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MX2012013286A - Polipeptidos biosinteticos de espira aleatoria de prolina/alanina y sus usos. - Google Patents

Polipeptidos biosinteticos de espira aleatoria de prolina/alanina y sus usos.

Info

Publication number
MX2012013286A
MX2012013286A MX2012013286A MX2012013286A MX2012013286A MX 2012013286 A MX2012013286 A MX 2012013286A MX 2012013286 A MX2012013286 A MX 2012013286A MX 2012013286 A MX2012013286 A MX 2012013286A MX 2012013286 A MX2012013286 A MX 2012013286A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
polypeptide
amino acid
random
proline
acid sequence
Prior art date
Application number
MX2012013286A
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English (en)
Other versions
MX338914B (es
Inventor
Arne Skerra
Uli Binder
Martin Schlapschy
Original Assignee
Xl Protein Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xl Protein Gmbh filed Critical Xl Protein Gmbh
Publication of MX2012013286A publication Critical patent/MX2012013286A/es
Publication of MX338914B publication Critical patent/MX338914B/es

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Abstract

La presente invención se relaciona con un polipéptido biosintético de espira aleatoria o un segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria o conjugado biosintético, en donde el polipéptido biosintético de espira aleatoria, el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria o el conjugado biosintético comprende una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina, en donde la secuencia de aminoácidos consiste de al menos aproximadamente 50 residuos de aminoácidos de prolina (Pro) y alanina (Ala). Al menos aproximadamente 50 residuos de aminoácidos de prolina (Pro) y alanina (Ala) pueden ser los constituyentes de un polipéptido heterólogo o un constructo de un polipéptido heterólogo. También se describen los usos y métodos de uso de estos polipéptidos biosintéticos de espira aleatoria o los segmentos de polipéptido o conjugados. Los usos pueden, inter alia, comprender usos médicos, usos de diagnóstico o usos en la industria alimenticia, así como otras aplicaciones industriales, como en la industria del papel, en la recuperación del petróleo, etc. En particular, se proporciona un conjugado de un fármaco que comprende (i) un polipéptido o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria, que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina, en donde la secuencia de aminoácidos consiste de al menos 50 residuos de aminoácidos de prolina (Pro) y alanina (Ala), y (ii) un fármaco seleccionado del grupo que consiste de (a) una proteína o un polipéptido biológicamente activo, que comprende o que es una secuencia de aminoácidos que tiene o media una actividad biológica y (b) un fármaco de molécula pequeña. Además, se describen las moléculas de ácidos nucleicos que codifican el polipéptido o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria y/o las proteínas heterólogas biológicamente activas, así como los vectores y células que comprenden las moléculas de ácidos nucleicos. Además, la presente invención proporciona composiciones que comprenden los compuestos de la invención, así como los usos específicos del polipéptido o el segmento del polipéptido de espira aleatoria, la proteínas biológicamente activas, los conjugados de fármacos o las moléculas de ácidos nucleicos, vectores y células de la invención. También se proporcionan métodos para producir y/o obtener los polipéptidos o los segmentos de polipéptidos biosintéticos de espira aleatoria inventivos, así como para producir y/o obtener las proteínas heterólogas biológicamente activas, inventivas, y/o los constructos de polipéptido o conjugados, como conjugados de fármacos.

Description

POLIPÉPTIDOS BIOSINTÉTICOS DE ESPIPA ALEATORIA DE PROLINA/ALANINA Y SUS USOS La presente invención se relaciona con un polipéptido biosintético de espira aleatoria o con un segmento o un conjugado de un polipéptido biosintético de espira aleatoria, el polipéptido biosintético de espira aleatoria o un segmento o un conjugado de un polipéptido biosintético de espira aleatoria comprende una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina, en donde la secuencia de aminoácidos consiste de al menos aproximadamente 50 residuos de aminoácidos de prolina (Pro) y alanina (Ala) . Los al menos aproximadamente 50 residuos de aminoácidos de prolina (Pro) y alanina (Ala) pueden ser (a) constituyentes de un polipéptido heterólogo o un constructo de un polipéptido heterólogo. También se describen los usos y métodos de uso de estos polipéptidos, segmentos o conjugados del polipéptido, biosintéticos de espira aleatoria. Los usos pueden, inter alia, comprender usos médicos, usos de diagnóstico o usos en la industria alimenticia, asi como otras aplicaciones industriales, como en la industria del papel, en la recuperación de petróleo y lo similar. La presente invención se relaciona, también, con los usos específicos del polipéptido biosintético de espira aleatoria o los segmentos o conjugados del polipéptido biosintético de espira aleatoria proporcionados en la presente, el polipéptido biosintético de espira aleatoria o los segmentos o conjugados del polipéptido biosintético de espira aleatoria comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina. La secuencia de aminoácidos del polipéptido biosintético de espira aleatoria o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria proporcionado en la presente, consiste de al menos aproximadamente 50, de al menos aproximadamente 100, de al menos aproximadamente 150, de al menos aproximadamente 200, de al menos aproximadamente 250, de al menos aproximadamente 300, de al menos aproximadamente 350 o de al menos aproximadamente 400 residuos de aminoácidos de prolina (Pro) y alanina (Ala) . Al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 150, al menos aproximadamente 200, al menos aproximadamente 250, al menos aproximadamente 300, al menos aproximadamente 350 o al menos aproximadamente 400 residuos de aminoácidos de prolina (Pro) y alanina (Ala) son de manera preferida, (a) un constituyente de un polipéptido heterólogo o un constructo de un polipéptido heterólogo o son de manera preferida, (b) un constituyente de un conjugado, como un conjugado de un fármaco, como un conjugado con un ingrediente o aditivo para alimentos o cosmético, como un conjugado con un compuesto biológicamente activo o como un conjugado con un compuesto espectroscópicamente activo. En particular, las proteínas heterólogas se proporcionan en la presente, en donde estas proteínas comprenden al menos dos dominios, en donde un primer dominio de al menos dos dominios comprende una secuencia de aminoácidos que tiene y/o que media una actividad, como una actividad biológica, y un segundo dominio de al menos dos dominios, que comprende el polipéptido de prolina/alanina o el segmento del polipéptido de prolina/alanina biosintético de espira aleatoria de la presente invención. La presente invención se relaciona, en particular, con un conjugado de un fármaco que comprende (i) un polipéptido o un segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria, que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina, en donde la secuencia de aminoácidos consiste de al menos 50 residuos de aminoácidos de prolina (Pro) y alanina (Ala), y (ii) un fármaco seleccionado del grupo que consiste de (a) una proteína o un polipéptido biológicamente activo que comprende o que es una secuencia de aminoácidos que tiene o media una actividad biológica y (b) un fármaco de molécula pequeña. Un objeto adicional de la presente invención, es un conjugado de un fármaco que comprende el polipéptido de prolina/alanina o el segmento del polipéptido de prolina/alanina, biosintético de espira aleatoria, como se proporciona en la presente y además, moléculas farmacéutica o médicamente útiles, como moléculas pequeñas, péptidos o biomacromoléculas (tales como proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, vesículas de lípidos) y lo similar, enlazados y/o acoplados al polipéptido de prolina/alanina o al segmento del polipéptido de prolina/alanina, biosintético de espira aleatoria. Además, se describen las moléculas de ácidos nucleicos que codifican el polipéptido o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria y/o las proteínas heterólogas biológicamente activas, así como los vectores y células que comprenden las moléculas de ácidos nucleicos. Además, se describen los métodos para la producción de los polipéptidos o los segmentos de polipéptidos biosintéticos de espira aleatoria, inventivos, descritos en la presente, y los conjugados de fármacos o alimentos correspondientes, es decir, conjugados que comprenden los polipéptidos o los segmentos de polipéptidos biosintéticos de espira aleatoria definidos en la presente, y un ingrediente para alimentos o un aditivo para alimentos. También se describen los conjugados correspondientes (que comprenden como un constituyente, el polipéptido o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria descrito en la presente) , que comprende, Ínter alia, un ingrediente o aditivo para cosméticos o un compuesto biológica o espectroscópicamente activo. Además, la presente invención proporciona composiciones que comprenden los compuestos de la invención (es decir, los polipéptidos de espira aleatoria o los segmentos de polipéptidos de espira aleatoria descritos en la presente, que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina y de moléculas de ácidos nucleicos que codifican la misma) , así como los usos específicos del polipéptido o el segmento del polipéptido de espira aleatoria, de las proteínas biológicamente activas que comprenden los polipéptidos de espira aleatoria o segmentos de polipéptidos de espira aleatoria, conjugados de un fármaco, los conjugados de alimentos o las moléculas de ácidos nucleicos, vectores y células de la invención. También se proporcionan métodos para producir y/o obtener los polipéptidos o los segmentos de polipéptidos biosintéticos de espira aleatoria, inventivos, así como para producir y/o obtener las proteínas heterólogas biológicamente inventivas y/o constructos de polipéptido o conjugados de un fármaco. Además, se proporcionan en la presente los usos médicos, farmacéuticos, así como de diagnóstico para el polipéptido o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria, que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina (o para las moléculas y conjugados que comprenden la misma) , como se define en la presente. Tal uso médico o farmacéutico puede comprender el uso del polipéptido o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria como un expansor del plasma y lo similar. Sin embargo, los medios y métodos proporcionados en la presente, no están limitados a los usos farmacéuticos, médicos y biológicos, sino también pueden emplearse en otras áreas industriales, como en la industria del papel, en la recuperación de petróleo, etc.
La rápida depuración de la circulación sanguínea es una propiedad típica de las moléculas pequeñas (incluyendo proteínas y péptidos pequeños) . Sin embargo, al expandir las dimensiones moleculares aparentes más allá del tamaño del poro de los glomérulos renales, la vida media en el plasma de las proteínas terapéuticas puede extenderse a un intervalo médicamente útil de varios días. Una estrategia para lograr tal efecto, es la conjugación química del compuesto biológico con el polímero sintético polietilenglicol (PEG) . Esto ha conducido a varios fármacos aprobados, por ejemplo, PEG-interferón alfa2a (Pegasys®), PEG-G-CSF (Neulasta®) y, recientemente, un fragmento de alfaTNF-Fab PEGilado (Cimzia®) . Sin embargo, la tecnología de la "PEGilación" tiene varias desventajas: los derivados de PEG grado clínico son caros y su acoplamiento covalente a una proteína recombinante requiere un procesamiento corriente abajo y pasos de purificación adicionales, disminuyendo así el rendimiento y elevando los costos. Además, es PEG no es biodegradable, lo que puede causar efectos secundarios, tales como la vacuolación del epitelio renal tras el tratamiento continuo; véase, por ejemplo, Gaberc-Porekar (2008) Curr Opin Drug Discov Devel 11:242-50; Knop (2010) Angew Chem Int Ed Engl 49:6288-308 o Armstrong rn: Veronese (Ed.), "PEGylated Protein Drugs : Basic Science and Clinical Applications"; Birkháuser Verlag, Basilea 2009.
Con el fin de superar algunas de las desventajas de la tecnología con PEG, ciertos miméticos polipeptídicos recombinantes se han proporcionado en la técnica, algunos de los cuales se basan en las secuencias de aminoácidos naturales o en tramos de aminoácidos sintéticos.
La mayoría de las secuencias de aminoácidos naturales no se comportan como una cadena aleatoria ideal en una solución fisiológica, debido a que tienden a adoptar una conformación plegada (estructura secundaria) o si están desplegadas, usualmente son insolubles y forman agregados. De hecho, la mayoría de los experimentos clásicos para investigar el comportamiento de la cadena aleatoria de los polipéptidos , se realizaron bajo condiciones desnaturalizantes, es decir, en la presencia de desnaturalizantes químicos como urea o cloruro de guanidinio (véase, por ejemplo, Cantor (1980) Biophysical Chemistry. W.H. Freeman and Company, Nueva York). Por lo tanto, tales tecnologías generalmente se basan en las secuencias de aminoácidos peculiares que se resisten al plegado, la agregación, asi como a la adsorción no especifica y asi, proporcionan cadenas aleatorias estables bajo condiciones fisiológicas de amortiguador y temperatura, incluso si están fusionadas genéticamente a un dominio de la proteina terapéutica plegada. Bajo estas circunstancias, tales miméticos de PEG recombinantes pueden conferir un incremento de tamaño mucho mayor del que normalmente se esperaría basándose en su masa molecular sola, retardando finalmente, la filtración renal y extendiendo de manera efectiva, la vida media en el plasma del compuesto biológico unido, por factores considerables.
Muchas de estas tecnologías tienen, sin embargo, excepciones y desventajas.
Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos naturales repetitivas se han probado para su utilidad en las ciencias médicas y en los procesos farmacéuticos. Uno de estos procesos se relaciona con la trans-sialidasa de Trypanosoma cruzi. Contiene un dominio catalítico de 680 residuos de aminoácidos, seguido por un dominio repetitivo C terminal, nombrado "antígeno de la fase aguda de la muda" (SAPA) , que comprende un número variable de repeticiones de aminoácidos de 12 meros. Los estudios de la farmacocinética (PK) en ratones de la trans-sialidasa que contiene 13 repeticiones de aminoácidos hidrofilicas y (a pH fisiológico) cargadas de manera negativa correspondientes, que tienen la secuencia natural DSSAHSTPSTPA, revelaron una vida media en el plasma cinco veces más larga, en comparación con la enzima recombinante de la cual la secuencia repetitiva C terminal se ha borrado (Buscaglia (1999) Blood 93:2025-32). Se observó un efecto similar que extiende la vida media, después de la infusión de la misma trans-sialidasa , es decir, su dominio catalítico de 76 kDa, con 13 repeticiones de aminoácidos cargadas de la secuencia EPKSA, que se encontraron en el antígeno 13 de la proteína de Trypanosoma cruzi. Ambas repeticiones de SAPA y del antígeno 13 fueron capaces de prolongar la vida media en el plasma de la proteina heteróloga glutatión S-transferasa (GST) de Schistosoma japonicum por un factor de 7-8 después - de la fusión genética a ambos términos C de esta enzima homodimérica (véase Buscaglia, loe. cit . ) . Incluso, aunque estas secuencias de aminoácidos naturales repetitivas de patógenos humanos, en principio pueden parecer atractivas para optimizar la farmacocinética de las proteínas terapéuticas, se encontró que son altamente inmunogénicas (véase Affranchino (1989), Mol Biochem Parasitol 34:221-8 o Buscaglia (1998), J Infect Dis 1998;177:431-6) .
Otro proceso se relaciona con el uso de gelatina. La gelatina, colágeno animal hidrolizado y desnaturalizado, contiene tramos largos de repeticiones Gly-Xaa-Yaa, en donde Xaa y Yaa se constituyen principalmente de prolina y 4-hidroxiprolina, respectivamente. La succinilación de la gelatina, ' principalmente vía los grupos e-amino de las cadenas laterales de lisina intercaladas naturalmente, incrementa la hidrofilicidad de este biopolimero y disminuye su punto isoeléctrico (pl) . La repulsión electrostática intramolecular entre los grupos carboxilato cargados de manera negativa de las cadenas laterales modificadas, supuestamente despliega la molécula a una conformación más o menos extendida. El volumen expandido resultante hace a la gelatina succinilada una macromolécula para utilizarla como un expansor de plasma en los humanos y es, Inter alia, comercializada como Volplex® (Beacon Pharmaceuticals Ltd) o Gelofusine® (B. Braun Melsungen AG) . Además, un efecto de extender la vida media se logró mediante la fusión genética del factor que estimula la colonia del granulocito (G-CSF) a un polipéptido artificial similar a la gelatina (Huang (2010) Eur J Pharm Biopharm 74:435-41) . Para este fin, todas las cadenas laterales hidrofóbicas en una gelatina natural se intercambiaron por residuos hidrofilicos , resultando en una proteina similar a la gelatina de 116 aminoácidos (GLK) , que comprende los aminoácidos G, P, E, Q, N, S, y K en orden variable. G-CSF se fusionó en su término N con 4 copias de esta secuencia GLK y se secretó en Pichia pastoris . Pichia pastoris pareció un organismo de producción favorable para las proteínas de fusión GLK; pero falta determinar si las GLK pueden producirse también en otros organismos, puesto que se conoce que los fragmentos de gelatina recombinante pueden expresarse con sólo bajo rendimiento en E. coli, por ejemplo, como se ilustra en Olsen (2003), Adv Drug Deliv Rev 55:1547-67.
La elastina es un componente de la matriz extracelular en muchos tejidos. Es formada del precursor soluble tropoelastina, que consiste de un dominio hidrofílico rico en Lys/Ala y un dominio elastomérico hidrofóbico, con una secuencia repetitiva. La reticulación enzimática de las cadenas laterales de lisina dentro del dominio hidrofílico conduce a la formación de la elastina insoluble. Los polipéptidos similares a la elastina (ELP) son secuencias repetitivas de aminoácidos diseñadas de manera artificial, derivadas del dominio hidrofóbico de la tropoelastina. El motivo de la secuencia repetido más común de los ELP es V-P-G-X-G, en donde "X" puede ser cualquier aminoácido, excepto Pro (MacEwan (2010) Biopolymers 94:60-77; Kim (2010) Adv Drug Deliv Rev 62:1468-78). Los ELP adecuados pueden fusionarse con las proteínas terapéuticas y producirse en E. coli. En consecuencia, la capacidad de los ELP de formar depósitos similares a un gel después de la inyección, pueden prolongar de manera significativa la vida media in vivo de un compuesto biológico unido, aunque por un mecanismo diferente de los otros polipéptidos no estructurados. Incluso, la unión a los ELP puede impedir la bioactividad del compañero de fusión como se demuestra por el antagonista del receptor de la interleucina-1 en un bioensayo de proliferación de los linfocitos inducido por IL-1 (Shamji (2007) Arthritis Rheum. 11:3650-3661). Además, los ELP son sometidos a degradación por las proteasas endógenas tales como la colagenasa. También, las proteínas agregadas son generalmente más susceptibles a la inmunogenicidad.
Los procedimientos adicionales se relacionan con el uso de polímeros polianiónicos . Por ejemplo, el poliglutamato (PG), se ha acoplado químicamente a fármacos de molécula pequeña, citotóxicos, poco solubles, para el tratamiento del cáncer. Un producto correspondiente sería Opaxio™, un conjugado de un fármaco de paclitaxel actualmente en estudios clínicos de fase III. La vida media del conjugado de PG de paclitaxel se prolongó por un factor de 3 a 14 en comparación con el compuesto no modificado (Singer (2005) J Control Reléase 109:120-6). Las proteínas de fusión adicionales, por ejemplo, G-CSF fusionados en su término N con un tramo de 175 residuos de Glu consecutivos o IFN-alfa2 que porta en su término C una cola de PG de 84 residuos, se produjeron en un estado soluble en el citoplasma de E. coli (véase la O2002/077036) . Para la traducción eficiente, la fusión N terminal requirió un péptido líder, que se eliminó posteriormente mediante escisión con la proteasa del Virus de las Manchas del Tabaco (TEV) . Las fusiones de poliglutamato de G-CSF e INFa2 mostraron bioactividad en ensayos de cultivo celular. Sin embargo, hasta la fecha, no se han reportado datos farmacocinéticos de estas fusiones de PG. También, la carga altamente negativa de las fusiones de PG es una desventaja general con respecto a las interacciones biomoleculares (por ejemplo, la unión del receptor objetivo o el factor soluble) , debido a la atracción electrostática artificial o a los efectos d repulsión.
La WO 2006/081249, describe una secuencia polipeptidica con aproximadamente 2 a 500 unidades repetidas de 3 a 6 aminoácidos, en donde G, N o Q representan los constituyentes principales, mientras que los constituyentes menores pueden ser A, S, T, D o E. Esta composición de aminoácidos permite la ' integración del secuón de glucosilación Asn-Xaa-Ser/Thr (en donde Xaa es cualquier aminoácido, excepto Pro) , para la glucosilación N enlazada de la cadena lateral Asn en los sistemas de expresión eucarióticos . El tamaño macromolecular incrementado de una proteina de fusión resultante, incluyendo la modificación postraduccional con estructuras de carbohidrato solvatadas voluminosas, puede extender la farmacocinética de la proteina conjugada genéticamente. Tales uniones de oligosacáridos ("glucoingenieria") , en general, pueden reducir la susceptibilidad a la proteólisis, e incrementar el volumen hidrodinámico (Sinclair (2005) J Pharm Sci 94:1626-35). Una desventaja es la heterogeneidad molecular intrínseca de la biomacromolécula glucosilada, que causa un esfuerzo adicional durante la producción biotecnológica y el control de calidad.
La WO 2010/091122 (y la WO 2007/103515) y Schellenberger (2009) Nat Biotechnol 27:1186-90, describen polímeros de aminoácidos no repetitivos no estructurados, que abarcan y que comprenden los residuos P, E, S, T, A y G. Este conjunto de aminoácidos, que muestra una composición no diferente de la repetición PSTAD descrita adicionalmente en lo anterior, se seleccionó de manera sistémica para las secuencias para proporcionar un polipéptido solvatado con un tamaño molecular grande, adecuado para el desarrollo biofarmacéutico, evitando las cadenas laterales hidrofóbicas , en particular, F, I, L, , V y W, que pueden dar lugar a 1a agregación y pueden causar una respuesta inmune mediada por HLA/ HC-II . También, los residuos de Cys potencialmente reticulantes , los aminoácidos catiónicos K, R y H, que podrían interactuar con las membranas celulares cargadas de manera negativa, y las cadenas laterales de amida de N y Q, que son potencialmente susceptibles a la hidrólisis, se excluyeron (véase Schellenberger (2009) loe. cit.). Las bibliotecas génicas sintéticas que codifican las secuencias no repetitivas que comprenden el conjunto de residuos PESTAG, que se fusionaron a la proteina fluorescente verde (GFP) , se seleccionaron con respecto a los niveles de expresión solubles en E. coli, y un subconjunto resultante se investigó adicionalmente para la estabilidad genética, la solubilidad de la proteina, la termoestabilidad, la tendencia a la agregación y el perfil contaminante. Finalmente, una secuencia de 864 aminoácidos que contiene 216 residuos de Ser (25.0% en mol), 72 residuos de Ala (8.3% en mol) y 144 aminoácidos (16.7% en mol) de cada uno de Pro, Thr, Glu y Gly, se probó adicionalmente para la fusión al agonista del receptor de GLP-1 Exendin-4 (E-XTEN) , y otros pocos compuestos biológicos. Las proteínas de fusión, que portan típicamente un dominio de unión a la celulosa, que se escindió posteriormente, se produjeron en un estado soluble en el citoplasma de E. coli y se aislaron. La investigación de E-XTEN mediante espectroscopia con dicroísmo circular (CD) , reveló una falta de la estructura secundaria, mientras que durante la cromatográfica con exclusión de tamaño (SEC), la proteína de fusión mostró sustancialmente menos retención que la esperada para una proteína de 84 kDa, demostrando así un volumen hidrodinámico incrementado ( Schellenberg (2009) loe. cit.). La estructura desordenada del polipéptido PESTAG y el incremento asociado en el radio hidrodinámico, pueden favorecerse por la repulsión electrostática entre los aminoácidos que portan una carga neta negativa alta, que están distribuidos a través de la secuencia XTEN (véase la WO 2010/091122). Sin embargo, un estudio adicional de Geething (2010) PLoS One 2010; 5: el0175, demostró que XTEN disminuye la potencia de su compañero de fusión terapéutico. En un ensayo de cultivo celular, una fusión de glucagon XTEN mostró simplemente 15% de bioactividad del péptido no modificado. Una pérdida aún más fuerte en la afinidad del receptor (EC50 incrementada 17 veces), se describió para una fusión XTEN de la hormona de crecimiento humana (hGH) ; véase la WO 2010/144502.
También la glicina, como el aminoácido más pequeño y es ructuralmente más simple, se ha considerado como el aminoácido conformacionalmente más flexible, basándose en los antecedentes teóricos; véase, por ejemplo, Schulz GE, Schirmer RH. Principies of Protein Structure. Springer, Nueva York 1979. Además, las simulaciones por computadora han indicado que el polímero Gly carece de la estructura secundaria, y probablemente forma una espira aleatoria en solución; véase Shental-Bechor (2005) Biophys J 88:2391-402. Desde una perspectiva química, la poliglicina es una poliamida no ramificada lineal que muestra cierto parecido con el poliéter PEG, en la medida que ambos son esencialmente macromoléculas unidimensionales, con muchos grados de libertad rotacional a lo largo de la cadena, que están hechas de unidades de hidrocarburo cortas repetidas, que están interrumpidas regularmente por enlaces de hidrógeno y por grupos polares altamente solvatados. En consecuencia, la poliglicina debería constituir el mimético de PEG codificable genéticamente más simple, con prospectos para extender la vida media en el plasma de las proteínas terapéuticas. Este concepto se empleó en la forma de "polímero de homoaminoácido (HAP) " o como una secuencia rica en glicina (GRS) , respectivamente; véase, Schlapschy (2007) Protein Eng Des Sel 20:273-84; O 2007/103515. Sin embargo, se ha sabido desde hace tiempo, que los polímeros puros sintetizados químicamente de Gly, muestran una pobre solubilidad en agua; véase, inter alia, en Baraford CH et al. Synthetic Polypéptidos - Preparation , Structure, and Properties . Academic Press, Nueva York 1956. Por lo tanto, se hicieron diferentes intentos de incrementar la hidrofilicidad, ya sea introduciendo cadenas laterales de serina y alcohol que se unen al hidrógeno (WO 2007/103515, así como Schlapschy (2007) loe. cit.) o, además, residuos de glutamato cargados de manera negativa (WO 2007/103515) . Debe notarse que los separadores peptídicos con la composición (Gly4Ser)n, se han descrito ya en la técnica, con el fin de enlazar los dominios de las proteínas de fusión de una manera flexible. Un volumen hidrodinámico significativamente incrementado, se detectó para estas proteínas de fusión en la SEC analítica. En el caso de la versión de HAP de 200 residuos, el incremento del tamaño aparente fue de 120% en comparación con el fragmento Fab no fusionado, mientras que la masa verdadera fue sólo mayor por 29%, revelando por lo tanto, el efecto de un volumen hidrodinámico mejorado, debido a la estructura de espira aleatoria solvatada de la marca de poliglicina. Además, los espectros de la diferencia de CD fueron característicos para la estructura secundaria desordenada para la porción HAP. Finalmente, la vida media en el plasma terminal del fragmento Fab que porta el HAP de 200 residuos en ratones, se prolongó por aproximadamente un factor 3. Aunque moderado, este efecto podría ser apropiado para ciertas aplicaciones de diagnóstico (especializadas), tales como formación de imágenes in vivo; véase, Schlapschy (2007); loe. cit. Desafortunadamente, la producción de las proteínas de fusión con secuencias repetidas de (Gly4Ser)n más largas, pareció menos factible debido a una tendencia incrementada para formar agregados, planteando así una limitación natural para el uso de los polímeros de glicina, más o menos puros, como miméticos de PEG.
La WO 2008/155134 describe que las secuencias con una mezcla apropiada de residuos de Pro, Ala y Ser (es decir, PAS) , conducen a la cancelación mutua de sus preferencias por la estructura secundaria distinta, y así, resultan en un polipéptido desordenado de manera estable. Sin embargo, la WO 2008/155134 también documenta que las proteínas de fusión con un dominio compuesto sólo de residuos de serina y alanina (SA) , es decir, un dominio que comprende solo dos tipos de aminoácidos, no forma una espira aleatoria, sino una estructura de lámina ß en su lugar.
La síntesis química de polipéptidos es bien conocida y se ha descrito en la técnica. Izuka describe la síntesis química de polipéptidos que contienen prolina (véase, Izuka (1993), Bull. Chem. Soc. Jpn 66, 1269-1272). Estos copolipéptidos contienen secuencias aleatorias de prolina y glicina, L-alanina, ácido L-a-aminobutírico (Abu) , L-norvalina (Nva) o L-leucina, respectivamente, y se sintetizan mediante copolimerizacion química. Izuka describe que tales copolipéptidos principalmente tienen una conformación similar al colágeno definida. Además, se describió en esta publicación que los copolipéptidos de prolina y alanina (o prolina y ácido L-a-aminobutírico) , son parcialmente solubles en agua, mientras que otros copolipéptidos son completamente inso.lubles. Se especuló en Izuka, que los copolipéptidos de prolina/alanina pueden tener una conformación desordenada parcial. Izuka enfatizó que los polipéptidos sintetizados químicamente con una secuencia de prolina/alanina aleatoria, ocurren predominantemente en una conformación similar al colágeno, es decir, en una conformación estructurada.
Así, el problema técnico subyacente a la presente invención, es la provisión de polipéptidos grandes con una conformación de espira aleatoria verdadera. El problema técnico se soluciona por la provisión de las modalidades caracterizadas en las reivindicaciones y como se proporcionan en la presente.
En consecuencia, la invención se relaciona con la provisión y uso de un polipéptido o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria, gue comprende una secuencia de aminoácidos que consiste de al menos aproximadamente 50, en particular de al menos aproximadamente 100, en · particular de al menos aproximadamente 150, en particular de al menos aproximadamente 200, en particular de al menos aproximadamente 250, en particular de al menos aproximadamente 300, en particular de al menos aproximadamente 350, en particular de al menos aproximadamente 400 residuos de aminoácidos de prolina y alanina. La invención se relaciona por lo tanto, con la provisión de polipéptidos o los segmentos de polipéptidos biosintéticos de espira aleatoria que comprenden una secuencia de aminoácidos de al menos 50 residuos de aminoácidos, la secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina, y que comprende al menos una prolina y al menos una alanina. La invención también proporciona para un conjugado de un fármaco que comprende (i) un polipéptido o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria, que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina, en donde la secuencia de aminoácidos consiste de al menos 50 residuos de aminoácidos de prolina (Pro) y alanina (Ala) , y (ii) un fármaco seleccionado del grupo que consiste de (a) una proteina o un polipéptido biológicamente activo, que comprende o que es una secuencia de aminoácidos que tiene o media una actividad biológica y (b) un fármaco de molécula pequeña. Los polipéptidos con conformación de espira aleatoria verdadera y los segmentos de polipéptidos con conformación de espira aleatoria verdadera, como se proporcionan en la presente, son también útiles en el contexto de usos cosméticos, asi como usos en la industria alimenticia y la producción de bebidas. Los polipéptidos grandes proporcionados en la presente, que muestran una conformación de espira aleatoria verdadera, consisten única y simplemente de residuos de prolina (P, Pro) y alanina (A, Ala) , y comprenden más de al menos 50 aminoácidos, en particular de al menos aproximadamente 100, en particular de al menos aproximadamente 150, en particular de al menos aproximadamente 200, en particular de al menos aproximadamente 250, en particular de al menos aproximadamente 300, en particular de al menos aproximadamente 350, en particular de al menos aproximadamente 400 residuos de aminoácidos de prolina y alanina. Ambos aminoácidos, P y A, necesitan estar presentes en los polipéptidos grandes proporcionados en la presente, con conformación de espira aleatoria verdadera y Ios-segmentos de polipéptidos con conformación de espira aleatoria verdadera. También se proporcionan en la presente, moléculas de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos o los segmentos de polipéptidos biosintéticos de espira aleatoria descritos en la presente, asi como conjugados de fármacos o alimentos, que comprenden los polipéptidos o los segmentos de polipéptidos biosintéticos de espira aleatoria y una proteina (enlazada de manera covalente) de interés, como una proteina biológicamente activa.
El polipéptido biosintético de espira aleatoria o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria como se describe en la presente, que se va a utilizar en los conjugados de fármacos o alimentos como se proporciona en la presente, y que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste de al menos aproximadamente 50, de al menos aproximadamente 100, de al menos aproximadamente 150, de al menos aproximadamente 200, de al menos aproximadamente 250, de al menos aproximadamente 300, de al menos aproximadamente 350, de al menos aproximadamente 400 residuos de aminoácidos de prolina (P) y alanina (A), ínter alia, se va a utilizar en un contexto heterólogo, es decir, en una proteina heteróloga biológicamente activa, constructo de proteina y/o en un conjugado de un fármaco gue comprende el polipéptido o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria y moléculas farmacéutica o médicamente útiles, como moléculas pequeñas, péptidos o biomacromoléculas tales como proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, vesículas de lípidos y lo similar. Como se ilustra en los ejemplos anexos, los inventores pudieron proporcionar de manera exitosa conjugados de fármacos que consisten de los polipéptidos de espira aleatoria verdadera definidos en la presente y proteínas biológicamente activas o tramos de proteínas, así como conjugados de fármacos que consisten de moléculas pequeñas o fármacos de molécula pequeña que comprenden y/o están enlazados a los polipéptidos de espira aleatoria descritos en la presente, que consisten únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina (es decir, de ambos aminoácidos P y A) .
En consecuencia, la presente invención proporciona, ínter alia, una proteína heteróloga biológicamente activa, que comprende al menos dos dominios, en donde (a) un primer dominio de al menos dos dominios, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene y/o media la actividad biológica; y (b) un segundo dominio de al menos dos dominios, que comprende el polipéptido o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria que consiste de una secuencia de aminoácidos que consiste de al menos aproximadamente 50, de al menos aproximadamente 100, de al menos aproximadamente 150, de al menos aproximadamente 200, de al menos aproximadamente 250, de al menos aproximadamente 300, de al menos aproximadamente 350, de al menos aproximadamente 400 residuos de aminoácidos de prolina y alanina. De acuerdo con esta invención, el "primer dominio" y el "segundo dominio", no están comprendidos en una proteína natural (es decir, que aparece en la naturaleza) o en una proteína hipotética, deducida de las secuencias de ácidos nucleicos codificantes, como marcos de lectura abiertos, etc.
Además, esta invención proporciona un conjugado de un fármaco que consiste del polipéptido o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria que comprende una secuencia de aminoácidos, que consiste de al menos aproximadamente 50, de al menos aproximadamente 100, de al menos aproximadamente 150, de al menos aproximadamente 200, de al menos aproximadamente 250, de al menos aproximadamente 300, de al menos aproximadamente 350, de al menos aproximadamente 400 residuos de aminoácidos de prolina y alanina, y moléculas farmacéutica, terapéutica y/o médicamente útiles, como moléculas pequeñas, péptidos o biomacromoléculas tales como proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, vesículas de lípidos y lo similar, que están conjugadas al polipéptido o al segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria. Nuevamente, debe notarse que el término "biológicamente activo", en contexto de los conjugados descritos en la presente, no está limitado a las moléculas biológicas puras, sino que también comprende moléculas médicamente activas, terapéuticamente activas, farmacéuticamente activas y lo similar. Es evidente para la persona con experiencia que los medios y métodos proporcionados en la presente, no están limitados a los usos farmacéuticos y médicos, sino que pueden emplearse en una amplia variedad de tecnologías, incluyendo, de manera no exclusiva, a las tecnologías de cosméticos, alimentos, bebidas y de nutrición, industria del petróleo, industria del papel y lo similar.
En contraste a los copolipéptidos sintetizados químicamente (como en Izuka, loe. cit.), los polipéptidos de espira aleatoria proporcionados en la presente, son producidos biosintéticamente . El término "biosintético", como se utiliza en la presente, se refiere a la síntesis por medio de métodos biotecnologicos (en contraste a la síntesis química) . Tales métodos biotecnologicos son bien conocidos en la técnica, y también se describen en la presente de manera adicional a continuación. La biosíntesis de los polipéptidos de espira aleatoria de la presente invención, permite la producción de polipéptidos con una secuencia definida de residuos de prolina y alanina, una longitud definida y/o una relación definida de residuos de prolina y alanina. Además, los polipéptidos proporcionados de acuerdo con la presente invención son sustancialmente puros, es decir, los polipéptidos producidos son esencialmente uniformes, y comparten las características anteriores (es decir, secuencia definida, longitud definida y/o relación de aminoácidos definida) . Los polipéptidos de espira aleatoria que consisten de al menos aproximadamente 50, en particular de al menos aproximadamente 100, en particular de al menos aproximadamente 150, en particular de al menos aproximadamente 200, en particular de al menos aproximadamente 250, en particular de al menos aproximadamente 300, en particular de al menos aproximadamente 350, en particular de al menos aproximadamente 400 residuos de aminoácidos de prolina y alanina, de acuerdo con esta invención por ejemplo, están comprendidos en polipéptidos/constructos de polipéptidos heterólogos biológicamente activos, y/o en conjugados de fármacos o alimentos, así como en otros conjugados útiles en áreas industriales adicionales, como, de manera no exclusiva, la industrial del papel, la industria del petróleo y lo similar .
En general, las características anteriores de los polipéptidos de la presente invención, permiten la formación de una espira aleatoria estable de los polipéptidos, y estos polipéptidos de espira aleatoria tienen propiedades sorprendentes y ventajosas. Por ejemplo, los polipéptidos de la presente invención son completamente solubles en solución acuosa, y tienen un volumen hidrodinámico incrementado. De manera inesperada, los polipéptidos de espira aleatoria como los definidos en la presente, también son capaces de conferir una estabilidad incrementada in vivo/in vitro. Esto es particularmente importante para aplicaciones médicas, por ejemplo, para proteínas biológicamente activas o conjugados de fármacos que comprenden el polipéptido de espira aleatoria de esta invención. Sin embargo, las numerosas propiedades ventajosas de los polipéptidos de espira aleatoria de la presente invención, no sólo permiten su uso en el campo médico, sino también en otros campos, como en los cosméticos/tratamientos cosméticos o en los campos de la tecnología de la nutrición y los alimentos, como en la industria láctea o en el procesamiento de la carne. Los ejemplos de los conjugados útiles en la industria alimenticia y lo similar, son conjugados que comprenden los polipéptidos o el segmento del polipéptido de espira aleatoria descritos en la presente, que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina, y compuestos que son útiles en estas tecnologías, como por ejemplo, polímeros de polioxipropileno o polioxietileno, que son agentes tensoactivos no iónicos utilizados como emulsificantes . También se considera en la presente, el uso de los polipéptidos biosintéticos de espira aleatoria como se definen en la presente, en los métodos bioquímicos y en los procesos técnicos, tales como la producción del papel, recuperación del petróleo y lo similar. Las características sorprendentes y ventajosas de los polipéptidos biosintéticos de espira aleatoria que consisten únicamente de residuos de prolina y alanina como se proporcionan en la presente (y también de los conjugados y constructos descritos en la presente, como conjugados/constructos de fármacos o alimentos, que comprenden los polipéptidos biosintéticos de espira aleatoria verdadera) , se describen a continuación con mayor detalle. Además, los usos y medios y métodos ilustrativos que emplean estos polipéptidos biosintéticos de espira aleatoria inventivos, se proporcionan a continuación. También los medios y métodos para la producción de tales polipéptidos biosintéticos de espira aleatoria, así como los polipéptidos o constructos de polipéptidos biológicamente activos, heterólogos, y de los conjugados y constructos descritos en la presente, como constructos de fármacos, que comprenden los polipéptidos de espira aleatoria, se proporcionan en la presente.
En el contexto de esta invención, se ha encontrado de manera sorprendente que los polímeros/polipéptidos de prolina-alanina con una composición uniforme, forman una. conformación de espira aleatoria estable. Esto también se demostró en los ejemplos anexos, en donde la estructura de espira aleatoria de los (co) polimeros/polipéptidos biosintéticos de prolina/alanina se confirmó mediante espectroscopia con dicroismo circular (CD) . La obtención y empleo de tales polipéptidos/polimeros biosintéticos de espira aleatoria verdadera fue sorprendente, puesto que el método de Chou-Fasman establecido (Chou y Fasman (1974), Biochemistry 13, 223-245) , predice una estructura secundaria de hélice a al 100% de los polimeros/polipéptidos (o segmentos de los mismos) compuestos de prolina y alanina, como se muestra en la Figura 7. Además, se encontró aquí de manera sorprendente y se demostró experimentalmente , que los polimeros/polipéptidos de prolina-alanina con una composición uniforme, forman una conformación de espira aleatoria estable. Esto también se demostró en los ejemplos anexos, en donde la estructura de espira aleatoria de los (co) polimeros/polipéptidos de prolina/alanina se confirmó mediante técnicas experimentales como espectroscopia con dicroismo circular (CD) y cromatografía con exclusión de tamaño (SEC) .
En contraste con los polipéptidos/polimeros de la presente invención, los polipéptidos sintetizados químicamente descritos, por ejemplo, en Izuka (1993), loe. cit., tienen una secuencia arbitraria/indefinida y estocástica, y una longitud diversa. Así, los polipéptidos sintetizados químicamente comprenden una mezcla de péptidos completamente diferentes con varias relaciones de prolina/alanina, longitudes y así sucesivamente. Como se mencionó en Izuka, los polipéptidos sintetizados químicamente de tal mezcla no forman (o sólo parcialmente) una espira aleatoria y, en consecuencia, no tienen ninguna de las propiedades ventajosas de los polipéptidos biosintéticos proporcionados y descritos en la presente a continuación. En consecuencia, la presente invención comprende y se relaciona con composiciones que comprenden los polipéptidos/polimeros biosintéticos de espira aleatoria inventivos, como se describe en la presente, por lo que los polipéptidos/polimeros biosintéticos de espira aleatoria son definidos, ínter alia, por su secuencia que comprende únicamente residuos de prolina y alanina. En una modalidad particular, la presente invención se relaciona con conjugados, como conjugados de fármacos o alimentos que comprenden, como un constituyente, estos polipéptidos/polimeros de espira aleatoria descritos en la presente. Estos polipéptidos/polimeros biosintéticos de espira aleatoria inventivos, comprendidos en las composiciones son, en una modalidad, de una longitud uniforme .
Como se mencionó anteriormente, los polipéptidos biosintéticos de espira aleatoria (o los segmentos de polipéptidos de espira aleatoria) de esta invención, que consisten únicamente de residuos de prolina y alanina, forman de manera inesperada una conformación de espira aleatoria estable. El término "espira aleatoria" como se utiliza en la presente, se relaciona generalmente con cualquier conformación de una molécula polimérica, incluyendo polímeros de aminoácidos/secuencias de aminoácidos/polipéptidos, en la cual los elementos monoméricos individuales que forman la estructura polimérica están esencialmente orientados de manera aleatoria hacia los elementos monoméricos adyacentes, mientras que están todavía unidos químicamente a los elementos monoméricos adyacentes. En particular, un polipéptido, secuencia de aminoácidos o polímero de aminoácidos que adopta/tiene/forma una "conformación de espira aleatoria", carece sustancialmente de una estructura secundaria y terciaria definida. En el contexto de los polipéptidos de la presente invención, los elementos monoméricos que forman la estructura polimérica (es decir, la secuencia polipeptídica/de aminoácidos), son aminoácidos únicos, tales como prolina y alanina per se o tramos de péptidos tales como las "repeticiones de aminoácidos"/"casetes de aminoácidos"/"repeticiones de casete"/"bloques de construcción"/"módulos" (o fragmentos de los mismos) , que se describen y definen adicionalmente a continuación .
La naturaleza de las espiras aleatorias del polipéptido y sus métodos de identificación experimental son conocidos por la persona con experiencia en la técnica, y se han descrito en la literatura científica (Cantor (1980) Biophysical Chemistry, 2a ed., . H. Freeman and Company, Nueva York; Creighton (1993) Proteins - Structures and Molecular Properties, 2a ed. , . H. Freeman and Company, Nueva York; Smith (1996) Fold Des 1:R95-R106) . El término "segmento", como se utiliza en la presente, se refiere a una parte del polipéptido biosintético de espira aleatoria definido en la presente, por lo que tal parte puede ser una parte interna del polipéptido biosintético de espira aleatoria descrito en la presente. Tal "segmento" puede, por ejemplo, ser un polipéptido biosintético de espira aleatoria como se define en la presente, en donde uno (o más) aminoácidos ha/se han suprimido, por ejemplo, del inicio y/o del final del polipéptido de la invención. Además, tal "segmento" puede, utilizarse como, o puede formar parte de una proteina o polipéptido más grande, por ejemplo, de una proteína de fusión con una proteína biológicamente activa. Tal "proteína de fusión" sería un ejemplo de un polipéptido/proteína/constructo de polipéptido heterólogo, biológicamente activo de la presente invención. El término "heterólogo", como se utiliza en la presente, se define aquí a continuación.
El polipéptido de espira aleatoria (o el segmento de espira aleatoria del mismo) , como se proporciona en la presente invención, y a ser empleado en el contexto de esta invención, adopta/forma una conformación de espira aleatoria, por ejemplo, en solución acuosa o a condiciones fisiológicas. El término "condiciones fisiológicas" se conoce en la técnica, y se relaciona con aquellas condiciones en las cuales las proteínas adoptar usualmente su conformación nativa, plegada. De manera más específica, el término "condiciones fisiológicas", se relaciona con los parámetros biofísicos que son típicamente válidos para las formas superiores de vida, y particularmente, en los mamíferos, de manera más preferida, en los seres humanos. El término "condiciones fisiológicas", puede- relacionarse con los parámetros bioquímicos y biofísicos que se encuentran normalmente en el cuerpo (en particular, en los fluidos corporales) de los mamíferos, y en particular en los humanos. Tales "condiciones fisiológicas" pueden relacionarse con los parámetros correspondientes encontrados en el cuerpo sano, así como los parámetros encontrados bajo condiciones de enfermedad o en pacientes humanos. Por ejemplo, un mamífero enfermo o un paciente humano pueden tener una condición de temperatura mayor, aunque "fisiológica", cuando el mamífero o el humano sufren de fiebre. Con respecto a las "condiciones fisiológicas" a las cuales las proteínas adoptan su conformación/estado nativo, los parámetros más importantes son temperatura (37°C para el cuerpo humano), pH (7.35-7.45 para la sangre humana) , osmolaridad (280-300 mmoles/kg de H20) , y, si es necesario, contenido de proteínas (66-85 g/1 en suero) . Además, la persona con experiencia en la técnica está consciente de que a condiciones fisiológicas, estos parámetros pueden variar, por ejemplo, la temperatura, pH, osmolaridad y contenido de proteínas puede ser diferente en un cuerpo dado o fluidos del tejido tales como la sangre, fluido cerebroespinal, fluido peritoneal y linfa (Klinke (2005) Physiologie, 5a ed. , Georg Thieme Verlag, Stuttgart) . Por ejemplo, en el fluido cerebroespinal, la osmolaridad. puede ser de alrededor de 290 mmoles/kg de H20 y la concentración de proteína puede ser de entre 0.15 g/1 a 0.45 g/1, mientras gue en la linfa, el pH puede ser de alrededor de 7.4 y el contenido de proteínas puede ser de entre 3 g/1 y 5 g/1. Cuando se determina si un polipéptido (o segmento del mismo) /secuencia de aminoácidos forma/adopta la conformación de espira aleatoria bajo condiciones experimentales utilizando los métodos descritos en la presente a continuación, los parámetros biofísicos tales como la temperatura, pH, osmolaridad y contenido de proteínas, pueden ser diferentes a las condiciones fisiológicas normalmente encontradas in vivo. Las temperaturas entre 1°C y 42°C o de manera preferida 4°C a 25°C, pueden considerarse útiles para probar y/o verificar las propiedades biofísicas y la actividad biológica de una proteína bajo condiciones fisiológicas in vitro.
Varios amortiguadores, en particular en los entornos experimentales (por ejemplo, en la determinación de las estructuras de las proteínas, en particular en las mediciones de CD y otros métodos que permiten que la persona con experiencia en la técnica determinar las propiedades estructurales de una proteína/tramos de aminoácidos) , o en amortiguadores, solventes y/o excipientes para composiciones farmacéuticas, son considerados para representar las "soluciones fisiológicas"/"condiciones fisiológicas" in vitro. Los ejemplos de tales amortiguadores son, por ejemplo, solución salina amortiguada con fosfato (PBS: NaCl 115 mM, KH2P04 4 mM, Na2HP04 16 mM, pH 7.4), amortiguadores Tris, amortiguadores de acetato, amortiguadores de citrato o amortiguadores similares, tales como aquéllos utilizados en los ejemplos anexos. Generalmente, el pH de un amortiguador que representa las "condiciones de la solución fisiológica", debe caer en un intervalo de 6.5 a 8.5, de manera preferida en un intervalo de 7.0 a 8.0, de manera más preferida, en un intervalo de 7.2 a 7.7, y la osmolaridad debe caer en un intervalo de 10 a 1000 mmoles/kg de H20, de manera más preferida en un intervalo de 50 a 500 mmoles/kg de H20 y de manera más preferida en un intervalo de 200 a 350 mmoles/kg de H20. Opcionalmente, el contenido de proteínas de un amortiguador que representa las condiciones de la solución fisiológica, puede caer en un intervalo de 0 a 100 g/1, despreciando la proteina con actividad biológica misma, por lo que las proteínas estabilizantes típicas pueden utilizarse, por ejemplo, seroalbúmina humana o bovina.
Se ha encontrado en la presente, que los polipéptidos (o segmentos de los mismos) , no sólo forman una conformación de espira aleatoria bajo condiciones fisiológicas, sino más generalmente, en solución acuosa. El término "solución acuosa", es bien conocido en la técnica. Una "solución acuosa" puede ser una solución con un contenido de agua (H20) de al menos aproximadamente 20%, de al menos aproximadamente 30%, de al menos aproximadamente 40%, de al menos aproximadamente 50%, de al menos aproximadamente 60%, de al menos aproximadamente 70%, de al menos aproximadamente 80% o de al menos aproximadamente 90% de H20 (peso/peso) . En consecuencia, el polipéptido (o segmento del mismo) de la presente invención, puede formar una conformación de espira aleatoria in solución acuosa, posiblemente que contiene otros solventes miscibles, o en dispersiones acuosas con un intervalo más amplio de temperaturas, valores de pH, osmolaridades o contenido de proteínas. Esto es particularmente relevante para las aplicaciones del polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) , fuera de la terapia médica o diagnóstico in vivo, por ejemplo, en la tecnología de cosméticos, nutrición o alimentos.
En consecuencia, se ha considerado también en el contexto de esta invención, que la conformación de espira aleatoria del polipéptido biosintético de prolina/alanina (o segmento del mismo) de la presente invención, se mantenga en, y/o se utilice en el contexto de composiciones farmacéuticas, como compuestos farmacéuticos/biológicos líquidos o composiciones farmacéuticas liofilizadas . Esto es particularmente importante en el contexto de las proteínas heterólogas biológicamente activas o los conjugados de un fármaco que comprenden, inter alia, el polipéptido de espira aleatoria (o el segmento del polipéptido) inventivo. De manera preferida, las "condiciones fisiológicas" se van a utilizar en los sistemas amortiguadores, solventes y/o excipientes correspondientes. Incluso, por ejemplo, en las composiciones liofilizadas o secas (como por ejemplo, composiciones farmacéuticas/compuestos biológicos) , se considera que la conformación de espira aleatoria del polipéptido de espira aleatoria (o el segmento del polipéptido) proporcionado en la presente, esté de manera transitoria no presente y/o no pueda detectarse. Sin embargo, el polipéptido de espira aleatoria (o el segmento del polipéptido) adoptará/formará nuevamente su espira aleatoria después de la reconstitución en amortiguadores/soluciones/excipientes/solventes correspondientes, o después de la administración al cuerpo. Los métodos para determinar si un polipéptido (o segmento del mismo) forma/adopta la conformación de espira aleatoria, se conocen en la técnica (Cantor (1980) loe. cit.; Creighton (1993) loe. cit.; Smith (1996) loe. cit.). Tales métodos incluyen espectroscopia con dicroismo circular (CD) como se ejemplifica en la presente a continuación. La espectroscopia con CD representa un método de espectroscopia con absorción de luz, en el cual se mide la diferencia en la absorbancia de la luz polarizada circularmente a la derecha y a la izquierda por una sustancia. La estructura secundaria de una proteina puede determinarse mediante espectroscopia con CD utilizando el espectro ultravioleta lejano, con una longitud de onda de entre aproximadamente 190 y 250 nm. A estas longitudes de onda, las diferentes estructuras secundarias encontradas comúnmente en los polipéptidos pueden analizarse, puesto que la hélice a, la lámina ß paralela y antiparalela, y las conformaciones de espira aleatoria, cada una dan lugar a una forma y magnitud características del espectro de CD. En consecuencia, al utilizar la espectrometría con CD, la persona con experiencia es fácilmente capaz de determinar si el polipéptido (o el segmento del mismo) forma/adopta la conformación de espira aleatoria en solución acuosa o a condiciones fisiológicas. Otros métodos biofisicos establecidos, incluyen espectroscopia con resonancia magnética nuclear (RMN) , espectroscopia con absorción, espectroscopia infrarroja y de Raman, medición del volumen hidrodinámico vía cromatografía con exclusión de tamaño, ultracentrifugación analítica o dispersión de la luz dinámica/estática, así como mediciones del coeficiente de fricción o la viscosidad intrínseca (Cantor (1980) loe. cit.; Creighton (1993) loe. cit.; Smith (1996) loe. cit.).
Además de los métodos experimentales anteriores, se han descrito los métodos teóricos para la predicción de las estructuras secundarias en las proteínas. Un ejemplo de tal método teórico es el método de Chou-Fasman (Chou and Fasman, loc.cit.), que se basa en un análisis de las frecuencias relativas de cada uno de los aminoácidos en las hélices a, las láminas ß, y las vueltas, basándose en las estructuras de proteínas conocidas solucionadas, por ejemplo, con cristalografía con rayos X. Sin embargo, se sabe que la predicción teórica de la estructura secundaria de la proteína no es confiable. Como se ejemplifica aquí a continuación, se encontró experimentalmente que las secuencias de aminoácidos esperadas para adoptar una estructura secundaria ce helicoidal, de acuerdo con el método de Chou-Fasman, forman una espira aleatoria. En consecuencia, los métodos teóricos tales como el algoritmo de Chou-Fasman pueden sólo tener un valor predictivo limitado de si un polipéptido dado adopta una conformación de espira aleatoria, como se ilustra también en los ejemplos y figuras anexos. Sin embargo, la predicción teórica descrita anteriormente es con frecuencia el primer procedimiento en la evaluación de una estructura secundaria putativa de un polipéptido/secuencia de aminoácidos dada. Una predicción teórica de una estructura de espira aleatoria también indica con frecuencia, que puede ser valioso verificar por los medios experimentales anteriores, si un polipéptido/secuencia de aminoácidos dado tiene en realidad una conformación de espira aleatoria.
Los homopolimeros de la mayoría de los aminoácidos, en particular los aminoácidos hidrofóbicos , son usualmente insolubles en solución acuosa (Bamford (1956) Synthetic Polypeptides - Preparation , Structure, and Properties, 2a ed., Academic Press, Nueva York). Los homopolimeros de varios aminoácidos hidrofílicos , son conocidos por formar estructuras secundarias, por ejemplo, la hélice a en el caso de Ala (Shental-Bechor (2005) Biophys J 88:2391-2402) y la lámina ß en el caso de Ser (Quadrifoglio (1968) J Am Chem Soc 90:2760-2765), mientras que la poliprolina, el homooligopéptido más rígido (Schimmel (1967) Proc Nati Acad Sci EUA 58:52-59), forma una hélice trans del tipo II en solución acuosa (Cowan (1955) Nature 176:501-503).
Utilizando los principios teóricos de la biofísica del polímero, el diámetro de la espira aleatoria de una cadena de 200 residuos de aminoácidos ascendería, en el caso de la poliglicina, por ejemplo, a aproximadamente 75 Á, calculada como la raíz cuadrada media promedio de la distancia extremo a extremo de - \ - ^jn - Cm , con n = 200 enlaces giratorios de longitud 1 = 3.8 Á para cada distancia. Ca-Ca y la "relación característica" C» ¾ 2.0 para poli(Gly) (Brant (1967) J Mol Biol 23:47-65; Creighton, (1993) loc.cit.). Esta relación muestra que la persona con experiencia en la técnica esperaría que el volumen hidrodinámico de un polímero de aminoácidos de cadena aleatoria, pudiera extenderse (a) utilizando una longitud de cadena mayor que 1 o (b) utilizando aminoácidos que exhiben una relación característica más larga, C». C» es una medida de la rigidez inherente de la cadena aleatoria molecular y tiene un valor general de 9 para la mayoría de los aminoácidos (Brant (1967) loc.cit.). Únicamente Gly, que carece de una cadena lateral, y también el aminoácido Pro, exhiben valores significativamente más pequeños. Por lo tanto, se espera que Gly y Pro (bajo condiciones desnaturalizantes) , contribuyan a reducir las dimensiones de las proteínas de espira aleatoria (Miller (1968) Biochemistry 7:3925-3935). Por lo tanto, se espera que las secuencias de aminoácidos que comprenden residuos de prolina, en consecuencia, tengan un volumen hidrodinámico relativamente compacto. En contraste con esta enseñanza, sin embargo, se muestra en la presente que el volumen hidrodinámico de los polimeros/polipéptidos de aminoácidos de la invención, que comprenden una mezcla de residuos de prolina y alanina, tienen un volumen hidrodinámico incrementado dramáticamente, determinado mediante cromatografía analítica con permeación en gel/exclusión de tamaño, cuando se compara con el volumen hidrodinámico esperado. De hecho, es sorprendente que los polipéptidos que comprenden mezclas de estos dos aminoácidos (prolina y alanina) , de los cuales, cada uno sólo tiende a formar un homooligopéptido con una estructura secundaria definida, adopten la conformación de espira aleatoria bajo condiciones fisiológicas. Tales polipéptidos de prolina/alanina inventivos tienen un radio hidrodinámico mayor que los homopolímeros que comprenden el mismo número de residuos de Gly, por ejemplo, y confieren mejor solubilidad a las proteínas o constructos biológicamente activas, es decir, proteínas heterólogas biológicamente activas o conjugados de fármacos, de acuerdo con la invención.
Como se mencionó anteriormente, los polipéptidos de prolina/alanina biosintéticos de espira aleatoria de la presente invención, difieren de los polipéptidos sintetizados químicamente en que pueden adoptar una longitud definida, uniforme, por medios y métodos fáciles. Mientras que la técnica previa proporciona mezclas/composiciones de polipéptidos con variaciones enormes en términos de la longitud de los péptidos, la presente invención puede proporcionar mezclas/composiciones de los polipéptidos biosintéticos de espira aleatoria con una longitud definida. De manera preferida, esencialmente todos los polipéptidos de la invención comprendidos en tal mezcla/composición, tienen la misma longitud definida, y por lo tanto, comparten las mismas características bioquímicas. Tal composición uniforme es más ventajosa en las varias aplicaciones médicas, cosméticas, nutritivas, en donde los polipéptidos biosintéticos de espira aleatoria pueden emplearse. Además, en particular en un contexto médico o farmacéutico, el polipéptido o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria definido en la presente, que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste de al menos aproximadamente 50, en particular de al menos aproximadamente 100, en particular de al menos aproximadamente 150, en particular de al menos aproximadamente 200, en particular de al menos aproximadamente 250, en particular de al menos aproximadamente 300, en particular de al menos aproximadamente 350, en particular de al menos aproximadamente 400 residuos de aminoácidos de prolina y alanina, también pueden utilizarse en la prevención, alivio y/o tratamiento de los trastornos relacionados y/o asociados con una situación de plasma en sangre reducido, por ejemplo, después de lesiones, quemaduras, cirugía y lo similar. Un uso médico de los polipéptidos biosintéticos de espira aleatoria o los segmentos de polipéptido es, en consecuencia, el uso como un expansor del plasma. Sin embargo, debe notarse que de acuerdo con esta invención, también los conjugados de fármacos y los polipéptidos heterólogos o los constructos de polipéptidos heterólogos descritos en la presente, pueden emplearse en el contexto de una intervención médica o farmacéutica de un trastorno relacionado con una cantidad de plasma en sangre o un contenido de plasma en sangre reducidos, o de un · trastorno relacionado con un volumen de sangre reducido.
En consecuencia, la presente invención se relaciona con una modalidad, con un polipéptido biosintético aleatorio (o segmento del mismo) , que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de al menos aproximadamente 50 residuos de aminoácidos de prolina y alanina, de al menos aproximadamente 100 residuos de aminoácidos de prolina y alanina, de al menos aproximadamente 150 residuos de aminoácidos de prolina y alanina o de al menos aproximadamente 200 residuos de prolina y alanina, en particular, cuando está comprendida en una proteina heteróloga/polipéptido/constructo de polipéptido o en un conjugado de un fármaco. La presente invención también se relaciona con polipéptidos biosintéticos de espira aleatoria, que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de al menos aproximadamente 200 residuos de aminoácidos de prolina y alanina, aún de manera más preferida, de al menos aproximadamente 300 residuos de aminoácidos de prolina y alanina, particularmente de manera, preferida, de al menos aproximadamente 400 residuos de aminoácidos de prolina y alanina, más particularmente de manera preferida, de al menos aproximadamente 500 residuos de aminoácidos de prolina y alanina, y de manera aún más preferida, de al menos aproximadamente 600 residuos de aminoácidos de prolina y alanina. La secuencia de aminoácidos que forma la conformación de espira aleatoria puede consistir de máximo aproximadamente 3000 residuos de aminoácidos de prolina y alanina, de máximo aproximadamente 2000 residuos de aminoácidos de prolina' y alanina, de máximo aproximadamente 1500 residuos de aminoácidos de prolina y alanina, de máximo aproximadamente 1200 residuos de aminoácidos de prolina y alanina, de máximo aproximadamente 800 residuos de aminoácidos de prolina y alanina. En consecuencia, el tramo de la secuencia de aminoácidos de prolina/alanina puede consistir de aproximadamente 50, de aproximadamente 100, de aproximadamente 150, de aproximadamente 200, de aproximadamente 250, de aproximadamente 300, de aproximadamente 350, de aproximadamente 400, de aproximadamente 500, de aproximadamente 600, de aproximadamente 700, de aproximadamente 800, de aproximadamente 900 a aproximadamente 3000 residuos de aminoácidos de prolina y alanina. En ciertas modalidades, la secuencia de aminoácidos biosintética inventiva, comprende aproximadamente 200 a aproximadamente 3000 residuos de prolina y alanina, aproximadamente 200 a aproximadamente 2500 residuos de prolina y alanina, aproximadamente 200 a aproximadamente 2000 residuos de prolina y alanina, aproximadamente 200 a aproximadamente 1500 residuos de prolina y alanina, aproximadamente 200 a aproximadamente 1000 residuos de prolina y alanina, aproximadamente 300 a aproximadamente 3000 residuos de prolina y alanina, aproximadamente 300 a aproximadamente 2500 residuos de prolina y alanina, aproximadamente 300 a aproximadamente 2000 residuos de prolina y alanina, aproximadamente 300 a aproximadamente 1500 residuos de prolina y alanina, aproximadamente 300 a aproximadamente 1000 residuos de prolina y alanina, aproximadamente 400 a aproximadamente 3000 residuos de prolina y alanina, aproximadamente 400 a aproximadamente 2500 residuos de prolina y alanina, aproximadamente 400 a aproximadamente 2000 residuos de prolina y alanina, aproximadamente 400 a aproximadamente 1500 residuos de prolina y alanina, aproximadamente 400 a aproximadamente 1000 residuos de prolina y alanina, aproximadamente 500 a aproximadamente 3000 residuos de prolina y alanina, aproximadamente 500 a aproximadamente 2500 residuos de prolina y alanina,. aproximadamente 500 a aproximadamente 2000 residuos de prolina y alanina, aproximadamente 500 a aproximadamente 1500 residuos de prolina y alanina, aproximadamente 500 a aproximadamente 1000 residuos de prolina y alanina, aproximadamente 600 a aproximadamente 3000 residuos de prolina y alanina, aproximadamente 600 a aproximadamente 2500 residuos de prolina y alanina, aproximadamente 600 a aproximadamente 2000 residuos de prolina y alanina, aproximadamente 600 a aproximadamente 1500 residuos de prolina y alanina, aproximadamente 600 a aproximadamente 1000 residuos de prolina y alanina, aproximadamente 700 a aproximadamente 3000 residuos de prolina y alanina, aproximadamente 700 a aproximadamente 2500 residuos de prolina y alanina, aproximadamente 700 a aproximadamente 2000 residuos de prolina y alanina, aproximadamente 700 a aproximadamente 1500 residuos de prolina y alanina, aproximadamente 700 a aproximadamente 1000 residuos de prolina y alanina, aproximadamente 800 a aproximadamente 3000 residuos de prolina y alanina, aproximadamente 800 a aproximadamente 2500 residuos de prolina y alanina, aproximadamente 800 a aproximadamente 2000 residuos de prolina y alanina, aproximadamente 800 a aproximadamente 1500 residuos de prolina y alanina, aproximadamente 800 a aproximadamente 1000 residuos de prolina y alanina. Como es evidente del contenido de esta invención, también las secuencias de aminoácidos biosintéticas más grandes (que consisten esencialmente de prolina y alanina) , están dentro del alcance de esta invención, y pueden emplearse fácilmente en las proteínas biológicamente activas o constructos de proteínas definidos en la presente, que comprenden como un dominio de al menos dos dominios, una secuencia de aminoácidos que tiene y/o media la actividad biológica y como otro dominio de al menos dos dominios, el polipéptido o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria que consiste de al menos aproximadamente 50 residuos de aminoácidos de prolina y alanina, de al menos aproximadamente 100 residuos de aminoácidos de prolina y alanina, de al menos aproximadamente 150 residuos de aminoácidos de prolina y alanina, de al menos aproximadamente 200, de al menos aproximadamente 250, de al menos aproximadamente 300, de al menos aproximadamente 350, de al menos aproximadamente 400 residuos de aminoácidos de prolina y alanina. Tal polipéptido biosintético de espira aleatoria o segmento del polipéptido corresponde a la parte de la espira aleatoria biosintética de una proteína heteróloga/constructo de proteína. Estos tramos de prolina/alanina biosintéticos , consisten de máximo aproximadamente 3000 residuos de aminoácidos de prolina y alanina. Estas secuencias de aminoácidos (tramos de prolina/alanina) , comprenden prolina y alanina como los residuos principales o únicos, como se explica además a continuación.
Se considera que es la secuencia de aminoácidos biosintéticas definida en la presente que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina (P) y alanina (?) , que forma/adopta/tiene una conformación de espira aleatoria. En el caso más simple, el polipéptido biosintético o el segmento del polipéptido consiste de la secuencia de aminoácidos que tiene -una conformación de espira aleatoria, como se define en la presente. Sin embargo, el polipéptido biosintético (o segmento del mismo) puede, además de la secuencia de aminoácidos descrita en la presente que forma/adopta/tiene una conformación de espira aleatoria, comprende secuencias de aminoácidos/residuos de aminoácidos adicionales, que no contribuyen a la formación de la conformación de la espira aleatoria, o que no son capaces de formar/adoptar/tener una conformación de espira aleatoria por si mismos. Sin diferir de la esencia de la invención, también tales polipéptidos biosintéticos (o segmentos de los mismos), son polipéptidos biosintéticos de "espira aleatoria" o segmentos de polipéptidos. Las secuencias de aminoácidos/residuos de aminoácidos adicionales pueden por ejemplo, ser útiles como enlazantes. Inter alia, los dimeros, trímeros, es decir, en 5 general los multimeros del polipéptido biosintético de espira aleatoria, también están considerados en el contexto de la presente invención, y tales multimeros pueden enlazarse por las secuencias/residuos de aminoácidos que no forman la conformación de espira aleatoria. Un ejemplo de una proteina que puede comprender tal polipéptido de espira aleatoria, es la proteina biológicamente activa proporcionada en la presente, que puede, además del polipéptido de espira aleatoria que consiste de residuos de aminoácidos de prolina y alanina como se definió en la presente, comprender además, otros polipéptidos que tengan/medien la actividad biológica. Nuevamente, tal constructo puede ser una proteina heteróloga, biológicamente activa o un constructo de polipéptido como se describe en la presente.
El término "al menos aproximadamente 50/100/150/200/300/400/500/600/700/800/etc. residuos de aminoácidos", no está limitado al número conciso de residuos de aminoácidos, sino que también comprende tramos de aminoácidos que comprenden residuos adicionales de aproximadamente 1-20%, como 10% a 20% de residuos o aproximadamente 1-20%, como aproximadamente 10% a 20% menos residuos. Por ejemplo, "al menos aproximadamente 100 residuos de aminoácidos", también puede comprender aproximadamente 80 a 100 y aproximadamente 100 a 120 residuos de aminoácidos, sin diferir de lo esencial de la presente invención. Por ejemplo, "al menos aproximadamente 200 residuos de aminoácidos", también puede comprender aproximadamente 160 a 200 y aproximadamente 200 a 240 residuos de aminoácidos, sin diferir de los esencial de esta invención. La definición y las explicaciones proporcionadas aquí anteriormente, se aplican, mutatis mutandis, también al término "máximo aproximadamente 3000/2000/1500/1200/800 residuos de aminoácidos", etc. En consecuencia, el término "aproximadamente" no está limitado o restringido al número conciso de residuos de aminoácidos en el contexto de secuencias de aminoácidos más largas (por ejemplo, secuencias de aminoácidos que comprenden o que consisten de máximo 300C residuos de aminoácidos) . Por lo tanto, el término "máximo aproximadamente 3000/2000/1500/1200/800 residuos de aminoácidos", también puede comprender tramos de aminoácidos que comprenden 10% a 20% o 10% a 20% menos residuos adicionales, sin apartarse de esta invención.
Además, los polipéptidos biosintéticos de espira aleatoria (o segmentos de los mismos) , están caracterizados por un contenido o relación de residuos de aminoácidos definido, en particular, de los constituyentes principales de prolina y alanina. Como se mencionó anteriormente, la presente invención se relaciona con un polipéptido o un segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina, en donde la secuencia de aminoácidos consiste de al menos aproximadamente 50, de al menos aproximadamente 100, de al menos aproximadamente 150, de al menos aproximadamente 200 de al menos aproximadamente 250, de al menos aproximadamente 300, de al menos aproximadamente 350, de al menos aproximadamente 400 residuos de aminoácidos de prolina (Pro) y alanina (Ala) , en particular cuando está comprendida en una proteina biológicamente activa heteróloga/constructo de proteina/polipéptido o conjugado de un fármaco. El término "únicamente", como se utiliza en la presente, significa que, de manera preferida, al menos aproximadamente 90% o al menos aproximadamente 95% de los aminoácidos son prolina y alanina, por lo que la prolina y la alanina constituyen la mayoría, pero no son los únicos residuos de aminoácidos, es decir, estas secuencias de aminoácidos inventivas no son necesariamente tramos de aminoácidos de prolina y alanina al 100%. Por lo tanto, los polipéptidos biosintéticos/secuencias de aminoácidos de la presente invención, también pueden comprender otros aminoácidos diferentes a la prolina y alanina como constituyentes menores, siempre que la secuencia de aminoácidos forme/adopte/tenga una conformación de espira aleatoria. Tal conformación de espira aleatoria puede determinarse fácilmente por los medios y métodos proporcionados en la presente. En consecuencia, también en el contexto del término "únicamente", una cantidad menor (menos que aproximadamente 10% o menos que aproximadamente 5%) de otros residuos de aminoácidos, puede estar comprendida. Los "otros" residuos de aminoácidos menores se definen en la presente a continuación.
En consecuencia, la presente invención se relaciona en una modalidad, con un polipéptido biosintético de espira aleatoria (o segmento del mismo) , por lo que la secuencia de aminoácidos consiste principalmente de prolina y alanina, y en donde los residuos de prolina constituyen más de aproximadamente 10% y menos de 75% de la secuencia de aminoácidos. Los residuos de alanina comprenden el resto de al menos 25% a 90% de la secuencia de aminoácidos (o el polipéptido o el segmento del polipéptido de espira aleatoria si consiste de la secuencia de aminoácidos) .
De manera preferida, la secuencia de aminoácidos comprende más de aproximadamente 10%, de manera preferida, más de aproximadamente 12%, aún de manera más preferida, más de aproximadamente 14%, particularmente de manera preferida, más de aproximadamente 18%, más particularmente de manera preferida, más de aproximadamente 20%, aún más particularmente de manera preferida, más de aproximadamente 22%, 23% o 24%, y aún de manera más preferida, más de aproximadamente 25% de residuos de prolina. La secuencia de aminoácidos comprende de manera preferida, menos que aproximadamente 75%, de manera más preferida, menos que 70%, 65%, 60%, 55% o 50% de residuos de prolina, en donde los valores inferiores son preferidos. Aún de manera más preferida, la secuencia de aminoácidos comprende menos que aproximadamente 48%, 46%, 44%, 42% de residuos de prolina. Las secuencias de aminoácidos particularmente preferidas, comprenden menos que aproximadamente 41%, 40%, 39% 38%, 37% o 36% de residuos de prolina, por lo que los valores inferiores son preferidos. De manera más preferida, la secuencia de aminoácidos comprende menos que aproximadamente 35% de residuos de prolina; véase también los constructos PA proporcionados a continuación en la presente.
Viceversa, la secuencia de aminoácidos comprende de manera preferida, menos que aproximadamente 90%, de manera más preferida, menos que 88%, 86%, 84%, 82% o 80% de residuos de alanina, en donde los valores inferiores son preferidos. Aún de manera más preferida, la secuencia de aminoácidos comprende menos que aproximadamente 79%, 78%, 77%, 76% de residuos de alanina, por lo que los valores inferiores son preferidos. De manera aún más preferida, la secuencia de aminoácidos comprende menos que aproximadamente 75% de residuos de alanina.
También se prefiere en la presente, una secuencia de aminoácidos que comprende más de aproximadamente 25%, de manera preferida, más de aproximadamente 30%, aún de manera más preferida, más de aproximadamente 35%, particularmente de manera preferida, más de aproximadamente 40%, más particularmente de manera preferida, más de aproximadamente 45% o 50%, aún más particularmente de manera preferida, más de aproximadamente 52%, 54%, 56%, 58% o 59% de residuos de alanina, en donde los valores más altos son preferidos. Aún de manera más preferida, la secuencia de aminoácidos comprende más de aproximadamente 60%, 61%, 62%, 63% o 64% de residuos de alanina, y de manera más preferida, más de aproximadamente 65% de residuos de alanina.
En consecuencia, el polipéptido de espira aleatoria. (o segmento del mismo), puede comprender una secuencia de aminoácidos que consiste de aproximadamente 25% de residuos de prolina, y aproximadamente 75% de residuos de alanina. De manera alterna, el polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) , puede comprender una secuencia de aminoácidos que consiste de aproximadamente 35% de residuos de prolina y aproximadamente 65% de residuos de alanina. El término "aproximadamente X%", como se utiliza en la presente anteriormente, no está limitado al número conciso del porcentaje, sino que también comprende valores de 10% a 20% o 10% a 20% menos residuos adicionales. Por ejemplo, el término 10% también puede relacionarse con 11% o 12% y a 9% y 8%, respectivamente.
Sin embargo, como se mencionó anteriormente, y como se detalla además en la presente a continuación, el polipéptido de espira aleatoria (o el segmento del polipéptido) y, en particular, la secuencia de aminoácidos, puede comprender también aminoácidos adicionales que difieren de la prolina y alanina como constituyentes menores. Como ya se discutió aquí anteriormente, los constituyentes menores, es decir, otros aminoácidos diferentes a la prolina o alanina, pueden comprender menos que aproximadamente 10%, menos que aproximadamente 9%, menos que aproximadamente 8%, menos que aproximadamente 7%, menos que aproximadamente 6%, menos que aproximadamente 5%, menos que aproximadamente 4%, menos que aproximadamente 4%, menos que aproximadamente 3% o menos que aproximadamente 2% del polipéptido/polimero biosintético de espira aleatoria de esta invención.
La persona con experiencia está consciente de que una secuencia de aminoácidos/polipéptido (o segmento del mismo) , también puede formar una conformación de espira aleatoria cuando otros residuos diferentes a prolina y alanina están comprendidos como un constituyente menor en la secuencia de aminoácidos/polipéptido (segmento del polipéptido) . El término "constituyente menor" como se utiliza en la presente, significa que máximo 5% o máximo 10% de residuos de aminoácidos son diferentes de prolina o alanina en los polipéptidos/polimeros biosintéticos de espira aleatoria inventivos de esta invención. Esto significa que máximo 10 de 100 aminoácidos pueden ser diferentes de prolina y alanina, de manera preferida máximo 8%, es decir, máximo 8 de 100 aminoácidos pueden ser diferentes de prolina y alanina, de manera más preferida, máximo 6%, es decir, máximo 6 de 100 aminoácidos pueden ser diferentes de prolina y alanina, aún de manera más preferida, máximo 5%, es decir, máximo 5 de 100 aminoácidos pueden ser diferentes de prolina y alanina, particularmente de manera preferida, máximo 4%, es decir, máximo 4 de 100 aminoácidos pueden ser diferentes de prolina y alanina, más particularmente de manera preferida, máximo 3%, es decir, máximo 3 de 100 aminoácidos pueden ser diferentes de prolina y alanina, aún más particularmente de manera preferida, máximo 2%, es decir, máximo 2 de 100 aminoácidos pueden ser diferentes de prolina y alanina, y de manera aún más preferida, máximo 1%, es decir, máximo 1 de 100 de los aminoácidos que están comprendidos en el polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) , pueden ser diferentes de prolina y alanina. Los aminoácidos diferentes de prolina y alanina, pueden seleccionarse del grupo que consiste de Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, et, Phe, Thr, Trp, Tyr y Val, incluyendo los aminoácidos modificados postraduccionalmente o aminoácidos no naturales (véase, por ejemplo, Budisa (2004) Angew Chem Int Ed Engl 43:6426-6463 o Young (2010) J Biol Chem 285:11039-11044). En el caso de que el "constituyente menor" (es decir, un aminoácido diferente de prolina y alanina) del polipéptido biosintético de espira aleatoria/constructo/polimero (o un fragmento del mismo) , comprenda como el "otro aminoácido"/"aminoácido diferente" (a) Ser, el aminoácido Ser/aminoácidos de Ser constituyen de manera preferida, menos que 50%, de manera más preferida, menos que 40%, menos que 30%, menos que 20% o menos que 10% de estos residuos de aminoácidos (menores) . En una modalidad más preferida, el polipéptido biosintético de espira aleatoria/constructo/polimero, como se describe en la presente, o la parte del polipéptido de espira aleatoria de una (por ejemplo) proteina de fusión como se describe en la presente, no comprende residuos de serina. Generalmente, se prefiere en la presente, que estos aminoácidos "menores" (diferentes a prolina y alanina) , no estén presentes en el polipéptido biosintético de espira aleatoria/constructo/polimero proporcionado en la presente, como se describe en la presente, o la parte del polipéptido de espira aleatoria de una (por ejemplo) proteina de fusión. De acuerdo con la invención, un polipéptido biosintético de espira aleatoria (o segmento del mismo) /la secuencia de aminoácidos puede, en particular, consistir exclusivamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina (es decir, ningún otro residuo de aminoácidos está presente en el polipéptido de espira aleatoria o en la secuencia de aminoácidos) .
Mientras que lo anterior se relaciona con la longitud total y el ' contenido de prolina/alanina de la secuencia de aminoácidos comprendida en el polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) , lo siguiente se relaciona con mayor detalle con secuencias de aminoácidos especificas, ejemplares (o fragmentos de las mismas) .
En una modalidad, las secuencias de aminoácidos/polipéptidos que adoptan la conformación de espira aleatoria (el polipéptido de espira aleatoria o segmento del mismo como se define en la presente) , por ejemplo, en solución acuosa o bajo condiciones fisiológicas, puede comprender una pluralidad de "repeticiones de aminoácidos"/"casetes de aminoácidos"/"repeticiones de cásete", en donde las "repeticiones de aminoácidos"/ "casetes de aminoácidos"/"repeticiones de casete"/"bloque de construcción"/"módulos" (estos términos se utilizan en la presente de manera indistinta) , consisten principalmente o de manera exclusiva de residuos de aminoácidos de prolina (Pro, P) y alanina (Ala, A) (descritos en la presente como "PA", o como "AP") , en donde no más de 6 residuos de aminoácidos consecutivos son idénticos. Un "bloque de construcción" ilustrativo es, por ejemplo, "AP", y este también se ha proporcionado en los ejemplos ilustrativos anexos como el dominio biosintético de espira aleatoria de la presente invención. Este ejemplo ilustrativo es la secuencia "P1A1", también proporcionada en la forma de APAPAPAPAPAPAPAPAPAP (SEQ ID NO: 51), es decir, una "repetición de aminoácidos"/"casete de aminoácidos"/"repetición de cásete" de "poli PA". En una modalidad preferida, la secuencia de aminoácidos/polipéptido que comprende las "repeticiones de aminoácidos"/"casetes de aminoácidos"/"repeticiones de cásete" definidos anteriormente y lo similar, comprende nos más de 5 residuos de aminoácidos consecutivos idénticos. Otras modalidades alternas se proporcionan en la presente a continuación, en el contexto de los bloques de construcción individuales, ejemplificados.
Dentro de un polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) de acuerdo con esta invención, las repeticiones de aminoácidos pueden ser idénticas o no idénticas. Los ejemplos no limitantes de "repeticiones de aminoácidos", "bloques de construcción", "módulos", "repeticiones", "casetes de aminoácidos", etc., que consisten de residuos de prolina y alanina, se proporcionan en la presente a continuación; véase, por ejemplo, la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y la SEQ ID NO. 51 (El listado de la secuencia anexo también comprende secuencias de ácidos nucleicos ilustrativas que codifican tales "repeticiones'V'módulos" , etc. Las secuencias anexas en el listado de secuencia como se presentan en la presente, constituyen parte de esta especificación y descripción) . También el uso de fragmentos (idénticos y/o no idénticos) de estas secuencias, está considerado en la presente, por lo que un "fragmento" comprende al menos 2 aminoácidos y comprende al menos una prolina y/o alanina, de manera preferida, al menos una prolina y una alanina. Los "fragmentos" de estas secuencias a ser empleadas de acuerdo con esta invención para la generación del polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) , pueden consistir de al menos 3, de manera preferida, de al menos 4, de manera más preferida, de al menos 5, aún de manera más preferida, de al menos 6, aún de manera más preferida, de al menos 8, particularmente de manera preferida, de al menos 10, más particularmente de manera preferida, de al menos 12, aún más particularmente de manera preferida, de al menos 14, aún más particularmente de manera preferida, de al menos 16, y de manera aún más preferida, de al menos 18 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs : 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 51 (debe notarse aquí que la SEQ ID No. 51 consiste de una repetición "AP" o "PA" ilustrativa) .
Basándose en las enseñanzas proporcionadas en la presente, la persona con experiencia en la técnica está fácilmente en una posición de generar secuencias de aminoácidos/polipéptidos · adicionales, que formen una conformación de espira aleatoria, por ejemplo, bajo condiciones acuosas o bajo condiciones fisiológicas, y que estén constituidos de principalmente prolina y alanina como se define en la presente. Los ejemplos adicionales de secuencias de aminoácidos/polipéptidos que forman una conformación de espira aleatoria a ser utilizados como bloques de construcción o módulos del polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) definido en la presente, pueden, ínter alia, comprender combinaciones y/o fragmentos o versiones permutadas circularmente de los "bloques de construcción", "casetes de polímero" o "repeticiones de polímero" específicos, mostrados anteriormente. En consecuencia, los módulos/unidades de secuencia/repeticiones de polímero/casetes de polímero ejemplificados del polipéptido/secuencia de aminoácidos de espira aleatoria, también pueden proporcionar fragmentos individuales que pueden combinarse recientemente para formar módulos/unidades de secuencia/repeticiones de polímero/casetes de polímero adicionales, de acuerdo con esta invención.
Los términos "módulos", "unidades de secuencia", "repeticiones de polímero", "casetes de polímero" y "bloques de construcción", se utilizan como sinónimos en la presente, y se relacionan con los tramos de aminoácidos individuales que pueden utilizarse para formar el polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) /secuencia de aminoácidos definido en la presente.
Una repetición de aminoácidos (utilizada como un "bloque de construcción", etc., de un polipéptido biosintético de espira aleatoria de la presente invención) , puede consistir de al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más residuos de aminoácidos, en donde cada repetición comprende residuos de prolina y alanina. Sin embargo, como se ilustra en la SEQ ID No. 51 anexa, el "bloque de construcción", también puede consistir simplemente de los- 2 residuos de aminoácidos proporcionados en la presente, P y A, a saber, en la forma de "PA" o "AP". En una modalidad, la repetición de aminoácidos de acuerdo con la presente invención, no comprende más de 50 residuos de aminoácidos. Sin embargo, es evidente para la persona con experiencia, que tal "repetición", puede comprender incluso más de 50 residuos de aminoácidos, por ejemplo, en los casos en donde el polipéptido biosintético de espira aleatoria/polímero inventivo comprende más de aproximadamente, por ejemplo, 100 aminoácidos, más de aproximadamente 150 aminoácidos, más de aproximadamente 200 aminoácidos, etc. En consecuencia, la cantidad máxima de residuos de aminoácidos comprendidos en tal "repetición", está condicionada por la longitud total del polipéptido biosintético (o segmento del mismo) /polímero, como se proporciona en la presente.
Incluso, debe notarse que los polipéptidos biosintéticos de espira aleatoria/secuencias de aminoácidos que comprenden las repeticiones anteriores, etc., deben de manera preferida, tener la longitud total y/o el contenido de prolina/alanina definido y explicado aquí anteriormente, es decir, consistir de aproximadamente 50, de aproximadamente 100, de aproximadamente 150, de aproximadamente 200, de aproximadamente 250, de aproximadamente 300, de aproximadamente 350, de aproximadamente 400 a aproximadamente 3000 aminoácidos y/o comprender más de aproximadamente 10% y menos que aproximadamente 75% de residuos de prolina. Todas las definiciones proporcionadas en la presente anteriormente en este contexto, también se aplican aquí, mutatis mutandis.
Como se discutió con detalle en la presente y como se proporcionó en la presente anteriormente, la presente invención proporciona proteínas heterólogas biológicamente activas o constructos de proteínas que son particularmente útiles en un entorno farmacéutico, médico y/o medicinal. Estas proteínas/constructos de proteína heterólogos, biológicamente activos, comprenden en al menos un dominio de al menos dos dominios, el polipéptido o el segmento del polipéptido de espira aleatoria que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de prolina y alanina, en donde la secuencia de aminoácidos consiste de aproximadamente 50, de aproximadamente 100, de aproximadamente 150, de aproximadamente 200, de aproximadamente 250, de aproximadamente 300, de aproximadamente 350, de aproximadamente 400 a aproximadamente 3000 residuos de prolina (Pro) y alanina (Ala) .
En el contexto de las proteínas, polipéptidos o constructos de proteínas heterólogos, biológicamente activos descritos en la presente, el término "heterólogo", se relaciona con al menos dos dominios dentro de las proteínas, polipéptidos o constructos de proteína, en donde un primer de al menos dos dominios confiere, tiene y/o media una actividad biológica definida, y en donde un segundo de al menos dos dominios, comprende el polipéptido biosintético de espira aleatoria que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina, y en donde al menos dos dominios no se encuentran enlazados de manera operativa uno al otro en la naturaleza, o no son codificados por una sola secuencia de ácidos nucleicos codificante (como un marco de lectura abierto), que exista en la naturaleza. El polipéptido biosintético de espira aleatoria/segmento del polipéptido que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina, como se proporciona en la presente, y como se emplea en las proteínas/constructos de proteína heterólogos, biológicamente activos de esta invención, de manera preferida no están modificados adicionalmente (químicamente) , por ejemplo, de manera preferida no están glucosilados ni hidroxilados .
Debe notarse que ciertas proteínas naturales o proteínas hipotéticas deducidas de los tramos de los ácidos nucleicos secuenciados encontrados en la naturaleza, se describen como que comprenden un contenido relativamente alto (es decir, por encima del promedio) de prolina y alanina. Por ejemplo, una proteína hipotética heteróloga se ha descrito para la cepa principal de Leishmania Friedlin (Ivens (2005) Science 309, 436-442) . El marco de lectura descrito comprende 1514 tripletes del codón que incluyen un tramo de 412 tripletes compuestos de 240 codones de Ala, 132 de Pro, 34 de Lys y 4 de Val. Los residuos de Lys, que están cargados de manera positiva bajo condiciones de amortiguador fisiológico, están distribuidas de manera casi uniforme entre esta secuencia, sugiriendo un efecto solubilizante . Sin embargo, como es evidente de la descripción en la presente, tal proteína hipotética homologa deducida de la molécula de ácidos nucleicos natural o el marco de lectura abierto, que comprende un alto contenido de prolina y alanina por encima del promedio, no es parte de esta invención. La invención se basa en el hecho de que un polipéptido de espira aleatoria o segmento del polipéptido bastante grande, que no ocurre en la naturaleza de una manera aislada, y que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de prolina y alanina, en donde la secuencia de aminoácidos consiste de aproximadamente 50, de aproximadamente 100, de aproximadamente 150, de aproximadamente 200, de aproximadamente 250, de aproximadamente 300, de aproximadamente 350, de aproximadamente 400 a aproximadamente 3000 residuos de prolina (Pro) y alanina · (Ala), se proporciona, que es particularmente útil en un contexto médico/farmacéutico. Los polipéptidos o los segmentos de polipéptidos biosintéticos de espira aleatoria aislados descritos en la presente, que no aparecen en la naturaleza en una manera aislada, también están comprendidos en las proteínas o constructos de proteína heterólogos, biológicamente activos descritos, que son particularmente útiles en un entorno farmacéutico, médico y/o medicinal. Estas proteínas/constructos de proteína heterólogos, biológicamente activos, comprenden como al menos un dominio de al menos dos dominios, el polipéptido o el segmento del polipéptido de espira aleatoria que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de prolina, y alanina, en donde la secuencia de aminoácidos consiste de aproximadamente 50, de aproximadamente 100, de aproximadamente 150, de aproximadamente 200, de aproximadamente 250, de aproximadamente 300, de aproximadamente 350, de aproximadamente 400 a aproximadamente 3000 residuos de prolina ' (Pro) y alanina (Ala) .
También, las proteínas de arabinogalactano (AGP) , proteínas ricas en Pro, y extensinas, pertenecen a un grupo grande de glucoproteínas, conocidas como glucoproteínas ricas en hidroxiprolina (Hyp) (HRGP) , que se expresan a través del reino vegetal. Un motivo AGP tal, que comprende una repetición de Ala-Pro (AP)51, se expresó como un péptido de glucomódulo sintético con una secuencia de la señal N terminal y la proteína fluorescente verde C terminal en Arabidopsis thaliana transgénica, y se investigó como un sustrato para las prolil hidroxilasas y la O-glucosilación posterior de los residuos de hidroxi prolina (Estévez (2006) Plant Physiol. 142, 458-470). Nuevamente, las cadenas laterales de Pro hidroxiladas y/o glucosiladas descritas, que pueden formar enlaces de hidrógeno con las moléculas de agua, parecen tener un efecto solubilizante .
Debe notarse que en la presente, las "proteínas biológicamente activas o constructos de proteínas que comprenden (al menos) un dominio, un polipéptido biosintético de espira aleatoria o segmento de péptido que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de prolina y alanina" descritas, se relaciona con proteínas o constructos de proteínas que no aparecen normalmente en la naturaleza, y así, son "heterólogos" . Además, y en contraste con las secuencias ricas en prolina descritas en el reino vegetal, los polipéptidos biosintéticos de espira aleatoria/segmentos de polipéptidos descritos en la presente, son de manera preferida no modificados químicamente, es decir, son de manera preferida no glucosilados o hidroxilados .
Una ventaja particular de los polipéptidos o los segmentos de polipéptidos biosintéticos de espira aleatoria de esta invención, es su carácter intrínsecamente hidrofílico pero no cargado. En consecuencia, como los aminoácidos "menores" (diferentes de prolina y alanina) , en el polipéptido biosintético de espira aleatoria o tramo de polipéptido descrito en la presente, se prefiere que tales aminoácidos no tengan cadenas laterales hidrofóbicas , como Val, lie, Leu, Met, Phe, Tyr o Trp, y/o que no tengan cadenas laterales cargadas, como Lys, Arg, Asp o Glu. De acuerdo con esta invención, se considera que (en los casos en donde tales aminoácidos individuales, sin embargo, están comprendidos en el polipéptido biosintético de espira aleatoria/segmento del polipéptido inventivo) , el contenido general de cada aminoácido individual que tiene una cadena lateral hidrofóbica, como Val, lie, Leu, Met, Phe, Tyr o Trp, y/o que tiene una cadena lateral cargada, como Lys, Arg, Asp o Glu, dentro del polipéptido biosintético de espira aleatoria (o segmento del mismo) definido en la presente, no exceda de 8%, 7%, 6% 5% , 4%, 3% , 2% o 1%.
El polipéptido biosintético de espira aleatoria/secuencias de aminoácidos de la presente invención, pueden comprender concatámeros de bloques individuales que comprenden tramos combinados de prolina/alanina de la secuencia ( Pro) x- (Ala) y, por lo que x puede tener un valor entero de 1 a, de manera preferida 15, de manera más preferida 1 a 10, aún de manera más preferida 1 a 5, y y puede tener un valor entero de 1 a, de manera preferida 15, de manera más preferida 1 a 10, aún de manera más preferida 1 a 5, y x y y pueden variar entre bloques posteriores. x y y también pueden ser un entero de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15.
Las secuencias de aminoácidos/polipéptidos que forman la conformación de espira aleatoria en solución acuosa, o bajo condiciones fisiológicas, pueden tener la fórmula (I): [ProxAla y]n en donde x se selecciona de manera independiente de un entero de 1 a 5. Además, para cada n, y se selecciona de manera independiente de un entero de 1 a 5. n, finalmente, es cualquier entero con la condición de que el polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) /secuencia de aminoácidos, consista de manera preferida de al menos aproximadamente 50, de al menos aproximadamente 100, de al menos aproximadamente 150, de al menos aproximadamente 200, de al menos aproximadamente 250, de al menos aproximadamente 300, de al menos aproximadamente 350, de al menos aproximadamente 400 residuos de aminoácidos y hasta aproximadamente 3000 residuos de aminoácidos. También en este contexto, debe notarse que los polipéptidos/secuencias de aminoácidos que comprenden los concatámeros anteriores o que tienen la fórmula (I) anterior, de manera preferida deben tener la longitud total y/o el contenido de prolina/alanina definido y explicado aquí anteriormente, es decir, consistir de aproximadamente 50, de aproximadamente 100, de aproximadamente 150, de aproximadamente 200, de aproximadamente 250, de aproximadamente 300, de aproximadamente 350, de aproximadamente 400 a aproximadamente 3000 aminoácidos y/o comprender más de aproximadamente 10% y menos que aproximadamente 75% de residuos de prolina. Nuevamente, todas las definiciones proporcionadas aquí anteriormente en este contexto, también se aplican aquí, mutatis mutandis .
La presente invención también se relaciona con polipéptidos de espira aleatoria (segmentos de polipéptido) /secuencias de aminoácidos que comprenden un tramo de aminoácidos, seleccionados del grupo que consiste de AAPAAPAPAAPAAPAPAAPA (SEQ ID NO: 1); AAPAAAPAPAAPAAPAPAAP (SEQ ID NO: 2); AAAPAAAPAAAPAAAPAAAP (SEQ ID NO: 3, siendo un ejemplo para [ ProiAla3] 5) ; AAPAAPAAPAAPAAPAAPAAPAAP (SEQ ID NO: 4); APAAAPAPAAAPAPAAAPAPAAAP (SEQ ID NO: 5); AAAPAAPAAPPAAAAPAAPAAPPA (SEQ ID NO: 6) y APAPAPAPAPAPAPAPAPAP (SEQ ID NO: 51, siendo un ejemplo para [ProiAlai] io) o versiones permutadas circulares o multimeros de estas secuencias como un todo o partes de estas secuencias. · En consecuencia, el polipéptido de espira aleatoria (segmentos de polipéptido del mismo) /secuencia de aminoácidos, puede comprender el tramo de aminoácidos AAPAAPAPAAPAAPAPAAPA (SEQ ID NO: 1), AAPAAPAPAAPAAPAPAAPA (SEQ ID NO: 1); AAPAAAPAPAAPAAPAPAAP (SEQ ID NO: 2); AAAPAAAPAAAPAAAPAAAP (SEQ ID NO: 3); AAPAAPAAPAAPAAPAAPAAPAAP (SEQ ID NO: 4); APAAAPAPAAAPAPAAAPAPAAAP (SEQ ID NO: 5); AAAPAAPAAPPAAAAPAAPAAPPA (SEQ ID NO: 6) y APAPAPAPAPAPAPAPAPAP (SEQ ID NO: 51) , asi como combinaciones de estos motivos o combinaciones de fragmentos o partes de estos motivos, siempre que el polipéptido biosintético de espira aleatoria resultante, consista únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina, en donde la secuencia de aminoácidos consiste de al menos 50 residuos de aminoácidos de prolina (Pro) y alanina (Ala) .
También pueden utilizarse las versiones permutadas de las secuencias de aminoácidos anteriores, de acuerdo con la presente invención. Las versiones permutadas circulares ejemplares de, por ejemplo, AAPAAPAPAAPAAPAPAAPA (SEQ ID NO: 1) , pueden generarse fácilmente, por ejemplo, eliminando la primera alanina y agregando otra alanina al final de la secuencia anterior. Tal versión permutada circular de la SEQ ID NO: 1, seria entonces APAAPAPAAPAAPAPAAPAA (SEQ ID NO: 7). Los ejemplos no limitantes adicionales de las versiones permutadas circulares de la SEQ ID NO. 1, son: PAAPAPAAPAAPAPAAPAAA (SEQ ID NO: 8), AAPAPAAPAAPAPAAPAAAP (SEQ ID NO: 9), APAPAAPAAPAPAAPAAAPA (SEQ ID NO: 10), PAPAAPAAPAPAAPAAAPAA (SEQ ID NO: 11), APAAPAAPAPAAPAAAPAAP (SEQ ID NO: 12), PAAPAAPAPAAPAAAPAAPA ( SEQ ID NO: 13), AAPAAPAPAAPAAAPAAPAP (SEQ ID NO: 14), APAAPAPAAPAAAPAAPAPA (SEQ ID NO: 15), PAAPAPAAPAAAPAAPAPAA (SEQ ID NO: 16), y lo similar. Basándose en las enseñanzas de la presente invención, una persona con experiencia está fácilmente en la posición de generar las versiones permutadas circulares correspondientes de los tramos de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y la SEQ ID NO. 51 (la SEQ ID No. 51 está basada completamente en repeticiones "AP" y una versión permutada circular podría basarse enteramente en repeticiones/bloques de construcción "PA" o "AP") .
Tales versiones permutadas circulares también pueden considerarse como ejemplos de un "módulo"/"bloque de construcción" adicional, etc., de los polipéptidos/secuencias de aminoácidos proporcionados en la presente, que pueden utilizarse en consecuencia en la presente.
Es evidente para la persona con experiencia en la técnica, que también los "módulos" y fragmentos (más cortos) o las versiones permutadas circularmente de los tramos de aminoácidos proporcionados en la presente, pueden utilizarse como "módulos", "repeticiones" y/o bloques de construcción para el polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) /secuencia de aminoácidos definido en la presente.
De acuerdo con lo anterior, el polipéptido de espira aleatoria/secuencia de aminoácidos que forman la conformación de espira aleatoria, puede comprender un multímero de cualquiera de los tramos de aminoácidos anteriores (o versiones permutadas circulares o fragmentos de las mismas), de manera preferida, aquéllas mostradas en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y la SEQ ID NO. 51. Nótese que estas secuencias de ninguna manera, son limitantes en el contexto de esta invención.
Nuevamente, los polipéptidos/secuencias de aminoácidos que comprenden los tramos de aminoácidos anteriores (o fragmentos de los mismos), versiones mutadas circulares (o fragmentos de las mismas), de manera preferida, deben tener la longitud total y/o el contenido de prolina/alanina como se definió y explicó aquí anteriormente, es decir, consistir de aproximadamente 50, de aproximadamente 100, de aproximadamente 150, de aproximadamente 200, de aproximadamente 250, de aproximadamente 300, de aproximadamente 350, de aproximadamente 400 a aproximadamente 3000 aminoácidos y/o comprender más de aproximadamente 10% y menos que aproximadamente 75% de residuos de prolina. Todas las definiciones proporcionadas en la presente anteriormente, en este contexto, también se aplican aqui, mutatis mutandis . También, el término "fragmento", se ha definido anteriormente .
Como se mencionó anteriormente, en el contexto de esta invención, se encontró de manera sorprendente que los polipéptidos biosintéticos de espira aleatoria (o el segmento del polipéptido) /polímeros proporcionados en la presente, están caracterizados por un volumen hidrodinámico relativamente grande. Este volumen hidrodinámico, también llamado tamaño aparente, puede determinarse fácilmente mediante filtración en gel analítica (también conocida como cromatografía con exclusión de tamaño, SEC) . De manera preferida, el polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo), tiene un tamaño aparente de al menos 10 kDa, de manera preferida, de al menos 25 kDa, de manera más preferida, de al menos 50 kDa, aún de manera más preferida, de al menos 100 kDa, particularmente de manera preferida, de al menos 200 kDa y de manera aún más preferida, de al menos 400 kDa. La persona con experiencia en la técnica es fácilmente capaz de determinar el volumen hidrodinámico de las proteínas específicas. Tales métodos pueden incluir dispersión de la luz dinámica/estática, ultracentrifugación analítica o filtración en gel analítica, como se ejemplifica-en la presente a continuación. La filtración en gel analítica representa un método conocido en la técnica para medir el volumen hidrodinámico de las macromoléculas . De manera alterna, el volumen hidrodinámico de un polipéptido globular puede estimarse por su peso molecular (Creighton (1993) loe. cit . ) . Como se describió en la presente, el volumen hidrodinámico de los polipéptidos de la invención que consisten de manera preferida de al menos aproximadamente 50, de al menos aproximadamente 100, de al menos aproximadamente 150, de al menos aproximadamente 200, de al menos aproximadamente 250, de al menos aproximadamente 300, de al menos aproximadamente 350, de al menos aproximadamente 400 a aproximadamente 3000 residuos de aminoácidos de prolina y alanina, y que tienen una conformación de espira aleatoria, muestran valores inesperadamente altos con relación al volumen hidrodinámico que se estimaría para una proteína globular plegada correspondiente, basándose en el peso molecular. Lo siguiente se relaciona con proteínas o constructos de proteína heterólogos, biológicamente activos, que comprenden, inter alia, el polipéptido biosintético de espira aleatoria (o segmento del mismo) , como se describió y definió aquí anteriormente, que representa una modalidad preferida de la presente invención. Sin apegarse a una teoría, se encontró de manera sorprendente en el contexto de la presente invención, que los tramos de polipéptido biosintético de espira aleatoria proporcionados en la presente, y que consisten únicamente de prolina y alanine. pueden, aún proporcionar un volumen hidrodinámico mayor que un tramo biosintético de espira aleatoria correspondiente, que tiene el mismo número total de residuos de aminoácidos, pero que consiste únicamente de prolina, alanina y serina (como se proporciona en la WO 2008/155134).
Las proteínas en plasma humanas comunes, tales como seroalbúmina (HSA) e inmunoglobulinas (Ig), incluyendo anticuerpos humanizados, muestran vidas medias largas, típicamente de 2 a 3 semanas, que es atribuible a su interacción específica con el receptor Fe neonatal (FcRn) , conduciendo a un reciclado endosomal (Ghetie (2002) Immunol Res, 25:97-113). En contraste, la mayoría de otras proteínas de interés farmacéutico, en particular los fragmentos de anticuerpos recombinantes, hormonas, interferones, etc., sufren de una depuración rápida (sangre) . Esto es particularmente cierto para las proteínas cuyo tamaño está por debajo del valor umbral para la filtración renal de aproximadamente 70 kDa (Caliceti (2003) Adv Drug Deliv Rev 55:1261-1277). En estos casos, la vida media en plasma de una proteina farmacéutica no modificada, puede ser considerablemente menor que una hora, volviéndola asi esencialmente útil para la mayoría de las aplicaciones terapéuticas. Con el fin de lograr una acción farmacológica sostenida y también un cumplimiento por parte del paciente mejorado, con intervalos de dosificación requeridos que se extienden a días o incluso semanas, se establecieron previamente varias estrategias para propósitos del desarrollo de un fármaco biofarmacéutico .
Primero, el mecanismo de reciclado de las proteínas en plasma naturales se ha empleado para producir proteínas de fusión con la porción Fe de las Ig, por ejemplo, Enbrel®, un híbrido entre el dominio extracelular del receptor de TNFa y la IgGl humana (Goldenberg (1999) Clin Ther 21:75-87), o con seroalbúmina, por ejemplo, Albuferon® (albinterferón alfa-2b, ZALBIN™, JOULFERON®) , una fusión correspondiente del IFNalfa con HSA (Osborn (2002) J Pharmacol Exp Ther 303:540-548). La albúmina con su alta concentración en plasma de de 600 µ? también se ha utilizado de una manera indirecta, sirviendo como un vehículo portador para compuestos biofarmacéuticos que están equipados con una función de unión a la albúmina, por ejemplo, vía fusión con un dominio que se une a la albúmina bacteriana (ABD) de la proteina G Streptococcal (Makrides (1996) J Pharmacol Exp Ther 277:534-542), o con un péptido seleccionado contra HSA de una biblioteca de representación del fago (Dennis (2002) J Biol Chem, 277:35035-35043; Nguyen (2006) Protein Eng Des Sel 19:291-297) .
Segundo, una metodología fundamentalmente diferente para prolongar la vida media en el plasma de los compuestos biofarmacéuticos, es la conjugación con polímeros químicos altamente solvatados y fisiológicamente inertes, alargando así de manera efectiva el radio hidrodinámico de la proteína terapéutica más allá del tamaño del poro glomerular de aproximadamente 3-5 nm (CaliCeti (2003) loe. cit.). El acoplamiento covalente bajo condiciones bioquímicamente suaves con derivados activados de polietilenglicol (PEG), ya sea aleatoriamente vía cadenas laterales de Lys (Clark (1996) J Biol Chem 271:21969-21977), o por medio de residuos de Cys introducidos de manera específica (Rosendahl (2005) BioProcess International : 52-60 ) , ha sido moderadamente exitosa y se está aplicando actualmente en varios fármacos aprobados. Las ventajas correspondientes se han logrado especialmente en conjunto con proteínas pequeñas que poseen una actividad farmacológica específica, por ejemplo, Pegasys®, un IFNa-2a recombinante PEGilado químicamente (Harris (2003) Nat Rev Drug Discov, 2:214-221; Walsh (2003) Nat Biotechnol 21:865-870).
Sin embargo, el acoplamiento químico de la proteína biológicamente activa con los polímeros sintéticos, tiene desventajas con respecto al desarrollo y producción biofarmacéuticos . Los derivados de PEG adecuados son caros, especialmente puesto que se necesita una alta pureza, y su conjugación con una proteína recombinante requiere pasos de procesamiento y purificación in vitro adicionales, que disminuyen el rendimiento y elevan los costos de fabricación. De hecho, el PEG está contaminado con frecuencia con aldehidos y peróxidos (Ray (1985) Anal Biochem 146:307-312), y es intrínsecamente susceptible a la degradación química tras el almacenamiento en la presencia de oxígeno. También, la función farmacéutica de una proteína terapéutica puede dificultarse si las cadenas laterales de aminoácidos en la vecindad de su sitio bioquímico activo se modifican por el proceso de PEGilación. Además, el acoplamiento químico con polímeros sintéticos resulta usualmente en una mezcla heterogénea de moléculas que muestran una variación sustancial de la actividad in vivo.
Tercero, el uso de análogos de la glucosilación de las proteínas biológicamente activas en las cuales las nuevas secuencias de consenso de la glucosilación N enlazadas se introducen, se ha propuesto para prolongar la vida media en el plasma; véase la WO 02/02597; Perlman (2003) J Clin Endocrinol Metab 88:2327-2335; o Elliott (2003) Nat Biotechnol 21:414-420). Las proteínas glucodiseñadas descritas, sin embargo, muestran una actividad in vivo alterada, que indica que las nuevas cadenas laterales de carbohidratos influencian la actividad biológica de la proteina diseñada. Además, las cadenas laterales de carbohidratos adicionales, probablemente incrementan la antigenicidad de las moléculas biológicas activas resultantes, lo que eleva sustancialmente las preocupaciones sobre la seguridad. Además, se ha reportado que las proteínas de fusión que comprenden la secuencia repetitiva artificial derivada de Trypanosoma cruzi, PSTAD, inducen una vida media prolongada en el plasma de la trans-sialidasa (Alvarez (2004) JBC 279:3375-3381). Incluso, se ha reportado que tales repeticiones derivadas de Trypanosoma cruzi inducen una respuesta inmune humoral (Alvarez (2004) loe. cit . ) . En consecuencia, se desean estrategias alternas para prolongar la acción de las proteínas biológicamente activas.
Se encontró de manera sorprendente que las secuencias de aminoácidos/polipéptidos biosintéticos descritos en la presente y que consisten únicamente de prolina y alanina, de acuerdo con la invención, adoptan una conformación de espira aleatoria, en particular bajo condiciones isiológicas. Por lo tanto, son moléculas ventajosas para proporcionar el "segundo dominio" definido a continuación en la presente de las proteinas/polipéptidos biológicamente activos, es decir, que comprende un tramo de polipéptido que forma bajo condiciones fisiológicas, una conformación de espira aleatoria, y que por lo tanto media una estabilidad in vivo y/o in vitro incrementada para las proteínas o polipéptidos biológicamente activos ("funcionales"), en particular, una vida media en el plasma incrementada. El volumen hidrodinámico de una proteína funcional que se fusiona al dominio de espira aleatoria se incrementa dramáticamente, como puede estimarse utilizando métodos estándar mencionados en la presente. Puesto que se piensa que el dominio de espira aleatoria no interfiere con la actividad biológica del primer dominio de la proteína biológicamente activa, la actividad biológica mediada por la proteína funcional de interés a la cual se fusiona, se conserva esencialmente. Además, se piensa que los polímeros/polipéptidos de aminoácidos que forman el dominio de espira aleatoria descrito en la presente, son muy inertes biológicamente, especialmente con respecto a la proteólisis en el plasma sanguíneo, inmunogenicidad, punto isoeléctrico/comportamiento electrostático, unión a los receptores de la superficie celular, así como la internalización, pero son todavía biodegradables , lo que proporciona claras ventajas con respecto a los polímeros sintéticos, tales como PEG.
De acuerdo con lo anterior, la presente invención se relaciona con una proteina biológicamente activa que comprende el polipéptido biosintético de espira aleatoria descrito en la presente. Tal proteina/constructo de proteina biológicamente activo que comprende el polipéptido biosintético de espira aleatorio descrito en la presente, es una proteina/constructo de proteina biológicamente activo heterólogo. En particular, se describen en la presente también proteínas heterólogas biológicamente activas, que comprenden o consisten de al menos dos dominios, en donde (a) un primer dominio de al menos dos dominios comprende o consiste de una secuencia de aminoácidos que tiene y/o media la actividad biológica; y (b) un segundo dominio de al menos dos dominios comprende o consiste del polipéptido o el segmento del polipéptido de espira aleatoria descrito y definido en la presente .
Debe notarse que de acuerdo con la presente invención, que el "primer dominio" y el "segundo dominio", se relacionan con tramos de proteínas que no aparecen naturalmente dentro de la misma proteína o que no se espera que sean parte de la misma proteína hipotética, codificada por una secuencia de ácidos nucleicos codificante (como un marco de lectura abierto) , como se encuentra en la naturaleza .
Las definiciones y explicaciones proporcionadas en la presente anteriormente, en el contexto del polipéptido o el segmento del polipéptido de espira aleatoria del mismo, se aplican, mutatis mutandis, en el contexto de las proteínas biológicamente activas que comprenden el polipéptido de espira aleatoria (o segmentos de polipéptidos del mismo) .
De manera preferida, la conformación de espira aleatoria media una estabilidad in vivo y/o in vitro incrementada de la proteína biológicamente activa, como la estabilidad in vivo y/o in vitro en muestras biológicas o en medios fisiológicos.
Por ejemplo, se considera en la presente, que las proteínas que comprenden un "segundo dominio" adicional definido en la presente, que adoptan una conformación de espira aleatoria en solución acuosa o bajo condiciones fisiológicas (por ejemplo, polímeros que consisten de aproximadamente 200 o aproximadamente 400 o aproximadamente 600 residuos de aminoácidos y que comprenden PA#1/SEQ ID NO. 1, PA#2/SEQ ID NO. 2, PA#3/SEQ ID NO. 3, PA#4/SEQ ID NO. 4, PA#5/SEQ ID NO. 5, PA#6/SEQ ID NO. 6 y/o P1A1/SEQ ID NO. 51 como "bloques de construcción"), tienen una estabilidad en suero o vida media en el plasma en suero ventajosa, incluso in vivo, (en particular, si se administran de manera intravenosa) , en comparación con un control que carece de la conformación de espira aleatoria.
En la WO 2008/155134 (como se discutió aquí anteriormente) , se ha mostrado que las proteínas biológicamente activas que comprenden un dominio con una secuencia de aminoácidos que adopta una conformación de espira aleatoria, tienen una estabilidad in vivo y/o in vitro incrementada. Los dominios de espira aleatoria descritos en la WO 2008/155134 consisten, en particular, de residuos de prolina, alanina y serina (PAS) . La presencia de estos tres residuos se describe en ei documento de la técnica previa como un requisito esencial para la formación de una espira aleatoria estable y soluble en solución acuosa.
Como se discutió en la introducción aquí anteriormente, la WO 2007/103515 describe polímeros recombinantes no estructurales, que comprenden como constituyentes principales, una gran variedad de aminoácidos, ínter alia, glicina, aspartato, alanina, serina, treonina, glutamato y prolina. Sin embargo, el término "polímero recombinante no estructurado" tiene, en contraste a los términos "biosintético" y "espira aleatoria", un significado claro no reconocido.
También se mencionó aquí anteriormente la WO 2006/081249. Este documento describe conjugados de proteínas que comprenden una proteína biológicamente activa acoplada a un polipéptido que comprende de 2 a 500 unidades de una repetición de aminoácidos que tiene Gly, Asn y Gln como los constituyentes principales y Ser, Thr, Asp, Gln, Glu, His y Asn como los constituyentes menores. Tales conjugados de proteina se describen por tener una vida media en el plasma incrementada o disminuida, cuando se comparan con la proteina biológicamente activa no conjugada. La WO 2006/081249, sin embargo, no proporciona ninguna enseñanza para predecir si hay una repetición de aminoácidos especifica que reduce o aumenta la vida media en el plasma del conjugado. Además, la WO 2006/081249 no enseña o sugiere que la vida media en el plasma de las proteínas puede incrementarse cuando la proteína conjugada comprende una repetición de aminoácidos que forma una conformación de espira aleatoria, como se muestra en la presente invención. Además, las repeticiones de aminoácidos descritas en la WO 2006/081249, comprenden al menos dos residuos seleccionados de Gly, Asn y Gln, que está en claro contraste con los polipéptidos biosintéticos de espira aleatoria de la presente invención, que comprenden una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina.
De manera sorprendente, se ha encontrado en la presente que las secuencias de aminoácidos biosintéticas de espira aleatoria proporcionadas en la presente, que en contraste con la técnica previa, comprenden únicamente residuos de prolina y alanina (es decir, que de manera preferida no comprenden una cantidad sustancial de cualquier otro aminoácido, tampoco una cantidad sustancial de serina o sin serina) , forman también una estructura de espira aleatoria útil. Esto es particularmente inesperado, dada la descripción en la WO 2008/155134 de las proteínas de fusión con un dominio compuesto únicamente de residuos de serina y alanina (SA) , es decir, en donde los residuos de prolina se omitieron, demostrando que tal dominio que comprende sólo dos tipos de aminoácidos, no forma una espira aleatoria, sino una estructura de lámina ß. Estos dominios de serina-alanina tampoco mostraron un volumen hidrodinámico incrementado como se observó con "PAS" o, en particular, con las secuencias "P/A" proporcionadas en la presente.
Como se utiliza en la presente, el término "actividad biológica" describe el efecto biológico de una sustancia en la materia viviente. En consecuencia, los términos "proteína biológicamente activa", como se utiliza en la presente, se relaciona con proteínas que son capaces de inducir un efecto biológico en células/organismos vivientes, que están expuestos a la proteína o polipéptido. Incluso, debe notarse que en el contexto de la presente invención, el término "proteína biológicamente activa", se relaciona con una proteína completa de la invención, que comprende tanto una secuencia de aminoácidos que tiene y/o media la actividad biológica (el primer dominio) , como la secuencia de aminoácidos inventiva que adopta/forma la conformación de espira aleatoria y que consiste únicamente de prolina y alanina (el segundo dominio) .
En consecuencia, los términos "secuencia de aminoácidos que tiene y/o que media la actividad biológica" o "secuencia de aminoácidos con actividad biológica", como se utilizan en la presente para el "primer dominio" definido anteriormente de la proteina biológicamente activa de la invención, que media o tiene o es capaz de mediar o tener la "actividad biológica" definida anteriormente. También comprendidos en los términos "secuencia de aminoácidos que tiene y/o media la actividad biológica" o "secuencia de aminoácidos con actividad biológica", están cualesquier proteínas de interés (y fragmentos funcionales de las mismas, tales como fragmentos ' de anticuerpo, fragmentos que comprenden dominios extracelulares o intracelulares de un receptor de membrana, formas truncas de un receptor de crecimiento o citocina y lo similar) , la vida media de las cuales, ya sea in vivo o in vitro, necesita prolongarse. En una modalidad de esta invención, la secuencia de aminoácidos que tiene y/o media la actividad biológica de acuerdo con la presente invención, puede deducirse de cualquier "proteína de interés", es decir, cualquier proteína de interés farmacéutico o biológico o cualquier proteína que es útil como un agente terapéutico/de diagnóstico.
En consecuencia, las proteínas biológicamente activas pueden comprender un primer dominio que comprende una secuencia de aminoácidos biológicamente activa, que se deriva de polipéptidos producidos naturalmente o polipéptidos producidos mediante tecnología de ADN recombinante . En una modalidad preferida, la proteína de interés puede seleccionarse del grupo que consiste de proteínas de unión/moléculas de unión, inmunoglobulinas, fragmentos de anticuerpo, proteínas de transporte, receptor de membrana, proteínas/péptidos de señalización tales como citocinas, factores de crecimiento, hormonas o enzimas y lo similar.
Como se explicó aquí anteriormente, el polipéptido de espira aleatoria (o el segmento del polipéptido) comprendido en el segundo dominio de la proteína biológicamente activa, forma la conformación de espira aleatoria en particular, bajo condiciones fisiológicas. Esto es particularmente relevante en el contexto de las proteínas biológicamente activas que pueden formar parte de una composición farmacéutica que se va a administrar a un sujeto o paciente.
Debe notarse que el dominio- biosintético de espira aleatoria inventivo (el "segundo dominio") de la proteína biológicamente activa, de manera nativa (es decir, bajo condiciones fisiológicas) , adopta/forma/tiene conformación de espira aleatoria, en particular in vivo, y cuando se administra a mamíferos o pacientes humanos en necesidad de intervención médica. En contraste, se sabe en la técnica que las proteínas que tienen una estructura secundaria y/c terciaria no aleatoria como la conformación nativa, tienden a adoptar una conformación de espira aleatoria bajo condiciones no fisiolóqicas (es decir, bajo condiciones desnaturalizantes) . Sin embargo, tales proteínas desnaturalizadas tienen características completamente diferentes, en comparación con la proteína biológicamente activa que comprende el polipéptido de espira aleatoria de la presente invención. Por lo tanto, es lo fundamental de esta invención, que la "proteína biológicamente activa" y la parte biológicamente activa de las proteínas de fusión/constructos de fusión proporcionados en la presente, mantengan su función biológica también cuando se combinen y/o enlacen con el polipéptido biosintético de espira aleatoria (o el segmento del polipéptido) de esta invención.
Además, el polipéptido de espira aleatoria (o el segmento del polipéptido) retiene la solubilidad bajo condiciones fisiológicas. En consecuencia, también se considera que el constructo de proteína de la presente invención (que comprende en "primer" y "segundo dominio" definidos anteriormente) , pueda comprender el "segundo" dominio que forma/adopta la espira aleatoria de manera transitoria o temporal, no en una conformación de espira aleatoria, por ejemplo, cuando está en la forma de una 1 composición especifica, como un liofilizado o una composición seca. Incluso, es importante que tal "segundo dominio" del constructo de proteina inventivo nuevamente adopte después de, por ejemplo, la reconstitución en amortiguadores correspondientes (de manera preferida, amortiguadores/excipientes y/o solventes "fisiológicos") , la conformación de espira aleatoria definida en la presente. El "segundo dominio" es (si es necesario, después de la reconstitución correspondiente) , capaz de mediar una estabilidad incrementada in vivo y/o in vitro de la proteina biológicamente activa inventiva. Se prefiere en la presente que el "segundo dominio", como se definió en la presente, consista del polipéptido de espira aleatoria (o el segmento del polipéptido) de la presente invención.
Como se utiliza en la presente, el término "dominio" se relaciona con cualquier región/parte de una secuencia de aminoácidos que es capaz de adoptar de manera autónoma, una estructura y/o función especifica. En el contexto de la presente invención, en consecuencia, un. "dominio" puede representar un dominio funcional o un dominio estructural. Como se describió en la presente, las proteínas de la presente invención comprenden al menos un dominio/parte que tiene y/o media la actividad biológica, y al menos un dominio/parte que forma la conformación de espira aleatoria. Incluso, las proteínas de la invención también pueden consistir de más de dos dominios, y pueden comprender, por ejemplo, un enlazante o estructura separadora adicional entre los dos dominios/partes definidos en la presente u otros dominios/partes como, por ejemplo, un sitio de escisión sensible a la proteasa, una marca de afinidad, tal como la marca His6 o la marca Strep, un péptido de la señal, un péptido de retención, un péptido de selección como un péptido de translocación de la membrana o dominios efectores adicionales como fragmentos de anticuerpo para la selección de tumores, asociados con una toxina antitumor o una enzima para la activación del profármaco, etc.
En otra modalidad, la proteina biológicamente activa de la invención tiene un volumen hidrodinámico determinado mediante filtración en gel analítica (también conocida como cromatografía con exclusión de tamaño, SEC) de al menos 50 kDa, de manera preferida, de al menos 70 kDa, de manera más preferida, de al menos 80 kDa, aún de manera más preferida, de al menos 100 kDa, particularmente de manera preferida, de al menos 125 kDa y de manera aún más preferida, de al menos 150 kDa. La persona con experiencia en la técnica es fácilmente capaz de determinar el volumen hidrodinámico de las proteínas específicas. Los métodos ejemplares se han descrito aquí anteriormente en el contexto del polipéptido de espira aleatoria. Una persona con experiencia está fácilmente en la posición de adaptar tales métodos también en el contexto de la proteína biológicamente activa de la presente invención. Como se describe aquí a continuación, el volumen hidrodinámico de las proteínas biológicamente activas de la invención, que comprenden el segundo dominio definido anteriormente, es decir, el dominio que comprende o consiste del polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) proporcionado en la presente, muestran tener un volumen hidrodinámico inesperadamente grande, con relación al volumen hidrodinámico estimado para una proteína plegada globular correspondiente, basándose en su peso molecular o número/composición de residuos de aminoácidos.
Deberá notarse que el primer dominio que comprende una "secuencia de aminoácidos que tiene y/o media la actividad biológica", también puede adoptar su actividad biológica en el contexto de, o después de la asociación con otro polipéptido o secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, el fragmento Fab de un anticuerpo, tal como uno del anticuerpo antitumor Herceptina (Eigenbrot (1993) J. Mol. Biol . 229:969-995), consiste de dos cadenas de polipéptidos diferentes, la cadena ligera de la inmunoglobulina y un fragmento de la cadena pesada de la inmunoglobulina, que pueden, además, estar enlazados vía enlaces disulfuro intercadena. De acuerdo con la presente invención, puede ser suficiente enlazar una de estas cadenas (por ejemplo, vía fusión génica) al polipéptido de espira aleatoria (o el segmento del polipéptido) , mientras que la proteina biológicamente activa completa se reconstituye por medio de la asociación con la otra cadena. Tal reconstitución puede lograrse, por ejemplo, mediante la coexpresión de los diferentes polipéptidos (por una parte, una proteina de fusión de una cadena y el polipéptido de espira aleatoria, y por otra parte, la otra cadena) , en la misma célula hospedera, como se describe en los ejemplos anexos, o mediante la reconstitución in vitro, por ejemplo, como parte de un protocolo de replegado.
En consecuencia, también tales proteínas (que comprenden dos cadenas polipeptidicas separadas), están consideradas como proteínas biológicamente activas de acuerdo con la presente invención. En tal caso, el primer dominio como se define en la presente, puede comprender dos cadenas polipeptidicas separadas, que están enlazadas solo de manera, no covalente. Además, las cadenas independientes de la proteína/dominio biológicamente activo pueden estar cada una, enlazadas al polipéptido de espira aleatoria (o el segmento del polipéptido) . Además de los fragmentos de anticuerpo, hay muchas otras proteínas homo o heterooligoméricas de interés (por ejemplo, insulina, hemoglobina y lo similar) , que están compuestas de varias cadenas polipeptidicas asociadas, y que son el objeto de esta invención.
Como se utiliza en la presente, el término "proteína de unión", se relaciona con una molécula que es capaz de interactuar de manera específica con compañeros de unión potenciales, de manera que es capaz de discriminar entre los compañeros de unión potenciales y una pluralidad de diferentes moléculas como los compañeros de unión potenciales, a tal grado que de una agrupación de la pluralidad de diferentes moléculas como compañeros de unión potenciales, sólo los compañeros de unión potenciales se unen, o se unen de manera significativa. Los métodos para medir la unión entre una proteína de unión y un compañero de unión potencial son conocidos en la técnica, y pueden realizarse de manera rutinaria, por ejemplo, utilizando ELISA, calorimetría con titulación isotérmica, diálisis en equilibrio, ensayos de desplegado, resonancia con plasmón en la superficie o un aparato Biacore. Las proteínas de unión/moléculas de unión ejemplares, que son útiles en el contexto de la presente invención incluyen, de manera no exclusiva, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos tales come fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2f fragmentos variables de una sola cadena (scFv) , regiones variables aisladas de anticuerpos (regiones VL y/o VH) , CDR, anticuerpos/inmunoglobulinas de un solo dominio, peptidomiméticos derivados de la CDR, lectinas, dominios de inmunoglobulina, dominios de fibronectina, dominios la proteína A, dominios SH3, dominios de repetición de la ankirina, lipocalinas o varios tipos de proteínas de unión derivadas de la estructura, como se describió, por ejemplo, en Skerra (2000) J Mol Recognit 13:167-187, Gebauer (2009) Curr Opin Chem Biol 13:245-255, Binz (2005) Nat Biotechnol 23:1257-1268 o Nelson (2009) Nat Biotechnol 27:331-337.
Otras proteínas biológicamente activas ejemplares de interés (en particular, proteínas comprendidas en el primer dominio o que constituyen/están en el primer dominio de la proteína biológicamente activa) , que son útiles en el contexto de la presente invención incluyen, de manera no exclusiva, el factor que estimula la colonia del granulocito, hormona del crecimiento humana, alfa-interferón, beta-interferón, gamma-interferón, lambda-interferón, factor de necrosis del tumor, eritropoyetina, factores de coagulación, tal como el factor de coagulación VIII, factor de coagulación Vlla, factor de coagulación IX, gpl20/gpl60, receptor del factor de necrosis del tumor I y II soluble, trombolíticos tales como reteplasa, péptidos con efectos metabólicos tales como GLP-1 o exendina-4, proteínas inmunosupresoras/inmunorreguladoras como los antagonistas del receptor de la interleucina-1 anakinra, interleucina-2 y lipocalina asociada con la neutrófilo gelatinasa u otras lipocalinas naturales o diseñadas, o aquellas proteínas o compuestos listados, por c ejemplo, en Walsh (2003) Nat Biotechnol 21:865-870 o Walsh (2004) Eur J Pharm Biopharm 58:185-196, o listados en las bases de datos en linea, tales como http://www.biopharma.com/approvals.html o http : //www . fármacobank . ca . Las proteínas biológicamente activas adicionales (en particular, las proteínas comprendidas del primer dominio o que constituyen/están en el primer dominio de la proteína biológicamente activa) , que pueden emplearse en el contexto de la presente invención son, inter alia, la hormona que estimula el folículo, glucocerebrosidasa, timosina alfa 1, glucagon, somatostatina, adenosina desaminasa, interleucina 11, hemátido, leptina, interleucina-20, subunidad alfa del receptor de la interleucina-22 (IL-22ra), interleucina-22, hialuronidasa , factor de crecimiento del fibroblasto 18, factor de crecimiento del fibroblasto 21, péptido 1 similar al glucagon, osteoprotegerina, proteína de unión a IL-18, factor que libera la hormona del crecimiento, receptor de TACI soluble, trombospondina-1, receptor del VEGF soluble Flt-1, a-galactosidasa A, antagonista de la miostatina, polipéptido inhibidor gástrico, alfa-1 antitripsina, IL-4 muteína y lo similar. Como será evidente de la descripción en la presente, la presente invención también se relaciona o comprende el polipéptido biosintético de espira aleatoria de prolina/alanina o el segmento del polipéptido de prolina/alanina y moléculas farmacéutica o médicamente útiles como moléculas pequeñas, péptidos o biomacromoléculas tales como proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, vesículas de lípidos y lo similar, en particular proteínas farmacéutica o médicamente útiles, como (de manera no exclusiva) , proteínas de unión/moléculas de unión, inmunoglobulinas, fragmentos de anticuerpo, proteínas de transporte, receptores de membrana, proteínas/péptidos de señalización, citocinas, factores de crecimiento, hormonas o enzimas y los similar, que pueden estar comprendidas en los constructos de un fármaco definidos en la presente, pero que también pueden ser parte de la proteína heteróloga biológicamente activa definida en la presente, que comprende o consiste de al menos dos dominios definidos. En tal caso, las proteínas farmacéutica o médicamente útiles particulares (o fragmentos funcionales de las mismas) , pueden estar en el "primer dominio" de al menos dos dominios que comprenden o consisten de una secuencia de aminoácidos que tiene y/o media la actividad biológica. Los fragmentos funcionales, en este contexto, son fragmentos de proteínas farmacéutica o médicamente útiles que son capaces de dilucidar la respuesta biológica o farmacéutica deseada in vivo y/o in vitro y/o tener o mediar incluso la actividad biológica deseada.
El enlazante/separador del polipéptido mencionado anteriormente, insertado entre el primer y el segundo dominios, de manera preferida, comprende una pluralidad de aminoácidos hidrofílicos, enlazados al péptido, que están enlazados de manera covalente a ambos dominios. En aún otra modalidad, el enlazante/separador del polipéptido comprende un sitio de escisión de la proteasa del plasma, que permite la liberación controlada del primer dominio que comprende un polipéptido que tiene y/o media una actividad biológica. Los enlazantes de diferentes tipos o longitudes pueden enlazarse sin una carga indebida, para obtener la actividad biológica óptima de las proteínas específicas.
En una modalidad preferida, las proteínas biológicamente activas de la presente invención son proteínas de fusión. Una proteína de fusión, como se describió en la presente, puede comprender al menos un dominio que puede mediar una actividad biológica, y al menos otro dominio que comprende el polipéptido biosintético de espira aleatoria (o el segmento del polipéptido) como se describió en la presente, en un solo polipéptido con múltiples dominios. Nuevamente, deberá notarse que la presente invención no está limitada a las proteínas de fusión, en donde un dominio media una actividad biológica. También se proporcionan en la presente, otras "proteínas de fusión"/"constructos de fusión", en donde una parte/dominio, es o comprende el polipéptido de espira aleatoria/polímero de prolina/alanina inventivo y la otra parte/dominio, comprende otro tramo/estructura de la proteína.
En particular, en el caso de las proteínas de fusión, el polipéptido de espira aleatoria (o el segmento del polipéptido) de acuerdo con esta invención, no necesariamente porta residuos de Pro o Ala en sus términos amino o carboxilo. En una modalidad alterna, la proteina biológicamente activa de acuerdo con la presente invención, puede representar un conjugado de proteina, en donde una proteina de interés o un polipéptido/tramo de polipéptido/péptido/secuencia de aminoácidos que tiene y/o media la actividad biológica, es conjugado vía un enlace no peptídico a una secuencia de aminoácidos que forma/adopta la conformación de espira aleatoria, en particular, el polipéptido de espira aleatoria (o el segmento del polipéptido) , como se proporciona en la presente, y que consiste únicamente de los residuos de prolina y alanina. Los enlaces no peptidicos que son útiles para reticular las proteínas son conocidos en la técnica, con el polipéptido o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria que comprende una secuencia de aminoácidos, que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina, en donde la secuencia de aminoácidos consiste de al menos 50 residuos de aminoácidos de prolina (Pro) y alanina (Ala) , como se proporciona en la presente. Tales enlaces no peptidicos pueden incluir enlaces de disulfuro, por ejemplo, entre las cadenas laterales de Cys, enlaces de tioéter o enlaces covalentes no peptidicos inducidos por reticuladores químicos, tales como el suberato de disuccinimidilo (DSS) o el 4- [p-maleimidofenil] butirato de sulfosuccinimidilo (Sulfo-SMPB) , grupos quelantes metálicos/complej antes , así como interacciones proteína-proteína no covalentes.
Deberá notarse que la "proteína biológicamente activa" de la presente invención, también puede comprender más de una "secuencia de aminoácidos que tiene y/o media una actividad biológica". Además, la proteína biológicamente activa también puede comprender más de un polipéptido biosintético de espira aleatoria (o segmento del mismo) . En el caso más simple, la proteína biológicamente activa consiste de dos dominios, es decir, un primer dominio que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene y/o media una actividad biológica, y un segundo dominio que comprende el polipéptido biosintético (o segmento del mismo) . Deberá notarse que la presente invención no está limitad a las "proteínas biológica o terapéuticamente activas" enlazadas al polipéptido o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria descrito en la presente, que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina, en donde la secuencia de aminoácidos consiste de al menos 50 residuos de aminoácidos de prolina (Pro) y alanina (Ala) . También otras proteínas o moléculas de interés, relevantes para otras industrias, como la industria alimenticia o de las bebidas, la industria cosmética y lo similar, pueden fabricarse por los medios y métodos proporcionados en la presente.
La persona con experiencia en la técnica está consciente de que el "dominio que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene y/o media una actividad biológica" y el "segundo dominio que comprende el polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo)", comprendido en las proteínas biológicamente activas de la invención, pueden organizarse en un orden específico.
En consecuencia, y en el contexto de la invención, el orden del "primer" y "segundo" dominio definidos en la presente del polipéptido biológicamente activo inventivo, puede colocarse en un orden, en donde el "primer dominio" (es decir, proteína de interés; "secuencia de aminoácidos que tiene y/o media la actividad biológica") , se localiza en el término amino (N) y el "segundo dominio" (es decir, el dominio que comprende el polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) proporcionado en la presente) , se localiza en el término carboxi (C) de la proteína biológicamente activa. Sin embargo, este orden también puede invertirse, por ejemplo, el "primer dominio" (es decir, proteína de interés; "secuencia de aminoácidos que tiene y/o media la actividad biológica") , se localiza en el término carboxi (C) y el "segundo dominio" (es decir, el dominio que comprende el polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) proporcionado en la presente) , se localiza en el término amino (N) de la proteina biológicamente activa. Si. la proteina biológicamente activa consiste solo del primer dominio y un segundo dominio, el orden de los dominios puede, en consecuencia, ser (del término N al término C) : primer dominio (secuencia de aminoácidos que tiene y/o media una actividad biológica) - segundo dominio (polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) ) . Viceversa, el orden de los dominios puede ser (del término N al término C) : segundo dominio (polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) ) - primer dominio (secuencia de aminoácidos que tiene y/o media una actividad biológica) .
También se considera que más de un dominio que comprende o consiste de una secuencia de aminoácidos que tiene y/o media la actividad biológica, se utilizan en el contexto del constructo de proteina inventivo. Por ejemplo, la proteina biológicamente activa puede comprender dos "primeros dominios", es decir, dos secuencias de aminoácidos específicas que tienen y/o median una actividad biológica, por lo que esta actividad biológica puede ser la misma o una actividad diferente. Si las proteínas biológicamente activas consisten de dos de tales "primeros dominios", es decir, dos secuencias de aminoácidos específicas que tienen y/o median una actividad biológica, y un "segundo dominio" (que comprende el polipéptido biosintético de espira aleatoria (o segmento del mismo) , el orden de los dominios puede ser (del término N al término C) : primer dominio (secuencia de aminoácidos que tiene y/o media actividad biológica especifica) - segundo dominio (polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) ) - primer dominio (secuencia de aminoácidos que tiene y/o media una actividad biológica específica (opcionalmente diferente)).
Las mismas explicaciones se aplican en los casos en donde la proteína biológicamente activa comprende más de un "segundo dominio" (es decir, la proteína biológicamente activa comprende más de un polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) . Si la proteina biológicamente activa consiste de dos de tales "segundos dominios", es decir, dos dominios que comprenden el polipéptido biosintético de espira aleatoria (o segmento del mismo) , y un "primer dominio" (que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene y/o media una actividad biológica) , el orden del dominio puede ser (del término N al término C) : segundo dominio (polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) ) - primer dominio (secuencia de aminoácidos que tiene y/o media una actividad biológica específica) - segundo dominio (polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) ) . Si la proteína biológicamente activa comprende más de un "segundo dominio", se considera en la presente que estos "segundos dominios" puedan ser idénticos o puedan ser diferentes.
Como se mencionó, anteriormente, la proteina biológicamente activa puede comprender más de un "primer dominio", es decir, más de una secuencia de aminoácidos especifica que tiene y/o media una actividad biológica y más de un "segundo dominio" (polipéptido biosintético de espira aleatoria (o segmento del mismo) ) , por lo que estos "primeros dominios", pueden ser idénticos o diferentes y/o, por lo que los "segundos dominios" pueden ser idénticos o diferentes. En tales casos, lo siguientes ordenes de los dominios ejemplares, son concebibles (del término N al término C) : primer dominio (secuencia de aminoácidos que tiene y/o media una actividad biológica específica) - segundo dominio (polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) ) - primer dominio (secuencia de aminoácidos que tiene y/o media una actividad biológica especifica) - segundo dominio (polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) ) ; segundo dominio (polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) ) - primer dominio (secuencia de aminoácidos que tiene y/o media una actividad biológica especifica) - primer dominio (secuencia de aminoácidos que tiene y/o media una actividad biológica especifica) - segundo dominio (polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) ) ; primer dominio (secuencia de aminoácidos que tiene y/o media una actividad biológica especifica) - segundo dominio (polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) ) - segundo dominio (polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) ) - primer dominio (secuencia de aminoácidos que tiene y/o media una actividad biológica especifica) ; segundo dominio (polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) ) - primer dominio (secuencia de aminoácidos que tiene y/o media una actividad biológica especifica) - segundo dominio (polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) ) - primer dominio (secuencia de aminoácidos que tiene y/o media una actividad biológica especifica) ; segundo dominio (polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) ) - segundo dominio (polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) ) primer dominio (secuencia de aminoácidos que tiene y/o media una actividad biológica especifica) - primer dominio (secuencia de aminoácidos que tiene y/o media una actividad biológica especifica) ; o primer dominio (secuencia de aminoácidos que tiene y/o media una actividad biológica especifica) - primer dominio' (secuencia de aminoácidos que tiene y/o media una actividad biológica especifica) - segundo dominio (polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) ) -segundo dominio (polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) ) .
Para una persona con experiencia en la técnica, los órdenes de los dominios correspondientes adicionales (en particular, · en los casos en donde más de dos "primeros dominios" o más de dos "segundos dominios", están comprendidos en la proteina biológicamente activa) , son fácilmente concebibles.
Como con todas las modalidades del presente polipéptido/proteina biológicamente activa inventivos, los dominios que comprenden una secuencia de aminoácidos que tienen y/o median la actividad biológica, también pueden ser un fragmento biológicamente activo de una proteina dada, con una función biológica deseada. Por lo tanto, el "segundo dominio" definido en la presente (de manera preferida, que comprende el polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) proporcionado en la presente) , también puede localizarse entre dos fragmentos biológicamente activos de una proteina de interés o entre fragmentos biológicamente activos de dos proteínas de interés. Todas las explicaciones y definiciones proporcionadas en la presente anteriormente en el contexto de proteínas/polipéptidos de "longitud completa" de interés (es decir, cunado las secuencias de aminoácidos tienen/median una cierta actividad biológica por si mismas) se aplican, mutatis mutandis, en el contexto de tales fragmentos .
Nuevamente la invención anterior no está limitada a los constructos que comprenden un "dominio" con una "función biológica activa". Los constructos de la presente invención también pueden comprender dominios con otras funciones, y no están limitados a actividades biológicas. Éstas son simplemente modalidades de la presente invención, y es evidente para la persona con experiencia, que otros constructos pueden hacerse y utilizarse fácilmente sin apartarse de lo esencial de la presente invención. En consecuencia, lo dicho en la presente en el contexto de la "secuencia de aminoácidos que tiene y/o media una actividad biológica específica" se aplica, mutatis mutandis, a otros constructos, por ejemplo, constructos a ser utilizados en otros campos técnicos, como en cosméticos, procesamiento de alimentos, productos lácteos, producción de papel, etc. como se mencionó aquí anteriormente, los polipéptidos/polímeros biosintéticos de la presente invención, también pueden utilizarse para enlazarse con, por ejemplo, moléculas pequeñas y lo similar.
Nuevamente, tiene que indicarse que el término "secuencia de aminoácidos que tiene y/o media una primera actividad biológica", no está limitado a los polipéptidos de longitud completa que tienen y/o median la actividad o función biológica, sino también a los fragmentos biológica y/o farmacológicamente activos de los mismos. Especialmente, pero no únicamente, en un contexto en donde dos o más "primeros dominios" como se definió en la presente, están comprendidos en la "proteína biológicamente activa" inventiva, también se considera que estos "primeros dominios" estén o representen diferentes partes de un complejo de proteínas o fragmentos de tales partes del complejo de proteínas .
Como se ejemplifica en la presente a continuación, las proteínas biológicamente activas de la invención, que están modificadas para comprender un polipéptido de espira aleatoria, exhiben de manera sorprendente una estabilidad incrementada in vivo y/o in vitro, cuando se comparan con las proteínas biológicamente activas no modificadas, que carecen del dominio de espira aleatoria. Como se utiliza en la presente, el término "estabilidad in vivo", se relaciona con la capacidad de una sustancia específica que se administra al cuerpo viviente, para permanecer biológicamente disponible y biológicamente activa. In vivo, una sustancia puede eliminarse y/o inactivarse debido a la excreción, filtración renal, captación hepática, agregación, degradación y/u otros procesos metabólicos. En consecuencia, en el contexto de la presente invención, las proteínas biológicamente activas que tienen una estabilidad incrementada in vivo, pueden excretarse menos rápidamente a través de los ríñones (orina) o vía las heces y/o pueden, ser más estables contra la. proteólisis, en particular contra la proteólisis in vivo en los fluidos biológicos, como la sangre, líquido cerebroespinal, fluido peritoneal y linfa. En una modalidad, la estabilidad incrementada in vivo de una proteína biológicamente activa, se manifiesta en una vida media en el plasma prolongada de la proteína biológicamente activa. En particular, la estabilidad incrementada in vivo de la proteína biológicamente activa, es una vida media en el plasma prolongada de la proteína biológicamente activa que comprende el segundo dominio, cuando se compara con la proteina biológicamente activa que carece del segundo dominio .
Los métodos para medir la estabilidad in vivo de las proteínas biológicamente activas son conocidos en la técnica. Como se ejemplifica aquí a continuación, las proteínas biológicamente activas pueden detectarse de manera específica en el plasma sanguíneo utilizando técnicas de transferencia Western o inmunoanálisis enlazado a enzimas (ELISA) . Incluso, la persona con experiencia en la técnica está consciente de que otros métodos pueden emplearse para medir de manera específica la vida media en el plasma de una proteína de interés. Tales métodos incluyen, de manera no exclusiva, la detección física de una proteína marcada radiactivamente de interés. Los métodos para el marcado radioactivo de proteínas, por ejemplo, mediante radioyodación se conocen en la técnica.
El término "estabilidad incrementada in vitro" , como se utiliza en la presente, se relaciona con la capacidad de una proteína biológicamente activa para resistir la degradación y/o agregación y mantener su actividad biológica original en un medio in vitro. Los métodos para medir la actividad biológica de las proteínas biológicamente activas son conocidos en la técnica.
Además, se proporciona un conjugado de un fármaco que comprende el polipéptido o el segmento del polipéptido de espira aleatoria descrito y definido en la presente, y un fármaco de molécula pequeña que está conjugado al polipéptido o el segmento del polipéptido de espira aleatoria. Los ejemplos no limitantes de las moléculas pequeñas son digoxigenina, fluoresceína doxorrubicina, caliqueamicina, camptotecina, fumagilina, dexametasona, geldanamicina, paclitaxel, docetaxel, irinotecano, ciclosporina, buprenorfina, naltrexona, naloxona, vindesina, vancomicina, risperidona, aripiprazol, palonosetron, granisetron, citarabina, NX1838, leuprólido, goserelina, buserelina, octréotido, teduglútido, cilengitida, abarelix, enfuvirtida, grelina y derivados, tubulisinas, derivados de platino, inhibidores de la alfa 4 integrina, ácidos nucleicos antisentido, ARN de interferencia pequeños, micro ARN, esteroides, aptámeros de ADN o ARN, péptidos, peptidomiméticos . En general, la presente invención también se relaciona con constructos de un fármaco que comprenden el polipéptido o el segmento del polipéptido de espira aleatoria definido en la presente, y en particular, moléculas farmacéutica o médicamente útiles, como moléculas pequeñas, péptidos o biomacromoléculas tales como proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, vesículas de lípidos y lo similar. En la parte experimental ilustrativa anexa, (véase, por ejemplo, el Ejemplo 22), la generación exitosa de constructos/conjugados de la presente invención se proporciona, también los constructos en donde las "moléculas químicas pequeñas" se han conjugado al polipéptido de espira aleatoria descrito en la presente. Por lo tanto, las presentes Figuras e información experimental en las leyendas de la figura correspondiente, proporcionan ejemplos ilustrativos, en donde los conjugados de un fármaco descritos en la presente comprenden, (i) un polipéptido o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina, en donde la secuencia de aminoácidos consiste de al menos 50 residuos de aminoácidos de prolina (Pro) y alanina (Ala) , y (ii) una molécula pequeña que es, como ilustración, seleccionada de digoxigenina y fluoresceína . Debe notarse que estos no son los únicos ejemplos académicos. La fluoresceína o los derivados de fluoresceína son utilizados comúnmente como diagnóstico, y las soluciones de fluoresceína médica se venden bajo los nombres comerciales Fluoescite®, AK-FLUOR® o Fluress®. Tales compuestos pueden beneficiarse ciertamente de los medios y métodos proporcionados en la presente. La digoxigenina forma la parte del esteroide de la digoxina, un metabolito de plantas secundario bien conocido, con función cardioactiya que contiene además tres azúcares de digitoxosa. La digoxina, y en menor grado el compuesto estrechamente relacionado de digitoxina, son ampliamente utilizados para el tratamiento de las taquiarritmias ventriculares y la falla cardiaca congestiva (Hauptman (1999) Circulation 99: 1265-1270). Todos los esteroides cardioactivos son inhibidores potentes y altamente específicos de la Na+/K+-ATPasa localizada en la membrana del plasma celular, ejerciendo por lo tanto efectos simpatolíticos o inotrópicos positivos.
Las definiciones y explicaciones proporcionadas aquí anteriormente, en el contexto del polipéptido o el segmento del polipéptido de espira aleatoria del mismo, se aplican, mutatis mutandis, en el contexto del conjugado de un fármaco que comprende el polipéptido de espira aleatoria (o el segmento del polipéptido del mismo) , y un fármaco seleccionado del grupo que consiste de (a) una proteína o un polipéptido biológicamente activo, que comprende o que es una secuencia de aminoácidos que tiene o media una actividad biológica y (b) un fármaco de molécula pequeña.
El polímero de aminoácidos que forma la conformación de espira aleatoria/el polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) , como se define y proporciona en la presente, puede conjugarse a una molécula pequeña/fármaco de molécula pequeña. Por este medio, la vida media en el plasma y/o la solubilidad de la molécula pequeña/fármaco de molécula pequeña puede incrementarse, la toxicidad no específica puede disminuirse, y la exposición prolongada del fármaco activo a las células o estructuras objetivo en el cuerpo, puede resultar en una farmacodinámica mej orada .
Una conjugación específica del sitio del término N del polipéptido de espira aleatoria con un derivado de un fármaco activado, por ejemplo, como el derivado del éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) (Hermanson (1996) Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, CA) , es posible. Generalmente, el grupo amino N terminal puede acoplarse químicamente con una amplia variedad de grupos funcionales, tales como aldehidos y cetonas (para formar bases de Schiff, que pueden reducirse a aminas utilizando borohidruro de sodio o cianoborohidruro de sodio, por ejemplo) , o a derivados de ácido carbónico activados (anhídridos, cloruros, ésteres y lo similar, para formar amidas), o a otros compuestos químicos reactivos, tales como isocianatos, isotiocianatos, cloruros de sulfonilo, etc. También, el término N del polimero/polipéptido de aminoácidos puede modificarse primero con un grupo protector adecuado, por ejemplo, un grupo acetilo, un grupo BOC o un grupo FMOC (Jakubke (1996) Peptide. Spektrum Akdemischer Verlag, Heidelberg, Alemania). Además, el término amino puede protegerse mediante un grupo piroglutamilo, que puede formar un residuo de aminoácido de Gln codificado que precede al péptido o segmento del polipéptido de Pro/Ala. Después de la activación del grupo carboxilato C terminal, por ejemplo, utilizando los reactivos comunes EDC (N- ( 3-dimetilaminopropil ) -N' -etilcarbodiimida ) y NHS, el acoplamiento específico del sitio al término C del polipéptido de espira aleatoria protegido, puede lograrse si el fármaco porta un grupo amino libre, por ejemplo.
De manera alterna, el término N o el término C del polímero de aminoácidos que forma la conformación de espira aleatoria/el polipéptido de espira aleatoria, puede modificarse con un reactivo enlazante comercialmente disponible, proporcionando un grupo maleimida, permitiendo así el acoplamiento químico a un grupo tiol como parte de la molécula del fármaco. De esta manera, los conjugados de un fármaco uniformes pueden obtenerse fácilmente. Las técnicas similares, que son bien conocidas en la técnica (Hermanson (1996) loe. cit.), pueden utilizarse para acoplar el polipéptido de espira aleatoria a un péptido, o incluso a un fármaco de proteina. Tales péptidos o proteínas pueden prepararse fácilmente, portando una cadena lateral de Lys o Cys, que permite su acoplamiento in vitro al polímero de aminoácidos que forma la conformación de espira aleatoria vía un éster de NHS o grupos activos de maleimida. Generalmente, los conjugados de un fármaco similares pueden prepararse con proteínas de fusión que comprenden el polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) . Incluso, y como se ilustra en los Ejemplos y Figuras anexos, la presente invención también proporciona la preparación polipéptidos de espira aleatoria o segmentos de polipéptidos de espira aleatoria, comprendidos en los conjugados innovadores de la presente invención .
Como una alternativa a la conjugación específica del sitio único, el polipéptido de espira aleatoria puede equiparse con cadenas laterales adicionales, en el término N o C o internamente, adecuadas para la modificación química, tales como residuos de lisina con sus grupos e-amino, residuos de cisteína con sus grupos tiol, o incluso aminoácidos no naturales, permitiendo la conjugación de múltiples moléculas pequeñas utilizando, por ejemplo, éster de NHS o grupos activos de maleimida.
Aparte de la conjugación estable, un profármaco puede enlazarse de manera transitoria al polipéptido de espira aleatoria. El enlace puede diseñarse para ser escindido in vivo, de una manera predecible, ya sea vía un mecanismo enzimático o mediante la hidrólisis lenta iniciada a un pH fisiológico, de manera similar a, por ejemplo, al agente antitumoral poco soluble camptotecina que se conjugó a un polímero de PEG, logrando así una biodistribución incrementada, toxicidad disminuida, eficacia y acumulación en el tumor mejorada (Conover (1998) Cáncer Chemother Pharmacol, 42:407-414). Los ejemplos para profármacos adicionales son agentes quimioterapéuticos como docetaxel (Liu (2008) J Pharm Sci. 97:3274-3290), doxorrubicina (Veronese (2005) Bioconjugate Chem. 16: 775-784) o paclitaxel (Greenwald (2001) J Control Reléase 74:159-171).
Además, la molécula pequeña puede acoplarse a una proteína de fusión que comprende el polímero/polipéptido de aminoácidos fusionado genéticamente a un dominio de selección, por ejemplo, un fragmento de anticuerpo, resultando así en un suministro específico del fármaco de molécula pequeña. En el último caso, las inmunotoxinas pueden generarse fácilmente mediante conjugación con una molécula pequeña citotóxica, si el dominio de selección es dirigido contra un receptor de la superficie celular, que se somete a internalización, por ejemplo.
De acuerdo con lo anterior, la presente invención también se relaciona, por lo tanto, con la provisión del polipéptido o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria descrito en la presente, que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina, para el acoplamiento posterior y adicional con otros compuestos de elección. El acoplamiento posterior y/o adicional puede ser y/o puede comprender, el primer acoplamiento del polipéptido biosintético de espira aleatoria o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria con, o a otro compuesto .
En otra modalidad, la presente invención se relaciona con moléculas de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de espira aleatoria (o segmentos de los mismos) o proteínas biológicamente activas como se describe en la presente. En consecuencia, la molécula de ácidos nucleicos puede comprender una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido que tiene actividad biológica, y una secuencia de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) ... El término "molécula de ácidos nucleicos", como se utiliza en la presente, pretende incluir moléculas de ácidos nucleicos tales como moléculas de ADN y moléculas de ARN . La molécula de ácidos nucleicos puede ser de una sola hebra o de doble hebra, pero de manera preferida es un ADN de doble hebra. De manera preferida, la molécula de ácidos nucleicos puede estar comprendida en un vector.
En consecuencia, la presente invención también se relaciona con una molécula de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido o el segmento del polipéptido de espira aleatoria, comprendido en los conjugados proporcionados en la presente, como un conjugado de un fármaco definido en la presente, o una molécula de ácidos nucleicos que codifica un conjugado de proteína que comprende una proteína biológicamente activa, definida anteriormente, y que comprende, además, un polipéptido o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina, en donde la secuencia de aminoácidos consiste de al menos 50 residuos de aminoácidos de prolina (Pro) y alanina (Ala).
En una modalidad, se proporciona una molécula de ácidos nucleicos que codifica un conjugado, como un conjugado de un fármaco o un conjugado de un alimento, como se definió anteriormente, la molécula de ácidos nucleicos comprende (i) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de aminoácidos y/o líder traducida; (ii) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina, en donde la secuencia de aminoácidos consiste de al menos 50 residuos de aminoácidos de prolina (Pro) y alanina (Ala) ; (iii) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteina biológicamente activa o el polipéptido, que comprende, o que es una secuencia de aminoácidos que tiene o que media una actividad biológica o una proteina de interés, como una proteina a ser empleada en otras áreas industriales, como la industria alimenticia; y (iv) una secuencia de ácidos nucleicos que representa o es un codón de paro traduccional .
El "aminoácido y/o secuencia líder traducida" mencionado anteriormente bajo (i) puede, por ejemplo, ser la " " de inicio, es decir, una metionina derivada de un codón de inicio correspondiente, también puede comprender secuencias no traducidas de un ARNm, como la secuencia 5' hasta un codón de inicio, que comprende, por ejemplo, un. sitio de unión al ribosoma. Tal secuencia puede, sin embargo, comprender también secuencias líder y/o de señal clásicas, por ejemplo, para la secreción de una proteína expresada en el periplasma o en un medio de cultivo. Los péptidos de señal procarioticos son, por ejemplo, OmpA, MalE, PhoA, DsbA, pelB, Afa, npr, STII. Los péptidos de señal eucarióticos son, por ejemplo, la secuencia de la señal de melitina de Abejas, secuencia de la señal de la glucoproteina gp67 ácida, secuencia de la señal de la IgM de ratón, secuencia de la señal de la hGH.
Las proteínas o polipéptidos biológicamente activos que comprenden o que son una secuencia de aminoácidos que tiene o que media una actividad biológica, así como otras proteínas de interés, como una proteína a ser empleada en otras áreas industriales, se han proporcionado aquí anteriormente. Las modalidades se aplican, mutatis mutandis, a la molécula de ácidos nucleicos (parte/segmentos (iii) ) , como se ilustra aquí anteriormente.
Los codones de paro traduccionales a ser empleados en la molécula de ácidos nucleicos proporcionada en la presente, son bien conocidos en la técnica, y son, por ejemplo, codones UAA, UAG o UGA.
En una modalidad de la molécula de ácidos nucleicos proporcionada en la presente anteriormente, las partes/segmentos (ii) y (iii) de la molécula de ácidos nucleicos, están intercambiados en su posición en la molécula de ácidos nucleicos que codifica un conjugado, como un conjugado de un fármaco o un conjugado de un alimento. Tal molécula de ácidos nucleicos comprendería el siguiente orden de partes/segmentos: (i) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de aminoácidos y/o líder traducida; (ii) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteina o un polipéptido biológicamente activo que comprende o que es una secuencia de aminoácidos que tiene o que media una actividad biológica o una proteína de interés, como una proteína a ser empleada en otras áreas industriales, como la industria alimenticia; (iii) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina, en donde la secuencia de aminoácidos consiste de al menos 50 residuos de aminoácidos de prolina (Pro) y alanina (Ala) ; y (iv) una secuencia de ácidos nucleicos que representa o que es un codón de paro traduccional .
Las moléculas de ácidos nucleicos proporcionadas en la presente anteriormente, también pueden comprender, opcionalmente, entre las partes/segmentos (i) y (ii) y/o entre la partes/segmentos (ii) y (iii), una proteasa y/o un sitio de escisión química y/o un sitio de reconocimiento. Tales sitios de escisión química son bien conocidos en la técnica, y comprenden, por ejemplo, secuencias de aminoácidos específicas individuales (véase, por ejemplo, Lottspeich and Engels (Hrsg.) (2006) Bioanalytik. 2. Auflage. Spektrum Akademischer Verlag, Elsevier, München, Alemania) . Por ejemplo, el bromuro de cianógeno o el cloruro de cianógeno escinden el enlace peptídico después de un residuo de Met; la hidroxilamina escinden el enlace de asparaginilo-glicilo; el ácido fórmico escinde Asp-Pro; 2- (2' -nitrofenilsulfenil) -3-metil-3-bromoinolenina, ácido 2-yodosobenzoico o N-clorosuccinimida después de Trp; el ácido 2-nitro-5-tiocianatobenzoico después de Cys. También se considera y es posible que el residuo que precede al polipéptido o el segmento del polipéptido de Pro/Ala, puede sustituirse a Met vía mutagénesis dirigida al sitio, y la proteina de fusión resultante puede escindirse entonces mediante BrCN. De manera similar, otras secuencias de aminoácidos que comprenden un sitio de escisión, pueden introducirse en la proteina de fusión recombinante o en su ácido nucleico codificante, por medio mutagénesis dirigida al sitio.
También los sitios de reconocimiento/escisión de la proteasa útiles son conocidos en la técnica. Estos comprenden, de manera no exclusiva: tripsina, quimiotripsina , enterocinasa, proteasa del Virus de las Manchas del Tabaco (TEV) , proteasa PreScission, Proteasa HRV 3C, Proteasa SUMO, Sortasa A, granzima B, furina, trombina, factor Xa o internas autoescindibles . El factor Xa hidroliza el enlace peptídico en el extremo C terminal de la secuencia de aminoácidos IleGluGlyArg, que puede insertarse entre el compañero de fusión N terminal y el polipéptido o el segmento del polipéptido de Pro/Ala. Un método particularmente simple para lograr la escisión proteolítica, seria mediante la inserción o sustitución de una cadena lateral de Lys o Arg en el extremo N terminal del polipéptido o el segmento del polipéptido de Pro/Ala, seguido por digestión con tripsina, que no se escinde dentro del polipéptido o el segmento del polipéptido de Pro/Ala, siempre que las cadenas laterales internas de Lys o Arg se eviten. Los sitios de reconocimiento ilustrativos son, de manera no exclusiva, D-D-D-D-K (enterocinasa) , ENLYFQ (G/S) (proteasa TEV) , I-(E/D)-G-R (Factor Xa), L-E-V-L-F-Q-G-P (HRV 3C) , R-X- (K/R) -R (Furina), LPXTG (Sortasa A), L-V-P-R-G (Trombina) o I-E-X-D-X-G (Granzima B) .
Como es evidente de la descripción proporcionada anteriormente, la presente invención proporciona polipéptidos biosintéticos de espira aleatoria y segmentos de polipéptidos producidos de manera recombinante, que pueden conjugarse con las moléculas de elección, como proteínas útiles, polipéptidos o moléculas pequeñas farmacéuticamente activos, polipéptidos o moléculas pequeñas diagnósticamente útiles o, inter alia, otras proteínas o moléculas pequeñas útiles de otras áreas industriales, como la industria alimenticia o del papel o en la recuperación de petróleo. Por lo tanto, la presente invención también proporciona un ácido nucleico que codifica un polipéptido o un segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina, en donde la secuencia de aminoácidos consiste de al menos 50 residuos de aminoácidos de prolina (Pro) y alanina (Ala) , la molécula de ácidos nucleicos comprende (i) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un aminoácido y/o secuencia líder producida; (ii) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina; y (iii) una secuencia de ácidos nucleicos que representa o que es un codón de paro traduccional .
Tal molécula de ácidos nucleicos puede comprender, opcionalmente, entre (i) y (ii) una proteasa y/o un sitio de escisión química y/o un sitio de reconocimiento) .
También para esta molécula de ácido nucleico, las modalidades proporcionadas en la presente anteriormente, en el contexto de las primeras dos moléculas de ácidos nucleicos descritas (es decir, una proteasa y/o un sitio de escisión química y/o de reconocimiento) , se aplican a la presente mutatis mutandis .
Las secuencias de la señal útiles e ilustrativas a ser empleadas en el contexto de esta invención comprenden, de manera no exclusiva, secuencias procarióticas como: OmpA, MalE, PhoA, DsbA, pelB, Afa, npr, STII o secuencias eucarióticas como: secuencia de la señal de melitina de Abejas, secuencia de la señal de la glucoproteina gp67 ácida, secuencia de la señal de la IgM de ratón, secuencia de la señal de la hGH.
En particular, la molécula de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina de la presente invención, es útil en los métodos proporcionados en la presente a continuación, e ilustrados en los ejemplos y figuras anexos. Tal polipéptido de espira aleatoria o segmento del polipéptido de espira aleatoria expresado, puede aislarse de, por ejemplo, células hospederas que expresan tal polipéptido de espira aleatoria o segmento del polipéptido de espira aleatoria. Tales células hospederas pueden ser células transíectadas , por ejemplo, con un vector como se proporciona en la presente.
Por lo tanto, se considera transfectar las células con la molécula o vectores de ácidos nucleicos, como se describe en la presente. En una modalidad adicional, la presente invención se relaciona con moléculas de ácidos nucleicos que, tras la expresión, codifican el polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) , o las proteínas biológicamente activas de la invención. Aún, en una modalidad adicional, la presente invención se relaciona con moléculas de ácidos nucleicos que tras la expresión, codifican los polipéptidos descritos en la presente que, totalmente o en parte, forman/adoptan la conformación de espira aleatoria en solución acuosa o bajo condiciones fisiológicas. Las moléculas de ácidos nucleicos pueden fusionarse a secuencias de control de la expresión adecuadas conocidas en la técnica, para asegurar la transcripción y traducción apropiadas del polipéptido, asi como secuencias de la señal para asegurar la secreción celular o dirigirse a los organelos. Tales vectores pueden comprender genes adicionales, tales como genes marcadores que permiten la selección del vector en una célula hospedera adecuada y bajo las condiciones adecuadas.
De manera preferida, la molécula de ácidos nucleicos de la invención está comprendida en un vector recombinante, en el cual una molécula de ácidos nucleicos que codifica la proteína biológicamente activa descrita en la presente, está enlazada de manera operativa a secuencias control de la expresión, que permiten la expresión en células procarióticas o eucarióticas . La expresión de la molécula de ácidos nucleicos comprende la transcripción de la molécula de ácidos nucleicos en un ARNm traducible. Los elementos regulatorios que permiten la expresión en las células hospederas procarióticas comprenden, por ejemplo, los promotores PL lambda, lac, trp, tac, ara, phoA, tet o T7 en E. coli. Los posibles elementos reguladores que aseguran la expresión en las células eucarióticas , de manera preferida en células de mamífero o levadura, son bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica. Usualmente comprenden secuencias reguladoras que aseguran el inicio de la transcripción y opcionalmente señales de poli-A que afectan la terminación de la transcripción y la estabilización del transcripto. Los elementos reguladores adicionales pueden incluir mejoradores transcripcionales, así como traduccionales, y/o regiones del promotor asociadas naturalmente o heterólogas. Los ejemplos para los elementos reguladores que permiten la expresión en las células hospederas eucarióticas son los promotores A0X1 o GAL1 en levadura o los promotores CMV, SV40, RSV (virus del sarcoma de Rous) , mejorador del CMV, mejorador del SV40 o un intrón de globina- en células de mamífero y otros animales. Aparte de los elementos que son responsables del inicio de la transcripción, tales elementos reguladores también pueden comprender señales de terminación de la transcripción, tal como el sitio SV40-poli-A o el sitio tk-poli-A, corriente abajo de la región codificante.
Los métodos que son bien conocidos por aquellos con experiencia en la técnica, pueden utilizarse para construir vectores recombinantes (véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory NY y Ausubel (1989), Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY) . En este contexto, los vectores de expresión adecuados son conocidos en la técnica, tales como el vector de expresión del ADNc de Okayama-Berg pcDVl (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNAl, pcDNA3, pPICZalpha A ( Invitrogen) , o pSPORTl (GIBCO BRL) . Además, dependiendo del sistema de expresión que se utiliza, las secuencias líder capaces de dirigir el polipéptido a un compartimiento celular o secretarlo en el medio de cultivo, pueden agregarse a la secuencia codificante de la molécula de ácidos nucleicos de la invención.
La presente invención también se relaciona con vectores, particularmente plásmidos, cósmidos, virus y bacteriófagos que se emplean de manera convencional en la ingeniería genética, que comprenden una molécula de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) o la proteína biológicamente activa de la invención. De manera preferida, el vector es un vector de expresión y/o un vector de transferencia o de selección génica. Los vectores de expresión derivados de los virus, tales como retrovirus, virus de la variolovacuna, virus adenoasociados , virus del herpes o virus del papiloma bovino, pueden utilizarse para suministrar los polinucleótidos o el vector de la invención en las poblaciones celulares seleccionadas .
Los vectores que contienen las moléculas de ácidos nucleicos de la invención pueden transfectarse en la célula hospedera mediante métodos bien conocidos, que varían dependiendo del tipo de célula. En consecuencia, la invención se relaciona además con una célula que comprende una molécula de ácidos nucleicos o el vector. Tales métodos, por ejemplo, incluyen las técnicas descritas en Sambrook (1989), loe. cit. y Ausubel (1989), loe. cit. En consecuencia, la transfección o electroporación con cloruro de calcio se utiliza comúnmente para células procarióticas , mientras que el tratamiento o electroporación con fosfato de calcio puede utilizarse para otros hospederos celulares (Sambrook (1989), loe. cit.). Como una alternativa adicional, las moléculas de ácidos nucleicos y vectores de la invención pueden reconstituirse en liposomas para el suministro a las células objetivo. La molécula de ácidos nucleicos o el vector de la invención que está presente en la célula hospedera, puede inteqrarse en el qenoma de la célula hospedera o puede mantenerse extracromosomalmente . En consecuencia, la presente invención también se relaciona con una célula hospedera que comprende la molécula de ácidos nucleicos y/o el vector de esta invención. Las células hospederas par ala expresión de los polipéptidos son bien conocidas en la técnica, y comprenden células procarióticas, asi como células eucarióticas, por ejemplo, células de E. coli, células de levadura, células de invertebrados, células CHO, células CH0-K1, células HEK 293, células Hela, células de mono COS-1, células de melanoma tales como células de Bowes, células L-929 de ratón, lineas celulares 3T3 derivadas de ratones Swiss, Balb-c o NIH, lineas celulares de hámster de BHK o HaK y lo similar.
En un aspecto adicional, la presente invención comprende métodos para la preparación de los conjugados de la presente invención, asi como el polipéptido biosintético de espira aleatoria (o segmento del mismo) , o proteínas biológicamente activas proporcionados en la presente, y que comprenden cultivar la célula (hospedera) de esta invención y aislar el polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) o el conjugado o una proteína biológicamente activa del cultivo como se describió en la presente. En general, el polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) inventivo, el conjugado o la proteína biológicamente activa que comprenden un dominio de espira aleatoria, pueden producirse mediante tecnología de ADN recombinante, por ejemplo, cultivando una célula que comprende la molécula de ácidos nucleicos o los vectores descritos, que codifican la proteina biológicamente activa o el polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) inventivo, y aislar la proteína/polipéptido del cultivo. La proteína biológicamente activa o el polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) inventivos, pueden producirse en cualquier sistema de cultivo celular adecuado, incluyendo células procarióticas, por ejemplo, E. coli BL21, KS272 o J 83, o células eucarióticas , por ejemplo, Pichia pastoris, cepa de levadura X-33 o células CHO. Las líneas celulares adecuadas adicionales conocidas en la técnica, se obtienen de los depósitos de lineas celulares como la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) .
El término "procariótico" pretende incluir células bacterianas, mientras que el término "eucariótico" pretende incluir células de levadura, plantas superiores, insectos y mamíferos. Los hospederos transformados pueden cultivarse en fermentadores y cultivarse de acuerdo con técnicas conocidas en el campo, para lograr el crecimiento celular óptimo. En una modalidad adicional, la presente invención se relaciona con un proceso para la preparación de un polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) o una proteína biológicamente activa, descritos anteriormente, que comprende cultivar una célula de la invención bajo condiciones adecuadas para la expresión de la proteína biológicamente activa o el polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo), y aislar la proteina/polipéptido de la célula o el medio de cultivo.
El polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) per se de la presente invención, de manera preferida no comprende ningún grupo químicamente reactivo, excepto posiblemente, un grupo amino primario N terminal (o, en el caso de prolina, secundario) y un grupo carboxilato en el término C del polímero. Sin embargo, es evidente para la persona con experiencia, que el polipéptido biosintético de espira aleatoria/polímero proporcionado en la presente, puede comprender un grupo químicamente reactive, por ejemplo, cuando el polipéptido de espira aleatoria/polímero es parte de una "proteína de fusión"/"constructo de fusión". Como se describió también anteriormente, el polipéptido biosintético de espira aleatoria (o segmento del mismo) , puede prepararse mediante la expresión recombinante en una célula transformada de varias formas, de acuerdo con los métodos bien conocidos por la persona con experiencia en l técnica, por ejemplo: (i) expresión directa en el citoplasma con la ayuda de un residuo de Met N terminal/codón de inicio; (ii) secreción vía un péptido de la señal N terminal, por ejemplo, OmpA, PhoA (Monteilhet (1993) Gene. 1993 125:223-228), melitina (Tessier (1991) Gene 98: 177-183), interleucina 2 (Zhang (2005) J Gene Med 7: 354-365), hGH (Pecceu (1991) Gene 97 (2) : 253-258) y lo similar, seguido por una escisión intracelular que resulta en el término N maduro, tal como Ala o Pro; (iii) expresión como una proteina de fusión con otra proteina soluble, por ejemplo, proteina que se une a la maltosa en el término N y con un sitio de escisión de la proteasa intercalado (Kapust y Waugh (2000) Protein Expr. Purif. 19:312-318), seguido por la escisión de la proteasa especifica in vitro o in vivo, liberando asi el polimero/polipéptido de aminoácidos, con su término N maduro, tal como Ala o Pro. Otro compañero de fusión adecuado es la proteina SUMO, que puede escindirse por la proteasa SUMO, como se . describe en los Ejemplos 20 y 21. Los compañeros de fusión adicionales incluyen, de manera no exclusiva, glutatión-S-transferasa, tiorredoxina, un dominio que se une a la celulosa, un dominio que se une a la albúmina, una proteina fluorescente (tal como GFP) , proteina A, proteina G, una inteina y lo similar (Malhotra (2009) Methods Enzymol. 463:239-258).
Como se explicó anteriormente, los polipéptidos de espira aleatoria (o los segmentos de polipéptido) /polímeros descritos, consisten de manera predominante de residuos de alanina y prolina, mientras que la serina, treonina o asparagina, que son requeridas para la O o N glucosilación, están de manera preferida ausentes. Así, la producción del polipéptido mismo o de una proteína biológicamente activa que comprende el polipéptido de espira aleatoria (o el segmento del polipéptido del mismo) o, generalmente, una proteína de fusión que comprende el polipéptido de espira aleatoria (o el segmento del polipéptido del mismo) , de manera sorprendente, puede resultar en un producto monodisperso, de manera preferida, desprovisto de las modificaciones postraduccionales dentro de la secuencia de Pro-Ala. Esto es una ventaja para la producción de la proteína recombinante en las células eucarióticas, como las células de ovario de hámster chino (CHO) o levadura, que se eligen con frecuencia para la biosíntesis de las proteínas complejas. Por ejemplo, la levadura se ha utilizado para la producción de proteínas terapéuticas aprobadas tales como insulina, factor que estimula la colonia del granulocito-macrófago, factor de crecimiento derivado de las plaquetas o hirudina (Gerngross (2004) Nat. Biotechnol. 22:1409-1414). Las células CHO han servido para la producción de proteínas terapéuticas tales como el factor de coagulación IX, interferona ß-la, tenecteplasa (Chu (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:180-187) o gonadotropinas , en donde el glucocomponente puede influenciar de manera positiva varios aspectos como la actividad funcional, el plegado, dimerización, secreción, así como la interacción del receptor, la transducción de la señal y la depuración metabólica (Walsh (2006) Nat. Biotechnol. 2 : -12 1-1252 ) . En consecuencia, la preparación de los constructos, polipéptidos de espira aleatoria y conjugados inventivos en sistemas de expresión eucarióticos , también se describe en el contexto de la presente invención.
Con los medios y métodos proporcionados en la presente, es ahora posible fabricar y proporcionar los conjugados y moléculas descritos en la presente, que comprenden (i) un polipéptido o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina, y (ii) una molécula adicional de interés, como una proteina útil, un segmento de proteina o una molécula pequeña. La presente invención, por lo tanto, también proporciona métodos para la preparación o fabricación de tales conjugados, asi como de los polipéptidos biosintéticos de espira aleatoria y/o moléculas o conjugados que comprenden el mismo. En consecuencia, la presente invención también proporciona un método para la preparación y/o fabricación de un polipéptido de espira aleatoria o un segmento del polipéptido de espira aleatoria, comprendido en los conjugados, como conjugados de un fármaco, conjugados de alimentos, conjugados para diagnóstico y lo similar. También, se proporcionan los métodos para la preparación y/o fabricación de la proteina o conjugado biológicamente activo, que comprenden el polipéptido de espira aleatoria o el segmento del polipéptido de espira aleatoria. Además, se proporcionan los métodos para la preparación y/o fabricación y/o para la preparación y/o fabricación de un polipéptido que comprende o que es una secuencia de aminoácidos que tiene o que media una actividad biológica, y que comprende además, el polipéptido de espira aleatoria o el segmento del polipéptido de espira aleatoria. Estos métodos, en particular comprenden (como un paso) , el cultivo de la célula (hospedera) proporcionada en la presente anteriormente y (como un paso adicional) , el aislamiento del polipéptido de espira aleatoria o la proteina biológicamente activa y/o la proteina biológicamente activa y/o el conjugado del polipéptido del cultivo o de la célula. Esta espira aleatoria aislada, un polipéptido o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina, asi como el conjugado aislado, pueden procesarse adicionalmente . Por ejemplo, el polipéptido o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina, pueden enlazarse químicamente o acoplarse a una molécula de interés, como se muestra también en los ejemplos anexos. De manera adicional y como una alternativa, la molécula de interés puede conjugarse enzimáticamente, por ejemplo, vía la transglutaminasa (Besheer (2009) J Pharm Sci. 98:4420-8) u otras enzimas (Subul (2009) Org. Biomol . Chem. 7:3361-3371), al polipéptido o al segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste de residuos de aminoácidos de prolina y alanina.
El polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) y/o un conjugado de proteina que comprenden el polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) y una proteina de interés, como una proteina biológica c terapéuticamente activa o una proteina a ser utilizada en, por ejemplo, métodos de diagnóstico, puede aislarse {ínter alia) , del medio de cultivo, lisados celulares, periplasma o fracciones de la membrana celular. (Nuevamente, la presente invención no está limitada a los conjugados (proteina), que son útiles en un entorno médico o farmacéutico. Los medios y métodos proporcionados en la presente, también son de uso en otras áreas industriales, como, de manera no exclusiva, la industria de los alimentos y bebidas, la industria de nutrientes, la industria del papel, industria de biorreactivos , herramientas de investigación e industria de reactivos, industrias en donde las enzimas se van a utilizar, la industria cosmética, procesamiento del petróleo y la recuperación del petróleo, y lo similar) . El aislamiento y purificación de los polipéptidos expresados de la invención, puede realizarse por cualquier medio convencional (Scopes (1982) "Protein Purification", Springer, Nueva York, NY) , incluyendo precipitación con sulfato de amonio, purificación por afinidad, cromatografía en columna, electroforesis en gel y lo similar, y puede involucrar el uso de anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos, por ejemplo, contra una marca fusionada con la proteína biológicamente activa de la invención. Por ejemplo, la proteína puede purificarse vía la marca de Strep II utilizando cromatografía por afinidad con estreptavidina (Skerra (2000) Methods Enzymol. 326:271-304), como se describe en los ejemplos anexos. Los polipéptidos sustancialmente puros, de al menos aproximadamente 90 a 95% de homogeneidad (al nivel de la proteína) se prefieren, y 98 a 99% o más de homogeneidad es más preferido, en particular para usos/aplicaciones farmacéuticas. Dependiendo de la célula/organismo hospedero empleado en el procedimiento de producción, los polipéptidos de la presente invención pueden ser glucosilados o pueden ser no glucosilados.
La invención se relaciona además con el uso de una proteína biológicamente activa, el polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) o los conjugados, como los conjugados de un fármaco de la invención, la molécula de ácidos nucleicos de la invención, el vector de la invención o la célula (hospedera) de la invención, para la preparación de un medicamento, en donde la proteína o fármaco biológicamente activo (o cualguier otra molécula pequeña o proteína de interés) , tienen una estabilidad incrementada ín vivo y/o in vitro en comparación con una molécula de control que no comprende o que no está enlazada a un polipéptido biosintético de espira aleatoria o al segmento del polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina, en donde la secuencia de aminoácidos consiste de al menos 50 residuos de aminoácidos de prolina (Pro) y alanina (Ala) .
En aún otra modalidad, la presente invención se relaciona con un método para el tratamiento de enfermedades y/o trastornos que se benefician de una estabilidad mejorada de la proteina o fármaco biológicamente activo, que comprende administrar la proteína o el conjugado del fármaco biológicamente activo como se describe en la presente, a un mamífero en necesidad de tal tratamiento. Dependiendo de la actividad biológica de la proteína o conjugado de un fármaco inventivo, la persona con experiencia es fácilmente capaz de determinar cual enfermedad/trastorno se va a tratar con una proteína o conjugado de un fármaco biológicamente activo específico de la invención. Algunos ejemplos no limitantes se listan en la siguiente Tabla: De acuerdo con lo anterior, la proteína biológicamente activa, el polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) , el conjugado de un fármaco, el ácido nucleico, el vector o la célula pueden utilizarse para la preparación de un medicamento, que de manera preferida, tiene o confiere una estabilidad incrementada in vivo y/o in vitro, en particular para la proteína biológicamente activa y/o componente del fármaco, para el tratamiento de deficiencias hormonales o trastornos relacionados, enfermedad autoinmune, cáncer, anemia, enfermedades neovasculares, enfermedades infecciosas/inflamatorias, trombosis, infarto al miocardio, diabetes, infertilidad, enfermedad de Gaucher, hepatitis, hipoglucemia, acromegalia, deficiencia de la adenosina desaminasa, trombocitopenia, hemofilia, anemia, obesidad, enfermedad de Alzheimer, lipodistrofia, psoriasis, melanoma metastásico, osteoartritis, dislipidemia, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, asma, osteoporosis y lesión por reperfusión u otras enfermedades renales, por ejemplo. En una modalidad, la proteina biológicamente activa, el conjugado de un fármaco el ácido nucleico, el vector o la célula es para utilizarse como un medicamento, que tiene una estabilidad incrementada in vivo y/o in vitro de la proteina biológicamente activa/conjugado de un fármaco. De manera similar, la proteina biológicamente activa, el polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) , el conjugado de un fármaco, el ácido nucleico, el vector o la célula son para utilizarse en el tratamiento de deficiencias hormonales o trastornos relacionados, enfermedad autoinmune, trastornos proliferativos , como cáncer, anemia, enfermedades neovasculares, enfermedades infecciosas y/o inflamatorias, trombosis, infarto al miocardio, apoplejía, diabetes, infertilidad, disfunción peniana, enfermedad de Gaucher, enfermedad de Fabry, sarcopenia, fibrosis quística, enfermedades pulmonares obstructivas, síndrome respiratorio agudo, hepatitis, hipoglucemia, acromegalia, deficiencia de la adenosina desaminasa, trombocitopenia, hemofilia, anemia, obesidad, enfermedad de Alzheimer, lipodistrofia, psoriasis, melanoma metastásico, osteoartritis , dislipidemia, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, asma, osteoporosis y lesión por reperfusión u otras enfermedades renales, por ejemplo.
La presente invención también se relaciona con el uso de las moléculas de ácidos nucleicos, vectores, así como células transfectadas, como se proporcionan en la presente, y comprenden las moléculas de ácidos nucleicos o vectores de la presente invención en procedimientos médicos, como por ejemplo, procedimientos de terapia génica basada en células o procedimientos de terapia génica basada en ácidos nucleicos.
En una modalidad adicional, el polipéptido de espira aleatoria (o el segmento del polipéptido del mismo) , como se proporciona en la presente, la proteína/constructo de proteína biológicamente activo, heterólogo o el conjugado de un fármaco o un alimento u otros conjugados que comprenden el polipéptido biosintético de espira aleatoria (o el segmento del polipéptido del mismo) y/o la molécula de ácidos nucleicos o el vector o la célula hospedera de la presente invención), es parte de una composición. La composición puede comprender uno o más de los polipéptidos de espira aleatoria (o los segmentos de polipéptidos de los mismos) inventivos, proteínas biológicamente activas, conjugados de alimentos, conjugados de interés, conjugados de fármaco o moléculas de ácidos nucleicos, vectores y/o células hospederas que codifican y/o expresan los mismos. La composición puede, ser una composición farmacéutica, que comprende opcionalmente además, un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. En una modalidad adicional, la presente invención se relaciona con el uso de la proteína biológicamente activa, el polipéptido de espira aleatoria (o segmento del mismo) o el conjugado de un fármaco descritos en la presente, para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención, el tratamiento o alivio de enfermedades que requieren la captación de tal composición farmacéutica.
Como se mencionó aquí anteriormente, no sólo los conjugados descritos en la presente, como conjugados de fármacos o conjugados para diagnóstico y/o proteinas/constructos de proteína heterólogos, biológicamente activos (que comprenden el polipéptido o el segmento del polipéptido de espira aleatoria del mismo, inventivos), son en particular, de uso médico o farmacéutico. También, el polipéptido o el segmento del polipéptido de espira aleatoria puede, per se, emplearse en tal contexto médico, por ejemplo, como un "expansor del plasma" o como un sustituto de sangre, en el alivio, prevención y/o tratamiento de un trastorno relacionado con una cantidad de sangre o contenido de plasma sanguíneo reducido o en el alivio, prevención y/o tratamiento de un trastorno relacionado con un volumen de sangre reducido. Los trastornos que son tratados con los expansores del plasma son de manera no exclusiva, trastornos afiliados con la pérdida de sangre, como lesiones, cirugías, quemaduras, traumas o emergencias abdominales, infecciones, deshidrataciones, etc. Incluso, tal uso médico no está limitado al polipéptido o el segmento del polipéptido de espira aleatoria de esta invención, sino que también puede extenderse a ciertos conjugados de fármacos descritos en la presente, o incluso a ciertas proteínas/constructos de proteínas heterólogos, biológicamente activos.
En una modalidad, la composición como se describe en la presente puede ser una. composición de diagnóstico, por ejemplo, un reactivo para la formación de imágenes, que comprende opcionalmente además, medios adecuados para la detección, en donde la composición de diagnóstico tiene una estabilidad incrementada in vivo y/o in vitro.
Las composiciones de la invención pueden estar en forma sólida o líquida, y pueden estar, ínter alia, en forma de polvos, tabletas, soluciones o aerosoles. Además, se considera que el medicamento de la invención pueda comprender agentes biológicamente activos adicionales, dependiendo del uso pretendido de la composición farmacéutica.
La administración de las composiciones adecuadas (farmacéuticas) puede efectuarse por diferentes formas, por ejemplo, mediante administración parénteral, subcutánea, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal , tópica, intrabronquial, intrapulmonar e intranasal, y si se desea para el tratamiento local, administración intralesional . Las administraciones parenterales incluyen la administración intraperitoneal, intramuscular, intradérmica, subcutánea, intravenosa o intraarterial. Las composiciones de la invención también pueden administrarse directamente en el sitio objetivo, por ejemplo, mediante suministro biolístico a un sitio objetivo externo o interno, como un órgano afectado de manera especifica.
Los ejemplos de portadores, excipientes y/o diluyentes farmacéuticos adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen soluciones salinas amortiguadas con fosfato u otras soluciones amortiguadoras, agua, emulsiones, tales como emulsiones aceite/agua, varios tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc. Las composiciones que comprende tales portadores pueden formularse mediante métodos convencionales bien conocidos. Los portadores adecuados pueden comprender cualquier material que cuando se combina con la proteina biológicamente activa/conjugado de un fármaco de la invención, retiene su actividad biológica y/o farmacéutica (véase Remington' s Pharmaceutical Sciences (1980) 16a edición, Osol, A. Ed, ack Publishing Company, Easton, PA) . Las preparaciones para la administración parenteral pueden incluir soluciones acuosas o no acuosas, suspensiones y emulsiones estériles. Los amortiguadores, solventes y/o excipientes empleados en el contexto de la composición farmacéutica, son de manera preferida "fisiológicos" como se definió en la presente anteriormente. Los ejemplos de solventes no acuosos son propilen glicol, polietilen glicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo solución salina y medio amortiguado. Los vehículos parenterales pueden incluir solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, lactato de Ringer o aceites fijos. Los vehículos intravenosos pueden incluir reabastecedores de fluidos y nutrientes, reabastecedores de electrolitos (tales como aquéllos basados en la dextrosa de Ringer), y lo similar. Los conservadores y otros aditivos también pueden estar presentes, incluyendo agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes y/o gases inertes y lo similar. Además, una composición farmacéutica de la presente invención puede comprender portadores proteináceos, como por ejemplo, seroalbúmina o inmunoglobulina, de manera preferida de origen humano.
Estas composiciones farmacéuticas pueden administrarse al sujeto en una dosis adecuada. El régimen de dosificación se determinará por el médico tratante y los factores clínicos. Como es bien conocido en el campo médico, las dosificaciones para cualquier paciente, dependen de muchos factores, incluyendo la talla del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto particular a ser administrado, el sexo, el tiempo y la ruta de administración, la salud general y otros fármacos que se estén administrando de manera concurrente. La materia farmacéuticamente activa puede estar presente en cantidades entre 1 pg y 20 mg/kg de peso corporal por dosis, por ejemplo, entre 0.1 mg a 10 mg/kg de peso corporal, por ejemplo, entre 0.5 mg a 5 mg/kg de peso corporal. Si el régimen es una infusión continua, deberá estar también en el intervalo de 1 pg a 10 mg por kilogramo de peso corporal por minuto. Incluso, dosis por debajo o por encima de los intervalos ejemplares indicados, también están considerados, especialmente considerando los factores mencionados anteriormente.
Además, se considera que la composición farmacéutica de la invención pueda comprender agentes biológica o farmacéuticamente activos adicionales, dependiendo del uso pretendido de la composición 15 farmacéutica. Estos agentes biológica o farmacéuticamente activos adicionales pueden ser, por ejemplo, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, hormonas, factores de crecimiento, enzimas, moléculas de unión, citocinas, quimiocinas, moléculas de ácidos nucleicos y fármacos.
Debe notarse que la presente invención no está limitada a composiciones farmacéuticas. También las composiciones a ser utilizadas en investigación o como diagnóstico están consideradas. Por ejemplo, se considera que las proteínas o conjugados de un fármaco biológicamente activos, que comprenden un dominio o componente de espira aleatoria como se define en la presente, se utilicen en un entorno de diagnóstico. Para tal propósito, la proteina o conjugado de un fármaco biológicamente activo inventivo de esta invención, puede marcarse con el fin de permitir la detección. Tales marcas comprenden, de manera no exclusiva, marcas radiactivas (como [3H] hidrógeno [125I]yodo o [123I]yodo), marcas fluorescentes (incluyendo proteínas fluorescentes, como proteína fluorescente verde (GFP) o fluoróforos, como isotiocianato de fluoresceína (FITC) ) o marcas de R N (como quelatos de gadolinio) . Las marcas o marcadores definidos en la presente, de ninguna manera son limitantes y simplemente representan los ejemplos ilustrativos. Las composiciones de diagnóstico de esta invención son particularmente útiles en experimentos de rastreo o formación de imágenes o en un entorno médico de diagnóstico. En los Ejemplos y Figuras anexos, la preparación de un constructo correspondiente se proporciona, que comprende los conjugados que comprenden (i) un polipéptido o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria que comprende una secuencia de aminoácidos ¦ que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina, en donde la secuencia de aminoácidos consiste de al menos 50 residuos de aminoácidos de prolina (Pro) y alanina (Ala) , y (ii) fluoresceina o digoxigenina; véanse las Figuras 13 y 14 anexas, y la leyenda de la figura correspondiente, asi como el Ejemplo 22 ilustrativo.
Pero no sólo los usos farmacéuticos o de diagnóstico de los medios y métodos proporcionados en la presente, están dentro de lo esencial de la presente invención. los compuestos/conjugados proporcionados en la presente, también son útiles en ciertas otras áreas industriales, como en la industria alimenticia, la industria de las bebidas, la industria de los cosméticos, la industria del petróleo, la industria del papel y lo similar. Por lo tanto, la presente invención también proporciona usos del polipéptido biosintético de espira aleatoria proporcionado en la presente en tales áreas industriales. También parte de esta invención es, en consecuencia, un método para la producción de un cosmético, de un compuesto a ser utilizado en tratamientos cosméticos, de un alimento o de una bebida, el método comprende el cultivo de la célula que comprende una molécula de ácidos nucleicos (o un vector) que codifica un polipéptido de espira aleatoria como se define en la presente, o que codifica una proteina biológicamente activa y/o una proteina y/o un polipéptido biológicamente activo, que comprende o que es una secuencia de aminoácidos que tiene o que media una actividad. Tal método también incluye el aislamiento del polipéptido de espira aleatoria, la proteina biológicamente activa y/o la proteina o el polipéptido biológicamente activo, que comprende o que es una secuencia de aminoácidos que tiene o que media una actividad, como una actividad biológica, y que comprende adicionalmente el polipéptido de espira aleatoria o el segmento del polipéptido de espira aleatoria del cultivo o de la célula. En el mismo contexto, pueden producirse otros conjugados de interés, por ejemplo, conjugados que son útiles en diferentes áreas de la industria, como en la industrial del petróleo o el papel. La persona con experiencia en la técnica está fácilmente en una posición de adaptar los medios y métodos proporcionados en la presente, para la generación de constructos moleculares/recombinantes correspondientes, asi como para la generación de conjugados que comprenden un polipéptido o un segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina, en donde la secuencia de aminoácidos consiste de al menos 50 residuos de aminoácidos de prolina (Pro) y alanina (Ala), y una molécula pequeña o un polipéptido de interés.
En aún otra modalidad, la presente invención proporciona un equipo que comprende el polipéptido de espira aleatoria (o el segmento del polipéptido del mismo) , la proteina biológicamente activa, el conjugado de un fármaco, la molécula de ácidos nucleicos que codifica la proteina biológicamente activa que codifica la proteina biológicamente activa y/o que codifica la proteína biológicamente activa y/o que codifica . el polipéptido que comprende o que es una secuencia de aminoácidos que tiene o que media una actividad (por ejemplo, una actividad biológica) , el vector que comprende la molécula de ácidos nucleicos o la célula que comprende el ácido nucleico o el vector, como se describe en. la presente. El equipo de la presente invención puede comprender además, amortiguadores, soluciones de almacenamiento y/o reactivos o materiales adicionales, requeridos para realizar ensayos y propósitos médicos, científicos o de diagnóstico. Además, las partes del equipo de la invención pueden empacarse de manera individual en viales o botellas, o en combinación en recipientes o unidades con múltiples recipientes.
El equipo de la presente invención puede utilizarse de manera ventajosa, inter alia, para llevar a cabo el método de la invención, y podría emplearse en una variedad de aplicaciones referidas en la presente, por ejemplo, como equipos de diagnóstico, como herramientas de investigación o como herramientas médicas. Además, el equipo de la invención puede contener medios para la detección adecuada para propósitos científicos, médicos y/o de diagnóstico. La fabricación de los equipos, de manera preferida, sigue los procedimientos estándar que son conocidos por la persona con experiencia en la técnica.
La invención se ilustra adicionalmente por las siguientes Figuras y Ejemplos no limitantes.
Figura 1. Diseño génico para el polímero/secuencia del polipéptido de Pro/Ala PA#1.
Secuencia nucleotídica y de aminoácidos codificada de un bloque de construcción para PA#1 (SEQ ID NO: 1) obtenida mediante la hibridación de dos oligodesoxinucleótidos complementarios (oligodesoxinucleótido de hebra superior/codificante SEQ ID NO: 17, oligodesoxinucleótido de hebra inferior/no codificante SEQ ID NO: 18). El ácido nucleico resultante tiene dos extremos adhesivos (mostrados en letras minúsculas) , que corresponden a un codón y un anticodón de Ala, respectivamente, y son mutualmente compatibles. Tras la ligadura repetida de tal bloque de construcción, pueden obtenerse concatámeros que codifican los polipéptidos de Pro-Ala de longitudes variables, y clonarse posteriormente, por ejemplo, via (a) un sitio de restricción SapI .
Figura 2. Estrategias de clonación para el polímero/secuencia de polipéptido de Pro/Ala como la fusión a un fragmento Fab o a un IFNa2b humano .
(A) Tramos de la secuencia nucleotídica y de aminoácidos codificada (hebra superior/codificante SEQ ID NO: 19, hebra inferior/no codificante SEQ ID NO: 20, secuencia de aminoácidos codificada SEQ ID NO: 21), alrededor del término C de la cadena ligera de la inmunoglobulina de un fragmento Fab de anticuerpo codificado por pASK88-Fab-2xSapI (SEQ ID NO: 22), un derivado de pASK75, utilizado para subclonar el polímero/secuencias de polipéptido de Pro/Ala y la expresión de las proteínas biológicamente activas correspondientes. La secuencia nucleotídica porta dos sitios de reconocimiento SapI en una orientación mutuamente inversa, que conduce, tras la digestión, a extremos de ADN sobresalientes que son compatibles con el cásete génico sintético mostrado en la Figura 1. Las secuencias de reconocimiento y los aminoácidos C terminales de la cadena ligera están subrayados.
(B) Secuencia nucleotídica y secuencia de aminoácidos codificada (hebra superior/codificante SEQ ID NO: 23, hebra inferior/no codificante SEQ ID NO: 24, secuencia de aminoácidos codificada SEQ ID NO: 25) de un polimero/polipéptido de PA#1 con 20 residuos, después de la inserción de un solo cásete, como se muestra en la Figura 1, en el plásmido pASK88-Fab-2xSapI . La ligadura/inserción similar de 10 de tales casetes repetidos, resultó en el vector del plásmido pFab-PA#l (200) (SEQ ID NO: 28), gue codifica un polimero/polipéptido con 200 residuos (SEQ ID NO: 26 y 27). Los sitios de restricción SapI que flanquean la secuencia que codifica el polímero de Pro/Ala están marcados (las secuencias de reconocimiento están subrayadas) .
(C) Mapa del plásmido de pFab-PA#l ( 200 ) (SEQ ID NO: 28) . Los genes estructurales para la cadena pesada (HC) y la cadena ligera (LC) de Fab-PA#1 ( 200 ) , están bajo el control transcripcional del promotor/operador de la tetraciclina (tetp°) , y los extremos del operón con el terminador de la lipoproteína (tipp) . La HC comprende el péptido de la señal de OmpA bacteriano, el dominio variable (VH) . y el primer dominio constante C (CH) de cadena pesada de la IgGl humana, así como la marca HÍSÉ. LC comprende el péptido de la señal de PhoA bacteriano, el dominio variable (VL) y constante de cadena ligera (CL) humano, el polimero/polipéptido de PA#1 con 200 residuos. La cadena principal del plásmido de pFab-PA#l (200) fuera del cásete de expresión flanqueado por los sitios de restricción Xbal y 1 HindIII, es idéntico a aquél del vector de clonación y expresión genérica pASK75 (Skerra (1994) Gene 151:131-135). Los sitios de restricción singulares están indicados.
(D) Tramo de la secuencia nucleotidica de aminoácidos (hebra superior/codificante SEQ ID NO: 29, hebra inferior/no codificante SEQ ID NO: 30, secuencia de aminoácidos codificada SEQ ID NO: 31) alrededor del término N del IFNa2b humano, clonado en pASK-IFNa2b (SEQ ID NO: 32) . El sitio de restricción único SapI que puede utilizarse para la inserción de la secuencia que codifica el polímero de Pro/Ala está marcado (la secuencia de reconocimiento está subrayada) . Los dos aminoácidos C terminales de la marca de Strep-II están subrayados. El primer aminoácido del IFNa2b maduro está marcado con +1.
(E) Tramo de la secuencia nucleotidica y de aminoácidos codificada (hebra superior/codificante SEQ ID NO: 33, hebra inferior/no codificante SEQ ID NO: 34, secuencia de aminoácidos codificada SEQ ID NO: 35) del término N del IFNa2b después de la inserción de un cásete de la secuencia de un polímero PA#1 como se muestra en la Figura 1. El sitio de restricción único SapI, que permanece después de la inserción de la secuencia que codifica el polímero de Pro/Ala, está marcado (las secuencias de reconocimiento están subrayadas) . El primer aminoácido de IFNa2b como parte de la proteína de fusión está marcado (1) y los dos aminoácidos C terminales de la marca de Strep-II están subrayados. La ligadura/inserción similar de 10 casetes de la secuencia del polímero PA#1 repetidos, resultó en el vector del plásmido pPA#l (200 ) -IFNa2b, que codifica un polímero/polipéptido con 200 residuos (SEQ ID NO: 36) .
(F) Mapa del plásmido de pPA#l (200) -IFNa2b (SEQ ID NO: 37) . El gen estructural para la proteína biológicamente activa PA#1 (200) -IFNa2b (que comprende el péptido de la señal de OmpA bacteriano, la marca de Strep-II, el segmento de polímero/polipéptido PA#1 con 200 residuos, y IFNa2b humano) , está bajo el control transcripcional del promotor/operador de la tetraciclina (tetp/o) y termina con el terminado de la lipoproteína (tipp) . La cadena principal del plásmido fuera, del cásete de expresión flanqueada por los sitios de restricción Xbal y HindIII, es idéntica a aquélla del vector-de clonación y expresión genérica pASK75 (Skerra (1994) loe. cit.). Los sitios de restricción singulares están indicados.
Figura 3. Análisis del fragmento Fab recombinante purificado y el IFNa2b recombinante purificado, asi como sus fusiones del polipéptido/polimero de Pro/Ala mediante SDS-PAGE.
Las proteínas recombinantes se produjeron en E. coli KS272 (Strauch (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:1576-80), vía la secreción periplásmica y se purificaron por medio de la marca His6 (Fab) o la marca Strep-II (IFNa2b) utilizando cromatografía por afinidad con metal inmovilizado o estreptavidina, respectivamente.
(A) Análisis de Fab recombinante purificado y su fusión de PA#1 con 200 residuos mediante SDS-PAGE al 12%. El gel indicó muestras de 2 g de proteína cada una de Fab y Fab-PA#1 (200 ) . Las muestras a la izquierda se redujeron con 2-mercaptoetanol, mientras que las muestras repetidas a la derecha se dejaron sin reducir. Los tamaños de los marcadores de la proteína, aplicados bajo condiciones reductoras, están indicados en el margen izquierdo. Tras la reducción del puente de disulfuro intercadena, el fragmento Fab y su fusión de PA#1 de 200 residuos, aparecen como dos bandas homogéneas. En el caso del fragmento Fab reducido, las dos bandas con tamaños moleculares de aproximadamente 24 y 26 kDa, respectivamente, corresponden a LC y HC separados. En el caso de la proteína de fusión Fab-PA#1 (200 ) reducida, la banda de 24 kDa corresponde a HC, mientras que la banda a aproximadamente 90 kDa, corresponde a LC fusionado con el segmento del polipéptido PA#1(200). Bajo condiciones no reductoras, el fragmento Fab y su fusión de PA#1(200), aparecen como bandas homogéneas únicas con tamaños moleculares aparentes de aproximadamente 45 kDa y 100 kDa, respectivamente. Los dos valores del tamaño aparentes para la proteína de fusión Fab-PA#1 (200) , son significativamente mayores que las masas calculadas de 64.3 kDa para Fab-PA#1 (200) no reducido, y de 39.1 kDa para LC-PA#1(200) aislado. Este efecto es debido a la adición del polímero/segmento del polipéptido de Pro/Ala, debido a que el fragmento Fab mismo, con una masa calculada de 48.0 kDa, o su cadena ligera no fusionada, exhiben una movilidad electroforática esencialmente normal.
(B) Análisis de IFNa2b recombinante purificado y su proteina de fusión PA#1 con 200 residuos mediante SDS-PAGE al 12%. El gel indica muestras de proteina de 2 µg cada una de IFNa2b y de PA#1 (200) -IFNa2b. Las muestras a la izquierda se redujeron con 2-mercaptoetanol , mientras que las muestras correspondientes a la derecha se dejaron sin reducir. Los tamaños de los marcadores de la proteina, aplicados bajo condiciones reductoras, se indican en el margen izquierdo. Las dos proteínas aparecen como bandas homogéneas únicas, con tamaños moleculares aparentes de aproximadamente 20 kDa y aproximadamente 80 kDa en la forma reducida. El último valor es significativamente mayor que la masa calculada de 37.0 kDa para PA#1 (200) -IFNa2b. Este efecto es debido a la adición del polímero/segmento del polipéptido de Pro/Ala, debido a que el IFNa2b mismo, con una masa calculada de 20.9 kDa, exhibe esencialmente una movilidad electroforética normal. El IFNa2b en el estado no reducido, tiene una movilidad electroforética ligeramente mayor, indicando una forma más compacta como resultado de sus dos puentes de disulfuro intramoleculares .
Figura 4. Análisis cuantitativo de los volúmenes hidrodinámicos del Fab y el IFNa2b recombinantes purificados, asi como sus fusiones PA#1(200).
(A) Cromatografía con exclusión de tamaño analítica (SEC) de Fab y Fab-PA#1 (200) . 250 µ? de la proteína purificada a una concentración de 0.25 mg/ml, se aplicaron a una columna Superdex S200 10/300 GL equilibrada con amortiguador PBS. La absorción a 280 nm se verificó y el pico de cada corrida de la cromatografía se normalizó a un valor de 1. La flecha indica el volumen hueco de la columna (7.8 mi ) .
(B) Curva de calibración para los cromatogramas de (A) utilizando una columna Superdex S200 10/300 GL. El logaritmo del peso molecular (MW) de las proteínas del marcador (citocromo c, 12.4 kDa; anhidrasa carbónica, 29.0 kDa; ovalbúmina, 43.0 kDa; seroalbúmina bovina, 66.3 kDa; alcohol deshidrogenasa, 150 kDa, ß-amilasa, 200 kDa, apo-ferritina, 440 kDa), se gráfico vs . sus volúmenes de elución (círculos negros) , y se ajustó mediante una línea recta. De los varios volúmenes de elución observados del fragmento Fab y su proteína de fusión PA#1 (cuadros negros) , sus tamaños moleculares aparentes se determinaron como sigue.
Fab: 31 kDa (masa verdadera: 48.0 kDa) ; Fab-PA#1 (200) : 237 kDa (masa verdadera: 64.3 kDa). Estos datos muestran que la fusión con el polipéptido PA#1 confiere un volumen hidrodinámico muy aumentado.
(C) Cromatografía con exclusión de tamaño analítica de IFNa2b y PA#1 (200) -IFNa2b. 250 µ? de cada proteína purificada a una concentración de 0.25 mg/ml, se aplicaron a una columna Superdex S200 10/300 GL equilibrada con solución salina amortiguada con fosfato, PBS . La. absorción a 280 nm se- verificó, y el pico de cada corrida de la cromatografía se normalizó a un valor de 1. La flecha. indica el volumen hueco de la columna (7.8 mi) .
(D) Curva de calibración para el cromatograma de (C) utilizando una columna Superdex S200 10/300 GL. El logaritmo del peso molecular (MW) de las proteínas del marcador (véase B) , se gráfico vs . sus volúmenes de elución, (círculos negros), y se ajustó mediante una línea recta. De los volúmenes de elución observados del IFNa2b y su proteína de fusión PA#1 (cuadros negros) , sus tamaños moleculares aparentes se determinaron como sigue. IFNa2b: 22.5 kDa (masa verdadera: 20.9 kDa); PA#1 (200) -IFNa2b: 229.0 kDa (masa verdadera: 37.0 kDa). Estos datos muestran que la fusión con el polipéptido PA#1 confiere un volumen hidrodinámico muy aumentado .
Figura 5. Análisis experimental de la estructura secundaria de las proteínas recombinantes y sus fusiones de polimero/polipéptido de PA#1 mediante espectroscopia con dicroismo circular (CD) .
Los espectros se registraron a temperatura ambiente en K2SO4 50 mM, fosfato de K 20 mM, pH 7.5, y se normalizaron a la elipticidad molar, T?, para cada proteina.
(A) Espectro CD de Fab y Fab-PA#1 ( 200 ) recombinantes purificados. El espectro CD para el fragmento Fab muestra las características típicas de una proteína de lámina ß predominante con un máximo negativo amplio de alrededor de 216 nm (Sreerama en: Circular Dichroism -Principies and Applications (2000) Berova, Nakanishi and Woody (Eds.) Wiley, Nueva York, NY, pp. 601-620), que indica. el plegado correcto del fragmento Fab producido de manera bacteriana. El espectro de su proteína de fusión con el polimero/polipéptido de Pro/Ala, revela una banda negativa dominante por debajo de 200 nm, que es indicativa de una conformación de espira aleatoria. Además, hay un reborde a alrededor de 220 nm, que resulta de la contribución de la lámina ß del fragmento Fab e indica su plegado correcto, incluso como parte de la proteína de fusión.
(B) Espectro CD de la diferencia molar para Fab-PA#1 (200) , obtenido mediante la sustracción del espectro del fragmento Fab. El espectro CD de la diferencia representa la estructura secundaria del polimero/segmento del polipéptido de PA#1 de 200 residuos, y revela un mínimo fuerte alrededor de 200 nm, que es una indicación clara de la conformación de espira aleatoria en la solución acuosa amortiguada (Greenfield (1969) Biochemistry 8: 4108-4116; Sreerama (2000) loe. cit.; Fándrich (2002) EMBO J. 21:5682-5690) .
(C) Espectro CD del IFNa2b y PA#1 ( 200 ) -IFNa2b recombinantes purificados. El espectro CD para el IFNa2b muestra las características típicas de una proteína de hélice a predominante con dos bandas negativas alrededor de 208 nm y 220 nm (Sreerama (2000) loe. cit.), que indica el plegado correcto del IFNa2b humano producido de manera bacteriana. El espectro de su proteína de fusión con el polímero/polipéptido de Pro/Ala, revela las desviaciones características con un mínimo dominante alrededor de 200 nm, que es indicativo de la conformación de espira aleatoria. Además, hay un reborde alrededor de 220 nm, que resulta de la contribución de la hélice a del IFNa2b y que indica el plegado correcto del IFNa2b incluso como parte de la proteína de fusión.
(D) Espectro CD de la diferencia molar para PA#1 (200) -IFNa2b, obtenido mediante la sustracción del espectro para el IFNa2b. El espectro CD de la diferencia representa la estructura secundaria del polímero/segmento del polipéptido PA#1 de 200 residuos, y revela un mínimo fuerte alrededor de 200 nm, esencialmente idéntico al mostrado en (B) . Esto es nuevamente, una clara indicación de la conformación de espira aleatoria en solución acuosa amortiguada para un polímero biológico que comprende residuos de Pro y Ala de acuerdo con la invención.
Figura 6. Producción secretora de una proteina de fusión entre la hormona de crecimiento humana (hGH) y el polímero PA#1 codificado genéticamente en células CHO.
(A) Tramo de la secuencia nucleotídica y de aminoácidos (hebra superior/codificante SEQ ID NO: 38, hebra inferior/no codificante SEQ ID NO: 39, secuencia de aminoácidos codificada SEQ ID NO: 40), alrededor del término N de la hGH clonada en pASK75-His6-hGH (SEQ ID NO: 41) . Los sitios de restricción únicos Nhel, que pueden utilizarse junto con HíndIII (no mostrado) para subclonación, y SapI, que puede utilizarse para la inserción de la secuencia que codifica el polímero de Pro/Ala, están marcados (la secuencia de reconocimiento está subrayada) . Los seis aminoácidos de la marca His6 están subrayados. El primer aminoácido de la hGH está marcado con +1.
(B) Secuencia nucleotídica y de aminoácidos codificada (hebra superior/codificante SEQ ID NO: 42, hebra inferior/no codificante SEQ ID NO: 43, secuencia de aminoácidos codificada SEQ ID NO: 44) del término N de la hGH después de la inserción de un cásete de la secuencia del polímero PA#1 como se muestra en la Figura 1. Los sitios de restricción únicos Nhel , que puede utilizarse para la subclonación, y SapI, que permanece después de la inserción de la secuencia que codifica el polímero de Pro/Ala, están marcados (las secuencias de reconocimiento están subrayadas). El primer aminoácido de hGH como parte de la proteína de fusión está marcado (1), y los aminoácidos de la marca His6 están subrayados. La ligadura/inserción similar de 10 casetes de la secuencia del polímero PA#1 repetidos, resultó en el vector del plásmido pASK75-His6-PA#l (200) -hGH, que codifica la proteína de fusión madura SEQ ID NO: 45) .
(C) Mapa del plásmido de pASK75-His6-PA#l (200) -hGH (SEQ ID NO: 46) . El gen estructural para la proteína biológicamente activa His6-PA#1 (200) -hGH (que comprende el péptido de la señal de OmpA bacteriano, la marca His6, el polímero/segmento del polipéptido PA#1 con 200 residuos, y GH humana) , está bajo el control transcripcional del promotor/operador de la tetraciclina (tetp o) y termina con el terminador de la lipoproteína (tipp) . La cadena principal del plásmido fuera del cásete de expresión flanqueado por los sitios de restricción Xbal y HindIII, es idéntica a aquélla del vector de la clonación y expresión genérica pASK75 (Skerra (1994) loe. cit.). Los sitios de restricción 17 singulares están indicados.
(D) Mapa del plásmido de pCH0-PA#l (200) -hGH, que codifica una proteina de fusión His6-PA#1 (200 ) -hGH (SEQ ID NO: 47) . El gen estructural, que comprende el péptido de la señal de la hormona del crecimiento humana (Sp) , la marca His6, la secuencia del polimero/polipéptido de PA#1 con 200 residuos (PA#1(200)), la hormona del crecimiento humano (hGH) , y que contiene la señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovino (bGH pA) , está bajo el control transcripcional del promotor del citomegalovirus (CMVP) . los sitios de restricción singulares Nhel y HindIII están indicados. El gen de la resistencia para la neomicinfosfotransferasa (neo) está bajo el control del promotor SV40 (SV40P) , y es seguido por una señal de poliadenilación de SV40 (SV40 pA) . Además, el plásmido contiene el origen de replicación ColEl bacteriano (ColEl-ori) , el origen de replicación fl del bacteriófago (fl-ori) , y el gen de ß-lactamasa (bla) para permitir la propagación y selección en E. coli.
(E) Análisis de transferencia Western de una proteina de fusión entre la hGH y el polímero PA#1 codificado genéticamente de 200 residuos, producido en células CHO con la hGH recombinante . Las células CHO-K1 se transíectaron con pCHO-PA#l (200) -hGH (SEQ ID NO: 48) o con pCHO-hGH (SEQ ID NO: 49) , un plásmido similar que codifica la hGH sin la secuencia PA#1(200) (pero que también porta la marca His6) . Dos días después de la transfección, una muestra del sobrenadante del cultivo celular se sometió a SDS-PAGE y a transferencia Western con un anticuerpo anti-hGH conjugado con peroxidasa de rábano picante. Las dos proteínas aparecen como bandas únicas indicadas por flechas, con tamaños moleculares aparentes de aproximadamente 23 kDa (His6-hGH) y aproximadamente 90 kDa (His6-PA#l-hGH) . Hay también una banda débil alrededor de 60 kDa que surge de las proteínas del suero en el medio de cultivo. Mientras que la hGH marcada con His6 aparece en la masa calculada de 23.5 kDa, el tamaño molecular aparente de His6-PA#l-hGH es significativamente mayor que su masa calculada de 39.5 kDa. Este efecto es debido a la naturaleza de la espira aleatoria hidrofílica del polímero de Pro-Ala.
Figura 7. Predicción teórica de la estructura secundaria para la secuencia del polipéptido/polímero de Pro/Ala PA#1.
Esta ilustración muestra el resultado del algoritmo de computadora CHOFAS, de acuerdo con el método de Chou-Fasman (Chou y Fasman (1974) Biochemistry 13: 222-245), implementado en el servidor de la Comparación de la Secuencia y predicción de la Estructura Secundaria en la Universidad de Virginia (URL: http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2). 1 Para evitar los efectos limite en los términos amino y carboxi, la repetición de aminoácidos de 20 meros de acuerdo con la Figura 1, se pegó en tres copias consecutivas (resultando en un concatámero similar al codificado después de la ligadura/inserción repetida del cásete del gen sintético) , y solo se consideró el resultado para el bloque de la secuencia de 20 meros central (en recuadro) . En el caso de la secuencia/segmento del polipéptido PA#1 (SEQ' ID NO: 1), el algoritmo de Chou-Fasman predice una estructura secundaria de hélice a al 100%. Esto está en contraste con la conformación de espira aleatoria predominante observada experimentalmente para el polipép ido/segmento del polipéptido PA#1 como parte de una proteina de fusión (véase la Figura 5B/D) .
Figura 8 : Análisis cuantitativo de la farmacocinética del fragmento Fab recombinante purificado y sus fusiones del polímero PA#1 con 200 y 600 residuos en ratones BALB/c.
Las muestras de plasma del Ejemplo 16 se probaron para las concentraciones de Fab, Fab-PA#1 ( 200 ) y Fab-PA#1 ( 600) , utilizando un ELISA intercalado. Para estimar la vida media en el plasma de Fab, Fab-PA#1 (200) y Fab-PA#1 ( 600 ) , los valores de la concentración medida se graficaron contra el tiempo postinyección intravenosa y se 1 ajustaron numéricamente, suponiendo un decaimiento biexponencial . El fragmento Fab no fusionado, exhibió una depuración muy rápida con una vida media de eliminación de 1.3 + 0.1 horas. En contraste, la fase de eliminación determinada para Fab-PA#1 ( 200 ) y Fab-PA#1 ( 600 ) fue significativamente más lenta, con vidas medias terminales de 4.1 ± 1.8 horas y 38.8 + 11.2 horas, respectivamente, demostrando asi una circulación prolongada aproximadamente 3 veces y aproximadamente 30 veces debida a la fusión del polímero de Pro/Ala con 200 ó 600 residuos, en comparación con el fragmento Fab no fusionado.
Figura 9: Análisis del fragmento Fab recombinante purificado como la fusión con el polímero P1A1 o P1A3 que tiene 200 residuos.
Las proteínas recombinantes se produjeron en E. coli KS272 vía secreción periplásmica y se purificó por medio de la marca His6 utilizando cromatografía por afinidad con metal inmovilizado. Las proteínas purificadas se analizaron mediante SDS-PAGE al 12%. El gel indica muestras de proteína de 2 g cada uno, de Fab-P1A1 ( 200 ) y Fab-P1A3 (200 ) , así como, para comparación, del fragmento Fab no fusionado (véase la Figura 3A) . Las muestras a la izquierda se redujeron con 2-mercaptoetanol, mientras que las muestras análogas a la derecha se dejaron sin reducir. Los tamaños de los marcadores de la proteína, aplicados bajo condiciones reductoras, se indican en el margen izquierdo. Después de la reducción de los puentes de disulfuro intercadena, el fragmento Fab y sus fusiones de Pro/Ala de 200 residuos, aparecen como dos bandas homogéneas. En el caso del fragmento Fab reducido, las dos bandas con tamaños moleculares de aproximadamente 24 y 26 kDa, respectivamente, corresponden al fragmento de cadena ligera (LC) y cadena pesada (HC) separados. En el caso de la proteína de fusión Fab-P1A1 (200) reducida, la banda a 24 kDa corresponde a HC, mientras que la banda a aproximadamente 90 kDa corresponde a LC fusionado con el polipéptido P1A1(200) . En el caso de la proteína de fusión Fab-P1A3 (200) reducida, la banda a 24 kDa corresponde a HC, mientras que la banda a aproximadamente 75 kDa, corresponde a LC fusionado con el polipéptido P1A5(200).
Bajo condiciones no reductoras, el fragmento Fab, su fusión P1A1(200) y P1A3(200), aparece como bandas prominentes únicas con tamaños moleculares aparentes de aproximadamente 45 kDa, 110 kDa y 90 kDa, respectivamente. los tamaños aparentes para las proteínas de fusión Fab-P1A1 (200) y Fab-P1A3 ( 200 ) , son significativamente mayores que las masas calculadas de 65.3 kDa para Fab-P1A1 ( 200 ) no reducido, y de 64.0 kDa para Fab-P1A3 (200 ) no reducido. También, los tamaños aparentes para las cadenas ligeras reducidas correspondientes son significativamente mayores que las masas calculadas de 40.7 1 kDa para LC de P1A1(200) y de 39.4 kDa para LC de P1A3(200). Este efecto es debido a la adición del segmento de polimero/polipéptido de Pro/Ala, debido a que el fragmento Fab mismo, con una masa calculada de 48.0 kDa, o su cadena ligera no fusionada, con una masa calculada de 23.4 kDa, exhiben una movilidad electroforética esencialmente normal.
Figura 10. Análisis cuantitativo de los volúmenes hidrodinámicos de las proteínas de fusión Fab-P1A1 (200) y Fab-P1A3 (200) recombinantes purificadas.
Cromatografía con exclusión de tamaño analítica (SEC) de Fab-P1A1 (200) y Fab-P1A3 (200 ) . 250 µ? de la proteína purificada a una concentración de 0.25 mg/ml, se aplicaron a una columna Superdex S200 10/300 GL equilibrada con PBS . La absorción a 280 nm se verificó y el pico de cada corrida de la cromatografía se normalizó a un valor de 1. La flecha indica el volumen hueco de la columna (7.8 mi). De los volúmenes de elución observados de las proteínas de fusión, sus tamaños moleculares aparentes se determinaron utilizando una curva de calibración similar como se muestra en la Figura 4B como sigue. Fab-PlAl (200 ) : 180.7 kDa (masa verdadera: 65.3 kDa); Fab-P1A3 (200) : 160.2 kDa (masa verdadera: 64.0 kDa) . Estos datos muestran que la fusión de una proteína con el polipéptido PlAl y/o P1A5, confiere un volumen hidrodinámico muy aumentado.
Figura 11. Análisis experimental de la estructura secundaria de las fusiones Fab-P1A1 (200) y Fab-P1A3 (200) mediante espectroscopia con dicroismo circular (CD) .
Los espectros se registraron a temperatura ambiente en K2SO4 50 mM, fosfato de K 20 mM, pH 7.5 y se normalizaron a la elipticidad molar, T?, para cada proteina.
(A) Espectro CD de Fab-P1A1 (200) y Fab-P1A3 (200 ) recombinantes purificados. Los espectros CD de las proteínas de fusión Fab con ambos polimeros/polipéptidos de Pro/Ala, revelan cada uno, una banda negativa dominante por debajo de 200 nm, que es indicativa de la conformación de espira aleatoria. Además, hay un reborde alrededor de 220 nm, que surge de la contribución de la lámina ß del fragmento Fab e indica su plegado correcto incluso como parte de la proteína de fusión.
(B) Espectro CD de la diferencia molar para Fab-P1A1 (200) y Fab-P1A3 (200), obtenidos mediante la sustracción del espectro del fragmento Fab no fusionado (véase la Figura 5A) . los espectros CD de la diferencia representan las estructuras secundarias de los polímeros/segmentos de polipéptido P1A1 de 200 residuos (SEQ ID NO: 51) y P1A3 (SEQ ID NO: 3) respectivamente, y revelan un mínimo fuerte alrededor de 200 nm, que es una clara indicación de su conformación de espira aleatoria en la solución acuosa amortiguada (Greenfield (1969) Biochemistry 17 8: 4108-4116; Sreerama (2000) loe. cit.; Fándrich (2002) EMBO J. 21:5682-5690).
Figura 12 : Preparación de un polimero/polipéptido de Pro/Ala biosintético aislado.
(A) Mapa del plásmido de pSUMO-PA#l (200 ) (SEQ ID NO: 60) . El gen estructural para la proteina de fusión MK-His ( 6) -SUM0-PA#1 (200 ) , que comprende un codón de inicio de metionina, seguido por un codón de lisina, una marca de afinidad N terminal de seis residuos de His consecutivos, proteina Smt3p del modificador similar a la ubiquitina pequeño (SUMO) escindible (Panavas (2009) Methods Mol Biol . 497: 303-17), y el he polímero/segmento del polipéptido PA#1 con 200 residuos (SEQ ID NO: 60), está bajo el control transcripcional del promotor del gen 10 del bacteriófago T7 y termina con el terminador t^. Los elementos del plásmido adicionales comprenden el origen de replicación (ori), el gen de resistencia a la ampicilina (bla) , y el origen de replicación f1. La cadena principal del plásmido fuera del cásete de expresión flanqueado por los sitios de restricción iVdel y HindIII es, excepto por un sitio de restricción SapI que se eliminó mediante mutación silenciosa, idéntica a aquella del vector de clonación y expresión genérica pRSET5a (Schoepfer (1993) 124: 83-85) .
La SEQ ID NO: 60 se proporciona en el listado de las secuencias anexo (que es también parte de esta descripción y especificación) , y se reproduce aquí a continuación . gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa 60 atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga 120 agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc 180 ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg 240 gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc 300 gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat 360 tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg 420 acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag 480 aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa 540 cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc 600 gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca 660 cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc 720 tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc 780 tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg 840 ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta 900 tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag 960 gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga 1020 ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 1080 tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 1140 agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 1200 aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 1260 cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt 1320 agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 1380 tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 1440 gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 1500 gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 1560 ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 1620 gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 1680 ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 1740 ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 1800 acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt 1860 gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag 1920 cggagaagcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca 1980 ggatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg agaccacaac ggtttccctc 2040 tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatacat atgaaacatc accaccatca 2100 ccattcggac tcagaagtca atcaagaagc taagccagag gtcaagccag aagtcaagcc 2160 tgagactcac atcaatttaa aggtgtccga tggatcttca gaaatcttct ttaagatcaa 2220 aaagaccact cctttaagaa ggctgatgga agcgttcgct aaaagacagg gtaaggaaat 2280 ggactcctta agattcttgt acgacggtat tagaattcaa gctgatcaga cccctgaaga 2340 tttggacatg gaggataacg atattattga ggctcacaga gaacagattg gtggcgccgc 2400 tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgccgc 2460 tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgccgc 2520 tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgccgc 2580 tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgccgc 2640 tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgccgc 2700 tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgccgc 2760 tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgccgc 2820 tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgccgc 2880 tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgccgc 2940 tccagctgca cctgctccag cagcacctgc tgcaccagct ccggctgctc ctgctgcctg 3000 aagagcaagc ttgatccggc tgctaacaa gcccgaaagg aagctgagtt ggctgctgcc 3060 accgctgagc aataactagc ataacccctt ggggcctcta aacgggtctt gaggggtttt 3120 ttgctgaaag gaggaactat atccggatct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc 3180 gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggga cgcgccctgt agcggcgcat 3240 taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag 3300 cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc 3360 aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc 3420 ccaaaaaact tgattagggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt 3480 ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa 3540 caacactcaa ccctatctcg gtctattctt ttgatttata agggattttg ccgatttcgg 3600 cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat 3660 taacgcttac aatttaggtg 3680 (B) Análisis de la proteina de fusión His ( 6) -SUMO-PA#1(200) producida de manera bacteriana y su escisión mediante SDS-PAGE al 12%. El gel muestra que la proteina de fusión SU O-PAS#l (200) extraída de E. coli y purificada vía cromatografía por afinidad con metal inmovilizado (IMAC) y cromatografía con exclusión de tamaño (SEC) antes (carril 1) y después de la escisión proteolítica con la proteasa 1 específica de Ubi (proteasa SUMO) (carril 2) , como se describe en el Ejemplo 21. Todas las muestras se redujeron con 2-mercaptoetanol . Los tamaños de los marcadores de la proteína (M) , aplicados bajo condiciones reductoras, se indican en el margen izquierdo. La proteína de fusión His (6) -SUM0-PA#1 (200) , aparece como una sola banda homogénea con un tamaño molecular aparente de aproximadamente 100 kDa . Así, el tamaño aparente para esta proteína de fusión His (6) -SU 0-PA#1 (200) , observada en SDS-PAGE, es significativamente mayor que la masa calculada de 28.3 kDa, que se debe a la presencia del polímero/polipéptido de Pro/Ala. Después de la escisión, el polipéptido PA#1(200) hidrofilico no es teñido de manera detectable con azul de Coomassie; por lo tanto, sólo una pequeña fracción residual de la proteína de fusión y la proteína His (6) -SUMO escindida, son visibles en el gel de poliacrilamida SDS (carril 2). La proteína His ( 6 ) -SUMO muestra una banda homogénea con un tamaño molecular aparente de aproximadamente 16 kDa (carril 2), que está de acuerdo con su masa molecular calculada de 12.2 kDa.
Figura 13 : Conjugación de un polímero/polipéptido biosintético de Pro/Ala con los compuestos químicos y/o fármacos .
(A-D) Producción de un conjugado de fluoresceína con un polímero/polipéptido biosintético 1 PA#1(200) (SEQ ID NO: 61), verificado vía cromatografía con exclusión de tamaño analítica (SEC) . Los paneles muestran (de la parte superior a la parte inferior) , las corridas de la SEC de His (6) -SUM0-PA#1 (200) (A), His ( 6) -SUMO-PA#l (200) purificadas, después de la reacción de escisión en la presencia de la proteasa SUMO (B) , la partida de His(6)-SUMO-PA#1(200) escindida después del acoplamiento químico con un éster de NHS de fluoresceína (C) , y el conjugado de fluoresceína-PA#l (200) después de la purificación con IMAC (D) . 250 µ? de proteina/polipéptido a una concentración de aproximadamente 0.5 mg/ml, se aplicaron a una columna Superdex S200 10/300 GL equilibrada con PBS en un sistema purificador Akta. La absorción a 225 nm, 280 nm y 494 nm, se verificó utilizando un detector de UV/VIS UV-900 (GE Healthcare) , y un pico prominente de cada cromatograma se normalizó a un valor de 1. La flecha indica el volumen hueco de la columna (7.3 mi).
(E-K) Caracterización del polimero/polipéptido biosintético PA#1(200) libre de fluoresceína, y su conjugado de fluoresceína vía SEC y espectroscopia UV/VIS. Los tres cromatogramas muestran (de la parte superior a la parte inferior) PA#1(200) purificada (E) , el compuesto químico fluoresceína (F) y el conjugado de fluoresceína-PA#l ( 200) purificado (G) . Los cuatro espectros UV/VIS muestran la proteína de fusión His ( 6) -SUM0-PA#1 (200 ) purificada (H) , el polímero/polipéptido PA#1(200) purificado (I), fluoresceina libre (J), y el conjugado de fluoresceina-PA#l (200 ) purificado (K) (todos en PBS) . Las flechas indican las bandas/rebordes de absorción característicos de SUMO (280 nm) , PA#1(200) (225 nm) y la fluoresceina (494 nm) .
(L) Curva de calibración para los cromatogramas de (A-G) utilizando una columna Superdex S200 10/300 GL. El logaritmo del peso molecular (MW) de las proteínas del marcador (aprotinina, 6.5 kDa; citocromo C, 12.4 kDa; anhidrasa carbónica, 29.0 kDa; seroalbúmina bovina, 66.3 kDa; alcohol deshidrogenasa, 150 kDa; ß-amilasa, 200 kDa; apo-ferri ina , 440 kDa), se gráfico vs . sus volúmenes de elución (x) , y se ajustó por una línea recta. De los volúmenes de elución observados de His ( 6) -SUM0-PA#1 (200 ) (10.81 mi), PA#1(200) (11.51 mi), fluoresceína-PA#l (200) (11.49 mi) y fluoresceina (27.57 mi), sus tamaños moleculares aparentes se determinaron como sigue. His (6) -SUMO-PA#l (200) : 215.6 kDa, PA#1(200): 154.1 kDa (masa verdadera: 16.1 kDa), fluoresceína-PA#l (200) : 155.6 kDa (masa verdadera: 16.6 kDa); SUMO: 25.7 kDa (masa verdadera: 12.2 kDa); fluoresceina: 0.09 kDa (masa verdadera: 0.33 kDa). Estos datos muestran que la fusión con el polipéptido/polímero de Pro/Ala, confiere un volumen hidrodinámico muy aumentado al fármaco conjugado en comparación con el compuesto no modificado.
(M) Caracterización del conjugado químico entre el polipéptido/polimero biosintético PA#1(200) y el compuesto esteroide digoxigenina vía Espectrometría de Masas con Ionización con Electrorrocío (ESI-MS) . Un espectro de ESI-MS sin espiras de digoxigenina-PA#l (200) , reveló una masa de 16671.4 Da, que coincide esencialmente con la masa calculada para el conjugado de digoxigenina-PA#l (200 ) (16670.6 Da).
Figura 14 : Ilustración de los conjugados químicos entre el polipéptido/polimero biosintético PA#1 (200) y los fármacos de molécula pequeña.
(A) Fluoresceína acoplada al término N de PA#1(200) biosintético.
(B) Digoxigenina acoplada al término N de PA#1(200) biosintético.
EJEMPLOS La presente invención se describe además por medio de los siguientes ejemplos ilustrativos no limitantes, que proporcionan un mejor entendimiento de la presente invención y de sus muchas ventajas.
A menos que se indique de otra manera, los métodos establecidos de tecnología de genes recombinantes se utilizaron, como se ' describió, por ejemplo, en Sambrook (2001) loe. cit.
Ejemplo 1: Síntesis del gen para los polimeros/polipéptidos de aminoácidos de Pro/Ala.
Como se describió aquí anteriormente, las repeticiones de aminoácidos que consisten de residuos de Pro y Ala se describen en la presente como Pro/Ala o "PA". Los fragmentos de gen que codifican una secuencia de polímero repetitiva que comprende Pro y Ala (PA#1 que corresponde a la SEQ ID NO: 1), se obtuvieron hibridando los dos oligodesoxinucleótidos complementarios (SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18) mostrados en la Figura 1, seguido por la formación de un concatámero de una manera dirigida vía la ligadura del ADN de sus extremos adhesivos mutuamente compatibles, pero no palindrómicos . Los oligodesoxinucleótidos se compraron de ThermoScientific (Ulm, Alemania) , y se purificaron mediante electroforesis preparativa sobre gel de poliacrilamida y urea. Las secuencias de ácidos nucleicos de los oligodesoxinucleótidos se describen en la Figura 1 (SEQ ID NOs 17 y 18, que comprenden codón GCC adicional para la alanina, que se vuelve parte de la siguiente repetición de la secuencia PA#1 tras la ligadura de los extremos adhesivos correspondientes. La fosforilación enzimática se realizó mezclando 200 pmoles de ambos oligodesoxinucleótidos en 100 µ? de Tris/HCl 50 mM, pH 7.6, MgCl2 10 mM, DTT 5 mM, ATP 1 mM e incubando durante 30 minutos a 37°C en la presencia de 10 u de la cinasa del polinucleótido (MBI Fermentas, St . Leon-Rot, Alemania) . Después de la desnaturalización durante 10 minutos a 80°C, la mezcla se enfrió a temperatura ambiente durante la noche, para lograr la hibridación. A continuación, 50 µ? de esta solución se ligaron agregando 1 u de la ADN ligasa T4 (MBI Fermentas) y 10 µ? de Tris/HCl 100 mM, pH 7.4, MgCl2 50 mM, DTT 20 inM, ATP 10 mM, y en algunos casos, 5 mM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP, en un volumen total de 100 µ?, e incubando durante 55 minutos en hielo. Después de 10 minutos de inactivación con calor a 70°C, los productos de la ligadura se separaron mediante electroforesis sobre gel de agarosa al 1.5% (peso/volumen), en la presencia del amortiguador TAE (Tris 40 mM, ácido acético 20 mM, EDTA 1 mM) . Después de la tinción con bromuro de etidio, la banda que corresponde al segmento del gen montado de 300 pb de longitud, se escindió y aisló.
Ejemplo 2: Construcción de pFab-PA#l (200) como el vector de expresión para una proteina de fusión Fab-PA#1.
Para la clonación de una repetición de 10 meros del fragmento del gen sintético que codifica la secuencia de 20 aminoácidos de PA#1 del Ejemplo 1, el vector del plásmido pASK88-Fab-2xSapI (SEQ ID NO: 22), se empleó un plásmido de expresión para un fragmento Fab (Schlapschy (2007) Protein Eng. Des. Sel. 20:273-284), que aloja una secuencia nucleotidica con dos sitios de restricción SapI, en la orientación complementaria inversa en el extremo 3' de la cadena ligera (Figura 2A) . Este vector, que es un derivado de pASK75 (Skerra, A. (1994) Gene 151:131-135), se cortó con SapI, se desfosforiló con fosfatasa alcalina de camarón (USB, Cleveland, OH) , y se ligó con un cásete de 300 pb del fragmento de ADN sintético obtenido del Ejemplo 1. EL plásmido intermedio resultante pFab-PA#l ( 100 ) , se cortó nuevamente con SapI, se desfosforiló con fosfatasa alcalina de camarón, y se ligó con un cásete de 300 pb del fragmento de ADN sintético obtenido del Ejemplo 1 (como se ejemplifica en la Figura 2B, sin embargo, con sólo un cásete del polimero/polipéptido de PA#1(20)) . El plásmido resultante se designó pFab-PA#l (200 ) (SEQ ID NO: 28) (Figura 2C) . Deberá notarse que en este plásmido, la región codificante para la repetición de la secuencia PA#1 de 200 residuos, se flanqueó por dos sitios de restricción SapI, lo que permite la escisión precisa y la subclonación adicional de todo el cásete de la secuencia, que porta las salientes del nucleótido 5'-GCC.
Después de la transformación de E. coli XLl-Blue (Bullock (1987) Biotechniques 5: 376-378), el plásmido se preparó y la secuencia del inserto del ácido nucleico sintético clonado se confirmó mediante análisis de restricción y secuenciamiento del ADN de doble hebra (analizador Genético ABI-Prism™310 , Perkin-Elmer Applied Biosystems, Weiterstadt, Alemania), utilizando un equipo terminador BigDye™, asi como los cebadores oligodesoxinucleotídicos que permitieron el secuenciamiento de ambos extremos.
Ejemplo 3: Construcción de pASK-PA#l (200) -IFNa2b como un vector de expresión para una proteina de fusión PA#1 (200) -IF a2b.
Para la construcción de un plásmido de expresión que cosifica a IFNa2b como una fusión con una repetición de la secuencia PA#1 de 200 residuos, PA#1(200), pASK-IFNa2b (SEQ ID NO: 32) (Figura 2D), se cortó con SapI , se desfosforiló con fosfatasa alcalina de camarón, y se ligó con el fragmento del gen que codifica el polipéptido PA#1 de 200 residuos, escindido del plásmido construido previamente pFab-PA#1(200) (Ejemplo 2), mediante la digestión con restricción con SapI (como se ejemplifica en la Figura 2E, sin embargo, con sólo un cásete de polimero/polipéptido de PA#1(20)). Después de la transformación de E. coli J 83 (Yanisch-Perron . (1985) Gene 33:103-119), el plásmido se preparó y la presencia del inserto se confirmó mediante análisis de restricción. El plásmido resultante se designó pPA#l(200)-IFNa2b (SEQ ID NO: 37) (Figura 2F) .
Ejemplo 4: Producción bacteriana y purificación de las proteina de fusión entre un fragmento Fab y un polimero/polipéptido PA#1 codificado genéticamente.
El fragmento Fab (masa calculada: 48.0 kDa) y la fusión Fab-PA#1 (200 ) (masa calculada: 64.3 kDa), se produjo a 22°C en E. coli KS272 que aloja los plásmidos de expresión correspondientes del Ejemplo 3, junto con el plásmido auxiliar del plegado pTUM4 (Schlapschy (2006). Protein Eng. Des. Sel. 19:385-390), utilizando cultivos del matraz del agitador con 2 L de medio LB que contienen 100 mg/1 de ampicilina y 30 mg/1 de cloranfenicol . La inducción de la expresión del gen recombinante se realizó mediante la adición de 0.4 mg de anhidrotetraciclina a OD550 = 0.5 durante la noche (resultando típicamente en una OD550 de aproximadamente 1.0 en la recolección). La extracción periplásmica en la presencia de sacarosa 500 mM, EDTA 1 mM, Tris/HCl 100 mM, pH 8.0 que contiene 50 pg/ml de lisozima, se realizó como se describió en otro lugar (Breustedt (2005) Biochim. Biophys. Acta 1764:161-173), y seguida por la purificación por medio de la marca His6 utilizando cromatografía por afinidad con metal inmovilizado (Skerra (1994) Gene 141: 79-84), con un gradiente de imidazol de 0 a 200 mM en betaína 500 mM, fosfato de Na 50 mM, pH 7.5).
Las preparaciones de la proteína homogénea se obtuvieron de ambos fragmentos de Fab recombinantes (Figura 3A) , con rendimientos de 0.2 mg L"1 OD"1 para Fab no fusionado y 0.1 mg IT1 OD"1 para Fab-PA#1 (200 ) . La SDS-PAGE se realizó utilizando un sistema amortiguador de Tris de alta molaridad (Fling (1986) Anal. Biochem. 155: 83-88). Las concentraciones de la proteina se determinaron de acuerdo con la absorción a 280 nm, utilizando coeficientes de extinción calculados (Gilí (1989) Anal. Biochem. 182: 319-326) de 68290 M"1 cm"1 para Fab no .fusionado y su fusión del polímero PA#1, puesto que el polímero de Pro/Ala no contribuyó a la absorción UV debido a su falta de aminoácidos aromáticos.
Ejemplo 5: Producción bacteriana y purificación de las proteínas de fusión entre el IFNa2b y un polimero/polipéptido PA#1 codificado genéticamente.
El IFNa2b (masa calculada: 20.9 kDa) y PA#1 (200) -IFNa2b (masa calculada: 37.0 kDa), se produjeron a 22°C en E. coli KS272, que aloja los plásmidos de expresión correspondientes del Ejemplo 3, junto con el plásmido auxiliar del plegado pTUM4 (Schlapschy (2006) loe. cit.), utilizando los cultivos del matraz del agitador con 2 L de medio LB que contienen 100 mg/1 de ampicilina y 30 mg/1 de cloranfenicol . La inducción de la expresión del gen recombinante se realizó mediante la adición de 0.4 mg de anhidrotetraciclina a OD550 = 0.5 durante la noche (resultando típicamente en una OD550 de aproximadamente 1.0 en la recolección) . La extracción periplásmica en la presencia de sacarosa 500 mM, EDTA 1 mM, Tris/HCl 100 mM, pH 8.0 que contiene 50 g/ml de lisozima, se realizó como se describió en otro lugar (Breustedt (2005) loe. cit.), y seguida por la purificación via la marca de Strep II utilizando cromatografía por afinidad con estreptavidina (Schmidt (2007) Nat. Protoc. 2:1528-1535), en la presencia de NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, Tris/HCl 100 mM, pH 8.0.
Las preparaciones de la proteína homogénea se obtuvieron de ambas proteínas de IFNa2b recombinantes (Figura 3B) , con rendimientos de 0.15 mg L"1 OD-1 para el IFNa2b y 0.1 mg L"1 OD-1 para PA#1 ( 200 ) -1 FNa2b . La SDS-PAGE se realizó utilizando un sistema de amortiguador Tris de alta molaridad (Fling (1986) loe. cit.). Las concentraciones de la proteína se determinaron de acuerdo con la absorción a 280 nm, utilizando los coeficientes de extinción calculados (Gilí (1989) loe. cit.) de 23590 M"1 cm"1 para el IFNa2b no fusionado y su fusión del polímero PA#1.
Ejemplo 6: Medición del volumen hidrodinámico para la proteína de fusión recom inante entre un fragmento Fab y u polímero PA#1 codificado genéticamente de 200 residuos mediante filtración en gel analítica.
La cromatografía con exclusión de tamaño (SEC) , se llevó a cabo en una columna Superdex S200 HR 10/300 GL (GE Healthcare Europe, Freiburg, Alemania) , a una velocidad de flujo de 1 ml/minuto, utilizando un sistema de Purificador 10 Akta (GE Healthcare) con PBS (NaCl 115 mM, KH2P04 4 m , Na2HP04 16 mM; pH 7.4), como el amortiguador de la corrida. Muestras de 250 µ? del fragmento Fab purificado y su fusión de PA#1 de 200 residuos, obtenidos de la cromatografía por afinidad con metal, tal como se describió en el Ejemplo 4, se aplicaron de manera individual a una concentración de 0.25 mg/ml en PBS. Ambas proteínas se eluyeron en un solo pico homogéneo como se muestra en la Figura 4A.
Para la calibración de la columna (Figura 4B) , 250 µ? de una mezcla apropiada de las siguientes proteínas globulares (Sigma, Deisenhofen, Alemania) , se aplicaron en PBS a concentraciones de la proteína entre 0.2 mg/ml y 0.5 mg/ml: citocromo c, 12.4 kDa; anhidrasa carbónica, 29.0 kDa; ovalbúmina, 43.0 kDa; seroalbúmina bovina, 66.3 kDa; alcohol deshidrogenasa, 150 kDa; ß-amilasa, 200 kDa; apo-ferritina, 440 kDa.
Como resultado, la proteína de fusión con el polimero/polipéptido PA#1 de 200 residuos, exhibió un tamaño significativamente mayor que las proteínas globulares correspondientes con el mismo peso molecular. El incremento en el tamaño aparente para Fab-PA#1 (200) , fue de 7.4 veces, en comparación con el fragmento Fab no fusionado, mientras que la masa verdadera fue sólo mayor por 1.3 veces. Esta observación indica claramente un volumen hidrodinámico bastante incrementado, conferido al fragmento Fab biológicamente activo, por el segmento del polipéptido de Pro/Ala de acuerdo con esta invención.
Ejemplo 7: Medición del volumen hidrodinámico para la proteína de fusión recombinante entre IFNa2b y un polímero PA#1 codificado genéticamente de 200 residuos mediante filtración en gel analítica.
La cromatografía con exclusión de tamaño se llevó a cabo con IFNa2b y PA#1 (200) -IFNa2b en una columna Superdex S200 HR 10/300 GL (GE Healthcare) , a una velocidad de flujo de 1 ml/minuto, utilizando un sistema Purificador Ákta (GE Healthcare), de manera similar al descrito en el Ejemplo 6. Ambas proteínas eluyeron en un solo pico homogéneo, como se muestra en la Figura 4C.
Como resultado, la proteína de fusión con el polimero/polipéptido PA#1 de 200 residuos, exhibió un tamaño significativamente mayor que las proteínas globulares correspondientes con el mismo peso molecular (Figura 4D) . El incremento del tamaño aparente para PA#1 ( 200 ) -IFNa2b fue de 10.2 veces en comparación con la proteína de IFNa2b no fusionada, mientras que la masa verdadera fue sólo mayor por 1.8 veces. Esta observación indica claramente un volumen hidrodinámico bastante incrementado, conferido al interferón biológicamente activo por el polímero/polipéptido de Pro/Ala de acuerdo con esta invención.
Ejemplo 8: Detección de la conformación de espira aleatoria para el polímero PA#1 biosintético , fusionado a un fragmento Fab vía espectroscopia con dicroísmo circular.
La estructura secundaria se analizó utilizando un espectropolarímetro J-810 (Jasco, Groß-Umstadt , Alemania) , equipado con una cubeta de cuarzo 106-QS (longitud de la trayectoria de 0.1 mm; Helima, üllheim, Alemania). Los espectros se registraron de 190 a 250 nm a temperatura ambiente, acumulando 16 corridas (ancho de la banda 1 nm, velocidad de la exploración 100 nm/minuto, respuesta 4 segundos), utilizando soluciones de proteína de 3.12 a 15.4 µ? obtenidas del Ejemplo 4 en K2S04 50 mM, fosfato de K 20 mM, pH 7.5. Después de la corrección para los blancos de la solución, los espectros se suavizaron utilizando el programa del instrumento, y la electricidad molar T?, se calculó de acuerdo con la ecuación: en donde 0obs denota la electricidad medida, c la concentración de la proteína [mol/1], d la longitud de la trayectoria de la cubeta de cuarzo [cm] . Los valores de T? se graficaron contra la longitud de onda utilizando Kaleidagraph (Synergy Software, Reading, PA) .
El espectro del dicroismo circular (CD) medido para el Fab recombinante, estuvo de acuerdo con el pliegue de la inmunogloblulina dominada por la lámina ß, mientras que el espectro para la proteina de fusión Fab-PA#1 (200 ) , reveló una contribución significativa de la conformación de espira aleatoria (Figura 5A) . Para analizar la contribución espectroscópica por el segmento del polipéptido de Pro/Ala con mayor detalle, el espectro CD de la diferencia molar con respecto al fragmento Fab no fusionado, se calculó (Figura 5B) , sustrayendo el último espectro de uno para Fab-PA#1 (200) . Como resultado, se observó un mínimo fuerte alrededor de 200 nm, que es característico de la conformación de espira aleatoria. Así, la secuencia de Pro/Ala como parte de la proteína de fusión recombinante, parece estar presente como un polímero de espira aleatoria bajo condiciones de amortiguador fisiológico.
Ejemplo 9: Detección de la conformación de espira aleatoria para el polímero PA#1 codificado genéticamente fusionado al IFNa2b vía espectroscopia con dicroismo circular.
La estructura secundaria se analizó mediante mediciones de CD para el IFNa2b y PA#1 (200) -IFNa2b (obtenido del Ejemplo 5), como se describió en el Ejemplo 8, utilizando soluciones de proteina de 3.6 a 38.7 µ?. El espectro de PA#1 (200) -IFNa2b, reveló contribuciones significativas de la estructura secundaria de la hélice a, indicativa del pliegue del haz de la hélice a conocido del interferón, asi como de una conformación de espira aleatoria (Figura 5C) . Para analizar las contribuciones espectroscopicas por el compañero de fusión del polímero de Pro/Ala con mayor detalle, el espectro CD de la diferencia molar con respecto. al IFNa2b no fusionado, se calculó sustrayendo de los dos espectros individuales (Figura 5D) . Como resultado, se observó un mínimo fuerte alrededor de 200 nm, característico de una conformación de espira aleatoria. Asi, el segmento del polipéptido de Pro/Ala como parte de la proteína de fusión recombinante, parece estar presente como un polímero de espira aleatoria bajo condiciones de amortiguador acuoso.
Ejemplo 10: Análisis cuantitativo de la estructura secundaria del fragmento Fab, de IFNa2b y de sus fusiones del polímero PA#1 de 200 residuos.
El contenido de la estructura secundaria del fragmento Fab, Fab-PA#1 ( 200 ) , IFNa2b y PA#1 (200) -IFNa2b, se cuantificó de manera individual del espectro CD correspondiente medido en los Ejemplos 8 y 9, utilizando el programa de desconvolución de la estructura secundaria CDNN versión 2.1 (Bóhm (1992) Protein Eng. 5:191-195), con un conjunto de 33 espectros de base para la desconvolución del espectro CD complejo. Los resultados de este análisis se proporcionan en la siguiente Tabla: En comparación con el contenido de la estructura secundaria predominantemente de la lámina ß del fragmento Fab recombinante, que está de acuerdo con su pliegue de inmunoglobulina conocido (véase Eigenbrot (1993) J. Mol.
Biol. 229:969-995), la fracción de la conformación no estructurada (que comprende la espira aleatoria y la vuelta ß) , se incrementa claramente si el polímero PA#1 se fusiona al fragmento Fab. El espectro CD de la diferencia para el segmento del polipéptido de Pro/Ala, reveló una conformación de espira aleatoria clara. El análisis de la estructura secundaria muestra -la presencia de una alta fracción de conformaciones no estructuradas (que comprenden la espira aleatoria y la vuelta ß) , que comprenden casi el 100% de la estructura secundaria total. De manera similar, en comparación con el contenido de la estructura secundaria predominantemente de la hélice a del IFNa2b recombinante , que está de acuerdo con su estructura tridimensional conocida como una proteína de haz de la hélice a (Radhakrishnan (1996) Structure 4:1453-1463), la fracción de la conformación no estructurada para toda la proteína, se incrementa claramente si el polímero PA#1 se fusiona al IFNa2b. El espectro CD de la diferencia para el segmento del polipéptido de Pro/Ala, revela una conformación de espira aleatoria clara. El análisis del estructura secundaria muestra la presencia de una alta fracción de conformaciones no estructuradas (que comprenden la espira aleatoria y la vuelta ß) , que comprenden casi 100% de la estructura secundaria total.
Se obtuvieron resultados diferentes cuando se realizó un análisis teórico de la secuencia del polímero PA#1 utilizando el algoritmo de Chou-Fasman (Chou y Fasman (1974) Biochemistry 13: 222-245). Los resultados de este análisis se ilustran en la Figura 7. Este algoritmo predice 100% de la estructura secundaria de la hélice a, gue está en claro contraste con los datos experimentales. Asi, este algoritmo no es útil para predecir de manera confiable la conformación no estructurada para un polímero de aminoácidos de acuerdo con la invención.
Ejemplo 11: Construcción de pASK75-His6-PA#l (200) -hGH como un vector de expresión para una proteina de fusión His6-PA#1 (200) -hGH .
Para la construcción de un plásmido de expresión que codifica la hGH como una fusión con una repetición de la secuencia de PA#1 de 200, PA#1(200), pASK75-His6-hGH (SEQ ID NO: 41) (Figura 6A) , se cortó con SapI, se desfosforiló con fosfatasa alcalina de camarón, y se ligó con el fragmento del gen que codifica el polipéptido PA#1 de 200 residuos, escindido del plásmido pFab-PA#l ( 200 ) construido previamente (Ejemplo 2), mediante digestión con restricción SapI (como se ejemplificó en la Figura 6B, con sólo un cásete de polímero/polipéptido PA#1(20)). Después de la transformación de E. coli JM83 ( Yanisch-Perron . (1985) loe. cit . ) , el plásmido se preparó y la presencia del inserto correcto se confirmó mediante análisis con restricción. El plásmido resultante se designó pASK75-His6-PA#l (200) -hGH (SEQ ID NO: 46) (Figura 6C) .
Ejemplo 12 : Construcción de un vector de expresión para la producción secretora de la hormona de crecimiento humana fusionada con un polimero/polipéptido PA#1 de 200 residuos en células de ovario de hámster Chino.
El vector pASK75-His6-PA#l (200 ) -hGH (SEQ ID NO: 46), un derivado de pASK75 (Skerra (1994) loe. cit . ) , que permite la producción procariótica de la proteina de fusión PA#1 de hGH, se cortó con Nhel y HindIII. Este fragmento se purificó vía electroforesis sobre gel de agarosa y se ligó con el vector de corte correspondiente pCHO (SEQ ID NO: 50) . Después de la transformación de E. coli XLl-Blue (Bullock (1987) loe. cit.), el plásmido se preparó y la inserción correcta del fragmento se verificó vía análisis de restricción. El plásmido resultante, gue codifica el péptido de la señal de hGH fusionado a su marca His6, un segmento del polipéptido PA#1(200), y la hormona de crecimiento humana (hGH), se designó pCHO-PA#l (200) -hGH SEQ ID NO: 48) y se describe en la Figura 6D. 1 Ejemplo 13: Producción secretora de una proteina de fusión entre la hormona del crecimiento humana (hGH) y el polímero PA#1 codificado genética en células CHO.
Las células CHO-K1 ATCC No. CCL-61, se cultivaron en medio Quantum 263 (PAA Laboratories, Cólbe, Alemania) , en un recipiente de plástico de 100 mm, hasta que se alcanzó la confluencia del 50%. Las células se transíectaron con 8 µ? de pCHO-PA#l (200) -hGH (SEQ ID NO: 48) o, para el control, pCHO-hGH (SEQ ID NO: 49), un plásmido similar que codifica hGH sin al secuencia PA#1(200), utilizando el Equipo de Nanofectina (PAA Laboratories, Cólbe, Alemania) . Después de 6 horas, el medio de cultivo celular se intercambió por 7 mi de medio de suero reducido con Opti- E ®-I (Invitrogen, Darmstadt, Alemania) , y las células se incubaron a 37 °C en una atmósfera humidificada con CO2 al 5%. Después de dos días, 20 µ? del sobrenadante de cultivo celular se tomaron y diluyeron con 5 µ? de amortiguador de carga de SDS-PAGE que contiene ß-mercaptoetanol . Después de 5 minutos de calentamiento a 95°C, 15 µ? de cada muestra se sometieron a SDS-PAGE al 12%. Después de la electrotransferencia en una membrana de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania) , por medio de un aparato de transferencia semiseco, la membrana se lavó 3 veces durante 15 minutos con 10 mi de PBST (PBS que contiene Tween 20 al 0.1% en volumen/volumen). La membrana se incubó con 10 mi de una dilución 1:1000 del anticuerpo antihormona del crecimiento humana abl956, conjugado con peroxidasa de rábano picante (Abcam, Cambridge, UK) . Después de la incubación durante 1 hora y lavando la membrana dos veces durante 5 minutos con 20 mi de PBST y dos veces durante 5 minutos con PBS, la reacción cromogénica se realizó en la presencia de 15 mi de solución de 3,3-diaminobenzidina SIGMAFAST™ ( Sigma-Aldrich Chemie, Munich, Alemania) . La reacción se detuvo lavando con agua y secando con aire la membrana. La transferencia reveló señales para ambas muestras de la proteína recombinante (Figura 6E) , proporcionando así una producción secretora de la proteína de fusión hGH con el polipéptido PA#1 en las células CHO.
Ejemplo 14: Producción bacteriana y purificación de las proteínas de fusión entre hGH y un polímero/polipéptido PA#1 codificado genéticamente.
La hormona de crecimiento humana (hGH) (masa calculada: 23.4 kDa) , PA#1 (200 ) -hGH (masa calculada: 39.6 kDa), PA#1 (400) -hGH (masa calculada: 55.8 kDa) y PA#1 (600) -hGH (masa calculada: 72.0 kDa), se produjeron en E. coli KS272, que aloja los plásmidos de expresión correspondientes del Ejemplo 11, o sus derivados con un cásete doble (que codifica 400 residuos) o triple (600 residuos) de la secuencia PA#1, respectivamente. La producción bacteriana se realizó a 22°C en cultivos del matraz del agitador con 2 L de medio LB que contiene 2.5 g/L de glucosa, 0.5 g/L de prolina y 100 mg/1 de ampicilina. La inducción de la expresión del gen recombinante, se realizó mediante la adición de 0.4 mg de anhidrotetraciclina a OD550 = 0.5 durante 3 horas. La extracción periplásmica en la presencia de sacarosa 500 mM, EDTA 1 mM, Tris/HCl 100 mM, pH 8.0, que contiene 50 g/ml de lisozima, se llevó a cabo como se describió en otro lugar (Breustedt (2005) loe. cit . ) y seguida por la purificación vía la marca His6 utilizando la columna de afinidad de Alto Rendimiento HisTrap (GE Healthcare), con fosfato de Na 40 mM, pH 7.5, NaCl 0.5 M como el amortiguador. Las proteínas se eluyeron utilizando un gradiente de concentración de imidazol de 0 a 150 mM (disuelto en el amortiguador de la corrida y ajustado con HC1 a pH 7.5), y se purificó además vía cromatografía con exclusión de tamaño, utilizando una columna Superdex 200-HR10/30 (GE Healthcare) , equilibrada con PBS (NaCl 115 mM, KH2P04 4 mM, Na2HP04 16 mM, pH 7.4).
Después de la cromatografía con exclusión de tamaño, se obtuvieron las preparaciones de la proteína homogénea para todas las proteínas de fusión de hGH recombinantes, sin signos de agregación y con rendimientos de 1 mg L"1 OD"1 para la hGH, 0.3 mg L"1 OD"1 para PA#1 ( 200 ) -hGH, 0.3 mg L"1 OD"1 para PA#1 (400) -hGH y 0.2 mg L"1 OD"1 para PA#1 (600) -hGH. La SDS-PAGE se realizó utilizando un sistema amortiguador de Tris de alta molaridad (Fling (1986) loe. cit.). Las concentraciones de la proteina se determinaron de acuerdo con la absorción a 280 nm, utilizando coeficientes de extinción calculados (Gilí (1989) loe. cit.) de 16050 M"1 era"1 para la hGH no fusionada y todas sus fusiones del polipéptido PA#1.
Ejemplo 15: Medición de la afinidad de unión de la hormona del crecimiento humana y sus fusiones del polímero PA#1 hacia el dominio extracelular del receptor de la hormona del crecimiento humana utilizando resonancia con plasmón en la superficie .
La afinidad de la hGH y sus fusiones del polipéptido PA#1 a la proteina de fusión Fe del receptor de la hormona del crecimiento humana (hGHR-Fc; R&D Systems) , se determinó vía mediciones en tiempo real de la resonancia con plasmón en la superficie (SPR) en un sistema Biacore 2000 (GE Healthcare) . Primero, 15 µ? del anticuerpo de captura de IgG-Fc antihumana de ratón ( Jackson Immuno Research) , a una concentración de 100 pg/ml en acetato de Na 10 mM, pH 5.0, se inmovilizaron en la superficie de dos canales de flujo de una microplaqueta CMDP (XanTec bioanalytics) , utilizando un equipo de acoplamiento de amina (GE Healthcare) . Esto resultó en aproximadamente 2700 unidades de respuesta (RU) . Después del equilibrio con PBS/T (PBS que contiene Tween 20 5 al 0.05% (volumen/ volumen)) como el amortiguador de flujo, un canal de la microplaqueta se cargó con 2 g/ml de hGHR-Fc a una velocidad de flujo de 5 µ?/minuto, hasta que se alcanzo una señal adicional de aproximadamente 300 RU. A continuación, 75 µ? de hGH o sus fusiones del polipéptido PA#1 en PBS/T, se inyectaron a concentraciones variables y las fases de asociación y disociación se midieron bajo un flujo de amortiguador continuo de 20 µ?/minuto. Para la regeneración, tres impulsos de 6 µ? de glicina/HCl 10 mM, pH 2.7 se aplicaron. Los sensogramas se corrigieron mediante la sustracción doble de las señales correspondientes medidas para el canal sin receptor inmovilizado y una linea basal promediada determinada de varias inyecciones del blanco del amortiguador (Myszka (1999) Mol. Recognit. 12: 279-284). La evaluación de los datos cinéticos se realizó mediante un ajuste global de los trazos de al menos siete diferentes inyecciones de muestra de acuerdo con el modelo de unión de Langmuir 1:1, utilizando el programa BIAevaluation versión 3.1 (GE Healthcare). Los valores obtenidos de las mediciones SPR para las constante cinéticas y derivadas del equilibrio de los complejos entre la hGH o sus fusiones de PA#1 y el receptor de la hormona del crecimiento humana, se resumen en la siguiente Tabla: Estos datos muestra que la fusión de hGH con los polipéptidos PA#1 de diferentes longitudes, no interfiere de manera significativa con la unión al receptor. Todas las fusiones del polipéptido PA#1 de hGH retienen la actividad de unión al receptor con un factor 5, en comparación con la hGH recombinante que carece del polipéptido PA#1.
Ejemplo 16: Detección de la vida media en el plasma prolongada in vivo para las proteínas de fusión recombinantes entre un fragmento Fab y los polímeros PA#1 codificados genéticamente .
Los ratones BALB/c adultos (crias de reserva SPF; TU ünchen, Freising, Alemania) , se inyectaron de manera intravenosa de acuerdo con la siguiente Tabla: El volumen total del articulo de prueba administrado de manera intravenosa, se calculó de acuerdo con el peso corporal (b. w.) individual registrado en el día de la administración (por ejemplo, un animal con 20 g de peso corporal, recibió 100 µ? de 1 mg/ml del articulo de prueba) . El muestreo de la sangre se realizó de acuerdo con la siguiente Tabla: Para cada sustancia (articulo de Prueba), en total nueve animales, divididos en tres subgrupos 1-3, cada uno con tres animales, se inyectaron, cada uno que proporciona cuatro muestras en diferentes puntos de medición. Las muestras de sangre (aproximadamente 50 µ?) , se tomaron de la vena de la cola y se almacenaron a 4°C durante 30 minutos. Después de la centrifugación durante 10 minutos a 10 000 g y 4°C, el sobrenadante (plasma) se congeló y almacenó inmediatamente a -20°C.
Para la detección cuantitativa de la proteina de fusión de Fab en una ELISA, los pozos de una placa de microtitulación de 96 pozos (Maxisorb, NUNC, Dinamarca) , se recubrieron durante la noche a 4°C con 50 µ? de una solución de 10 µg/ml del antigeno de ectodominio Her2/ErbB2 recombinante en NaHC03 50 mM, pH 9.6. A continuación, los pozos se bloquearon con 200 µ? de BSA al 3% (peso/volumen) en PBS durante 1 hora, y se lavaron tres veces con PBS/T (PBS que contiene Tween 20 al 0.1% (volumen/volumen) ) . Las muestras de plasma se aplicaron en series de diluciones en PBS/T que contienen plasma de ratón al 0.5% (volumen/volumen) de un animal no tratado y se incubaron durante 1 hora. Los pozos se lavaron a continuación tres veces con PBS/T y se incubaron durante 1 hora con 50 µ? de una solución diluida 1:1000 de un conjugado de fosfatasa alcalina del anticuerpo CK antihumano en PBS/T. Después de lavar dos veces con PBS/T y dos veces con PBS, la reacción cromogénica empezó agregando 50 µ? de 0.5 pg/ml de fosfato de p-nitrofenilo en Tris/HCl 100 mM, pH 8.8, NaCl 100 mM, MgCl2 5 mM como el sustrato, y después de 15 minutos a 25°C, se midió la absorbancia a 405 nm. Las concentraciones de Fab, Fab-PA#1 (200 ) y Fab-PA#1 ( 600) en las muestras de plasma se cuantificaron mediante comparación de las señales medidas con las curvas estándar que se determinaron para las series de diluciones para las proteínas purificadas correspondientes a concentraciones definidas en PBS/T, que contienen plasma de ratón al 0.5% (volumen/volumen) de los animales no tratados.
Para estimar la vida media en el plasma de Fab, Fab-PA#1 (200) y Fab-PA#1 ( 600 ) , los valores de la concentración, c(t), se determinaron para cada punto de medición de las mediciones de la ELISA, y se graficaron contra el tiempo postinyección intravenosa, t. Estos datos se ajustaron numéricamente utilizando el programa KaleidaGraph, suponiendo un decaimiento biexponencial de acuerdo con la ecuación en donde ta1/2 y xPi 2, son los valores de la vida media de la fase de distribución a y la fase de eliminación ß, respectivamente. c0 es la concentración en sangre total en el punto de medición cero, mientras que ca es la amplitud de la concentración para la fase de distribución.
La Figura 8 describe la farmacocinética para los tres artículos de prueba en ratones BALB/c. Mientras que el Fab recombinante muestra una rápida depuración de la sangre con una vida media de eliminación de justo aproximadamente 1.3 horas, las proteínas de fusión Fab-PA#1 (200 ) y Fab-PA#1 ( 600 ) tienen una vida media extendida más de 3 veces y 29 veces, con los valores correspondientes de aproximadamente 4.1 horas y 38.8 horas, respectivamente. Estos datos prueban que la vida media en el plasma in vivo de un fragmento Fab se prolonga de manera significa iva debido a la fusión con un polímero/polipéptido de Pro/Ala, por lo que la vida media se vuelve más larga con la longitud que se incrementa del polímero del aminoácido.
Ejemplo 17: Síntesis del gen de los polimeros/polipéptidos de aminoácidos PlAl y P1A3 y la construcción de pFab-PlAl (200) y pFab-PlA3 (200) , como vectores de expresión para las proteínas de fusión Fab-P1A1 (200) y Fab-P1A3 (200) .
Los fragmentos de genes que codifican una secuencia de polímero repetitiva que comprenden los polipéptidos/polímeros de Pro/Ala PlAl (SEQ ID NO: 51) y P1A3, también designado PA#3, (SEQ ID NO: 3), se obtuvieron mediante hibridación de los pares de los 1 oligodesoxinucleótidos complementarios, respectivamente, SEQ ID NO: 52 y SEQ ID NO: 53 para P1A1, y SEQ ID NO: 54 y SEQ ID NO: 55 para P1A3, como se describió en el Ejemplo 1. pFab-PlAl (200) (SEQ ID NO: 58) y pFab-PlA3 ( 200 ) (SEQ ID NO: 59) , que codifican para los fragmentos Fab con los polímeros/segmentos de polipéptido de Pro/Ala correspondientes de 200 residuos en el término C de la cadena ligera (LC) (secuencia de aminoácidos de LC Fab-P1A1 (200 ) : SEQ ID NO: 56; secuencia de aminoácidos de LC Fab-P1A3 (200 ) : SEQ ID NO: 57), se construyeron de una manera análoga a pFab-PA#l (200 ) , que se ha descrito en el Ejemplo 2.
En lo siguiente, las SEQ ID NOs : 56, 57, 58 y 59 también se reproducen. Sin embargo, estas secuencias también están comprendidas en el listado de secuencias anexo, que es una parte especifica de esta publicación y la descripción de la presente invención.
SEQ ID NO: 56 Asp lie Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser Ser Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 210 215 220 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 225 230 235 240 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 245 250 255 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 260 265 270 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 275 280 285 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 290 295 300 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 305 310 315 320 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 325 330 335 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 340 345 350 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 355 360 365.
Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 370 375 380 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 385 390 395 400 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 405 410 415 Ala SEQ ID NO: 57 Asp lie Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser Ser Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro 210 215 220 Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro 225 230 235 240 Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro 245 250 255 Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro 260 265 270 Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro 275 280 285 Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro 290 295 300 Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro 305 310 315 320 Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro 325 330 335 Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro 340 345 350 Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro 355 360 365 Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro 370 375 380 Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro 385 390 395 400 Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro 405 410 415 Ala SEQ ID NO: 58' acccgacacc atcgaatggc cagatgatta attcctaatt tttgttgaca ctctatcatt 60 gatagagtta ttttaccact ccctatcagt gatagagaaa agtgaaatga atagttcgac 120 aaaaatctag ataacgaggg caaaaaatga aaaagacagc tatcgcgatt gcagtggcac 180 tggctggttt cgctaccgta gcgcaggccg aagttaaact gcaggaatcc ggtggtggtc 240 tggttcagcc aggtggttcc ctgcggctct cgtgtgctgc ttccggtttc aacatcaaag 300 acacctacat ccactgggtt cgtcaggctc cgggtaaagg cctggaatgg gttgctcgta 360 tctacccgac caacggttac accaggtatg ccgattcagt taaaggtcgt ttcaccatct 420 cggccgacac ttccaaaaac accgcttacc tccagatgaa ctccctgcgt gctgaagaca 480 cagctgttta ttattgctcc cgttggggtg gtgacggttt ctacgctatg gactactggg 540 gtcagggtac cctggtcacc gtctcctcag cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc 600 tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg 660 actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc 720 acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgactg 780 tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgttaatcac aaacccagca 840 acaccaaggt cgacaagaaa gttgagccca aatcttgcca tcaccaccat caccattaat 900 aaccatggag aaaataaagt gaaacaaagc actattgcac tggcactctt accgttactg 960 tttacccctg tgacaaaagc cgacatcgag ctcacccaat ccccgtcctc cctgtccgct 1020 tccgttggcg accgtgttac catcacgtgt agggcctcgc aagacgtaaa caccgccgta 1080 gcgtggtatc agcagaaacc cgggaaagct ccgaaactgc tgatctatag cgcttccttc 1140 ctgtattccg gagttccgag caggttcagt ggttcccgtt ccggtaccga cttcaccctg 1200 acgatatcct ccctccagcc ggaagacttc gctacctact actgtcaaca gcactacacc 1260 accccgccga ccttcggtca gggtaccaaa ctcgagatca aacggactgt ggctgcacca 1320 tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg 1380 tgcctgctga ataacttcta tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc 1440 ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc acagagcagg acagcaagga cagcacctac 1500 agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc 1560 tgcgaagtca cccatcaggg cctgagttcg cccgtcacaa agagcttcaa ccgcggagag 1620 tgctcttctg cccctgctcc tgctccagca cctgcaccag cacctgctcc agcaccagct 1680 cctgcaccag cccctgctcc tgctccagca cctgcaccag cacctgctcc agcaccagct 1740 cctgcaccag cccctgctcc tgctccagca cctgcaccag cacctgctcc agcaccagct 1800 cctgcaccag cccctgctcc tgctccagca cctgcaccag cacctgctcc agcaccagct 1860 cctgcaccag cccctgctcc tgctccagca cctgcaccag cacctgctcc agcaccagct 1920 cctgcaccag cccctgctcc tgctccagca cctgcaccag cacctgctcc agcaccagct 1980 cctgcaccag cccctgctcc tgctccagca cctgcaccag cacctgctcc agcaccagct 2040 cctgcaccag cccctgctcc tgctccagca cctgcaccag cacctgctcc agcaccagct 2100 cctgcaccag cccctgctcc tgctccagca cctgcaccag cacctgctcc agcaccagct 2160 cctgcaccag cccctgctcc tgctccagca cctgcaccag cacctgctcc agcaccagct 2220 cctgcaccag cctgaagagc ttaagcttga cctgtgaagt gaaaaatggc gcacattgtg 2280 cgacattttt tttgtctgcc gtttaccgct actgcgtcac ggatctccac gcgccctgta 2340 gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca 2400 gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct 2460 ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc 2520 acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat 2580 agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc 2640 aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt tgatttataa gggattttgc 2700 cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac gcgaatttta 2760 acaaaatatt aacgtttaca atttcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc 2820 ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct 2880 gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg 2940 cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg 3000 tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc 3060 tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca 3120 cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac 3180 tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa 3240 agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg 3300 ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt 3360 ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg 3420 aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc 3480 gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaattg atagactgga 3540 tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta 3600 ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg gctctcgcgg tatcattgca gcactggggc 3660 cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg 3720 atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaggaat 3780 taatgatgtc tcgtttagat aaaagtaaag tgattaacag cgcattagag ctgcttaatg 3840 aggtcggaat cgaaggttta acaacccgta aactcgccca gaagctaggt gtagagcagc 3900 ctacattgta ttggcatgta aaaaataagc gggctttgct cgacgcctta gccattgaga 3960 tgttagatag gcaccatact cacttttgcc ctttagaagg ggaaagctgg caagattttt 4020 tacgtaataa cgctaaaagt tttagatgtg ctttactaag tcatcgcgat ggagcaaaag 4080 tacatttagg tacacggcct acagaaaaac agtatgaaac tctcgaaaat caattagcct ttttatgcca acaaggtttt tcactagaga atgcattata tgcactcagc gcagtggggc attttacttt aggttgcgta ttggaagatc aagagcatca agtcgctaaa gaagaaaggg aaacacctac tactgatagt atgccgccat tattacgaca agctatcgaa ttatttgatc accaaggtgc agagccagcc ttcttattcg gccttgaatt gatcatatgc ggattagaaa aacaacttaa atgtgaaagt gggtcttaaa agcagcataa cctttttccg tgatggtaac ttcactagtt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg SEQ ID NO : 59 acccgacacc atcgaatggc cagatgatta attcctaatt tttgttgaca ctctatcatt gatagagtta ttttaccact ccctatcagt gatagagaaa agtgaaatga atagttcgac aaaaatctag ataacgaggg caaaaaatga aaaagacagc tatcgcgatt gcagtggcac tggctggttt cgctaccgta gcgcaggccg aagttaaact gcaggaatcc ggtggtggtc tggttcagcc aggtggttcc ctgcggctct cgtgtgctgc ttccggtttc aacatcaaag 300 acacctacat ccactgggtt cgtcaggctc cgggtaaagg cctggaatgg gttgctcgta 360 tctacccgac caacggttac accaggtatg ccgattcagt taaaggtcgt ttcaccatct 420 cggccgacac ttccaaaaac accgcttacc tccagatgaa ctccctgcgt gctgaagaca 480 cagctgttta ttattgctcc cgttggggtg gtgacggttt ctacgctatg gactactggg 540 gtcagggtac cctggtcacc gtctcctcag cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc 600 tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg 660 actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc 720 acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgactg 780 tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgttaatcac aaacccagca 840 acaccaaggt cgacaagaaa gttgagccca aatcttgcca tcaccaccat caccattaat 900 aaccatggag aaaataaagt gaaacaaagc actattgcac tggcactctt accgttactg 960 tttacccctg tgacaaaagc cgacatcgag ctcacccaat ccccgtcctc cctgtccgct 1020 tccgttggcg accgtgttac catcacgtgt agggcctcgc aagacgtaaa caccgccgta 1080 gcgtggtatc agcagaaacc cgggaaagct ccgaaactgc tgatctatag cgcttccttc 1140 ctgtattccg gagttccgag caggttcagt ggttcccgtt ccggtaccga cttcaccctg 1200 acgatatcct ccctccagcc ggaagacttc gctacctact actgtcaaca gcactacacc 1260 accccgccga ccttcggtca gggtaccaaa ctcgagatca aacggactgt ggctgcacca 1320 tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg 1380 tgcctgctga ataacttcta tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc 1440 ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc acagagcagg acagcaagga cagcacctac 1500 agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc 1560 tgcgaagtca cccatcaggg cctgagttcg cccgtcacaa agagcttcaa ccgcggagag 1620 tgctcttctg ccgctgcacc tgctgcagca cctgctgcag ctccagcagc tgctcctgca 1680 gcagctccag ccgctgcacc tgctgcagca cctgctgcag ctccagcagc tgctcctgca 1740 gcagctccag ccgctgcacc tgctgcagca cctgctgcag ctccagcagc tgctcctgca 1800 gcagctccag ccgctgcacc tgctgcagca cctgctgcag ctccagcagc tgctcctgca 1860 gcagctccag ccgctgcacc tgctgcagca cctgctgcag ctccagcagc tgctcctgca 1920 gcagctccag ccgctgcacc tgctgcagca cctgctgcag ctccagcagc tgctcctgca 1980 gcagctccag ccgctgcacc tgctgcagca cctgctgcag ctccagcagc tgctcctgca 2040 gcagctccag ccgctgcacc tgctgcagca cctgctgcag ctccagcagc tgctcctgca 2100 gcagctccag ccgctgcacc tgctgcagca cctgctgcag ctccagcagc tgctcctgca 2160 gcagctccag ccgctgcacc tgctgcagca cctgctgcag ctccagcagc tgctcctgca 2220 gcagctccag cctgaagagc ttaagcttga cctgtgaagt gaaaaatggc gcacattgtg 2280 cgacattttt tttgtctgcc gtttaccgct actgcgtcac ggatctccac gcgccctgta 2340 gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca 2400 gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct 2460 ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc 2520 acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat 2580 agacggtttt tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc 2640 aaactggaac aacactcaac cctatctcgg tctattcttt tgatttataa gggattttgc 2700 cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac gcgaatttta 2760 acaaaatatt aacgtttaca atttcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc 2820 ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct 2880 gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg 2940 cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg 3000 tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc 3060 tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca 3120 cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac 3180 tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa 3240 agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg 3300 ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt 3360 ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg 3420 aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc 3480 gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaattg atagactgga 3540 tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta 3600 ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg gctctcgcgg tatoattgca gcactggggc 3660 cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg 3720 atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaggaat 3780 taatgatgtc tcgtttagat aaaagtaaag tgattaacag cgcattagag ctgcttaatg 3840 aggtcggaat cgaaggttta acaacccgta aactcgccca gaagctaggt gtagagcagc 3900 ctacattgta ttggcatgta aaaaataagc gggctttgct cgacgcctta gccattgaga 3960 tgttagatag gcaccatact cacttttgcc ctttagaagg ggaaagctgg caagattttt 4020 tacgtaataa cgctaaaagt tttagatgtg ctttactaag tcatcgcgat ggagcaaaag 4080 tacatttagg tacacggcct acagaaaaac agtatgaaac tctcgaaaat caattagcct 4140 ttttatgcca acaaggtttt tcactagaga atgcattata tgcactcagc gcagtggggc 4200 attttacttt aggttgcgta ttggaagatc aagagcatca agtcgctaaa gaagaaaggg 4260 aaacacctac tactgatagt atgccgccat tattacgaca agctatcgaa ttatttgatc 4320 accaaggtgc agagccagcc ttcttattcg gccttgaatt gatcatatgc ggattagaaa 4380 aacaacttaa atgtgaaagt gggtcttaaa agcagcataa cctttttccg tgatggtaac 4440 ttcactagtt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc 4500 cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt 4560 cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac 4620 cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct 4680 tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact 4740 tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg 4800 ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata 4860 aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga 4920 cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag 4980 ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg 5040 agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac 5100 ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca 5160 acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg 5210 Ejemplo 18: Medición del volumen hidrodinámico para la proteína de fusión recombinante entre un fragmento Fab y un polipéptido/polimero P1A1 o P1A3 codificado genéticamente mediante filtración en gel analítica.
La SEC se llevó a cabo en una columna Superdex S200 HR 10/300 GL (GE Healthcare Europe, Freiburg, Alemania) a una velocidad de flujo de 1 mi/minuto, utilizando un sistema Purificador 10 de Ákta (GE Healthcare) con PBS como el amortiguador de la corrida. Muestras de 250 µ? de las proteínas de fusión Fab-P1A1 (200 ) y Fab-P1A3 (200) , que se produjeron y purificaron de manera similar (Figura 9), como se describió para Fab-PA#1 (200 ) en el Ejemplo 4, se aplicaron de manera individual a una concentración de 0.25 mg/ml en PBS. Ambas proteínas eluyeron en un solo pico homogéneo como se muestra en la Figura 10.
Como resultado, las proteínas de fusión con los polímeros/polipéptidos PlAl o P1A3 de 200 residuos, exhibieron tamaños significativamente mayores que el fragmento Fab no fusionado correspondiente. El incremento del tamaño aparente para Fab-PlAl (200 ) y Fab-P1A3 (200) fue de 5.8 veces y 5.2 veces, respectivamente, en comparación con el fragmento Fab (véase la Figura 4B) , mientras que la masa verdadera fue sólo mayor por 1.4 veces y 1.3 veces. Esta observación indica claramente un volumen hidrodinámico bastante incrementado, conferido al fragmento Aab biológicamente activo por los segmentos de polipéptidos biosintéticos PlAl y P1A3, de acuerdo con esta invención.
Ejemplo 19: Detección de la conformación de espira aleatoria para los polímeros/polipéptidos biosintéticos PlAl y P1A3 fusionados a un fragmento Fab vía espectroscopia con dicroismo circular (CD) .
Los espectros de CD para Fab-PlAl (200 ) y Fab-P1A3(200) se registraron como se describió en el Ejemplo 8, utilizando soluciones de proteina 4.2 y 6.5 µ?, respectivamente, preparadas de manera similar a como se describió en el Ejemplo 4, utilizando K2S04 50 mM, fosfato de K 20 mM pH 7.5 como amortiguador.
Los espectros para las proteínas de fusión Fab-P1A1(200) y Fab-P1A3 (200) revelaron una fracción significativa de conformación de espira aleatoria (Figura 11A) . Para analizar la contribución espectroscópica por el segmento del polipéptido de Pro/Ala con mayor detalle, el espectro de CD de la diferencia molar con respecto al fragmento Fab no fusionado (véase el Ejemplo 8), se calculó (Figura 11B) sustrayendo el último espectro de uno para Fab-P1A1(200) y Fab-P1A3 (200 ) , respectivamente, después de la normalización a la misma concentración molar. Como resultado, se observó un mínimo fuerte a una longitud de onda de aproximadamente 200 nm, que es característico de la conformación de espira aleatoria. Así, las secuencias P1A1 y P1A3 como parte de la proteína de fusión recombinante, parecen estar presentes e la conformación de espira aleatoria bajo condiciones de amortiguador fisiológico.
Ejemplo 20: Construcción de pSUMO-PA#1 (200) como el vector de expresión para una proteina de fusión His (6) -SUMO-PA#l (200) .
Para la construcción de un plásmido de expresión que codifica una marca His de seis residuos y la proteína del modificador pequeño similar a la ubiquitina (SUMO) (Panavas (2009) Methods Mol. Biol . 497: 303-17), fusionada a una repetición de la secuencia de PA#1 de 200 residuos, la proteína SUMO) de Saccharomyces cerevisiae [también conocida como Smt3p; Uniprot: Q12306] , se amplificó vía reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de un ADNc clonado. El cebador 5' introdujo un sitio de restricción Ndel, que contiene un codón de inicio de et (ATG) y un codón de Lys adicional, asi como la marca His6 que codifica la secuencia, mientras que el cebador 3 introdujo un sitio de restricción HindlII y SapI en el producto de la PCR. El fragmento de ADN resultante se digirió con Ndel y HindlII y se ligó con un derivado digerido de manera correspondiente del plásmido pSAl (Schmidt (1994) J. Chromatogr. 676: 337-345) , en donde el sitio de restricción SapI se ha eliminado mediante una mutación silenciosa. El plásmido resultante se cortó con SapI, se desfosforiló con fosfatasa alcalina de camarón, y se ligó con el fragmento del gen que codifica el segmento del polipéptido PA#1 de 200 residuos, escindido del plásmido pFab-PA#l (200 ) (descrito en el Ejemplo 2), mediante la digestión con restricción con SapI (de una forma análoga a como se ejemplificó en la Figura 2E) . El plásmido resultante se designó pSUM0-PA#l ( 200 ) (SEQ ID NO: 60) y se describe en la Figura 12A.
Ejemplo 21: Expresión bacteriana y aislamiento de un polimero/polipéptido PA#1 (200) codificado genéticamente.
El polipéptido PA#1(200) (masa calculada: 16.1 kDa) se produjo inicialmente como una proteina de fusión con la proteína del modificador pequeño similar a la ubiquitina (SUMO) (masa calculada: 12.2 kDa), en el citoplasma de E. coli BLR ( DE3 ) (NEB, Ipswich, MA, EUA) , que aloja el plásmido de expresión pSU O-PA#l (200) (descrito en el Ejemplo 21), junto con el plásmido pLysE (Studier (1991) J. Mol. Biol . 219: 37-44), que suprime el promotor T7. La producción bacteriana se realizó a 30°C en los cultivos del matraz del agitador, con 2 L de medio LB que contiene 2.5 g/L de D-glucosa, 0.5 g/L de L-prolina, 100 mg/1 de ampicilina, y 30 mg/1 de cloranfenicol . La expresión del gen recombinante se indujo mediante la adición de isopropil-ß-?-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 0.5 mM. Las bacterias se recolectaron 3 horas después de la inducción, se resuspendieron en NaCl 100 mM, fosfato de Na 40 mM pH 7.5 y se Usaron utilizando una celda de presión French (Thermo Scientific, altham, MA, EUA) . Después de la centrifugación (15 minutos, 15000 g) del lisado, no se observaron cuerpos de inclusión.
El sobrenadante que contiene la proteina de fusión soluble se incubó a 70°C durante 15 minutos y se centrifugó (15 minutos, 15000 g) para eliminar las proteínas de la célula hospedera térmicamente inestables. La proteína de fusión His (6) -SUM0-PA#1 (200) se purificó del sobrenadante vía IMAC (Skerra (1994) Gene 141: 79-84) utilizando una columna de alto desempeño HisTrap cargada con Ni2+ de 12 mi (GE Healthcare), conectada a un sistema purificador de Akta (GE Healthcare) y se eluyó con un gradiente de imidazol de 0 a 150 mM en NaCl 500 mM, fosfato de Na 40 mM pH 7.5. Después de un paso de SEC preparativa posterior, se obtuvo una preparación homogénea de la proteina de fusión His ( 6 ) -SUMO-PA#1(200) (Figura 12B) con un rendimiento de aproximadamente 5 mg por 1 L de cultivo bacteriano con OD550 = 1. La concentración de la proteina se determinó de acuerdo con la absorción a 280 nm, utilizando un coeficiente de extinción calculado (Gilí (1989) loe. cit) de 1280 M~1 enf1 para la fusión del polipéptido His ( 6) -SUMO-PA#l (200) . Nótese que el segmento del polipéptido PA#1(200) no contribuye a la absorción a 280 nm debido a su falta de cadenas laterales aromáticas o que contienen azufre.
El polipéptido biosintético PA#1(200) se liberó de la proteina de fusión mediante escisión proteolitica especifica del sitio (corriente debajo de un motivo Gly-Gly que precede al segmento del polipéptido de Pro/Ala) con 2 U/mg de la proteasa 1 especifica de Ubi de Saccharomyces cerevisiae (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) , durante 1 hora a 30°C en amortiguador de escisión (Igepal al 0.2% en peso/volumen, DTT 1 mM, NaCl 150 mM, Tris-HCl 50 mM pH 8.0). El proceso de escisión se verificó mediante SDS-PAGE (Figura 12B) , utilizando un sistema de amortiguador Tris de alta molaridad (Fling (1986) Anal. Biochem. 155: 83-88) . Con el fin de eliminar la proteina His (6) -SUMO escindida, la proteina de fusión residual no escindida y también la proteasa SUMO, todas que portan la marca His6, la mezcla de reacción se sometió a otro IMAC utilizando una columna de alto desempeño HisTras cargada con Ni2+ de 5 mi (GE Healthcare) y NaCl 500 M, fosfato 20 mM, pH 7.5 como el amortiguador de la corrida. Esta vez, el flujo pasante contenia el polipéptido biosintético PA#1(200) puro (Figura 13E) . Nótese que el polipéptido/polimero biosintético PA#1(200) (SEQ ID NO: 61) preparado de esta manera, comprende un total de 201 residuos de aminoácidos, lo que surge del producto génico combinado codificado de 10 bloques de construcción de oligodesoxinucleótidos ligados de doble hebra, cada uno que codifica 20 residuos de aminoácidos, como se muestra en la Figura 1, y un residuo de Ala adicional codificado por la saliente de ADN triple del sitio de restricción SapI corriente abajo, que se utilizó para la clonación.
Ejemplo 22: Preparación y caracterización de la molécula pequeña/conjugados de fármacos con PA#1 (200) .
La mezcla de reacción de la escisión proteolitica no purificada de la proteina de fusión His ( 6) -SUMO-PA#l (200) del Ejemplo 21, se dializó dos veces a 4°C contra NaHC03 50 mM pH 8.3 y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora después de mezclar con un exceso molar de 10 veces de una solución del éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 6-[fluorescein-5 (6) -carboxamido] hexanoico ( Fluoresceina- éster de NHS; Sigma-Aldrich) en dimetilformamida seca (DMF) . Para este fin, 200 µ? de una solución de 2.5 mg/ml de la mezcla de escisión de His (6) -SUMO-PA#l (200) se agregaron a 17.6 µ? de una solución 10 mM del éster de Fluoresceina-NHS disuelto en DMF. La mezcla resultante se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora y se aplicó a IMAC como se describió en el Ejemplo 21, para eliminar la proteina His (6) -SUMO escindida, la proteina de fusión residual no escindida y la proteasa SUMO, y se purificó además mediante SEC preparativa en una columna Superdex S200 10/300 GL equilibrada con PBS a una velocidad de flujo de 0.5 ml/minuto.
Las muestras de los diferentes pasos se analizaron entonces vía SEC analítica en una columna Superdex S200 10/300 GL equilibrada con PBS a una velocidad de flujo de 0.5 ml/minuto. La proteina SUMO se detectó vía sus cadenas laterales aromáticas a 280 nm y los enlaces peptidicos, incluyendo aquéllos del polipéptido o el segmento del polipéptido de Pro/Ala, se detectaron a 225 nm, mientras que la fluoresceina se detectó a 494 nm (Figura 13A-G) . Por comparación, los espectros UV/VIS de una solución de la fluoresceina libre (Sigma-Aldrich) y de las fracciones de cada pico distinto detectado en la SEC, se midieron utilizando un instrumento Lambda 9 (Perkin Elmer, Waltham, MA, EUA) (Figura 13H-K) . Para la calibración del tamaño de la columna de la cromatografía (Figura 13L) , 250 µ? de una mezcla apropiada de las siguientes proteínas globulares (Sigma-Aldrich) , se aplicaron en PBS a concentraciones entre 0.2 y 0.5 mg/ml: aprotinina, 6.5 kDa; citocromo c, 12.4 kDa; anhidrasa carbónica, 29.0 kDa; seroalbúmina bovina, 66.3 kDa; alcohol deshidrogenasa, 150 kDa; ß-amilasa, 200 kDa; apo-ferritina, 440 kDa.
Como resultado, después del acoplamiento del polipéptido/polímero biosintético PA#1(200) con Fluoresceína-éster de NHS, se aisló un conjugado macromolecular vía IMAC y SEC, que exhibe esencialmente las propiedades del tamaño del polipéptido/polímero PA#1(200) y la firma espectroscópica de la molécula pequeña, es decir, el grupo de fluoresceína . Esto demuestra que la molécula pequeña se acopló de manera exitosa al polipéptido/polímero sintético de Pro/Ala, que de acuerdo con esta invención, incrementa de manera dramática el volumen hidrodinámico del fármaco o compuesto de molécula pequeña conjugado.
Para preparar un conjugado similar entre el polipéptido/polímero biosintético de Pro/Ala y el esteroide de plantas digoxigenina, 0.1 mg del polipéptido PA#1(200) purificado del Ejemplo 21, se dializó contra aHC03 50 mM pH 8.3, como se describió anteriormente. La concentración del polipéptido PA#1(200) purificado se determinó de acuerdo con la absorción a 205 nm (Gilí (1989) loe. cit) . El polipéptido PA#1(200) se acopló con un exceso molar de 10 veces del éster de NHS del ácido digoxigenin-3-0-metilcarbonil-s-aminocaproico (DIG-éster de NHS; Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania) . Para este propósito, 100 µ? de una solución de 1 mg/ml del polipéptido PA#1(200) purificado en NaHC03 50 mM pH 8.3, se agregaron a 2 µ? de una solución 30 mM de DIG-éster de NHS disuelto en DMF seca y la mezcla de reacción se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. La solución resultante del conjugado se purificó utilizando una columna de desalación en espiral Zeba™ con un corte de 7 kDa (Thermo Scientific) , se dializó dos veces contra amortiguador de acetato de amonio 10 mM pH 6.8 y se analizó vía espectrometría de masas ESI en un instrumento Q-Tof Ultima ( aters, Eschbronn, Alemania) utilizando el modo de ion positivo.. Como resultado, el especto del conjugado de Digoxigenina-PA#l (200) reveló una masa de 16671.4 Da, que coincide esencialmente con la masa calculada de 16670.6 Da (Figura 13M) . Esto demuestra claramente que un polipéptido/polímero biosintético de Pro/Ala, en particular PA#1(200), puede conjugarse de manera eficiente con un fármaco de molécula pequeña.
La presente invención se relaciona con, y se refiera a las siguientes secuencias ejemplificadas, por lo que el listado de secuencias anexo se presenta como parte de la descripción y en consecuencia, es una parte de esta especificación .
La SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia de aminoácidos de PA#1.
La SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia de aminoácidos de PA#2.
La SEQ ID NO: 3 muestra la secuencia de aminoácidos de PA#3.
La SEQ ID NO.: 4 muestra la secuencia de aminoácidos de PA#4.
La SEQ ID NO: 5 muestra la secuencia de aminoácidos de PA#5.
La SEQ ID NO: 6 muestra la secuencia de aminoácidos de PA#6.
La SEQ ID NO: 7 muestra una secuencia de aminoácidos de una versión permutada circular de la SEQ ID NO: 1 La SEQ ID NO: 8 muestra una secuencia de aminoácidos de una versión permutada circular de la SEQ ID NO: 1.
La SEQ ID NO: 9 muestra una secuencia de aminoácidos de una versión permutada circular de la SEQ ID NO: 1.
La SEQ ID NO: 10 muestra una secuencia de aminoácidos de una versión permutada circular de la SEQ ID NO: 1.
La SEQ ID NO: 11 muestra una secuencia de aminoácidos de una versión permutada circular de la SEQ ID NO: 1.
La SEQ ID NO: 12 muestra una secuencia de aminoácidos de una versión permutada circular de la SEQ ID NO: 1.
La SEQ ID NO: 13 muestra una secuencia de aminoácidos de una versión permutada circular de la SEQ ID NO: 1.
La SEQ ID NO: 14 muestra una secuencia de aminoácidos de una versión permutada circular de la SEQ ID NO: 1.
La SEQ ID NO: 15 muestra una secuencia de aminoácidos de una versión permutada circular de la SEQ ID NO: 1.
La SEQ ID NO: 16 muestra una secuencia de aminoácidos de una versión permutada circular de la SEQ ID NO: 1.
La SEQ ID NO: 17 muestra una secuencia de ácidos nucleicos del oligodesoxinucleótido de la hebra superior/codificante utilizado para la generación del bloque de construcción PA#1.
La SEQ ID NO: 18 muestra una secuencia de ácidos nucleicos del oligodesoxinucleótido de la hebra inferior/no codificante utilizado para la generación del bloque de construcción para PA#1.
La SEQ ID NO: 19 muestra un tramo de una secuencia de ácidos nucleicos (hebra superior/codificante) alrededor del término C de la cadena ligera de la inmunoglobulina de un fragmento Fab del anticuerpo, codificado en pASK88-Fab-2xSapI .
La SEQ ID NO: 20 muestra un tramo de una secuencia de ácidos nucleicos (hebra inferior/no codificante) alrededor del término C de la cadena ligera de la inmunoglobulina de un fragmento Fab del anticuerpo, codificado en pASK88-Fab-2xSapI .
La SEQ ID NO: 21 muestra una secuencia de aminoácidos del término C de la cadena ligera del fragmento Fab, codificado en pASK88-Fab-2xSapI .
La SEQ ID NO: 22 muestra la secuencia de ácidos nucleicos de pASK88-Fab-2xSapI .
La SEQ ID NO: 23 muestra un tramo de una secuencia de ácidos nucleicos (hebra superior/codificante) que codifica la secuencia de aminoácidos del término C de la cadena ligera de Fab después de la inserción de un polímero PA#1(20).
La SEQ ID NO: 24 muestra una secuencia de ácidos nucleicos (hebra inferior/no codificante) para un tramo de aminoácidos del término C de una cadena ligera de Fab después de la inserción de un polímero PA#1(20) .
La SEQ ID NO: 25 muestra un tramo de una secuencia de aminoácidos del término C de una cadena ligera de Fab después de la inserción de un polímero PA#1(20).
La SEQ ID NO: 26 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de Fab, codificada en pFab-PA#1 (200) .
La SEQ ID NO: 27 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de Fab fusionada con el polímero PA#1(200), codificada en pFab-PA#l (200 ) .
La SEQ ID NO: 28 muestra la secuencia de ácidos nucleicos de pFab-PA#l (200) .
La SEQ ID NO: 29 muestra la secuencia de ácidos nucleicos (hebra superior/codificante) que codifica la secuencia de aminoácidos del término N de INFa2b y la marca de Strep II (sólo los últimos dos aminoácidos) .
La SEQ ID NO: 30 muestra una secuencia de ácidos nucleicos (hebra inferior/no codificante) que codifica la secuencia de aminoácidos del término N de INFa2b y la marca de Strep II (sólo los últimos dos aminoácidos) .
La SEQ ID NO: 31 muestra la secuencia de aminoácidos del término C de la marca de Strep II y el término N de IÑFa2b.
La SEQ ID NO: 32 muestra la secuencia de ácidos nucleicos de pASK-IFNa2b.
La SEQ ID NO: 33 muestra un tramo de la secuencia de ácidos nucleicos (hebra superior/codificante) que codifica el término C de la marca de Strep II y el término N de IFNa2b después de la inserción de un cásete de la secuencia del polímero PA#1.
La SEQ ID NO: 34 muestra un tramo de la secuencia de ácidos nucleicos (hebra inferior/no codificante) del término C de la marca de Strep II y el término N de IFNa2b después de la inserción de un cásete de la secuencia del polímero PA#1.
La SEQ ID NO: 35 muestra un tramo de una secuencia de aminoácidos del término C de la marca de Strep II y el término N de IFNa2b después de la fusión con un cásete del polímero PA#1.
La SEQ ID NO: 36 muestra la secuencia de aminoácidos de IFNa2b y la marca de Strep II fusionada con el polímero PA#1(200), codificada en pPA#l (200 ) -IFNa2b.
La SEQ ID NO: 37 muestra la secuencia de ácidos nucleicos de pPA#l (200) -IFNa2b.
La SEQ ID NO: 38 muestra un tramo de la secuencia de ácidos nucleicos (hebra superior/codificante) en pASK75-His6-hGH, que codifica la secuencia de aminoácidos alrededor del término N de His6-hGH.
La SEQ ID NO: 39 muestra un tramo de la secuencia de ácidos nucleicos (hebra inferior/no codificante) en pASK75-His6-hGH, que codifica la secuencia de aminoácidos alrededor del término N de hGH.
La SEQ ID NO: 40 muestra un tramo de una secuencia de aminoácidos del término N de His6-hGH, codificada en pAS 75-His6-hGH.
La SEQ ID NO: 41 muestra la secuencia de ácidos nucleicos de pASK75-His6-hGH .
La SEQ ID NO: 42 muestra un tramo de una secuencia de ácidos nucleicos (hebra superior/codificante), que codifica la secuencia de aminoácidos del término N de His6-hGH, después de la inserción del polímero PA#1(20).
La SEQ ID NO: 43 muestra una secuencia de ácidos nucleicos (hebra inferior/no codificante) , que codifica el término N de hGH, después de la inserción de un cásete de la secuencia del polímero PA#1.
La SEQ ID NO: 44 muestra la secuencia de aminoácidos del término N de His6-hGH, después de la inserción del polímero PA#1(20).
La SEQ ID NO: 45 muestra la secuencia de aminoácidos de His6-PA#1 (200) -hGH madura, codificada en pASK75-His6-PA#l (200) -hGH.
La SEQ ID NO: 46 muestra la secuencia de ácidos nucleicos de pASK75-His6-PA#l (200) -hGH.
La SEQ ID NO: 47 muestra la secuencia de aminoácidos de His6-PA#1 (200 ) -hGH codificada en pCHO-PA#1 (200) -hGH.
La SEQ ID NO: 48 muestra la secuencia de ácidos nucleicos de pCHO-PA#l (200) -hGH.
La SEQ ID NO: 49 muestra la secuencia de ácidos nucleicos de pCHO-hGH.
La SEQ ID NO: 50 muestra la secuencia de ácidos nucleicos de pCHO.
La SEQ ID NO: 51 muestra la secuencia de aminoácidos de PlAl .
La SEQ ID NO: 52 muestra la secuencia de ácidos nucleicos del oligodesoxinucleótido de la hebra superior/codificante, utilizada para la generación del bloque de construcción para PlAl.
La SEQ ID NO: 53 muestra la secuencia de ácidos nucleicos del oligodesoxinucleótido de la hebra inferior/no codificante, utilizada para la generación del bloque de construcción para PlAl.
La SEQ ID NO: 54 muestra la secuencia de ácidos nucleicos del oligodesoxinucleótido de la hebra superior/codificante, utilizada para la generación del bloque de construcción para P1A3.
La SEQ ID NO: 55 muestra la secuencia de ácidos nucleicos del oligodesoxinucleótido de la hebra inferior/no codificante, utilizado para la generación del bloque de construcción para P1A3.
La SEQ ID NO: 56 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de Fab fusionada con el polímero PlAl (200), codificada en pFab-PlAl (200) .
La SEQ ID NO: 57 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de Fab fusionada con el polímero P1A3(200), codificada en pFab-PlA3 ( 200 ) .
La SEQ ID NO: 58 muestra la secuencia de ácidos nucleicos de pFab-PlAl (200) .
La SEQ .ID NO: 59 muestra la secuencia de aminoácidos de pFab-PlA3 (200 ) .
La SEQ ID NO: 60 muestra la secuencia de ácidos nucleicos de pSUMO-PA#l (200) .
La SEQ ID NO: 61 muestra el polipéptido/polímero PA#1(200) utilizado para la preparación de los conjugados de fármacos (hechos mediante la ligadura de 10 casetes del gen que codifican los 20 meros, incluyendo un residuo de Ala C terminal adicional, que resulta del sitio de ligadura corriente abajo.

Claims (31)

REIVINDICACIONES :
1. Un conjugado de un fármaco que comprende (i) un polipéptido o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina · y alanina, en donde l secuencia de aminoácidos consiste de al menos 50 residuos de aminoácidos de prolina (Pro) y alanina (Ala) , y (ii) un fármaco seleccionado del grupo que consiste de (a) una proteina o un polipéptido biológicamente activo, que comprende o que es una secuencia de aminoácidos que tiene o media una actividad biológica y (b) un fármaco de molécula pequeña .
2. El conjugado de un fármaco de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido o el segmento del polipéptido de espira aleatoria comprende una secuencia de aminoácidos que consiste de aproximadamente 50 a aproximadamente 3000 residuos de aminoácidos.
3. El conjugado de un fármaco de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque los residuos de prolina constituyen más de aproximadamente 10% y menos que aproximadamente 75% de las secuencias de aminoácidos.
4. El conjugado de un fármaco de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el polipéptido o el segmento del polipéptido de espira aleatoria comprende una pluralidad de repeticiones de aminoácidos, en donde la repetición consiste de residuos de prolina y alanina y en donde no más de 6 residuos de aminoácidos consecutivos son idénticos.
5. El conjugado de un fármaco de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el polipéptido o el segmento del polipéptido de espira aleatoria comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de AAPAAPAPAAPAAPAPAAPA (SEQ ID NO: 1); AAPAAAPAPAAPAAPAPAAP (SEQ ID NO: 2); AAAPAAAPAAAPAAAPAAAP (SEQ ID NO: 3); AAPAAPAAPAAPAAPAAPAAPAAP (SEQ ID NO: 4); APAAAPAPAAAPAPAAAPAPAAAP (SEQ ID NO: 5) ; AAAPAAPAAPPAAAAPAAPAAPPA (SEQ ID NO: 6); y APAPAPAPAPAPAPAPAPAP (SEQ ID NO: 51) o versiones permutadas circulares o multímeros de estas secuencias, como un todo o partes de estas secuencias.
6. El conjugado de un fármaco de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el polipéptido con actividad biológica, la proteina biológicamente activa o el polipéptido que comprende o que es una secuencia de aminoácidos que tiene o que media una actividad biológica, es seleccionado del grupo que consiste de proteínas de unión, fragmentos de anticuerpo, citocinas, factores de crecimiento, hormonas o enzimas.
7. El conjugado de un fármaco de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el polipéptido con actividad biológica es una proteína de unión, y en donde la molécula de unión es seleccionada del grupo que consiste de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos tales como fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, peptidomiméticos derivados de la CDR, fragmentos variables de una sola cadena (scFv) , anticuerpos del dominio lectinas, dominios de inmunoglobulina, dominios de fibronectina, dominios la proteína A, dominios SH3, dominios de repetición de la ankirina y lipocalinas.
8. El conjugado de un fármaco de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la proteína biológicamente activa es seleccionada del grupo que consiste del factor que estimula la colonia del granulocito, hormona del crecimiento humana, alfa-interferón, beta-interferón, gamma-interferón, factor de necrosis del tumor, eritropoyetina, factor de coagulación VIII, gpl20/gpl60, receptor del factor de necrosis del tumor I y II soluble, reteplasa, exendina-4, anakinra, interleucina-2 , lipocalina asociada con la neutrófilo gelatinasa, hormona que estimula el folículo, glucocerebrosidasa, timosina alfa 1, glucagon, somatostatina, adenosina desaminasa, interleucina 11. factor de coagulación VIIA, factor de coagulación IX, hemátido, interferona lamda, leptina, subunidad alfa del receptor de la interleucina-22 (IL-22ra) , interleucina-22 , hialuronidasa, factor de crecimiento del fibroblasto 18, factor de crecimiento del fibroblasto 21, péptido 1 similar al glucagon, osteoprotegerina, proteina de unión a IL-18, factor que libera la hormona del .crecimiento, receptor de TACI soluble, trombospondina-1, receptor del VEGF soluble Flt-1 e IL-4 muteina.
9. El conjugado de un fármaco de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el polipéptido biosintético de espira aleatoria o el polipéptido media una estabilidad incrementada in vivo y/o in vitro del conjugado de un fármaco.
10. El conjugado de un fármaco de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la estabilidad incrementada in vivo es una vida media en el plasma prolongada del conjugado de un fármaco, que comprende el polipéptido o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria, que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina, en donde la secuencia de aminoácidos consiste de al menos 50 residuos de aminoácidos de prolina (Pro) y alanina (Ala), cuando se comparara co la estabilidad del polipéptido de control o un control conjugado que carece del polipéptido o el segmento del polipéptido de espira aleatoria .
11. El conjugado de un fármaco de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la molécula pequeña es seleccionada del grupo que consiste de digoxigenina, fluoresceína, doxorrubicina, caliqueamicina, camptotecina, fumagilina, dexametasona, geldanamicina, paclitaxel, docetaxel, irinotecano, ciclosporina, buprenorfina, naltrexona, naloxona, vindesina, vancomicina, risperidona, aripiprazol, palonosetron, granisetron, citarabina NX1838, leuprólido, goserelina, buserelina, octreótido, teduglútido, cilengitida, abarelix, enfuvirtida, grelina, inhibidores de la integrina alfa 4, ácidos nucleicos antisentido, ARN de interferencia pequeños, micro ARN, esteroides, aptámeros de ADN o ARN y péptidos y/o peptidomiméticos .
12. Una composición que comprende el conjugado de un fármaco de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
13. La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque es una composición farmacéutica, que comprende opcionalmente además, portadores farmacéuticos aceptables o que es una composición de diagnóstico, que comprende opcionalmente además, portadores aceptables en las composiciones de diagnóstico.
14. Una molécula de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido o el segmento del polipéptido de espira aleatoria, comprendida en el conjugado de un fármaco, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o una molécula de ácidos nucleicos que codifica un conjugado de proteina que comprende una proteina biológicamente activa, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, y que comprende un polipéptido o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina, en donde la secuencia de aminoácidos consiste de al menos 50 residuos de aminoácidos de prolina (Pro) y alanina (Ala) .
15. Una molécula de ácidos nucleicos que codifica un conjugado de un fármaco, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, la molécula de ácidos nucleicos comprende (i) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de aminoácidos y/o líder traducida; (ii) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina, en donde la secuencia de aminoácidos consiste de al menos 50 residuos de aminoácidos de prolina (Pro) y alanina (Ala) ; (iii) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteina o un polipéptido biológicamente activo que comprende o que es una secuencia de aminoácidos que tiene o que media una actividad biológica y/o terapéutica; y (iv) una secuencia de ácidos nucleicos que representa o que es un codón de paro traduccional .
16. La molécula de ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque las partes o segmentos de la molécula de ácidos nucleicos, como se definió en (ii) y en (iii), están intercambiados en su posición en la molécula de ácidos nucleicos que codifica un conjugado de un fármaco .
17. ' La molécula de ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 15 ó 16, caracterizada porque comprende opcionalmente, entre las partes o segmentos definidos en (i) y en (ii) y/o entre las partes o segmentos definidos en (ii) y (iii) , una proteasa y/o un sitio de escisión química y/o un sitio de reconocimiento.
18. Un ácido nucleico que codifica un polipéptido o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria, que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina, en donde la secuencia de aminoácidos consiste de al menos 50 residuos de aminoácidos de prolina (Pro) y alanina (Ala) , la molécula de ácidos nucleicos comprende (i) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica' una secuencia de aminoácidos y/o líder traducida; (ii) una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria, que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina; y (iii) una secuencia de ácidos nucleicos que representa o es un codón de paro traduccional .
19. La molécula de ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque comprende opcionalmente, entre (i) y (ii), una proteasa y/o un sitio de escisión química y/o de reconocimiento.
20. Un vector que comprende el ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19.
21. Una célula hospedera que comprende el ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, o el vector de conformidad con la reivindicación 20.
22. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque la célula hospedera es una célula hospedera eucariótica.
23. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la célula hospedera eucariótica es una célula de hongos o animal.
24. Un método para la preparación de un polipéptido de espira aleatoria o un segmento del polipéptido de espira aleatoria, comprendido en el conjugado de un fármaco, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para la preparación de la proteina biológicamente activa o un conjugado de un fármaco o de un alimento, que comprende el polipéptido de espira aleatoria o el segmento del polipéptido de espira aleatoria, y/o para la preparación de un polipéptido que comprende o que es una secuencia de aminoácidos que tiene o que media una actividad biológica, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y que comprende además, el polipéptido de espira aleatoria o el segmento del polipéptido de espira aleatoria, el método comprende cultivar la célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, y aislar el polipéptido de espira aleatoria o la proteina biológicamente activa y/o la proteina o el polipéptido biológicamente activo del cultivo o de la célula.
25. El conjugado de un fármaco de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, la composición de conformidad con la reivindicación 12 ó 13, el ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, el vector de conformidad con la reivindicación 20, la célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, o la proteina biológicamente activa o el polipéptido que comprende el polipéptido de espira aleatoria o el segmento del polipéptido de espira aleatoria, y preparado mediante el método de conformidad con la reivindicación 24, para el tratamiento de trastornos relacionados con las deficiencias hormonales, enfermedad autoinmune, trastornos proliferativos, cáncer, anemia, enfermedades neovasculares, enfermedades infecciosas/inflamatorias, trastornos alérgicos, trombosis, infarto al miocardio, restinosis, diabetes, infertilidad, enfermedad de Gaucher, hepatitis B crónica, hepatitis C, hipoglucemia , acromegalia, deficiencia de la adenosina desaminasa, trombocitopenia, hemofilia, anemia, obesidad, enfermedad de Alzheimer, lipodistrofia, psoriasis, melanoma metastásico, osteoartritis , dislipidemia, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, asma, osteoporosis y lesión por reperfusión u otras enfermedades renales.
26. El conjugado de un fármaco de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, la composición de conformidad con la reivindicación 12 ó 13, el ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, el vector de conformidad con la reivindicación 20 o la célula de conformidad' con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, para utilizarse como un medicamento que tiene una estabilidad incrementada in vivo y/o in vi tro del polipéptido o el segmento del polipéptido de espira aleatoria, proteina biológicamente activa o conjugado de un fármaco.
27. El uso del polipéptido de espira aleatoria o el segmento del polipéptido de espira aleatoria de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o codificado por una molécula de ácidos nucleicos o partes de la misma, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, en cosméticos, en tratamientos cosméticos, nutrición o en la tecnología de los alimentos o en la industria del papel.
28. Un método para la producción de un conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, de un cosmético, de un compuesto a ser utilizado en tratamientos cosméticos, de un alimento o de una bebida, o de un conjugado de interés en la industria, el método comprende el cultivo de la célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, y aislar el polipéptido de espira aleatoria, la proteína biológicamente activa y/o la proteína o el polipéptido biológicamente activo, que comprende o que es una secuencia de aminoácidos que tiene o que media una actividad biológica o una actividad de interés y que comprende además, el polipéptido de espira aleatoria o segmento del polipéptido de espira aleatoria del cultivo o de la célula.
29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el polipéptido de espira aleatoria, la proteina biológicamente activa y/o la proteina o el polipéptido biológicamente activo que comprende o que es una secuencia de aminoácidos que tiene o que media una actividad biológica o una actividad de interés, y que comprende además, el polipéptido de espira aleatoria o el segmento del polipéptido de espira aleatoria, se aisla del medio de crecimiento o del medio de cultivo, lisados celulares, fracciones de la membrana celular, periplasma de la célula (hospedera) .
30. El método de conformidad con la reivindicación 28 o 29, caracterizado porque el polipéptido de espira aleatoria está enlazado y/o acoplado a una molécula de interés .
31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque el enlace o el acoplamiento es un enlace o acoplamiento químico. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un polipéptido biosintético de espira aleatoria o un segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria o conjugado biosintético, en donde el polipéptido biosintético de espira aleatoria, el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria o el conjugado biosintético comprende una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina, en donde la secuencia de aminoácidos consiste de al menos aproximadamente 50 residuos de aminoácidos de prolina (Pro) y alanina (Ala) . Al menos aproximadamente 50 residuos de aminoácidos de prolina (Pro) y alanina (Ala) pueden ser los constituyentes de un polipéptido heterólogo o un constructo de un polipéptido heterólogo. También se describen los usos y métodos de uso de estos polipéptidos biosintéticos de espira aleatoria o los segmentos de polipéptido o conjugados. Los usos pueden, ínter alia, comprender usos médicos, usos de diagnóstico o usos en la industria alimenticia, asi como otras aplicaciones industriales, como en la industria del papel, en la recuperación del petróleo, etc. En particular, se proporciona un conjugado de un fármaco que comprende (i) un polipéptido o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria, que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste únicamente de residuos de aminoácidos de prolina y alanina, en donde la secuencia de aminoácidos consiste de al menos 50 residuos de aminoácidos de prolina (Pro) y alanina (Ala), y (ii) un fármaco seleccionado del grupo que consiste de (a) una proteina o un polipéptido biológicamente activo, que comprende o que es una secuencia de aminoácidos que tiene o media una actividad biológica y (b) un fármaco de molécula pequeña. Además, se describen las moléculas de ácidos nucleicos que codifican el polipéptido o el segmento del polipéptido biosintético de espira aleatoria y/o las proteínas heterólogas biológicamente activas, así como los vectores y células que comprenden las moléculas de ácidos nucleicos. Además, la presente invención proporciona composiciones que comprenden los compuestos de la invención, así como los usos específicos del polipéptido o el segmento del polipéptido de espira aleatoria, la proteínas biológicamente activas, los conjugados de fármacos o las moléculas de ácidos nucleicos, vectores y células de la invención. También se proporcionan métodos para producir y/o obtener los polipéptidos o los segmentos de polipéptidos biosintéticos de espira aleatoria inventivos, así como para producir y/o obtener las proteínas heterólogas biológicamente activas, inventivas, y/o los constructos de polipéptido o conjugados, como conjugados de fármacos.
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Families Citing this family (86)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX357674B (es) 2010-05-21 2018-07-18 Xl Protein Gmbh Polipeptidos biosinteticos de espira aleatoria de prolina/alanina y sus usos.
US20140323402A1 (en) * 2011-08-12 2014-10-30 Ascendis Phama A/S Protein Carrier-Linked Prodrugs
EA037979B1 (ru) 2012-02-27 2021-06-18 Амуникс Оперейтинг Инк. Композиции конъюгата xten и способы их получения
EA031986B1 (ru) 2012-04-04 2019-03-29 Галозим, Инк. Способ и комбинация для лечения солидной раковой опухоли и набор, содержащий комбинацию
ES2744804T3 (es) 2013-01-22 2020-02-26 Deutsches Zentrum Fuer Neurodegenerative Erkrankungen E V Proteínas de repetición de dipéptidos como objetivo terapéutico en enfermedades neurodegenerativas con expansión de repetición de hexanucleótidos
JP6259207B2 (ja) * 2013-06-17 2018-01-10 雪印メグミルク株式会社 エラスチン産生促進剤
JP6259209B2 (ja) * 2013-06-17 2018-01-10 雪印メグミルク株式会社 コラーゲン産生促進剤
JP6259208B2 (ja) * 2013-06-17 2018-01-10 雪印メグミルク株式会社 ヒアルロン酸産生促進剤
EP3068438A1 (en) 2013-11-11 2016-09-21 Ascendis Pharma Relaxin Division A/S Relaxin prodrugs
US9618507B2 (en) 2014-02-24 2017-04-11 Betanien Hospital Methods of treating rheumatoid arthritis
US9975929B2 (en) 2014-03-05 2018-05-22 Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa Recombinant clostridial neurotoxins with increased duration of effect
PL228341B1 (pl) * 2014-04-21 2018-03-30 Bio Ventures Inst Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia Sposób uzyskiwania białka poliepitopowego oraz wektor DNA do realizacji tego sposobu
WO2016030334A2 (en) * 2014-08-26 2016-03-03 Betanien Hospital Methods, agents and compositions for treatment of inflammatory conditions
MX2017006113A (es) 2014-11-18 2017-10-16 Ascendis Pharma Endocrinology Div A/S Nuevos profarmacos polimericos de la hormona del crecimiento humana (hgh).
US12016903B2 (en) 2014-11-21 2024-06-25 Ascendis Pharma Endocrinology Division A/S Long-acting growth hormone treatment
EP3303380B1 (en) 2015-06-02 2020-01-15 Novo Nordisk A/S Insulins with polar recombinant extensions
TW201718627A (zh) 2015-06-11 2017-06-01 梅茲製藥有限兩合公司 重組梭菌神經毒素及其使用與形成方法、包括其之醫藥組合物及對應其之前驅物、編碼前驅物之核酸序列及其獲得方法與前驅物之形成方法、載體與包括核酸序列之重組宿主細胞
EP3347874B1 (en) * 2015-09-09 2021-05-12 Technische Universiteit Eindhoven Imaging of dispersion and velocity of contrast agents
MA43348A (fr) 2015-10-01 2018-08-08 Novo Nordisk As Conjugués de protéines
WO2017060857A1 (en) * 2015-10-08 2017-04-13 The Governors Of The University Of Alberta Hepatitis c virus e1/e2 heterodimers and methods of producing same
LT3394266T (lt) * 2015-12-22 2021-08-25 Xl-Protein Gmbh Nukleorūgštys, koduojančios pasikartojančias aminorūgščių sekas, turtingas prolino ir alanino liekanomis, kurios turi mažai kartotinų nukleotidų sekų
JP7026044B2 (ja) 2015-12-23 2022-02-25 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー 神経性状態および神経変性状態の治療としての長時間作用型ＧＬＰ－１ｒアゴニスト
EP3400022A1 (en) 2016-01-08 2018-11-14 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Controlled-release cnp agonists with low initial npr-b activity
KR102373744B1 (ko) 2016-01-08 2022-03-15 아센디스 파마 그로우쓰 디스오더스 에이/에스 낮은 npr-c 결합을 갖는 제어 방출성 cnp 작용제
SG11201805028RA (en) 2016-01-08 2018-07-30 Ascendis Pharma Growth Disorders As Controlled-release cnp agonists with increased nep stability
CA3008017C (en) 2016-01-08 2024-01-02 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Controlled-release cnp agonists with reduced side-effects
PL3400019T3 (pl) 2016-01-08 2023-01-23 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Proleki cnp z przyłączeniem nośnika w ugrupowaniu pierścieniowy
CA3007976C (en) 2016-01-08 2023-09-26 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Cnp prodrugs with large carrier moieties
EP3405480B1 (en) 2016-01-20 2022-08-03 Merz Pharma GmbH & Co. KGaA Novel recombinant clostridial neurotoxins with increased duration of effect
MX2018009938A (es) 2016-03-01 2019-03-14 Ascendis Pharma Bone Diseases As Profarmacos de hormona paratiroidea (pth).
US11969461B2 (en) 2016-03-02 2024-04-30 Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa Composition comprising botulinum toxin
WO2017173346A1 (en) * 2016-04-01 2017-10-05 Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Par3 mimetic peptides and uses thereof
CN109310780A (zh) * 2016-05-04 2019-02-05 纳维格蛋白质有限公司 包含肽接头的用于化学部分位点-特异性偶联的靶向化合物
WO2018011266A1 (en) 2016-07-13 2018-01-18 Ascendis Pharma A/S Conjugation method for carrier-linked prodrugs
NZ751745A (en) 2016-09-29 2023-05-26 Ascendis Pharma Bone Diseases As Pth compounds with low peak-to-trough ratios
CA3037444A1 (en) 2016-09-29 2018-04-05 Ascendis Pharma Bone Diseases A/S Incremental dose finding in controlled-release pth compounds
EP3518960B1 (en) 2016-09-29 2023-07-19 Ascendis Pharma Bone Diseases A/S Dosage regimen for a controlled-release pth compound
IL290054B2 (en) 2016-09-29 2024-03-01 Ascendis Pharma Growth Disorders As Combined treatment with CNP agonists with controlled release
US10738338B2 (en) 2016-10-18 2020-08-11 The Research Foundation for the State University Method and composition for biocatalytic protein-oligonucleotide conjugation and protein-oligonucleotide conjugate
EP3541848A4 (en) * 2016-11-16 2020-05-27 Auckland Uniservices Limited PROTEINLIGATION METHOD AND USES THEREOF
EP3606560A2 (en) 2017-04-05 2020-02-12 Novo Nordisk A/S Oligomer extended insulin-fc conjugates
EP3642222A1 (en) 2017-06-20 2020-04-29 Merz Pharma GmbH & Co. KGaA Novel recombinant botulinum toxin with increased duration of effect
US10174302B1 (en) * 2017-06-21 2019-01-08 Xl-Protein Gmbh Modified L-asparaginase
CN110891612A (zh) * 2017-06-21 2020-03-17 Xl-蛋白有限责任公司 蛋白质药物与p/a肽的缀合物
EP3418383A1 (en) 2017-06-21 2018-12-26 XL-protein GmbH Modified l-asparaginase
AU2018287145B2 (en) * 2017-06-21 2024-04-18 Jazz Pharmaceuticals Ireland Limited Modified L-asparaginase
EP3649143B1 (en) 2017-07-06 2022-08-31 Merz Pharma GmbH & Co. KGaA Novel recombinant botulinum neurotoxins with increased duration of effect
EP3483619A1 (en) * 2017-11-13 2019-05-15 Technische Universität München Automated noninvasive determining the sex of an embryo of and the fertility of a bird's egg
WO2019101308A1 (en) * 2017-11-22 2019-05-31 Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa Novel recombinant botulinum toxin with increased duration of effect
US20190184028A1 (en) * 2017-12-14 2019-06-20 Janssen Biotech, Inc. Targeting with firbronectin type iii like domain molecules
GB201804092D0 (en) * 2018-03-14 2018-04-25 Imperial Innovations Ltd Methods and compositions
CA3093083A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 Ascendis Pharma A/S Conjugates
WO2019185705A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 Ascendis Pharma A/S Il-2 conjugates
TWI724392B (zh) * 2018-04-06 2021-04-11 美商美國禮來大藥廠 生長分化因子15促效劑化合物及其使用方法
WO2019219896A1 (en) 2018-05-18 2019-11-21 Ascendis Pharma Bone Diseases A/S Starting dose of pth conjugates
CN113286812A (zh) 2018-09-27 2021-08-20 西里欧发展公司 掩蔽型细胞因子多肽
WO2020109978A1 (en) 2018-11-26 2020-06-04 Novartis Ag Lpl-gpihbp1 fusion polypeptides
US20240018190A1 (en) * 2019-01-10 2024-01-18 Roswell Biotechnologies, Inc. Conductive synthetic peptides for molecular electronics
AU2020223441A1 (en) 2019-02-11 2021-07-29 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Dry pharmaceutical formulations of CNP conjugates
WO2020165087A1 (en) 2019-02-11 2020-08-20 Ascendis Pharma Bone Diseases A/S Liquid pharmaceutical formulations of pth conjugates
WO2020178273A1 (en) 2019-03-04 2020-09-10 Ascendis Pharma Endocrinology Division A/S Long-acting growth hormone dosage forms with superior efficacy to daily somatropin
EP3714909A1 (en) * 2019-03-28 2020-09-30 Industrie Biomediche Insubri S.A. Improved bone implant matrix comprising proline-rich peptide and method of preparing the same
US10784093B1 (en) * 2019-04-04 2020-09-22 Thermo Finnigan Llc Chunking algorithm for processing long scan data from a sequence of mass spectrometry ion images
EP3986477A1 (en) 2019-06-21 2022-04-27 Ascendis Pharma A/S CONJUGATES OF pi-ELECTRON-PAIR-DONATING HETEROAROMATIC NITROGEN-COMPRISING COMPOUNDS
EP3986472A1 (en) 2019-06-21 2022-04-27 Ascendis Pharma A/S Conjugates of heteroaromatic nitrogen-comprising compounds
AU2020296295A1 (en) 2019-06-21 2021-12-23 Ascendis Pharma A/S Conjugates of an electron-donating nitrogen or tertiary amine comprising compounds
AU2020338947A1 (en) 2019-08-27 2022-03-31 Tonix Pharma Limited Modified TFF2 polypeptides
CA3156066A1 (en) 2019-10-25 2021-04-29 Mi Rim Choi Recombinant l-asparaginase
WO2021113434A1 (en) * 2019-12-03 2021-06-10 Rodan & Fields, Llc Peptides and compositions for inhibiting hair growth
IL294327A (en) 2020-01-03 2022-08-01 Ascendis Pharma As Conjugates undergoing intramolecular rearrangements
CN115003320A (zh) 2020-01-13 2022-09-02 阿森迪斯药物骨疾病股份有限公司 甲状旁腺功能减退的治疗
GB202007106D0 (en) * 2020-05-14 2020-07-01 Ucl Business Plc Cyclosporine analogues
CA3178074A1 (en) 2020-06-03 2021-12-09 Nina Gunnarsson Il-2 sequences and uses thereof
WO2022029178A1 (en) 2020-08-05 2022-02-10 Ascendis Pharma A/S Conjugates comprising reversible linkers and uses thereof
TW202228784A (zh) 2020-09-23 2022-08-01 奧地利商艾柏力維亞生技有限公司 用以於一患者中螯合非預期的抗ｐｅｇ抗體的化合物
US20230364199A1 (en) 2020-09-28 2023-11-16 Ascendis Pharma Bone Diseases A/S Improvement of physical and mental well-being of patients with hypoparathyroidism
IL303816A (en) 2020-12-22 2023-08-01 Xl Protein Gmbh Antibodies specific for structurally disordered sequences
CN112843222B (zh) * 2021-01-21 2023-01-31 暨南大学 Ankrd22蛋白在制备治疗或延缓自身免疫性疾病的产品中的应用
WO2022207798A1 (en) 2021-04-01 2022-10-06 Ascendis Pharma A/S Use of long-acting growth hormone for treating inflammation-induced diseases
EP4404951A1 (en) 2021-09-22 2024-07-31 Ascendis Pharma Bone Diseases A/S Long-acting pth compound treatments
WO2023110758A1 (en) 2021-12-13 2023-06-22 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Effective doses of cnp conjugates
AU2023276829A1 (en) 2022-05-23 2024-10-31 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Liquid pharmaceutical formulations of cnp compounds
WO2024094673A1 (en) 2022-11-02 2024-05-10 Ascendis Pharma Bone Diseases A/S Pth treatment regimen comprising two pth compounds
WO2024104922A1 (en) 2022-11-14 2024-05-23 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Method of improving skeletal muscle function
GB202218084D0 (en) 2022-12-01 2023-01-18 Volution Immuno Pharmaceuticals Sa Fusion proteins
WO2024194300A1 (en) 2023-03-20 2024-09-26 Ascendis Pharma Growth Disorders A/S Method of treatment of a thoracolumbar deformity in a human subject with achondroplasia

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI92601C (fi) 1992-03-11 1994-12-12 Marja Makarow Menetelmä hyötyproteiinien erittämiseksi hiivoista
US6639050B1 (en) * 1997-07-21 2003-10-28 Ohio University Synthetic genes for plant gums and other hydroxyproline-rich glycoproteins
US20030190740A1 (en) 1998-10-13 2003-10-09 The University Of Georgia Research Foundation, Inc Stabilized bioactive peptides and methods of identification, synthesis, and use
CA2412882A1 (en) 2000-06-30 2002-01-10 Maxygen Aps Peptide extended glycosylated polypeptides
US20020169125A1 (en) 2001-03-21 2002-11-14 Cell Therapeutics, Inc. Recombinant production of polyanionic polymers and uses thereof
US20060252120A1 (en) * 2003-05-09 2006-11-09 Kieliszewski Marcia J Synthetic genes for plant gums and other hydroxyproline-rich glycoproteins
JP2007529522A (ja) * 2004-03-15 2007-10-25 トリメリス，インコーポレーテッド ＨＩＶｇｐ４１由来ペプチドの部位特異的化学修飾
US8221969B2 (en) 2004-04-19 2012-07-17 Sanyo Chemical Industries, Ltd. Method of producing virus
AU2006208199B2 (en) 2005-01-25 2012-06-07 Cell Therapeutics, Inc. Conjugates of biologically active proteins having a modified in vivo half-life
EP1996937A4 (en) 2006-03-06 2009-04-08 Amunix Inc GENETIC PACKS AND USES THEREOF
DK2158211T3 (en) * 2007-05-31 2016-12-05 Medigene Ag Mutated structural protein of a parvovirus
PL2369005T3 (pl) * 2007-06-21 2013-10-31 Univ Muenchen Tech Białka czynne biologicznie o zwiększonej stabilności in vivo i(lub) in vitro
TW200936156A (en) * 2008-01-28 2009-09-01 Novartis Ag Methods and compositions using Klotho-FGF fusion polypeptides
MX2011008094A (es) 2009-02-03 2012-02-13 Amunix Operating Inc Polipeptidos recombinantes extendidos y composiciones que comprenden los mismos.
AU2010258892B2 (en) 2009-06-08 2015-08-13 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides and methods of making and using same
MX357674B (es) 2010-05-21 2018-07-18 Xl Protein Gmbh Polipeptidos biosinteticos de espira aleatoria de prolina/alanina y sus usos.

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