと
するポリマー分子の任意のコンホメーションに関し、前記ポリマー構造を形成する個々の
モノマー要素は、本質的にランダムに、隣接するモノマー要素に向かい、一方で、前記隣
接するモノマー要素と化学的に結合する。特に、「ランダムコイルコンホメーション」を
とる／有する／形成するポリペプチド、アミノ酸配列またはアミノ酸ポリマーは、定義さ
れた二次構造および三次構造を実質的に欠く。本発明のポリペプチドに関連して、ポリマ
ー構造（すなわち、ポリペプチド／アミノ酸配列）を形成するモノマー要素は、プロリン
およびアラニン自体などの単一のアミノ酸またはさらに以下に記載および定義される「ア
ミノ酸リピート」／「アミノ酸カセット」／「カセットリピート」／「ビルディングブロ
ック」／「モジュール」（またはその断片）などのペプチドストレッチのいずれかである
。
ポリペプチドランダムコイルの性質およびその実験的同定方法は、当業者に公知であり
、科学文献（Cantor (1980年) Biophysical Chemistry, 第2版, W. H. Freeman and Comp
any, New York; Creighton (1993年) Proteins - Structures and Molecular Properties
, 第2版, W. H. Freeman and Company, New York; Smith (1996年) Fold Des 1:R95-R106
）に記載されている。本明細書において、用語「セグメント」とは、本明細書において定
義される生合成ランダムコイルポリペプチドの一部を指し、それによって、このような一
部が、本明細書に記載される生合成ランダムコイルポリペプチドの内部の一部であり得る
。例えば、このような「セグメント」は、例えば、本発明のポリペプチドの最初から、お
よび／または最後から１個（または複数個の）アミノ酸が欠失している本明細書に定義さ
れる生合成ランダムコイルポリペプチドであり得る。さらに、このような「セグメント」
は、大きなタンパク質またはポリペプチドの、例えば、生物学的に活性なタンパク質との
融合タンパク質の一部として使用されるか、またはそれを形成し得る。このような「融合
タンパク質」はまた、本発明の異種性の、生物学的に活性なポリペプチド／タンパク質／
ポリペプチド構築物の一例となろう。本明細書において、用語「異種性の」（heterologo
us）とは、本明細書において以下に定義される。
本発明において提供され、本発明との関連で使用されるランダムコイルポリペプチド（
またはそのランダムコイルセグメント）は、例えば、水性溶液中で、または生理学的条件
で、ランダムコイルコンホメーションをとる／形成する。用語「生理学的条件」とは、当
技術分野で公知であり、タンパク質が、通常、その天然の、フォールディングされたコン
ホメーションをとる条件に関する。より詳しくは、用語「生理学的条件」とは、生物物理
学的パラメータに関するが、これは、それらが、通常、高等生物、特に、哺乳動物、最も
好ましくは、ヒトにおいて有効であるからである。用語「生理学的条件」は、生化学的お
よび生物物理学的パラメータに関する場合もあるが、これは、それらが、普通、哺乳動物
の身体（特に、体液において）において、特に、ヒトにおいて見られるからである。前記
「生理学的条件」は、健常な身体において見られる対応するパラメータならびに疾患状態
下で、またはヒト患者において見られるパラメータに関する場合もある。例えば、病気の
哺乳動物またはヒト患者は、前記哺乳動物または前記ヒトが発熱を患っている場合に、高
いが、「生理学的な」温度条件を有し得る。タンパク質がその天然のコンホメーション／
状態をとる「生理学的条件」に関して、最も重要なパラメータは、温度（ヒト身体の３７
℃）、ｐＨ（ヒト血液の７．３５〜７．４５）、モル浸透圧濃度（２８０〜３００ｍｍｏ
ｌ／ｋｇ Ｈ２Ｏ）、必要に応じて、タンパク質含量（６６〜８５ｇ／血清１ｌ）である
。しかし、当業者は、生理学的条件では、これらのパラメータは、変動し得る、例えば、
温度、ｐＨ、モル浸透圧濃度およびタンパク質含量は、所与の身体または組織液、例えば
、血液、脳脊髄液、腹水およびリンパ液において異なり得ることを承知している（Klinke
(2005年) Physiologie, 第5版, Georg Thieme Verlag, Stuttgart）。例えば、脳脊髄液
では、モル浸透圧濃度は、およそ２９０ｍｍｏｌ／ｋｇ Ｈ２Ｏであり得、タンパク質濃
度は、０．１５ｇ／ｌから０．４５ｇ／ｌの間であり得るのに対し、リンパ液では、ｐＨ
は、およそ７．４であり得、タンパク質含量は、３ｇ／ｌから５ｇ／ｌの間であり得る。
以下で本明細書に記載される方法を使用して実験条件下で、ポリペプチド（またはそのセ
グメント）／アミノ酸配列が、ランダムコイルコンホメーションを形成する／とるかどう
かを決定する場合には、温度、ｐＨ、モル浸透圧濃度およびタンパク質含量などの生物物
理学的パラメータは、普通、ｉｎ ｖｉｖｏで見られる生理学的条件とは異なる場合もあ
る。１℃から４２℃の間の温度、好ましくは、４℃から２５℃は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生
理学的条件下でタンパク質の生物物理学的特性および生物学的活性を試験および／または
検証するのに有用であると考えられ得る。
特に、実験設定において（例えば、タンパク質構造の決定における、特に、ＣＤ測定お
よび当業者がタンパク質／アミノ酸ストレッチの構造特性を決定するのを可能にするその
他の方法において）または医薬組成物のバッファー、溶媒および／または賦形剤において
、いくつかのバッファーが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで「生理学的溶液」／「生理学的条件」に
相当すると考えられる。このようなバッファーの例として、例えば、リン酸緩衝生理食塩
水（ＰＢＳ：１１５ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１６ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４
ｐＨ７．４）、Ｔｒｉｓバッファー、酢酸バッファー、クエン酸バッファーまたは添付
の実施例において使用されるものなどの同様のバッファーがある。一般に、「生理学的溶
液条件」に相当するバッファーのｐＨは、６．５から８．５の範囲に、好ましくは、７．
０から８．０の範囲に、最も好ましくは、７．２から７．７の範囲にあるべきであるが、
モル浸透圧濃度は、１０から１０００ｍｍｏｌ／ｋｇ Ｈ２Ｏの範囲に、より好ましくは
、５０から５００ｍｍｏｌ／ｋｇ Ｈ２Ｏの範囲に、最も好ましくは、２００から３５０
ｍｍｏｌ／ｋｇ Ｈ２Ｏの範囲にあるべきである。場合により、生理学的溶液条件に相当
するバッファーのタンパク質含量は、それ自体が生物活性を有するタンパク質を無視して
、０から１００ｇ／ｌの範囲にあり得、通常の安定化タンパク質、例えば、ヒトまたはウ
シ血清アルブミンが使用され得る。
ポリペプチド（またはそのセグメント）が、生理学的条件下でランダムコイルコンホメ
ーションを形成するだけでなく、より一般に、水性溶液中でも形成することが本明細書に
おいて見出された。用語「水性溶液」は、当技術分野で周知である。「水性溶液」は、少
なくとも約２０％の、少なくとも約３０％の、少なくとも約４０％の、少なくとも約５０
％の、少なくとも約６０％の、少なくとも約７０％の、少なくとも約８０％の、または少
なくとも約９０％のＨ２Ｏ（重量／重量）の水（Ｈ２Ｏ）含量を有する溶液であり得る。
したがって、本発明のポリペプチド（またはそのセグメント）は、その他の混和性溶媒を
含有する可能性のある水性溶液中で、またはより広い範囲の温度、ｐＨ値、モル浸透圧濃
度またはタンパク質含量を有する水性分散物中でランダムコイルコンホメーションを形成
し得る。これは、医学療法またはｉｎ ｖｉｖｏ診断以外の、例えば、化粧品、栄養また
は食品技術におけるランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント）の適用に特に
関連する。
したがって、本発明に関連して、本発明のプロリン／アラニン生合成ポリペプチド（ま
たはそのセグメント）のランダムコイルコンホメーションは、液体製剤／生物製剤もしく
は凍結乾燥医薬組成物のような医薬組成物中で、および／または液体製剤／生物製剤もし
くは凍結乾燥医薬組成物のような医薬組成物との関連で維持されることが予想される。こ
れは、本明細書において提供される生物学的に活性な、異種タンパク質またはとりわけ、
本発明のランダムコイルポリペプチド（またはポリペプチドセグメント）を含む薬物コン
ジュゲートとの関連で特に重要である。好ましくは、「生理学的条件」は、相当するバッ
ファー系、溶媒および／または賦形剤において使用されるべきである。しかし、例えば、
凍結乾燥した、または乾燥した組成物（例えば、医薬組成物／生物製剤のような）では、
本明細書において提供されるランダムコイルポリペプチド（またはそのポリペプチドセグ
メント）のランダムコイルコンホメーションが一時的に存在しない、および／または検出
され得ないことが予想される。しかし、前記ランダムコイルポリペプチド（またはポリペ
プチドセグメント）は、相当するバッファー／溶液／賦形剤／溶媒中での再構成後に、ま
たは身体への投与後に、やはり、そのランダムコイルをとる／形成する。ポリペプチド（
またはそのセグメント）が、ランダムコイルコンホメーションを形成する／とるかどうか
を調べる方法は、当技術分野で公知である（Cantor (1980年)同著; Creighton (1993年)
同著; Smith (1996年)同著）。このような方法として、本明細書において以下で例示され
る円二色性（ＣＤ）分光法が挙げられる。ＣＤ分光法は、物質による右および左円偏光の
吸光度の相違が測定される光吸収分光法を表す。およそ１９０から２５０ｎｍの間の波長
を有する遠紫外スペクトルを使用するＣＤ分光法によって、タンパク質の二次構造が決定
され得る。これらの波長では、α−ヘリックス、平行および逆平行β−シートおよびラン
ダムコイルコンホメーションが各々特徴的な形および規模のＣＤスペクトルを生じさせる
ので、ポリペプチドにおいてよく見られる種々の二次構造が分析され得る。したがって、
ＣＤ分光測定を使用することによって、当業者ならば、ポリペプチド（またはそのセグメ
ント）が、水性溶液中で、または生理学的条件でランダムコイルコンホメーションを形成
する／とるかどうかを容易に決定できる。その他の確立された生物物理学的方法として、
核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、吸収分光測定、赤外およびラマン分光法、サイズ排除クロ
マトグラフィーによる流体力学的容積の測定、分析用超遠心分離法または動的／静的光散
乱ならびに摩擦係数または固有粘度の測定が挙げられる（Cantor (1980年)同著; Creight
on (1993年)同著; Smith (1996年)同著）。
上記の実験方法に加えて、タンパク質中の二次構造を予測するための理論的方法が記載
されている。このような理論的方法の一例として、例えば、Ｘ線結晶学を用いて解かれた
既知タンパク質構造に基づいた、α−ヘリックス、β−シートおよびターン中の各アミノ
酸の相対頻度の分析に基づいているチョウ−ファスマン法（Chou and Fasman、同著）が
ある。しかし、タンパク質二次構造の理論的予測は、信頼できないとわかっている。本明
細書において以下に例示されるように、チョウ−ファスマン法に従ってα−ヘリックス二
次構造をとると予想されるアミノ酸配列は、ランダムコイルを形成すると実験的にわかっ
た。したがって、添付の実施例および図面に示されるように、チョウ−ファスマンアルゴ
リズムなどの理論的方法は、所与のポリペプチドがランダムコイルコンホメーションをと
るかどうか限定された予測値しか有さない場合もある。それにもかかわらず、上記の理論
的予測は、所与のポリペプチド／アミノ酸配列の推定二次構造の評価において第１のアプ
ローチであることが多い。ランダムコイル構造の理論的予測はまた、所与のポリペプチド
／アミノ酸配列が、実際にランダムコイルコンホメーションを有するかどうかの、上記の
実験的手段による価値ある検証であり得るということを示すことが多い。
ほとんどのアミノ酸、特に、疎水性アミノ酸のホモポリマーは、普通、水性溶液に不溶
性である（Bamford (1956) Synthetic Polypeptides - Preparation, Structure, and Pr
operties, 第２版, Academic Press, New York）。いくつかの親水性アミノ酸のホモポリ
マーは、Ａｌａの場合には、二次構造、例えば、α−ヘリックスを（Shental-Bechor (20
05年) Biophys J 88:2391〜2402頁）、Ｓｅｒの場合にはβ−シートを（Quadrifoglio (1
968年) J Am Chem Soc 90:2760-2765）形成するのに対し、ポリ−プロリン、最も硬いホ
モオリゴペプチド（Schimmel (1967年) Proc Natl Acad Sci USA 58:52〜59頁）は、水性
溶液中でＩＩ型トランスヘリックスを形成する（Cowan (1955年) Nature 176:501〜503頁
）ことがわかっている。
ポリマー生物物理学の理論的原理を使用すると、２００個のアミノ酸残基の鎖のランダ
ムコイル直径は、ポリ−グリシンの場合には、例えば、
の平均二乗平均平方根末端間距離として、ｎ＝２００、各Ｃα−Ｃα距離の回転可能な結
合の長さｌ＝３．８Åおよびポリ（Ｇｌｙ）の「特性比」Ｃ∞≒２．０を用いて算出され
る約７５Åに達する（Brant (1967年) J Mol Biol 23:47〜65; Creighton, (1993年)同著
）。この関係は、当業者が、ランダム鎖アミノ酸ポリマーの流体力学的容積は、（ａ）長
い鎖長ｌを使用することによってか、または（ｂ）大きな特性比Ｃ∞を示すアミノ酸を使
用することのいずれかによって拡張され得ると予測することを示す。Ｃ∞は、分子のラン
ダム鎖の固有の硬さの尺度であり、ほとんどのアミノ酸について９の一般値を有する（Br
ant (1967年)同著）。側鎖を欠くＧｌｙのみ、およびイミノ酸Ｐｒｏもまた、大幅に小さ
い値を示す。したがって、ＧｌｙおよびＰｒｏ（変性条件下で）は、ランダムコイルタン
パク質の寸法の減少に寄与すると予測される（Miller (1968年) Biochemistry 7:3925〜3
935頁）。したがって、プロリン残基を含むアミノ酸配列は、比較的緻密な流体力学的容
積を有すると予測される。しかし、この教示とは対照的に、本明細書において、プロリン
およびアラニン残基の混合物を含む本発明のアミノ酸ポリマー／ポリペプチドの流体力学
的容積が、予想される流体力学的容積と比較した場合に、分析用ゲル浸透／サイズ排除ク
ロマトグラフィーによって決定される著しく増大した流体力学的容積を有するということ
が示される。実際、各々単独で、定義された二次構造を有するホモオリゴペプチドを形成
する傾向があるこれら２種のアミノ酸（プロリンおよびアラニン）の混合物を含むポリペ
プチドが、生理学的条件下で、ランダムコイルコンホメーションをとることは驚くべきこ
とである。このような本発明のプロリン／アラニンポリペプチドは、同数のＧｌｙ残基を
含むホモポリマーよりも大きな流体力学的半径を有する、例えば、それらは、生物学的に
活性なタンパク質または構築物、すなわち、本発明の生物学的に活性な異種タンパク質ま
たは薬物コンジュゲートに、より良好な可溶性を付与する。
上記のように、本発明の生合成ランダムコイルプロリン／アラニンポリペプチドは、そ
れらが、容易な手段および方法によって、定義された、均一な長さをとり得る点で、化学
的に合成されたポリペプチドとは異なる。先行技術は、ペプチドの長さの点で膨大な変動
を有するポリペプチドの混合物／組成物を提供するのに対し、本発明は、定義された長さ
を有する生合成ランダムコイルポリペプチドの混合物／組成物を提供し得る。好ましくは
、このような混合物／組成物中に含まれる本発明の本質的にすべてのポリペプチドは、同
一の定義された長さを有し、ひいては、同一の生化学的特徴を共有する。このような均一
な組成物は、生合成ランダムコイルポリペプチドが使用され得る、種々の医学的適用、化
粧品適用、栄養的適用において、より有利である。さらに、特に、医学的または薬学的関
連では、少なくとも約５０個、特に、少なくとも約１００個、特に、少なくとも約１５０
個、特に、少なくとも約２００個、特に、少なくとも約２５０個、特に、少なくとも約３
００個、特に、少なくとも約３５０個、特に、少なくとも約４００個のプロリンおよびア
ラニンアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む、本明細書において定義される生合成ラ
ンダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントはまた、損なわれた血漿状態、
例えば、損傷、火傷、手術後などと結びついている、および／または関連している障害の
予防、寛解および／または治療においても使用され得る。したがって、前記生合成ランダ
ムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントの１つの医学的使用は、血漿増補液
としての使用である。しかし、本明細書に同様に記載される本発明に従って、薬物コンジ
ュゲートおよび異種ポリペプチドまたは異種ポリペプチド構築物は、損なわれた血漿量ま
たは血漿内容物と関連する障害の、または損なわれた血液容積と関連する障害の医学的ま
たは薬学的介入との関連で使用され得るということは注目すべきことである。
したがって、本発明は、一実施形態では、特に、異種タンパク質／ポリペプチド／ポリ
ペプチド構築物中に、または薬物コンジュゲート中に含まれる場合の、もっぱら、少なく
とも約５０個のプロリンおよびアラニンアミノ酸残基、少なくとも約１００個のプロリン
およびアラニンアミノ酸残基、少なくとも約１５０個のプロリンおよびアラニンアミノ酸
残基または少なくとも約２００個のプロリンおよびアラニン残基からなるアミノ酸配列を
含む生合成ランダムポリペプチド（またはそのセグメント）に関する。本発明はまた、少
なくとも約２００個のプロリンおよびアラニンアミノ酸残基、さらにより好ましくは、少
なくとも約３００個のプロリンおよびアラニンアミノ酸残基、特に好ましくは、少なくと
も約４００個のプロリンおよびアラニンアミノ酸残基、より特に好ましくは、少なくとも
約５００個のプロリンおよびアラニンアミノ酸残基、最も好ましくは、もっぱら少なくと
も約６００個のプロリンおよびアラニンアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む生合成
のランダムコイルポリペプチドに関する。ランダムコイルコンホメーションを形成するア
ミノ酸配列は、最大で、約３０００個のプロリンおよびアラニンアミノ酸残基、最大で、
約２０００個のプロリンおよびアラニンアミノ酸残基、最大で、約１５００個のプロリン
およびアラニンアミノ酸残基、最大で、約１２００個のプロリンおよびアラニンアミノ酸
残基、最大で、約８００個のプロリンおよびアラニンアミノ酸残基からなり得る。したが
って、プロリン／アラニンアミノ酸配列ストレッチは、約５０、約１００、約１５０、約
２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約５００、約６００、約７００、約
８００、約９００〜約３０００個のプロリンおよびアラニンアミノ酸残基からなり得る。
特定の実施形態では、本発明の生合成アミノ酸配列は、約２００〜約３０００個のプロリ
ンおよびアラニン残基、約２００〜約２５００個のプロリンおよびアラニン残基、約２０
０〜約２０００個のプロリンおよびアラニン残基、約２００〜約１５００個のプロリンお
よびアラニン残基、約２００〜約１０００個のプロリンおよびアラニン残基、約３００〜
約３０００個のプロリンおよびアラニン残基、約３００〜約２５００個のプロリンおよび
アラニン残基、約３００〜約２０００個のプロリンおよびアラニン残基、約３００〜約１
５００個のプロリンおよびアラニン残基、約３００〜約１０００個のプロリンおよびアラ
ニン残基、約４００〜約３０００個のプロリンおよびアラニン残基、約４００〜約２５０
０個のプロリンおよびアラニン残基、約４００〜約２０００個のプロリンおよびアラニン
残基、約４００〜約１５００個のプロリンおよびアラニン残基、約４００〜約１０００個
のプロリンおよびアラニン残基、約５００〜約３０００個のプロリンおよびアラニン残基
、約５００〜約２５００個のプロリンおよびアラニン残基、約５００〜約２０００個のプ
ロリンおよびアラニン残基、約５００〜約１５００個のプロリンおよびアラニン残基、約
５００〜約１０００個のプロリンおよびアラニン残基、約６００〜約３０００個のプロリ
ンおよびアラニン残基、約６００〜約２５００個のプロリンおよびアラニン残基、約６０
０〜約２０００個のプロリンおよびアラニン残基、約６００〜約１５００個のプロリンお
よびアラニン残基、約６００〜約１０００個のプロリンおよびアラニン残基、約７００〜
約３０００個のプロリンおよびアラニン残基、約７００〜約２５００個のプロリンおよび
アラニン残基、約７００〜約２０００個のプロリンおよびアラニン残基、約７００〜約１
５００個のプロリンおよびアラニン残基、約７００〜約１０００個のプロリンおよびアラ
ニン残基、約８００〜約３０００個のプロリンおよびアラニン残基、約８００〜約２５０
０個のプロリンおよびアラニン残基、約８００〜約２０００個のプロリンおよびアラニン
残基、約８００〜約１５００個のプロリンおよびアラニン残基、約８００〜約１０００個
のプロリンおよびアラニン残基を含む。本発明の内容から明らかなように、同様に大きな
生合成アミノ酸配列（本質的に、プロリンおよびアラニンからなる）は、本発明の範囲内
にあり、少なくとも２つのドメインの１つのドメインとして、前記生物学的活性を有する
、および／または媒介するアミノ酸配列と、少なくとも２つのドメインのもう１つのドメ
インとして、少なくとも約５０個のプロリンおよびアラニンアミノ酸残基、少なくとも約
１００個のプロリンおよびアラニンアミノ酸残基、少なくとも約１５０個のプロリンおよ
びアラニンアミノ酸残基、少なくとも約２００個の、少なくとも約２５０個の、少なくと
も約３００個の、少なくとも約３５０個の、少なくとも約４００個のプロリンおよびアラ
ニンアミノ酸残基からなる生合成ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメ
ントを含む、本明細書において定義される生物学的に活性なタンパク質またはタンパク質
構築物において容易に使用され得る。このような生合成ランダムコイルポリペプチドまた
はポリペプチドセグメントは、異種タンパク質／タンパク質構築物の生合成ランダムコイ
ル部分に対応する。これらの生合成プロリン／アラニンストレッチは、最大で、約３００
０個のプロリンおよびアラニンアミノ酸残基からなる。これらのアミノ酸配列（プロリン
／アラニンストレッチ）は、以下にさらに説明されるように、主な、独特の残基としてプ
ロリンおよびアラニンを含む。
ランダムコイルコンホメーションを形成する／とる／有するのは、もっぱらプロリン（
Ｐ）およびアラニン（Ａ）アミノ酸残基からなる本明細書において定義される生合成アミ
ノ酸配列であると想定される。最も簡単な場合には、生合成ポリペプチドまたはポリペプ
チドセグメントは、本明細書において定義されるランダムコイルコンホメーションを有す
るアミノ酸配列からなる。しかし、生合成ポリペプチド（またはそのセグメント）は、ラ
ンダムコイルコンホメーションを形成する／とる／有する本明細書において記載されるア
ミノ酸配列に加えて、ランダムコイルコンホメーションの形成に寄与しない、またはそれ
自体でランダムコイルコンホメーションを形成する／とる／有することができない、さら
なるアミノ酸配列／アミノ酸残基を含み得る。本発明の主旨から逸脱することなく（defe
rring）、同様に、このような生合成ポリペプチド（またはそのセグメント）もまた、生
合成「ランダムコイル」ポリペプチドまたはポリペプチドセグメントである。さらなるア
ミノ酸配列／アミノ酸残基は、例えば、リンカーとして有用である。生合成ランダムコイ
ルポリペプチドの、とりわけ、二量体、三量体、すなわち、一般に、多量体もまた、本発
明との関連で想定され、このような多量体は、ランダムコイルコンホメーションを形成し
ないアミノ酸配列／残基によって連結され得る。このようなランダムコイルポリペプチド
を含み得るタンパク質の一例として、本明細書において定義されるプロリンおよびアラニ
ンアミノ酸残基からなるランダムコイルポリペプチドに加えて、生物活性を有する／媒介
する、さらに別のポリペプチドを含む、本明細書において提供される生物学的に活性なタ
ンパク質がある。やはり、このような構築物も、本明細書に記載される、異種の、生物学
的に活性なタンパク質またはポリペプチド構築物であり得る。
用語「少なくとも約５０／１００／１５０／２００／３００／４００／５００／６００
／７００／８００個／などのアミノ酸残基」は、アミノ酸残基の簡潔な数に制限されるの
ではなく、１０％〜２０％のような約１〜２０％のさらなる残基または約１０％〜２０％
のような約１〜２０％少ない残基のいずれかを含むアミノ酸ストレッチも含む。例えば、
「少なくとも約１００個のアミノ酸残基」はまた、本発明の主旨から逸脱することなく（
deferring）、約８０〜１００個および約１００〜１２０個のアミノ酸残基を含み得る。
例えば、「少なくとも約２００個のアミノ酸残基」はまた、本発明の主旨から逸脱するこ
となく（deferring）、約１６０〜２００個および約２００〜２４０個のアミノ酸残基を
含み得る。本明細書において上記で与えられた定義および説明はまた、用語「最大で、約
３０００／２０００／１５００／１２００／８００個のアミノ酸残基」などについて準用
する。したがって、用語「約」とは、より長いアミノ酸配列（例えば、最大で、３０００
個のアミノ酸残基を含むか、またはからなるアミノ酸配列）との関連で、アミノ酸残基の
簡潔な数に限定または制限されない。したがって、用語「最大で、約３０００／２０００
／１５００／１２００／８００個のアミノ酸残基」は、本発明から逸脱することなく（de
ferring）さらなる１０％〜２０％の残基または１０％〜２０％少ない残基も含むアミノ
酸ストレッチも含み得る。
さらに、生合成ランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント）は、アミノ酸残
基の、特に、主な構成要素プロリンおよびアラニンの、定義された含量または比を特徴と
する。上記のように、本発明は、もっぱらプロリンおよびアラニンアミノ酸残基からなる
アミノ酸配列を含む、生合成ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメント
に関し、前記アミノ酸配列は、特に、異種の、生物学的に活性なタンパク質／タンパク質
構築物／ポリペプチドまたは薬物コンジュゲート中に含まれる場合に、少なくとも約５０
個、少なくとも約１００個、少なくとも約１５０個、少なくとも約２００個、少なくとも
約２５０個、少なくとも約３００個、少なくとも約３５０個、少なくとも約４００個のプ
ロリン（Ｐｒｏ）およびアラニン（Ａｌａ）アミノ酸残基からなる。本明細書において、
用語「もっぱら」（solely）とは、好ましくは、アミノ酸の少なくとも約９０％または少
なくとも約９５％が、プロリンおよびアラニンであり、それによって、プロリンおよびア
ラニンが大部分を構成するが、唯一のアミノ酸残基ではない場合もあり、すなわち、これ
らの本発明のアミノ酸配列は、必ずしも１００％プロリンおよびアラニンアミノ酸ストレ
ッチではないということを意味する。したがって、本発明の生合成ポリペプチド／アミノ
酸配列はまた、アミノ酸配列がランダムコイルコンホメーションを形成する／とる／有す
る限り、少量の構成要素として、プロリンおよびアラニン以外のアミノ酸を含み得る。こ
のようなランダムコイルコンホメーションは、本明細書において提供される手段および方
法によって容易に決定され得る。したがって、同様に、用語「もっぱら」との関連で、少
量（約１０％未満または約５％未満）のその他のアミノ酸残基が含まれ得る。前記「その
他の」、少量のアミノ酸残基は、本明細書において以下に定義される。
したがって、本発明は、一実施形態では、生合成ランダムコイルポリペプチド（または
そのセグメント）に関し、それによって、アミノ酸配列は、主に、プロリンおよびアラニ
ンからなり、ここで、プロリン残基は、アミノ酸配列の約１０％超、７５％未満を構成す
る。アラニン残基は、前記アミノ酸配列（またはアミノ酸配列からなる場合には、ランダ
ムコイルポリペプチドもしくはポリペプチドセグメント）の残りの少なくとも２５％〜９
０％を含む。
好ましくは、アミノ酸配列は、約１０％超、好ましくは、約１２％超、さらにより好ま
しくは、約１４％超、特に好ましくは、約１８％超、より特に好ましくは、約２０％超、
さらにより特に好ましくは、約２２％、２３％または２４％超、最も好ましくは、約２５
％超のプロリン残基を含む。アミノ酸配列は、好ましくは、約７５％未満、より好ましく
は、７０％、６５％、６０％、５５％または５０％未満のプロリン残基を含み、ここで、
より低い値が好ましい。さらにより好ましくは、アミノ酸配列は、約４８％、４６％、４
４％、４２％未満のプロリン残基を含む。特に好ましいのもとして、約４１％、４０％、
３９％、３８％、３７％または３６％未満のプロリン残基を含むアミノ酸配列があり、こ
れによっては、より小さい値が好ましい。最も好ましくは、アミノ酸配列は、約３５％未
満のプロリン残基を含む；また、本明細書において以下に提供されるＰＡ構築物も参照の
こと。
逆もまた同様に、アミノ酸配列は、好ましくは、約９０％未満、より好ましくは、８８
％、８６％、８４％、８２％または８０％未満のアラニン残基を含み、より小さい値が好
ましい。さらにより好ましくは、アミノ酸配列は、約７９％、７８％、７７％、７６％未
満のアラニン残基を含み、これによっては、より小さい値が好ましい。最も好ましくは、
アミノ酸配列は、約７５％未満のアラニン残基を含む。
また、約２５％超、好ましくは、約３０％超、さらにより好ましくは、約３５％超、特
に好ましくは、約４０％超、より特に好ましくは、約４５％または５０％超、さらにより
特に好ましくは、約５２％、５４％、５６％、５８％または５９％超のアラニン残基を含
むアミノ酸配列も本明細書において好ましく、ここでは、より大きい値が好ましい。さら
により好ましくは、アミノ酸配列は、約６０％、６１％、６２％、６３％または６４％超
のアラニン残基を含み、最も好ましくは、約６５％超のアラニン残基を含む。
したがって、ランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント）は、約２５％のプ
ロリン残基と、約７５％のアラニン残基からなるアミノ酸配列を含み得る。あるいは、ラ
ンダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント）は、約３５％のプロリン残基と、約
６５％のアラニン残基からなるアミノ酸配列を含み得る。上記の本明細書において、用語
「約Ｘ％」とは、パーセンテージの簡潔な数に制限されるのではなく、さらなる１０％〜
２０％または１０％〜２０％少ない残基の値も含む。例えば、用語１０％はまた、それぞ
れ、１１％または１２％ならびに９％および８％にも関する。
しかし、上記および下記にさらに詳細に記載されるように、前記ランダムコイルポリペ
プチド（またはポリペプチドセグメント）、特に、アミノ酸配列は、少量の構成要素とし
て、プロリンおよびアラニンとは異なるさらなるアミノ酸を含み得る。上記で本明細書に
おいてすでに論じたように、前記少量の構成要素（単数および複数）、すなわち、プロリ
ンまたはアラニン以外のアミノ酸は、本発明の生合成ランダムコイルポリペプチド／ポリ
マーの約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、
約４％未満、約４％未満、約３％未満または約２％未満を含み得る。
当業者ならば、前記アミノ酸配列／ポリペプチド（ポリペプチドセグメント）中に少量
の構成要素として、プロリンおよびアラニン以外の残基が含まれる場合にも、アミノ酸配
列／ポリペプチド（またはそのセグメント）はまた、ランダムコイルコンホメーションを
形成し得るということは承知している。本明細書において、用語「少量の構成要素」とは
、本発明の生合成ランダムコイルポリペプチド／本発明のポリマー中、最大で５％または
最大で１０％のアミノ酸残基が、プロリンまたはアラニンとは異なることを意味する。こ
れは、１００個のアミノ酸のうち最大で１０個が、プロリンおよびアラニンとは異なり得
る、好ましくは、最大で８％、すなわち、１００個のアミノ酸のうち最大で８個が、プロ
リンおよびアラニンとはとは異なり得る、より好ましくは、最大で６％、すなわち、１０
０個のアミノ酸のうち最大で６個が、プロリンおよびアラニンとはとは異なり得る、さら
により好ましくは、最大で５％、すなわち、１００個のアミノ酸のうち最大で５個が、プ
ロリンおよびアラニンとはとは異なり得る、特に好ましくは、最大で４％、すなわち、１
００個のアミノ酸のうち最大で４個が、プロリンおよびアラニンとはとは異なり得る、よ
り特に好ましくは、最大で３％、すなわち、１００個のアミノ酸のうち最大で３個が、プ
ロリンおよびアラニンとはとは異なり得る、さらにより特に好ましくは、最大２％、すな
わち、１００個のアミノ酸のうち最大で２個が、プロリンおよびアラニンとはとは異なり
得る、最も好ましくは、最大で１％、すなわち、ランダムコイルポリペプチド（またはそ
のセグメント）中に含まれる１００個のアミノ酸のうち最大で１個が、プロリンおよびア
ラニンとはとは異なり得ることを意味する。前記プロリンおよびアラニンとは異なるアミ
ノ酸は、翻訳後修飾されたアミノ酸または非天然アミノ酸を含めた（例えば、Budisa (20
04年) Angew Chem Int Ed Engl 43:6426〜6463頁またはYoung (2010年) J Biol Chem 285
:11039〜11044頁参照のこと）、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇ
ｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒおよ
びＶａｌからなる群から選択され得る。生合成ランダムコイルポリペプチド／構築物／ポ
リマー（またはそのフラグメント）の「少量の構成要素」（すなわち、プロリンおよびア
ラニン以外のアミノ酸）が、「その他のアミノ酸」／「異なるアミノ酸」Ｓｅｒ（単数ま
たは複数）を含む場合には、前記Ｓｅｒアミノ酸（単数または複数）は、これらの（少量
の）アミノ酸残基の、好ましくは、５０％未満、より好ましくは、４０％未満、３０％未
満、２０％未満または１０％未満を構成する。最も好ましい実施形態では、本明細書に記
載される生合成ランダムコイルポリペプチド／構築物／ポリマーまたは（例えば）本明細
書に記載される融合タンパク質のランダムコイルポリペプチド部分は、セリン残基（単数
または複数）を含まない。概して、これらの「少量の」アミノ酸（プロリンおよびアラニ
ン以外）は、本明細書において記載される本明細書において提供される生合成ランダムコ
イルポリペプチド／構築物／ポリマーまたは（例えば）融合タンパク質のランダムコイル
ポリペプチド部分中に存在しないことが本明細書において好ましい。本発明にしたがって
、生合成ランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント）／アミノ酸配列は、特に
、プロリンおよびアラニンアミノ酸残基のみからなり得る（すなわち、ランダムコイルポ
リペプチド中またはアミノ酸配列中にその他のアミノ酸残基は存在しない）。
上記が、ランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント）中に含まれるアミノ酸
配列の全長およびプロリン／アラニン含量に関するのに対して、以下は、より詳細に、特
定の、例示的アミノ酸配列（またはその断片）に関する。
一実施形態では、例えば、水性溶液中または生理学的条件下で、ランダムコイルコンホ
メーション（本明細書において定義されるランダムコイルポリペプチドまたはそのセグメ
ント）をとるアミノ酸配列／ポリペプチドは、複数の「アミノ酸リピート」／「アミノ酸
カセット」／「カセットリピート」を含む場合があり、ここで、前記「アミノ酸リピート
」／「アミノ酸カセット」／「カセットリピート」／「ビルディングブロック」／「モジ
ュール」（これらの用語は、本明細書において交換可能に使用される）は、主に、または
排他的に、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）およびアラニン（Ａｌａ、Ａ）アミノ酸残基（本明細
書において、「ＰＡ」として、または「ＡＰ」として表される）からなり、ここで、６個
以下の連続したアミノ酸残基が同一である。例示的「ビルディングブロック」は、例えば
、「ＡＰ」であり、これはまた、本発明の機能的生合成ランダムコイルドメインとして添
付の例示的実施例において提供されている。この例示的実施例は、ＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰ
ＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰ（配列番号５１）、すなわち、「ポリＰＡ」「アミノ酸リピート」
／「アミノ酸カセット」／「カセットリピート」の形態でも提供される、配列「Ｐ１Ａ１
」である。好ましい実施形態では、上記の定義された「アミノ酸リピート」／「アミノ酸
カセット」／「カセットリピート」などを含むアミノ酸配列／ポリペプチドは、５以下の
同一の連続したアミノ酸残基を含む。その他の代替実施形態は、例示される、個々のビル
ディングブロックとの関連で本明細書において以下に提供される。
本発明のランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント）内で、アミノ酸リピー
トは、同一である場合も、同一でない場合もある。プロリンおよびアラニン残基からなる
「アミノ酸リピート」、「ビルディングブロック」、「モジュール」、「リピート」、「
アミノ酸カセット」などの限定されない例が、本明細書において以下に提供される；例え
ば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および
配列番号５１参照のこと（同封の配列表はまた、このような「リピート」／「モジュール
」などをコードする例示的核酸配列も含む。ともにファイルされた前記配列表中の添付の
配列は、本明細書および説明の一部を構成する）。また、これらの配列の（同一な、およ
び／または同一でない）断片の使用が、本明細書において想定され、それによっては、「
断片」は、少なくとも２個のアミノ酸を含み、少なくとも１個のプロリンおよび／または
アラニン、好ましくは、少なくとも１個のプロリンおよび１個のアラニンを含む。ランダ
ムコイルポリペプチド（またはそのセグメント）の作製のために本発明に従って使用され
るこれらの配列の「断片」は、前記配列番号１、２、３、４、５、６および５１（ここで
、配列番号５１が、例示的「ＡＰ」または「ＰＡ」リピートからなることは注目すべきこ
とである）からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも３個、好ましくは、少な
くとも４個、より好ましくは、少なくとも５個、さらにより好ましくは、少なくとも６個
、なおより好ましくは、少なくとも８個、特に好ましくは、少なくとも１０個、より特に
好ましくは、少なくとも１２個、さらにより特に好ましくは、少なくとも１４個、なおよ
り特に好ましくは、少なくとも１６個、最も好ましくは、少なくとも１８個の連続したア
ミノ酸からなり得る。
本明細書において与えられる教示に基づいて、当業者は、例えば、水性条件下または生
理学的条件下でランダムコイルコンホメーションを形成し、本明細書において定義される
ように、主にプロリンおよびアラニンから構成される、さらなるアミノ酸配列／ポリペプ
チドを容易に作製することができる。本明細書において定義されるランダムコイルポリペ
プチド（またはそのセグメント）のビルディングブロックまたはモジュールとして使用さ
れる、ランダムコイルコンホメーションを形成するアミノ酸配列／ポリペプチドのさらな
る例は、とりわけ、上記で示される特定の「ビルディングブロック」「ポリマーカセット
」または「ポリマーリピート」の組合せおよび／もしくは断片または環状に順序を変えら
れたものを含み得る。したがって、ランダムコイルポリペプチド／アミノ酸配列の例示さ
れたモジュール／配列ユニット／ポリマーリピート／ポリマーカセットはまた、本発明に
従うさらなるモジュール／配列ユニット／ポリマーリピート／ポリマーカセットを形成す
るよう新規に組合され得る個々の断片を提供し得る。
用語「モジュール（単数または複数）」、「配列ユニット（単数または複数）」、「ポ
リマーリピート（単数または複数）」、「ポリマーカセット（単数または複数）」および
「ビルディングブロック（単数または複数）は、本明細書において同義語として使用され
、本明細書において定義されるランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント）／
アミノ酸配列を形成するよう使用され得る個々のアミノ酸ストレッチに関する。
アミノ酸リピート（本発明の生合成ランダムコイルポリペプチドの「ビルディングブロ
ック」などとして使用される）は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１
、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、
２５、２６、２７、２８、２９、３０個以上のアミノ酸残基からなり得、各リピートは、
プロリンおよびアラニン残基（単数または複数）を含む。しかし、添付の配列番号５１に
示されるように、前記「ビルディングブロック」はまた、単に、２個の本明細書において
提供されるアミノ酸残基ＰおよびＡ、すなわち、「ＰＡ」または「ＡＰ」の形態のものか
らなる場合もある。一実施形態では、本発明のアミノ酸リピートは、５０個を超えるアミ
ノ酸残基を含まない。しかし、当業者には、このような「リピート」は、例えば、前記発
明の生合成ランダムコイルポリペプチド／ポリマーが、約、例えば、１００個超のアミノ
酸、約１５０個超のアミノ酸、約２００個超のアミノ酸などを含む場合には、５０個を超
えるアミノ酸残基でさえ含み得るということは明らかである。したがって、このような「
リピート」中に含まれる最大量のアミノ酸残基は、本明細書において提供される生合成ポ
リペプチド（またはそのセグメント）／ポリマーの全長によって調節される。
しかし、上記のリピートなどを含む生合成ランダムコイルポリペプチド／アミノ酸配列
は、好ましくは、本明細書において上記で定義され、説明された全長および／またはプロ
リン／アラニン含量を有するべきである、すなわち、約５０個、約１００個、約１５０個
、約２００個、約２５０個、約３００個、約３５０個、約４００個〜約３０００個のアミ
ノ酸からなり、および／または、約１０％を超え、約７５％未満のプロリン残基を含むと
いうことは注目すべきことである。これに関連して上記の本明細書において与えられるす
べての定義はまた、ここで準用する。
本明細書において詳細に論じられるように、上記の本明細書において提供されるように
、本発明は、薬学的設定、医学的設定および／または医薬的設定において特に有用である
、生物学的に活性な、異種タンパク質（単数または複数）またはタンパク質構築物（単数
または複数）を提供する。これらの生物学的に活性な、異種タンパク質／タンパク質構築
物は、前記少なくとも２つのドメインの少なくとも１つのドメインとして、もっぱら、プ
ロリンおよびアラニン残基からなるアミノ酸配列を含むランダムコイルポリペプチドまた
はポリペプチドセグメントを含み、前記アミノ酸配列は、約５０個、約１００個、約１５
０個、約２００個、約２５０個、約３００個、約３５０個、約４００個〜約３０００個の
プロリン（Ｐｒｏ）およびアラニン（Ａｌａ）残基からなる。
本明細書において開示される生物学的に活性な、異種タンパク質、ポリペプチドまたは
タンパク質構築物との関連で、用語「異種」とは、前記タンパク質、ポリペプチドまたは
タンパク質構築物内の少なくとも２つのドメインに関し、前記少なくとも２つのドメイン
の第１のものは、定義された生物活性を付与し、有し、および／または媒介し、前記少な
くとも２つのドメインの第２のものは、もっぱら、プロリンおよびアラニンアミノ酸残基
からなる生合成ランダムコイルポリペプチドを含み、これによっては、前記少なくとも２
つのドメインは、天然には互いに機能しうる形で連結されているとは見られず、天然には
単一のコーディング核酸配列（オープンリーディングフレームのような）によってコード
されない。本明細書において提供され、本発明の生物学的に活性な、異種タンパク質／タ
ンパク質構築物において使用される、もっぱら、プロリンおよびアラニンアミノ酸残基か
らなる生合成ランダムコイルポリペプチド／ポリペプチドセグメントは、さらに（化学的
に）修飾されていないことが好ましい。例えば、それらは、グリコシル化もヒドロキシル
化もされていないことが好ましい。
特定の天然に存在するタンパク質または天然に見られる配列決定された核酸ストレッチ
から推定される仮説上のタンパク質は、プロリンおよびアラニンの相対的に高い（すなわ
ち、平均を上回る）含量を含むと記載されることは注目すべきことである。例えば、リー
シュマニア大型株Ｆｒｉｅｄｌｉｎの相同な仮説上のタンパク質が記載されている（Iven
s (2005年) Science 309, 436〜442頁。）。１５１４個のコドントリプレットを含む開示
されたリーディングフレームは、２４０個のＡｌａ、１３２個のＰｒｏ、３４個のＬｙｓ
および４個のＶａｌコドンから構成される４１２個のトリプレットのストレッチを含む。
生理学的バッファー条件下で正荷電のＬｙｓ残基は、この配列中にほとんど均等に分布し
ており、これは、可溶性効果を示唆する。しかし、本明細書における開示内容から明らか
であるように、平均よりも高いプロリンおよびアラニン含量を含む、天然に存在する核酸
分子またはオープンリーディングフレームから推定されるこのような相同な仮説上のタン
パク質は、本発明の一部ではない。本発明は、医学的／薬学的関連において特に有用であ
る、単離された方法で天然には生じない、もっぱら、プロリンおよびアラニン残基からな
るアミノ酸配列を含む、かなり大きなランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセ
グメントが提供される（ここで、前記アミノ酸配列は、約５０個、約１００個、約１５０
個、約２００個、約２５０個、約３００個、約３５０個、約４００個〜約３０００個のプ
ロリン（Ｐｒｏ）およびアラニン（Ａｌａ）残基からなる）という事実に基づいている。
単離された方法で天然には生じない、本明細書において記載される単離された生合成ラン
ダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントはまた、薬学的、医学的および／
または医薬的設定において特に有用である、本明細書において開示される生物学的に活性
な、異種タンパク質（単数または複数）またはタンパク質構築物（単数または複数）中に
含まれる。これらの生物学的に活性な、異種タンパク質／タンパク質構築物は、前記少な
くとも２つのドメインの少なくとも１つのドメインとして、もっぱら、プロリンおよびア
ラニン残基からなるアミノ酸配列を含むランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチド
セグメントを含み、前記アミノ酸配列は、約５０個、約１００個、約１５０個、約２００
個、約２５０個、約３００個、約３５０個、約４００個〜約３０００個のプロリン（Ｐｒ
ｏ）およびアラニン（Ａｌａ）残基からなる。
また、アラビノガラクタンタンパク質（ＡＧＰ）、Ｐｒｏリッチタンパク質およびエク
ステンシンは、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）リッチ糖タンパク質（ＨＲＧＰ）としても
知られ、植物界中で発現されている糖タンパク質の大きな群に属する。Ａｌａ−Ｐｒｏリ
ピート（ＡＰ）５１を含む１つのこのようなＡＧＰモチーフは、トランスジェニックシロ
イヌナズナにおいてＮ末端シグナル配列およびＣ末端緑色蛍光タンパク質を有する合成糖
モジュールペプチドとして発現され、プロリルヒドロキシラーゼおよびその後のヒドロキ
シプロリン残基のＯ−グリコシル化の基質として調べられた（Estevez (2006年) Plant P
hysiol. 142, 458〜470頁）。やはり、水分子と水素結合を形成し得る、開示されたヒド
ロキシル化および／またはグリコシル化Ｐｒｏ側鎖は、可溶化効果を有すると思われる。
本明細書において記載される「（少なくとも）１つのドメインとして、もっぱら、プロ
リンおよびアラニン残基からなるアミノ酸配列を含む生合成ランダムコイルポリペプチド
またはペプチドセグメントを含む、生物学的に活性なタンパク質またはタンパク質構築物
」とは、天然には普通生じず、したがって、「異種」であるタンパク質またはタンパク質
構築物に関するということは注目すべきことである。さらに、植物界において記載される
プロリンリッチ配列とは対照的に、本明細書において記載される生合成ランダムコイルポ
リペプチド/ポリペプチドセグメントは、化学的に修飾されていないことが好ましい、す
なわち、それらは、グリコシル化またはヒドロキシル化されていないことが好ましい。
本発明の生合成ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントの特定の利
点は、その内因的に親水性であるが、無電荷の特性である。したがって、本明細書におい
て記載される生合成ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドストレッチ中の「少
量の」アミノ酸（プロリンおよびアラニン以外）として、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅ
ｔ、Ｐｈｅ、ＴｙｒもしくはＴｒｐのような疎水性側鎖を有さないアミノ酸および／また
はＬｙｓ、Ａｒｇ、ＡｓｐもしくはＧｌｕのような荷電を有する側鎖を有さないアミノ酸
が好ましい。本発明に従って、（それにもかかわらず、このような個々のアミノ酸が、本
発明の生合成ランダムコイルポリペプチド／ポリペプチドセグメント中に含まれる場合に
は）本明細書において定義される生合成ランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメ
ント）内の、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＴｙｒもしくはＴｒｐのような
疎水性側鎖を有する個々のアミノ酸各々および／またはＬｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｐもしくは
Ｇｌｕのような荷電を有する側鎖を有する個々のアミノ酸各々の全含量は、８％、７％、
６％、５％、４％、３％、２％または１％を超えないということが想定される。
本発明の生合成ランダムコイルポリペプチド／アミノ酸配列は、配列（Ｐｒｏ）ｘ−（
Ａｌａ）ｙ（式中、ｘは、１〜好ましくは、１５、より好ましくは、１〜１０、さらによ
り好ましくは、１〜５の整数値を有し得、ｙは、１〜好ましくは、１５、より好ましくは
、１〜１０、さらにより好ましくは、１〜５を有し得、ｘおよびｙは、その後のブロック
間で変わり得る）の組み合わされたプロリン／アラニンストレッチを含む個々のブロック
のコンカテマー（concatamer）を含み得る。前記ｘおよびｙはまた、１、２、３、４、５
、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５の整数であり得る。
水性溶液中または生理学的条件下で、ランダムコイルコンホメーションを形成するアミ
ノ酸配列／ポリペプチドは、式（Ｉ）：
［ＰｒｏｘＡｌａｙ］ｎ
［式中、ｘは、独立に、整数１〜５から選択される］
を有し得る。さらに、各ｎについて、ｙは、独立に、整数１〜５から選択される。ｎは、
最終的に、ランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント）／アミノ酸配列が、好
ましくは、少なくとも約５０個、少なくとも約１００個、少なくとも約１５０個、少なく
とも約２００個、少なくとも約２５０個、少なくとも約３００個、少なくとも約３５０個
、少なくとも約４００個のアミノ酸残基および最大約３０００個のアミノ酸残基からなる
という条件で、任意の整数である。また、これに関連して、上記のコンカテマーを含むか
、上記の式（Ｉ）を有するポリペプチド／アミノ酸配列は、好ましくは、本明細書におい
て上記で定義され、説明された全長および／またはプロリン／アラニン含量を有する、す
なわち、約５０個、約１００個、約１５０個、約２００個、約２５０個、約３００個、約
３５０個、約４００個〜約３０００個のアミノ酸からなる、および／または約１０％超お
よび約７５％未満のプロリン残基を含むはずであるということは注目すべきことである。
やはり、これに関連して上記の本明細書において与えられるすべての定義はまた、ここで
準用する。
本発明はまた、ＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡ（配列番号１）；ＡＡＰＡ
ＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰ（配列番号２）；ＡＡＡＰＡＡＡＰＡＡＡＰＡＡＡＰ
ＡＡＡＰ（例えば、［Ｐｒｏ１Ａｌａ３］５である配列番号３）；ＡＡＰＡＡＰＡＡＰＡ
ＡＰＡＡＰＡＡＰＡＡＰＡＡＰ（配列番号４）；ＡＰＡＡＡＰＡＰＡＡＡＰＡＰＡＡＡＰ
ＡＰＡＡＡＰ（配列番号５）；ＡＡＡＰＡＡＰＡＡＰＰＡＡＡＡＰＡＡＰＡＡＰＰＡ（配
列番号６）およびＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰ（例えば、［Ｐｒｏ１Ａｌ
ａ１］１０である配列番号５１）またはこれらの配列の全体または一部としてのこれらの
配列の環状に順序を変えられたものまたは多量体（単数または複数）からなる群から選択
されるアミノ酸ストレッチを含むランダムコイルポリペプチド（ポリペプチドセグメント
（単数または複数））／アミノ酸配列に関する。したがって、ランダムコイルポリペプチ
ド（そのポリペプチドセグメント（単数または複数））／アミノ酸配列は、得られる生合
成ランダムコイルポリペプチドが、もっぱら、プロリンおよびアラニンアミノ酸残基から
なり、前記アミノ酸配列が、少なくとも５０個のプロリン（Ｐｒｏ）およびアラニン（Ａ
ｌａ）アミノ酸残基からなる限り、アミノ酸ストレッチＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡ
ＰＡＡＰＡ（配列番号１）、ＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡ（配列番号１）
；ＡＡＰＡＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰ（配列番号２）；ＡＡＡＰＡＡＡＰＡＡＡ
ＰＡＡＡＰＡＡＡＰ（配列番号３）；ＡＡＰＡＡＰＡＡＰＡＡＰＡＡＰＡＡＰＡＡＰＡＡ
Ｐ（配列番号４）；ＡＰＡＡＡＰＡＰＡＡＡＰＡＰＡＡＡＰＡＰＡＡＡＰ（配列番号５）
；ＡＡＡＰＡＡＰＡＡＰＰＡＡＡＡＰＡＡＰＡＡＰＰＡ（配列番号６）およびＡＰＡＰＡ
ＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰ（配列番号５１）、ならびにこれらのモチーフの組合せ
またはこのモチーフの断片および部分の組合せを含み得る。
また、上記のアミノ酸配列の環状に順序を変えられたものも、本発明において使用され
得る。例えば、ＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡ（配列番号１）の例示的な環
状に順序を変えられたものは、第１のアラニンを除去することおよび上記の配列の末端に
別のアラニンを付加することによって容易に作製され得る。配列番号１のこのような環状
に順序を変えられたものは、ＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡＰＡＰＡＡＰＡＡ（配列番号７）
となる。さらに、配列番号１の環状に順序を変えられたものの限定されない例として、以
下：
などがある。本発明の教示に基づいて、当業者ならば、配列番号２、配列番号３、配列番
号４、配列番号５、配列番号６および配列番号５１に示されるアミノ酸ストレッチの対応
する環状に順序を変えられたものを容易に作製することができる（前記配列番号５１は「
ＡＰ」リピートに完全に基づいており、環状に順序を変えられたものは、「ＰＡ」または
「ＡＰ」リピート／ビルディングブロックに完全に基づいたものであり得る）。
このような環状に順序を変えられたものはまた、本明細書に従って使用され得る、本明
細書において提供されたポリペプチド／アミノ酸配列のさらなる「モジュール／「ビルデ
ィングブロック」などの例と考えられ得る。
当業者には、本明細書において提供されたアミノ酸ストレッチの「モジュール」および
（より短い）断片または環状に順序を変えられたものは、本明細書において定義されるラ
ンダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント）／アミノ酸配列の「モジュール」、
「リピート」および／またはビルディングブロックとして使用され得るということは明ら
かである。
上記に従って、ランダムコイルコンホメーションを形成するランダムコイルポリペプチ
ド／アミノ酸配列は、上記のアミノ酸ストレッチ（またはその環状に順序を変えられたも
のもしくはその断片）、好ましくは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４
、配列番号５、配列番号６および配列番号５１に示されるもののいずれかの多量体を含み
得る。これらの配列は、本発明との関連で、決して制限的ではないということは注目すべ
きことである。
やはり、上記のアミノ酸ストレッチ（またはその断片）、環状に順序を変えられたもの
（またはその断片）を含むポリペプチド／アミノ酸配列は、好ましくは、本明細書におい
て上記で定義され、説明された全長および／またはプロリン／アラニン含量を有する、す
なわち、約５０個、約１００個、約１５０個、約２００個、約２５０個、約３００個、約
３５０個、約４００〜約３０００個のアミノ酸からなり、および／または約１０％超およ
び約７５％未満のプロリン残基を含むはずである。これに関連して上記の本明細書におい
て与えられるすべての定義はまた、ここで準用する。また、用語「断片」は、上記に定義
されている。
上記のように、本発明との関連で、本明細書において提供される生合成ランダムコイル
ポリペプチド（またはポリペプチドセグメント）／ポリマーは、比較的大きい流体力学的
容積を特徴とするということを驚くべきことに見出した。この、見かけの大きさとも呼ば
れる、流体力学的容積は、分析用ゲル濾過（サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＥＣとし
ても知られる）によって容易に決定され得る。好ましくは、ランダムコイルポリペプチド
（またはそのセグメント）は、少なくとも１０ｋＤａ、好ましくは、少なくとも２５ｋＤ
ａ、より好ましくは、少なくとも５０ｋＤａ、さらにより好ましくは、少なくとも１００
ｋＤａ、特に好ましくは、少なくとも２００ｋＤａ、最も好ましくは、少なくとも４００
ｋＤａの見かけの大きさを有する。当業者ならば、特定のタンパク質の流体力学的容積を
容易に決定できる。このような方法は、本明細書において以下に例示される、動的／静的
光散乱、分析用超遠心分離法または分析用ゲル濾過を含み得る。分析用ゲル濾過は、高分
子の流体力学的容積を測定するための当技術分野で公知の方法に相当する。あるいは、球
状ポリペプチドの流体力学的容積は、その分子量によって推定され得る（Creighton (199
3年)同著）。本明細書において記載されるように、好ましくは、少なくとも約５０個、少
なくとも約１００個、少なくとも約１５０個、少なくとも約２００個、少なくとも約２５
０個、少なくとも約３００個、少なくとも約３５０個、少なくとも約４００〜約３０００
個のプロリンおよびアラニンアミノ酸残基からなり、ランダムコイルコンホメーションを
有する本発明のポリペプチドの流体力学的容積は、予想外なことに、対応するフォールデ
ィングされた、球状タンパク質について、分子量に基づいて推定される流体力学的容積と
の関連で高い値を示す。以下は、本発明の好ましい実施形態に相当する、とりわけ、本明
細書において上記で記載され、定義される生合成ランダムコイルポリペプチド（またはそ
のセグメント）を含む、生物学的に活性な、異種タンパク質またはタンパク質構築物に関
する。理論に拘束されるものではないが、驚くべきことに、本発明との関連で、本明細書
において提供され、もっぱら、プロリンおよびアラニンからなる生合成ランダムコイルポ
リペプチドストレッチは、同じ総数のアミノ酸残基を有するが、もっぱら、プロリン、ア
ラニンおよびセリンからなる対応する生合成ランダムコイルストレッチ（ＷＯ２００８／
１５５１３４において提供されるような）よりも大きい流体力学的容積をさらに提供する
ことを見出した。
血清アルブミン（ＨＳＡ）およびヒト化抗体をはじめとする免疫グロブリン（Ｉｇ）な
どの一般的なヒト血漿タンパク質は、一般に、２〜３週間の長い半減期を示し、これは、
新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との特異的相互作用に起因し、エンドソーム再利用につな
がる（Ghetie (2002年) Immunol Res, 25:97〜113頁）。対照的に、薬学的に注目される
ほとんどのその他のタンパク質、特に、組換え抗体断片、ホルモン、インターフェロンな
どは、迅速な（血液）クリアランスに悩まされている。これは、特に、その大きさが、約
７０ｋＤａの腎臓濾過の閾値未満であるタンパク質に当てはまる（Caliceti (2003年) Ad
v Drug Deliv Rev 55:1261〜1277頁）。これらの場合には、修飾されていない薬剤タンパ
ク質の血漿半減期は、１時間より大幅に少ないものであり得、これが、ほとんどの治療的
適用にとって本質的に役に立たないものにしている。必要な投薬間隔が数日または数週間
にさえ延長された、持続した薬理作用およびまた改善された患者コンプライアンスを達成
するために、生物薬剤開発を目的として、いくつかの戦略がこれまでに確立された。
第１に、天然血漿タンパク質の再利用機序が、ＩｇのＦｃ部分との融合タンパク質、例
えば、エンブレル（登録商標）、ＴＮＦα受容体の細胞外ドメインとヒトＩｇＧ１間のハ
イブリッド（Goldenberg (1999年) Clin Ther 21:75〜87頁）または血清アルブミンとの
融合タンパク質、例えば、アルブフェロン（登録商標）（アルブインターフェロンα−２
ｂ、ＺＡＬＢＩＮ（商標）、ＪＯＵＬＦＥＲＯＮ（登録商標））、ＩＦＮαのＨＳＡとの
対応する融合物（Osborn (2002年) J Pharmacol Exp Ther 303:540〜548頁）を製造する
ことによって使用された。６００μＭのその高い血漿濃度を有するアルブミンもまた、例
えば、連鎖球菌プロテインＧに由来する細菌アルブミン−結合ドメイン（ＡＢＤ）との（
Makrides (1996年) J Pharmacol Exp Ther 277:534〜542頁）、またはファージディスプ
レイライブラリーからＨＳＡに対して選択されたペプチドとの（Dennis (2002年) J Biol
Chem, 277:35035〜35043頁;Nguyen (2006年) Protein Eng Des Sel 19:291〜297頁）融
合によるアルブミン−結合機能を備えている生物薬剤の担体媒体として働き、間接的な方
法で利用されている。
第２に、生物薬剤の血漿半減期を延長するための根本的に異なる方法論として、高度に
溶媒和され、生理学的に不活性の化学的ポリマーとコンジュゲートし、ひいては、およそ
３〜５ｎｍの糸球体の孔径を超えて治療タンパク質の流体力学的半径を効果的に拡大する
ことがある（Caliceti (2003)同著）。Ｌｙｓ側鎖を介して無作為に（Clark (1996年) J
Biol Chem 271:21969〜21977頁）か、または特別に誘導されたＣｙｓ残基によって（Rose
ndahl (2005年) BioProcess International:52〜60頁）のいずれかによる、ポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）の活性化された誘導体との生化学的に穏やかな条件下での共有結合
は、中程度に成功しており、現在、いくつかの承認薬において適用されている。対応する
利点は、特に、特定の薬理活性を有する小タンパク質、例えば、Pegasys（登録商標）、
化学的にＰＥＧ化された組換えＩＦＮａ−２ａと併用して達成されている（Harris (2003
年) Nat Rev Drug Discov, 2:214〜221頁;Walsh (2003年) Nat Biotechnol 21:865〜870
頁）。
しかし、生物学的に活性なタンパク質の合成ポリマーとの化学的結合は、生物薬剤開発
および製造に関して不利点を有する。適したＰＥＧ誘導体は、特に、高純度が必要とされ
、組換えタンパク質とのそのコンジュゲーションが、さらなるｉｎ ｖｉｔｒｏ処理およ
び精製ステップを必要とし、これが、収率を低下させ、製造コストを上げるので、高価で
ある。実際、ＰＥＧは、アルデヒドおよびペルオキシドが混入していることが多く（Ray
(1985年) Anal Biochem 146:307〜312頁）、酸素の存在下での保存の際に内因的に化学的
分解する傾向がある。また、治療タンパク質の薬学的機能は、その生化学的に活性な部位
の近くにあるアミノ酸側鎖が、ＰＥＧ化プロセスによって修飾されたものになる場合には
、妨害され得る。さらに、合成ポリマーとの化学的結合は、普通、ｉｎ ｖｉｖｏ 活性
の実質的な不一致を示し得る分子の異種の混合物をもたらす。
第３に、新規Ｎ結合型グリコシル化コンセンサス配列が導入されている、生物学的に活
性なタンパク質のグリコシル化類似体の使用が、血漿半減期を延長するために提案されて
いる；ＷＯ０２／０２５９７；Perlman (2003年) J Clin Endocrinol Metab 88:2327〜23
35頁;またはElliott (2003年) Nat Biotechnol 21:414〜420頁）参照のこと。しかし、記
載される糖質工学的に操作されたタンパク質は、変更されたｉｎ ｖｉｖｏ活性を示し、
これは、新規糖質側鎖が、操作されたタンパク質の生物活性に影響を及ぼすことを示す。
さらに、さらなる糖質側鎖は、得られた生物学的に活性な分子の抗原性を高める可能性が
高く、これによって、実質的な安全性の懸念を生じさせる。さらに、トリパノソーマクル
ージ（Trypanosoma cruzi）由来人工反復配列PSTADを含む融合タンパク質は、トランスシ
アリダーゼの血漿半減期の延長を誘導すると報告されている（Alvarez (2004年) JBC 279
:3375〜3381頁）。しかし、このようなトリパノソーマクルージ（Trypanosoma cruzi）由
来リピートは、体液性免疫応答を誘導すると報告されている（Alvarez (2004年)同著）。
したがって、生物学的に活性なタンパク質の作用を延長するための代替戦略が望まれる。
本明細書において開示され、本発明に従う、もっぱら、プロリンおよびアラニンからな
る生合成アミノ酸配列／ポリペプチドは、驚くべきことに、特に、生理学的条件下でラン
ダムコイルコンホメーションをとるとわかった。したがって、それらは、本明細書におい
て以下に定義される生物学的に活性なタンパク質（単数または複数）／ポリペプチド（単
数または複数）の「第２のドメイン」、すなわち、生理学的条件下で、ランダムコイルコ
ンホメーションを形成し、それによって、生物学的に活性な（「機能的」）タンパク質（
単数または複数）またはポリペプチド（単数または複数）に増大したｉｎ ｖｉｖｏおよ
び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性を、特に、増大した血漿半減期を媒介するポリペプチ
ドストレッチを含むものを提供するのに有利な分子である。前記ランダムコイルドメイン
に融合されている機能的タンパク質の流体力学的容積は、本明細書に記載される標準法を
使用することによって推定され得るように著しく増大される。ランダムコイルドメインは
、生物学的に活性なタンパク質の第１のドメインの生物活性を干渉しないと考えられるの
で、それが融合されている注目される機能的タンパク質によって媒介される生物活性は、
本質的に保存される。さらに、本明細書において開示されるランダムコイルドメインを形
成するアミノ酸ポリマー／ポリペプチドは、生物学的に広範に不活性であり、特に、血漿
におけるタンパク質分解、免疫原性、等電点／静電的挙動、細胞表面受容体との結合なら
びに内部移行に関して不活性であるが、依然として生分解性であり、このことが、ＰＥＧ
などの合成ポリマーを上回る明確な利点を提供すると考えられる。
上記に従って、本発明は、本明細書において記載される生合成ランダムコイルポリペプ
チドを含む生物学的に活性なタンパク質に関する。本明細書において記載される生合成ラ
ンダムコイルポリペプチドを含むこのような生物学的に活性なタンパク質／タンパク質構
築物は、異種の、生物学的に活性なタンパク質／タンパク質構築物である。特に、少なく
とも２つのドメインを含むか、または少なくとも２つのドメインからなり、
（ａ）前記少なくとも２つのドメインの第１のドメインが、前記生物活性を有するおよ
び／または媒介するアミノ酸配列を含むか、または前記生物活性を有するおよび／または
媒介するアミノ酸配列からなり；
（ｂ）前記少なくとも２つのドメインの第２のドメインが、本明細書において記載され
、定義されたランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントを含むか、また
は本明細書において記載され、定義されたランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチ
ドセグメントからなる、
生物学的に活性な異種タンパク質（単数または複数）もまた本明細書において開示される
。
本発明において、「第１のドメイン」および前記「第２のドメイン」が、同一のタンパ
ク質内には天然に存在しないタンパク質ストレッチまたは天然に見られるようなコーディ
ング核酸配列（オープンリーディングフレームのような）によってコードされるような同
一の仮説上のタンパク質の一部であると予想されないタンパク質ストレッチに関すること
は注目すべきことである。
ランダムコイルポリペプチドまたはそのポリペプチドセグメントとの関連で、本明細書
において上記で与えられた定義および説明は、前記ランダムコイルポリペプチド（または
そのポリペプチドセグメント（単数または複数））を含む生物学的に活性なタンパク質と
の関連で準用する。
好ましくは、前記ランダムコイルコンホメーションは、ｉｎ ｖｉｖｏおよび／または
生体サンプルにおける、または生理学的環境におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性のような、
前記生物学的に活性なタンパク質の増大したｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ安定性を媒介する。
例えば、本明細書において、水性溶液中または生理学的条件下でランダムコイルコンホ
メーションをとる、本明細書において定義された、さらなる「第２のドメイン」を含むタ
ンパク質（例えば、約２００または約４００または約６００個のアミノ酸残基からなり、
「ビルディングブロック」として、ＰＡ番号１／配列番号１、ＰＡ番号２／配列番号２、
ＰＡ番号３／配列番号３、ＰＡ番号４／配列番号４、ＰＡ番号５／配列番号５、ＰＡ番号
６／配列番号６および／またはＰ１Ａ１／配列番号５１を含むポリマー）は、ｉｎ ｖｉ
ｖｏでさえ（特に、静脈内に投与された場合に）、前記ランダムコイルコンホメーション
を欠く対照と比較して、有利な血清安定性または血漿半減期を有するということが想定さ
れる。
ＷＯ２００８／１５５１３４（本明細書において上記で論じられる）では、ランダムコ
イルコンホメーションをとるアミノ酸配列を有するドメインを含む生物学的に活性なタン
パク質は、増大したｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性を有すること
が示されている。ＷＯ２００８／１５５１３４に開示されたランダムコイルドメインは、
特に、プロリン、アラニンおよびセリン（ＰＡＳ）残基からなる。これら３種の残基の存
在は、水性溶液における安定で可溶性のランダムコイルの形成の必要不可欠な条件として
この先行技術文書に記載されている。
本発明の明細書において上記で序文において論じられるように、ＷＯ２００７／１０３
５１５には、主な構成要素として、多種多様なアミノ酸、とりわけ、グリシン、アスパラ
ギン酸、アラニン、セリン、トレオニン、グルタミン酸およびプロリンを含む、構築され
ていない組換えポリマーが記載されている。しかし、用語「構築されていない組換えポリ
マー」は、用語「生合成の」および「ランダムコイル」とは対照的に、認識される明確な
意味を有さない。
ＷＯ２００６／０８１２４９も本明細書において上記で記載される。この文書には、Ｇ
ｌｙ、ＡｓｎおよびＧｌｎを主要な構成要素として、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、
Ｇｌｕ、ＨｉｓおよびＡｓｎを少量の構成要素として有するアミノ酸リピートの２〜５０
０のユニットを含むポリペプチドにカップリングされている生物学的に活性なタンパク質
を含むタンパク質コンジュゲートが記載されている。前記タンパク質コンジュゲートは、
コンジュゲートされていない生物学的に活性なタンパク質と比較した場合に、増大または
減少した血漿半減期のいずれかを有すると記載されている。しかし、ＷＯ２００６／０８
１２４９は、特定のアミノ酸リピートが、コンジュゲートの血漿半減期を減少または増強
するかどうかを予測するための教示は全く提供しない。さらに、ＷＯ２００６／０８１２
４９は、コンジュゲートされたタンパク質が、本発明において示されるようにランダムコ
イルコンホメーションを形成するアミノ酸リピートを含む場合に、タンパク質の血漿半減
期が増大され得ることを教示または示唆しない。さらに、ＷＯ２００６／０８１２４９に
開示されるアミノ酸リピートは、もっぱら、プロリンおよびアラニンアミノ酸残基からな
るアミノ酸配列を含む本発明の生合成ランダムコイルポリペプチドとは明確に対照的であ
る、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＧｌｎから選択される少なくとも２個の残基を含む。
驚くべきことに、先行技術とは対照的に、もっぱら、プロリンおよびアラニン残基を含
む（すなわち、好ましくは、実質的な量の任意のその他のアミノ酸を、実質的な量のセリ
ンも、またはセリンを全く含まない）、本明細書において提供される生合成ランダムコイ
ルアミノ酸配列はまた、有用なランダムコイル構造を形成することが本明細書において見
出された。これは、セリンおよびアラニン（ＳＡ）残基のみから構成される、すなわち、
プロリン残基が省略されているドメインとの融合タンパク質のＷＯ２００８／１５５１３
４における開示内容が、２種のアミノ酸のみを含むこのようなドメインが、ランダムコイ
ルを形成しなかったが、β−シート構造を形成することを示すことを考えると、特に予想
外である。これらのセリン−アラニンドメインはまた、「ＰＡＳ」を用いて、または特に
、本明細書において提供された「Ｐ／Ａ」配列を用いて観察されたような増大した流体力
学的容積も示さなかった。
本明細書において、用語「生物活性」は、生物に対する物質の生物学的効果を説明する
。したがって、本明細書において、用語「生物学的に活性なタンパク質」は、前記タンパ
ク質またはポリペプチドに曝露されている生存している細胞／生物において生物学的効果
を誘導できるタンパク質に関する。しかし、本発明に関連して、用語「生物学的に活性な
タンパク質」は、前記生物活性を有する、および／または媒介するアミノ酸配列（前記第
１のドメイン）およびランダムコイルコンホメーションをとり／形成し、もっぱら、プロ
リンおよびアラニンからなる本発明のアミノ酸配列（前記第２のドメイン）の両方を含む
本発明の全タンパク質に関することは注目すべきことである。
したがって、本明細書において、用語「生物活性を有する、および／または媒介するア
ミノ酸配列」または「生物活性を有するアミノ酸配列」は、上記で定義された「生物活性
」を媒介するか、もしくは有する、または媒介できるか、もしくは有することができる、
本発明の生物学的に活性なタンパク質の上記で定義された「第１のドメイン」。その半減
期が、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで、延長される必要がある、任
意の注目されるタンパク質（およびその機能的断片、例えば、抗体断片、膜受容体の細胞
外または細胞内ドメイン（単数または複数）を含む断片、増殖因子またはサイトカインの
末端切断型など）も、用語「生物活性を有する、および／または媒介するアミノ酸配列」
または「生物活性を有するアミノ酸配列」中に含まれる。本発明の一実施形態では、本発
明において生物活性を有する、および／または媒介するアミノ酸配列は、任意の「注目さ
れるタンパク質」、すなわち、任意の薬学的または生物学的に注目されるタンパク質また
は任意の治療薬／診断薬として有用であるタンパク質から推定され得る。
したがって、生物学的に活性なタンパク質は、天然産生されたポリペプチドまたは組換
えＤＮＡ技術によって製造されたポリペプチドに由来する生物学的に活性なアミノ酸配列
を含む第１のドメインを含み得る。好ましい実施形態では、注目されるタンパク質は、結
合タンパク質／結合分子、免疫グロブリン、抗体断片、輸送タンパク質、膜受容体、シグ
ナル伝達タンパク質／サイトカイン、増殖因子、ホルモンまたは酵素などのペプチドなど
からなる群から選択され得る。
本明細書において上記で説明されるように、生物学的に活性なタンパク質の第２のドメ
イン中に含まれるランダムコイルポリペプチド（またはポリペプチドセグメント）は、特
に、生理学的条件下でランダムコイルコンホメーションを形成する。これは、対象または
患者に投与される予定である医薬組成物の一部を形成し得る生物学的に活性なタンパク質
との関連で特に関連する。
特にｉｎ ｖｉｖｏで、およぼ医学的介入を必要とする哺乳動物またはヒト患者に投与
された場合に、生物学的に活性なタンパク質の本発明の生合成ランダムコイルドメイン（
前記「第２のドメイン」）が、自然に（すなわち、生理学的条件下で）、ランダムコイル
コンホメーションをとる／形成する／有することは注目すべきことである。対照的に、天
然コンホメーションとして非ランダムな二次構造および／または三次構造を有するタンパ
ク質は、非生理学的条件下（すなわち、変性条件下）でランダムコイルコンホメーション
をとる傾向があるということは、当技術分野で公知である。しかし、このような変性タン
パク質は、本発明のランダムコイルポリペプチドを含む生物学的に活性なタンパク質と比
較して、完全に異なる特徴を有する。したがって、「生物学的に活性なタンパク質」およ
び本明細書において提供される融合タンパク質／融合構築物の生物学的に活性な一部は、
本発明の生合成ランダムコイルポリペプチド（またはポリペプチドセグメント）と組み合
わされ、および／または連結された場合に、その生物学的機能を維持することが本発明の
主旨である。
さらに、ランダムコイルポリペプチド（またはポリペプチドセグメント）は、生理学的
条件下で溶解性を保持する。したがって、本発明のタンパク質構築物（上記の定義された
「第１の」および「第２のドメイン」を含む）が、一過性にまたは一時的にランダムコイ
ルコンホメーションにはない、例えば、凍結乾燥物または乾燥組成物のような特定の組成
物の形態にある場合に、「第２の」、ランダムコイルを形成する／とるドメインを含み得
ることも想定される。しかし、本発明のタンパク質構築物のこのような「第２のドメイン
」は、例えば、対応するバッファー（好ましくは、「生理学的」バッファー／賦形剤およ
び／または溶媒）における再構成後に、本明細書において定義されるランダムコイルコン
ホメーションをやはりとることが重要である。前記「第２のドメイン」は、（必要に応じ
て、対応する再構成後に）本発明の生物学的に活性なタンパク質の増大したｉｎ ｖｉｖ
ｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性を媒介できる。本明細書において、本明細書に
おいて定義される「第２のドメイン」は、本発明のランダムコイルポリペプチド（または
ポリペプチドセグメント）からなることが好ましい。
本明細書において、用語「ドメイン」は、特定の構造および／または機能を自律的にと
ることができるアミノ酸配列の任意の領域／部分に関する。したがって、本発明に関連し
て、「ドメイン」は、機能ドメインまたは構造ドメインに相当し得る。本明細書に記載さ
れるように、本発明のタンパク質は、生物活性を有する、および／または媒介する少なく
とも１つのドメイン／部分およびランダムコイルコンホメーションを形成する少なくとも
１つのドメイン／部分を含む。しかし、本発明のタンパク質はまた、３以上のドメインか
らなる場合もあり、例えば、本明細書において定義される２つのドメイン／部分または例
えば、プロテアーゼ感受性切断部位、Ｈｉｓ６−タグまたはＳｔｒｅｐ−タグなどの親和
性タグ、シグナルペプチド、保持ペプチド、膜転移ペプチドのようなターゲッティングペ
プチドまたは抗腫瘍毒素もしくはプロドラッグ活性化のための酵素と関連している腫瘍タ
ーゲッティングのための抗体断片のようなさらなるエフェクタードメインなどのような別
のドメイン／部分間にさらなるリンカーまたはスペーサー構造を含み得る。
別の実施形態では、本発明の生物学的に活性なタンパク質は、少なくとも５０ｋＤａ、
好ましくは、少なくとも７０ｋＤａ、より好ましくは、少なくとも８０ｋＤａ、さらによ
り好ましくは、少なくとも１００ｋＤａ、特に好ましくは、少なくとも１２５ｋＤａ、最
も好ましくは、少なくとも１５０ｋＤａの分析用ゲル濾過（サイズ排除クロマトグラフィ
ー、ＳＥＣとしても知られる）によって決定される流体力学的容積を有する。当業者なら
ば、特定のタンパク質の流体力学的容積を容易に決定できる。本明細書において上記で、
ランダムコイルポリペプチドとの関連で例示的方法が記載されている。当業者ならば、同
様に、本発明の生物学的に活性なタンパク質との関連で、このような方法を容易に適合さ
せることができる。本明細書において以下に記載されるように、上記で定義された第２の
ドメイン、すなわち、本明細書において提供されたランダムコイルポリペプチド（または
そのセグメント）を含むまたは本明細書において提供されたランダムコイルポリペプチド
（またはそのセグメント）からなるドメインを含む本発明の生物学的に活性なタンパク質
の流体力学的容積は、対応するフォールディングされた、球状タンパク質について、その
分子量またはアミノ酸残基の数／組成に基づいて推定される流体力学的容積との関連で、
予想外に大きい流体力学的容積を有すると示される。
「生物活性を有する、および／または媒介するアミノ酸配列」を含む第１のドメインは
また、別のポリペプチドまたはアミノ酸配列との関連で、または別のポリペプチドまたは
アミノ酸配列との会合後に、その生物活性を身につけることは注目すべきである。例えば
、抗腫瘍抗体ハーセプチンの１種などの抗体のＦａｂ断片（Eigenbrot (1993年) J. Mol.
Biol. 229:969〜995頁）は、２種の異なるポリペプチド鎖、免疫グロブリン軽鎖および
免疫グロブリン重鎖の断片からなり、これは、鎖間ジスルフィド結合（単数または複数）
によってさらに連結され得る。本発明に従って、それらの鎖の一方をランダムコイルポリ
ペプチド（またはポリペプチドセグメント）と連結し（例えば、遺伝子融合によって）、
一方で、全生物学的に活性なタンパク質がもう一方の鎖との会合によって再構成されるこ
とは十分であり得る。このような再構成は、例えば、添付の実施例に記載される同一の宿
主細胞における、異なるポリペプチド（一方では、一方の鎖およびランダムコイルポリペ
プチドの融合タンパク質、もう一方では、もう一方の鎖）の同時発現によって、または例
えば、再フォールディングプロトコールの一部としてのｉｎ ｖｉｔｒｏでの再構成によ
って達成され得る。
したがって、同様にこのようなタンパク質（２つの（tow）別個のポリペプチド鎖を含
む）は、本発明に従う生物学的に活性なタンパク質と考えられる。このような場合には、
本明細書に定義される第１のドメインは、非共有結合によってのみ連結されている２つの
別個のポリペプチド鎖を含み得る。さらに、生物学的に活性なタンパク質／ドメインの独
立した鎖が、各々、ランダムコイルポリペプチド（またはポリペプチドセグメント）と連
結され得る。抗体断片に加え、いくつかの関連ポリペプチド鎖から構成され、本発明の対
象である、注目される多数のその他のホモ−またはヘテロ−オリゴマータンパク質がある
（例えば、インスリン、ヘモグロビンなど）。
本明細書において、用語「結合タンパク質」とは、潜在的な結合パートナー（単数また
は複数）と特異的に相互作用でき、その結果、前記複数の種々の分子のプールから、潜在
的結合パートナー（単数または複数）として前記潜在的結合パートナー（単数または複数
）のみが結合されるか、著しく結合される程度に、前記潜在的結合パートナー（単数また
は複数）として前記潜在的結合パートナー（単数または複数）と複数の種々の分子との間
を区別できる分子に関する。結合タンパク質と潜在的結合パートナー間の結合を測定する
ための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、ＥＬＩＳＡ、等温滴定熱量測定法、平
衡透析、プルダウンアッセイ、表面プラズモン共鳴またはＢｉａｃｏｒｅ装置を使用する
ことによって日常的に実施され得る。本発明に関連して有用である例示的結合タンパク質
／結合分子として、それだけには限らないが、抗体、抗体断片、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ
（ａｂ’）２断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、抗体の単離可変領域（ＶＬおよび／ま
たはＶＨ領域）、ＣＤＲ、単一ドメイン抗体／免疫グロブリン、ＣＤＲ由来ペプチドミメ
ティック、レクチン、免疫グロブリンドメイン、フィブロネクチンドメイン、プロテイン
Ａドメイン、ＳＨ３ドメイン、アンキリンリピートドメイン、リポカリンまたは例えば、
Skerra (2000年) J Mol Recognit 13:167〜187頁、Gebauer (2009年) Curr Opin Chem Bi
ol 13:245〜255頁、Binz (2005年) Nat Biotechnol 23:1257〜1268頁またはNelson (2009
年) Nat Biotechnol 27:331〜337頁に記載される種々の種類のスキャフォールド由来結合
タンパク質が挙げられる。
本発明に関連して有用である、その他の例示的な注目される生物学的に活性なタンパク
質（特に、第１のドメイン中に含まれるタンパク質、または生物学的に活性なタンパク質
の第１のドメインを構成する／であるタンパク質）として、それだけには限らないが、顆
粒球コロニー刺激因子、ヒト成長ホルモン、α−インターフェロン、β−インターフェロ
ン、γ−インターフェロン、λ−インターフェロン、腫瘍壊死因子、エリスロポエチン、
凝固因子ＶＩＩＩ、凝固因子ＶＩＩａ、凝固因子ＩＸなどの凝固因子、ｇｐ１２０／ｇｐ
１６０、可溶性腫瘍壊死因子ＩおよびＩＩ受容体、レテプラーゼなどの血栓溶解薬、ＧＬ
Ｐ−１またはエキセンディン−４などの代謝効果を有するペプチド、インターロイキン−
１受容体アンタゴニストまたはアナキンラのような免疫抑制／免疫調節性タンパク質、イ
ンターロイキン−２および好中球ゼラチナーゼ関連リポカリンまたはその他の天然もしく
は操作されたリポカリンまたは例えば、Walsh (2003年) Nat Biotechnol 21:865〜870頁
もしくはWalsh (2004年) Eur J Pharm Biopharm 58:185〜196頁に列挙される、またはｈ
ｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｐｈａｒｍａ．ｃｏｍ／ａｐｐｒｏｖａｌｓ．ｈｔｍｌもし
くはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａなどのオンラインデータベースに列
挙されるタンパク質もしくは化合物が挙げられる。本発明との関連で使用され得る、さら
なる生物学的に活性なタンパク質（特に、第１のドメイン中に含まれるタンパク質、また
は生物学的に活性なタンパク質の第１のドメインを構成する／であるタンパク質）として
、とりわけ、卵胞刺激ホルモン、グルコセレブロシダーゼ、チモシンα１、グルカゴン、
ソマトスタチン、アデノシンデアミナーゼ、インターロイキン１１、ヘマタイド、レプチ
ン、インターロイキン−２０、インターロイキン−２２受容体サブユニットα（ＩＬ−２
２ｒａ）、インターロイキン−２２、ヒアルロニダーゼ、線維芽細胞増殖因子１８、線維
芽細胞増殖因子２１、グルカゴン様ペプチド１、オステオプロテジュリン、ＩＬ−１８結
合タンパク質、成長ホルモン放出因子、可溶性ＴＡＣＩ受容体、トロンボスポンジン−１
、可溶性ＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ−１、α−ガラクトシダーゼＡ、ミオスタチンアンタゴニ
スト、胃抑制ポリペプチド、α−１アンチトリプシン、ＩＬ−４ムテインなどがある。本
明細書における開示内容から明らかとなろうが、本発明はまた、生合成ランダムコイルプ
ロリン／アラニンポリペプチドまたはプロリン／アラニンポリペプチドセグメントおよび
小分子、ペプチドまたはタンパク質、核酸、炭水化物、脂質小胞などといった生体高分子
のような薬学的にまたは医学的に有用な分子を含むことに関し、結合タンパク質／結合分
子、免疫グロブリン、抗体断片、輸送タンパク質、膜受容体、シグナル伝達タンパク質／
ペプチド、サイトカイン、成長因子、ホルモンまたは酵素などのような（それに制限され
ないが）特に薬学的にまたは医学的に有用なタンパク質が本明細書において定義される薬
物構築物に含まれ得るが（ｂｔｕ）、それらはまた、前記定義された少なくとも２つのド
メインを含むまたはからなる、本明細書において定義される生物学的に活性な、異種タン
パク質の一部でもあり得る。このような場合には、前記特定の薬学的にまたは医学上有用
なタンパク質（またはその機能的断片）は、前記生物学的活性を有する、および／または
媒介するアミノ酸配列を含む、またはからなる前記少なくとも２つのドメインの「第１の
ドメイン」であり得る。これに関連して、機能的断片は、所望の生物学的または薬学的応
答をｉｎ ｖｉｖｏおよび／もしくはｉｎ ｖｉｔｒｏでさらに解明でき、ならびに／ま
たは所望の生物学的活性を依然として有するもしくは媒介する前記薬学的にまたは医学上
有用なタンパク質の断片である。
前記第１および前記第２のドメイン間に挿入される上記のポリペプチドリンカー／スペ
ーサーは、好ましくは、複数の親水性で、両ドメインに共有結合によって連結しているペ
プチド結合されたアミノ酸を含む。さらに別の実施形態では、前記ポリペプチドリンカー
／スペーサーは、生物活性を有する、および／または媒介するポリペプチドを含む前記第
１のドメインの制御された放出を可能にする血漿プロテアーゼ切断部位を含む。種々の種
類または長さのリンカーが、特定のタンパク質の最適生物活性を得るために過度の負担を
伴うことなく同定され得る。
好ましい実施形態では、本発明の生物学的に活性なタンパク質は、融合タンパク質であ
る。本明細書に記載される融合タンパク質は、単一のマルチドメインポリペプチド中に、
生物活性を媒介し得る少なくとも１つのドメインと、本明細書に記載される生合成ランダ
ムコイルポリペプチド（またはポリペプチドセグメント）を含む少なくとも１つのその他
のドメインを含み得る。やはり、本発明は、１つのドメインが生物活性を媒介する融合タ
ンパク質に制限されないということは注目すべきである。また、一方の部分／ドメインが
、本発明のプロリン／アラニンのランダムコイルポリペプチド／ポリマーであるか、また
は含み、もう一方の部分／ドメインが、別のタンパク質ストレッチ／構造を含む、その他
の「融合タンパク質」／「融合構築物」が本明細書において提供される。
特に、融合タンパク質の場合には、本発明のランダムコイルポリペプチド（またはポリ
ペプチドセグメント）は、そのアミノまたはカルボキシル末端に、ＰｒｏまたはＡｌａ残
基を必ずしも保持しない。代替実施形態では、本発明に従う生物学的に活性なタンパク質
は、注目されるタンパク質または生物活性を有するおよび／または媒介するポリペプチド
／ポリペプチドストレッチ／ペプチド／アミノ酸配列が、非ペプチド結合によって、ラン
ダムコイルコンホメーションを形成する／とるアミノ酸配列、特に、本明細書において提
供され、もっぱら、プロリンおよびアラニン残基からなるランダムコイルポリペプチド（
またはポリペプチドセグメント）にコンジュゲートされているタンパク質コンジュゲート
に相当し得る。本明細書において提供される少なくとも５０個のプロリン（Ｐｒｏ）およ
びアラニン（Ａｌａ）アミノ酸残基からなる、もっぱら、プロリンおよびアラニンアミノ
酸残基からなるアミノ酸配列を含む生合成ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチ
ドセグメントを用いて、タンパク質を架橋するのに有用である非ペプチド結合は、当技術
分野で公知である。このような非ペプチド結合として、例えば、Ｃｙｓ側鎖間のジスルフ
ィド結合、チオエーテル結合またはスベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）またはスル
ホスクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート（スルホ−ＳＭＰＢ）、
金属キレート化基／錯化基などの化学的クロスリンカー、ならびに非共有結合性タンパク
質−タンパク質相互作用によって誘導される非ペプチド共有結合を挙げることができる。
本発明の「生物学的に活性なタンパク質」がまた、２つ以上の「生物活性を有する、お
よび／または媒介するアミノ酸配列」を含み得ることは注目すべきである。さらに、生物
学的に活性なタンパク質はまた、生合成ランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメ
ント）以上を含み得る。最も簡単な場合には、生物学的に活性なタンパク質は、２つのド
メイン、すなわち、生物活性を有する、および／または媒介するアミノ酸配列を含む第１
のドメインおよび生合成ポリペプチド（またはそのセグメント）を含む第２のドメインか
らなる。本発明は、少なくとも５０個のプロリン（Ｐｒｏ）およびアラニン（Ａｌａ）ア
ミノ酸残基からなる、もっぱら、プロリンおよびアラニンアミノ酸残基からなるアミノ酸
配列を含む、本明細書において開示された生合成ランダムコイルポリペプチドまたはポリ
ペプチドセグメントに連結された、「生物学的にまたは治療上活性であるタンパク質」に
制限されないということは注目すべきである。また、食品または飲料産業、化粧品産業な
どのようなその他の産業に関連するものとして注目されるその他のタンパク質または分子
も、本明細書において提供される手段および方法によって製造され得る。
当業者ならば、本発明の生物学的に活性なタンパク質中に含まれる「生物活性を有する
、および／または媒介するアミノ酸配列を含むドメイン」および「ランダムコイルポリペ
プチド（またはそのセグメント）を含む第２のドメインは、特定の順序で構築され得るこ
とを承知している。
したがって、本発明との関連で、本発明の生物学的に活性なポリペプチドの本明細書に
おいて定義される「第１の」および「第２の」ドメインの順序は、前記「第１のドメイン
」（すなわち、注目されるタンパク質；「前記生物活性を有する、および／または媒介す
るアミノ酸配列」）がアミノ（Ｎ−）末端に配置され、前記「第２のドメイン」（すなわ
ち、本明細書において提供されたランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント）
を含むドメイン）が生物学的に活性なタンパク質のカルボキシ（Ｃ−）末端に配置される
順序で配列され得る。しかし、この順序はまた逆転される場合もあり、例えば、前記「第
１のドメイン」（すなわち、注目されるタンパク質；「前記生物活性を有する、および／
または媒介するアミノ酸配列」）がカルボキシ（Ｃ−）末端に配置され、前記「第２のド
メイン」（すなわち、本明細書において提供されたランダムコイルポリペプチド（または
そのセグメント）を含むドメイン）が生物学的に活性なタンパク質のアミノ（Ｎ−）末端
に配置される。生物学的に活性なタンパク質が、１つの第１のドメインおよび１つの第２
のドメインのみからなる場合には、ドメイン順序は、従って、（Ｎ末端からＣ末端に）第
１のドメイン（生物活性を有する、および／または媒介するアミノ酸配列）−第２のドメ
イン（ランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント））であり得る。逆もまた同
様に、ドメイン順序は、（Ｎ末端からＣ末端に）第２のドメイン（ランダムコイルポリペ
プチド（またはそのセグメント））−第１のドメイン（生物活性を有する、および／また
は媒介するアミノ酸配列）であり得る。
前記生物活性を有する、および／または媒介するアミノ酸配列を含む、またはからなる
２つ以上のドメインが、本発明のタンパク質構築物との関連で使用されることも想定され
る。例えば、生物学的に活性なタンパク質は、２つの「第１のドメイン」、すなわち、同
一または異なる活性であり得る生物活性を有する、および／または媒介する２つの特定の
アミノ酸配列を含み得る。生物学的に活性なタンパク質が、２つのこのような「第１のド
メイン」、すなわち、生物活性を有する、および／または媒介する２つの特定のアミノ酸
配列と、１つの「第２のドメイン」（生合成ランダムコイルポリペプチド（またはそのセ
グメント）を含む）からなる場合には、ドメイン順序は、（Ｎ末端からＣ末端に）第１の
ドメイン（特定の生物活性を有する、および／または媒介するアミノ酸配列）−第２のド
メイン（ランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント））−第１のドメイン（特
定の（場合により異なる）生物活性を有する、および／または媒介するアミノ酸配列）で
あり得る。
生物学的に活性なタンパク質が、２つ以上の「第２のドメイン」を含む場合（すなわち
、生物学的に活性なタンパク質が、２つ以上のランダムコイルポリペプチド（またはその
セグメント）を含む）には、同じ説明が当てはまる。生物学的に活性なタンパク質が、２
つのこのような「第２のドメイン」、すなわち、生合成ランダムコイルポリペプチド（ま
たはそのセグメント）を含む２つのドメインと、１つの「第１のドメイン」（生物活性を
有する、および／または媒介するアミノ酸配列を含む）からなる場合には、ドメイン順序
は、（Ｎ末端からＣ末端に）第２のドメイン（ランダムコイルポリペプチド（またはその
セグメント））−第１のドメイン（特定の生物活性を有する、および／または媒介するア
ミノ酸配列）−第２のドメイン（ランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント）
）であり得る。生物学的に活性なタンパク質が、２つ以上の「第２のドメイン」を含む場
合には、これらの「第２のドメイン」は同一である場合も、異なる場合もあることが本明
細書において想定される。
上記のように、生物学的に活性なタンパク質は、２つ以上の「第１のドメイン」、すな
わち、生物活性を有する、および／または媒介する２つ以上の特定のアミノ酸配列と、２
つ以上の「第２のドメイン」（生合成ランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメン
ト））を含み得、これによっては、これらの「第１のドメイン」は同一であっても、異な
っていてもよく、および／または前記「第２のドメイン」は同一であっても、異なってい
てもよい。このような場合には、以下の例示的ドメイン順序が、考えられる（Ｎ末端から
Ｃ末端に）：
−第１のドメイン（特定の生物活性を有する、および／または媒介するアミノ酸配列）
−第２のドメイン（ランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント））−第１のド
メイン（特定の生物活性を有する、および／または媒介するアミノ酸配列）−第２のドメ
イン（ランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント））；
−第２のドメイン（ランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント））−第１の
ドメイン（特定の生物活性を有する、および／または媒介するアミノ酸配列）−第１のド
メイン（特定の生物活性を有する、および／または媒介するアミノ酸配列）−第２のドメ
イン（ランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント））；
−第１のドメイン（特定の生物活性を有する、および／または媒介するアミノ酸配列）
−第２のドメイン（ランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント））−第２のド
メイン（ランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント））−第１のドメイン（特
定の生物活性を有する、および／または媒介するアミノ酸配列）；
−第２のドメイン（ランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント））−第１の
ドメイン（特定の生物活性を有する、および／または媒介するアミノ酸配列）−第２のド
メイン（ランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント））−第１のドメイン（特
定の生物活性を有する、および／または媒介するアミノ酸配列）；
−第２のドメイン（ランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント））−第２の
ドメイン（ランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント））−第１のドメイン（
特定の生物活性を有する、および／または媒介するアミノ酸配列）−第１のドメイン（特
定の生物活性を有する、および／または媒介するアミノ酸配列）；または
−第１のドメイン（特定の生物活性を有する、および／または媒介するアミノ酸配列）
−第１のドメイン（特定の生物活性を有する、および／または媒介するアミノ酸配列）−
第２のドメイン（ランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント））−第２のドメ
イン（ランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント））。
当業者にとっては、さらなる対応するドメイン順序（特に、生物学的に活性なタンパク
質中に３つ以上の「第１のドメイン」または「３つ以上の「第２のドメイン」が含まれる
場合には）が容易に考えられる。
本発明のポリペプチド／生物学的に活性なタンパク質のすべての実施形態と同様に、前
記生物活性を有する、および／または媒介するアミノ酸配列を含む前記ドメイン（単数ま
たは複数）はまた、所望の生物学的機能を有する所与のタンパク質の生物学的に活性な断
片であり得る。したがって、本明細書において定義される「第２のドメイン」（好ましく
は、本明細書において提供されたランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント）
を含む）は、注目されるタンパク質の２つの生物学的に活性な断片の間に、または注目さ
れる２つのタンパク質の生物学的に活性な断片の間に配置され得る。注目される「全長」
タンパク質／ポリペプチドとの関連で（すなわち、アミノ酸配列が特定の生物活性をそれ
自体で有する／媒介する場合に）、本明細書において上記で与えられたすべての説明およ
び定義は、このような断片との関連で準用する。
やはり、上記の発明は、「生物学的に活性な機能」を有する「ドメイン」を含む構築物
に制限されない。本発明の構築物はまた、その他の機能を有するドメインを含む場合もあ
り、生物学的活性に制限されない。これらは、単に、本発明の実施形態であり、当業者に
は、その他の構築物が、本発明の主旨から逸脱することなく（deferring）容易に製造さ
れ、使用され得ることは明らかである。したがって（Accordingyl）、「特定の生物活性
を有する、および／または媒介するアミノ酸配列」との関連で本明細書において前記のも
のは、その他の構築物、例えば、化粧品、食品加工、乳製品、紙製造などにおけるような
、その他の技術分野において使用される構築物に対して準用する。本明細書において上記
で記載されるように、本発明の生合成ポリペプチド／ポリマーはまた、例えば、小分子な
どと連結されるよう使用され得る。
やはり、用語「第１の生物活性を有する、および／または媒介するアミノ酸配列」は、
前記生物活性または機能を有する、および／または媒介する全長ポリペプチドに制限され
ず、その生物学的および／または薬理学的に活性な断片にも制限されないことは指摘され
なければならない。特に、２つ以上の本明細書において定義される「第１のドメイン」が
、本発明の「生物学的に活性なタンパク質」中に含まれる場合に関連してだけでなく、こ
れらの「第１のドメイン」が、タンパク質複合体またはタンパク質複合体のこのような部
分の断片の異なる部分であるか、または相当することも想定される。
本明細書において以下に例示されるように、ランダムコイルポリペプチドを含むよう修
飾されている本発明の生物学的に活性なタンパク質は、驚くべきことに、前記ランダムコ
イルドメインを欠く修飾されていない生物学的に活性なタンパク質と比較した場合に、増
大したｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性を示す。本明細書において
、用語「ｉｎ ｖｉｖｏ安定性」とは、生体に投与される特定の物質の、生物学的に利用
可能な、生物学的に活性なままである能力に関する。ｉｎ ｖｉｖｏでは、物質は、排出
、腎臓濾過、肝臓取り込み、凝集、分解および／またはその他の代謝過程のために除去お
よび／または不活化され得る。したがって、本発明に関連して、増大したｉｎ ｖｉｖｏ
安定性を有する生物学的に活性なタンパク質は、腎臓（尿）を介して、または糞便によっ
てあまり迅速に排出されない場合があり、および／またはタンパク質分解に対して、特に
、血液、脳脊髄液、腹水およびリンパ液のような生体液中でのｉｎ ｖｉｖｏタンパク質
分解に対してより安定であり得る。一実施形態では、生物学的に活性なタンパク質の増大
したｉｎ ｖｉｖｏ安定性は、前記生物学的に活性なタンパク質の血漿半減期の延長を示
す。特に、生物学的に活性なタンパク質の増大したｉｎ ｖｉｖｏ安定性は、第２のドメ
インを欠く生物学的に活性なタンパク質と比較した場合の、前記第２のドメインを含む前
記生物学的に活性なタンパク質の血漿半減期の延長である。
生物学的に活性なタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ安定性を測定する方法は、当技術分野で
公知である。本明細書において以下に例示されるように、生物学的に活性なタンパク質は
、ウエスタンブロッティング技術または酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を使用し
て血漿中で特異的に検出され得る。しかし、当業者ならば、注目されるタンパク質の血漿
半減期を特異的に測定するためにその他の方法が使用され得ることは承知している。この
ような方法として、それだけには限らないが、放射性標識された注目されるタンパク質の
物理的検出が挙げられる。例えば、放射性ヨウ素化によってタンパク質を放射性標識する
方法は、当技術分野で公知である。
本明細書において、用語「増大したｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
環境において、生物学的に活性なタンパク質の分解および／または凝集に抵抗する能力お
よびその元の生物活性を維持する能力に関する。生物学的に活性なタンパク質の生物活性
を測定する方法は、当技術分野で周知である。
さらに、本明細書において記載され、定義されるランダムコイルポリペプチドまたはポ
リペプチドセグメントと、前記ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメン
トにコンジュゲートされている小分子薬を含む薬物コンジュゲートが提供される。小分子
の限定されない例として、ジゴキシゲニン、フルオレセインドキソルビシン、カリケアマ
イシン、カンプトテシン、フマギリン、デキサメタゾン、ゲルダナマイシン、パクリタキ
セル、ドセタキセル、イリノテカン、シクロスポリン、ブプレノルフィン、ナルトレキソ
ン、ナロキソン、ビンデシン、バンコマイシン、リスペリドン、アリピプラゾール、パロ
ノセトロン、グラニセトロン、シタラビン、NX1８３８、ロイプロリド、ゴセレリン、ブ
セレリン、オクトレオチド、テデュグルチド（teduglutide）、シレンジチド（cilengiti
de）、アバレリックス、エンフビルチド、グレリンおよび誘導体、ツブリシン（tubulysi
ns）、プラチン誘導体、α４インテグリン阻害剤、アンチセンス核酸、短鎖干渉ＲＮＡ、
マイクロＲＮＡ、ステロイド、ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマー、ペプチド、ペプチドミメ
ティックがある。一般に、本発明はまた、本明細書において定義されるランダムコイルポ
リペプチドまたはポリペプチドセグメントと、特に、小分子、ペプチドまたはタンパク質
、核酸、炭水化物、脂質小胞などといった生体高分子のような薬学的にまたは医学上有用
な分子を含む薬物構築物にも関する。添付の例示的実験部分（例えば、実施例２２参照の
こと）では、本発明の構築物／コンジュゲートの成功した作製が提供され、同様に構築物
では、「小さい化学的分子」が本明細書において開示されたランダムコイルポリペプチド
にコンジュゲートされている。したがって、本図面および対応する図面の説明文中の実験
情報は、本明細書において開示された薬物コンジュゲートが、（ｉ）少なくとも５０個の
プロリン（Ｐｒｏ）およびアラニン（Ａｌａ）アミノ酸残基からなる、もっぱら、プロリ
ンおよびアラニンアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む生合成ランダムコイルポリペ
プチドまたはポリペプチドセグメントおよび（ｉｉ）示されるように、ジゴキシゲニンお
よびフルオレセインから選択される小分子を含む例示的例を提供する。これらは学問的な
例だけではないということは注目すべきである。フルオレセインまたはフルオレセイン誘
導体は、診断薬としてよく使用され、医学的フルオレセイン溶液は、商標名Ｆｌｕｏｅｓ
ｃｉｔｅ（登録商標）、ＡＫ−ＦＬＵＯＲ（登録商標）またはＦｌｕｒｅｓｓ（登録商標
）の下で販売されている。このような化合物は、本明細書において提供される手段および
方法から特に恩恵を受け得る。ジゴキシゲニンは、３つのジギトキソーズ糖をさらに含有
する、心臓作用性機能を有する周知の二次植物代謝物のジゴキシンのステロイド部分を形
成する。ジゴキシンおよびより少ない程度で、密接に関連した化合物ジギトキシンは、心
室性頻脈性不整脈およびうっ血性心不全の治療のために広く使用されている（Hauptman (
1999年) Circulation 99: 1265〜1270頁）。すべての心臓作用性ステロイドは、強力であ
り、細胞原形質膜中に位置するＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰアーゼの高度に特異的な阻害剤であ
り、それによって交感神経遮断作用または陽性変力作用を発揮する。
ランダムコイルポリペプチドまたはそのポリペプチドセグメントとの関連で本明細書に
おいて上記で与えられる定義および説明は、ランダムコイルポリペプチド（またはそのポ
リペプチドセグメント）および（ａ）生物学的に活性なタンパク質、または生物活性を有
するもしくは媒介するアミノ酸配列を含むか、もしくは生物活性を有するもしくは媒介す
るアミノ酸配列であるポリペプチドおよび（ｂ）小分子薬からなる群から選択される薬物
を含む薬物コンジュゲートとの関連で準用する。
本明細書において定義され提供されるランダムコイルコンホメーション／ランダムコイ
ルポリペプチド（またはそのセグメント）を形成するアミノ酸ポリマーは、小分子／小分
子薬にコンジュゲートされ得る。このようにして、小分子／小分子薬の血漿半減期および
／または溶解度は、増大され得、非特異的毒性が低減され得、身体中の標的細胞または構
造に対する活性薬物の曝露の延長が、薬物動力学の増強をもたらし得る。
例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル誘導体のような活性化され
た薬物誘導体との、ランダムコイルポリペプチドのＮ末端の部位特異的コンジュゲーショ
ン（Hermanson (1996年) Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego，CA）
が可能である。一般に、Ｎ末端アミノ基は、アルデヒドおよびケトンなどのさまざまな官
能基と（シッフ塩基を形成し、これは、例えば、水酸化ホウ素ナトリウムまたはシアノ水
酸化ホウ素ナトリウムを使用して、アミンに還元され得る）、または活性化された炭酸誘
導体と（無水物、塩化物、エステルなど、アミドを形成する）、またはイソシアネート、
イソチオシアネート、スルホニルクロリドなどのその他の反応性化学物質などと化学的に
カップリングされ得る。また、アミノ酸ポリマー／ポリペプチドのＮ末端は、まず、適し
た保護基、例えば、アセチル基、ＢＯＣ基またはＦＭＯＣ基を用いて修飾され得る（Jaku
bke (1996) Peptide. Spektrum Akdemischer Verlag, Heidelberg、Germany）。さらに、
アミノ末端は、Ｐｒｏ／Ａｌａポリペプチドまたはポリペプチドセグメントの前のコード
されるＧｌｎアミノ酸残基から形成し得るピログルタミル基によって保護され得る。例え
ば、一般的な試薬ＥＤＣ（Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジ
イミド）およびＮＨＳを使用してＣ末端カルボン酸基を活性化した後、例えば、薬物が遊
離アミノ基を保持する場合には、保護されたランダムコイルポリペプチドのＣ末端への部
位特異的カップリングが達成され得る。
あるいは、ランダムコイルコンホメーション／ランダムコイルポリペプチドを形成する
アミノ酸ポリマーのＮ末端またはＣ末端は、マレイミド基を提供する市販のリンカー試薬
を用いて修飾され得、ひいては、薬物分子の一部としてのチオール基との化学的カップリ
ングを可能にする。このように、均一な薬物コンジュゲートは容易に得られる。当技術分
野で周知である同様の技術（Hermanson (1996年)同著）が、ランダムコイルポリペプチド
をペプチドと、またはさらには、タンパク質薬物とカップリングするために使用され得る
。このようなペプチドまたはタンパク質は、ＬｙｓまたはＣｙｓ側鎖を保持して容易に調
製され得、これによって、ＮＨＳエステルまたはマレイミド活性基によるランダムコイル
コンホメーションを形成するアミノ酸ポリマーとのそれらのｉｎ ｖｉｔｒｏカップリン
グが可能となる。一般に、同様の薬物コンジュゲートは、ランダムコイルポリペプチド（
またはそのセグメント）を含む融合タンパク質を用いて調製され得る。しかし、添付の実
施例および図面に示されるように、本発明はまた、本発明の革新的なコンジュゲート中に
含まれるようなランダムコイルポリペプチドまたはランダムコイルポリペプチドセグメン
トの調製を提供する。
単一部位特異的コンジュゲーションの代替として、ランダムコイルポリペプチドは、Ｎ
もしくはＣ末端または内部に、そのε−アミノ基を有するリシン残基、そのチオール基を
有するシステイン残基、またはさらには非天然アミノ酸などの化学的修飾に適したさらな
る側鎖を備えてもよく、これによって、例えば、ＮＨＳエステルまたはマレイミド活性基
を使用する複数の小分子のコンジュゲーションが可能となる。
安定なコンジュゲーションは別として、プロドラッグが、ランダムコイルポリペプチド
に一時的に連結され得る。連結は、例えば、難溶性抗腫瘍剤カンプトテシンがＰＥＧポリ
マーにコンジュゲートされ、ひいては、体内分布の増大、毒性の低減、有効性の増強およ
び腫瘍蓄積を達成したのと同様に、酵素的機序によって、または生理学的ｐＨで開始され
る遅い加水分解のいずれかによって、予測可能な方法でｉｎ ｖｉｖｏで切断されるよう
設計され得る（Conover (1998年) Cancer Chemother Pharmacol, 42:407〜414頁）。さら
なるプロドラッグの例として、ドセタキセル（Liu (2008年) J Pharm Sci. 97:3274〜329
0頁）、ドキソルビシン（Veronese (2005年) Bioconjugate Chem. 16:775〜784頁）また
はパクリタキセル（Greenwald (2001年) J Control Release 74:159〜171頁）のような化
学療法薬がある。
さらに、小分子は、ターゲッティングドメイン、例えば、抗体断片に遺伝子融合された
アミノ酸ポリマー／ポリペプチドを含む融合タンパク質にカップリングされ得、ひいては
、小分子薬の特異的送達をもたらす。後者の場合には、例えば、ターゲッティングドメイ
ンが内部移行を受ける細胞−表面受容体に対するものである場合には、免疫毒素は、細胞
傷害性小分子とのコンジュゲーションによって容易に作製され得る。
上記に従って、本発明はまた、従って、もっぱら、プロリンおよびアラニンアミノ酸残
基からなるアミノ酸配列を含む、本明細書において開示された生合成ランダムコイルポリ
ペプチドまたはポリペプチドセグメントの、その他の選択化合物とのさらなる、追加のカ
ップリングのための提供に関する。前記さらなる、および／または追加のカップリングは
、前記生合成ランダムコイルポリペプチドまたは生合成ランダムコイルポリペプチドセグ
メントの別の化合物とのまたは別の化合物への第１のカップリングであり得る、および／
または含み得る。
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるランダムコイルポリペプチド（ま
たはそのセグメント）または生物学的に活性なタンパク質をコードする核酸分子に関する
。したがって、前記核酸分子は、生物活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列お
よびランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント）をコードする核酸配列を含み
得る。本明細書において、用語「核酸分子」とは、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子などの核
酸分子を含むよう意図される。前記核酸分子は、一本鎖であっても、二本鎖であってもよ
いが、二本鎖ＤＮＡであることが好ましい。前記核酸分子は、ベクター中に含まれ得るこ
とが好ましい。
したがって、本発明はまた、本明細書において提供された薬物コンジュゲートのような
本明細書において提供されたコンジュゲート中に含まれるようなランダムコイルポリペプ
チドまたはポリペプチドセグメントをコードする核酸分子、または上記で定義された生物
学的に活性なタンパク質を含み、さらに、少なくとも５０個のプロリン（Ｐｒｏ）および
アラニン（Ａｌａ）アミノ酸残基からなる、もっぱら、プロリンおよびアラニンアミノ酸
残基からなるアミノ酸配列を含む生合成ランダムコイルポリペプチドもしくはポリペプチ
ドセグメントを含むタンパク質コンジュゲートをコードする核酸分子に関する。
一実施形態では、上記で定義された薬物コンジュゲートまたは食品コンジュゲートのよ
うなコンジュゲートをコードする核酸分子が提供され、前記核酸分子は、
（ｉ）翻訳されるアミノ酸および／またはリーダー配列をコードする核酸配列；
（ｉｉ）少なくとも５０個のプロリン（Ｐｒｏ）およびアラニン（Ａｌａ）アミノ酸残
基からなる、もっぱら、プロリンおよびアラニンアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含
む生合成ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントをコードする核酸配
列；
（ｉｉｉ）生物学的に活性なタンパク質、または生物活性を有するか、もしくは媒介す
るアミノ酸配列を含むか、もしくは生物活性を有するか、もしくは媒介するアミノ酸配列
である前記ポリペプチド、または食品産業のようなその他の産業領域において使用される
タンパク質のような注目されるタンパク質をコードする核酸配列；および
（ｉｖ）翻訳停止コドンを表す、または翻訳停止コドンである核酸配列
を含む。
（ｉ）の下、上記で記載される「翻訳されるアミノ酸および／またはリーダー配列」と
は、例えば、出発「Ｍ」、すなわち、対応する出発コドンに由来するメチオニンであり得
、例えば、リボソーム結合部位を含む、出発コドンまでの５’配列のようなｍＲＮＡの翻
訳されない配列も含み得る。しかし、このような配列はまた、例えば、発現されたタンパ
ク質の周辺質への、または培養培地への分泌のための古典的なリーダーおよび／またはシ
グナル配列を含み得る。原核生物シグナルペプチドとして、例えば、ＯｍｐＡ、ＭａｌＥ
、ＰｈｏＡ、ＤｓｂＡ、ｐｅｌＢ、Ａｆａ、ｎｐｒ、ＳＴＩＩがある。真核細胞シグナル
ペプチドとして、例えば、ミツバチメリチンシグナル配列、酸性糖タンパク質ｇｐ６７シ
グナル配列、マウスＩｇＭシグナル配列、ｈＧＨシグナル配列がある。
生物活性を有する、もしくは媒介するアミノ酸配列を含む、または生物活性を有する、
もしくは媒介するアミノ酸配列である生物学的に活性なタンパク質またはポリペプチドな
らびにその他の産業領域において使用されるタンパク質のようなその他の注目されるタン
パク質が、本明細書において上記で提供された。前記実施形態は、本明細書において上記
で示される核酸分子（molece）（部分／セグメント（ｉｉｉ））に準用する。
本明細書において提供される核酸分子において使用される翻訳停止コドンは、当技術分
野で周知であり、例えば、コドンＵＡＡ、ＵＡＧまたはＵＧＡがある。
本明細書において上記で提供される核酸分子の一実施形態では、前記核酸分子部分／セ
グメント（ｉｉ）および（ｉｉｉ）は、薬物コンジュゲートまたは食品コンジュゲートの
ようなコンジュゲートをコードする前記核酸分子上でその位置が交換される。このような
核酸分子は、以下の順序の部分／セグメントを含む：
（ｉ）翻訳されるアミノ酸および／またはリーダー配列をコードする核酸配列と；
（ｉｉ）生物学的に活性なタンパク質、または生物活性を有する、もしくは媒介するア
ミノ酸配列を含む、もしくは生物学的に活性なタンパク質または生物活性を有する、もし
くは媒介するアミノ酸配列である前記ポリペプチドまたは食品産業のようなその他の産業
領域において使用されるタンパク質のような注目されるタンパク質をコードする核酸配列
と；
（ｉｉｉ）少なくとも５０個のプロリン（Ｐｒｏ）およびアラニン（Ａｌａ）アミノ酸
残基からなる、もっぱら、プロリンおよびアラニンアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を
含む生合成ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントをコードする核酸
配列と；
（ｉｖ）翻訳停止コドンを表す、または翻訳停止コドンである核酸配列。
本明細書において上記で提供される核酸分子はまた、場合により、部分／セグメント（
ｉ）および（ｉｉ）間および／または部分／セグメント（ｉｉ）および（ｉｉｉ）間に、
プロテアーゼおよび／または化学的切断部位および／または認識部位を含み得る。このよ
うな化学的切断部位は、当技術分野で周知であり、例えば、特定の、個別のアミノ酸配列
を含む（例えば、Lottspeich and Engels (Hrsg.) (2006年) Bioanalytik. 2. Auflage.
Spektrum Akademischer Verlag, Elsevier、Munchen、Germany参照のこと）。例えば、臭
化シアンまたは塩化シアンは、Ｍｅｔ残基の後ろのペプチド結合を切断し；ヒドロキシル
アミンは、アスパラギニル−グリシル結合を切断し；ギ酸は、Ａｓｐ−Ｐｒｏ；Ｔｒｐ後
の２−（２’−ニトロフェニルスルフェニル）−３−メチル−３−ブロモイノレニン、２
−ヨードソ安息香酸またはＮ−クロロサクシンイミド；Ｃｙｓ後の２−ニトロ−５−チオ
シアナト安息香酸を切断する。部位特異的突然変異誘発によって、Ｐｒｏ／Ａｌａポリペ
プチドまたはポリペプチドセグメントの前の残基がＭｅｔに置換され得、次いで、得られ
た融合タンパク質がＢｒＣＮによって切断され得ることも想定され、可能である。同様に
、部位特異的突然変異誘発によって、切断部位を含むその他のアミノ酸配列が、組換え融
合タンパク質中またはそのコードする核酸中に導入され得る。
また、有用なプロテアーゼ認識／切断部位は、当技術分野で公知である。これらは、そ
れだけには限らないが：トリプシン、キモトリプシン、エンテロキナーゼ、タバコエッチ
ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ、ＨＲＶ ３Ｃ
プロテアーゼ、ＳＵＭＯプロテアーゼ、Ｓｏｒｔａｓｅ Ａ、グランザイムＢ、フューリ
ン、トロンビン、第Ｘ因子または自己切断性インテインを含む。第Ｘ因子は、Ｎ末端融合
パートナーとＰｒｏ／Ａｌａポリペプチドまたはポリペプチドセグメント間に挿入され得
るアミノ酸配列ＩｌｅＧｌｕＧｌｙＡｒｇのＣ末端でペプチド結合を加水分解する。タン
パク質分解切断を達成するための特に簡単な方法は、Ｐｒｏ／Ａｌａポリペプチドまたは
ポリペプチドセグメントのＮ末端でのＬｙｓまたはＡｒｇ側鎖の挿入または置換と、それ
に続く、トリプシンを用いる消化によってであり、これは、内部ＬｙｓまたはＡｒｇ側鎖
が避けられる限り、Ｐｒｏ／Ａｌａポリペプチドまたはポリペプチドセグメント内を切断
しない。例示的認識部位として、制限されるものではないが、Ｄ−Ｄ−Ｄ−Ｄ−Ｋ（エン
テロキナーゼ）、ＥＮＬＹＦＱ（Ｇ／Ｓ）（ＴＥＶプロテアーゼ）、Ｉ−（Ｅ／Ｄ）−Ｇ
−Ｒ（第Ｘａ因子）、Ｌ−Ｅ−Ｖ−Ｌ−Ｆ−Ｑ−Ｇ−Ｐ（ＨＲＶ ３Ｃ）、Ｒ−Ｘ−（Ｋ
／Ｒ）−Ｒ（フューリン）、ＬＰＸＴＧ（Ｓｏｒｔａｓｅ Ａ）、Ｌ−Ｖ−Ｐ−Ｒ−Ｇ（
トロンビン）またはＩ−Ｅ−Ｘ−Ｄ−Ｘ−Ｇ（グランザイムＢ）がある。
上記の本明細書における開示内容から（form）明らかであるが、本発明は、有用なタン
パク質、薬学的に活性なポリペプチドまたは小分子、診断上有用なポリペプチドまたは小
分子または、とりわけ、食品または製紙業または油回収におけるようなその他の産業領域
のその他の有用なタンパク質または小分子のような、選択された分子とコンジュゲートさ
れ得る、組換えによって製造された生合成ランダムコイルポリペプチドおよびポリペプチ
ドセグメントを提供する。したがって、本発明はまた、少なくとも５０個のプロリン（Ｐ
ｒｏ）およびアラニン（Ａｌａ）アミノ酸残基からなる、もっぱら、プロリンおよびアラ
ニンアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む生合成ランダムコイルポリペプチドまたは
ポリペプチドセグメントをコードする核酸を提供し、前記核酸分子は、
（ｉ）翻訳されるアミノ酸および／またはリーダー配列をコードする核酸配列と；
（ｉｉ）もっぱら、プロリンおよびアラニンアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む
前記生合成ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントをコードする核酸
配列と；および
（ｉｉｉ）翻訳停止コドンを表す、または翻訳停止コドンである核酸配列と
を含む。
このような核酸分子は、場合により、（ｉ）および（ｉｉ）間にプロテアーゼおよび／
または化学的切断部位および／または認識部位を含み得る。
また、最初の２つの記載された核酸分子（すなわち、プロテアーゼおよび／または化学
的切断部位および／または認識）との関連で、本明細書において上記で提供される実施形
態は、この核酸分子についてここで準用する。
本発明との関連で使用される有用な、例示的シグナル配列として、制限されるものでは
ないが、ＯｍｐＡ、ＭａｌＥ、ＰｈｏＡ、ＤｓｂＡ、ｐｅｌＢ、Ａｆａ、ｎｐｒ、ＳＴＩ
Ｉのような原核生物の配列またはミツバチメリチンシグナル配列、酸性糖タンパク質ｇｐ
６７シグナル配列、マウスＩｇＭシグナル配列、ｈＧＨシグナル配列のような真核細胞の
配列がある。
特に、本発明のもっぱら、プロリンおよびアラニンアミノ酸残基からなるアミノ酸配列
を含む生合成ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントをコードする核
酸分子は、同様に本明細書において以下に提供され、添付の実施例および図面において示
される方法において有用である。このような発現されたランダムコイルポリペプチドまた
はランダムコイルポリペプチドセグメントは、単離された形態、例えば、このようなラン
ダムコイルポリペプチドまたはランダムコイルポリペプチドセグメントを発現する宿主細
胞であり得る。このような宿主細胞は、例えば、本明細書において提供されるベクターで
トランスフェクトされた細胞であり得る。
したがって、細胞を本明細書において記載される核酸分子またはベクターでトランスフ
ェクトすることが想定される。さらなる実施形態では、本発明は、発現時に本発明のラン
ダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント）または生物学的に活性なタンパク質を
コードする核酸分子に関する。しかし、さらなる実施形態では、本発明は、発現時に水性
溶液中で、または生理学的条件下で、ランダムコイルコンホメーションを完全に、または
部分的に形成する／とる本明細書において開示されたポリペプチドをコードする核酸分子
に関する。前記核酸分子は、ポリペプチドならびに細胞性分泌または細胞小器官へのター
ゲッティングを確実にするシグナル配列の適切な転写および翻訳を確実にすると当技術分
野で知られている、適した発現制御配列に融合され得る。このようなベクターは、適した
宿主細胞における、適した条件下での前記ベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子な
どのさらなる遺伝子を含み得る。
好ましくは、本発明の核酸分子は、本明細書において記載される生物学的に活性なタン
パク質をコードする核酸分子が発現制御配列に作動可能に連結されており、原核細胞また
は真核細胞における発現を可能にする、組換えベクター中に含まれる。前記核酸分子の発
現は、核酸分子の翻訳可能なｍＲＮＡへの転写を含む。原核生物宿主細胞における発現を
可能にする調節エレメントは、例えば、大腸菌（E. coli）におけるλ ＰＬ、ｌａｃ、
ｔｒｐ、ｔａｃ、ａｒａ、ｐｈｏＡ、ｔｅｔまたはＴ７プロモーターを含む。真核細胞、
好ましくは、哺乳動物細胞または酵母における発現を確実にする、可能性ある調節エレメ
ントは、当業者に周知である。それらは、普通、転写の開始を確実にする調節配列および
場合により、転写の終結および転写物の安定化を達成するポリ−Ａシグナルを含む。さら
なる調節エレメントとして、転写ならびに翻訳エンハンサー、および／または天然に関連
している、もしくは異種のプロモーター領域を挙げることができる。真核細胞宿主細胞に
おける発現を可能にする調節エレメントの例として、酵母におけるＡＯＸ１もしくはＧＡ
Ｌ１プロモーターまたは哺乳動物およびその他の動物細胞におけるＣＭＶ、ＳＶ４０、Ｒ
ＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー
もしくはグロビンイントロンがある。転写の開始に関与しているエレメントは別にして、
このような調節エレメントはまた、転写終結シグナル、例えば、ＳＶ４０−ポリ−Ａ部位
またはｔｋ−ポリ−Ａ部位、コーディング領域の下流も含み得る。
組換えベクターを構築するためには、当業者に周知である方法が使用され得る（例えば
、Sambrook (1989年)、Molecular Clonig: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor L
aboratory NYおよびAusubel (1989年)、Current Protocols in Molecular Biology, Gree
n Publishing Associates and Wiley Interscience, NYに記載される技術）。これに関連
して、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３、ｐＰＩＣＺａｌｐｈ
ａ Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）など、適
した発現ベクターは、当技術分野で公知である。さらに、使用される発現系に応じて、ポ
リペプチドを細胞コンパートメントに向けることができるか、またはそれを培養培地中に
分泌することができるリーダー配列が、本発明の核酸分子のコード配列に加えられてもよ
い。
本発明はまた、本発明のランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント）または
生物学的に活性なタンパク質をコードする核酸分子を含む、遺伝子操作において従来使用
されるベクター、特に、プラスミド、コスミド、ウイルスおよびバクテリオファージに関
する。好ましくは、前記ベクターは、発現ベクターおよび／または遺伝子導入またはター
ゲッティングベクターである。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイル
ス、ヘルペスウイルスまたはウシパピローマウイルスなどのウイルス由来の発現ベクター
が、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターの標的細胞集団への送達のために使用され
得る。
本発明の核酸分子を含有するベクターは、周知の方法によって宿主細胞にトランスフェ
クトされ得るが、これは細胞の種類に応じて異なる。したがって、本発明は、前記核酸分
子または前記ベクターを含む細胞にさらに関する。このような方法として、例えば、Samb
rook(1989)、同著およびAusubel(1989)、同著に記載される技術が挙げられる。したがっ
て、原核細胞には塩化カルシウムトランスフェクションまたはエレクトロポレーションが
一般に利用されるのに対し、その他の細胞性宿主には、リン酸カルシウム処理またはエレ
クトロポレーションが使用され得る（Sambrook (1989)、同著）。さらなる代替として、
本発明の核酸分子およびベクターは、標的細胞への送達のためにリポソーム中に再構成さ
れ得る。宿主細胞中に存在する本発明の核酸分子またはベクターは、宿主細胞のゲノムに
組み込まれ得るか、または染色体外性に維持され得るかのいずれかである。したがって、
本発明はまた、本発明の核酸分子および／またはベクターを含む宿主細胞に関する。ポリ
ペプチドの発現のための宿主細胞は、当技術分野で周知であり、原核細胞ならびに真核細
胞、例えば、大腸菌（E. coli）細胞、酵母細胞、無脊椎動物細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ
−Ｋ１ 細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ−１サル細胞、Ｂｏｗｅｓ細胞
などの黒色腫細胞、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓ、Ｂａｌｂ−ｃまたはＮＩＨマウ
ス由来の３Ｔ３細胞系統、ＢＨＫまたはＨａＫハムスター細胞系統などを含む。
さらなる態様では、本発明は、本明細書において提供された本発明のコンジュゲートな
らびに生合成ランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント）または生物学的に活
性なタンパク質を調製する方法を含み、本発明の（宿主）細胞を培養することおよび本明
細書において記載されるように培養物から前記ランダムコイルポリペプチド（またはその
セグメント）またはコンジュゲートまたは生物学的に活性なタンパク質を単離することを
含む。一般に、本発明のランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント）、ランダ
ムコイルドメインを含むコンジュゲートまたは生物学的に活性なタンパク質は、組換えＤ
ＮＡ技術によって、例えば、記載された核酸分子または本発明の生物学的に活性なタンパ
ク質またはランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント）をコードするベクター
を含む細胞を培養することおよび前記タンパク質／ポリペプチドを培養物から単離するこ
とによって製造され得る。本発明の生物学的に活性なタンパク質またはランダムコイルポ
リペプチド（またはそのセグメント）は、原核細胞、例えば、大腸菌（E. coli）ＢＬ２
１、ＫＳ２７２もしくはＪＭ８３または真核細胞、例えば、ピチア・パストリス（Pichia
pastoris）、酵母株Ｘ−３３もしくはＣＨＯ細胞をはじめとする、任意の適した細胞培
養系において製造され得る。当技術分野で公知のさらなる適した細胞系統は、Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）のような細胞株
保管所から得られる。
用語「原核生物の」とは、細菌細胞を含むものとし、他方、用語「真核細胞の」とは、
酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を含むものとする。形質転換された宿主は、最
適な細胞成長を達成するよう当技術分野で公知の技術に従って発酵槽において増殖され、
培養され得る。さらなる実施形態では、本発明は、生物学的に活性なタンパク質またはラ
ンダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント）の発現に適した条件下で本発明の細
胞を培養することおよび前記タンパク質／ポリペプチドを細胞または培養培地から単離す
ることを含む、上記で記載されるランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント）
または生物学的に活性なタンパク質を調製する方法に関する。
本発明のランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント）それ自体は、おそらく
は、１つのＮ末端第１級（または、プロリンの場合には、第２級）アミノ基とポリマーの
Ｃ末端の１つのカルボン酸基以外に化学的反応基を全く含まないことが好ましい。しかし
、当業者には、例えば、前記ランダムコイルポリペプチド／ポリマーが、「融合タンパク
質」／「融合構築物」の部分である場合に、本明細書において提供される生合成ランダム
コイルポリペプチド／ポリマーが化学的反応基を含み得ることは明らかである。同様に記
載されるように、生合成ランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント）は、当業
者に周知の方法に従ういくつかの方法での形質転換細胞における組換え発現、例えば：（
ｉ）Ｎ末端Ｍｅｔ残基／開始コドンの助けを借りた細胞質における直接発現；（ｉｉ）Ｎ
末端シグナルペプチドによる分泌、例えば、ＯｍｐＡ、ＰｈｏＡ（Monteilhet (1993) Ge
ne. 1993 125:223〜228頁）、メリチン（Tessier (1991) Gene 98: 177〜183頁）、イン
ターロイキン２（Zhang (2005) J Gene Med 7: 354〜365頁）、ｈＧＨ（Pecceu (1991) G
ene 97(2):253〜258頁）などとそれに続く、結果として成熟したＮ末端、例えば、Ａｌａ
またはＰｒｏが得られる細胞内切断；（ｉｉｉ）別の可溶性タンパク質、例えば、Ｎ末端
でのマルトース結合性タンパク質との、および散在したプロテアーゼ切断部位との融合タ
ンパク質としての発現（Kapust and Waugh (2000年) Protein Expr. Purif. 19:312〜318
頁）と、それに続く、ひいては、成熟したＮ末端、例えば、ＡｌａまたはＰｒｏを有する
アミノ酸ポリマー／ポリペプチドを放出するｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの
特異的プロテアーゼ切断によって調製され得る。別の適した融合パートナーとして、実施
例２０および２１に記載のように、ＳＵＭＯタンパク質があり、これは、ＳＵＭＯプロテ
アーゼによって切断され得る。さらなる融合パートナーとして、制限するものではないが
、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、チオレドキシン、セルロース結合性ドメイン
、アルブミン結合性ドメイン、蛍光タンパク質（ＧＦＰなど）、プロテインＡ、プロテイ
ンＧ、インテインなど（Malhotra (2009) Methods Enzymol. 463:239〜258頁）が挙げら
れる。
上記で説明したように、記載されるランダムコイルポリペプチド（またはポリペプチド
セグメント）／ポリマーは、主にアラニンおよびプロリン残基からなるのに対し、Ｏ−ま
たはＮ−グリコシル化に必要であるセリン、トレオニンまたはアスパラギンはないことが
好ましい。したがって、ランダムコイルポリペプチド（またはそのポリペプチドセグメン
ト）を含む生物学的に活性なタンパク質のポリペプチド自体、または全般的に、ランダム
コイルポリペプチド（またはそのポリペプチドセグメント）を含む融合タンパク質の製造
は、驚くべきことに、好ましくは、Ｐｒｏ−Ａｌａ配列内に翻訳後修飾を欠く単分散生成
物をもたらし得る。これは、複雑なタンパク質の生合成のために選択されることが多いチ
ャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）または酵母のような真核細胞における組換えタ
ンパク質製造の利点である。例えば、インスリン、顆粒球−マクロファージコロニー刺激
因子、血小板由来増殖因子またはヒルジンなどの承認された治療タンパク質の製造のため
に酵母が使用されている（Gerngross (2004年) Nat. Biotechnol. 22:1409〜1414頁）。
ＣＨＯ細胞は、凝固因子ＩＸ、インターフェロンβ−１ａ、テネクテプラーゼ（Chu (200
1年) Curr. Opin. Biotechnol. 12:180〜187頁）またはゴナドトロピンなどの治療タンパ
ク質の製造に役立っており、糖成分が、機能活性、フォールディング、二量体化、分泌な
らびに受容体相互作用、シグナル変換および代謝クリアランスのようないくつかの態様に
正に影響を及ぼし得る（Walsh (2006年) Nat. Biotechnol. 24:-1241〜1252頁）。したが
って、真核細胞発現系における本発明の構築物、ランダムコイルポリペプチドおよびコン
ジュゲートの調製も、本発明との関連で開示される。
本明細書において提供された手段および方法を用いて、ここで、（ｉ）もっぱら、プロ
リンおよびアラニンアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む生合成ランダムコイルポリ
ペプチドまたはポリペプチドセグメントおよび（ｉｉ）有用なタンパク質、タンパク質セ
グメントまたは小分子のような注目されるさらなる分子を含む本明細書において開示され
たコンジュゲートおよび分子を製造および提供することが可能である。したがって、本発
明はまた、このようなコンジュゲートならびに生合成ランダムコイルポリペプチドおよび
／またはそれを含む分子もしくはコンジュゲートを調製または製造する方法も提供する。
したがって、本発明はまた、薬物コンジュゲート、食品コンジュゲート、診断用コンジュ
ゲートなどのようなコンジュゲート中に含まれるランダムコイルポリペプチドまたはラン
ダムコイルポリペプチドセグメントを調製および／または製造する方法も提供する。また
、生物学的に活性なタンパク質またはランダムコイルポリペプチドもしくはランダムコイ
ルポリペプチドセグメントを含むコンジュゲートを調製および／または製造する方法も提
供される。さらに、調製および／もしくは製造する方法ならびに／または生物活性を有す
るか、または媒介するアミノ酸配列を含むか、または生物活性を有するか、または媒介す
るアミノ酸配列であり、前記ランダムコイルポリペプチドまたはランダムコイルポリペプ
チドセグメントをさらに含むポリペプチドを調製および／または製造する方法が提供され
る。これらの方法は、特に、（１ステップとして）本明細書において上記で提供された（
宿主）細胞を培養することと、（さらなるステップとして）前記ランダムコイルポリペプ
チドまたは生物学的に活性なタンパク質および／または前記生物学的に活性なタンパク質
および／または前記ポリペプチドコンジュゲートを、培養物から、または前記細胞から単
離することを含む。この単離されたランダムコイル、もっぱら、プロリンおよびアラニン
アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む生合成ランダムコイルポリペプチドまたはポリ
ペプチドセグメントならびに単離されたコンジュゲートは、次いでさらに処理されてもよ
い。例えば、添付の実施例においても示されるように、前記もっぱら、プロリンおよびア
ラニンアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む生合成ランダムコイルポリペプチドまた
はポリペプチドセグメントは、注目される分子に化学的に連結またはカップリングされ得
る。さらに、代替として、注目される分子は、例えば、トランスグルタミナーゼ（Beshee
r (2009年) J Pharm Sci. 98:4420〜8頁）またはその他の酵素（Subul (2009年) Org. Bi
omol. Chem. 7:3361〜3371頁）によって、前記プロリンおよびアラニンアミノ酸残基から
なるアミノ酸配列を含む生合成ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメン
トに酵素的にコンジュゲートされ得る。
ランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント）および／またはランダムコイル
ポリペプチド（またはそのセグメント）および生物学的にまたは治療上活性なタンパク質
または例えば、診断的方法において使用されるタンパク質のような注目されるタンパク質
を含むタンパク質コンジュゲートは、（とりわけ）増殖培地、細胞溶解物、周辺質または
細胞膜画分から単離され得る。（やはり、本発明は、医学的または薬学的設定において有
用である（タンパク質）コンジュゲートに制限されない。本明細書において提供された手
段および方法はまた、それだけには限らないが、食品および飲料産業、栄養産業、製紙業
、バイオ試薬産業、研究ツールおよび試薬産業、酵素が使用される産業、化粧品産業、油
処理および油回収などその他の産業領域においても有用である）。発現された本発明のポ
リペプチドの単離および精製は、硫酸アンモニウム沈殿、親和性精製、カラムクロマトグ
ラフィー、ゲル電気泳動などをはじめとする任意の従来手段によって実施され得（Scopes
(1982年)「Protein Purification」, Springer, New York, NY）、例えば、本発明の生
物学的に活性なタンパク質と融合しているタグに対して向けられるモノクローナルまたは
ポリクローナル抗体の使用を含み得る。例えば、タンパク質は、添付の実施例において記
載されるように、ストレプトアビジン親和性クロマトグラフィーを使用してＳｔｒｅｐ−
タグＩＩを介して精製され得る（Skerra (2000年) Methods Enzymol. 326:271〜304頁）
。特に、薬学的使用／適用にとって、少なくとも約９０〜９５％の均一性（タンパク質レ
ベルで）の実質的に純粋なポリペプチドが好ましく、９８〜９９％以上の均一性が最も好
ましい。製造手順において使用される宿主細胞／生物に応じて、本発明のポリペプチドは
、グリコシル化される場合も、グリコシル化されない場合もある。
本発明はさらに、医薬の調製のための、生物学的に活性なタンパク質、ランダムコイル
ポリペプチド（またはそのセグメント）または本発明の薬物コンジュゲートのようなコン
ジュゲート、本発明の核酸分子、本発明のベクターまたは本発明の（宿主）細胞の使用に
関し、これでは、前記生物学的に活性なタンパク質または薬物（または任意のその他の小
分子または注目されるタンパク質）は、少なくとも５０個のプロリン（Ｐｒｏ）およびア
ラニン（Ａｌａ）アミノ酸残基からなる、もっぱらプロリンおよびアラニンアミノ酸残基
からなるアミノ酸配列を含む生合成ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグ
メントを含まないか、またはそれに連結されていない対照分子と比較して、増大したｉｎ
ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性を有する。
なお別の実施形態では、本発明は、本明細書において記載される生物学的に活性なタン
パク質または薬物コンジュゲートを、このような治療を必要とする哺乳動物に投与するこ
とを含む、前記生物学的に活性なタンパク質または薬物の安定性の改善から恩恵を受ける
疾患および／または障害を治療するための方法に関する。本発明のタンパク質の生物活性
または薬物コンジュゲートに応じて、当業者ならば、どの疾患／障害が、本発明の特定の
生物学的に活性なタンパク質または薬物コンジュゲートを用いて治療されるかを容易に決
定できる。いくつかの限定されない例が、以下の表中に列挙されている：
上記に一致して、生物学的に活性なタンパク質、ランダムコイルポリペプチド（または
そのセグメント）、薬物コンジュゲート、核酸、ベクターまたは細胞は、例えば、ホルモ
ン欠乏または関連障害、自己免疫疾患、癌、貧血、血管新生疾患、感染性／炎症性疾患、
血栓症、心筋梗塞、糖尿病、不妊症、ゴーシェ病、肝炎、低血糖、先端巨大症（acromega
ly）、アデノシンデアミナーゼ欠乏症、血小板減少症、血友病、貧血、肥満症、アルツハ
イマー病、リポジストロフィー（lipodistrophy）、乾癬、転移性黒色腫、変形性関節症
、脂質代謝異常、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythromato
sis）、多発性硬化症、喘息、骨粗鬆症および再灌流傷害またはその他の腎臓疾患の治療
のための、好ましくは、特に、生物学的に活性なタンパク質および／または薬物成分の増
大したｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性を有するか、または付与す
る医薬の調製のために使用され得る。一実施形態では、生物学的に活性なタンパク質、薬
物コンジュゲート核酸、ベクターまたは細胞は、前記生物学的に活性なタンパク質／薬物
コンジュゲートの増大したｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性を有す
る医薬として使用するためのものである。同様に、生物学的に活性なタンパク質、ランダ
ムコイルポリペプチド（またはそのセグメント）、薬物コンジュゲート、核酸、ベクター
または細胞は、例えば、ホルモン欠乏または関連障害、自己免疫疾患、癌のような増殖性
障害、貧血、血管新生疾患、感染および／または炎症性疾患、血栓症、心筋梗塞卒中、糖
尿病、不妊症、陰茎機能不全、ゴーシェ病、ファブリー病、筋肉減少症、嚢胞性線維症、
閉塞性肺疾患、急性呼吸器症候群、肝炎、低血糖、先端巨大症、アデノシンデアミナーゼ
欠乏症、血小板減少症、血友病、貧血、肥満症、アルツハイマー病、リポジストロフィー
（lipodistrophy）、乾癬、転移性黒色腫、変形性関節症、脂質代謝異常、関節リウマチ
、全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythromatosis）、多発性硬化症、喘息、
骨粗鬆症および再灌流傷害またはその他の腎臓疾患の治療において使用するためのもので
ある。
本発明はまた、例えば、細胞ベースの遺伝子療法アプローチまたは核酸ベースの遺伝子
療法アプローチのような医学的アプローチにおける、核酸分子、ベクターならびに本明細
書において提供され、本発明の核酸分子またはベクターを含むトランスフェクトされた細
胞の使用に関する。
さらなる実施形態では、本明細書において提供されるランダムコイルポリペプチド（ま
たはそのポリペプチドセグメント）、生物学的に活性な、異種タンパク質／タンパク質構
築物または生合成ランダムコイルポリペプチド（またはそのポリペプチドセグメント）お
よび／もしくは本発明の核酸分子もしくはベクターもしくは宿主細胞を含む薬物もしくは
食品コンジュゲートまたはその他のコンジュゲートは、組成物の部分である。前記組成物
は、１つまたは複数の本発明のランダムコイルポリペプチド（またはそのポリペプチドセ
グメント）、生物学的に活性なタンパク質、食品コンジュゲート、注目されるコンジュゲ
ート、薬物コンジュゲートまたは核酸分子、ベクターおよび／またはそれをコードおよび
／または発現する宿主細胞を含み得る。前記組成物は、場合により、薬学的に許容される
担体および／または希釈剤をさらに含む医薬組成物であり得る。さらなる実施形態では、
本発明は、このような医薬組成物の取り込みを必要とする疾患の予防、治療または寛解の
ための医薬組成物の調製のための、本明細書において記載される生物学的に活性なタンパ
ク質、ランダムコイルポリペプチド（またはそのセグメント）または薬物コンジュゲート
の使用に関する。
本明細書において上記に記載したように、薬物コンジュゲートまたは診断用コンジュゲ
ートのような本明細書において開示されたコンジュゲートだけでなく、および／または生
物学的に活性な、異種タンパク質／タンパク質構築物（本発明のランダムコイルポリペプ
チドまたはそのポリペプチドセグメントを含む）は、特に、医学的または薬学的に使用さ
れる。また、前記ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントは、それ自
体、このような医学的関連で、例えば、損なわれた血漿量または血漿内容物と関連する障
害の寛解、予防および／または治療において、または損なわれた血液容積と関連する障害
の寛解、予防および／または治療において「血漿増補液」として、または血液代替物とし
て使用され得る。血漿増補液で治療される障害として、それだけには限らないが、傷害、
手術、火傷、外傷または腹部緊急事態、感染、脱水（dehydratations）などのような血液
喪失に帰する障害がある。しかし、このような医学的使用は、本発明のランダムコイルポ
リペプチドまたはポリペプチドセグメントに制限されず、本明細書において開示される特
定の薬物コンジュゲートまたはさらに、特定の生物学的に活性な、異種タンパク質／タン
パク質構築物に拡張され得る。
一実施形態では、本明細書において記載される組成物は、場合により、検出のための適
した手段をさらに含む診断用組成物、例えば、イメージング試薬であり得、前記診断用組
成物は、増大したｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性を有する。
本発明の組成物は、固体または液体形態であり得、とりわけ、散剤（単数または複数）
、錠剤（単数または複数）、溶液（単数または複数）またはエアゾール（単数または複数
）の形態であり得る。さらに、本発明の医薬は、医薬組成物の意図される使用に応じて、
さらなる生物学的に活性な薬剤を含み得るということが想定される。
適した（医薬）組成物の投与は、必要に応じて、局所治療、病巣内投与のために、種々
の方法によって、例えば、非経口、皮下、静脈内、動脈内、腹腔内、局所、気管支内、肺
内および鼻腔内投与によって達成され得る。非経口投与として、腹腔内、筋肉内、皮内、
皮下、静脈内または動脈内投与が挙げられる。本発明の組成物はまた、例えば、標的部位
に直接的に、例えば、外部標的または特異的に影響を受ける臓器のような内部標的に遺伝
子銃送達によって投与され得る。
適した薬学的担体、賦形剤および／または希釈剤の例は、当技術分野で周知であり、こ
れとして、リン酸緩衝生理食塩水溶液またはその他のバッファー溶液、水、油／水エマル
ジョンなどのエマルジョン、種々の種類の湿潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。このよう
な担体を含む組成物は、周知の従来法によって製剤され得る。適した担体は、本発明の生
物学的に活性なタンパク質／薬物コンジュゲートと組み合わせた場合に、その生物学的お
よび／または薬学的活性を保持する任意の物質を含み得る（Remington's Pharmaceutical
Sciences (1980年) 16th edition, Osol, A. Ed、Mack Publishing Company, Easton,PA
参照のこと）。非経口投与のための製剤は、滅菌水性または非水性溶液、懸濁液およびエ
マルジョンを含み得る。医薬組成物との関連で使用される、バッファー、溶媒および／ま
たは賦形剤は、好ましくは、本明細書において上記で定義されるように「生理学的」であ
る。非水性溶媒の例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ
オイルなどの植物油およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルがある。水性担体
として、生理食塩水および緩衝培地をはじめとする、水、アルコール性／水性溶液、エマ
ルジョンまたは懸濁液が挙げられる。非経口媒体は、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキ
ストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲルまたは固定油を含み
得る。静脈内媒体として、液体および栄養補充剤（fluid and nutrient replenishes）、
電解質補充剤（リンガーデキストロースに基づくものなど）などを挙げることができる。
防腐剤および抗菌剤、抗酸化物質、キレート化剤および／または不活性ガスなどをはじめ
とするその他の添加物もまた、存在し得る。さらに、本発明の医薬組成物は、例えば、好
ましくは、ヒト起源の血清アルブミンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質性担体を
含み得る。
これらの医薬組成物は、適した用量で対象に投与され得る。投与計画は、主治医および
臨床因子によって決定される。医学的技術分野においては周知であるが、任意の１人の患
者のための投与量は、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、
投与の時間および経路、全身の健康および同時に投与されているその他の薬物をはじめと
する多数の因子に応じて変わる。医薬上活性な物質は、用量あたり１μｇから２０ｍｇ／
体重１ｋｇの間、例えば、０．１ｍｇから１０ｍｇ／体重１ｋｇの間、例えば、０．５ｍ
ｇから５ｍｇ／体重１ｋｇの間の量で存在し得る。投与計画が連続注入である場合には、
１分あたり体重１キログラムあたり１μｇ〜１０ｍｇの範囲になければならない。しかし
、示される例示的範囲を下回るまたは超える用量も、特に前記因子を考慮して想定される
。
さらに、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の意図される使用に応じてさらなる生物学
的にまたは薬学的に活性な薬剤を含み得ることが想定される。これらのさらなる生物学的
にまたは薬学的に活性な薬剤は、例えば、抗体、抗体断片、ホルモン、増殖因子、酵素、
結合分子、サイトカイン、ケモカイン、核酸分子および薬物であり得る。
本発明は医薬組成物に制限されないということは注目すべきことである。また、研究に
おいて、または診断薬（単数または複数）として使用される組成物が想定される。例えば
、本明細書において定義されるランダムコイルドメインまたは構成要素を含む生物学的に
活性なタンパク質または薬物コンジュゲートは、診断設定において使用されるということ
が想定される。このような目的のために、本発明の生物学的に活性なタンパク質または本
発明の薬物コンジュゲートは、検出を可能にするために標識され得る。このような標識は
、それだけには限らないが、放射性標識（［３Ｈ］水素［１２５Ｉ］ヨウ化物または［１
２３Ｉ］ヨウ化物のような）、蛍光標識（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような蛍光タ
ンパク質、またはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）のようなフルオロフォ
アを含む）またはＮＭＲ標識（ガドリニウムキレートのような）を含む。ここで、定義さ
れた標識またはマーカーは、決して制限ではなく、単に例示的実施例を表すだけである。
本発明の診断用組成物は、追跡もしくはイメージング実験において、または診断的医学的
設定において特に有用である。添付の実施例および図面において、（ｉ）少なくとも５０
個のプロリン（Ｐｒｏ）およびアラニン（Ａｌａ）アミノ酸残基からなる、もっぱら、プ
ロリンおよびアラニンアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む生合成ランダムコイルポ
リペプチドまたはポリペプチドセグメントおよび（ｉｉ）フルオレセインまたはジゴキシ
ゲニンを含むコンジュゲートを含む対応する構築物の調製が提供される：添付の図１３お
よび１４ならびに対応する図の説明ならびに例示的実施例２２を参照のこと。
しかし、本明細書において提供される手段および方法の薬学的または診断的使用だけで
ないものが、本発明の主旨内にある。本明細書において提供される化合物／コンジュゲー
トもまた、食品産業、飲料産業、化粧品産業、油産業、製紙業など特定のその他の産業領
域においても有用である。したがって、本発明はまた、このような産業領域における、本
明細書において提供される生合成ランダムコイルポリペプチドの使用を提供する。また、
したがって、本発明の一部は、化粧品、美容的処置において使用される化粧品化合物、食
品または飲料の製造方法であり、前記方法は、本明細書において定義されるランダムコイ
ルポリペプチドをコードする核酸分子、または生物学的に活性なタンパク質および／また
は生物学的に活性なタンパク質および／または活性を有するか、もしくは媒介するアミノ
酸配列を含むか、または活性を有するか、もしくは媒介するアミノ酸配列であるポリペプ
チドをコードする核酸分子（またはベクター）を含む細胞の培養を含む。このような方法
はまた、前記ランダムコイルポリペプチド、前記生物学的に活性なタンパク質および／ま
たは生物活性のような活性を有するか、もしくは媒介するアミノ酸配列を含むか、または
生物活性のような活性を有するか、もしくは媒介するアミノ酸配列であり、前記ランダム
コイルポリペプチドまたはランダムコイルポリペプチドセグメントをさらに含む前記生物
学的に活性なタンパク質または前記ポリペプチドを、培養物から、または前記細胞から単
離することをも含む。同様の関連で、注目されるその他のコンジュゲート、例えば、油産
業または製紙業のような種々の産業の領域において有用であるコンジュゲートが製造され
得る。当業者は、対応する分子／組換え構築物を作製するために、ならびに少なくとも５
０個のプロリン（Ｐｒｏ）およびアラニン（Ａｌａ）アミノ酸残基からなる、もっぱら、
プロリンおよびアラニンアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む生合成ランダムコイル
ポリペプチドまたはポリペプチドセグメントおよび注目される小分子またはポリペプチド
を含むコンジュゲートを作製するために、本明細書において提供される手段および方法を
容易に適合させることができる。
なお別の実施形態では、本発明は、ランダムコイルポリペプチド（またはそのポリペプ
チドセグメント）、生物学的に活性なタンパク質、薬物コンジュゲート、前記生物学的に
活性なタンパク質をコードする、前記生物学的に活性なタンパク質をコードする核酸分子
、および／または前記生物学的に活性なタンパク質をコードするおよび／または活性（例
えば、生物活性）を有するか、もしくは媒介するアミノ酸配列を含むか、または活性（例
えば、生物活性）を有するか、もしくは媒介するアミノ酸配列である前記ポリペプチドを
コードする核酸分子、前記核酸分子を含むベクターまたは本明細書において記載される前
記核酸または前記ベクターを含む細胞を含むキットを提供する。本発明のキットはまた、
バッファー（単数または複数）、保存溶液および／または医学的、科学的または診断的ア
ッセイおよび目的の実施のために必要な追加の試薬または物質をさらに含み得る。さらに
、本発明のキットの一部は、バイアルまたはボトル中に個別に、または容器もしくはマル
チコンテナユニット中に組み合わせてパッケージングされ得る。
本発明のキットは、とりわけ、本発明の方法を実施するために使用され得、本明細書に
おいて言及される種々の適用において、例えば、診断キットとして、研究ツールとして、
または医学的ツールとして使用され得ることが有利である。さらに、本発明のキットは、
科学的、医学的および／または診断的目的に適した検出のための手段を含有し得る。キッ
トの製造は、当業者に公知である標準手順に従うことが好ましい。
本発明を、以下の、制限しない図面および実施例によってさらに例示する。
ＰＡ番号１ Ｐｒｏ／Ａｌａポリマー／ポリペプチド配列の遺伝子設計を示す図である。 ２つの相補的オリゴデオキシヌクレオチド（上部／コーディング鎖オリゴデオキシヌクレオチド配列番号１７、下部／非コーディング鎖オリゴデオキシヌクレオチド配列番号１８）のハイブリダイゼーションによって得られるＰＡ番号１（配列番号１）のビルディングブロックのヌクレオチドおよびコードされるアミノ酸配列。得られた核酸は、それぞれ、Ａｌａコドンおよびアンチコドンに対応する２つの付着末端（小文字で示される）を有し、相互に整合性の取れたものである。このようなビルディングブロックの繰り返されたライゲーションの際に、変動する長さのＰｒｏ−Ａｌａポリペプチドをコードするコンカテマーが得られ、続いて、例えば、ＳａｐＩ制限部位（単数または複数）によってクローニングされ得る。 Ｆａｂ断片との、またはヒトＩＦＮａ２ｂとの融合物としてのＰｒｏ／Ａｌａポリマー／ポリペプチド配列のクローニング戦略を示す図である。（Ａ）Ｐｒｏ／Ａｌａポリマー／ポリペプチド配列のサブクローニングおよび対応する生物学的に活性なタンパク質の発現に使用される、ｐＡＳＫ８８−Ｆａｂ−２ｘＳａｐＩ（配列番号２２）、ｐＡＳＫ７５の誘導体上にコードされるような抗体Ｆａｂ断片の免疫グロブリン軽鎖のＣ末端の周囲の、ヌクレオチドおよびコードされるアミノ酸配列ストレッチ（上部／コーディング鎖配列番号１９、下部／非コーディング鎖配列番号２０、コードされるアミノ酸配列配列番号２１）。ヌクレオチド配列は、相互に逆方向に２つのＳａｐＩ認識部位を保持し、これが、消化の際に、図１に示される合成遺伝子カセットに適合するＤＮＡ末端の突出につながる。軽鎖の認識配列およびＣ末端アミノ酸に下線が引かれている。 Ｆａｂ断片との、またはヒトＩＦＮａ２ｂとの融合物としてのＰｒｏ／Ａｌａポリマー／ポリペプチド配列のクローニング戦略を示す図である。（Ｂ）図１に示される単一カセットの、ｐＡＳＫ８８−Ｆａｂ−２ｘＳａｐＩプラスミドへの挿入後の、２０個の残基を有するＰＡ番号１ポリマー／ポリペプチドのヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列（上部／コーディング鎖配列番号２３、下部／非コーディング鎖配列番号２４、コードされるアミノ酸配列配列番号２５）。１０のこのような繰り返されたカセットの同様のライゲーション／挿入の結果、２００個の残基を有するポリマー／ポリペプチド（配列番号２６および２７）をコードするプラスミドベクターｐＦａｂ−ＰＡ番号１（２００）（配列番号２８）が得られた。Ｐｒｏ／Ａｌａポリマーをコードする配列に隣接するＳａｐＩ制限部位が標識される（認識配列に下線が引かれている）。 Ｆａｂ断片との、またはヒトＩＦＮａ２ｂとの融合物としてのＰｒｏ／Ａｌａポリマー／ポリペプチド配列のクローニング戦略を示す図である。（Ｃ）ｐＦａｂ−ＰＡ番号１（２００）（配列番号２８）のプラスミドマップ。Ｆａｂ−ＰＡ番号１（２００）の重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）の構造遺伝子は、テトラサイクリンプロモーター／オペレーター（ｔｅｔｐ／ｏ）およびリポタンパク質ターミネーター（ｔｌｐｐ）を有するオペロン末端の転写制御下にある。ＨＣは、細菌ＯｍｐＡシグナルペプチド、可変（ＶＨ）および第１のヒトＩｇＧ１重鎖定常Ｃドメイン（ＣＨ）ならびにＨｉｓ６−タグを含む。ＬＣは、細菌ＰｈｏＡシグナルペプチド、可変（ＶＬ）およびヒト軽鎖定常（ＣＬ）ドメイン、２００個の残基を有するＰＡ番号１ポリマー／ポリペプチドを含む。ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に隣接する発現カセットの外側のｐＦａｂ−ＰＡ番号１（２００）のプラスミド骨格は、遺伝子クローニングのものおよび発現ベクターｐＡＳＫ７５と同一である（Skerra (1994年) Gene 151:131〜135頁）。唯一の制限部位が示されている。 Ｆａｂ断片との、またはヒトＩＦＮａ２ｂとの融合物としてのＰｒｏ／Ａｌａポリマー／ポリペプチド配列のクローニング戦略を示す図である。（Ｄ）ｐＡＳＫ−ＩＦＮａ２ｂ（配列番号３２）上にクローニングされるようなヒトＩＦＮａ２ｂのＮ末端の周囲のヌクレオチドおよびアミノ酸配列ストレッチ（上部／コーディング鎖配列番号２９、下部／非コーディング鎖配列番号３０、コードされるアミノ酸配列配列番号３１）。Ｐｒｏ／Ａｌａポリマーをコードする配列の挿入のために使用され得る単一の制限部位ＳａｐＩが標識されている（認識配列に下線が引かれている）。Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩの２つのＣ末端アミノ酸に下線が引かれている。成熟ＩＦＮａ２ｂの第１のアミノ酸は、＋１で標識されている。 Ｆａｂ断片との、またはヒトＩＦＮａ２ｂとの融合物としてのＰｒｏ／Ａｌａポリマー／ポリペプチド配列のクローニング戦略を示す図である。（Ｅ）図１に示される１つのＰＡ番号１ポリマー配列カセットを挿入した後のＩＦＮａ２ｂのＮ末端のヌクレオチドおよびコードされるアミノ酸配列ストレッチ（上部／コーディング鎖配列番号３３、下部／非コーディング鎖配列番号３４、コードされるアミノ酸配列配列番号３５）。Ｐｒｏ／Ａｌａポリマーをコードする配列を挿入した後に残る単一の制限部位ＳａｐＩが標識されている（認識配列に下線が引かれている）。ＩＦＮａ２ｂの第１のアミノ酸は、融合タンパク質の一部として標識されており（１）、Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩの２つのＣ末端アミノ酸に下線が引かれている。１０の繰り返されたＰＡ番号１ポリマー配列カセットの同様のライゲーション／挿入の結果、２００個の残基を有するポリマー／ポリペプチドをコードするプラスミドベクターｐＰＡ番号１（２００）−ＩＦＮａ２ｂ（配列番号３６）が得られた。 Ｆａｂ断片との、またはヒトＩＦＮａ２ｂとの融合物としてのＰｒｏ／Ａｌａポリマー／ポリペプチド配列のクローニング戦略を示す図である。（Ｆ）ｐＰＡ番号１（２００）−ＩＦＮａ２ｂ（配列番号３７）のプラスミドマップ。生物学的に活性なタンパク質ＰＡ番号１（２００）−ＩＦＮａ２ｂ（細菌ＯｍｐＡシグナルペプチド、Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩ、２００個の残基を有するＰＡ番号１ポリマー／ポリペプチドセグメントおよびヒトＩＦＮａ２ｂを含む）の構造遺伝子は、テトラサイクリンプロモーター／オペレーター（ｔｅｔｐ／ｏ）およびリポタンパク質ターミネーター（ｔｌｐｐ）を有する末端の転写制御下にある。ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位が隣接する発現カセットの外側のプラスミド骨格は、遺伝子クローニングのものおよび発現ベクターｐＡＳＫ７５と同一である（Skerra (1994年)同著）。唯一の制限部位が示されている。 精製された組換えＦａｂ断片および精製された組換えＩＦＮａ２ｂならびにそれらのＰｒｏ／Ａｌａポリペプチド／ポリマー融合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を示す図である。 組換えタンパク質は、周辺質分泌によって大腸菌（E. coli）ＫＳ２７２において製造し（Strauch (1988年) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:1576〜80頁）、それぞれ、固定された金属またはストレプトアビジン親和性クロマトグラフィーを使用してＨｉｓ６−タグ（Ｆａｂ）またはＳｔｒｅｐ−タグＩＩ（ＩＦＮａ２ｂ）によって精製した。 （Ａ）精製された組換えＦａｂおよび２００個の残基を有するそのＰＡ番号１融合物の１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析。ゲルは、ＦａｂおよびＦａｂ−ＰＡ番号１（２００）の２μｇのタンパク質サンプル各々を示す。左側のサンプルは、２−メルカプトエタノールを用いて還元されているのに対し、右側の繰り返されたサンプルは還元されないまま残された。還元条件下で適用されたタンパク質マーカーの大きさは、左側余白に示されている。鎖間ジスルフィド橋を還元すると、Ｆａｂ断片およびその２００個の残基のＰＡ番号１融合物は、２つの均一なバンドとして現れる。還元されたＦａｂ断片の場合には、それぞれ、約２４および２６ｋＤａの分子の大きさを有する２つのバンドは、分離されたＬＣおよびＨＣに相当する。還元されたＦａｂ−ＰＡ番号１（２００）融合タンパク質の場合には、２４ｋＤａのバンドは、ＨＣに相当するのに対し、約９０ｋＤａのバンドは、ＰＡ番号１（２００）ポリペプチドセグメントと融合しているＬＣに相当する。非還元条件下では、Ｆａｂ断片およびそのＰＡ番号１（２００）融合物は、それぞれ、約４５ｋＤａおよび１００ｋＤａの見かけの分子の大きさを有する単一の均一なバンドとして現れる。Ｆａｂ−ＰＡ番号１（２００）融合タンパク質の２つの見かけの大きさの値は、非還元Ｆａｂ−ＰＡ番号１（２００）の６４．３ｋＤａの、および単離ＬＣ−ＰＡ番号１（２００）の３９．１ｋＤａの算出された質量よりも大幅に大きい。この効果は、４８．０ｋＤａの算出された質量を有するＦａｂ断片自体またはその融合していない軽鎖が、本質的に正常な電気泳動移動度を示すので、Ｐｒｏ／Ａｌａポリマー／ポリペプチドセグメントの付加によるものである。 （Ｂ）精製された組換えＩＦＮａ２ｂおよび２００個の残基を有するそのＰＡ番号１融合タンパク質の１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析。ゲルは、ＩＦＮａ２ｂおよびＰＡ番号１（２００）−ＩＦＮａ２ｂの２μｇのタンパク質サンプル各々を示す。左側のサンプルは、２−メルカプトエタノールを用いて還元されているのに対し、右側の対応するサンプルは、還元されないまま残された。還元条件下で適用されたタンパク質マーカーの大きさは、左側余白に示されている。２種のタンパク質は、還元形態で、約２０ｋＤａおよび約８０ｋＤａの見かけの分子の大きさを有する単一の均一なバンドとして現れる。後者の値は、ＰＡ番号１（２００）−ＩＦＮａ２ｂの３７．０ｋＤａの算出された質量よりも大幅に大きい。この効果は、２０．９ｋＤａの算出された質量を有するＩＦＮａ２ｂ自体が、本質的に正常な電気泳動移動度を示すので、Ｐｒｏ／Ａｌａポリマー／ポリペプチドセグメントの付加によるものである。非還元状態のＩＦＮａ２ｂは、わずかに高い電気泳動移動度を有し、これは、その２つの分子内ジスルフィド橋の結果としての、より緻密な形態を示す。 精製された組換えＦａｂおよびＩＦＮａ２ｂならびにそれらのＰＡ番号１（２００）融合物の流体力学的容積の定量的分析を示す図である。（Ａ）ＦａｂおよびＦａｂ−ＰＡ番号１（２００）の分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）。０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度の精製されたタンパク質２５０μｌを、ＰＢＳバッファーを用いて平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００ １０／３００ ＧＬカラムに適用した。２８０ｎｍでの吸収をモニタリングし、各クロマトグラフィー実施のピークを、１の値に正規化した。矢印は、カラムのボイド容量（７．８ｍｌ）を示す。 精製された組換えＦａｂおよびＩＦＮａ２ｂならびにそれらのＰＡ番号１（２００）融合物の流体力学的容積の定量的分析を示す図である。（Ｂ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００ １０／３００ ＧＬカラムを使用する（Ａ）からのクロマトグラムの較正曲線。マーカータンパク質（チトクロムｃ、１２．４ｋＤａ；炭酸脱水酵素、２９．０ｋＤａ；オボアルブミン、４３．０ｋＤａ；ウシ血清アルブミン、６６．３ｋＤａ；アルコール脱水素酵素、１５０ｋＤａ、β−アミラーゼ、２００ｋＤａ、アポフェリチン、４４０ｋＤａ）の分子量（ＭＷ）の対数を、その溶出容量（黒色の丸）に対してプロットし、直線によってフィッティングした。Ｆａｂ断片およびそのＰＡ番号１融合タンパク質（黒色の四角）の観察された溶出容量から、それらの見かけの分子の大きさが以下のように決定された。Ｆａｂ：３１ｋＤａ（真の質量：４８．０ｋＤａ）；Ｆａｂ−ＰＡ番号１（２００）：２３７ｋＤａ（真の質量：６４．３ｋＤａ）。これらのデータは、ＰＡ番号１ポリペプチドとの融合物がかなり増大した流体力学的容積を付与することを示す。 精製された組換えＦａｂおよびＩＦＮａ２ｂならびにそれらのＰＡ番号１（２００）融合物の流体力学的容積の定量的分析を示す図である。（Ｃ）ＩＦＮａ２ｂおよびＰＡ番号１（２００）−ＩＦＮａ２ｂの分析用サイズ排除クロマトグラフィー。０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度の各々精製されたタンパク質２５０μｌを、リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳを用いて平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００ １０／３００ ＧＬカラムに適用した。２８０ｎｍでの吸収をモニタリングし、各クロマトグラフィー実施のピークを、１の値に正規化した。矢印は、カラムのボイド容量（７．８ｍｌ）を示す。 精製された組換えＦａｂおよびＩＦＮａ２ｂならびにそれらのＰＡ番号１（２００）融合物の流体力学的容積の定量的分析を示す図である。（Ｄ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００ １０／３００ ＧＬカラムを使用する（Ｃ）からのクロマトグラムの較正曲線。マーカータンパク質（Ｂを参照のこと）の分子量（ＭＷ）の対数を、その溶出容量（黒色の丸）に対してプロットし、直線によってフィッティングした。ＩＦＮａ２ｂおよびそのＰＡ番号１融合タンパク質（黒色の四角）の観察された溶出容量から、それらの見かけの分子の大きさが以下のように決定された。ＩＦＮａ２ｂ：２２．５ｋＤａ（真の質量：２０．９ｋＤａ）；ＰＡ番号１（２００）−ＩＦＮａ２ｂ：２２９．０ｋＤａ（真の質量：３７．０ｋＤａ）。これらのデータは、ＰＡ番号１ポリペプチドとの融合物がかなり増大した流体力学的容積を付与することを示す。 組換えタンパク質およびそのＰＡ番号１ポリマー／ポリペプチド融合物の円二色性（ＣＤ）分光法による実験的二次構造分析を示す図である。各タンパク質について、スペクトルを、５０ｍＭ Ｋ２ＳＯ４、２０ｍＭ Ｋ−ホスフェート ｐＨ７．５中、室温で記録し、モル楕円率、ΘＭに対して正規化した。（Ａ）精製された組換えＦａｂおよびＦａｂ−ＰＡ番号１（２００）のＣＤスペクトル。Ｆａｂ断片のＣＤスペクトルは、主なβ−シートタンパク質の通常の特徴を示し、約２１６ｎｍの広い負の最大を有し（Sreerama in: Circular Dichroism - Principles and Appications (2000年) Berova, Nakanishi and Woody (編) Wiley, New York, NY、601〜620頁）、これは、細菌によって産生されたＦａｂ断片の正しいフォールディングを示す。Ｐｒｏ／Ａｌａポリマー／ポリペプチドとのその融合タンパク質のスペクトルは、ランダムコイルコンホメーションを示す２００ｎｍ未満のドミナントネガティブバンドを示す。さらに、約２２０ｎｍに肩部があり、これは、Ｆａｂ断片のβ−シート寄与に起因し、融合タンパク質の一部としてでさえその正しいフォールディングを示す。 組換えタンパク質およびそのＰＡ番号１ポリマー／ポリペプチド融合物の円二色性（ＣＤ）分光法による実験的二次構造分析を示す図である。各タンパク質について、スペクトルを、５０ｍＭ Ｋ２ＳＯ４、２０ｍＭ Ｋ−ホスフェート ｐＨ７．５中、室温で記録し、モル楕円率、ΘＭに対して正規化した。（Ｂ）Ｆａｂ断片のスペクトルをサブトラクションすることによって得られるＦａｂ−ＰＡ番号１（２００）のモル差ＣＤスペクトル。差ＣＤスペクトルは、２００個の残基のＰＡ番号１ポリマー／ポリペプチドセグメントの二次構造を表し、約２００ｎｍの強い最小を示し、これは、緩衝水性溶液におけるランダムコイルコンホメーションを明確に示す（Greenfield (1969年) Biochemistry 8: 4108〜4116頁;Sreerama (2000年)同著;Fandrich (2002年) EMBO J. 21:5682〜5690頁）。 組換えタンパク質およびそのＰＡ番号１ポリマー／ポリペプチド融合物の円二色性（ＣＤ）分光法による実験的二次構造分析を示す図である。各タンパク質について、スペクトルを、５０ｍＭ Ｋ２ＳＯ４、２０ｍＭ Ｋ−ホスフェート ｐＨ７．５中、室温で記録し、モル楕円率、ΘＭに対して正規化した。（Ｃ）精製された組換えＩＦＮａ２ｂおよびＰＡ番号１（２００）−ＩＦＮａ２ｂのＣＤスペクトル。ＩＦＮａ２ｂのＣＤスペクトルは、主なα−ヘリックスタンパク質の通常の特徴を示し、約２０８ｎｍおよび２２０ｎｍに２つの負のバンドを有し（Sreerama （2000年）同著）、これは、細菌によって産生されたヒトＩＦＮａ２ｂの正しいフォールディングを示す。Ｐｒｏ／Ａｌａポリマー／ポリペプチドとのその融合タンパク質のスペクトルは、特徴的な偏向を示し、約２００ｎｍにドミナント最小を有し、これは、ランダムコイルコンホメーションを示す。さらに、約２２０ｎｍに肩部があり、これは、ＩＦＮａ２ｂのα−ヘリックス寄与に起因し、融合タンパク質の一部としてでさえＩＦＮａ２ｂの正しいフォールディングを示す。 組換えタンパク質およびそのＰＡ番号１ポリマー／ポリペプチド融合物の円二色性（ＣＤ）分光法による実験的二次構造分析を示す図である。各タンパク質について、スペクトルを、５０ｍＭ Ｋ２ＳＯ４、２０ｍＭ Ｋ−ホスフェート ｐＨ７．５中、室温で記録し、モル楕円率、ΘＭに対して正規化した。（Ｄ）ＩＦＮａ２ｂのスペクトルをサブトラクションすることによって得られるＰＡ番号１（２００）−ＩＦＮａ２ｂのモル差ＣＤスペクトル。差ＣＤスペクトルは、２００個の残基のＰＡ番号１ポリマー／ポリペプチドセグメントの二次構造を表し、約２００ｎｍの強い最小を示し、（Ｂ）において示されるものと本質的に同一である。これは、やはり、本発明のＰｒｏおよびＡｌａ残基を含む生物学的ポリマーの緩衝水性溶液におけるランダムコイルコンホメーションを明確に示す。 ＣＨＯ細胞におけるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）および遺伝子によって（genetically）コードされるＰＡ番号１ポリマー間の融合タンパク質の分泌性製造を示す図である。（Ａ）ｐＡＳＫ７５−Ｈｉｓ６−ｈＧＨ（配列番号４１）上にクローニングされるｈＧＨのＮ末端の周囲の、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列ストレッチ（上部／コーディング鎖配列番号３８、下部／非コーディング鎖配列番号３９、コードされるアミノ酸配列配列番号４０）。サブクローニングのためにＨｉｎｄＩＩＩ（示されていない）と一緒に使用され得る単一制限部位ＮｈｅＩおよびＰｒｏ／Ａｌａポリマーをコードする配列の挿入のために使用され得るＳａｐＩが、標識されている（認識配列に下線が引かれている）。Ｈｉｓ６−タグの６個のアミノ酸に下線が引かれている。ｈＧＨの第１のアミノ酸が、＋１で標識されている。 ＣＨＯ細胞におけるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）および遺伝子によってコードされるＰＡ番号１ポリマー間の融合タンパク質の分泌性製造を示す図である。（Ｂ）図１に示される１つのＰＡ番号１ポリマー配列カセットの挿入後の、ｈＧＨのＮ末端の、ヌクレオチドおよびコードされるアミノ酸配列（上部／コーディング鎖配列番号４２、下部／非コーディング鎖配列番号４３、コードされるアミノ酸配列配列番号４４）。サブクローニングのために使用され得る単一制限部位ＮｈｅＩおよびＰｒｏ／Ａｌａポリマーをコードする配列の挿入後にそのままであるＳａｐＩが標識されている（認識配列に下線が引かれている）。融合タンパク質の一部としてｈＧＨの第１のアミノ酸が標識されており（１）、Ｈｉｓ６−タグのアミノ酸に下線が引かれている。１０の繰り返されたＰＡ番号１ポリマー配列カセットの同様のライゲーション／挿入の結果、成熟融合タンパク質配列番号４５をコードするプラスミドベクターｐＡＳＫ７５−Ｈｉｓ６−ＰＡ番号１（２００）−ｈＧＨが得られた。 ＣＨＯ細胞におけるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）および遺伝子によってコードされるＰＡ番号１ポリマー間の融合タンパク質の分泌性製造を示す図である。（Ｃ）ｐＡＳＫ７５−Ｈｉｓ６−ＰＡ番号１（２００）−ｈＧＨ（配列番号４６）のプラスミドマップ。生物学的に活性なタンパク質Ｈｉｓ６−ＰＡ番号１（２００）−ｈＧＨ（細菌ＯｍｐＡシグナルペプチド、Ｈｉｓ６−タグ、２００個の残基を有するＰＡ番号１ポリマー／ポリペプチドセグメントおよびヒトＧＨを含む）の構造遺伝子は、テトラサイクリンプロモーター／オペレーター（ｔｅｔｐ／ｏ）およびリポタンパク質ターミネーター（ｔｌ ｐｐ）を有する末端の転写制御下にある。ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位が隣接する発現カセットの外側のプラスミド骨格は、遺伝子クローニングのものおよび発現ベクターｐＡＳＫ７５と同一である（Skerra (1994年)同著）。唯一の制限部位が示されている。 ＣＨＯ細胞におけるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）および遺伝子によってコードされるＰＡ番号１ポリマー間の融合タンパク質の分泌性製造を示す図である。（Ｄ）Ｈｉｓ６−ＰＡ番号１（２００）−ｈＧＨ融合タンパク質（配列番号４７）をコードするｐＣＨＯ−ＰＡ番号１（２００）−ｈＧＨのプラスミドマップ。ヒト成長ホルモンシグナルペプチド（Ｓｐ）、Ｈｉｓ６−タグ、２００個の残基を有するＰＡ番号１ポリマー／ポリペプチド配列（ＰＡ番号１（２００））、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を含み、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨ ｐＡ）を含有する構造遺伝子は、サイトメガロウイルスウイルスプロモーター（ＣＭＶｐ）の転写制御下にある。唯一の制限部位ＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩが示されている。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）の耐性遺伝子は、ＳＶ４０プロモーター（ＳＶ４０ｐ）とそれに続くＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０ ｐＡ）の制御下にある。さらに、プラスミドは、大腸菌の増殖および選択を可能にするために、細菌ＣｏｌＥ１複製起点（ＣｏｌＥ１−ｏｒｉ）、バクテリオファージｆ１複製起点（ｆ１−ｏｒｉ）およびβ−ラクタマーゼ遺伝子（ｂｌａ）を含有する。 ＣＨＯ細胞におけるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）および遺伝子によってコードされるＰＡ番号１ポリマー間の融合タンパク質の分泌性製造を示す図である。（Ｅ）組換えｈＧＨと比較した、ＣＨＯ細胞において製造されたｈＧＨおよび２００個の残基の遺伝子によってコードされるＰＡ番号１ポリマー間の融合タンパク質のウエスタンブロット分析。ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、ｐＣＨＯ−ＰＡ番号１（２００）−ｈＧＨ（配列番号４８）で、またはｐＣＨＯ−ｈＧＨ（配列番号４９）、ＰＡ番号１（２００）配列を含まないｈＧＨをコードする同様のプラスミド（Ｈｉｓ６−タグも保持する）のいずれかでトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、細胞培養上清のサンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウマラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲートされた抗ｈＧＨ抗体を用いるウエスタンブロッティングに付した。約２３ｋＤａ（Ｈｉｓ６−ｈＧＨ）および約９０ｋＤａ（Ｈｉｓ６−ＰＡ番号１−ｈＧＨ）の見かけの分子の大きさを有する２種のタンパク質が、矢印によって示される単一バンドとして現れる。また、培養培地中の血清タンパク質に起因する約６０ｋＤａの弱いバンドがある。Ｈｉｓ６−タグがつけられたｈＧＨは、２３．５ｋＤａの算出された質量で現れるのに対し、Ｈｉｓ６−ＰＡ番号１−ｈＧＨの見かけの分子の大きさは、３９．５ｋＤａのその算出された質量よりも大幅に大きい。この効果は、Ｐｒｏ−Ａｌａポリマーの親水性ランダムコイルの性質によるものである。 ＰＡ番号１Ｐｒｏ／Ａｌａポリペプチド／ポリマー配列の二次構造の理論的予測を示す図である。 この例示は、バージニア大学の配列比較および二次構造予測サーバー（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２）で実施される、チョウ−ファスマン法のＣＨＯＦＡＳコンピュータアルゴリズムからのアウトプットを示す（Chou and Fasman (1974年) Biochemistry 13: 222〜245頁）。アミノおよびカルボキシ末端での境界効果を避けるために、図１の２０マーのアミノ酸リピートを３回の連続コピーでペーストし（その結果、合成遺伝子カセットの繰り返されたライゲーション／挿入後にコードされるものと同様のコンカテマーが得られる）、中央の２０マーの配列ブロック（四角で囲まれた）のアウトプットのみが考慮された。ＰＡ番号１ポリペプチド配列／セグメント（配列番号１）の場合には、チョウ−ファスマンアルゴリズムによって、１００％のα−ヘリックス二次構造が予測される。これは、融合タンパク質の一部としてのＰＡ番号１ポリペプチド／ポリペプチドセグメントの実験で観察された主なランダムコイルコンホメーションとは対照的である（図５Ｂ／Ｄ参照のこと）。 ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける精製された組換えＦａｂ断片および２００および６００個の残基を有するそのＰＡ番号１ポリマー融合物の薬物動態の定量的分析を示す図である。 実施例１６から得られた血漿サンプルを、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用してＦａｂ、Ｆａｂ−ＰＡ番号１（２００）およびＦａｂ−ＰＡ番号１（６００）濃度についてアッセイした。Ｆａｂ、Ｆａｂ−ＰＡ番号１（２００）およびＦａｂ−ＰＡ番号１（６００）の血漿半減期を推定するために、測定された濃度値を、静脈内注射後の時間に対してプロットし、双指数関数的（bi-exponential）減衰を推定しながら数値的にフィッティングした。融合していないＦａｂ断片は、極めて迅速なクリアランスを示し、１．３±０．１時間の排出半減期を有する。対照的に、Ｆａｂ−ＰＡ番号１（２００）およびＦａｂ−ＰＡ番号１（６００）について決定された排出相は、大幅に遅く、それぞれ、４．１±１．８時間および３８．８±１１．２時間の末端半減期を有し、したがって、融合していないＦａｂ断片と比較して、２００または６００個の残基を有するＰｒｏ／Ａｌａポリマー融合によって約３倍および約３０倍の延長された循環を実証した。 ２００個の残基を有するＰ１Ａ１またはＰ１Ａ３ポリマーとの融合物としての精製された組換えＦａｂ断片の分析を示す図である。 組換えタンパク質は、周辺質分泌によって大腸菌（E. coli）ＫＳ２７２において製造し、固定された金属親和性クロマトグラフィーを使用してＨｉｓ６−タグによって精製した。精製されたタンパク質は、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ゲルは、Ｆａｂ−Ｐ１Ａ１（２００）およびＦａｂ−Ｐ１Ａ３（２００）の、ならびに、比較のために、融合していないＦａｂ断片（図３Ａ参照のこと）の２μｇのタンパク質サンプル各々を示す。左側のサンプルは、２−メルカプトエタノールを用いて還元されているのに対し、右側の類似のサンプルは還元されないまま残された。還元条件下で適用したタンパク質マーカーの大きさは、左側余白に示されている。鎖間ジスルフィド橋を還元した後、Ｆａｂ断片およびその２００個の残基のＰｒｏ／Ａｌａ融合物が、２つの均一なバンドとして現れる。還元されたＦａｂ断片の場合には、それぞれ、約２４および２６ｋＤａの分子の大きさを有する２つのバンドは、分離された軽鎖（ＬＣ）および重鎖断片（ＨＣ）に相当する。還元されたＦａｂ−Ｐ１Ａ１（２００）融合タンパク質の場合には、２４ｋＤａのバンドがＨＣに相当するのに対し、約９０ｋＤａのバンドは、Ｐ１Ａ１（２００）ポリペプチドと融合しているＬＣに相当する。還元されたＦａｂ−Ｐ１Ａ３（２００）融合タンパク質の場合には、２４ｋＤａのバンドは、ＨＣに相当するのに対し、約７５ｋＤａのバンドは、Ｐ１Ａ５（２００）ポリペプチドと融合しているＬＣに相当する。非還元条件下では、Ｆａｂ断片、そのＰ１Ａ１（２００）およびそのＰ１Ａ３（２００）融合物は、それぞれ、約４５ｋＤａ、１１０ｋＤａおよび９０ｋＤａの見かけの分子の大きさを有する単一の顕著なバンドとして現れる。Ｆａｂ−Ｐ１Ａ１（２００）およびＦａｂ−Ｐ１Ａ３（２００）融合タンパク質の見かけの大きさは、非還元Ｆａｂ−Ｐ１Ａ１（２００）の６５．３ｋＤａの、および非還元Ｆａｂ−Ｐ１Ａ３（２００）の６４．０ｋＤａの算出された質量よりも大幅に大きい。また、対応する還元軽鎖の見かけの大きさも、Ｐ１Ａ１（２００）ＬＣの４０．７ｋＤａの、およびＰ１Ａ３（２００）ＬＣの３９．４ｋＤａの算出された質量よりも大幅に大きい。この効果は、４８．０ｋＤａの算出された質量を有するＦａｂ断片自体または２３．４ｋＤａの算出された質量を有するその融合していない軽鎖は、本質的に正常な電気泳動移動度を示すので、Ｐｒｏ／Ａｌａポリマー／ポリペプチドセグメントの付加によるものである。 精製された組換えＦａｂ−Ｐ１Ａ１（２００）およびＦａｂ−Ｐ１Ａ３（２００）融合タンパク質の流体力学的容積の定量的分析を示す図である。 Ｆａｂ−Ｐ１Ａ１（２００）およびＦａｂ−Ｐ１Ａ３（２００）の分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）。０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度の精製されたタンパク質２５０μｌを、ＰＢＳを用いて平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００ １０／３００ ＧＬカラムに適用した。２８０ｎｍでの吸収をモニタリングし、各クロマトグラフィー実施のピークを、１の値に正規化した。矢印は、カラムのボイド容量を示す（７．８ｍｌ）。融合タンパク質の観察された溶出容量から、それらの見かけの分子の大きさが、図４Ｂに示されるものと同様の較正曲線を使用して以下のように決定された。Ｆａｂ−Ｐ１Ａ１（２００）：１８０．７ｋＤａ（真の質量：６５．３ｋＤａ）；Ｆａｂ−Ｐ１Ａ３（２００）：１６０．２ｋＤａ（真の質量：６４．０ｋＤａ）。これらのデータは、タンパク質のＰ１Ａ１および／またはＰ１Ａ５ポリペプチドとの融合物がかなり増大した流体力学的容積を付与することを示す。 Ｆａｂ−Ｐ１Ａ１（２００）およびＦａｂ−Ｐ１Ａ３（２００）融合物の円二色性（ＣＤ）分光法による実験的二次構造分析を示す図である。 各タンパク質について、スペクトルを、５０ｍＭ Ｋ２ＳＯ４、２０ｍＭ Ｋ−ホスフェートｐＨ７．５中、室温で記録し、モル楕円率、ΘＭに対して正規化した。 （Ａ）精製された組換えＦａｂ−Ｐ１Ａ１（２００）およびＦａｂ−Ｐ１Ａ３（２００）のＣＤスペクトル。Ｐｒｏ／Ａｌａポリマー／ポリペプチドを有するＦａｂ融合タンパク質のＣＤスペクトルは各々、ランダムコイルコンホメーションを示す２００ｎｍ未満のドミナントネガティブバンドを示す。さらに、約２２０ｎｍに肩部があり、これは、Ｆａｂ断片のβ−シート寄与に起因し、融合タンパク質の一部としてでさえその正しいフォールディングを示す。 （Ｂ）融合していないＦａｂ断片のスペクトルをサブトラクションすることによって得られるＦａｂ−Ｐ１Ａ１（２００）およびＦａｂ−Ｐ１Ａ３（２００）のモル差ＣＤスペクトル（図５Ａ参照のこと）。差ＣＤスペクトルは、２００個の残基のＰ１Ａ１（配列番号５１）およびＰ１Ａ３（配列番号３）ポリマー／ポリペプチドセグメント、それぞれの二次構造を表し、約２００ｎｍの強い最小を示し、これは、緩衝水性溶液におけるそれらのランダムコイルコンホメーションを明確に示す（Greenfield (1969年) Biochemistry 8: 4108〜4116頁;Sreerama (2000年)同著;Fandrich (2002年) EMBO J. 21:5682〜5690頁）。 単離された生合成Ｐｒｏ／Ａｌａポリマー／ポリペプチドの調製を示す図である。 （Ａ）ｐＳＵＭＯ−ＰＡ番号１（２００）（配列番号６０）のプラスミドマップ。開始メチオニンコドンと、それに続くリシンコドン、６個の連続したＨｉｓ残基のＮ末端親和性タグ、切断可能な小さいユビキチン様モディファイヤー（ＳＵＭＯ）タンパク質Ｓｍｔ３ｐ（Panavas (2009年) Methods Mol Biol. 497:303〜17頁）および２００個の残基を有するＰＡ番号１ポリマー／ポリペプチドセグメント（配列番号６０）を含む融合タンパク質ＭＫ−Ｈｉｓ（６）−ＳＵＭＯ−ＰＡ番号１（２００）の構造遺伝子は、バクテリオファージＴ７の遺伝子１０プロモーターおよびtφターミネーターを有する末端の転写制御下にある。さらなるプラスミドエレメントは、複製起点（ｏｒｉ）、アンピシリン耐性遺伝子（ｂｌａ）およびｆ１複製起点を含む。ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位が隣接する発現カセットの外側のプラスミド骨格は、サイレント突然変異によって排除されたＳａｐＩ制限部位を除いて、遺伝子クローニングのものおよび発現ベクターｐＲＳＥＴ５ａと同一である（Schoepfer (1993年) 124: 83〜85頁）。 同封の配列表（同様に本説明および明細書の一部である）中に配列番号６０が提供され、本明細書において以下に再現される。
（Ｂ）細菌によって産生されたＨｉｓ（６）−ＳＵＭＯ−ＰＡ番号１（２００）融合タ
ンパク質およびその切断の１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析。ゲルは、実施例２１に記
載されたようにＵｂｌ特異的プロテアーゼ１（ＳＵＭＯプロテアーゼ）でのタンパク質分
解切断の前（レーン１）後（レーン２）の、大腸菌（E. coli）から抽出され、固定され
た金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓ
ＥＣ）によって精製されたＳＵＭＯ−ＰＡＳ番号１（２００）融合タンパク質を示す。す
べてのサンプルは２−メルカプトエタノールを用いて還元されていた。還元条件下で適用
されたタンパク質マーカー（Ｍ）の大きさは、左側余白に示されている。Ｈｉｓ（６）−
ＳＵＭＯ−ＰＡ番号１（２００）融合タンパク質は、約１００ｋＤａの見かけの分子の大
きさを有する単一の均一なバンドとして現れる。したがって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて
観察されたＨｉｓ（６）−ＳＵＭＯ−ＰＡ番号１（２００）融合タンパク質の見かけの大
きさは、２８．３ｋＤａの算出された質量よりも大幅に大きく、これはＰｒｏ／Ａｌａポ
リマー／ポリペプチドの存在によるものである。切断後、親水性ＰＡ番号１（２００）ポ
リペプチドは、クマシーブルーによって検出可能に染色されず、したがって、融合タンパ
ク質の小さい残存する画分および切断されたＨｉｓ（６）−ＳＵＭＯタンパク質のみが、
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で見える（レーン２）。Ｈｉｓ（６）−ＳＵＭＯタンパ
ク質は、約１６ｋＤａの見かけの分子の大きさを有する均一なバンドを示し（レーン２）
、これは、１２．２ｋＤａのその算出された分子量とよく一致する。
生合成Ｐｒｏ／Ａｌａポリマー／ポリペプチドの化合物および／または薬物とのコンジュゲーションを示す図である。（Ａ−Ｄ）分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってモニタリングされた生合成ＰＡ番号１（２００）ポリマー／ポリペプチド（配列番号６１）を有するフルオレセインコンジュゲートの製造。パネルは、（上から下に）精製されたＨｉｓ（６）−ＳＵＭＯ−ＰＡ番号１（２００）（Ａ）、ＳＵＭＯプロテアーゼの存在下での切断反応後のＨｉｓ（６）−ＳＵＭＯ−ＰＡ番号１（２００）（Ｂ）、フルオレセインＮＨＳエステルを用いた化学的カップリング後の切断されたＨｉｓ（６）−ＳＵＭＯ−ＰＡ番号１（２００）バッチ（Ｃ）およびＩＭＡＣ精製後のフルオレセイン−ＰＡ番号１（２００）コンジュゲート（Ｄ）のＳＥＣ実施を示す。約０．５ｍｇ／ｍｌの濃度のタンパク質／ポリペプチド２５０μｌを、Ａｋｔａ精製器システムでＰＢＳを用いて平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００ １０／３００ ＧＬカラムに適用した。２２５ｎｍ、２８０ｎｍおよび４９４ｎｍでの吸収を、ＵＶ−９００ ＵＶ／ＶＩＳ検出器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してモニタリングし、各クロマトグラムの顕著なピークを、１の値に正規化した。矢印は、カラムのボイド容量を示す（７．３ｍｌ）。 生合成Ｐｒｏ／Ａｌａポリマー／ポリペプチドの化合物および／または薬物とのコンジュゲーションを示す図である。（Ｅ−Ｋ）遊離フルオレセイン、生合成ＰＡ番号１（２００）ポリマー／ポリペプチドおよびそのフルオレセインコンジュゲートのＳＥＣおよびＵＶ／ＶＩＳ分光法による特性決定。３つのクロマトグラムは、（上から下に）精製されたＰＡ番号１（２００）（Ｅ）、化合物フルオレセイン（Ｆ）および精製されたフルオレセイン−ＰＡ番号１（２００）コンジュゲート（Ｇ）を示す。４種のＵＶ／ＶＩＳスペクトルは、精製されたＨｉｓ（６）−ＳＵＭＯ−ＰＡ番号１（２００）融合タンパク質（Ｈ）、精製されたＰＡ番号１（２００）ポリマー／ポリペプチド（Ｉ）、遊離フルオレセイン（Ｊ）および精製されたフルオレセイン−ＰＡ番号１（２００）コンジュゲート（Ｋ）（すべてＰＢＳ中）を示す。矢印は、ＳＵＭＯ（２８０ｎｍ）、ＰＡ番号１（２００）（２２５ｎｍ）およびフルオレセイン（４９４ｎｍ）の特徴的な吸収バンド／肩部を示す。 生合成Ｐｒｏ／Ａｌａポリマー／ポリペプチドの化合物および／または薬物とのコンジュゲーションを示す図である。（Ｅ−Ｋ）遊離フルオレセイン、生合成ＰＡ番号１（２００）ポリマー／ポリペプチドおよびそのフルオレセインコンジュゲートのＳＥＣおよびＵＶ／ＶＩＳ分光法による特性決定。３つのクロマトグラムは、（上から下に）精製されたＰＡ番号１（２００）（Ｅ）、化合物フルオレセイン（Ｆ）および精製されたフルオレセイン−ＰＡ番号１（２００）コンジュゲート（Ｇ）を示す。４種のＵＶ／ＶＩＳスペクトルは、精製されたＨｉｓ（６）−ＳＵＭＯ−ＰＡ番号１（２００）融合タンパク質（Ｈ）、精製されたＰＡ番号１（２００）ポリマー／ポリペプチド（Ｉ）、遊離フルオレセイン（Ｊ）および精製されたフルオレセイン−ＰＡ番号１（２００）コンジュゲート（Ｋ）（すべてＰＢＳ中）を示す。矢印は、ＳＵＭＯ（２８０ｎｍ）、ＰＡ番号１（２００）（２２５ｎｍ）およびフルオレセイン（４９４ｎｍ）の特徴的な吸収バンド／肩部を示す。 生合成Ｐｒｏ／Ａｌａポリマー／ポリペプチドの化合物および／または薬物とのコンジュゲーションを示す図である。（Ｌ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００ １０／３００ ＧＬカラムを使用して（Ａ−Ｇ）から得られたクロマトグラムの較正曲線。マーカータンパク質（アプロチニン、６．５ｋＤａ；チトクロムＣ、１２．４ｋＤａ；炭酸脱水酵素、２９．０ｋＤａ；ウシ血清アルブミン、６６．３ｋＤａ；アルコール脱水素酵素、１５０ｋＤａ；β−アミラーゼ、２００ｋＤａ；アポフェリチン、４４０ｋＤａ）の分子量（ＭＷ）の対数を、その溶出容量（ｘ）に対してプロットし、直線によってフィッティングした。Ｈｉｓ（６）−ＳＵＭＯ−ＰＡ番号１（２００）（１０．８１ｍｌ）、ＰＡ番号１（２００）（１１．５１ｍｌ）、フルオレセイン−ＰＡ番号１（２００）（１１．４９ｍｌ）およびフルオレセイン（２７．５７ｍｌ）の観察された溶出容量から、それらの見かけの分子の大きさが以下のように決定された。Ｈｉｓ（６）−ＳＵＭＯ−ＰＡ番号１（２００）：２１５．６ｋＤａ、ＰＡ番号１（２００）：１５４．１ｋＤａ（真の質量：１６．１ｋＤａ）、フルオレセイン−ＰＡ番号１（２００）：１５５．６ｋＤａ（真の質量：１６．６ｋＤａ）；ＳＵＭＯ：２５．７ｋＤａ（真の質量：１２．２ｋＤａ）；フルオレセイン：０．０９ｋＤａ（真の質量：０．３３ｋＤａ）。これらのデータは、Ｐｒｏ／Ａｌａポリペプチド／ポリマーとの融合物が、コンジュゲートされた薬物に、修飾されていない化合物と比較してかなり増大した流体力学的容積を付与することを示す。 生合成Ｐｒｏ／Ａｌａポリマー／ポリペプチドの化合物および／または薬物とのコンジュゲーションを示す図である。（Ｍ）生合成ＰＡ番号１（２００）ポリペプチド／ポリマーおよびステロイド化合物ジゴキシゲニン間の化学的コンジュゲートのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）による特性決定。ジゴキシゲニン−ＰＡ番号１（２００）のデコンボリューションされたＥＳＩ−ＭＳスペクトルは、１６６７１．４Ｄａの質量を示し、ジゴキシゲニン−ＰＡ番号１（２００）コンジュゲートの算出された質量（１６６７０．６Ｄａ）と本質的に一致する。 生合成ＰＡ番号１（２００）ポリペプチド／ポリマーおよび小分子薬間の化学的コンジュゲートを例示する図である。 （Ａ）生合成ＰＡ番号１（２００）のＮ末端にカップリングされたフルオレセイン。 （Ｂ）生合成ＰＡ番号１（２００）のＮ末端にカップリングされたジゴキシゲニン。
本発明を、本発明およびその多数の利点のより良好な理解を提供する以下の例示的な限
定されない例によってさらに記載する。
特に断りのない限り、例えば、Sambrook (2001)同著に記載される組換え遺伝子技術の
確立された方法を使用した。
Ｐｒｏ／Ａｌａアミノ酸ポリマー／ポリペプチドの遺伝子合成。
本明細書において上記で記載されるように、ＰｒｏおよびＡｌａ残基からなるアミノ酸
リピートは、本明細書においてＰｒｏ／Ａｌａまたは「ＰＡ」と表される。Ｐｒｏおよび
Ａｌａを含む反復ポリマー配列をコードする遺伝子断片（配列番号１に対応するＰＡ番号
１）は、図１に示される２種の相補的オリゴデオキシヌクレオチド（配列番号１７および
配列番号１８）のハイブリダイゼーションと、それに続く、相互に適合するが、非回文構
造の付着末端のＤＮＡライゲーションによる方向性のある方法でのコンカテマー形成によ
って得た。オリゴデオキシヌクレオチドは、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｕｌｍ
、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、分取尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製
した。オリゴデオキシ（desoxy）ヌクレオチドの核酸配列が図１に表されている（対応す
る付着末端のライゲーションの際に以下のＰＡ番号１配列リピートの一部となる、アラニ
ンに対するさらなるＧＣＣコドンを含む配列番号１７および１８。酵素的リン酸化は、１
００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．６、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ
ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ中で２００ｐｍｏｌの両オリゴデオキシヌクレオチドを混合し、
１０ｕのポリヌクレオチドキナーゼ（ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｓｔ． Ｌｅｏｎ−
Ｒｏｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の存在下、３７℃で３０分間インキュベートすることによって
実施した。８０℃で１０分間変性させた後、混合物を室温に一晩冷却して、ハイブリダイ
ゼーションを達成した。次いで、５０μｌのこの溶液を、１ｕのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（
ＭＢＩ Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）および１０μｌの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７
．４、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＡＴＰ、場合によっては、
５ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを１００μｌの総容量に添加す
ることおよび氷上で５５分間インキュベートすることによってライゲーションした。７０
℃で１０分間熱不活性化した後、ライゲーション生成物を、ＴＡＥバッファー（４０ｍＭ
Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ酢酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ）の存在下で１．５％（ｗ／ｖ）アガロー
スゲル電気泳動によって分離した。臭化エチジウムを用いて染色した後、３００ｂｐの長
さの組み立てられた（assembled）遺伝子セグメントに対応するバンドを切り出し、単離
した。
Ｆａｂ−ＰＡ番号１融合タンパク質の発現ベクターとしてのｐＦａｂ−ＰＡ番号１（２０
０）の構築。
実施例１から得られたＰＡ番号１の２０個のアミノ酸配列をコードする１０マーのリピ
ートの合成遺伝子断片のクローニングのために、プラスミドベクターｐＡＳＫ８８−Ｆａ
ｂ−２ｘＳａｐＩ（配列番号２２）、軽鎖の３’末端に、逆の相補的方向に２つのＳａｐ
Ｉ制限部位を有するヌクレオチド配列を有するＦａｂ断片の発現プラスミド（Schlapschy
(2007年) Protein Eng. Des. Sel. 20:273〜284頁）（図２Ａ）を使用した。ｐＡＳＫ７
５の誘導体である（Skerra、A. (1994年) Gene 151:131〜135頁）このベクターを、Ｓａ
ｐＩを用いて切断し、エビアルカリホスファターゼ（ＵＳＢ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ
）を用いて脱リン酸化し、実施例１から得られた合成ＤＮＡ断片の３００ｂｐのカセット
とライゲーションした。得られた中間プラスミドｐＦａｂ−ＰＡ番号１（１００）を、Ｓ
ａｐＩを用いて再度切断し、エビアルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化し、実施例
１から得られた合成ＤＮＡ断片の３００ｂｐのカセットとライゲーションした（図２Ｂに
例示されるが、ＰＡ番号１（２０）ポリマー／ポリペプチドカセットのみを有する）。得
られたプラスミドは、ｐＦａｂ−ＰＡ番号１（２００）（配列番号２８）（図２Ｃ）と表
した。このプラスミド上、２００個の残基のＰＡ番号１配列リピートのコーディング領域
は、２つのＳａｐＩ制限が隣接しており、これによって、５’−ＧＣＣヌクレオチドオー
バーハングを保持する全配列カセットの正確な切り出しおよびさらなるサブクローニング
が可能となるということは留意されなければならない。
大腸菌（E. coli）ＸＬ１−Ｂｌｕｅを形質転換した後（Bullock (1987年) Biotechniq
ues 5: 376〜378頁）、プラスミドを調製し、クローニングされた合成核酸インサートの
配列を、ＢｉｇＤｙｅ（商標）ターミネーターキットならびに両側からの配列決定を可能
にしたオリゴデオキシヌクレオチドプライマーを使用して、制限分析および二本鎖ＤＮＡ
配列決定（ＡＢＩ−Ｐｒｉｓｍ（商標）３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｐ
ｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｅｉｔｅｒｓｔａ
ｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって確認した。
ＰＡ番号１（２００）−ＩＦＮａ２ｂ融合タンパク質の発現ベクターとしてのｐＡＳＫ
−ＰＡ番号１（２００）−ＩＦＮａ２ｂの構築。
２００個の残基のＰＡ番号１配列リピート、ＰＡ番号１（２００）を有する融合物とし
てＩＦＮａ２ｂをコードする発現プラスミドを構築するために、ｐＡＳＫ−ＩＦＮａ２ｂ
（配列番号３２）（図２Ｄ）をＳａｐＩ用いて切断し、エビアルカリホスファターゼを用
いて脱リン酸化し、ＳａｐＩを用いる制限消化によって、先に構築したプラスミドｐＦａ
ｂ−ＰＡ番号１（２００）（実施例２）から切り出した、２００個の残基のＰＡ番号１ポ
リペプチドをコードする遺伝子断片とライゲーションした（図２Ｅに例示されるが、ＰＡ
番号１（２０）ポリマー／ポリペプチドカセットのみを有する）。大腸菌（E. coli）Ｊ
Ｍ８３形質転換した後（Yanisch-Perron. (1985年) Gene 33:103〜119頁）、プラスミド
を調製し、制限分析によって正しいインサートの存在を確認した。得られたプラスミドは
、ｐＰＡ番号１（２００）−ＩＦＮａ２ｂ（配列番号３７）（図２Ｆ）と表した。
Ｆａｂ断片および遺伝子によってコードされるＰＡ番号１ポリマー／ポリペプチド間の融
合タンパク質の細菌製造および精製。
Ｆａｂ断片（算出された質量：４８．０ｋＤａ）およびＦａｂ−ＰＡ番号１（２００）
融合物（算出された質量：６４．３ｋＤａ）を、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンおよび３
０ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含有する２ＬのＬＢ培地を用い、振盪フラスコ培養
を使用して、実施例３から得られた対応する発現プラスミドを、フォールディングヘルパ
ープラスミドｐＴＵＭ４（Schlapschy (2006年) Protein Eng. Des. Sel. 19:385〜390頁
）と一緒に有する大腸菌（E. coli）ＫＳ２７２において２２℃で製造した。組換え遺伝
子発現の誘導は、ＯＤ５５０＝０．５で一晩、０．４ｍｇのアンヒドロテトラサイクリン
を加えることによって実施した（通常、回収時に約１．０のＯＤ５５０をもたらす）。５
０μｇ／ｍｌリゾチームを含有する、５００ｍＭスクロース、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００
ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８．０の存在下での周辺質抽出を、別の場所に記載される
ように実施し（Breustedt (2005年) Biochim. Biophys. Acta 1764:161〜173頁）、続い
て、５００ｍＭベタイン、５０ｍＭ Ｎａ−ホスフェートｐＨ７．５中、０〜２００ｍＭ
のイミダゾール勾配を用い、固定された金属親和性クロマトグラフィー（Skerra (1994年
) Gene 141: 79〜84頁）を使用してＨｉｓ６−タグによって精製した。
両組換えＦａｂ断片の均一なタンパク質調製物が得られ（図３Ａ）、融合していないＦ
ａｂについて０．２ｍｇ Ｌ−１ＯＤ−１およびＦａｂ−ＰＡ番号１（２００）について
０．１ｍｇ Ｌ−１ＯＤ−１の収率を有する。高モル濃度Ｔｒｉｓバッファー系を使用し
てＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した（Fling (1986年) Anal. Biochem. 155: 83〜88頁）。Ｐ
ｒｏ／Ａｌａポリマーが、その芳香族アミノ酸がないためにＵＶ吸収に関与しなかったの
で、融合していないＦａｂおよびそのＰＡ番号１ポリマー融合物のタンパク質濃度は、６
８２９０Ｍ−１ｃｍ−１の算出された吸光係数を使用して２８０ｎｍでの吸収に従って決
定した（Gill (1989年) Anal. Biochem. 182: 319〜326頁）。
ＩＦＮａ２および遺伝子によってコードされるＰＡ番号１ポリマー／ポリペプチド間の融
合タンパク質の細菌製造および精製
ＩＦＮａ２ｂ（算出された質量：２０．９ｋＤａ）およびＰＡ番号１（２００）−ＩＦ
Ｎａ２ｂ（算出された質量：３７．０ｋＤａ）を、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンおよび
３０ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含有する２ＬのＬＢ培地を用い、振盪フラスコ培
養を使用して、実施例３から得られた対応する発現プラスミドを、フォールディングヘル
パープラスミドｐＴＵＭ４（Schlapschy (2006年)同著）と一緒に有する大腸菌（E. coli
）ＫＳ２７２において２２℃で製造した。組換え遺伝子発現の誘導は、ＯＤ５５０＝０．
５で一晩、０．４ｍｇのアンヒドロテトラサイクリンを加えることによって実施した（通
常、回収時に約１．０のＯＤ５５０をもたらす）。５０μｇ／ｍｌリゾチームを含有する
、５００ｍＭスクロース、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８．
０の存在下での周辺質抽出を、別の場所に記載されるように実施し（Breustedt (2005年)
同著）、続いて、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ８．０の存在下で、ストレプトアビジン親和性クロマトグラフィーを使用して
Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩによって精製した（Schmidt (2007年) Nat. Protoc. 2:1528〜1535
頁）。
両組換えＩＦＮａ２ｂタンパク質の均一なタンパク質調製物が得られ（図３Ｂ）、ＩＦ
Ｎａ２ｂについて０．１５ｍｇ Ｌ−１ＯＤ−１およびＰＡ番号１（２００）−ＩＦＮａ
２ｂについて０．１ｍｇ Ｌ−１ＯＤ−１の収率を有する。高モル濃度Ｔｒｉｓバッファ
ー系を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した（Fling (1986年)同著）。融合していないＩ
ＦＮａ２ｂおよびそのＰＡ番号１ポリマー融合物のタンパク質濃度は、２３５９０Ｍ−１
ｃｍ−１の算出された吸光係数を使用して２８０ｎｍでの吸収に従って決定した（Gill (
1989)同著）。
Ｆａｂ断片および２００個の残基の遺伝子によってコードされるＰＡ番号１ポリマー間の
組換え融合タンパク質の流体力学的容積の、分析用ゲル濾過による測定。
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、Ａｋｔａ精製器１０システム（ＧＥ Ｈ
ｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、ランニングバッファーとしてＰＢＳ（１１５ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、４ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１６ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４；ｐＨ７．４）を用い、１ｍｌ
／分の流速でＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００ ＨＲ １０／３００ ＧＬ カラム（ＧＥ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施した
。実施例４に記載されるように、金属親和性親和性クロマトグラフィーから得られた、精
製されたＦａｂ断片およびその２００個の残基ＰＡ番号１融合物の２５０μlのサンプル
を、ＰＢＳ中、０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で個々に適用した。両タンパク質とも、図４Ａ
に示されるように単一の均一なピークで溶出した。
カラム較正のために（図４Ｂ）、２５０μlの以下の球状タンパク質の適当な混合物（
Ｓｉｇｍａ、Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、ＰＢＳ中、０．２ｍｇ／ｍ
ｌから０．５ｍｇ／ｍｌの間のタンパク質濃度で適用した：チトクロムｃ、１２．４ｋＤ
ａ；炭酸脱水酵素、２９．０ｋＤａ；オボアルブミン、４３．０ｋＤａ；ウシ血清アルブ
ミン、６６．３ｋＤａ；アルコール脱水素酵素、１５０ｋＤａ；β−アミラーゼ、２００
ｋＤａ；アポフェリチン、４４０ｋＤａ。
結果として、２００個の残基のＰＡ番号１ポリマー／ポリペプチドを有する融合タンパ
ク質は、同一分子量を有する対応する球状タンパク質よりも大幅に大きな大きさを示した
。Ｆａｂ−ＰＡ番号１（２００）の見かけの大きさの増大は、融合していないＦａｂ断片
と比較して７．４倍であったのに対し、真の質量は、１．３倍大きいだけであった。この
知見は、本発明のＰｒｏ／Ａｌａポリペプチドセグメントによって生物学的に活性なＦａ
ｂ断片に付与された、かなり増大した流体力学的容積を明確に示す。
ＩＦＮａ２ｂおよび２００個の残基の遺伝子によってコードされるＰＡ番号１ポリマー間
の組換え融合タンパク質の流体力学的容積の分析用ゲル濾過による測定。
サイズ排除クロマトグラフィーを、ＩＦＮａ２ｂおよびＰＡ番号１（２００）−ＩＦＮ
ａ２ｂを用い、実施例６に記載されるのと同様に、Ａｋｔａ精製器１０システム（ＧＥ
Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用し、１ｍｌ／分の流速でＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００ Ｈ
Ｒ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実施した。両タンパク
質とも、図４Ｃに示されるように単一の均一なピークで溶出した。
結果として、２００個の残基のＰＡ番号１ポリマー／ポリペプチドを有する融合タンパ
ク質は、同一分子量を有する対応する球状タンパク質よりも大幅に大きな大きさを示した
（図４Ｄ）。ＰＡ番号１（２００）−ＩＦＮａ２ｂの見かけの大きさの増大は、融合して
いないＩＦＮａ２ｂタンパク質と比較して、１０．２倍であったのに対し、真の質量は、
１．８倍大きいだけであった。この知見は、本発明のＰｒｏ／−Ａｌａポリマー／ポリペ
プチドによって生物学的に活性なインターフェロンに付与された、かなり増大した流体力
学的容積を明確に示す。
Ｆａｂ断片に融合している生合成ＰＡ番号１ポリマーのランダムコイルコンホメーション
の円二色性分光法による検出。
石英キュベット１０６−ＱＳ（０．１ｍｍ路長；Ｈｅｌｌｍａ、Ｍｕｌｌｈｅｉｍ、Ｇ
ｅｒｍａｎｙ）を備えたＪ−８１０分光偏光計（Ｊａｓｃｏ、Ｇｒｏβ−Ｕｍｓｔａｄｔ
、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して二次構造を分析した。実施例４から得られた、５０ｍＭ
Ｋ２ＳＯ４、２０ｍＭ Ｋ−ホスフェートｐＨ７．５中、３．１２から１５．４μＭのタ
ンパク質溶液を使用して１６回の実施を蓄積することによって、室温で１９０から２５０
ｎｍのスペクトルを記録した（バンド幅１ｎｍ、スキャン速度１００ｎｍ／分、反応４秒
）。溶液ブランクを補正した後、スペクトルを、機器ソフトウェアを使用してスムージン
グし、以下の方程式に従ってモル楕円率ΘＭを算出した：
［式中、Θｏｂｓは、測定された楕円率を示し、ｃは、タンパク質濃度［ｍｏｌ／ｌ］、
ｄは、石英キュベットの路長を示す［ｃｍ］］。Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ（Ｓｙｎｅｒ
ｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｒｅａｄｉｎｇ、ＰＡ）を使用して、ΘＭ値を波長に対してプ
ロットした。
組換えＦａｂの測定された円二色性（ＣＤ）スペクトルは、βシートに偏った免疫グロ
ブリン（immunglobuline）フォールドと一致していたのに対し、Ｆａｂ−ＰＡ番号１（２
００）融合タンパク質のスペクトルは、ランダムコイルコンホメーションの相当な寄与を
示した（図５Ａ）。Ｐｒｏ／Ａｌａポリペプチドセグメントによる分光学的寄与をより詳
細に分析するために、融合していないＦａｂ断片に関するモル差ＣＤスペクトルを、Ｆａ
ｂ−ＰＡ番号１（２００）のものから後者のスペクトルをサブトラクションすることによ
って算出した（図５Ｂ）。結果として、ランダムコイルコンホメーションに特有の約２０
０ｎｍの強い最小が観察された。したがって、組換え融合タンパク質の一部としてのＰｒ
ｏ／Ａｌａ配列は、生理学的バッファー条件下でランダムコイルポリマーとして存在する
と思われる。
ＩＦＮａ２ｂと融合している遺伝子によってコードされるＰＡ番号１ポリマーのランダム
コイルコンホメーションの円二色性分光法による検出。
３．６〜３８．７μＭのタンパク質溶液を使用し、実施例８に記載のように、ＩＦＮａ
２ｂおよびＰＡ番号１（２００）−ＩＦＮａ２ｂ（実施例５から得られた）のＣＤ測定に
よって二次構造を分析した。ＰＡ番号１（２００）−ＩＦＮａ２ｂのスペクトルは、α−
ヘリックス二次構造の相当な寄与を示し、これは、インターフェロンの公知のα−ヘリッ
クス束フォールドならびにランダムコイルコンホメーションを示す（図５Ｃ）。Ｐｒｏ／
Ａｌａポリマー融合パートナーによる分光学的寄与をより詳細に分析するために、融合し
ていないＩＦＮａ２ｂに関するモル差ＣＤスペクトルを、２つの個々のスペクトルをサブ
トラクションすることによって算出した（図５Ｄ）。結果として、ランダムコイルコンホ
メーションに特有の約２００ｎｍの強い最小が観察された。したがって、組換え融合タン
パク質の一部としてのＰｒｏ／Ａｌａポリペプチドセグメントは、水性バッファー条件下
でランダムコイルポリマーとして存在すると思われる。
Ｆａｂ断片の、ＩＦＮａ２ｂの、およびそれらの２００個の残基のＰＡ番号１ポリマー融
合物の二次構造の定量的分析。
Ｆａｂ断片、Ｆａｂ−ＰＡ番号１（２００）、ＩＦＮａ２ｂおよびＰＡ番号１（２００
）−ＩＦＮａ２ｂの二次構造含量を、複雑なＣＤスペクトルのデコンボリューションのた
めに一連の３３のベーススペクトルを用い、二次構造デコンボリューションプログラムＣ
ＤＮＮバージョン２．１（Bohm (1992年) Protein Eng. 5:191〜195頁）を使用して、実
施例８および９において測定された対応するＣＤスペクトルから個々に定量した。この分
析の結果が、以下の表に提供されている：
その公知の免疫グロブリンフォールド（Eigenbrot (1993年) J. Mol. Biol. 229:969〜
995頁参照のこと）に一致している組換えＦａｂ断片の大部分のβ−シート二次構造含量
と比較して、構築されていないコンホメーションの割合（ランダムコイルおよびβ−ター
ンを含む）は、ＰＡ番号１ポリマーがＦａｂ断片に融合される場合には明確に増大する。
Ｐｒｏ／Ａｌａポリペプチドセグメントの差ＣＤスペクトルは、明確なランダムコイルコ
ンホメーションを示す。二次構造の分析は、全二次構造のほぼ１００％を含む、高い割合
の構築されていないコンホメーション（ランダムコイルおよびβ−ターンを含む）の存在
を示す。同様に、α−ヘリックス束タンパク質としてのその公知の三次元構造（Radhakri
shnan (1996年) Structure 4:1453〜1463頁）に一致している組換えＩＦＮａ２ｂの大部
分のα−ヘリックス二次構造含量と比較して、全タンパク質の構築されていないコンホメ
ーションの割合は、ＰＡ番号１ポリマーがＩＦＮａ２ｂに融合される場合には明確に増大
する。Ｐｒｏ／Ａｌａポリペプチドセグメントの差ＣＤスペクトルは、明確なランダムコ
イルコンホメーションを示す。二次構造の分析は、全二次構造のほぼ１００％を含む、高
い割合の構築されていないコンホメーション（ランダムコイルおよびβ−ターンを含む）
の存在を示す。
チョウ−ファスマンアルゴリズム（Chou and Fasman (1974年) Biochemistry 13: 222
〜245頁）を使用してＰＡ番号１ポリマー配列の理論的分析が実施された場合には、異な
る結果が得られた。この分析の結果が図７に示されている。このアルゴリズムは、１００
％のα−ヘリックス二次構造を予測し、これは、実験データとは明確に対照的である。し
たがって、このアルゴリズムは、本発明のアミノ酸ポリマーの構築されていないコンホメ
ーションを確信を持って予測するのには有用でない。
Ｈｉｓ６−ＰＡ番号１（２００）−ｈＧＨ融合タンパク質の発現ベクターとしてのｐＡＳ
Ｋ７５−Ｈｉｓ６−ＰＡ番号１（２００）−ｈＧＨの構築。
２００個の残基のＰＡ番号１配列リピート、ＰＡ番号１（２００）を有する融合物とし
て、ｈＧＨをコードする発現プラスミドを構築するために、ｐＡＳＫ７５−Ｈｉｓ６−ｈ
ＧＨ（配列番号４１）（図６Ａ）を、ＳａｐＩを用いて切断し、エビアルカリホスファタ
ーゼを用いて脱リン酸化し、ＳａｐＩを用いる制限消化によって、先に構築したプラスミ
ドｐＦａｂ−ＰＡ番号１（２００）（実施例２）から切り出した、２００個の残基のＰＡ
番号１ポリペプチドをコードする遺伝子断片とライゲーションした（図６Ｂに例示される
が、ＰＡ番号１（２０）ポリマー／ポリペプチドカセットのみを有する）。大腸菌（E. c
oli）ＪＭ８３を形質転換した後（Yanisch-Perron. (1985年)同著）、プラスミドを調製
し、制限分析によって正しいインサートの存在を確認した。得られたプラスミドは、ｐＡ
ＳＫ７５−Ｈｉｓ６−ＰＡ番号１（２００）−ｈＧＨ（配列番号４６）（図６Ｃ）と表し
た。
チャイニーズハムスター卵巣細胞における、２００個の残基のＰＡ番号１ポリマー／ポ
リペプチドと融合しているヒト成長ホルモンの分泌性製造のための発現ベクターの構築。
ｈＧＨ ＰＡ番号１融合タンパク質の原核生物製造を可能にするベクターｐＡＳＫ７５
−Ｈｉｓ６−ＰＡ番号１（２００）−ｈＧＨ（配列番号４６）、ｐＡＳＫ７５の誘導体（
Skerra (1994年)同著）を、ＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断した。この断片
をアガロースゲル電気泳動によって精製し、相応に切断されたベクターｐＣＨＯ（配列番
号５０）とライゲーションした。大腸菌（E. coli）ＸＬ１−Ｂｌｕｅを形質転換した後
（Bullock (1987年)同著）、プラスミドを調製し、制限分析によって断片の正しいインサ
ートを確認した。得られたＨｉｓ６タグ、ＰＡ番号１（２００）ポリペプチドセグメント
およびヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）と融合しているｈＧＨシグナルペプチドをコードする
プラスミドは、ｐＣＨＯ−ＰＡ番号１（２００）−ｈＧＨ（配列番号４８）と表し、図６
Ｄに表されている。
ＣＨＯ細胞における、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）および遺伝子によってコードされるＰ
Ａ番号１ポリマー間の融合タンパク質の分泌性製造。
ＣＨＯ−Ｋ１細胞ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−６１を、５０％コンフルエンシーが達せられる
まで、１００ｍｍプラスチックディッシュ中で、Ｑｕａｎｔｕｍ２６３培地（ＰＡＡ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃｏｌｂｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で培養した。細胞を、Ｎａｎｏ
ｆｅｃｔｉｎキット（ＰＡＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃｏｌｂｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ
）を使用して、８μｇのｐＣＨＯ−ＰＡ番号１（２００）−ｈＧＨ（配列番号４８）で、
または対照のために、ｐＣＨＯ−ｈＧＨ（配列番号４９）、ｈＧＨをコードするがＰＡ番
号１（２００）配列を含まない同様のプラスミドでトランスフェクトした。６時間後、細
胞培養培地を、７ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）−Ｉ還元血清培地（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって交換し、細胞を３７℃、５％
ＣＯ２を含む加湿雰囲気中でインキュベートした。２日後、２０μｌの細胞培養上清を採
取し、５μｌのβ−メルカプトエタノールを含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッ
ファーを用いて希釈した。９５℃で５分加熱した後、１５μｌの各サンプルを、１２％Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥに付した。セミドライブロッティング装置によって、ニトロセルロースメ
ンブラン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｄａｓｓｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ
）上にエレクトロトランスファーした後、メンブランを、１０ｍｌ ＰＢＳＴ（０．１％
ｖ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ）を用いて１５分間３回洗浄した。メンブラ
ンを１０ｍｌのウマラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲートされた抗ヒト成長ホ
ルモン抗体ａｂ１９５６（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）の１：１０００希釈
物をとともにインキュベートした。１時間インキュベートし、メンブランを２０ｍｌのＰ
ＢＳＴを用いて５分間で２回、ＰＢＳを用いて５分間で２回洗浄した後、１５ｍｌのＳＩ
ＧＭＡＦＡＳＴ（商標）３，３−ジアミノベンジジン溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ
Ｃｈｅｍｉｅ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の存在下で発色反応を実施した。水で
洗浄することによって反応を停止させ、メンブランを風乾した。両組換えタンパク質サン
プルについて、ブロットはシグナルを示し（図６Ｅ）、したがって、ＣＨＯ細胞における
ＰＡ番号１ポリペプチドを有するｈＧＨ融合タンパク質の分泌性製造を提供する。
ｈＧＨおよび遺伝子によってコードされるＰＡ番号１ポリマー／ポリペプチド間の融合
タンパク質の細菌製造および精製。
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）（算出された質量：２３．４ｋＤａ）、ＰＡ番号１（２０
０）−ｈＧＨ（算出された質量：３９．６ｋＤａ）、ＰＡ番号１（４００）−ｈＧＨ（算
出された質量：５５．８ｋＤａ）およびＰＡ番号１（６００）−ｈＧＨ（算出された質量
：７２．０ｋＤａ）を、実施例１１から得られた対応する発現プラスミドまたはそれぞれ
、２倍（４００個の残基をコードする）もしくは３倍（６００個の残基）のＰＡ番号１配
列カセットを有するその誘導体を有する大腸菌（E. coli）ＫＳ２７２において製造した
。細菌製造は、２．５ｇ／Ｌのグルコース、０．５ｇ／Ｌのプロリンおよび１００ｍｇ／
ｌのアンピシリンを含有する２ＬのＬＢ培地を用い、振盪フラスコ培養において２２℃で
実施した。組換え遺伝子発現の誘導は、ＯＤ５５０＝０．５で３時間、０．４ｍｇのアン
ヒドロテトラサイクリンを加えることによって実施した。５０μｇ／ｍｌリゾチームを含
有する、５００ｍＭスクロース、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐ
Ｈ８．０の存在下での周辺質抽出を、別の場所に記載されるように実施し（Breustedt (2
005)同著）、続いて、バッファーとして４０ｍＭ Ｎａ−ホスフェートｐＨ７．５、０．
５Ｍ ＮａＣｌを用い、ＨｉｓＴｒａｐ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ親和性カラ
ム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、Ｈｉｓ６−タグによって精製した。タン
パク質は、０〜１５０ｍＭのイミダゾール濃度勾配を使用して溶出し（ランニングバッフ
ァーに溶解され、ＨＣｌを用いてｐＨ７．５に調整された）、ＰＢＳ（１１５ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、４ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１６ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４）を用いて平衡化
したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００−ＨＲ１０／３０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
を使用するサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。
サイズ排除クロマトグラフィー後に、すべての組換えｈＧＨ融合タンパク質について均
一なタンパク質調製物が得られ、凝集の徴候はなく、ｈＧＨについて１ｍｇ Ｌ−１ＯＤ
−１、ＰＡ番号１（２００）−ｈＧＨについて０．３ｍｇ Ｌ−１ＯＤ−１、ＰＡ番号１
（４００）−ｈＧＨについて０．３ｍｇ Ｌ−１ＯＤ−１およびＰＡ番号１（６００）−
ｈＧＨについて０．２ｍｇ Ｌ−１ＯＤ−１の収率を有していた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、
高モル濃度Ｔｒｉｓバッファーシステムを使用して実施した（Fling (1986年)同著）。融
合していないｈＧＨおよびすべてのそのＰＡ番号１ポリペプチド融合物のタンパク質濃度
は、１６０５０Ｍ−１ｃｍ−１の算出された吸光係数を使用して２８０ｎｍでの吸収に従
って決定した（Gill (1989年)同著）。
表面プラズモン共鳴を使用する、ヒト成長ホルモン受容体の細胞外ドメインに向けた、ヒ
ト成長ホルモンおよびそのＰＡ番号１ポリマー融合物の結合親和性の測定。
ｈＧＨおよびそのＰＡ番号１ポリペプチド融合物のヒト成長ホルモン受容体Ｆｃ融合タ
ンパク質（ｈＧＨＲ−Ｆｃ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に対する親和性を、Ｂｉａｃｏｒ
ｅ ２０００システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
リアルタイム測定によって決定した。まず、１５μｌの１０ｍＭ 酢酸Ｎａ ｐＨ５．０
中、１００μｇ／ｍｌの濃度のマウス抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ捕獲抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉ
ｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、アミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃ
ａｒｅ）を使用してＣＭＤＰチップ（ＸａｎＴｅｃ ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃｓ）の２つ
のフローチャネルの表面に固定した。この結果、約２７００反応単位（ＲＵ）が得られた
。フローバッファーとしてＰＢＳ／Ｔ（０．０５％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０を含有
するＰＢＳ）を用いて平衡化した後、チップの１つのチャネルに、２μｇ／ｍｌのｈＧＨ
Ｒ−Ｆｃを、約３００ＲＵのさらなるシグナルが達せられるまで５μｌ／分の流速で入れ
た。次いで、７５μｌのＰＢＳ／Ｔ中の、ｈＧＨまたはそのＰＡ番号１ポリペプチド融合
物を変動する濃度で注入し、２０μｌ／分の連続バッファーフロー下で会合および解離相
を測定した。再生するために、１０ｍＭグリシン／ＨＣｌ ｐＨ２．７の３回の６μｌパ
ルスを適用した。固定された受容体を有さないチャネルについて測定された対応するシグ
ナルを２度サブトラクションすることによってセンソグラムを補正し、いくつかのバッフ
ァーブランク注入から平均化したベースラインを決定した（Myszka (1999年) Mol. Recog
nit. 12: 279〜284頁）。動的データ評価を、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア
バージョン３．１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する、１：１ Ｌａｎｇｍｕｉ
ｒ結合モデルに従う、少なくとも７回の異なるサンプル注射から得られたトレースの全体
的適合によって実施した。ｈＧＨまたはそのＰＡ番号１融合物およびヒト成長ホルモン受
容体間の複合体の速度定数および導かれる平衡定数のＳＰＲ測定から得られた値が、以下
の表に要約されている：
これらのデータは、ｈＧＨの種々の長さのＰＡ番号１ポリペプチドとの融合物は、受容
体結合に大きくは干渉しないということを示す。すべてのｈＧＨ ＰＡ番号１ポリペプチ
ド融合物は、ＰＡ番号１ポリペプチドを欠く組換えｈＧＨと比較して５倍内の受容体結合
活性を保持する。
Ｆａｂ断片および遺伝子によってコードされるＰＡ番号１ポリマー間の組換え融合タンパ
ク質のｉｎ ｖｉｖｏでの延長された血漿半減期の検出。
成体ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＳＰＦ ｓｔｏｃｋ ｂｒｅｅｄｉｎｇ； ＴＵ Ｍｕｎｃ
ｈｅｎ、Ｆｒｅｉｓｉｎｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に、以下の表に従って静脈内に注射した：
静脈内に投与された試験項目の総容積を、個体の体重（ｂ．ｗ．）に従って算出し、投
与日に記録した（例えば、１００μｌの１ｍｇ／ｍｌ試験項目を与えられた２０ｇの体重
を有する動物）。血液サンプリングは、以下の表に従って実施した：
各物質（試験項目）について、全部で９匹の動物−各３匹の動物を有する３つの亜群１
〜３に分けられた−に注射し、各々が、種々の時点で４種のサンプルを提供する。血液サ
ンプル（およそ５０μｌ）を、尾静脈（ｖｅｎｅ）から採取し、４℃で３０分間保存した
。１００００ｇ、４℃で１０分間遠心分離した後、上清（血漿）を直ちに凍結し、−２０
℃で保存した。
ＥＬＩＳＡにおけるＦａｂ融合タンパク質の定量的検出のために、９６ウェルマイクロ
タイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、ＮＵＮＣ、Ｄｅｎｍａｒｋ）のウェルを５０ｍＭ
ＮａＨＣＯ３ ｐＨ９．６中の組換えＨｅｒ２／ＥｒｂＢ２外部ドメイン抗原の１０μ
ｇ／ｍｌ溶液５０μｌを用いて４℃で一晩コーティングした。次いで、ＰＢＳ中の３％（
ｗ／ｖ）ＢＳＡ２００μｌを用いてウェルを１時間ブロッキングし、ＰＢＳ／Ｔ（０．１
％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ）を用いて３回洗浄した。血漿サンプル
は、未処理動物から得た０．５％（ｖ／ｖ）マウス血漿を含有するＰＢＳ／Ｔ中の希釈シ
リーズで適用し、１時間インキュベートした。次いで、ウェルをＰＢＳ／Ｔを用いて３回
洗浄し、ＰＢＳ／Ｔ中の抗ヒトＣｋ抗体アルカリホスファターゼコンジュゲートの１：１
０００希釈溶液５０μｌとともに１時間インキュベートした。ＰＢＳ／Ｔを用いて２回お
よびＰＢＳを用いて２回洗浄した後、基質として１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８
．８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２中の０．５μｇ／ｍｌのｐ−ニトロフ
ェニル ホスフェート５０μｌを添加することによって発色反応を開始させ、２５℃で１
５分後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。血漿サンプル中のＦａｂ、Ｆａｂ−ＰＡ番号１
（２００）およびＦａｂ−ＰＡ番号１（６００）の濃度を、測定されたシグナルを、０．
５％（ｖ／ｖ）未処理動物由来マウス血漿を含有するＰＢＳ／Ｔ中、定義された濃度の対
応する精製されたタンパク質の希釈シリーズについて決定された標準曲線と比較すること
によって定量化した。
Ｆａｂ、Ｆａｂ−ＰＡ番号１（２００）およびＦａｂ−ＰＡ番号１（６００）の血漿半
減期を推定するために、ＥＬＩＳＡ測定値から各時点の濃度値、ｃ（ｔ）を決定し、静脈
内注射後の時間、ｔに対してプロットした。これらのデータを、以下の方程式に従って双
指数関数的（bi-exponential）減衰を推定しながらＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈソフトウェ
アを使用して数値的にフィッティングした。
［式中、ｔα １／２およびｔβ １／２は、それぞれ、分布相αおよび排出相βの半減期の
値である。ｃ０は、時点ゼロでの総血液濃度であり、ｃαは、分布相の濃度振幅である］
。
図８は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける３種の試験項目の薬物動態を表す。組換えＦａｂ
は、迅速な血液クリアランスを示し、実に約１．３時間という排出半減期を有し、Ｆａｂ
−ＰＡ番号１（２００）およびＦａｂ−ＰＡ番号１（６００）融合タンパク質は、３倍お
よび２９倍を超える拡張された半減期を有し、それぞれ、約４．１時間および３８．８時
間の対応する値を有する。これらのデータは、Ｆａｂ断片のｉｎ ｖｉｖｏ血漿半減期は
、Ｐｒｏ／Ａｌａポリマー／ポリペプチドとの融合によって大幅に延長され、それによっ
て半減期は、アミノ酸ポリマーの長さが増大するにつれてより長くなるということを証明
する。
Ｐ１Ａ１およびＰ１Ａ３アミノ酸ポリマー／ポリペプチドの遺伝子合成およびＦａｂ−
Ｐ１Ａ１（２００）およびＦａｂ−Ｐ１Ａ３（２００）融合タンパク質の発現ベクターと
してのｐＦａｂ−Ｐ１Ａ１（２００）およびｐＦａｂ−Ｐ１Ａ３（２００）の構築。
Ｐｒｏ／Ａｌａポリペプチド／ポリマーＰ１Ａ１（配列番号５１）およびＰＡ番号３、
（配列番号３）とも表されるＰ１Ａ３を含む反復ポリマー配列をコードする遺伝子断片を
、実施例１に記載されるように、相補的オリゴデオキシヌクレオチド、それぞれ、Ｐ１Ａ
１のための配列番号５２および配列番号５３ならびにＰ１Ａ３のための配列番号５４およ
び配列番号５５の対のハイブリダイゼーションによって得た。軽鎖（ＬＣ）のＣ末端に２
００個の残基の対応するＰｒｏ／Ａｌａポリマー／ポリペプチドセグメントを有するＦａ
ｂ断片（ＬＣ Ｆａｂ−Ｐ１Ａ１（２００）のアミノ酸配列：配列番号５６；ＬＣ Ｆａ
ｂ−Ｐ１Ａ３（２００）のアミノ酸配列：配列番号５７）をコードするｐＦａｂ−Ｐ１Ａ
１（２００）（配列番号５８）およびｐＦａｂ−Ｐ１Ａ３（２００）（配列番号５９）を
、類似の方法で、実施例２に記載されているｐＦａｂ−ＰＡ番号１（２００）に構築した
。
以下では、配列番号５６、５７、５８および５９も再現される。しかし、これらの配列
はまた、本発明の開示内容および説明の特定の部分である添付の配列表中に含まれる。
配列番号５６
配列番号５７
配列番号５８
配列番号５９
Ｆａｂ断片および遺伝子によってコードされるＰ１Ａ１またはＰ１Ａ３ポリペプチド／ポ
リマー間の組換え融合タンパク質の流体力学的容積の分析用ゲル濾過による測定。
ＳＥＣを、ランニングバッファーとしてＰＢＳを用い、Ａｋｔａ精製器１０システム（
ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、１ｍｌ／分の流速でＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２
００ ＨＲ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ、
Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施した。実施例４においてＦａｂ−ＰＡ番号１
（２００）について記載されたように、同様に製造され、精製された（図９）、Ｆａｂ−
Ｐ１Ａ１（２００）およびＦａｂ−Ｐ１Ａ３（２００）融合タンパク質のサンプル２５０
μｌを、ＰＢＳ中、０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で個別に適用した。両タンパク質とも、図
１０に示されるように単一の均一なピークで溶出した。
結果として、２００個の残基を有する融合タンパク質Ｐ１Ａ１またはＰ１Ａ３ポリマー
／ポリペプチドは、対応する融合していないＦａｂ断片よりも大幅に大きな大きさを示し
た。Ｆａｂ−Ｐ１Ａ１（２００）およびＦａｂ−Ｐ１Ａ３（２００）の見かけの大きさの
増大は、Ｆａｂ断片（図４Ｂ参照のこと）と比較して、それぞれ、５．８倍および５．２
倍であったのに対し、真の質量は、１．４倍および１．３倍大きいだけであった。この知
見は、本発明の生合成Ｐ１Ａ１およびＰ１Ａ３ポリペプチドセグメントによって生物学的
に活性なＦａｂ断片に付与された、かなり増大した流体力学的容積を明確に示す。
Ｆａｂ断片と融合している生合成Ｐ１Ａ１およびＰ１Ａ３ポリマー／ポリペプチドのラン
ダムコイルコンホメーションの円二色性（ＣＤ）分光法による検出。
バッファーとして５０ｍＭ Ｋ２ＳＯ４、２０ｍＭ Ｋ−ホスフェートｐＨ７．５を使
用して実施例４に記載されるものと同様に調製した、それぞれ、４．２および６．５μＭ
タンパク質溶液を使用して、実施例８に記載されるように、Ｆａｂ−Ｐ１Ａ１（２００）
およびＦａｂ−Ｐ１Ａ３（２００）のＣＤスペクトルを記録した。
Ｆａｂ−Ｐ１Ａ１（２００）およびＦａｂ−Ｐ１Ａ３（２００）融合タンパク質のスペ
クトルは、大幅な割合のランダムコイルコンホメーションを示した（図１１Ａ）。Ｐｒｏ
／Ａｌａポリペプチドセグメントによる分光学的寄与をより詳細に分析するために、融合
していないＦａｂ断片に関するモル差ＣＤスペクトル（実施例８参照）を、同一モル濃度
に正規化した後に、それぞれ、Ｆａｂ−Ｐ１Ａ１（２００）およびＦａｂ−Ｐ１Ａ３（２
００）のものから後者のスペクトルをサブトラクションすることによって算出した（図１
１Ｂ）。結果として、ランダムコイルコンホメーションに特有である、およそ２００ｎｍ
の波長の強い最小が観察された。したがって、組換え融合タンパク質の一部としてのＰ１
Ａ１およびＰ１Ａ３配列は、生理学的バッファー条件下でランダムコイルコンホメーショ
ンで存在すると思われる。
Ｈｉｓ（６）−ＳＵＭＯ−ＰＡ番号１（２００）融合タンパク質の発現ベクターとしての
ｐＳＵＭＯ−ＰＡ番号１（２００）の構築。
２００個の残基のＰＡ番号１配列リピートと融合している、６個の残基のＨｉｓ−タグ
および小さいユビキチン様モディファイヤー（ＳＵＭＯ）タンパク質（Panavas (2009年)
Methods Mol. Biol. 497: 303〜17頁）をコードする発現プラスミドを構築するために、
サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＳＵＭＯタンパク質
）［Ｓｍｔ３ｐ；Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ１２３０６としても知られる］を、クローニングさ
れたｃＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。５’−プライマー
は、ＰＣＲ産物中に、Ｍｅｔ開始コドン（ＡＴＧ）およびさらなるＬｙｓコドンを含有す
るＮｄｅＩ制限部位ならびにＨｉｓ６−タグをコードする配列を導入し、３’−プライマ
ーは、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｐＩ制限部位を導入した。得られたＤＮＡ断片を、Ｎｄ
ｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、プラスミドｐＳＡ１（Schmidt (1994年) J.
Chromatogr. 676: 337〜345頁）の相応に消化された誘導体とライゲーションし、Ｓａｐ
Ｉ制限部位がサイレント突然変異によって排除されている。得られたプラスミドを、Ｓａ
ｐＩを用いて切断し、エビアルカリホスファターゼを用いて脱リン酸化し、プラスミドｐ
Ｆａｂ−ＰＡ番号１（２００）（実施例２において記載される）からＳａｐＩを用いる制
限消化によって切り出した（図２Ｅに例示されるものと類似の方法で）２００個の残基の
ＰＡ番号１ポリペプチドセグメントをコードする遺伝子断片とライゲーションした。得ら
れたプラスミドは、ｐＳＵＭＯ−ＰＡ番号１（２００）（配列番号６０）と表し、図１２
Ａに表されている。
遺伝子によってコードされるＰＡ番号１（２００）ポリマー／ポリペプチドの細菌発現お
よび単離。
ＰＡ番号１（２００）ポリペプチド（算出された質量：１６．１ｋＤａ）を、発現プラ
スミドｐＳＵＭＯ−ＰＡ番号１（２００）（実施例２１に記載される）を、Ｔ７プロモー
ターを抑制するプラスミドｐＬｙｓＥ（Studier (1991年) J. Mol. Biol. 219: 37〜44頁
）と一緒に有する大腸菌（E. coli）ＢＬＲ（ＤＥ３）（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ
、ＵＳＡ）の細胞質において、小さいユビキチン様モディファイヤー（ＳＵＭＯ）タンパ
ク質（算出された質量：１２．２ｋＤａ）との融合タンパク質として最初に製造した。細
菌製造は、２．５ｇ／ＬのＤ−グルコース、０．５ｇ／ＬのＬ−プロリン、１００ｍｇ／
ｌのアンピシリンおよび３０ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含有する２ＬのＬＢ培地
を用い、振盪フラスコ培養において３０℃で実施した。組換え遺伝子発現は、０．５ｍＭ
の最終濃度へのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によ
って誘導された。細菌は、誘導の３時間後に回収し、１００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ
Ｎａ−ホスフェートｐＨ７．５に再懸濁し、Ｆｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｅｌｌ
（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して溶
解した。溶解物を遠心分離（１５分、１５０００ｇ）した後、封入体は観察されなかった
。
可溶性融合タンパク質を含有する上清を、７０℃で１５分間インキュベートし、遠心分
離（１５分、１５０００ｇ）して、熱に不安定な宿主細胞タンパク質を除去した。Ｈｉｓ
（６）−ＳＵＭＯ−ＰＡ番号１（２００）融合タンパク質を、Ａｋｔａ精製器システム（
ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に連結させた、１２ｍｌのＮｉ２ ＋をチャージさせたＨｉ
ｓＴｒａｐ高性能カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＩＭＡＣ（Skerra (
1994) Gene 141: 79〜84頁）によって上清から精製し、５００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ
Ｎａ−ホスフェート ｐＨ７．５中、０から１５０ｍＭのイミダゾール勾配を用いて溶
出した。その後の分取ＳＥＣステップ後に、Ｈｉｓ（６）−ＳＵＭＯ−ＰＡ番号１（２０
０）融合タンパク質の均一な調製物（図１２Ｂ）が得られ、１ＬのＯＤ５５０＝１を有す
る細菌培養物あたりおよそ５ｍｇの収率を有していた。Ｈｉｓ（６）−ＳＵＭＯ−ＰＡ番
号１（２００）ポリペプチド融合物のタンパク質濃度は、１２８０ Ｍ−１ ｃｍ−１の
算出された吸光係数を使用し、２８０ｎｍでの吸収に従って決定した（Gill (1989年)同
著）。ＰＡ番号１（２００）ポリペプチドセグメントは、その芳香族または硫黄含有アミ
ノ酸側鎖がないために２８０ｎｍでの吸収に関与しないということは留意されたい。
切断バッファー（０．２ｗ／ｖ％Ｉｇｅｐａｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０）中、３０℃で１時間の２Ｕ／ｍｇのサッ
カロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来のＵｂｌ特異的プロテアーゼ
１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いる部位特異的タン
パク質分解切断（Ｐｒｏ／Ａｌａポリペプチドセグメントの前のＧｌｙ−Ｇｌｙモチーフ
の下流）によって、融合タンパク質から生合成ＰＡ番号１（２００）ポリペプチドを遊離
させた。切断プロセスは、高モル濃度Ｔｒｉｓバッファーシステムを使用するＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによって（図１２Ｂ）調べた（Fling (1986) Anal. Biochem. 155: 83〜88頁）。
切断されたＨｉｓ（６）−ＳＵＭＯタンパク質、残存する切断されていない融合タンパク
質およびまたＳＵＭＯプロテアーゼ、Ｈｉｓ６−タグを保持するすべてのものを除去する
ために、反応混合物を５ｍｌのＮｉ２ ＋をチャージしたＨｉｓＴｒａｐ高性能カラム（Ｇ
Ｅ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびランニングバッファーとして５００Ｍ ＮａＣｌ、２
０ｍＭホスフェート、ｐＨ７．５を使用する別のＩＭＡＣに付した。今回は、フロースル
ーが純粋な生合成ＰＡ番号１（２００）ポリペプチドを含有していた（図１３Ｅ）。この
方法で調製された生合成ＰＡ番号１（２００）ポリペプチド／ポリマー（配列番号６１）
は、合計２０１個のアミノ酸残基を含み、これは、図１に示される、各々、２０個のアミ
ノ酸残基をコードする、１０のライゲーションされた二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド
ビルディングブロックおよびクローニングに使用された下流ＳａｐＩ制限部位のトリプレ
ットＤＮＡオーバーハングによってコードされる追加のＡｌａ残基の、コードされる組み
合わされた遺伝子産物に起因するということは留意されたい。
ＰＡ番号１（２００）を有する小分子／薬物コンジュゲートの調製および特性決定。
実施例２１から得られたＨｉｓ（６）−ＳＵＭＯ−ＰＡ番号１（２００）融合タンパク
質の未精製タンパク質分解切断反応混合物を、５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３ ｐＨ８．３に対
して４℃で２回透析し、１０倍モル過剰の無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、６−
［フルオレセイン−５（６）−カルボキサミド］ヘキサン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル（フルオレセイン−ＮＨＳエステル；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の溶液と
混合した後、室温で１時間インキュベートした。このために、ＤＭＦに溶解したフルオレ
セイン−ＮＨＳエステルの１０ｍＭ溶液１７．６μｌに、Ｈｉｓ（６）−ＳＵＭＯ−ＰＡ
番号１（２００）切断混合物の２．５ｍｇ／ｍｌ溶液２００μｌを加えた。得られた混合
物を室温で１時間インキュベートし、実施例２１に記載されるようにＩＭＡＣに適用して
、切断されたＨｉｓ（６）−ＳＵＭＯタンパク質、残存する切断されていない融合タンパ
ク質およびＳＵＭＯプロテアーゼを除去し、ＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２
００ １０／３００ ＧＬカラムで分取ＳＥＣによって、０．５ ｍｌ／分の流速でさら
に精製した。
次いで、種々のステップから得られたサンプルを、ＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅ
ｘ Ｓ２００ １０／３００ ＧＬカラムで分析用ＳＥＣによって、０．５ｍｌ／分の流
速で分析した。ＳＵＭＯタンパク質は、２８０ｎｍでその芳香族側鎖によって検出され、
Ｐｒｏ／Ａｌａポリペプチドまたはポリペプチドセグメントのものを含めたペプチド結合
は、２２５ｎｍで検出されたが、フルオレセインは、４９４ｎｍで検出された（図１３Ａ
〜Ｇ）。比較のために、遊離フルオレセイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の溶液のＵ
Ｖ／ＶＩＳスペクトルおよびＳＥＣにおいて検出された各個別のピークに由来する画分の
ＵＶ／ＶＩＳスペクトルを、λ９機器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍ
Ａ、ＵＳＡ）を使用して測定した（図１３Ｈ〜Ｋ）。クロマトグラフィーカラムの大きさ
較正のために（図１３Ｌ）、ＰＢＳ中、０．２から０．５ｍｇ／ｍｌの間の濃度の、以下
の球状タンパク質の適当な混合物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）２５０μｌを適用した
：アプロチニン、６．５ｋＤａ；チトクロムｃ、１２．４ｋＤａ；炭酸脱水酵素、２９．
０ｋＤａ；ウシ血清アルブミン、６６．３ｋＤａ；アルコール脱水素酵素、１５０ｋＤａ
；β−アミラーゼ、２００ｋＤａ；アポフェリチン、４４０ｋＤａ。
結果として、生合成ＰＡ番号１（２００）ポリペプチド／ポリマーのフルオレセイン−
ＮＨＳエステルとのカップリング後に、ＩＭＡＣおよびＳＥＣによって、ＰＡ番号１（２
００）ポリペプチド／ポリマーの大きさの特性および小分子、すなわち、フルオレセイン
基の分光学的サインを本質的に示す高分子コンジュゲートが単離された。これは、小分子
が生合成Ｐｒｏ／Ａｌａポリペプチド／ポリマーに成功裏にカップリングされたことを実
証し、これは、本発明に従って、コンジュゲートされた小分子薬または化合物の流体力学
的容積を著しく増大する。
生合成Ｐｒｏ／Ａｌａポリペプチド／ポリマーおよび植物ステロイドジゴキシゲニン間
の同様のコンジュゲートを調製するために、上記のように、実施例２１から得られた０．
１ｍｇの精製されたＰＡ番号１（２００）ポリペプチドを、５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３ ｐ
Ｈ８．３に対して透析した。精製されたＰＡ番号１（２００）ポリペプチドの濃度は、２
０５ｎｍでの吸収に従って決定した（Gill (1989)同著）。ＰＡ番号１（２００）ポリペ
プチドは、１０倍モル過剰のジゴキシゲニン−３−Ｏ−メチルカルボニル−ε−アミノカ
プロン酸ＮＨＳエステル（ＤＩＧ−ＮＨＳエステル；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ
ｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてカップリングした。この目的のために
、５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３ ｐＨ８．３中の、精製されたＰＡ番号１（２００）ポリペプ
チドの１ｍｇ／ｍｌ溶液１００μｌを、無水ＤＭＦに溶解したＤＩＧ−ＮＨＳエステルの
３０ｍＭ溶液２μｌに加え、反応混合物を室温で１時間インキュベートした。得られたコ
ンジュゲートの溶液を、７ｋＤａのカットオフを有するＺｅｂａ（商標）スピン脱塩カラ
ム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して精製し、１０ｍＭ酢酸アンモニウ
ムバッファーｐＨ６．８に対して２回透析し、正イオンモードを使用して、Ｑ−Ｔｏｆ
Ｕｌｔｉｍａ機器（Ｗａｔｅｒｓ、Ｅｓｃｈｂｒｏｎｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でＥＳＩ質量
分析によって分析した。結果として、ジゴキシゲニン−ＰＡ番号１（２００）コンジュゲ
ートのスペクトルは、１６６７１．４Ｄａの質量を示し、これは、１６６７０．６Ｄａの
算出された質量に本質的に一致する（図１３Ｍ）。これは、生合成Ｐｒｏ／Ａｌａポリペ
プチド／ポリマー、特に、ＰＡ番号１（２００）は、小分子薬を用いて効率的にコンジュ
ゲートされ得ることを明確に実証する。
本発明は、以下の例示された配列に関し、以下の例示された配列を指し、それによって
、添付の配列表が説明の一部として示され、したがって、本明細書の一部である。
配列番号１は、ＰＡ番号１のアミノ酸配列を示す。
配列番号２は、ＰＡ番号２のアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、ＰＡ番号３のアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、ＰＡ番号４のアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、ＰＡ番号５のアミノ酸配列を示す。
配列番号６は、ＰＡ番号６のアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、配列番号１の環状に順序をかえられたもののアミノ酸配列を示す。
配列番号８は、配列番号１の環状に順序をかえられたもののアミノ酸配列を示す。
配列番号９は、配列番号１の環状に順序をかえられたもののアミノ酸配列を示す。
配列番号１０は、配列番号１の環状に順序をかえられたもののアミノ酸配列を示す。
配列番号１１は、配列番号１の環状に順序をかえられたもののアミノ酸配列を示す。
配列番号１２は、配列番号１の環状に順序をかえられたもののアミノ酸配列を示す。
配列番号１３は、配列番号１の環状に順序をかえられたもののアミノ酸配列を示す。
配列番号１４は、配列番号１の環状に順序をかえられたもののアミノ酸配列を示す。
配列番号１５は、配列番号１の環状に順序をかえられたもののアミノ酸配列を示す。
配列番号１６は、配列番号１の環状に順序をかえられたもののアミノ酸配列を示す。
配列番号１７は、ビルディングブロックＰＡ番号１の作製に使用される上部／コーディング鎖オリゴデオキシヌクレオチドの核酸配列を示す。
配列番号１８は、ビルディングブロックＰＡ番号１の作製に使用される下部／非コーディング鎖オリゴデオキシヌクレオチドの核酸配列を示す。
配列番号１９は、ｐＡＳＫ８８−Ｆａｂ−２ｘＳａｐＩ上にコードされる、抗体Ｆａｂ断片の免疫グロブリン軽鎖のＣ末端の周囲の、核酸配列ストレッチ（上部／コーディング鎖）を示す。
配列番号２０は、ｐＡＳＫ８８−Ｆａｂ−２ｘＳａｐＩ上にコードされる、抗体Ｆａｂ断片の免疫グロブリン軽鎖のＣ末端の周囲の、核酸配列ストレッチ（下部／非コーディング鎖）を示す。
配列番号２１は、ｐＡＳＫ８８−Ｆａｂ−２ｘＳａｐＩ上にコードされる、Ｆａｂ断片の軽鎖のＣ末端のアミノ酸配列を示す。
配列番号２２は、ｐＡＳＫ８８−Ｆａｂ−２ｘＳａｐＩの核酸配列を示す。
配列番号２３は、１つのＰＡ番号１（２０）ポリマーの挿入後の、Ｆａｂ軽鎖のＣ末端のアミノ酸配列をコードする核酸配列ストレッチ（上部／コーディング鎖）を示す。
配列番号２４は、１つのＰＡ番号１（２０）ポリマーの挿入後の、Ｆａｂ軽鎖のＣ末端のアミノ酸ストレッチのための核酸配列（下部／非コーディング鎖）を示す。
配列番号２５は、１つのＰＡ番号１（２０）ポリマーの挿入後の、Ｆａｂ軽鎖のＣ末端のアミノ酸配列ストレッチを示す。
配列番号２６は、ｐＦａｂ−ＰＡ番号１（２００）上にコードされるＦａｂ重鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号２７は、ｐＦａｂ−ＰＡ番号１（２００）上にコードされるＰＡ番号１（２００）ポリマーと融合しているＦａｂ軽鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号２８は、ｐＦａｂ−ＰＡ番号１（２００）の核酸配列を示す。
配列番号２９は、ＩＮＦａ２ｂのＮ末端およびＳｔｒｅｐ−タグＩＩ（最後の２個のアミノ酸のみ）のアミノ酸配列をコードする核酸配列（上部／コーディング鎖）を示す。
配列番号３０は、ＩＮＦａ２ｂのＮ末端およびＳｔｒｅｐ−タグＩＩ（最後の２個のアミノ酸のみ）のアミノ酸配列をコードする核酸配列（下部／非コーディング鎖）を示す。
配列番号３１は、Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩのＣ末端およびＩＮＦａ２ｂのＮ末端のアミノ酸配列を示す。
配列番号３２は、ｐＡＳＫ−ＩＦＮａ２ｂの核酸配列を示す。
配列番号３３は、１つのＰＡ番号１ポリマー配列カセットの挿入後の、Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩのＣ末端およびＩＦＮａ２ｂのＮ末端をコードする核酸配列ストレッチ（上部／コーディング鎖）を示す。
配列番号３４は、１つのＰＡ番号１ポリマー配列カセットの挿入後の、Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩのＣ末端およびＩＦＮａ２ｂのＮ末端の核酸配列ストレッチ（下部／非コーディング鎖）を示す。
配列番号３５は、１つのＰＡ番号１ポリマーカセットとの融合後の、Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩのＣ末端およびＩＦＮａ２ｂのＮ末端のアミノ酸配列ストレッチを示す。
配列番号３６は、ｐＰＡ番号１（２００）−ＩＦＮａ２ｂ上にコードされるＰＡ番号１（２００）ポリマーと融合している、ＩＦＮａ２ｂおよびＳｔｒｅｐ−タグＩＩのアミノ酸配列を示す。
配列番号３７は、ｐＰＡ番号１（２００）−ＩＦＮａ２ｂの核酸配列を示す。
配列番号３８は、Ｈｉｓ６−ｈＧＨのＮ末端の周囲のアミノ酸配列をコードするｐＡＳＫ７５−Ｈｉｓ６−ｈＧＨ上の核酸配列ストレッチ（上部／コーディング鎖）を示す。
配列番号３９は、ｈＧＨのＮ末端の周囲のアミノ酸配列をコードするｐＡＳＫ７５−Ｈｉｓ６−ｈＧＨ上の核酸配列ストレッチ（下部／非コーディング鎖）を示す。
配列番号４０は、ｐＡＳＫ７５−Ｈｉｓ６−ｈＧＨ上にコードされるＨｉｓ６−ｈＧＨのＮ末端のアミノ酸配列ストレッチを示す。
配列番号４１は、ｐＡＳＫ７５−Ｈｉｓ６−ｈＧＨの核酸配列を示す。
配列番号４２は、ＰＡ番号１（２０）ポリマーの挿入後のＨｉｓ６−ｈＧＨのＮ末端のアミノ酸配列をコードする核酸配列（上部／コーディング鎖）ストレッチを示す。
配列番号４３は、１つのＰＡ番号１ポリマー配列カセットの挿入後のｈＧＨのＮ末端をコードする核酸配列（下部／非コーディング鎖）を示す。
配列番号４４は、ＰＡ番号１（２０）ポリマーの挿入後のＨｉｓ６−ｈＧＨのＮ末端のアミノ酸配列を示す。
配列番号４５は、ｐＡＳＫ７５−Ｈｉｓ６−ＰＡ番号１（２００）−ｈＧＨ上にコードされる成熟したＨｉｓ６−ＰＡ番号１（２００）−ｈＧＨのアミノ酸配列を示す。
配列番号４６は、ｐＡＳＫ７５−Ｈｉｓ６−ＰＡ番号１（２００）−ｈＧＨの核酸配列を示す。
配列番号４７は、ｐＣＨＯ−ＰＡ番号１（２００）−ｈＧＨ上にコードされるＨｉｓ６−ＰＡ番号１（２００）−ｈＧＨのアミノ酸配列を示す。
配列番号４８は、ｐＣＨＯ−ＰＡ番号１（２００）−ｈＧＨの核酸配列を示す。
配列番号４９は、ｐＣＨＯ−ｈＧＨの核酸配列を示す。
配列番号５０は、ｐＣＨＯの核酸配列を示す。
配列番号５１は、Ｐ１Ａ１のアミノ酸配列を示す。
配列番号５２は、Ｐ１Ａ１のビルディングブロックの作製に使用される上部／コーディング鎖オリゴデオキシヌクレオチド（oligodesoxynucleotide）の核酸配列を示す。
配列番号５３は、Ｐ１Ａ１のビルディングブロックの作製に使用される下部／非コーディング鎖オリゴデオキシヌクレオチド（oligodesoxynucleotide）の核酸配列を示す。
配列番号５４は、Ｐ１Ａ３のビルディングブロックの作製に使用される上部／コーディング鎖オリゴデオキシヌクレオチド（oligodesoxynucleotide）の核酸配列を示す。
配列番号５５は、Ｐ１Ａ３のビルディングブロックの作製に使用される下部／非コーディング鎖オリゴデオキシヌクレオチド（oligodesoxynucleotide）の核酸配列を示す。
配列番号５６は、ｐＦａｂ−Ｐ１Ａ１（２００）上にコードされるＰ１Ａ１（２００）ポリマーと融合しているＦａｂ軽鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号５７は、ｐＦａｂ−Ｐ１Ａ３（２００）上にコードされるＰ１Ａ３（２００）ポリマーと融合しているＦａｂ軽鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号５８は、ｐＦａｂ−Ｐ１Ａ１（２００）の核酸配列を示す。
配列番号５９は、ｐＦａｂ−Ｐ１Ａ３（２００）の酸配列を示す。
配列番号６０は、ｐＳＵＭＯ−ＰＡ番号１（２００）の核酸配列を示す。
配列番号６１は、薬物コンジュゲート（１０の遺伝子カセットをコードする２０マーのライゲーションによって作製され、下流ライゲーション部位に起因する１個の追加のＣ末端Ａｌａ残基を含む）の調製に使用されるＰＡ番号１（２００）ポリペプチド／ポリマーを示す。
ここで本発明は以下を提供する。
［１］
（ｉ）少なくとも５０個のプロリン（Ｐｒｏ）およびアラニン（Ａｌａ）アミノ酸残基からなる、もっぱら、プロリンおよびアラニンアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む生合成ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントと、
（ｉｉ）（ａ）生物学的に活性なタンパク質、または生物活性を有する、もしくは媒介するアミノ酸配列を含むか、もしくは生物活性を有する、もしくは媒介するアミノ酸配列であるポリペプチドおよび（ｂ）小分子薬からなる群から選択される薬物と
を含む薬物コンジュゲート。
［２］
前記ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントが、約５０個〜約３０００個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の薬物コンジュゲート。
［３］
前記プロリン残基が、アミノ酸配列の約１０％超かつ約７５％未満を構成する、請求項１または２に記載の薬物コンジュゲート。
［４］
前記ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントが、複数のアミノ酸リピートを含み、前記リピートが、プロリンおよびアラニン残基からなり、６個以下の連続したアミノ酸残基が同一である、請求項１から３のいずれか一項に記載の薬物コンジュゲート。
［５］
前記ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントが、
またはこれらの配列全体もしくはこれらの配列の部分の環状パーミューテッドバージョンもしくは多量体（単数または複数）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の薬物コンジュゲート。
［６］
前記生物活性を有するポリペプチド、前記生物学的に活性なタンパク質、または前記生物活性を有するか、もしくは媒介するアミノ酸配列を含むか、もしくは生物活性を有する、もしくは媒介するアミノ酸配列であるポリペプチドが、結合タンパク質、抗体断片、サイトカイン、増殖因子、ホルモンまたは酵素からなる群から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の薬物コンジュゲート。
［７］
前記生物活性を有するポリペプチドが、結合タンパク質であり、前記結合分子が、抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’） ２ 断片、ＣＤＲ由来ペプチドミメティック、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ドメイン抗体、レクチン、免疫グロブリンドメイン、フィブロネクチンドメイン、プロテインＡドメイン、ＳＨ３ドメイン、アンキリンリピートドメインおよびリポカリンからなる群から選択される、請求項６に記載の薬物コンジュゲート。
［８］
前記生物学的に活性なタンパク質が、顆粒球コロニー刺激因子、ヒト成長ホルモン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、腫瘍壊死因子、エリスロポエチン、凝固因子ＶＩＩＩ、ｇｐ１２０／ｇｐ１６０、可溶性腫瘍壊死因子ＩおよびＩＩ受容体、レテプラーゼ、エキセンディン−４、アナキンラ、インターロイキン−２、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、卵胞刺激ホルモン、グルコセレブロシダーゼ、チモシンα１、グルカゴン、ソマトスタチン、アデノシンデアミナーゼ、インターロイキン１１、凝固因子ＶＩＩａ、凝固因子ＩＸ、ヘマタイド、λ−インターフェロン、レプチン、インターロイキン−２２受容体サブユニットα（ＩＬ−２２ｒａ）、インターロイキン−２２、ヒアルロニダーゼ、線維芽細胞増殖因子１８、線維芽細胞増殖因子２１、グルカゴン様ペプチド１、オステオプロテジュリン、ＩＬ−１８結合タンパク質、成長ホルモン放出因子、可溶性ＴＡＣＩ受容体、トロンボスポンジン−１、可溶性ＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ−１およびＩＬ−４ムテインからなる群から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の薬物コンジュゲート。
［９］
前記生合成ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドが、前記薬物コンジュゲートの増大したｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性を媒介する、請求項１から８のいずれか一項に記載の薬物コンジュゲート。
［１０］
前記増大したｉｎ ｖｉｖｏ安定性が、少なくとも５０個のプロリン（Ｐｒｏ）およびアラニン（Ａｌａ）アミノ酸残基からなる、もっぱら、プロリンおよびアラニンアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む前記生合成ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントを含む前記薬物コンジュゲートの、前記ランダムコイルランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントを欠く対照ポリペプチドまたは対照コンジュゲートの安定性と比較した場合における、延長された血漿半減期である、請求項９に記載の薬物コンジュゲート。
［１１］
前記小分子が、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、ドキソルビシン、カリケアマイシン、カンプトテシン、フマギリン、デキサメタゾン、ゲルダナマイシン、パクリタキセル、ドセタキセル、イリノテカン、シクロスポリン、ブプレノルフィン、ナルトレキソン、ナロキソン、ビンデシン、バンコマイシン、リスペリドン、アリピプラゾール、パロノセトロン、グラニセトロン、シタラビンＮＸ１８３８、ロイプロリド、ゴセレリン、ブセレリン、オクトレオチド、テデュグルチド（teduglutide）、シレンジチド（cilengitide）、アバレリックス、エンフビルチド、グレリン、α４インテグリン阻害剤、アンチセンス核酸、短鎖干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ステロイド、ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマーならびにペプチドおよび／またはペプチドミメティックからなる群から選択される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の薬物コンジュゲート。
［１２］
請求項１から１１のいずれか一項に記載の薬物コンジュゲートを含む組成物。
［１３］
１または複数の薬学的に許容される担体を場合によりさらに含む医薬組成物である、または診断用組成物において許容される１または複数の担体を場合によりさらに含む診断用組成物である、請求項１２に記載の組成物。
［１４］
請求項１から１１のいずれか一項に記載の薬物コンジュゲート中に含まれるランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントをコードする核酸分子、または請求項６から８のいずれか一項に記載の生物学的に活性なタンパク質を含み、少なくとも５０個のプロリン（Ｐｒｏ）およびアラニン（Ａｌａ）アミノ酸残基からなる、もっぱら、プロリンおよびアラニンアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む生合成ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントを含むタンパク質コンジュゲートをコードする核酸分子。
［１５］
（ｉ）翻訳されるアミノ酸および／またはリーダー配列をコードする核酸配列と；
（ｉｉ）少なくとも５０個のプロリン（Ｐｒｏ）およびアラニン（Ａｌａ）アミノ酸残基からなる、もっぱら、プロリンおよびアラニンアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む生合成ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントをコードする核酸配列と；
（ｉｉｉ）生物学的に活性なタンパク質、または生物学的活性および／もしくは治療活性を有する、もしくは媒介するアミノ酸配列を含むか、または生物学的活性および／もしくは治療活性を有する、もしくは媒介するアミノ酸配列である前記ポリペプチドをコードする核酸配列と；
（ｉｖ）翻訳停止コドンを表すか、または翻訳停止コドンである核酸配列と
を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の薬物コンジュゲートをコードする核酸分子。
［１６］
（ｉｉ）に記載および（ｉｉｉ）に記載の核酸分子部分またはセグメントが、薬物コンジュゲートをコードする前記核酸分子上でそれらの位置が交換されている、請求項１５に記載の核酸分子。
［１７］
（ｉ）に記載および（ｉｉ）に記載の部分もしくはセグメントの間、ならびに／または（ｉｉ）および（ｉｉｉ）に記載の部分もしくはセグメントの間に、プロテアーゼおよび／または化学的切断部位および／または認識部位を場合により含む、請求項１５または１６に記載の核酸分子。
［１８］
少なくとも５０個のプロリン（Ｐｒｏ）およびアラニン（Ａｌａ）アミノ酸残基からなる、もっぱら、プロリンおよびアラニンアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む生合成ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントをコードする核酸であって、前記核酸分子が、
（ｉ）翻訳されるアミノ酸および／またはリーダー配列をコードする核酸配列と；
（ｉｉ）もっぱら、プロリンおよびアラニンアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む前記生合成ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメントをコードする核酸配列と；
（ｉｉｉ）翻訳停止コドンを表すか、または翻訳停止コドンである核酸配列と
を含む核酸。
［１９］
（ｉ）および（ｉｉ）の間に、プロテアーゼおよび／または化学的切断部位および／または認識を場合により含む、請求項１８に記載の核酸分子。
［２０］
請求項１４から１９のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
［２１］
請求項１４から１９のいずれか一項に記載の核酸または請求項２０に記載のベクターを含む宿主細胞。
［２２］
真核宿主細胞である、請求項２１に記載の宿主細胞。
［２３］
前記真核宿主細胞が、真菌または動物細胞である、請求項２２に記載の宿主細胞。
［２４］
請求項１から１１のいずれか一項に記載の薬物コンジュゲート中に含まれるランダムコイルポリペプチドもしくはランダムコイルポリペプチドセグメントを調製する方法、前記ランダムコイルポリペプチドもしくは前記ランダムコイルポリペプチドセグメントを含む生物学的に活性なタンパク質もしくは薬物もしくは食品コンジュゲートを調製する方法、および／または請求項１から８のいずれか一項に記載の生物活性を有する、もしくは媒介するアミノ酸配列を含むか、または生物活性を有する、もしくは媒介するアミノ酸配列であり、前記ランダムコイルポリペプチドもしくはランダムコイルポリペプチドセグメントをさらに含むポリペプチドを調製する方法であって、
請求項２１から２３のいずれか一項に記載の細胞を培養することと、前記ランダムコイルポリペプチドもしくは生物学的に活性なタンパク質および／または前記生物学的に活性なタンパク質もしくは前記ポリペプチドを、培養物から、または前記細胞から単離することとを含む方法。
［２５］
ホルモン欠乏症関連障害、自己免疫疾患、増殖性障害、癌、貧血、血管新生疾患、感染／炎症性疾患、アレルギー性障害、血栓症、心筋梗塞、再狭窄（restinosis）、糖尿病、不妊症、ゴーシェ病、慢性Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、低血糖、先端巨大症、アデノシンデアミナーゼ欠乏症、血小板減少症、血友病、貧血、肥満症、アルツハイマー病、リポジストロフィー（lipodistrophy）、乾癬、転移性黒色腫、変形性関節症、脂質代謝異常、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythromatosis）、多発性硬化症、喘息、骨粗鬆症および再灌流傷害またはその他の腎臓疾患の治療のための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の薬物コンジュゲート、請求項１２または１３に記載の組成物、請求項１４から１９のいずれか一項に記載の核酸、請求項２０に記載のベクター、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の細胞、または請求項２４に記載の方法によって調製された、前記ランダムコイルポリペプチドもしくはランダムコイルポリペプチドセグメントを含む生物学的に活性なタンパク質もしくはポリペプチド。
［２６］
前記ランダムコイルポリペプチドまたはポリペプチドセグメント、生物学的に活性なタンパク質または薬物コンジュゲートの、ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性が増大した医薬として使用するための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の薬物コンジュゲート、請求項１２または１３に記載の組成物、請求項１４から１９のいずれか一項に記載の核酸、請求項２０に記載のベクターまたは請求項２１から２４のいずれか一項に記載の細胞。
［２７］
化粧品における、美容的処置における、栄養における、または食品技術における、または製紙業における、請求項１から５のいずれか一項に記載、または請求項１４から１９のいずれか一項に記載の核酸分子もしくはその一部によってコードされるランダムコイルポリペプチドまたはランダムコイルポリペプチドセグメントの使用。
［２８］
請求項１から１１のいずれか一項に記載のコンジュゲート、化粧品、美容的処置において使用される化合物、食品もしくは飲料または産業において注目されるコンジュゲートを製造する方法であって、
請求項２１から２３のいずれか一項に記載の細胞を培養することと、前記ランダムコイルポリペプチド、前記生物学的に活性なタンパク質および／または生物活性もしくは注目される活性を有する、もしくは媒介するアミノ酸配列を有するか、もしくは生物学的に活性なタンパク質および／または生物活性もしくは注目される活性を有する、もしくは媒介するアミノ酸配列であり、前記ランダムコイルポリペプチドもしくはランダムコイルポリペプチドセグメントをさらに含む前記生物学的に活性なタンパク質もしくは前記ポリペプチドを培養物から、または前記細胞から単離することとを含む方法。
［２９］
前記前記ランダムコイルポリペプチド、前記生物学的に活性なタンパク質および／または生物活性もしくは注目される活性を有する、もしくは媒介するアミノ酸配列を含むか、もしくは生物活性もしくは注目される活性を有する、もしくは媒介するアミノ酸配列であり、前記ランダムコイルポリペプチドもしくはランダムコイルポリペプチドセグメントをさらに含む前記生物学的に活性なタンパク質もしくは前記ポリペプチドが、増殖培地または培養培地、細胞溶解物、細胞膜画分、前記（宿主）細胞の周辺質から単離される、請求項２８に記載の方法。
［３０］
前記ランダムコイルポリペプチドが、注目される分子に連結および／またはカップリングされている、請求項２８または２９に記載の方法。
［３１］
前記連結または前記カップリングが、化学的連結またはカップリングである、請求項３０に記載の方法。

Claims (6)

  1. 少なくとも５０個のプロリン（Ｐｒｏ）およびアラニン（Ａｌａ）アミノ酸残基からなる、プロリンおよびアラニンアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む生合成ランダムコイルポリペプチド。
  2. ５０個〜３０００個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の生合成ランダムコイルポリペプチド。
  3. 前記プロリン残基が、前記アミノ酸配列の１０％超かつ７５％未満を構成する、請求項１または２に記載の生合成ランダムコイルポリペプチド。
  4. 複数のアミノ酸リピートを含み、前記リピートが、プロリンおよびアラニン残基からなり、６個以下の連続したアミノ酸残基が同一である、請求項１から３のいずれか一項に記載の生合成ランダムコイルポリペプチド。


  5. またはこれらの配列全体もしくはこれらの配列の部分の円順列変異体もしくは多量体（単数または複数）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の生合成ランダムコイルポリペプチド。
  6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の生合成ランダムコイルポリペプチドをコードする核酸分子。
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