JP6073684B2

JP6073684B2 - 指向性バイオマーカーシグナル増幅のための新規の試薬

Info

Publication number: JP6073684B2
Application number: JP2012550095A
Authority: JP
Inventors: ゲイロード，ブレント，エス．; バーソロミュー，グレン，ピー．; バルドッチ，ラッセル，エー．; ホン，ジャニス，ダブリュー．; ホイスマン，ウィリアム，エイチ．; リャン，ヨンチャオ; グエン，トラン; トラン，ラン，ピー．; ホイーラー，ジーン，エム．; プラマー，エイドリアン，チャールズ，バーノン; ユッカート，フランク，ピーター
Original assignee: シリゲンセカンドリミテッド
Priority date: 2010-01-19
Filing date: 2011-01-19
Publication date: 2017-02-01
Anticipated expiration: 2031-01-19
Also published as: EP3981819C0; EP3981819A3; US11899018B2; JP2013517374A; ES2974909T3; US9139869B2; EP4322238A3; US20220283169A1; EP3981819B1; ES2977359T3; US10094838B2; US20190346450A1; US20140206557A1; US10955417B2; US20190204328A1; US20200378976A1; US20220276255A1; US11333666B2; US12111321B2; JP2015163718A

Description

相互参照
本出願は、２０１０年１月１９日に出願された米国仮特許出願第６１／２９６，３７９号および２０１０年６月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／３５８，４０６号（これらの出願は参照によって本明細書中に援用される）の利益を主張する。

発明の背景
蛍光ハイブリダイゼーションプローブは、ＤＮＡおよびＲＮＡの配列特異的検出における重要な手段となっている。付加された蛍光標識（または色素）によって発生されるシグナルはリアルタイムで監視することができ、生物学的標的および事象を検出するための簡単で高速、そして頑強な方法が提供され得る。マイクロアレイおよびリアルタイムＰＣＲから蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）まで様々な用途における実用性が示されている。

多発色団の分野、特に共役ポリマー（ＣＰ）に関する最近の研究では、このような方法の検出感度の大幅な改善においてこれらの材料が有する可能性が取り上げられている（Liu and Bazan, Chem. Mater., 2004）。これらの材料の集光構造を水溶性にして、種々のプローブ標識の蛍光出力を増幅するように適合させることができる（２００３年６月２０日に出願された米国特許出願第１０／６００，２８６号、およびGaylord, Heeger, and Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci.,2002 を参照、これらはいずれも参照によってその全体が本明細書中に援用される）。

このような結果は、核酸診断の分野において、特にサンプル量が乏しい場合に、ＣＰが非常に有望であることを示す。しかしながら、核酸標的を増幅（または複製）するための方法（すなわち、ＰＣＲ）は存在している。比較的に、タンパク質認識の分野では、標的材料を増幅するためのこのような簡単な方法は存在しない。従って、ＣＰの適用から生じるシグナルの増強は、この分野において非常に重要である。

色素標識抗体は、免疫組織化学、タンパク質アッセイ、ＥＬＩＳＡ試験、およびフローサイトメトリーなどの用途において、タンパク質標的の検出のために定型的に使用されている。このような方法論にＣＰ材料を組み込むと、このようなアッセイの性能の劇的な向上が提供される見込みがあり、従来の蛍光レポーター（例えば、色素）ではこれまで達成できなかった検出レベルが可能になる。

付加シグナル以上に、生物学的検出形式における他の重要な推進要素の１つは、同じ試験で多数の分析物を検出できること、すなわち多重化である。これは、一般に、種々の識別可能な波長で作用する蛍光レポーターを用いることにより達成される。ＣＰ材料は、理想的に、多重化の拡張のための基盤を提供するのに適している。これは、異なるＣＰの構造が異なる波長で作用するように調整することによって、あるいはポリマー−生体分子コンジュゲート（conjugate）内に色素を取り込むことによって達成することができる。

分子（核酸）およびイムノアッセイ形式の両方において、より高感度の生物学的アッセイを生じ、そして多重化を高めるための材料および方法が非常に所望されている。

発明の概要
本明細書では、式（Ｉ）：

の水溶性共役ポリマーが提供されており、式中、
Ｒはそれぞれ独立して、１０ｍｇ／ｍＬを超える水中の溶解度を付与することができる非イオン性側基であり、
ＭＵは、ポリマー主鎖に沿って均等またはランダムに分配されたポリマー修飾単位またはバンドギャップ修飾単位であり、場合により、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、（ＣＨ_２）_ｘ’（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙ’ＯＣＨ_３（ここで、ｘ’はそれぞれ独立して０〜２０の整数であり、ｙ’は独立して０〜５０の整数である）、またはＣ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール基から選択される１つまたは複数の場合により置換され得る置換基によって置換されていてもよく、
任意リンカーＬ_１およびＬ_２はそれぞれ、ポリマー主鎖に沿って均等またはランダムに分配されたアリールまたはヘテロアリール基であり、別の基質、分子または生体分子への共役のために、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基で終結された１つまたは複数のペンダント鎖によって置換されており、
Ｇ_１およびＧ_２はそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、アミン、カルバメート、カルボン酸、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、場合により置換され得るアリール、場合により置換され得るヘテロアリール、ハロゲン置換されたアリール、ボロン酸置換されたアリール、ボロン酸エステル置換されたアリール、ボロン酸エステル、ボロン酸、場合により置換され得るフルオレン、およびアリールまたはヘテロアリール（別の基質、分子または生体分子への共役のために、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基で終結された１つまたは複数のペンダント鎖によって置換されている）から選択され、
ここで、ポリマーは、別の分子、基質または生体分子への官能性共役（functional conjugation）を可能にするために、Ｇ_１、Ｇ_２、Ｌ_１またはＬ_２内に、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、およびチオールから選択される少なくとも１つの官能基を含み、
破線の結合− − − − − −はそれぞれ独立して、単結合、三重結合、または場合により置換され得るビニレン（−ＣＲ^５＝ＣＲ^５−）であり、ここで、Ｒ^５はそれぞれ独立して、水素、シアノ、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキルまたはＣ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール基であり、ここで、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキルまたはＣ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール基はそれぞれ、場合により、１つまたは複数のハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキニル基、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、またはＣ_１〜Ｃ_１２ハロアルキルによって置換されていてもよく、
ｎは、１〜約１０，０００の整数であり、そして
ａ、ｂ、ｃおよびｄは、均等またはランダムにそれぞれが繰り返され得る構造内の各単位のモル％を定義し、ａは１０〜１００％のモル％であり、ｂは０〜９０％のモル％であり、ｃおよびｄはそれぞれ０〜２５％のモル％である。

１つの態様では、式（Ｉ）の水溶性共役ポリマーは、式（Ｉａ）：

の構造を有し、式中、Ｒ、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｇ_１、Ｇ_２、ＭＵ、ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｎは、式（Ｉ）に対して既に記載されている。

いくつかの実施形態では、Ｒはそれぞれ独立して、（ＣＨ_２）_ｘ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙＯＣＨ_３（ここで、ｘはそれぞれ独立して０〜２０の整数であり、ｙはそれぞれ独立して０〜５０の整数である）、または場合により１つもしくは複数のハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、もしくは（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｚＯＣＨ_３（ここで、ｚはそれぞれ独立して０〜５０の整数である）によって置換されていてもよいベンジルである。いくつかの例では、Ｒはそれぞれ、（ＣＨ_２）_３（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_１１ＯＣＨ_３である。

他の実施形態では、Ｒはそれぞれ、少なくとも１つの（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_１０ＯＣＨ_３基で置換されたベンジルである。いくつかの例では、ベンジルは、２つの（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_１０ＯＣＨ_３基によって置換されている。他の例では、ベンジルは、３つの（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_１０ＯＣＨ_３基によって置換されている。

いくつかの実施形態では、任意リンカーＬ_１またはＬ_２は、構造：

（＊＝不飽和骨格への共有結合のための部位）
を有し、式中、Ｒ^３は独立して、水素、ハロゲン、アルコキシ（Ｃ_１〜Ｃ_１２）、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキルまたはＣ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール基であり、ここで、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキルまたはＣ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール基はそれぞれ、場合により、１つまたは複数のハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキニル基、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、またはＣ_１〜Ｃ_１２ハロアルキルによって置換されていてもよく、そしてｑは、０〜４の整数である。

他の実施形態では、任意リンカーＬ_１またはＬ_２は、構造：

（＊＝不飽和骨格への共有結合のための部位）
を有し、式中、Ａは、共役、鎖延長または架橋のための部位であり、−［Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２］_ｑ−Ｗ、または（Ｃ_１〜Ｃ_１２）アルコキシ−ＸまたはＣ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール、フェノキシ、アミド、アミノ、カルバメート、カルボキシレート、カルボネート、スルフィド、ジスルフィド、またはイミド基（別の基質、分子または生体分子への共役のために、アミン、カルバメート、カルボキシレート、カルボン酸、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基で終結される）であり、Ｗは、−ＯＨまたは−ＣＯＯＨであり、Ｘは、−ＮＨ_２、−ＮＨＣＯＯＨ、−ＮＨＣＯＯＣ（ＣＨ_３）_３、−ＮＨＣＯ（Ｃ_３〜Ｃ_１２）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル−Ｎ−マレイミド、または−ＮＨＣＯ［ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ］_ｔＮＨ_２であり、ｑは、１〜２０の整数であり、そしてｔは、１〜８の整数である。

さらに他の実施形態では、任意リンカーＬ_１またはＬ_２は、構造：

（＊＝骨格への共有結合のための部位）
を有し、式中、
Ｒ^２５はそれぞれ独立して、結合、Ｃ_１〜Ｃ_２０アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_２０アルコキシ、Ｃ_２〜Ｃ_２０アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_２０アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_２０シクロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_２０ハロアルキル、（ＣＨ_２）_ｘ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ（ＣＨ_２）_ｘ（ここで、ｘはそれぞれ独立して０〜２０の整数であり、ｐは独立して０〜５０の整数である）、アリール、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール、フェノキシ、アミド、アミノ、カルバメート、カルボキシレート、カルボネート、スルフィド、ジスルフィド、またはイミド基のいずれか１つまたはこれらの組み合わせであり、
ここで、少なくとも１つのＲ^２５は、別の基質、分子または生体分子への共役のために、アミン、カルバメート、カルボキシレート、カルボン酸、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基で終結される。

さらなる実施形態では、任意リンカーＬ_１またはＬ_２は、構造：

（＊＝不飽和骨格への共有結合のための部位）
を有し、式中、
Ｒ３５は、結合、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、Ｃ１〜Ｃ２０アルコキシ、Ｃ２〜Ｃ２０アルケン、Ｃ２〜Ｃ２０アルキン、Ｃ３〜Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ１〜Ｃ２０ハロアルキル、（ＣＨ２）ｘ（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｐ（ＣＨ２）ｘ（ここで、ｘはそれぞれ独立して０〜２０の整数であり、ｐは独立して０〜５０の整数である）、アリール、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール、フェノキシ、アミド、アミノ、カルバメート、カルボキシレート、カルボネート、スルフィド、ジスルフィド、またはイミド基のいずれか１つまたはこれらの組み合わせであり、別の基質、分子または生体分子への共役のために、アミン、カルバメート、カルボキシレート、カルボン酸、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基で終結される。

（＊＝不飽和骨格への共有結合のための部位）
を有するａ〜ｈからなる群から選択され、式中、
Ｒ’は独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、（Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル）ＮＨ_２、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、−［ＣＨ_２−ＣＨ_２］_ｒ’−Ｚ^１、もしくは（Ｃ_１〜Ｃ_１２）アルコキシ−Ｘ^１（ここで、Ｚ^１は−ＯＨまたは−ＣＯＯＨであり、Ｘ^１は−ＮＨ_２、−ＮＨＣＯＯＨ、−ＮＨＣＯＯＣ（ＣＨ_３）_３、−ＮＨＣＯ（Ｃ_３〜Ｃ_１２）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル−Ｎ−マレイミド、または−ＮＨＣＯ［ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ］_ｓ’（ＣＨ_２）_ｓ’ＮＨ_２であり、ｒ’は１〜２０の整数であり、そしてｓ’はそれぞれ独立して１〜２０の整数である）、（ＣＨ_２）_３（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｘ”ＯＣＨ_３（ここで、ｘ”は独立して０〜５０の整数である）、または場合により１つもしくは複数のハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、もしくは（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙ”ＯＣＨ_３（ここで、ｙ”はそれぞれ独立して０〜５０の整数である）によって置換されていてもよいベンジルであり、そしてＲ’はＲとは異なり、
ｋは、２、４、８、１２または２４であり、
Ｒ^１５は、構造：

（＊＝骨格への共有結合のための部位）
を有するｌ〜ｔからなる群から選択される。

またさらなる実施形態では、任意リンカーＬ_１またはＬ_２は、

である。

いくつかの実施形態では、Ｇ_１およびＧ_２はそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキン、場合により置換され得るアリール、場合により置換され得るヘテロアリール、ハロゲン置換されたアリール、ボロン酸置換されたアリール、ボロン酸エステル置換されたアリール、ボロン酸エステル、ボロン酸、場合により置換され得るフッ素、およびアリールまたはヘテロアリール（別の基質、分子または生体分子への共役のために、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基、分子または生体分子で終結された１つまたは複数のペンダント鎖によって置換されている）から選択される。

いくつかの実施形態では、Ｇ_１およびＧ_２はそれぞれ独立して、構造

を有し、式中、Ｒ^１１は、結合、Ｃ_１〜Ｃ_２０アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_２０アルコキシ、Ｃ_２〜Ｃ_２０アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_２０アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_２０シクロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_２０ハロアルキル、（ＣＨ_２）_ｘ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ（ＣＨ_２）_ｘ（ここで、ｘはそれぞれ独立して０〜２０の整数であり、ｐは独立して０〜５０の整数である）、アリール、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール、フェノキシ、アミド、アミノ、カルバメート、カルボキシレート、カルボネート、スルフィド、ジスルフィド、またはイミド基のいずれか１つまたはこれらの組み合わせであり、別の基質、分子または生体分子への共役のために、アミン、カルバメート、カルボキシレート、カルボン酸、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基で終結される。

他の実施形態では、Ｇ_１およびＧ_２はそれぞれ独立して、構造：

（＊＝骨格への共有結合のための部位）
を有する１〜３１からなる群から選択され、式中、Ｒ^１５は、構造：

を有するｌ〜ｔからなる群から選択され、
ｋは、２、４、８、１２または２４である。

さらなる実施形態では、Ｇ_１およびＧ_２は、場合により置換され得るアリールまたはヘテロアリールであり、ここで、任意置換基は、ハロゲン、アミン、カルバメート、カルボン酸、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、ボロン酸、ボロン酸ラジカル、ボロン酸エステル、および場合により置換され得るフルオレンから選択される。

いくつかの実施形態では、Ｇ_１およびＧ_２は同一である。他の実施形態では、Ｇ_１およびＧ_２は異なる。さらなる実施形態では、ポリマーは、ポリマー鎖のただ１つの終端Ｇ_１またはＧ_２において単一の共役部位を含有する。

またさらなる実施形態では、Ｇ_１およびＧ_２は、

または

である。

いくつかの実施形態では、ＭＵは、構造：

（＊＝不飽和骨格への共有結合のための部位）
を有するａ’〜ｋ’からなる群から選択され、式中、
Ｒは、１０ｍｇ／ｍＬを超える水中の溶解度を付与することができる非イオン性側基である。

いくつかの実施形態では、水溶性共役ポリマーは、式：

の構造を有し、式中、Ｇ_１またはＧ_２の少なくとも１つは官能性共役部位を含む。

いくつかの実施形態では、水溶性共役ポリマーは、式：

の構造を有し、式中、Ｌ_１は官能性共役部位を含む。

いくつかの実施形態では、水溶性共役ポリマーは、式：

他の実施形態では、ポリマーは、式：

の構造を有する。

他の実施形態では、ポリマーは、式：

の構造を有する。

他の実施形態では、ポリマーは、式：

の構造を有する。

他の実施形態では、ポリマーは、式：

の構造を有する。

他の実施形態では、ポリマーは、式：

の構造を有する。

他の実施形態では、ポリマーは、式：

の構造を有する。

他の実施形態では、ポリマーは、式：

の構造を有する。

他の実施形態では、ポリマーは、式：

の構造を有する。

いくつかの例では、シグナル伝達発色団は、ＮＨ_２基を介してポリマーに結合される。特定の例では、シグナル伝達発色団は、Cy3またはDylight 594色素である。特定の例では、リンカー、

は、ポリマー全体の約１０％である。他の例では、ポリマーは二次色素レポーターおよび抗体に共役される。

本明細書に記載される共役ポリマーのいくつかの実施形態では、ポリマーはさらに付加的な分子に共役される。いくつかの実施形態では、ポリマーは、ストレプトアビジン、抗体または核酸に共役され、直接的な蛍光レポーターとして使用される。特定の実施形態では、ポリマーは、ストレプトアビジンに共役される。他の実施形態では、ポリマーは、抗体のヒンジ領域のチオール基に共役される。さらに他の実施形態では、ポリマーは、ヘテロ二官能性リンカーにより修飾されたタンパク質において、アミン基に共役される。さらなる実施形態では、ポリマーは核酸に共役される。またさらなる実施形態では、ポリマーは抗体に共役される。特定の例では、ポリマーは、モノクローナル抗体、二次抗体または一次抗体に共役される。他の例では、ポリマー抗体コンジュゲートはフローサイトメトリーアッセイにおいて約４０５ｎｍで励起され、その際、特異的シグナルは、Pacific Blueに共役された同じ抗体よりも少なくとも３倍大きい。

本明細書に記載される共役ポリマーのいくつかの実施形態では、ポリマーはイオン交換クロマトグラフィによって精製される。他の実施形態では、ポリマーは、９５％以上純粋である。

本明細書に記載される共役ポリマーのいくつかの実施形態では、ポリマーは、異なる細胞マーカーまたは細胞型を同定するために、フローサイトメトリーアッセイにおいて使用される。他の実施形態では、ポリマーは、細胞を分類するために使用される。さらに他の実施形態では、ポリマーは、治療で使用するための細胞を分類するために使用される。

本明細書に記載される共役ポリマーのいくつかの実施形態では、ポリマーは、細胞内染色のために使用される。特定の例では、ポリマーは、異なる細胞マーカーまたは細胞型を同定するためにフローサイトメトリーアッセイにおいて使用される。

本明細書に記載される共役ポリマーのいくつかの実施形態では、ポリマーは、４０，０００ｇ／ｍｏｌよりも大きい最小数平均分子量と、純水またはリン酸緩衝食塩水溶液中の５０ｍｇ／ｍＬよりも大きい水溶性とを含む。

本明細書に記載される共役ポリマーのいくつかの実施形態では、ポリマーは、２つの独特の材料に共役することができる少なくとも２つの独特の共役リンカーを含む。

本明細書には、標的生体分子を含有する疑いのあるサンプルを提供するステップと、少なくとも１つのシグナル伝達発色団に共役され、標的生体分子または標的関連生体分子と相互作用することができるセンサータンパク質を提供するステップと、本明細書に記載される水溶性共役ポリマーを提供するステップと、センサータンパク質が標的生体分子または標的関連生体分子（存在すれば）に結合できる条件下でサンプルを溶液中でセンサータンパク質および共役ポリマーと接触させるステップと、共役ポリマーを励起させることができる光源をサンプルに適用するステップと、シグナル伝達発色団から光が放出されるかどうかを検出するステップとを含む、アッセイ法も提供されている。

いくつかの実施形態では、センサータンパク質は抗体である。他の実施形態では、センサータンパク質は、複数のシグナル伝達発色団に共役された複数のセンサータンパク質を含み、複数の発色団のうちの少なくとも２つは、多発色団からのエネルギー移動の際に異なる波長の光を放出する。

また、本明細書には、センサー生体分子、バイオコンジュゲートおよび標的生体分子からなる群から選択される少なくとも１つの生体分子に結合されたポリマーを含む共役ポリマー複合体も提供されており、ここで、ポリマーは、それに垂下する少なくとも１つのバイオコンジュゲーション部位によって共有結合されており、ポリマーはシグナル伝達発色団を含むか、あるいはシグナル伝達発色団は場合によりポリマーまたはセンサー生体分子に共有結合されていてもよく、ポリマーは、式：

の構造を含み、式中、
Ｒはそれぞれ、１０ｍｇ／ｍＬを超える水中の溶解度を付与することができる非イオン性側基であり、
ＭＵは、ポリマー主鎖に沿って均等またはランダムに分配されたポリマー修飾単位またはバンドギャップ修飾単位であり、場合により、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、（ＣＨ_２）_ｘ’（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙ’ＯＣＨ_３（ここで、ｘ’はそれぞれ独立して０〜２０の整数であり、ｙ’は独立して０〜５０の整数である）、またはＣ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール基から選択される１つまたは複数の場合により置換され得る置換基によって置換されていてもよく、
任意リンカーＬ_１およびＬ_２はそれぞれ、ポリマー主鎖に沿って均等またはランダムに分配されたアリールまたはヘテロアリール基であり、別の分子、基質または生体分子への共役のために、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基で終結された１つまたは複数のペンダント鎖によって置換されており、
Ｇ_１およびＧ_２はそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、アミン、カルバメート、カルボン酸、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、場合により置換され得るアリール、場合により置換され得るヘテロアリール、ハロゲン置換されたアリール、ボロン酸置換されたアリール、ボロン酸エステル置換されたアリール、ボロン酸エステル、ボロン酸、場合により置換され得るフルオレン、およびアリールまたはヘテロアリール（別の基質、分子または生体分子への共役のために、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基で終結された１つまたは複数のペンダント鎖によって置換されている）から選択され、
ここで、ポリマーは、別の分子、基質または生体分子への官能性共役を可能にするために、Ｇ_１、Ｇ_２、Ｌ_１またはＬ_２内に、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、およびチオールから選択される少なくとも１つの官能基を含み、
ｎは、１〜約１０，０００の整数であり、そして
ａ、ｂ、ｃおよびｄは、均等またはランダムにそれぞれが繰り返され得る構造内の各単位のモル％を定義し、ａは１０〜１００％のモル％であり、ｂは０〜９０％のモル％であり、ｃおよびｄはそれぞれ０〜２５％のモル％である。

いくつかの実施形態では、センサー生体分子は、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、アビジンＤＮ、およびアビジンＤからなる群から選択される。他の実施形態では、共役ポリマー複合体は、さらに、ビオチン標識抗体、ビオチン標識タンパク質、およびビオチン標識標的生体分子からなる群から選択される複合体に結合するように構成される。

さらなる実施形態では、センサー生体分子は抗体である。またさらなる実施形態では、シグナル伝達発色団およびセンサー生体分子はいずれも、複数のリンカーを介して多発色団に共有結合される。いくつかの他の実施形態では、シグナル伝達発色団およびセンサー生体分子はいずれも、ポリマー、シグナル伝達発色団およびセンサー生体分子に共有結合する中央連結部位を介してポリマーに共有結合される。さらに他の実施形態では、ポリマーまたはセンサー生体分子に共有結合される場合、シグナル伝達発色団は有機色素である。

また、本明細書には、
式（Ｉａ）：

の構造を有する水溶性共役ポリマーが提供されており、式中、
Ｒはそれぞれ独立して、（ＣＨ_２）_ｘ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙＯＣＨ_３（ここで、ｘはそれぞれ独立して０〜２０の整数であり、ｙは独立して０〜５０の整数である）、または場合により１つもしくは複数のハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、もしくは（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｚＯＣＨ_３（ここで、ｚはそれぞれ独立して０〜５０の整数である）によって置換されていてもよいベンジルであり、
任意リンカーＬ_１またはＬ_２はそれぞれ、構造

（＊＝不飽和骨格への共有結合のための部位）
を有するａ〜ｉからなる群から選択され、ここで、
Ｒ’は独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、（Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル）ＮＨ_２、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、−［ＣＨ_２−ＣＨ_２］_ｒ’−Ｚ^１、もしくは（Ｃ_１〜Ｃ_１２）アルコキシ−Ｘ^１（ここで、Ｚ^１は−ＯＨまたは−ＣＯＯＨであり、Ｘ^１は−ＮＨ_２、−ＮＨＣＯＯＨ、−ＮＨＣＯＯＣ（ＣＨ_３）_３、−ＮＨＣＯ（Ｃ_３〜Ｃ_１２）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル−Ｎ−マレイミド、または−ＮＨＣＯ［ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ］_ｓ’（ＣＨ_２）_ｓ’ＮＨ_２であり、ｒ’は１〜２０の整数であり、そしてｓ’はそれぞれ独立して１〜２０の整数である）、（ＣＨ_２）_３（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｘ”ＯＣＨ_３（ここで、ｘ”は独立して０〜５０の整数である）、または場合により１つもしくは複数のハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、もしくは（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙ”ＯＣＨ_３（ここで、ｙ”はそれぞれ独立して０〜５０の整数である）によって置換されていてもよいベンジルであり、そしてＲ’はＲとは異なり、
Ｒ^１５は、構造：

（＊＝骨格への共有結合のための部位）
を有するｌ〜ｔからなる群から選択され、ここで
ｋは、２、４、８、１２または２４であり、
ＭＵは、構造：

（＊＝不飽和骨格への共有結合のための部位）
を有するａ’〜ｋ’からなる群から選択されるポリマー修飾単位またはバンドギャップ修飾単位であり、ここで、
Ｒは１０ｍｇ／ｍＬを超える水中の溶解度を付与することができる非イオン性側基であり、
Ｇ_１およびＧ_２はそれぞれ独立して、構造：

を有する１〜３１からなる群から選択され、
ここで、ポリマーは、別の分子、基質または生体分子への官能性共役を可能にするために、Ｇ_１、Ｇ_２、Ｌ_１またはＬ_２内に、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、およびチオールから選択される少なくとも１つの官能基を含み、
ｎは、１〜約１０，０００の整数であり、そして
ａ、ｂ、ｃおよびｄは、均等またはランダムにそれぞれが繰り返され得る構造内の各単位のモル％を定義し、ａは１０〜１００％のモル％であり、ｂは０〜９０％のモル％であり、ｃおよびｄはそれぞれ０〜２５％のモル％である。

また、本明細書には、式：

の構造を有する水溶性共役ポリマーも提供されており、式中、Ａｒはアリールまたはヘテロアリールであり、場合により、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、（ＣＨ_２）_ｘ’（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙ’ＯＣＨ_３（ここで、ｘ’はそれぞれ独立して０〜２０の整数であり、ｙ’は独立して０〜５０の整数である）から選択される１つまたは複数の場合により置換され得る置換基によって置換されていてもよく、そして破線の結合、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｇ_１、Ｇ_２、ＭＵ、ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｎは、式（Ｉ）に対して既に記載されている。

参照による援用
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的かつ個別に参照によって援用されると示された場合と同程度に、参照によって本明細書中に援用される。

本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲において詳細に記載される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な記載および添付の図面を参照することによって得られるであろう。

本発明の一実施形態における共役ポリマーの結合の概略図である。本発明の一実施形態のバイオコンジュゲートポリマーの概略図である。（Ａ）抗体、（Ｂ）アビジン、（Ｃ）核酸、（Ｄ）色素、例えば発色団と共役された例示的な共役ポリマーの概略図である。（Ａ）色素標識抗体に共役されて、ＦＲＥＴをもたらすポリマー、（Ｂ）色素標識ストレプトアビジンに共役されて、ＦＲＥＴをもたらすポリマー、（Ｃ）共役ポリマーに共役された消光剤分子で標識された核酸プローブ配列、（Ｄ）消光剤分子共役ポリマー−色素タンデム複合体で標識された核酸プローブ配列の概略図である。標的生体分子または標的関連生体分子についてアッセイする種々の方法の概略図である。（Ａ）バイオコンジュゲートに連結された共役ポリマー、（Ｂ）一般的な標的を認識するポリマーおよび色素標識抗体、（Ｃ）色素および第２のバイオコンジュゲートの両方に共役されたセンサー生体分子、（Ｄ）いずれも核酸に共役された第２のバイオコンジュゲートおよびシグナル伝達発色団。ポリマー内の第２の連結部位の付加の概略図である。色素および生体分子に共役されたポリマー、および得られるエネルギー移動の概略図である。（Ａ）ポリマーはバイオコンジュゲートに共役され、（Ｂ）ポリマーはストレプトアビジンおよび色素に共役され、（Ｃ）ポリマーは核酸および色素に共役される。センサー生体分子または標的関連生体分子との間接的な関連の概略図である。（Ａ）共役ポリマーの共有結合コンジュゲートと相互作用するビオチン化抗体、（Ｂ）ビオチン化抗体共役ポリマー−色素タンデム複合体、（Ｃ）共役ポリマーの共有結合コンジュゲートと相互作用するビオチン化核酸、（Ｄ）ビオチン化核酸共役ポリマー−色素タンデム複合体、（Ｅ）共役ポリマーの共有結合コンジュゲートと相互作用する、ジゴキシゲニン（digoxygenin）部分を有する核酸、（Ｆ）ジゴキシゲニン部分を有する核酸共役ポリマー−色素タンデム複合体。二次抗体（）および一次抗体（Ｂ）に共役された例示的な共役ポリマーの概略図である。サンドイッチ型複合体の概略図である。（Ａ）ストレプトアビジンにバイオコンジュゲートされた共役ポリマー複合体、（Ｂ）標的タンパク質を直接探索するために使用されるビオチン標識一次抗体ｅ。１つまたは２つのフェニルキャッピング単位をフルオレンポリマーに付加する概略図である。代表例の論理デバイスを示すブロック図である。キットの代表例を示すブロック図である。ストレプトアビジンの共役ポリマーとの共役、および得られるコンジュゲート構造の概略図（上）、ならびにストレプトアビジン結合ＣＰを表すクーマシー染色アガロースゲル（下）である。ビオチン化ポリマー単独またはＣｙ５標識ストレプトアビジンに結合したビオチン化ポリマーの代表的なアクリルアミドゲルの描写である。ビオチン化ミクロスフェアに結合する図１４のストレプトアビジン結合共役ポリマーの概略図（上）、ならびに対照ビオチン化ミクロスフェアおよびストレプトアビジン共役ポリマーに結合したミクロスフェアの蛍光励起のプロットである。ビオチン化ミクロスフェアに選択的に結合した図１４のストレプトアビジン結合共役ポリマー、および共存されるストレプトアビジン−色素コンジュゲートにおける色素受容体へのエネルギー移動の概略図（上）、ならびにストレプトアビジン結合共役ポリマーから色素受容体へのエネルギー移動のプロット（下）である。ストレプトアビジン被覆ミクロスフェアに結合する図１４のビオチン化ポリマーの概略図（上）、ならびに対照ストレプトアビジン被覆ミクロスフェアおよびビオチン化ポリマーに結合したミクロスフェアの蛍光励起のプロットである。色素標識ストレプトアビジンコンジュゲートに結合する図１４のビオチン化ポリマーおよびＦＲＥＴの概略図（上）、ビオチン化ポリマーから２つの異なる色素受容体へのエネルギー移動のプロット（左下）、ならびにポリマー飽和の滴定プロット（右下）である。４４０ｎｍのポリマー−ストレプトアビジン−コンジュゲートによるCyto-trol細胞のＣＤ４マーキングのフローサイトメトリー分析である。（Ａ）（左から右へ）ＦＩＴＣ、Cy3、DyLight 594およびDyLight 633に共役された実施例３８ｂのポリマー構造、（Ｂ）その吸収最大値付近で励起される色素（DyLight 594）の蛍光（下側の曲線）および４０５ｎｍで励起されるポリマー−色素コンジュゲートの蛍光（上側の曲線）の比較、（Ｃ）基本ポリマー（色素なし、４２０ｎｍ付近のピーク発光）蛍光シグナルと、ポリマー−色素コンジュゲート（６２０ｎｍ付近のピーク発光）の蛍光シグナルとの比較である。全溶解血液サンプルにおけるモノクローナル抗体（抗ＣＤ４）コンジュゲートのフロー試験のプロットである。５９４ｎｍにおける色素の励起および３８０ｎｍにおけるポリマー−色素コンジュゲートの励起による、色素（DyLight 594）およびポリマー−色素コンジュゲートの蛍光のプロットである。ストレプトアビジン結合共役ポリマーによる蛍光イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）のプロットである。標的とハイブリッド形成したＤＮＡオリゴマー−ポリマーコンジュゲートの蛍光強度対温度のプロットである。遊離ポリマーを除去するためのポリマー抗体コンジュゲートのイオン交換クロマトグラム（左）および遊離抗体からの最終コンジュゲートの分離を示すＳＥＣクロマトグラムである。いずれのクロマトグラムにおいても、吸光度は、２８０ｎｍ（下側の曲線）および４０７ｎｍ（上側の曲線）で監視した。 Luminexアッセイにおけるサンドイッチイムノアッセイ（左）、ならびに共役ポリマーおよびＰＥストレプトアビジン検出コンジュゲートの両方の５３２ｎｍ励起を用いるLuminexシステムにおける対応する結果である。左側のデータは補正ビーズにより得られた結果を示し、右側のデータはヒト血液サンプルにおける４色アッセイからの結果を示す。（Ａ）および（Ｂ）は、共役ポリマーの二次抗体への共有結合の概略図である。蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）における共役ポリマーの概略図である。（Ａ）検出抗体に共有結合した共役ポリマー、（Ｂ）共役ポリマーに共有結合し、ビオチン化検出抗体と相互作用するビオチン結合タンパク質、（Ｃ）共役ポリマーに共有結合し、検出抗体と相互作用する二次抗体。（Ａ）共役ポリマーに共役された消光剤分子で標識された核酸プローブ配列の概略図、（Ｂ）共役ポリマー−色素タンデム複合体に共役された消光剤分子で標識された核酸プローブ配列の概略図である。 HybProbe検出技術の修正の概略図である。（Ａ）供与体プローブに共有結合した共役ポリマーおよび得られる受容体プローブへのエネルギー移動、（Ｂ）共役ポリマーが受容体プローブによって消光される、HybProbeアプローチの「シグナルオフ」修正。 Jurkat細胞（リンパ球細胞株）モデルにおける種々のポリマーの非特異的結合の比較（上）、純粋に非特異的結合（ＮＳＢ）により発生されたシグナルに関してポリマーをランク付けするプロット（下）である。 Jurkat細胞株を用いるフローサイトメトリー分析（ＢＤＬＳＲ−ＩＩサイトメーターにおいて４０５ｎｍ励起）から集められたヒストグラムであり、（左）非染色細胞および負の対照、アニオン性Ｐ４ポリマー、（中央）同じ細胞において試験された様々なポリマーおよびポリマー側鎖の組み合わせ、（右）中性ポリマーＰ２０（未処置の細胞からのオフセットをほとんど示さなかった）である。ポリマーＡＡ１との共役の程度の関数としてアビジンの相対移動度を示すゲル電気泳動である。 Superdex 200サイズ排除カラムにおける粗製ポリマー−アビジンコンジュゲート混合物の分画であり、（上）ＵＶ吸光度による画分の監視、（下）アビジンがポリマーに結合された程度を可視化するための、選択された画分のゲル電気泳動である。ストレプトアビジンに対して種々のモル過剰であるポリマーを用いて実施された共役反応のゲル電気泳動であり、（左）ＵＶ照射、（右）５３２ｎｍ励起である。実施例９に例示されるポリマー（Ｐ３０で示される）を用いたポリマーストレプトアビジンコンジュゲートの精製を示すプロットであり、（上）粗製サンプル、（下）精製したコンジュゲートである。

発明の詳細な説明
本発明をさらに詳細に説明する前に、記載される特定の方法、デバイス、溶液または装置は当然ながら異なり得るので、本発明はこのような方法論、デバイス、溶液または装置に限定されないことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであって、本発明の範囲を限定することは意図されないことも理解されるべきである。

単数形の「a」、「an」および「the」の使用は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の言及も含む。従って、例えば、「凝集センサー」への言及は複数の凝集センサーを含み、「プローブ」への言及は複数のプローブを含む、などである。さらに、「２つ」、「３つ」などの特定の複数の言及の使用は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、より大きい数の同じ対象と読み取られる。

「接続される（connected）」、「結合される（attached）」、「共役される（conjugated）」および「連結される（linked）」などの用語は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、直接および間接的な接続、結合、連結または共役を包含する。１つの例では、「共役ポリマー」という語句は、当該技術分野におけるその通常の意味に従って使用され、拡張された一連の不飽和結合を含有するポリマーを指し、そして文脈が指示するように、「共役される」という用語は、単なる直接または間接的な接続、結合または連結以上のものであると解釈されるべきである。

値の範囲が列挙される場合、列挙されるその範囲の上限と下限の間に介在する各整数値およびその各分数も、このような値の間の各部分範囲と共に明確に開示されると理解されるべきである。任意の範囲の上限および下限は独立してその範囲内に含まれてもよいし、その範囲から排除されてもよく、上限および下限のいずれかが含まれる、いずれも含まれない、両方が含まれる範囲もそれぞれ本発明に包含される。議論されている値が固有の限界を有する場合、例えば、成分が０〜１００％の濃度で存在し得る場合、または水溶液のｐＨが１〜１４の範囲であり得る場合、これらの固有の限界は具体的に開示される。値が明確に列挙される場合、列挙された値とほぼ同じ数または量である値も、それが基づく範囲と同様に、本発明の範囲内に含まれると理解されるべきである。組み合わせが開示される場合その組み合わせの要素の部分的な組み合わせもそれぞれ具体的に開示され、本発明の範囲内に含まれる。反対に、異なる要素または要素の群が開示される場合、これらの組み合わせも開示される。本発明の任意の要素が複数の代替物を有するとして開示される場合、各代替物が単独で排除または他の代替物との任意の組み合わせで排除された発明の例も本明細書に開示され、発明の２つ以上の要素がこのような排除を有することができ、このような排除を有する要素の全ての組み合わせは本明細書で開示される。

他に定義されない限り、または文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料はこれから記載される。

本明細書で言及される全ての刊行物は、その参考文献が引用された特定の材料および方法論を開示および説明するために、参照によって本明細書に援用される。本明細書で議論される刊行物は、本出願の出願日よりも前のその開示についてのみ提供される。本明細書中のものはどれも、本発明が従来の発明によるこのような開示に先行する権利がないと認めることである解釈されるべきではない。

定義
本発明の説明において、以下の用語が使用され得るが、以下に示されるように定義されることが意図される。

「アルキル」は、場合により１つまたは複数の位置で置換されていてもよい、１〜２４個の炭素原子を有する分枝状、非分枝状または環状の飽和炭化水素基を指し、多環式化合物を含む。アルキル基の例としては、場合により置換され得るメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル、ｎ−デシル、ヘキシルオクチル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルなど、ならびにシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、アダマンチル、およびノルボルニルなどのシクロアルキル基が挙げられる。「低級アルキル」という用語は、１〜６個の炭素原子、好ましくは１〜４個の炭素原子を有するアルキル基を指す。置換されたアルキル基における例示的な置換基としては、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、−ＮＯ_２、ハロゲン、ハロアルキル、ヘテロアルキル、カルボキシアルキル、アミン、アミド、チオエーテルおよび−ＳＨが挙げられる。

「アルコキシ」は「−Ｏアルキル」基を指し、ここでアルキルは、上記で定義した通りである。「低級アルコキシ」基は、１〜６個、より好ましくは１〜４個の炭素原子を含有するアルコキシ基を意図する。

「アルケニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含有し、場合により１つまたは複数の位置で置換されていてもよい、２〜２４個の炭素原子を有する分枝状、非分枝状または環状の炭化水素基を指す。アルケニル基の例としては、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル（アリル）、１−メチルビニル、シクロプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブテニル、１，４−ブタジエニル、シクロブテニル、１−メチルブタ−２−エニル、２−メチルブタ−２−エン−４−イル、プレニル、ペンタ−１−エニル、ペンタ−３−エニル、１，１−ジメチルアリル、シクロペンテニル、ヘキサ−２−エニル、１−メチル−１−エチルアリル、シクロヘキセニル、ヘプテニル、シクロヘプテニル、オクテニル、シクロオクテニル、デセニル、テトラデセニル、ヘキサデセニル、エイコセニル、テトラコセニルなどが挙げられる。本明細書において好ましいアルケニル基は、２〜１２個の炭素原子を含有する。「低級アルケニル」という用語は、２〜６個の炭素原子、好ましくは２〜４個の炭素原子を有するアルケニル基を意図する。「シクロアルケニル」という用語は、３〜８個、好ましくは５または６個の炭素原子を有する環状アルケニル基を意図する。置換されたアルケニル基における例示的な置換基としては、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、−ＮＯ_２、ハロゲン、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アミン、チオエーテルおよび−ＳＨが挙げられる。

「アルケニルオキシ」は「−Ｏアルケニル」基を指し、ここでアルケニルは、上記で定義した通りである。

「アルキルアリール」は、アリール基に共有結合したアルキル基を指す。好ましくは、アルキルは低級アルキルである。例示的なアルキルアリール基としては、ベンジル、フェネチル、フェノプロピル、１−ベンジルエチル、フェノブチル、２−ベンジルプロピルなどが挙げられる。

「アルキルアリールオキシ」は「−Ｏアルキルアリール」基を指し、ここでアルキルアリールは、上記で定義した通りである。

「アルキニル」は、少なくとも１つの−Ｃ／Ｃ−三重結合を含有し、場合により１つまたは複数の位置で置換されていてもよい、２〜２４個の炭素原子を有する分枝状または非分枝状の炭化水素基を指す。アルキニル基の例としては、エチニル、ｎ−プロピニル、イソプロピニル、プロパルギル、ブタ−２−イニル、３−メチルブタ−１−イニル、オクチニル、デシニルなどが挙げられる。本明細書において好ましいアルキニル基は、２〜１２個の炭素原子を含有する。「低級アルキニル」という用語は、２〜６個、好ましくは２〜４個の炭素原子と、１個の−Ｃ＝Ｃ−三重結合とを有するアルキニル基を意図する。置換されたアルキニル基における例示的な置換基としては、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、−ＮＯ_２、ハロゲン、ハロアルキル、ヘテロアルキル、アミン、チオエーテルおよび−ＳＨが挙げられる。

本明細書において言及される「抗体」は、最も広い意味で使用され、具体的には、選択された抗原に対する結合活性または親和性を示す限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多選択性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２およびＦｖ）を包含する。

「抗原」は、本明細書で使用される場合、免疫応答を誘発することができるあらゆる物質を指す。

「アミド」は、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”を指し、ここで、Ｒ’およびＲ”は、水素、アルキル、アリール、およびアルキルアリールから独立して選択される。

「アミン」は、−Ｎ（Ｒ’）Ｒ”基を指し、ここで、Ｒ’およびＲ”は、水素、アルキル、アリール、およびアルキルアリールから独立して選択される。

「アリール」は、共役π電子系を有する少なくとも１つの環を有する芳香族基を指し、炭素環式、複素環式、架橋および／または多環式アリール基を含み、場合により、１つまたは複数の位置で置換されていてもよい。典型的なアリール基は１〜５個の芳香環を含有し、これらは縮合および／または連結され得る。例示的なアリール基としては、フェニル、フラニル、アゾリル、チオフラニル、ピリジル、ピリミジル、ピラジニル、トリアジニル、ビフェニル、インデニル、ベンゾフラニル、インドリル、ナフチル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、ピリドピリジニル、ピロロピリジニル、プリニル、テトラリニルなどが挙げられる。場合により置換され得るアリール基における例示的な置換基としては、アルキル、アルコキシ、アルキルカルボキシ、アルケニル、アルケニルオキシ、アルケニルカルボキシ、アリール、アリールオキシ、アルキルアリール、アルキルアリールオキシ、場合により置換され得る縮合飽和または不飽和環、ハロゲン、ハロアルキル、ヘテロアルキル、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、スルホニル、−ＳＯ_３Ｒ、−ＳＲ、−ＮＯ_２、−ＮＲＲ’、−ＯＨ、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、−（ＣＨ_２）_ｎＣＯ_２Ｒまたは−（ＣＨ_２）_ｎＣＯＮＲＲ’が挙げられ、ここで、ｎは０〜４であり、ＲおよびＲ’は独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはアルキルアリールである。

「アリールオキシ」は「−Ｏアリール」基を指し、ここで、アリールは上記で定義した通りである。

「炭素環式」は、少なくとも１つの環を含有し、全ての環原子が炭素である、場合により置換され得る化合物を指し、飽和でも不飽和でもよい。

「炭素環式アリール」は、環原子が炭素である、場合により置換され得るアリール基を指す。

「ハロ」または「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードを指す。「ハロゲン化物」はハロゲンのアニオン形態を指す。

「ハロアルキル」は、１つまたは複数の位置でハロゲンにより置換されたアルキル基を指し、ただ１つのタイプのハロゲン原子によって置換されたアルキル基、ならびに異なるタイプのハロゲン原子の混合物によって置換されたアルキル基を含む。例示的なハロアルキル基としては、トリハロメチル基、例えばトリフルオロメチルが挙げられる。

「ヘテロアルキル」は、１つまたは複数の炭素原子および関連の水素原子が、場合により置換され得るヘテロ原子によって置換されたアルキル基を指し、ただ１つのタイプのヘテロ原子によって置換されたアルキル基、ならびに異なるタイプのへテロ原子の混合物によって置換されたアルキル基を含む。へテロ原子は、酸素、硫黄、および窒素を含む。本明細書で使用される場合、窒素へテロ原子および硫黄へテロ原子は、窒素および硫黄のあらゆる酸化形態、ならびに４つの共有結合を有する窒素のあらゆる形態（プロトン化形態を含む）を含む。場合により置換され得るヘテロ原子は、窒素原子に結合した１つまたは複数の水素の、アルキル、アリール、アルキルアリールまたはヒドロキシルによる置換を指す。

「複素環式」は、少なくとも１つのヘテロ原子を有する少なくとも１つの飽和または不飽和環を含有し、場合により１つまたは複数の位置で置換され得る化合物を指す。典型的な複素環式基は１〜５個の環を含有し、これらは縮合および／または連結されていてもよく、ここで、環はそれぞれ５個または６個の原子を含有する。複素環式基の例としては、ピペリジニル、モルホリニルおよびピロリジニルが挙げられる。場合により置換され得る複素環式基のための例示的な置換基は、環炭素においてはアルキルおよびアリールと同様であり、そしてへテロ原子においてはヘテロアルキルと同様である。

「複素環式アリール」は、少なくとも１つの芳香族環中に少なくとも１個のヘテロ原子を有するアリール基を指す。例示的な複素環式アリール基としては、フラニル、チエニル、ピリジル、ピリダジニル、ピロリル、Ｎ−低級アルキル−ピロロ、ピリミジル、ピラジニル、トリアジニル、テトラジニル、トリアゾリル、テトラゾリル、イミダゾリル、ビピリジル、トリピリジル、テトラピリジル、フェナジニル、フェナントロリニル、プリニル、ペリレン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、ベンゾチオジアゾール、ベンゾオキサジアゾール、チエノピラジンなどが挙げられる。

「ヒドロカルビル」は、分枝状、非分枝状および環状の種ならびに飽和および不飽和種を含む、１〜約２０個の炭素原子を含有するヒドロカルビル置換基を指し、例えば、アルキル基、アルキリデニル基、アルケニル基、アルキルアリール基、アリール基などである。「低級ヒドロカルビル」という用語は、１〜６個の炭素原子、好ましくは１〜４個の炭素原子を有するヒドロカルビル基を含む。

「置換基」は、炭素または窒素に結合した１つまたは複数の水素を置換する基を指す。例示的な置換基としては、アルキル、アルキリデニル、アルキルカルボキシ、アルコキシ、アルケニル、アルケニルカルボキシ、アルケニルオキシ、アリール、アリールオキシ、アルキルアリール、アルキルアリールオキシ、−ＯＨ、アミド、カルボキサミド、カルボキシ、スルホニル、＝Ｏ、＝Ｓ、−ＮＯ_２、ハロゲン、ハロアルキル、場合により置換され得る縮合飽和または不飽和環、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−ＳＯ_３Ｒ、−ＳＲ、−ＮＲＲ’、−ＯＨ、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、−（ＣＨ２）_ｎＣＯ_２Ｒまたは−（ＣＨ２）_ｎＣＯＮＲＲ’が挙げられ、ここで、ｎは０〜４であり、ＲおよびＲ’は独立して、Ｈ、アルキル、アリールまたはアルキルアリールである。また置換基は、炭素原子および１つまたは複数の関連の水素原子の、場合により置換され得るヘテロ原子による置換も含む。

「スルホニル」は−Ｓ（Ｏ）_２Ｒを指し、ここで、Ｒはアルキル、アリール、−Ｃ（ＣＮ）＝Ｃ−アリール、−ＣＨ_２ＣＮ、アルキルアリール、またはアミンである。

「チオアミド」は−Ｃ（Ｓ）ＮＲ’Ｒ”を指し、ここで、Ｒ’およびＲ”は、水素、アルキル、アリール、およびアルキルアリールから独立して選択される。

「チオエーテル」は−ＳＲを指し、ここで、Ｒはアルキル、アリール、またはアルキルアリールである。

本明細書で使用される場合、「結合対」という用語は、サンプル中の他の成分に対するよりも大きい親和性で互いに特異的に結合する第１および第２の分子を指す。結合対のメンバー間の結合は通常は非共有結合である。例示的な結合対としては、免疫学的結合対（例えば、対応する抗体またはその結合部分もしくは断片と組み合わせた任意のハプテンまたは抗原性化合物、例えば、ジゴキシゲニンおよび抗ジゴキシゲニン、フルオレセインおよび抗フルオレセイン、ジニトロフェノールおよび抗ジニトロフェノール、ブロモデオキシウリジンおよび抗ブロモデオキシウリジン、マウス免疫グロブリンおよびヤギ抗マウス免疫グロブリン）や、非免疫学的結合対（例えば、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジン、ホルモン［例えば、チロキシンおよびコルチゾール］−ホルモン結合タンパク質、受容体−受容体アゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、アセチルコリン受容体−アセチルコリンまたはその類似体）ＩｇＧ−タンパク質Ａ、レクチン−炭水化物、酵素−酵素補因子、酵素−酵素−阻害薬、ならびに核酸二重鎖を形成可能な相補的ポリヌクレオチド対）などが挙げられる。結合対のメンバーの一方または両方は、付加的な分子に共役され得る。

「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」という用語は、本明細書では交換可能に使用されて、任意の長さのヌクレオチドの重合体形態を指し、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、これらの類似体、またはこれらの混合物を含むことができる。これらの用語は、分子の一次構造のみを指す。従って、これらの用語は、三本鎖、二本鎖および一本鎖のデオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、ならびに三本鎖、二本鎖および一本鎖のリボ核酸（「ＲＮＡ」）を含む。また、例えばアルキル化および／またはキャッピングによるポリヌクレオチドの修飾された形態、ならびにポリヌクレオチドの非修飾形態も含まれる。これらの用語についてのさらなる詳細、ならびに塩基対形成の詳細については、２００６年１月３１日に出願された米国特許出願第１１／３４４，９４２号（参照によってその全体が本明細書中に援用される）において見出すことができる。

「相補的」または「実質的に相補的」は、ヌクレオチドまたは核酸の間、例えばセンサーペプチド核酸と標的ポリヌクレオチドとの間などで、ハイブリッド形成または塩基対を形成する能力を指す。相補的ヌクレオチドは、一般に、ＡおよびＴ（またはＡおよびＵ）、またはＣおよびＧである。２つの一本鎖ポリヌクレオチドまたはＰＮＡは、最適に整列および比較され、適切な挿入または欠失を有する一方のストランドの塩基が、他方のストランドの塩基の少なくとも約８０％、通常は少なくとも約９０％〜９５％、そしてより好ましくは約９８〜１００％と対を形成する場合に、実質的に相補的であると言われる。

あるいは、実質的な相補性は、ポリヌクレオチドまたはＰＮＡが選択的ハイブリダイゼーション条件下でその補体とハイブリッド形成をし得る場合に存在する。通常、選択的ハイブリダイゼーションは、少なくとも１４〜２５個の塩基配列にわたって少なくとも約６５％相補的、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９０％相補的である場合に生じ得る。M.Kanehisa Nucleic Acids Res.12:203(1984)を参照されたい。

「優先的結合」または「優先的ハイブリダイゼーション」は、１つのポリヌクレオチドまたはＰＮＡが、サンプル中の非相補的ポリマーと比較して、サンプル中のその補体に結合する傾向の増大を指す。

ポリヌクレオチドのためのハイブリダイゼーション条件は、通常、約１Ｍ未満の塩濃度、より一般には約５００ｍＭ未満、好ましくは約２００ｍＭ未満の塩濃度を含むであろう。ペプチド核酸とポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションの場合、ハイブリダイゼーションは、塩を少ししかまたは全く含有しない溶液中で行うことができる。ハイブリダイゼーション温度は５℃という低温でもあり得るが、一般的には２２℃よりも高く、より一般的には約３０℃よりも高く、好ましくは約３７℃を超える。より長い断片は、特異的ハイブリダイゼーションのためにより高いハイブリダイゼーション温度を必要とし得る。相補鎖の塩基組成および長さ、有機溶媒の存在、ならびに塩基のミスマッチの存在を含むその他の因子がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響することもあり、使用されるパラメータの組み合わせは、いずれか１つだけの絶対尺度よりも重要である。調節可能なその他のハイブリダイゼーション条件としては、緩衝液のタイプおよび濃度、溶液のｐＨ、反復配列などのバックグラウンド結合を低減するための遮断試薬または遮断タンパク質溶液の存在および濃度、洗剤のタイプおよび濃度、ポリヌクレオチドの相対濃度を増大させるポリマーなどの分子、金属イオンおよびその濃度、キレート剤およびその濃度、ならびに当該技術分野において知られている他の条件が挙げられる。

本明細書における「多重化」は、多数の分析物を同時にアッセイすることができるアッセイまたは他の分析方法を指す。

「有する（having）」は、「含む（comprising）」および「含む（including）」のように制約のない語句であり、付加的な要素が含まれる状況および付加的な要素が含まれない状況を含む。

「任意（optional）」または「場合により（optionally）」は、その後に記載される事象または状況が生じても生じなくてもよく、その記載が事象または状況が生じる場合および事象または状況が生じない場合を含むことを意味する。

本明細書において開示される実施形態は、一般に、他の分子や基質などへの共役（または結合）のための活性官能基を含有する共役ポリマー材料の組成に関する。特定の実施形態には、このような官能性部位の取り込みおよびそれに続く共役の特異的な調節を提供する方法および組成物が記載される。リンカーは、共役ポリマー鎖の一方もしくは両方の端部または内部に取り込まれ、重合で使用されるモノマーの比率によって調節され得る。このようなリンカーは同一でも異なっていてもよく、２つ以上の別個の実体が共役ポリマー構造に結合されることを可能にする。

さらなる実施形態には、活性共役部位を提供するだけでなく、非イオン性側鎖（形式電荷なし）の使用により可溶化される共役ポリマー組成物が記載される。このような実施形態は例外的な水溶性を示し、生物学的分子およびその他の一般的な生物学的アッセイ構成要素との最小限の相互作用を提供する。

本明細書において開示される実施形態はさらに、一般に、その独特の特性によって提供される増強されたシグナルによる標的生体分子または標的分子に関連する生体分子の同定のために有用な共役ポリマーを含むアッセイおよび複合体に関する。

特定の一般的な実施形態では、共役ポリマーは、生体分子、基質またはその他のアッセイ構成要素に結合される光学レポーターとしての機能を直接果たす。共役ポリマーは、励起されたときに従来の有機色素よりも大きいエネルギーを吸収することができる、拡張された集光構造として役立つ。次に、ポリマーは光を再放出し、これを検出または測定することができる。このような共役ポリマー複合体から発生されるシグナルは、他の蛍光レポーターから得られるよりも著しく大きいことが可能である。

他の実施形態では、１つの態様は、共役ポリマーから、ポリマーに結合された色素への、あるいはバイオコンジュゲートを含む生体分子（例えば、抗体、ストレプトアビジンまたは核酸配列）であり得るセンサーへのエネルギー移動を含む。このような実施形態では、共役ポリマーの励起およびその後のエネルギー移動の結果として増幅された色素シグナル（直接色素励起に対して）を観察することが一般的である。さらに、様々なエネルギーを有する様々な色素を使用して、多色または多重検出形式のための基礎を築くことが可能である。

特定の実施形態では、フローサイトメトリーおよび細胞選別アッセイにおける特異的細胞マーカーおよび細胞型の同定のために、中性共役ポリマーは抗体に結合される。他の実施形態では、共役ポリマーはさらに二次色素レポーターに結合される。さらなる実施形態では、ポリマーおよびポリマー−色素構造はモノクローナル抗体に結合される。

他の実施形態では、中性共役ポリマーは、種々のサンドイッチイムノアッセイにおいて使用するために、抗体に結合される。

一実施形態では、Gaylord, Heeger, and Bazan, J.Am.Chem.Soc., 2003に記載されるような核酸センサーアッセイに関して以下のように形式が修正されたアプローチに従うことができる。具体的には、共役ポリマーのシグナル増幅は結合事象に基づいており、ハイブリダイゼーション事象を示すことができる。確立された任意の共役ポリマーを供与体として選択することができ、１つまたは複数の色素、好ましくは効率的なエネルギー移動の履歴を有する色素、例えばフルオレセインおよびcy3を受容体として選択することができる。色素はセンサー分子に直接共役され得ることが想定される。図１に概略的に示されるように、センサーは溶液中または基質上の生体分子（例えば、抗体）であることができ、これに、共役ポリマーが付加され得る。図１に示される実施形態では、色素は、抗体（Ｙ型構造）に共有結合（バイオコンジュゲート）させることができ、これは、正味の負電荷を有する。共役ポリマー（波線で示される）の付加は、共役ポリマーと抗体との間に相互作用または結合をもたらし、共役ポリマーおよび色素を極めて接近させることができる。相互作用または結合は、任意の既知の方法（アビジン／ビオチン標識化を含むがこれに限定されない）によって達することができる。従って、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のための距離の必要条件を満たすことができ、光（ｈνで示される）によるポリマーの励起の結果、増幅された色素発光が生じる。色素が顕著な吸光度を有さない波長において共役ポリマーを励起させることができると想定される。一実施形態では、色素発光は、共役ポリマーの発光よりも長い波長で起こり得る。使用の際、アッセイ法は、標的生体分子を含有する疑いのあるサンプルを提供するステップと、シグナル伝達発色団に共役され、標的生体分子と相互作用することができるセンサーを提供するステップと、センサーと相互作用し、励起時にエネルギーをセンサーシグナル伝達発色団に移動させることができる共役ポリマーを提供するステップと、センサーが標的生体分子（存在すれば）に結合できる条件下でサンプルを溶液中でセンサーおよび共役ポリマーと接触させるステップとを含むことができると想定される。次に、方法は、共役ポリマーを励起させることができる光源をサンプルに適用するステップと、シグナル伝達発色団から光が放出されるかどうかを検出するステップとを含むことができる。

本明細書に開示されるように、共役ポリマーと色素標識抗体との間の相互作用または結合は、例えば生体分子標的の検出感度を増大させるための実行可能なアプローチであり得る。さらなる実施形態では、共役ポリマーと、色素、生体分子（例えば、抗体複合体）または両方との共有結合は、バックグラウンドの低下および／またはエネルギー移動の改善を含むいくつかの利点を提供する。生体分子への直接的な連結の場合、非特異的なポリマー相互作用または結合事象（図１において上記したものなど）ではなく生体認識事象が、共役ポリマーの存在を支配するはずである。このようにして、生体分子への共役ポリマーの非特異的結合を排除することができ、共役ポリマー自体から生じるバックグラウンド発光が低減される。上述の生体分子としては、タンパク質、ペプチド、親和性リガンド、抗体、抗体断片、糖、脂質、酵素および核酸（ハイブリダイゼーションプローブおよび／またはアプタマーとして）が挙げられるが、これらに限定されない。

一般に、別の態様では、本発明は、親和性リガンド（親和性リガンドは、別の生体分子に対する親和性を有する生体分子を示す）へのポリマーのバイオコンジュゲーションを含む。図２は、共役ポリマー（波線で示される）が色素、生体分子、または生体分子／色素複合体（Ｘで標識）に連結された類の材料を示す。共役ポリマーへの連結は、生体分子および／または色素（Ｘを参照）に連結された第２の官能性リンカーＡ’と共有結合することができるバイオコンジュゲーション部位として機能する共役ポリマー上の第１の官能性リンカーＡを介するものであり得る。この構成により、共役ポリマーとＸとの間の距離を固定することができ、それにより、ポリマーとＸとの間の特異的な相互作用のみが保証される。この実施形態の生体分子成分Ｘは、本明細書に開示される種々の生体分子（抗体、タンパク質、親和性リガンド、酵素または核酸を含むがこれらに限定されない）のいずれであってもよいことが想定される。

リンカーＡは、ポリマーの末端位置、反復サブユニットの内部、反復サブユニットの合間、またはこれらの任意の組み合わせを含む、共役ポリマー上のどこにあってもよい。同様に、リンカーＡ’は、生体分子および／または色素のどこに連結されてもよい。Ａ−Ａ’のための連結化学には、マレイミド／チオールと、チオール／チオールと、ピリジルジチオール／チオールと、ヨード酢酸スクシンイミジル／チオールと、Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＮＨＳエステル）、スルホジクロロフエノールエステル（ＳＤＰエステル）、またはペンタフルオロフェニル−エステル（ＰＦＰエステル）／アミンと、ビススクシンイミジルエステル／アミンと、イミドエステル／アミンと、ヒドラジンまたはアミン／アルデヒド、ジアルデヒドまたはベンズアルデヒドと、イソシアナート／ヒドロキシルまたはアミンと、炭水化物−過ヨウ素酸／ヒドラジンまたはアミンと、ジアジリン／アリールアジド化学と、ピリジルジチオール／アリールアジド化学と、アルキン／アジドと、カルボキシ−カルボジイミド／アミンと、アミン／Sulfo-SMCC（スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）／チオールと、アミン／ＢＭＰＨ（Ｎ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド・ＴＦＡ）／チオールとが含まれるが、これらに限定されない。

この文脈におけるＸは、色素、蛍光タンパク質、ナノマテリアル（例えば、量子ドット）、化学ルミネッセンス発生分子、色素および化学ルミネッセンス発生分子間のコンジュゲート、蛍光タンパク質および化学ルミネッセンス発生分子間のコンジュゲート、ナノマテリアル（例えば、量子ドット）および化学ルミネッセンス発生分子間のコンジュゲート、ストレプトアビジン、アビジン、酵素、酵素のための基質、酵素のための基質類似体、受容体、受容体のためのリガンド、受容体のためのリガンド類似体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾核酸、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、修飾核酸アプタマー、ペプチドアプタマー、抗体、抗原、ファージ、細菌、または上記の項目のいずれか２つのコンジュゲートであり得るが、これらに限定されないことが想定される。

別の態様では、本発明は、直接標識としての共役ポリマーの使用を含む。図３は、標識共役ポリマーの例を示す。一実施形態の図３Ａでは、ポリマー（包囲された六角形で示される）は、抗体（例えば、一次または二次抗体であり得る）に共役されて示されている。ポリマーおよび抗体のコンジュゲートは、直接レポーターとして、例えばアッセイにおいて使用することができる。付加的な実施形態では、ポリマーからのシグナルは他のアッセイ構成要素によって調節されないだけでなく、特異的な生体分子認識に応じて、検出時にアッセイにおけるその存在に依存する。光（図示せず）によるポリマーの励起はポリマーの発光をもたらすことができ、アッセイまたはアッセイ溶液中の抗体（一次または二次）の存在が示される。図３Ｂおよび３Ｃはさらに、特異的な標的および標的関連生体分子を検出することができる生体分子標識としての共役ポリマーの使用を例示する。図３Ｂには、ビオチン修飾された分子、生体分子または基質に結合することができるポリマーアビジン（ストレプトアビジン、neutraAvidinなど）コンジュゲートが描かれている。図３Ｃには、相補的な核酸配列とハイブリッド形成することができる核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなど）コンジュゲートが描かれている。標的生体分子または標的関連分子（図３に例示されるものなど）を認識することができる分子に対する蛍光共役ポリマーの連結または共役は、直接的な検出手段を提供する。付加的な実施形態では、共役ポリマーの励起から発生されるシグナルは、ポリマーに直接共役されるものを除く他のアッセイ構成要素によって調節される。このような実施形態では、ポリマー複合体は蛍光標識としての役割を直接果たしている。

図３Ｄに示される別の実施形態では、共役ポリマーは、色素、例えば発色団で標識される。この場合、エネルギー移動プロセスにおいて、共役ポリマーは供与体としての役割を果たし、色素は受容体としての役割を果たすことができる。ここで、共役ポリマーは集光体としての役割を果たすことができ、共役ポリマーの励起に続いて、エネルギー移動プロセス（ＦＲＥＴを含むがこれに限定されない）による色素への励起のチャネリングが起こる。この結果、色素発光が増幅される（色素の直接励起と比較して）。供与体共役ポリマーの蛍光は、一実施形態では、消光され得る（例えば、９０％よりも大きい消光）。これは、単なる例として、実施例３８に例示され、図２１に示されている。いくつかの例では、図３Ｄ（および本明細書に開示される類似の図面）の共役ポリマーは、ポリマー構造の内部または終端に位置し得る多数の色素の結合を有することができる（単に例示的な目的のためだけに単一の色素が示される）。

色素（図３Ｄ）または生体分子／色素複合体（図４に例示される）への直接的な連結の場合、供与体−受容体の距離は、相互作用または結合の強度に依存するのではなく、固定することができ、エネルギー移動効率は著しく増大され得る。これは、色素シグナル伝達（または消光）の改善と、供与体−受容体クロストークに関連するバックグラウンド蛍光の低下との関連で、重要な結果をもたらす。この場合のクロストークは、共役ポリマー（供与体）の発光ピークと色素（受容体）の発光ピークとの間の重複を指す。エネルギー移動のためには大きすぎる距離で非特異的に結合する共役ポリマーは、バックグラウンド蛍光（またはクロストーク）の一因となり得る。供与体と受容体との間のより短い（固定された）距離は、直接的な色素増幅を容易にできるだけでなく、単なる例として図２１に示されるように、供与体の発光を大幅に消光することができる。この結果、受容体の発光波長における供与体の発光が少なくなり、続いて、クロストーク補正の必要性が低減されるか、あるいはさらに、排除される。

さらなる実施形態では、共役ポリマーおよびシグナル伝達発色団の局在化は、認識事象によって、例えば２つの親和性対の結合によって、あるいは同じ標的分子または標的関連分子の同時認識によって一緒にされる（図５）。このような実施形態は、溶液ベースの形式で、あるいは要素の１つまたは複数が別の生体分子（細胞、組織、タンパク質、核酸など）または基質（ビーズ、ウェルプレート、表面、管など）に結合されたような配置で実施することができる。

一般に、別の態様では、本発明は、標的生体分子または標的関連生体分子についてアッセイする方法を含む。図５Ａに示されるように、一実施形態では、共役ポリマー（波線で示される）は、第２の色素−標識バイオコンジュゲート（例えば、一次抗体）に対して特異的な第１のバイオコンジュゲート（Ｙ型物体として示される）（例えば、二次抗体）に連結され得る。ここで、一次抗体と二次抗体との間の認識事象は、供与体共役ポリマーと受容体色素との間の距離の低減をもたらすであろう。図５Ｂに描かれる類似の実施形態では、ポリマーおよび色素標識抗体は共通の標的を認識する。これらの認識事象のいずれかの後、光（ｈνで示される）による供与体共役ポリマーの励起は、受容体色素へのエネルギー移動（例えば、ＦＲＥＴ）（湾曲した矢印で示される）をもたらし、増幅された色素発光（色素の直接励起と比較して）が観察されるであろう。使用の際、アッセイ法は、シグナル伝達発色団に共役され、標的生体分子と相互作用することができる第１のバイオコンジュゲート、例えば一次抗体を提供するステップによって、標的生体分子を含有する疑いのあるサンプルを提供することを含み得ることが想定される。この後、ポリマーに共役された第２のバイオコンジュゲート、例えば二次抗体または一次抗体が提供され、ここで、第２のバイオコンジュゲートは第１のバイオコンジュゲートまたは標的に結合することができ、そしてこのような結合の際、共役ポリマーの励起はエネルギーをシグナル伝達発色団に移動させることができる。次に、方法は、第１のバイオコンジュゲートが標的生体分子（存在すれば）に結合できる条件下でサンプルを溶液中で第１のバイオコンジュゲートと接触させることと、溶液を第２のバイオコンジュゲートと接触させることとを含む。方法は、次に、標的生体分子またはタグ付きの標的生体分子に光源（ここで、光源は共役ポリマーを励起させることができる）を適用することと、続いて、シグナル伝達発色団から光が放出されるかどうかを検出することとを含む。

別の態様では、本発明は、共役ポリマーおよびセンサー生体分子複合体を用いてサンプルをアッセイする方法を含む。図５ＣおよびＤに示されるように、ポリマー（波線で示される）は、第１のバイオコンジュゲート、例えばビオチンに対する強力な親和性を有するストレプトアビジン（ＳＡ）に共役され得る。図５Ｃにおいて、センサー生体分子（例えば、一次抗体または二次抗体であり得る抗体）は、色素および第２のバイオコンジュゲート（例えば、ビオチン部分）の両方に共役される。図５Ｄには、類似の実施形態が描かれており、ここで、第２のバイオコンジュゲート（例えば、ビオチン部分）およびシグナル伝達発色団はいずれも核酸に共役される。第１のバイオコンジュゲートと第２のバイオコンジュゲートとの間（例えば、ＳＡとビオチンとの間）の生体認識事象の後、共役ポリマーおよび色素は極めて接近させられ、供与体共役ポリマーの励起は、受容体色素へのエネルギー移動をもたらすであろう。色素発光は、第１のバイオコンジュゲート（例えば、抗体または核酸）の存在を示すであろう。色素の直接励起と比較して、エネルギー移動プロセス、例えばＦＲＥＴにより間接的に励起される場合、色素シグナル強度の増幅が観察されるであろう。

図５ＣおよびＤに示される実施形態を用いる方法は、標的生体分子を含有する疑いのあるサンプルを提供するステップと、共有結合した第１のバイオコンジュゲート（例えば、ＳＡ）を含む共役ポリマーを提供するステップと、標的分子と相互作用することができるセンサー生体分子、シグナル伝達発色団、および第１のバイオコンジュゲートと結合することができる共有結合した第２のバイオコンジュゲートを含むセンサー生体分子複合体を提供するステップとを含むことができ、このような結合の際、共役ポリマーの励起は、エネルギーをシグナル伝達発色団に移動させることができる。この方法は、さらに、センサー生体分子が標的生体分子（存在すれば）と結合できる条件下でサンプルをセンサー溶液中で生体分子複合体と接触させるステップと、溶液を共役ポリマーと接触させるステップと、共役ポリマーを励起させることができる光源をサンプルに適用するステップと、シグナル伝達発色団から光が放出されるかどうかを検出するステップとを含むことができる。

さらに、共役ポリマーは、２つ以上の種への共役または結合に適した付加的な連結部位を含有することができる。図６は、ポリマー内の第２の連結部位の付加を例示する。このようなリンカーＡおよびＢは、異なる種の直交共役（orthogonal conjugation）を可能にするために同一であっても異なっていてもよい。リンカーは、末端および内部位置を含む、ポリマー上のどこにあってもよい。Ａ−Ａ’およびＢ−Ｂ’（および場合により、Ｃ−Ｃ’、Ｄ−Ｄ’など）のための連結化学には、マレイミド／チオールと、チオール／チオールと、ピリジルジチオール／チオールと、ヨード酢酸スクシンイミジル／チオールと、Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＮＨＳエステル）、スルホジクロロフエノールエステル（ＳＤＰエステル）、またはペンタフルオロフェニル−エステル（ＰＦＰエステル）／アミンと、ビススクシンイミジルエステル／アミンと、イミドエステル／アミンと、ヒドラジンまたはアミン／アルデヒド、ジアルデヒドまたはベンズアルデヒドと、イソシアナート／ヒドロキシルまたはアミンと、炭水化物−過ヨウ素酸／ヒドラジンまたはアミンと、ジアジリン／アリールアジド化学と、ピリジルジチオール／アリールアジド化学と、アルキン／アジドと、カルボキシ−カルボジイミド／アミンと、アミン／Sulfo-SMCC（スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）／チオールと、アミン／ＢＭＰＨ（Ｎ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド・ＴＦＡ）／チオールとが含まれるが、これらに限定されない。市販のSulfo-SBEDのスルホスクシンイミジル［２−６−（ビオチンアミド）−２−（ｐ−アジドベンズアミド）−ヘキサノアミド］−エチル−１，３’−ジチオプロピオネートなどの三官能性リンカーは、Ｘ、Ｙ、および共役ポリマーの間の三方向の連結において十分に役立つことができる。

図６に示される実施形態では、ＸまたはＹは、色素、蛍光タンパク質、ナノマテリアル（例えば、量子ドット）、化学ルミネッセンス発生分子、色素および化学ルミネッセンス発生分子間のコンジュゲート、蛍光タンパク質および化学ルミネッセンス発生分子間のコンジュゲート、ナノマテリアル（例えば、量子ドット）および化学ルミネッセンス発生分子間のコンジュゲート、ストレプトアビジン、アビジン、酵素、酵素のための基質、酵素のための基質類似体、受容体、受容体のためのリガンド、受容体のためのリガンド類似体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾核酸、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、修飾核酸アプタマー、ペプチドアプタマー、抗体、抗原、ファージ、細菌、または上記の項目のいずれか２つのコンジュゲートであり得るが、これらに限定されない。

一般に、別の態様では、本発明は、標的生体分子を同定するためにポリマー、センサー生体分子およびシグナル伝達発色団を含む共役ポリマー複合体を提供する。図６に示されるように、一実施形態では、ポリマー（波線）は、リンカー官能性Ａ−Ａ’を介して色素Ｘに、そしてリンカー官能性Ｂ−Ｂ’を介して生体分子Ｙにバイオコンジュゲートされ得る。図７に描かれるように、一実施形態では、ポリマーは、色素および生体分子、例えば生体認識分子の両方にバイオコンジュゲートされ得る。有用な生体分子は、抗体（図７Ａ）、アビジン誘導体（図７Ｂ）親和性リガンド、核酸（図７Ｃ）、タンパク質、ナノ粒子または酵素のための基質を含むことができるが、これらに限定されない。ポリマーに近接して色素を共有結合する利点は上記で記載されている。受容体色素および生体認識分子の両方をポリマーに付けることによる利点は、受容体が供与体共役ポリマーの近くにあることが保証される（逆も同じである）ように供与体−受容体距離を固定することと、生体認識事象を示すためのポリマー結合の特異性を増大させることの両方によって２倍になる。これらの共有結合複合体は、本明細書に記載されるモノマー、ポリマーおよび連結化学によって作製することができる。

使用の際、図６に示される実施形態は標的生体分子を同定するための共役ポリマー複合体であり得るが、ここで、複合体には、共役ポリマー、共役ポリマーに共有結合されたシグナル伝達発色団、および共役ポリマーに共有結合されたセンサー生体分子が含まれる。複合体のシグナル伝達発色団は共役ポリマーの励起時に共役ポリマーからエネルギーを受け取ることができ、センサー生体分子は、標的生体分子と相互作用することができる。生体分子は抗体、タンパク質、親和性リガンド、ペプチド、または核酸を含むことができるが、これらに限定されないと想定される。

図７Ａに示される一実施形態では、ポリマーは、バイオコンジュゲート、例えば抗体（１次または２次）と、色素との両方に共役される。供与体共役ポリマーと受容体色素との間の共有結合は、近接を保証する。供与体共役ポリマーの励起は、受容体色素へのエネルギー移動、例えばＦＲＥＴをもたらす。バイオコンジュゲートが抗体である場合、抗体がその標的（例えば、抗原）に結合すれば、これは、供与体ポリマーの励起時に色素発光によって示されるであろう。代替の実施形態では、図７Ｂに示されるように、ポリマーは、ＳＡおよび色素の両方に共役され得る。再度、供与体共役ポリマーと受容体色素との共有結合は近接を保証し、供与体共役ポリマーの励起は、受容体色素へのエネルギー移動をもたらす。ＳＡ複合体を使用して、ビオチン化抗体または核酸などのビオチン標識生体分子を標識または検出することができる。ポリマー励起に続く色素標識へのエネルギー移動の結果、検出シグナルが大きく増強される（すなわち、より大きい感度）であろう。

図７Ａに例示される例は、色素受容体で標識され、さらに抗体に共役された共役ポリマーである。このタンデム配置は、図３Ａの構造について記載されるものと同様の形で使用することができるが、多くの場合、多重形式において検出のために二次シグナルを発生させる上で有用である。図７の共役ポリマー複合体は、ポリマー構造の内部または終端に位置し得る多数の色素の結合を有することができる（単に例示的な目的のためだけに単一の色素が示される）。

他の実施形態では、図３Ａおよび７Ａに示されるように、センサー生体分子、例えば一次抗体（Ｙ型）は、共役ポリマー（包囲された六角形）または共役ポリマー−色素タンデム複合体（垂下する包囲された星形を有する六角形）に共役され共有結合される。共役ポリマーが励起されると、共役ポリマー（図３Ａ）または色素（図７Ａ）からの発光はバイオ複合体の存在を示し、適切なアッセイ設計で拡張することによってセンサー分子により認識される標的の存在を示し、例えばアッセイにおいて、レポーターとしての使用が可能になるであろう。図２９Ａおよび２９Ｂは共役ポリマーの二次抗体への共有結合を有する比較例を表す。

代替の実施形態として、共役ポリマーは、センサー生体分子または標的関連生体分子と間接的に関連されてもよい。図８Ｃおよび８Ｄは、ビオチン部分（ドロップ型）に共有結合的に共役された配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ（波線）を示す。ここで、共役ポリマー（包囲された六角形）または共役ポリマー−色素タンデム複合体（垂下する包囲された星形を有する六角形）は、ビオチン認識タンパク質（例えば、アビジン、ストレプトアビジン、またはリガンドビオチンに対して高い特異親和性を有する類似のもの）に共有結合または共役される。図８Ａおよび８Ｂは、ビオチン認識タンパク質に対する共役ポリマー（図８Ａ）および共役ポリマー−色素タンデム複合体（図８Ｂ）の共有結合コンジュゲートと相互作用するビオチン化抗体を有する比較例を示す。標的関連生体分子と共役ポリマーとの間接的な関連は、ビオチンに仲介される相互作用に限定されない。図８ＥおよびＦは、ジゴキシゲニン部分（７角星形）によって共有結合的に標識された配列特異的オリゴヌクレオチド（波線）を表す。そして次に、ジゴキシゲニン部分は、共役ポリマー（図８Ｅ）および共役ポリマー−色素タンデム複合体（図８Ｆ）に共有結合した一次抗体によって認識されている。絵では示されていないが、共役ポリマー（または共役ポリマー−色素タンデム複合体）に共有結合したビオチン化抗体およびビオチン認識タンパク質、あるいは共役ポリマー（または共役ポリマー−色素タンデム複合体）に共有結合したジゴキシゲニンを認識する非標識一次抗体および適切な二次抗体を使用して、ジゴキシゲニンの間接的な検出を用いるさらなる実施形態が意図される。

多数のさらなる実施形態も共役ポリマーと受容体色素との間のエネルギー移動（例えばＦＲＥＴであるが、これに限定されない）に基づいている。多重化分析の可能性を考慮すると、共役ポリマーは、フルオレセイン、６−ＦＡＭ、ローダミン、Texas Red、California Red、iFluor 594、テトラメチルローダミン、カルボキシローダミン、カルボキシローダミン６Ｇ、カルボキシロドール（carboxyrhodol）、カルボキシローダミン１１０、Cascade Blue、Cascade Yellow、クマリン、Cy2（登録商標）、Cy3（登録商標）、Cy3.5（登録商標）、Cy5（登録商標）、Cy5.5（登録商標）、Cy7（登録商標）、Cy-Chrome、DyLight 350、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 594、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、DyLight 750、DyLight 800、フィコエリトリン、PerCP（ペリジニンクロロフィル−タンパク質）、PerCP-Cy5.5、JOE（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン）、NED、ROX（５−（および−６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、HEX、Lucifer Yellow、Marina Blue、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Alexa Fluor（登録商標）350、Alexa Fluor（登録商標）430、Alexa Fluor（登録商標）488、Alexa Fluor（登録商標）532、Alexa Fluor（登録商標）546、Alexa Fluor（登録商標）568、Alexa Fluor（登録商標）594、Alexa Fluor（登録商標）633、Alexa Fluor（登録商標）647、Alexa Fluor（登録商標）660、Alexa Fluor（登録商標）680、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸、BODIPY（登録商標）FL、BODIPY（登録商標）FL-Br₂、BODIPY（登録商標）530/550、BODIPY（登録商標）558/568、BODIPY（登録商標）564/570、BODIPY（登録商標）576/589、BODIPY（登録商標）581/591、BODIPY（登録商標）630/650、BODIPY（登録商標）650/665、BODPY（登録商標）R6G、BODIPY（登録商標）TMR、BODIPY（登録商標）TR、これらのコンジュゲート、およびこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、多数の色素またはシグナル伝達発色団に連結され得ることが想定される。これらの実施形態には、受容体色素がアッセイレポーターとしての機能を果たす上記の例の修正が含まれる（図３Ｄ、４Ｄ、７、８Ｂ、８Ｄ、８Ｅ、２９Ｂ（包囲された十角星形は色素を表す）に例示される）。

特定の実施形態では、図２〜１０、２９および３０に提供される共役ポリマーコンジュゲートは、フローサイトメトリー、細胞選別、分子診断、蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ポリメラーゼ鎖反応、顕微鏡（蛍光、共焦点、２二光子など）、ブロッティング（例えば、ノーザン、サザン、ウエスタン）、サイトミックビーズアレイ（cytomic bead array）（Luminex形式など）、蛍光免疫アッセイ（ＦＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、核酸配列決定およびマイクロアレイにおける使用が意図されるが、これらに限定されない。

また、ポリメラーゼ鎖反応、転写介在性（transcription-mediated）増幅、ローリングサークル（rolling circle）増幅、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅、ヘリカーゼ依存性（helicase dependent）増幅、および対数増幅後直線増幅（Linear-After-The-Exponential）ポリメラーゼ鎖反応などであるが、これらに限定されない核酸増幅技術と組み合わせて配列特異的蛍光プローブを用いて核酸の検出および定量化を増強するために共役ポリマーが使用される実施形態も想定される。

図３２は、HybProbe検出技術の修正を表す。図３２Ａにおいて、エネルギー移動供与体として従来使用されている色素は、供与体プローブ（より長いらせん波線で示される核酸標的との関連のために右側のらせん二本鎖として表される波状らせん構造）に共有結合された共役ポリマー（六角形の鎖）によって置換される。配列特異的ハイブリダイゼーションの際、供与体および受容体（供与体プローブと同様であるが、核酸標的の左側に表される）プローブは、十分に近接して、対象の標的核酸ストランド上に空間的に並置され、蛍光（fluors）間でエネルギー移動が生じるのを可能にする。励起エネルギーは共役ポリマーを介して伝達され、色素（包囲された十角星形）によって読取可能なシグナルとして放出され、核酸の定量化、検出および／または特徴付けを可能にする。増大されたテンプレートの存在はプローブ同時ハイブリダイゼーション事象の数の増大を可能にし、従って受容体色素からの特異的シグナルの増大と相関する。HybProbe実験において一般に使用される融解曲線（melt curve）技術と組み合わせて、配列多様性に相当する配列特異的情報は、適切に設計された実験において収集可能であり得ることが想定される。図３２Ｂは、HybProbeアプローチの「シグナルオフ」修正を表しており、ここで、共役ポリマーは、小分子蛍光消光剤（例えば、Black Hole Quenchers（商標）、Iowa Black（登録商標）またはDabsylであるが、これらに限定されない）からなる受容体プローブによって消光される。

別の実施形態では、図４Ｃおよび４Ｄに記載されるものと同様の共役ポリマーおよび共役ポリマー−色素タンデム複合体が、核酸標的の検出、定量化および／または特徴付けにおいて使用される。消光剤分子（黒丸、例えば、Black Hole Quenchers（商標）、Iowa Black（登録商標）またはDabsylであるが、これらに限定されない）で標識された核酸プローブ配列も共役ポリマー（図４Ｃおよび３１Ａ）および共役ポリマー−色素タンデム複合体（図４Ｄおよび３１Ｂ）に共役される。図４ＣおよびＤにおいて、標的配列の認識は、ハイブリダイゼーションと、共役ポリマーまたは共役ポリマー−色素タンデム複合体からの消光剤の分離とをもたらし、ポリマーの励起時に、蛍光シグナルの増大が生じる。図３１Ａおよび３１Ｂにおいて、核酸プローブコンジュゲートは相補的な標的配列にハイブリッド形成することができ、特異的酵素による処理によって、プローブ配列は切断されるかあるいはハイブリッド形成され、共役ポリマーまたは共役された共役ポリマー−色素タンデム複合体が消光剤から解放され、ポリマーの励起時に、蛍光シグナルの増大が生じる。図３１に記載される方法の最も一般的な例は、ヌクレアーゼ活性を含有するＤＮＡポリメラーゼ酵素の使用である（例えば、TaqMan PCRアッセイ）。

図９は、二次抗体（図９Ａ）および一次抗体（図９Ｂ）（抗体はＹ型構造で示される）に共役された共役ポリマー（六角形）の例を示す。アッセイにおいて、非標識一次抗体は、抗原、例えば標的タンパク質（黒色三角形で示される）に結合することができる。ポリマーに共役される二次抗体の付加は、一次抗体に特異的に結合することができる。洗浄して非結合の二次抗体を除去した後、そして適切な励起波長の光の適用時、ポリマー発光の観察は、特異的な結合を示す（図９Ａ）。他のアッセイ実施形態では、ポリマー−標識一次抗体は、黒色三角形で示される標的タンパク質に直接結合することができ、洗浄して非結合の一次抗体を除去した後、そして適切な励起波長の光の適用時、ポリマー発光の観察は、特異的な結合を示す（図９Ｂ）。場合により、一次抗体に共役されるか二次抗体に共役されるかに関わらず、ポリマーはさらに色素に共役されてもよい。このような場合、共役ポリマーの光学的励起の結果、色素へのエネルギー移動と、直接色素励起で生じる場合と比較して増幅された色素発光とが生じ得る。色素発光の観察は、特異的な結合を示す。

図１０は、本発明の一実施形態のサンドイッチ型複合体の一例を示す。図１０Ａに示されるアッセイにおいて、共役ポリマー複合体は、生体分子、例えばストレプトアビジン（Ｘ型）にバイオコンジュゲートされたポリマー（六角形で示される）で構成される。非標識一次抗体が、黒色三角形で示される標的（例えば、タンパク質）に結合した後、ビオチン標識二次抗体が一次抗体に特異的に結合する。別のステップでは、共役ポリマー複合体の付加は、ビオチンとストレプトアビジンとの間の特異的結合をもたらし得る。共役ポリマーの励起の結果、ポリマーの発光が生じ、標的タンパク質の存在が示されるであろう。さらに、別の実施形態において、ビオチン標識一次抗体は、標的タンパク質を直接探索するために使用され得る（図１０Ｂ）。この結合事象が生じた後、ストレプトアビジン−ポリマー複合体の付加は、ビオチンとストレプトアビジンとの間の特異的結合をもたらし、共役ポリマーの励起の結果、ポリマーの発光が生じ、標的タンパク質の存在が示されるであろう。場合により、ポリマーはさらに色素と共役されてもよい。このような場合、ポリマーの光学的励起の結果、色素の直接励起と比較して増幅された色素発光が生じ得る。色素の発光から生じるシグナルは、標的タンパク質の存在を示すであろう。

図３０は、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）における共役ポリマーの使用を取り巻く実例の実施形態を描く。図３０のパネルＡ〜Ｃにおいて、分析物抗原は、マイクロタイタープレートウェル、ビーズ粒子、ガラススライド、ラテラルフローストリップ、ラミナーフローデバイス、マイクロ流体デバイス、ウイルス、ファージ、組織または細胞表面を含むことができるがこれらに限定されない表面に固定されている。次に、分析物の分子は、標識検出コンジュゲートまたはセンサー生体分子の使用によって検出される。図３０Ａでは、検出抗体に共有結合された共役ポリマーが検出のために用いられる。図３０Ｂでは、共役ポリマーに共有結合されて、ビオチン化検出抗体と相互作用するビオチン結合タンパク質（例えば、アビジン、ストレプトアビジンまたはその他の高親和性ビオチン特異的誘導体であるが、これらに限定されない）が検出のために用いられる。図３０Ｃでは、共役ポリマーに共有結合されて、検出抗体と相互作用する二次抗体が検出のために用いられる。図５Ｂには、２つの別々の抗体がそれぞれ対象の抗原に結合する均質な溶液ベースの例も具体化される。一方の抗体は共役ポリマーに共有結合され、他方は色素に共有結合される。抗原に結合する場合、それぞれのフルオロフォアは、エネルギー移動が生じるように十分に空間的に近接される。図３０および図５Ｂの設計に基づくアッセイでは、サンプルは共役ポリマーの励起に適合された光で調べられ、色素の発光波長においてシグナルが報告される。図３０Ａ〜Ｃにおいて具体化される例では、ポリマー−色素タンデム複合体の使用がさらに開示される。このような場合、ポリマーの光学的励起は、色素の直接励起と比較して増幅された色素発光を生じ得る。色素の発光から生じるシグナルは、標的タンパク質の存在を示すであろう。

さらなる態様において、本発明は、多数の受容体に対する供与体のエネルギー移動の多重化を提供する。エネルギー移動システムにおいて供与体として共役ポリマーを用いることによって、利益は、多重化の能力も含む。単一の供与体がいくつかの色素にエネルギーを移動させることができ、従って、単一の励起源を用いて、多数の色素の強度を監視することができる。これは、細胞イメージング（すなわち、免疫組織化学）、フローサイトメトリーおよび細胞選別を含むがこれらに限定されない用途のために有用であり、この場合、異なるタイプの細胞をタンパク質−抗体認識事象によって監視することができる。

一実施形態では、２つの色素標識抗体が、生物学的材料、例えば培養細胞株、組織切片または血液サンプルと共にインキュベートされ得る。抗体は、その表面に標的タンパク質が発現された細胞を認識し、これらのタンパク質にのみ特異的に結合することができる。２つの抗体を異なる色素で標識化することによって、２つの異なるタンパク質または異なる細胞型の発現を同時に監視することが可能である。通常、これは、２回の走査、励起または画像（正しい励起波長によりそれぞれ１回）を必要とし得る。分析の前の最後のステップとして、これらの２回の画像またはデータセットはオーバーレイまたは結合されなければならないであろう。色素および共役ポリマーの両方に共役された抗体を使用することによって、共役ポリマーに対して１つの励起波長を使用して両方の色素を励起することができ、単一の画像または走査は、２つの抗体のそれぞれからのデータセットを含み得る。これは、任意の数の抗体の組み合わせによって行うことができるが、ただし得られるシグナルを分解するのに十分な能力を有するものとする。

本明細書に記載される発明は、口腔液サンプルのためのＦＤＡ承認ＨＩＶ診断テストであるOraSure Technologies, Inc.(Bethlehem, PA）により製造されるOraQuick Rapid HIV-1/2 Antibody Testを含むがこれらに限定されない多数の市販の試験のいずれかの感度を増大されるために使用可能であることが想定される。この試験は、わずか２０分で９９パーセントを超える精度でスクリーニング結果を提供することができる。

共役ポリマー
集光性共役ポリマー系は、近くの発光種のエネルギーを効率的に移動させることができる。エネルギー移動のメカニズムには、例えば、共鳴エネルギー移動（Forster（または蛍光）共鳴エネルギー移動、ＦＲＥＴ）、量子電荷交換（quantum charge exchange)（Dexterエネルギー移動）などが含まれる。しかしながら、通常、これらのエネルギー移動メカニズムは比較的短い範囲であり、効率的なエネルギー移動のためにはシグナル伝達発色団に対する集光性共役ポリマー系の近接が必要とされる。発光の増幅は、集光性共役ポリマー系の個々の発色団の数が多い場合に生じ、入射光（「ポンプ光」）が、集光性共役ポリマー系により吸収されてフルオロフォアに移動される波長である場合に、フルオロフォアがポンプ光により直接励起される場合よりも、フルオロフォアからの発光が強い可能性がある。

本発明で使用される共役ポリマーは、電荷中性であっても、カチオン性またはアニオン性であってもよい。いくつかの実施形態では、共役ポリマーはポリカチオン性共役ポリマーである。他の実施形態では、共役ポリマーはポリアニオン性共役ポリマーである。さらなる実施形態では、共役ポリマーは、種々の反復サブユニット中にカチオン性、アニオン性、および／または中性の基を含むことができる。さらに他の実施形態では、共役ポリマーは中性共役ポリマーである。いくつかの例では、共役ポリマーは、水溶液中の溶解性を付与する、エチレングリコールオリゴマー、エチレングリコールポリマー、ω−アンモニウムアルコキシ塩、および／またはω−スルホネートアルコキシ塩などの基を含有する。いくつかの例では、非イオン性側鎖を有する中性共役ポリマーは、水またはリン酸緩衝食塩水溶液中の溶解度が１０ｍｇ／ｍＬよりも大きく、特定の場合には、溶解度は５０ｍｇ／ｍＬよりも大きい。いくつかの実施形態では、共役ポリマーは、末端連結部位（例えば、キャッピング単位）、内部連結部位のいずれかまたは両方を含有する。

いくつかの実施形態では、共役ポリマーは、ポリマーに約４５０ｎｍ〜約１０００ｎｍの範囲の吸収を与えるタイプおよび量の「低バンドギャップ繰返し単位」を含むものである。低バンドギャップ繰返し単位は、重合前にこのような吸収を示しても示さなくてもよいが、共役ポリマー内に取り込まれるとその吸収を導入する。このような吸収特性によって、生物学的サンプルの分析およびイメージングならびに／または分子の検出を含む様々な設定において、ポリマーは、より少ないバックグラウンド蛍光を生じる波長で励起されることが可能になる。従って、共役ポリマーの吸光度をより低いエネルギーおよびより長い波長にシフトさせることにより、より高感度で頑強な方法が可能になる。さらに、多くの市販の機器は、このような問題を少なくともある程度回避するためにこのような波長で動作するイメージング部品を組み込んでいる。例えば、この領域で動作する、増幅反応中にリアルタイム検出を実施するサーマルサイクラーおよびマイクロアレイリーダーが入手可能である。この領域で吸収するポリマーを提供することにより、検出方法をこのような形式に適応させるができ、全く新しい方法を実施することが可能になる。

バンドギャップを低減する繰返し単位を取り込むことにより、このような特徴を有する共役ポリマーを生成することができる。このような波長の光を吸収するポリマーをもたらす、場合により置換さていてもよい例示的な種としては、２，１，３−ベンゾチアジアゾール、ベンゾオキシダゾール、ベンゾセレナジアゾール、ベンゾテルロジアゾール（benzotellurodiazole）、ナフトセレナジアゾール、４，７−ジ（チエン−２−イル）−２，１，３−ベンゾチアジアゾール、スクアライン色素、キノキサリン、ペリレン、ペリレンジイミド、ジケトピロロピロール、チエノピラジン低バンドギャップ市販色素、オレフィン、およびシアノ置換オレフィン、ならびにこれらの異性体が挙げられる。適切な共役ポリマーの組成、構造、特性および合成に関するさらなる詳細は、米国特許出願公開第２００６−０１８３１４０Ａ１号として現在公開されている、２００６年１月１０日に出願された米国特許出願第１１／３２９，４９５号（参照によって全体が本明細書中に援用される）において見出すことができる。

１つの態様では、式（Ｉ）：

の共役ポリマーが本明細書で提供されおり、式中、
Ｒはそれぞれ独立して、１０ｍｇ／ｍＬを超える水中の溶解度を付与することができる非イオン性側基であり、
ＭＵは、ポリマー主鎖に沿って均等またはランダムに分配されたポリマー修飾単位またはバンドギャップ修飾単位であり、場合により、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、（ＣＨ_２）_ｘ’（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙ’ＯＣＨ_３（ここで、ｘ’はそれぞれ独立して０〜２０の整数であり、ｙ’は独立して０〜５０の整数である）、またはＣ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール基から選択される１つまたは複数の場合により置換され得る置換基によって置換されていてもよく、
任意リンカーＬ_１およびＬ_２はそれぞれ、ポリマー主鎖に沿って均等またはランダムに分配されたアリールまたはヘテロアリール基であり、別の基質、分子または生体分子への共役のために、アミン、カルバメート、カルボン酸、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基で終結された１つまたは複数のペンダント鎖によって置換されており、
Ｇ_１およびＧ_２はそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、アミン、カルバメート、カルボン酸、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、場合により置換され得るアリール、場合により置換され得るヘテロアリール、ハロゲン置換されたアリール、ボロン酸置換されたアリール、ボロン酸エステル置換されたアリール、ボロン酸エステル、場合により置換され得るフッ素、およびアリールまたはヘテロアリール（別の基質、分子または生体分子への共役のために、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基、分子または生体分子で終結された１つまたは複数のペンダント鎖によって置換されている）から選択され、
ここで、ポリマーは、別の分子、基質または生体分子への官能性共役を可能にするために、Ｇ_１、Ｇ_２、Ｌ_１またはＬ_２内に、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、およびチオールから選択される少なくとも１つの官能基を含み、
破線の結合− − − − − −はそれぞれ独立して、単結合、三重結合、または場合により置換され得るビニレン（−ＣＲ^５＝ＣＲ^５−）であり、ここで、Ｒ^５はそれぞれ独立して、水素、シアノ、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキルまたはＣ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール基であり、ここで、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキルまたはＣ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール基はそれぞれ、場合により、１つまたは複数のハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキニル基、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、またはＣ_１〜Ｃ_１２ハロアルキルによって置換されていてもよく、
ｎは、１〜約１０，０００の整数であり、そして
ａ、ｂ、ｃおよびｄは、均等またはランダムにそれぞれが繰り返され得る構造内の各単位のモル％を定義し、ａは１０〜１００％のモル％であり、ｂは０〜９０％のモル％であり、ｃおよびｄはそれぞれ０〜２５％のモル％である。

水中の溶解性を付与することができる非イオン性側基は、本明細書で使用される場合、得られるポリマーを、目に見える微粒子を存在させずに水または水溶液中に可溶性にすることができる、帯電していない側基を指す。いくつかの実施形態では、Ｒはそれぞれ独立して、１０ｍｇ／ｍＬを超える、１５ｍｇ／ｍＬを超える、２０ｍｇ／ｍＬを超える、２５ｍｇ／ｍＬを超える、３０ｍｇ／ｍＬを超える、３５ｍｇ／ｍＬを超える、４０ｍｇ／ｍＬを超える、４５ｍｇ／ｍＬを超える、５０ｍｇ／ｍＬを超える、６０ｍｇ／ｍＬを超える、７０ｍｇ／ｍＬを超える、８０ｍｇ／ｍＬを超える、９０ｍｇ／ｍＬを超える、あるいは１００ｍｇ／ｍＬを超える水中の溶解度を付与することができる非イオン性側基である。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される共役ポリマーは、５，０００ｇ／ｍｏｌよりも大きい、１０，０００ｇ／ｍｏｌよりも大きい、１５，０００ｇ／ｍｏｌよりも大きい、２０，０００ｇ／ｍｏｌよりも大きい、２５，０００ｇ／ｍｏｌよりも大きい、３０，０００ｇ／ｍｏｌよりも大きい、４０，０００ｇ／ｍｏｌよりも大きい、５０，０００ｇ／ｍｏｌよりも大きい、６０，０００ｇ／ｍｏｌよりも大きい、７０，０００ｇ／ｍｏｌよりも大きい、８０，０００ｇ／ｍｏｌよりも大きい、９０，０００ｇ／ｍｏｌよりも大きい、あるいは１００，０００ｇ／ｍｏｌよりも大きい最小数平均分子量を含む。

いくつかの実施形態では、Ｒはそれぞれ独立して、（ＣＨ_２）_ｘ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙＯＣＨ_３（ここで、ｘはそれぞれ独立して０〜２０の整数であり、ｙはそれぞれ独立して０〜５０の整数である）、または場合により１つもしくは複数のハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、もしくは（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｚＯＣＨ_３（ここで、ｚはそれぞれ独立して０〜５０の整数である）によって置換されていてもよいベンジルである。いくつかの例では、Ｒはそれぞれ（ＣＨ_２）_３（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_１１ＯＣＨ_３である。

他の実施形態では、Ｒはそれぞれ独立して、少なくとも１つの（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｚＯＣＨ_３基によって置換されたベンジルであり、ここで、ｚはそれぞれ独立して０〜５０の整数である。いくつかの例では、Ｒはそれぞれ、少なくとも１つの（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_１０ＯＣＨ_３基によって置換されたベンジルである。他の例では、Ｒはそれぞれ、少なくとも２つの（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_１０ＯＣＨ_３基によって置換されたベンジルである。さらなる例では、Ｒはそれぞれ、少なくとも３つの（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_１０ＯＣＨ_３基によって置換されたベンジルである。

さらなる実施形態では、Ｒはそれぞれ独立して、

（＊＝共有結合のための部位）
であり、式中、ｋおよびｌは独立して、０〜２５の整数である。

またさらなる実施形態では、Ｒはそれぞれ独立して、場合により末端置換を有する１〜４世代の、ＰＡＭＡＭ、ＰＥＡ、ＰＥＨＡＭ、ＰＰＩ、三分枝状ベンゾエート、またはグリセロールのデンドリマーであり、前記場合による末端置換は、（− − − − −）（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｊＣＨ_３、または（− − − − −）（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｊＣＨ_３であり、ｊは０〜２５の整数であり、点線（− − − − −）はそれぞれ独立して、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、アミド、アミノ、アリール、（ＣＨ_２）_ｒ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｓ（ＣＨ_２）_ｒ（ここで、ｒはそれぞれ独立して０〜２０の整数であり、ｓは独立して０〜５０の整数である）、カルバメート、カルボキシレート、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、イミド、フェノキシ、またはＣ_４〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール基のいずれか１つまたはこれらの組み合わせから選択される。

代替の実施形態では、Ｒはそれぞれ独立して、

であり、式中、
ｋおよびｌは独立して０〜２５の整数であり、点線（− − − − −）はそれぞれ独立して、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、アミド、アミノ、アリール、（ＣＨ_２）_ｒ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｓ（ＣＨ_２）_ｒ（ここで、ｒはそれぞれ独立して０〜２０の整数であり、ｓは独立して０〜５０の整数である）、カルバメート、カルボキシレート、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、イミド、フェノキシ、またはＣ_４〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール基のいずれか１つまたはこれらの組み合わせから選択され、＊＝共有結合のための部位である。

代替の実施形態では、Ｒはそれぞれ独立して、

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される共役ポリマーは、任意リンカーＬ_１および／またはＬ_２を含有しない。他の実施形態では、共役ポリマーは、少なくとも約０．０１モル％、少なくとも約０．０２モル％、少なくとも約０．０５モル％、少なくとも約０．１モル％、少なくとも約０．２モル％、少なくとも約０．５モル％、少なくとも約１モル％、少なくとも約２モル％、少なくとも約５モル％、少なくとも約１０モル％、少なくとも約２０モル％、または約２５モル％の任意リンカーＬ_１および／またはＬ_２を含有する。いくつかの実施形態では、共役ポリマーは全体で最大５０モル％の任意リンカーＬ_１およびＬ_２を含有し、約４０モル％以下、約３０モル％以下、約２５モル％以下、約２０モル％以下、約１５モル％以下、約１０モル％以下、または約５モル％以下で含有してもよい。リンカーは、ポリマー主鎖に沿って均等またはランダムに分配され得る。

（＊＝不飽和骨格への共有結合のための部位）
を有し、式中、
Ｒ^３は独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキルまたはＣ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール基であり、ここで、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキルまたはＣ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール基はそれぞれ、場合により、１つまたは複数のハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキニル基、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、またはＣ_１〜Ｃ_１２ハロアルキルによって置換されていてもよく、そしてｑは０〜４の整数である。

いくつかの実施形態では、任意リンカーＬ_１またはＬ_２は：

（＊＝不飽和骨格への共有結合のための部位）
によって表される構造を有し、式中、
Ａは共役、鎖延長または架橋のための部位であり、−［Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２］_ｔ−Ｗ、または（Ｃ_１〜Ｃ_１２）アルコキシ−Ｘであり、
Ｗは、−ＯＨまたは−ＣＯＯＨであり、
Ｘは、−ＮＨ_２、−ＮＨＣＯＯＨ、−ＮＨＣＯＯＣ（ＣＨ_３）_３、−ＮＨＣＯ（Ｃ_３〜Ｃ_１２）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル−Ｎ−マレイミド、または−ＮＨＣＯ［ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ］_ｕＮＨ_２であり、
ｔは、１〜２０の整数であり、そして
ｕは、１〜８の整数である。

（＊＝不飽和骨格への共有結合のための部位）
を有するａ〜ｈからなる群から選択され、式中、
Ｒ’は独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、（Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル）ＮＨ_２、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、−［ＣＨ_２−ＣＨ_２］_ｒ’−Ｚ^１、もしくは（Ｃ_１〜Ｃ_１２）アルコキシ−Ｘ^１（ここで、Ｚ^１は−ＯＨまたは−ＣＯＯＨであり、Ｘ^１は−ＮＨ_２、−ＮＨＣＯＯＨ、−ＮＨＣＯＯＣ（ＣＨ_３）_３、−ＮＨＣＯ（Ｃ_３〜Ｃ_１２）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル−Ｎ−マレイミド、または−ＮＨＣＯ［ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ］_ｓ’（ＣＨ_２）_ｓ’ＮＨ_２であり、ｒ’は１〜２０の整数であり、そしてｓ’はそれぞれ独立して１〜２０の整数である）、（ＣＨ_２）_３（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｘ”ＯＣＨ_３（ここで、ｘ”は独立して０〜５０の整数である）、または場合により１つもしくは複数のハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、もしくは（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙ”ＯＣＨ_３（ここで、ｙ”はそれぞれ独立して０〜５０の整数である）によって置換されていてもよいベンジルであり、そしてＲ’はＲとは異なり、
Ｒ^１５は、構造：

（＊＝骨格への共有結合のための部位）
を有するｌ〜ｔからなる群から選択され、
ｋは２、４、８、１２または２４である。

特定の実施形態では、任意リンカーＬ_１またはＬ_２は、

である。

いくつかの実施形態では、Ｇ_１およびＧ_２は、場合により置換されていてもよいアリールであり、ここで、場合による置換基は、ハロゲン、アミン、カルバメート、カルボン酸、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、ボロン酸、ボロン酸ラジカル、ボロン酸エステルおよび場合により置換され得るフルオレンから選択される。

他の実施形態では、Ｇ_１およびＧ_２は同一である。さらなる実施形態では、Ｇ_１およびＧ_２は異なる。Ｇ_１およびＧ_２は、さらなる共役、架橋、またはポリマー鎖延長を可能にする活性化単位であってもよいし、あるいは非活性化末端単位であってもよい。

いくつかの実施形態では、Ｇ_１およびＧ_２は独立して、

（＊＝骨格への共有結合のための部位）
によって表される構造から選択され、式中、
Ｒ^１１は、結合、Ｃ_１〜Ｃ_２０アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_２０アルコキシ、Ｃ_２〜Ｃ_２０アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_２０アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_２０シクロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_２０ハロアルキル、（ＣＨ_２）_ｘ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ（ＣＨ_２）_ｘ（ここで、ｘはそれぞれ独立して０〜２０の整数であり、ｐは独立して０〜５０の整数である）、アリール、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール、フェノキシ、アミド、アミノ、カルバメート、カルボキシレート、カルボネート、スルフィド、ジスルフィド、またはイミド基のいずれか１つまたはこれらの組み合わせであり、別の基質、分子または生体分子への共役のために、アミン、カルバメート、カルボキシレート、カルボン酸、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基で終結される。

他の実施形態では、Ｇ_１およびＧ_２は独立して、構造：

（＊＝骨格への共有結合のための部位）
を有する１〜１８からなる群から選択され、式中、Ｒ^１５は、構造：

を有するｌ〜ｔからなる群から選択され、
ｋは２、４、８、１２または２４である。

さらなる実施形態では、Ｇ_１およびＧ_２は、

または

である。

いくつかの実施形態では、任意リンカーＬ_１および／またはＬ_２、Ｇ_１、および／またはＧ_２は、さらに、有機色素、生体分子または基質に共役され得る。共有結合は任意の既知の方法によって導入することができ、マレイミド／チオールと、チオール／チオールと、ピリジルジチオール／チオールと、ヨード酢酸スクシンイミジル／チオールと、Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＮＨＳエステル）、スルホジクロロフエノールエステル（ＳＤＰエステル）、またはペンタフルオロフェニル−エステル（ＰＦＰエステル）／アミンと、ビススクシンイミジルエステル／アミンと、イミドエステル／アミンと、ヒドラジンまたはアミン／アルデヒド、ジアルデヒドまたはベンズアルデヒドと、イソシアナート／ヒドロキシルまたはアミンと、炭水化物−過ヨウ素酸／ヒドラジンまたはアミンと、ジアジリン／アリールアジド化学と、ピリジルジチオール／アリールアジド化学と、アルキン／アジドと、カルボキシ−カルボジイミド／アミンと、アミン／Sulfo-SMCC（スルホスクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）／チオールと、アミン／ＢＭＰＨ（Ｎ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド・ＴＦＡ）／チオールとを伴う化学を含み得るが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、ＭＵは、構造：

（＝不飽和骨格への共有結合のための部位）
を有するａ’〜ｋ’からなる群から選択され、式中、
Ｒは、１０ｍｇ／ｍＬを超える水中の溶解度を付与することができる非イオン性側基である。非イオン性側基には、式（Ｉ）のポリマーに対して既に記載されたものが含まれる。

本明細書で使用される場合、いくつかの実施形態では、ペンダント鎖は、結合、Ｃ_１〜Ｃ_２０アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_２０アルコキシ、Ｃ_２〜Ｃ_２０アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_２０アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_２０シクロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_２０ハロアルキル、（ＣＨ_２）_ｘ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ（ＣＨ_２）_ｘ（ここで、ｘはそれぞれ独立して０〜２０の整数であり、ｐは独立して０〜５０の整数である）、アリール、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール、フェノキシ、アミド、アミノ、カルバメート、カルボキシレート、カルボネート、スルフィド、ジスルフィド、またはイミド基のいずれか１つまたはこれらの組み合わせであり、ポリマーを別の基質、分子、または生体分子への共役のための官能基と接続させる。

いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の共役ポリマーは、式（Ｉａ）：

の構造を有し、式中、Ｒ、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｇ_１、Ｇ_２、ＭＵ、ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｎは式（Ｉ）に対して既に記載されている。

さらなる態様では、式Ｉの共役ポリマーは、式（Ｉｂ）：

の構造を有し、式中、Ｇ_１またはＧ_２の少なくとも１つは、官能性共役部位を含む。

さらなる態様では、式Ｉの共役ポリマーは、式（Ｉｃ）：

の構造を有し、式中、Ｌ_１は官能性共役部位を含む。

さらなる態様では、式Ｉの共役ポリマーは、式（Ｉｄ）：

さらなる態様では、式Ｉの共役ポリマーは、式（ＩＩ）：

の構造を有し、式中、Ｌ_１、Ｇ_１、Ｇ_２、ａ、ｃ、ｎおよび破線の結合は、式（Ｉ）に対して既に記載されている。

いくつかの実施形態では、式（ＩＩ）の共役ポリマーは、式（ＩＩａ）：

の構造を有し、式中、Ｌ_１、Ｇ_１、Ｇ_２、ａ、ｃ、およびｎは、式（Ｉ）に対して既に記載されている。

さらなる態様では、式Ｉの共役ポリマーは、式（ＩＩＩ）：

いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩ）の共役ポリマーは、式（ＩＩＩａ）：

さらなる態様では、式Ｉの共役ポリマーは、式（ＩＶ）：

の構造を有し、式中、
Ｒ^５はそれぞれ独立して、水素、シアノ、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキルまたはＣ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール基であり、ここで、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキルまたはＣ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール基はそれぞれ、場合により、１つまたは複数のハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキニル基、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、またはＣ_１〜Ｃ_１２ハロアルキルによって置換されていてもよく、そして
Ｌ_１、Ｇ_１、Ｇ_２、ａ、ｃ、ｎおよび破線の結合は、式（Ｉ）に対して既に記載されている。

さらなる態様では、式Ｉの共役ポリマーは、式（Ｖ）：

また本明細書には、以下の式：

の構造を有するポリマーが提供されており、式中、
Ｇ_１およびＧ_２はそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、アミン、カルバメート、カルボン酸、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、場合により置換され得るアリール、ハロゲン置換されたアリール、ボロン酸置換されたアリール、ボロン酸エステル置換されたアリール、ボロン酸エステルおよび場合により置換され得るフルオレンから選択され、
Ｌは、結合、またはポリマー主鎖に沿って均等またはランダムに分配されたアリールもしくはヘテロアリール基であり、場合により、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、（ＣＨ_２）_ｘ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐＯＣＨ_３（ここで、ｘはそれぞれ独立して０〜２０の整数であり、ｐは独立して０〜５０の整数である）、またはＣ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール基から選択される１つまたは複数の場合により置換され得る置換基によって置換されていてもよく、
Ｌ^１、Ｌ^１’、Ｌ^２およびＬ^２はそれぞれ独立して、共有結合、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキレン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキレン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケニレン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキニレン、（Ｃ_６〜Ｃ_１８）アリール（Ｃ_１〜Ｃ_１２）アルキレン、（Ｃ_６〜Ｃ_１８）アリール（Ｃ_２〜Ｃ_１２）アルケニレン、（Ｃ_６〜Ｃ_１８）アリール（Ｃ_１〜Ｃ_１２）アルキニレン、Ｃ_６〜Ｃ_１８アリーレン基、−Ｙ_１−［Ｏ−Ｙ_２］_ｐ−、−Ｏ−Ｙ_１−［Ｏ−Ｙ_２］_ｐ−であり、ここで、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキレン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキレン、（Ｃ_６〜Ｃ_１８）アリール（Ｃ_１〜Ｃ_１２）アルキレン、またはＣ_６〜Ｃ_１８アリーレン基はそれぞれ、場合により、１つまたは複数のハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキニル基、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_１〜Ｃ_１２ハロアルキル、−Ｙ_１−［Ｏ−Ｙ_２］_ｐ−または−Ｏ−Ｙ_１−［Ｏ−Ｙ_２］_ｐ−によって置換されていてもよく、
ｑは、０または１〜８の整数であり、
ｐは、０または１〜２４の整数であり、
Ｙ_１およびＹ_２はそれぞれ独立して、共有結合、またはＣ_１〜１２アルキレン基、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキレン、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリーレン、（Ｃ_６〜Ｃ_１８）アリール（Ｃ_１〜Ｃ_１２）アルキレンであり、ここで、Ｃ_１〜１２アルキレン基、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキレン、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリーレン、（Ｃ_６〜Ｃ_１８）アリール（Ｃ_１〜Ｃ_１２）アルキレンはそれぞれ、場合により、１つまたは複数のハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケニル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキニル基、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、またはＣ_１〜Ｃ_１２ハロアルキルによって置換されていてもよく、
Ｅ^１およびＥ^１’はそれぞれ独立して、水素、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキル、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＳＨ、−ＳＲ、−ＳＨＲ^＋、ＳＲ_２ ^＋、−ＳＯ_３ ⁻、−ＰＯ_４ ⁻、Ｂｒ、−ＮＨ_２、−ＮＨＲ、−ＮＲ_２、−ＮＨ_３ ^＋、−ＮＨ_２Ｒ^＋、−ＮＨＲ_２ ^＋または−ＮＲ_３ ^＋であり、ここで、Ｒはそれぞれ独立して、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルおよび−ＳＨＲ^＋、ＳＲ_２ ^＋、−ＳＯ_３ ⁻、−ＰＯ_４ ⁻、−ＮＨ_３ ^＋、−ＮＨ_２Ｒ^＋、−ＮＨＲ_２ ^＋または−ＮＲ_３ ^＋（それぞれ場合により、関連の対イオンを有していてもよい）であり、そして
ｎは、１〜約１，０００の整数である。

また本明細書には、以下の式：

の構造を有するポリマーが提供されており、式中、
Ｒはそれぞれ独立して、Ｏ（ＣＨ_ｘ）、もしくは（ＣＨ_２）_３（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐＯＣＨ_３（ここで、ｘはそれぞれ独立して０〜２０の整数であり、ｐはそれぞれ独立して０〜５０の整数である）、または場合により１つまたは複数のハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、もしくは（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｍＯＣＨ_３（ここで、ｍはそれぞれ独立して０〜５０の整数である）によって置換されていてもよいベンジルであり、
Ｇ１は、水素、ハロゲン、アミン、カルバメート、カルボン酸、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、場合により置換され得るアリール、ハロゲン置換されたアリール、ボロン酸置換されたアリール、ボロン酸エステル置換されたアリール、ボロン酸エステルおよび場合により置換され得るフルオレンから選択され、そして
ｎは、１〜約１０，０００の整数である。

共役ポリマーの付加的な実施形態は、以下の実施例において記載されている。

共役ポリマーの調製
本明細書に記載される共役ポリマーの合成は、化学文献に記載される手段を用いて、本明細書に記載される方法方法を用いて、あるいはこれらに組み合わせて達成することができる。

本明細書に記載される共役ポリマーは、当業者に知られている標準的な合成技術を用いて、あるいは本明細書に記載される方法と組み合わせて当該技術分野において既知の方法を用いて合成することができる。さらに、本明細書において提示される溶媒、温度およびその他の反応条件は、当業者の習慣および知識に従って異なり得る。

式（１）の共役ポリマーおよび本明細書中に記載される先行のセクションで記載された構造を有するポリマーの合成のために使用される出発材料は、Aldrich Chemical Co.(Milwaukee,Wis.)、Sigma Chemical Co.(St.Louis,Mo.)などの商業的供給源から入手することもできるし、あるいは出発材料は合成することもできる。本明細書中に記載されるポリマー、および異なる置換基を有する他の関連のポリマーは、例えば、March,ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY 4^th Ed.(Wiley 1992)、Carey and Sundberg, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY 4^th Ed., Vols.A and B(Plenum 2000, 2001)、およびGreen and Wuts, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS 3^RD ED. (Wiley 1999)（これらは全て、参照によってその全体が援用される）などに記載されるように、当業者に知られている技術および材料を用いて合成することができる。本明細書に開示されるポリマーの調製のための一般的な方法は、当該分野において既知の反応から導くことができ、当業者によって認識されるように、反応は、本明細書で提供される式中に見出される種々の部分の導入のために、適切な試薬および条件の使用によって修正され得る、参考として、以下の合成方法が利用され得る。

一般に、フルオレン高分子構造の重合は、当業者に知られている重合技術を用いて、あるいは本明細書に記載される方法と組み合わせて当該技術分野において知られている方法を用いて達成することができる。例えば、重合は、市販のフルオレン−ジハライドモノマー、例えば２，７−ジブロモフルオレン、およびそのジボロン酸またはエステル誘導体を用いる鈴木カップリングにより達成することができる。

構造Ａ−１およびＡ−２は金属触媒により触媒されて、終結点の標識Ｙを有する例示的なポリマーＡ−３を形成する。Ｙはそれぞれ独立して、−Ｈ、−Ｂｒ、−Ｂ（ＯＨ）_２、またはボロン酸エステル、例えば４，４，５，５，−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラニルである。

フルオレン−ジハライドモノマーからのジボロン酸エステル誘導体の合成は、ビス（ピナコラト）ジボロンを用いる鈴木カップリングにより達成することもできる。

エチレングリコールオリゴマーまたはエチレングリコールポリマーなどの置換基は重合の前のモノマーに結合されても、重合後のポリマー自体に結合されてもよい。ｍＰＥＧ化（mPEGylated）基によって置換されたフルオレンモノマーを合成する例示的なスキームは、以下の通りである。

２，７−ジブロモフルオレン（Ｂ−１）および３−ブロモプロパノールは、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどの強塩基と、相間移動触媒（例えば、臭化テトラブチルアンモニウム）との存在下で加熱され、完結するまで反応されて、２，７−ジブロモ−９，９−ジ（３’−ヒドロキシプロパニル）フルオレン（Ｂ−２）を形成する。Ｂ−２の−ＯＨ基はピリジンの存在下で塩化トシルによりトシル化され、完結するまで反応させられ、２，７−ジブロモ−９，９−ジ（３’−メチルベンゼンスルホナトプロパニル）フルオレン（Ｂ−３）を形成する。次に、Ｂ−３は、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシドの存在下、ｍＰＥＧ（ｘ）アルコールと反応されて、ｍＰＥＧ鎖が結合されたＢ−４を形成する。ｍＰＥＧアルコールは、１〜５０のｍＰＥＧ鎖を有することができる。典型的なサイズとしては、ｍＰＥＧ５、ｍＰＥＧ８、ｍＰＥＧ１１、ｍＰＥＧ２４が挙げられるが、これらに限定されない。代替のスキームでは、ｍＰＥＧアルコールはまず塩化トシルによりトシル化され、次にＢ−２と反応されて、Ｂ−４を形成することができる。

例示的な構造Ｂ−４などの置換されたモノマーは、本明細書に開示されるスキームにおいてさらにジボロン酸エステルに誘導体化することができ、続いて鈴木カップリングなどによる重合のために使用することができる。高分子フルオレンは、有機金属触媒作用を伴う他の反応スキームの使用によって得ることもできる。例えば、山本反応は、例示的な構造Ｂ−４のようなハロゲン化アリールモノマーのホモカップリングのためにニッケル（０）ベースの触媒を使用する。さらに、共役ポリマーは、Stille、HeckおよびSonogashiraカップリング反応を用いて合成することができる。例えば、山本反応スキームについては、Yamamoto et al., Macromolecules 25:1214-1223, 1992、Kreyenschmidt et al.,Macromolecules 28:4577-4582, 1995、およびPei et al.,J.Am.Chem.Soc.118:7416-7417, 1996を参照されたい。また、Stille反応スキームについては、Leclerc, Polym.Sci.Part A:Polym.Chem. 39:2867-2873, 2001、Heck反応スキームについては、Mikroyannidis et al., J.Polym.Sci. Part A:Polym.Chem. 45:4661-4670, 2007、そしてSonogashira反応スキームについては、Sonogashira et al., Tetrahedron Lett. 16:4467-4470,1975およびLee et al., Org.Lett. 3:2005-2007, 2001を参照されたい。

リンカーおよびキャッピング単位は、前述と同様のメカニズムによってフルオレンポリマー骨格に共役され得る。例えば、キャッピング単位のブロモ−およびボロン酸エステルは、ポリマーの一方または両方の端部に付加するために使用され得る。キャッピング単位のブロモ−およびボロン酸エステルを両方用いると、ポリマーの両方の端部に付加し得る。一方の形態（キャッピング単位ブロモ−またはボロン酸エステルのいずれか）のみを用いると、そのそれぞれの補体で終結される端部のみに付加され、対称Ａ−Ａ＋Ｂ−Ｂ重合の場合、ポリマーの一端のみを統計的に修飾するために使用することができる。非対称性ポリマーの場合、このアプローチは、ポリマーが単鎖の終端において修飾されるだけであることを化学的に保証するために使用される。図１１は、鈴木カップリングを用いて、Ｙ端部を有する例示的なフルオレンポリマーと、ブロモベンゼン、フェニルボロン酸またはその両方を有する１つまたは複数のフェニル基とを付加させることを示す。

またキャッピング単位は、まずブロモ−キャッピング単位を、Ｙ端部を有するポリマーと反応させ、続いてポリマーをボロン酸エステルキャッピング単位と反応させることによって、非対称的に付加することもできる。例示的なブロモ−およびボロン酸エステルキャッピング単位としては、以下の構造：

が挙げられるが、これらに限定されない。

さらなるキャッピング単位は、本明細書中に記載される構造１〜３１、あるいは以下の実施例およびその結合のための方法において見出すことができる。

任意リンカーの共役ポリマー骨格中への取り込みは、さらに、２００７年１０月８日に出願され、米国特許出願公開第２００８／０２９３１６４号として公開された米国特許出願第１１／８６８，８７０号（この出願は、参照によってその全体が本明細書中に援用される）に記載されている。

所望される任意リンカーの取り込みは、二官能性モノマーに対する任意リンカーのモル比を変えることによって達成することができる。例えば、任意リンカーは、一定の割合の二官能性モノマーの１つを、対象の共役部位を含む同様の二官能性任意リンカーによって置換することによって取り込むことができる。ポリマー中に含まれる連結部位の数およびタイプは、重合反応において、任意リンカーに対するモノマーのフィード比によって調節される。フィード比を変えることによって、共役ポリマーは少なくとも約０．０１モル％のリンカーＬを含有することができ、少なくとも約０．０２モル％、少なくとも約０．０５モル％、少なくとも約０．１モル％、少なくとも約０．２モル％、少なくとも約０．５モル％、少なくとも約１モル％、少なくとも約２モル％、少なくとも約５モル％、少なくとも約１０モル％、少なくとも約２０モル％、または少なくとも約３０モル％を含有することができる。共役ポリマーは最大１００モル％のリンカーＬを含有することができ、約９９モル％以下、約９０モル％以下、約８０モル％以下、約７０モル％以下、約６０モル％以下、約５０モル％以下、または約４０モル％以下を含有することができる。リンカーは、ポリマー主鎖に沿って均等またはランダムに分配され得る。さらなる実施形態では、任意リンカーはさらに、得られるポリマーの、生体分子、第２のレポーターまたは他のアッセイ構成要素への共有結合を可能にすることができる。

代替の実施形態では、任意リンカーを取り込むために本明細書に記載される方法は、連結部位を有するキャッピング単位を導入する方法と組み合わせて使用されて、共役のための内部および末端連結部位の両方を有するポリマーが生じ得る。共役のための連結部位を有する任意リンカーおよび末端キャッピング単位を両方有するポリマーの非限定的な適用はポリマー−色素−生体分子タンデムコンジュゲートであり、ここで、ポリマーは、ＦＲＥＴなどにおける第２の色素受容体へのエネルギー移動供与体として使用され、従って、発光波長が対応する色素にシフトされる。

当業者は、以下の説明および非限定的な実施例の概説において、本開示の種々の合成および重合方法ならびに実施形態をさらに認識し得る。

抗原−抗体相互作用
抗原と抗体との間の相互作用は、他の非共有結合的なタンパク質−タンパク質相互作用の場合と同じである。一般に、抗原と抗体の間には４つのタイプの結合相互作用が存在する：（ｉ）水素結合、（ｉｉ）分散力、（ｉｉｉ）ルイス酸とルイス塩基の間の静電力、および（ｉｖ）疎水性相互作用。特定の物理的力は、抗原−抗体結合、例えば、異なる抗体結合部位を有するエピトープ形状の適合または優遇（complimentary）に寄与する。さらに、他の材料および抗原が抗体と交差反応し、それにより利用可能な遊離抗体が競合されることもある。

抗原と抗体の間の結合の親和定数および特異性の測定は、使用するのに最良の抗原および抗体調製物を評価するためだけでなく、基本的なイムノアッセイ設計が整えられた後に品質管理を維持するためにも、イムノアッセイの効力を決定する上で重要な要素である。

抗体
抗体分子は免疫グロブリンと呼ばれる血漿タンパク質のファミリーに属し、その基本的な構成要素である免疫グロブリンフォールドまたはドメインは、免疫系および他の生物学的認識系の多数の分子において種々の形態で使用される。典型的な免疫グロブリンは、可変領域として知られている抗原結合領域と、定常領域として知られている非可変領域とを含有する４つのポリペプチド鎖を有する。

天然の抗体および免疫グロブリンは、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は１つのジスルフィド共有結合によって重鎖に連結されるが、ジスルフィド連結の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。また重鎖および軽鎖はそれぞれ、規則的に離間された鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、多数の定常ドメインがそれに続く。各軽鎖は一端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、その他端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインと整列され、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列される。

重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには少なくとも五（５）つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらに、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３およびＩｇＧ−４、ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２に分類され得る。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元配置はよく知られている。抗体の構造、機能、使用および調製についてのさらなる詳細は、２００６年２月１４日に発行された米国特許第６，９９８，２４１号（その内容全体は、参照によって本明細書中に援用される）において論じられている。

サンドイッチアッセイ
抗体または多抗体サンドイッチアッセイは当業者に周知であり、１９８４年１２月４日に発行された米国特許第４，４８６，５３０号およびその中で言及される参考文献に開示されるものが含まれる。図６、７、８、９、１０および１４に記載される構造は、記載されるように直接使用することもできるし、あるいは実施例３７に記載されるものを含む種々のサンドイッチ配置において使用することもできる。サンドイッチ配置またはサンドイッチアッセイは、種々の生体分子およびレポート要素の層を構築して、特定の生体分子（例えば、標的生体分子または標的関連生体分）の存在をシグナル伝達するための、連続認識事象の使用を指す。これの標準的な例は、抗体の連続使用であり得る。これらのアッセイにおいて、一次抗体は標的に結合し、二次抗体は一次抗体に結合し、三次抗体は二次抗体に結合できる、などである。各連続層を用いて、付加的なレポート基を添加することができる。別の戦略は、２つ（またはそれ以上）の相互に認識可能な構成要素、または鎖認識関係にある３つ以上の要素（マルチマー構造の形態である構成要素の一方または両方を含む）の交互の層の繰り返しの付加を用いることである。このような設定では、マルチマー構造のそれぞれの１つまたは複数の官能基は、レポート基で標識することが可能であり、非占有官能基は、他の構成要素のための認識部位としての機能を果たし、続いて、この系はシグナル増幅のための基盤を提供し得る。このアプローチの典型的な例は、ストレプトアビジン−レポーターコンジュゲートおよびビオチン化抗ストレプトアビジン抗体の使用である。このようなアッセイでは、ビオチン化センサー分子（核酸または抗体）を使用して、標的生体分子を結合することができ、これは次に、ストレプトアビジン−レポーターコンジュゲートおよびビオチン化抗ストレプトアビジン抗体を含有する検出システムによって認識される。この場合のサンドイッチ構造は、シグナル増幅を達成するためにビオチン化抗体および標識ストレプトアビジン複合体相互作用の連続ラウンドによって構築することができる。ビオチン化抗体またはストレプトアビジンレポーター複合体のいずれかに対する共役ポリマーの付加的な共役により、シグナル出力をさらに増大することが可能である。本質的に、このタイプのシグナル増幅系に共役ポリマーを取り込むと、シグナルをより高いレベルまでさらに増幅することができる。

図６、７、８、９、１０、１４、１５、１６および１７に記載されるバイオコンジュゲートポリマー複合体を使用して、一般に用いられる認識要素中に集光性共役ポリマーを直接取り込むことによって、光学的に増強されたサンドイッチアッセイを形成することができる。共役ポリマーの共役構造の利点は、連続認識要素を必要とすることなく、一次標的認識要素に直接適用することもできる。例えば、一次抗体は、図１４に示されるように、ポリマー−色素複合体に直接共役させることができる。このような複合体は、標的生体分子の存在を直接探索するために使用することができる。

ポリヌクレオチド
増幅された標的ポリヌクレオチドは、増幅後処理を受けてもよい。例えば、いくつかの場合には、より接近しやすいセグメントを提供するために、ハイブリダイゼーションの前に標的ポリヌクレオチドを断片化することが望ましいこともある。核酸の断片化は、実施されているアッセイにおいて有用なサイズの断片を生じる任意の方法によって実行することができ、適切な物理的、化学的および酵素的方法が当該技術分野において知られている。

増幅反応は、増幅サイクルの少なくとも一部の間にセンサーポリヌクレオチドが増幅産物とハイブリッド形成できるようにする条件下で実施することができる。アッセイがこのようにして実施される場合、増幅中の発光を監視することによって、このハイブリダイゼーション事象のリアルタイム検出を行うことができる。

リアルタイムＰＣＲ産物分析（および関連のリアルタイム逆転写ＰＣＲ）により、様々な状況で使用されているリアルタイムＰＣＲ監視のために周知の技術が提供され、これは、本明細書に記載される方法と共に使用するように適合され得る（Laurendeau et al. (1999) “taqman PCR-based gene dosage assay for predictive testing in individuals from a cancer family with INK4 locus haploinsufficiency” Clin Chem 45(7):982-6、Laurendeau et al. (1999) “Quantitation of MYC gene expression in sporadic breast tumors with a real-time reverse transcription-PCR assay” Clin Chem 59(12):2759-65、およびKreuzer et al. (1999) “LightCycler technology for the quantitation of bcr/abl fusion transcripts” Cancer Research 59(13):3171-4（これらは全て参照によって援用される）を参照されたい）。

サンプル
原則として、サンプルは、共役ポリマー複合体の励起を引き起こすことができる標的生体分子（例えば、抗体、タンパク質、親和性リガンド、ペプチド、核酸など）を含有する疑いのある任意の材料であり得る。いくつかの実施形態では、サンプルは、生きている生物体から直接または間接的に得ることができる生体分子（細胞、組織または流体を含む）、ならびにウイルス、マイコプラズマ、および化石を含むその生物体によって残される沈着物を含む任意の生物学的材料源であり得る。サンプルは、全部または一部が合成手段によって調製された標的生体分子を含むこともできる。通常、サンプルは、主に水性の媒体として得られるか、あるいは主に水性の媒体中に分散される。サンプルの非限定的な例としては、血液、尿、精液、乳、痰、粘液、頬側スワブ、膣スワブ、直腸スワブ、吸引液、針生検、例えば手術または剖検によって得られる組織の切片、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚、呼吸器、腸、および泌尿生殖器の外分泌、涙、唾液、腫瘍、臓器、インビトロ細胞培養成分のサンプル（細胞培地中の細胞の増殖から得られる条件培地、推定的にウイルス感染した細胞、組換細胞、および細胞成分を含むが、これらに限定されない）、およびポリヌクレオチド配列を含む組換えライブラリーが挙げられる。

サンプルは、標的生体分子またはそのサロゲートを含有することが知られている正の対照サンプルであってもよい。標的生体分子を含有することが予期されないが、標的生体分子（１つまたは複数の試薬の汚染による）または偽陽性を生じることができる別の成分を含有する疑いのある負の対照サンプルも使用することができ、所与のアッセイにおいて使用される試薬の標的生体分子による汚染がないことを確認するため、および所与のアッセイ条件のセットが偽陽性（サンプル中に標的生体分子が存在しない場合でも正のシグナル）を生じるかどうかを決定するために試験される。

サンプルは希釈、溶解、分散、抽出、または別の方法で処理され、存在する任意の標的ポリヌクレオチドを可溶化および／または精製するか、あるいは増幅スキームで使用される試薬または検出試薬に到達可能にすることができる。サンプルが細胞を含有する場合、細胞を溶解または透過処理して、細胞内のポリヌクレオチドを放出することができる。一段階透過処理緩衝液を用いて細胞を溶解することができ、これは、例えばポリメラーゼ鎖反応などのさらなるステップが溶解後に直接実施されることを可能にする。

有機色素
有機色素は、シグナル伝達発色団およびフルオロフォアを含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達発色団またはフルオロフォアは、例えば、光学活性単位の励起状態から移動されたエネルギーを受け取るため、あるいは、標識プローブとエネルギー交換するため、あるいは多重エネルギー移動スキームにおいて使用され得る。本明細書に記載される本発明において有用なフルオロフォアは、適切な波長のエネルギーを吸収し、エネルギーを放出または移動させることができる任意の物質を含む。多重化アッセイの場合、検出可能に異なる発光スペクトルを有する複数の異なるフルオロフォアを使用することができる。典型的なフルオロフォアとしては、蛍光色素、半導体ナノ結晶、ランタニドキレート、および蛍光タンパク質が挙げられる。

例示的な蛍光色素としては、フルオレセイン、６−ＦＡＭ、ローダミン、Texas Red、テトラメチルローダミン、カルボキシローダミン、カルボキシローダミン６Ｇ、カルボキシロドール、カルボキシローダミン１１０、Cascade Blue、Cascade Yellow、クマリン、Cy2（登録商標）、Cy3（登録商標）、Cy3.5（登録商標）、Cy5（登録商標）、Cy5.5（登録商標）、Cy-Chrome、DyLight 350、DyLight 405、DyLight 488、DyLight 549、DyLight 594、DyLight 633、DyLight 649、DyLight 680、DyLight 750、DyLight 800、フィコエリトリン、PerCP（ペリジニンクロロフィル−タンパク質）、PerCP-Cy5.5、JOE（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン）、NED、ROX（５−（および−６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、HEX、Lucifer Yellow、Marina Blue、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Alexa Fluor（登録商標）350、Alexa Fluor（登録商標）430、Alexa Fluor（登録商標）488、Alexa Fluor（登録商標）532、Alexa Fluor（登録商標）546、Alexa Fluor（登録商標）568、Alexa Fluor（登録商標）594、Alexa Fluor（登録商標）633、Alexa Fluor（登録商標）647、Alexa Fluor（登録商標）660、Alexa Fluor（登録商標）680、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸、BODIPY（登録商標）FL、BODIPY（登録商標）FL-Br₂、BODIPY（登録商標）530/550、BODIPY（登録商標）558/568、BODIPY（登録商標）564/570、BODIPY（登録商標）576/589、BODIPY（登録商標）581/591、BODIPY（登録商標）630/650、BODIPY（登録商標）650/665、BODPY（登録商標）R6G、BODIPY（登録商標）TMR、BODIPY（登録商標）TR、これらのコンジュゲート、およびこれらの組み合わせが挙げられる。例示的なランタニドキレートとしては、ユウロピウムキレート、テルビウムキレートおよびサマリウムキレートが挙げられる。

様々な種類の蛍光半導体ナノ結晶（「ＳＣＮＣ」）が当該技術分野において知られており、半導体ナノ結晶を製造および使用する方法は、１９９９年５月２７日に公開された国際公開第９９／２６２９９号パンフレット（発明者Bawendiら）、Weissらに１９９９年１１月２３日に発行された米国特許第５，９９０，４７９号、およびBruchez et al., Science 281:2013, 1998に記載されている。ピーク発光波長が十分に確定された非常に狭い発光帯を有する半導体ナノ結晶を得ることができ、多数の異なるＳＣＮＣを同じアッセイで（場合により、他の非ＳＣＮＣタイプのシグナル伝達発色団と組み合わせて）シグナル伝達発色団として使用することが可能になる。

例示的なポリヌクレオチド特異的色素としては、アクリジンオレンジ、アクリジンホモダイマー、アクチノマイシンＤ、７−アミノアクチノマイシン（aminoactmomycin）Ｄ（７−ＡＡＤ）、９−アミノ−６−クロル−２−メトキシアクリジン（ACMA）、BOBO（商標）−１ヨージド（４６２／４８１）、BOBO（商標）−３ヨージド（５７０／６０２）、BO-PRO（商標）−１ヨージド（４６２／４８１）、BO-PRO（商標）−３ヨージド（５７５／５９９）、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、二塩酸塩（ＤＡＰＩ）、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、二塩酸塩（ＤＡＰＩ）、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、二乳酸塩（ＤＡＰＩ、二乳酸塩）、ジヒドロエチジウム（ヒドロエチジン）、ジヒドロエチジウム（ヒドロエチジン）、ジヒドロエチジウム（ヒドロエチジン）、臭化エチジウム、エチジウムジアジドクロリド、エチジウムホモダイマー−１（EthD-1）、エチジウムホモダイマー−２（EthD-2）、エチジウムモノアジドブロミド（ＥＭＡ）、ヨウ化ヘキシジウム、Hoechst 33258、Hoechst 33342、Hoechst 34580、Hoechst S769121、ヒドロキシスチルバミジン、メタンスルホネート、JOJO（商標）−１ヨージド（529/545）、JO-PRO（商標）−１ヨージド（530/546）、LOLO^（商標）−１ヨージド（565/579）、LO-PRO（商標）−１ヨージド（567/580）、NeuroTrace^（商標）435/455、NeuroTrace（商標）500/525、NeuroTrace（商標）515/535、NeuroTrace（商標）530/615、NeuroTrace（商標）640/660、OliGreen、PicoGreen（登録商標）ｓｓＤＮＡ、PicoGreen（登録商標）ｄｓＤＮＡ、POPO（商標）−１ヨージド（434/456）、POPO（商標）−３ヨージド（534/570）、PO-PRO（商標）−１ヨージド（435/455）、PO-PRO（商標）−３ヨージド（539/567）、ヨウ化プロピジウム、RiboGreen（登録商標）、SlowFade（登録商標）、SlowFade（登録商標）Light、SYBR（登録商
標）Green I、SYBR（登録商標）Green II、SYBR（登録商標）Gold、SYBR（登録商標）101、SYBR（登録商標）102、SYBR（登録商標）103、SYBR（登録商標）DX、TO-PRO（登録商標）-1、TO-PRO（登録商標）-3、TO-PRO（登録商標）-5、TOTO（登録商標）-1、TOTO（登録商標）-3、YO-PRO（登録商標）-1(オキサソ゛ールイエロー)、YO-PRO（登録商標）-3、YOYO（登録商標）-1、YOYO（登録商標）-3、TO、SYTOX（登録商標）Blue、SYTOX（登録商標）Green、SYTOX（登録商標）Orange、SYTO（登録商標）9、SYTO（登録商標）BC、SYTO（登録商標）40、SYTO（登録商標）41、SYTO（登録商標）42、SYTO（登録商標）43、SYTO（登録商標）44、SYTO（登録商標）45、SYTO（登録商標）Blue、SYTO（登録商標）11、SYTO（登録商標）12、SYTO（登録商標）13、SYTO（登録商標）14、SYTO（登録商標）15、SYTO（登録商標）16、SYTO（登録商標）20、SYTO（登録商標）21、SYTO（登録商標）22、SYTO（登録商標）23、SYTO（登録商標）24、SYTO（登録商標）25、SYTO（登録商標）Green、SYTO（登録商標）80、SYTO（登録商標）81、SYTO（登録商標）82、SYTO（登録商標）83、SYTO（登録商標）84、SYTO（登録商標）85、SYTO（登録商標）Orange、SYTO（登録商標）17、SYTO（登録商標）59、SYTO（登録商標）60、SYTO（登録商標）61、SYTO（登録商標）62、SYTO（登録商標）63、SYTO（登録商標）64、SYTO（登録商標）Red、ネトロプシン、ジスタマイシン、アクリジンオレンジ、３，４−ベンゾピレン、チアゾールオレンジ、TOMEHE、ダウノマイシン、アクリジン、ペンチル−TOTAB、およびブチル−TOTINが挙げられる。不斉シアニン色素がポリヌクレオチド特異的色素として使用されてもよい。他の対象の色素には、Geierstanger,B.H.and Wemmer, D.E., Annu.Rev. Vioshys.Biomol.Struct. 1995,24,463-493、Larson,C.J.and Verdine,G.L.,Bioorganic Chemistry:Nucleic Acids,Hecht, S.M.,Ed., Oxford University Press:New York, 1996, pp 324-346、およびGlumoff,T. and Goldman,A. Nucleic Acids in Chemistry AND Biology,2^nd ed., Blackburn, G.M. AND Gait,M.J.,Eds., Oxford University Press:Oxford, 1996, pp375-441によって記載されるものが含まれる。ポリヌクレオチド特異的色素は挿入色素であってもよく、二本鎖ポリヌクレオチドに特異的であってもよい。

「蛍光タンパク質」という用語は、光を吸収および放出することが知られているタイプのタンパク質を含む。より一般的に使用されるこのような材料の種類の１つは、フィコビリンタンパク質である。例としては、フィコエリトリン（ＰＥおよびＲ−ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）およびPerCPが挙げられるが、これらに限定されない。その他の種類には、緑色蛍光タンパク質および関連のバージョンがある。

「緑色蛍光タンパク質」という用語は、天然のAequorea緑色蛍光タンパク質と、変更された蛍光特性（変更された励起および発光最大値、ならびに異なる形状の励起および発光スペクトルを含む）を示すことが確認されいている変異型との両方を指す（Delagrave,S. et al. (1995) Bio/Technology 13:151-154、Heim,R. et al. (1994) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 91:12501-12504、Heim,R.et al. (1995) Nature 373:663-664）。Delgraveらは、赤方偏移（red-shifted）した励起スペクトルを有するクローン化オワンクラゲ（Aequorea victoria）ＧＦＰの変異体を単離した（Bio/Technology 13:151-154(1995)）。Heim,R.らは、青色蛍光を有する変異体（Ｔｙｒ６６がＨｉｓに変異）について報告した（Proc.Natl.Acad.Sci. (1994) USA 91:12501-12504）。

基質
いくつかの実施形態では、アッセイ構成要素は、基質上に位置することができる。基質は、生物学的、非生物学的、有機、無機、またはこれらのどれかの組み合わせのどれでもよい広範な材料を含むことができる。例えば、基質は、重合されたLangmuir Blodgett膜、機能性ガラス、Ｓｉ、Ｇｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＳｉＯ_２、ＳｉＮ_４、変性ケイ素、または様々な種類のゲルまたはポリマー（例えば、（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンジフルオリド、ポリスチレン、架橋ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（ラクチドコグリコリド）、ポリ酸無水物、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチレン−ｃｏ−酢酸ビニル）、ポリシロキサン、高分子シリカ、ラテックス、デキストランポリマー、エポキシ、ポリカーボネート、またはこれらの組み合わせなど）のいずれか１つであり得る。導電性ポリマーおよび光伝導性材料を使用することもできる。

基質は、シリカベースの基質（例えば、ガラス、石英など）などの平面の結晶性基質であっても、例えば半導体およびマイクロプロセッサ産業において使用される、ケイ素、ガリウムヒ素、インジウムドープＧａＮなど結晶性基質であってもよく、半導体ナノ結晶を含む。

基質は、光ダイオード、光電子半導体チップまたは光電子薄膜半導体などの、光電子センサー、またはバイオチップの形態をとることができる。基質上のプローブの位置は、アドレス指定可能であり得る。これは高密度形式で行うことができ、その位置は、マイクロアドレス指定可能またはナノアドレス指定可能であり得る。

シリカエーロゲルも基質として使用することができ、当該技術分野において既知の方法によって調製することができる。エーロゲル基質は、自立基質として、あるいは別の基質材料の表面コーティングとして使用され得る。

基質は任意の形態をとり得るが、通常は、プレート、スライド、ビーズ、ペレット、ディスク、粒子、微粒子、ナノ粒子、ストランド、沈殿物、場合により多孔質ゲル、シート、管、球、容器、毛管、パッド、切片、フィルム、チップ、マルチウェルプレートまたは皿、光ファイバーなどである。基質は剛性または半剛性である任意の形態であり得る。基質は、アッセイ構成要素が配置される隆起または陥没領域を含有していてもよい。所望の表面特徴、例えば、溝、ｖ溝、メサ構造などを提供するために、基質の表面を周知の技術を用いてエッチングすることもできる。

基質の表面は、基質と同じ材料で構成することもできるし、異なる材料から作製することもでき、化学的または物理的な手段によって基質に結合させることができる。このような結合表面は、様々な種類材料（例えば、ポリマー、プラスチック、樹脂、多糖類、シリカまたはシリカベースの材料、炭素、金属、無機ガラス、膜、または上記の基質材料のいずれか）のいずれかで構成され得る。表面は光学的に透明であってもよく、シリカ表面に見出されるような表面Ｓｉ−ＯＨ官能性を有することもできる。

基質および／またはその任意表面は、使用される合成および／または検出方法に適した特徴を提供するように選択することができる。基質および／または表面は、多方向から適用される光による基質の暴露を可能にするために透明であってもよい。光の回収を高めるために、基質および／または表面に反射「鏡」構造が設けられてもよい。

基質および／またはその表面は、一般に、使用時に暴露される条件に対して耐性であるか、耐性であるように処理され、場合により、このような条件への暴露の後、耐性材料を除去するように処理されることもある。

ポリヌクレオチドまたはポリペプチドプローブは、任意の適切な方法、例えば、米国特許第５，１４３，８５４号、国際公開第９２／１００９２号パンフレット、１９９０年１２月６日に出願された（現在は放棄されている）米国特許出願第０７／６２４，１２０号、Fodor et al.,Science,251:767-777(1991)、および国際公開第９０／１５０７０号パンフレットに記載されている方法によって、基質上に製造されるか、あるいは基質に結合され得る。機械的な合成戦略を用いてこれらのアレイを合成するための技術は、例えば、国際公開第９３／０９６６８号パンフレットおよび米国特許第５，３８４，２６１号に記載されている。

またさらなる技術には、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／０４１４５号に記載されるものなどのビーズに基づいた技術、米国特許第５，２８８，５１４号に記載されるものなどのピンに基づいた方法が含まれる。

センサーポリヌクレオチドまたはポリペプチドを基質に結合するために適用可能な付加的なフローチャネルまたはスポッティング方法は、１９９２年１１月２０日に出願された米国特許出願第０７／９８０，５２３号、および米国特許第５，３８４，２６１号に記載されている。試薬は、（１）所定の領域上に画定されたチャネル内を流すか、あるいは（２）所定の領域上に「スポッティング」するかのいずれかによって基質に送達される。親水性または疎水性コーティング（溶媒の性質に依存する）などの保護コーティングは、時には、他の領域において反応物溶液による湿潤を容易にする材料と組み合わせて、保護すべき基質の部分に対して使用することができる。このようにして、流動する溶液は、その指定された流路の外側に流れることがさらに防止される。

典型的なディスペンサーとしては、種々の試薬が連続してまたは同時に反応領域に送達されるように、マイクロピペット（場合によりロボット制御される）、インクジェットプリンタ、一連の管、マニフォールド、ピペットのアレイなどが挙げられる。

基質またはその領域は、問い合わせ中の基質または領域に位置するセンサーの同一性が決定されるようにコードされ得る。例えば、光学コード、ＲＦＩＤタグ、磁気コード、物理コード、蛍光コード、およびコードの組み合わせなどの任意の適切なコーディングスキームを使用することができる。

励起および検出
共役ポリマー複合体を励起することができ、検出される発光波長よりも短い波長を提供する任意の機器を励起のために使用することができる。市販のデバイスは、適切な励起波長および適切な検出成分を提供することができる。

例示的な励起源には、適切なフィルタを有する重水素ランプなどの広帯域ＵＶ光源、キセノンランプまたは重水素ランプなどの白色光源の出力（所望の波長を抽出するためにモノクロメーターを通過させた後）、連続波（ｃｗ）ガスレーザー、固相ダイオードレーザー、または任意のパルスレーザが含まれる。放出される光は、任意の適切なデバイスまたは技術によって検出することができ、多くの適切なアプローチが当該技術分野において知られている。例えば、蛍光光度計または分光光度計を使用して、共役ポリマーの励起時に試験サンプルがシグナル伝達発色団に特徴的な波長の光を放出するかどうか検出することができる。

組成物（composition of matter）
本明細書に記載される分子のいずれかの組成物も、種々の形態のいずれかで提供される。本明細書に記載される共役ポリマーおよび共役ポリマーを含む複合体は、精製および／または単離された形態で提供されてもよい。共役ポリマーおよび共役ポリマーを含む複合体は、結晶形態またはアモルファス形態のいずれで提供されてもよい。

共役ポリマーおよび共役ポリマーを含む複合体は、ほとんどが水溶液であり得る溶液中で提供されてもよく、これには、付加的な溶媒、緩衝液、生体分子、ポリヌクレオチド、フルオロフォアなどを限定することなく含む、本明細書に記載される付加的な溶液成分の１つまたは複数が含まれ得る。さらに、溶液中のＣＰの混合物は、単一のＣＰ／色素系と比較して改善された検出感度を提供することもできる。共役ポリマーおよび共役ポリマーを含む複合体は、生体分子標的またはそれに関連する生体分子が存在しなくても第１の光学活性単位からの第１の発光を検出可能である濃度で、溶液中に存在することができる。溶液は、共役ポリマーおよび共役ポリマーを含む複合体のためのある種またはあるクラスの生体分子標的またはそれに関連する生体分子に特異的な蛍光標識抗体またはポリヌクレオチドなどの標識プローブを含む、本明細書中に記載される付加的な成分を含んでいてもよい。

共役ポリマーおよび共役ポリマーを含む複合体は、フィルムの形態で提供されてもよい。組成物は、提唱される構造、合成方法、吸収および／または発光スペクトル、元素分析、ＮＭＲスペクトル、または他の任意の特性もしくは特徴を含む、本明細書に記載されるあらゆる特性によって請求され得る。

いくつかの実施形態では、サンプル中で遺伝子の発現が検出される。さらなる実施形態では、フローサイトメーター、細胞選別機、顕微鏡、プレートリーダーまたは蛍光画像形成装置のいずれかにおいて、細胞マーカーまたは細胞型の同定がサンプル中で検出される。さらなる実施形態では、細胞型またはマーカーの同定は、リンパ腫または他の循環癌の診断において使用される。さらなる実施形態では、細胞型またはマーカーの同定は、ＨＩＶ感染の診断および監視において使用される。さらなる実施形態では、細胞型またはマーカーの同定は、治療用途のために細胞を選別するために使用される。さらなる実施形態では、生体分子標的またはそれに関連する生体分子の検出の測定結果は、患者の病状を診断するために使用することができる。さらに別の実施形態では、本発明の検出方法はさらに、病状の診断方法を含むことができる。関連の実施形態では、疾患の診断方法は、生体分子標的またはそれに関連する生体分子の存在に関するデータを精査または分析すること、および患者、ヘルスケア提供者またはヘルスケア管理者に、疾患の診断に関するデータの精査または分析に基づいた結論を提供することを含むことができる。このようなデータの精査または分析は、本明細書に記載されるように、コンピュータまたは他のデジタルデバイスおよびネットワークを用いて容易にすることができる。このようなデータに関連する情報はネットワークを介して伝送可能であることが想定される。

本発明の方法の実施において、場合により、分子生物学における多数の従来の技術が利用されてもよい。これらの技術は周知であり、例えば、Ausubel et al. (Eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I,II,and III, (1997)、Ausubel et al. (Eds.), Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 5^th Ed., John Wiley & Sons,Inc. (2002)、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2000)、Innis et al. (Eds.) PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications, Elsevier Science & Technology Books (1990)、およびGreg T.Hermanson, Bioconjugate Techniques,2^nd Ed., Academic Press, Inc. (2008)（これらは全て参照によって本明細書中に援用される）において説明されている。

図１２は、本発明に関連するデータの精査または分析を達成することができる代表例の論理デバイスを示すブロック図である。このようなデータは、被験者の疾患、障害または状態に関連することができる。図１２は、例えば結果を得るために、共役ポリマーまたは共役ポリマー複合体８２４と共に使用するための装置８２０に接続されたコンピュータシステム（またはデジタルデバイス）８００を示す。コンピュータシステム８００は、場合により、固定媒体８１２を有するサーバー８０９に接続されてもよい、媒体８１１および／またはネットワーク８０５からの指示を読み取ることができる論理装置であると理解され得る。図１２に示されるシステムは、ＣＰＵ８０１、ディスクドライブ８０３、キーボード８１５および／またはマウス８１６などの任意入力デバイスおよび任意モニター８０７を含む。ローカルまたは遠隔地で、指示される通信媒体を介してサーバー８０９へのデータ通信を達成することができる。通信媒体は、データの伝送および／または受信手段を含むことができる。例えば、通信媒体は、ネットワーク接続、ワイヤレス接続またはインターネット接続であり得る。本発明に関するデータは、このようなネットワークまたは接続介して伝送可能であることが想定される。

一実施形態では、コンピュータ可読の媒体は、生物学的サンプルの分析の結果の伝送に適した媒体を含む。媒体は被験者の疾患の状態または状況に関する結果を含むことができ、このような結果は、本明細書に記載される方法を用いて得ることができる。

キット
記載される方法を実施するために有用な試薬を含むキットも提供される。

いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載されるように、共役ポリマーまたは共役ポリマー複合体、バイオコンジュゲート、例えば、抗体、核酸、および他の成分を含む試薬を含む。

キットは、場合により、以下の：共役ポリマーまたは共役ポリマー複合体内に取り込むことができる１つまたは複数の標識と、アレイを含有してもしなくてもよい１つまたは複数の基質などと、のうちの１つまたは複数を含有していてもよい。

キットの構成要素は、ハウジングによって保持することができる。記載される方法を実施するためのキットの使用説明書は、ハウジングと共に提供することができ、任意の固定媒体で提供することができる。説明書はハウジングの内部に入れられてもハウジングの外側に置かれてもよく、説明書を読み易くする、ハウジングを形成する表面の内側または外側に印刷されてもよい。キットは、１つまたは複数の異なる標的生体分子またはそれに関連する生体分子の検出のために多重形態であってもよい。

本明細書において記載され、図１３に示されるように、特定の実施形態では、キット９０３は、種々の構成要素を格納するための容器またはハウジング９０２を含むことができる。図１３に示され、本明細書において記載されるように、一実施形態では、１つまたは複数の共役ポリマーまたは共役ポリマー複合体試薬９０５と、場合により基質９００とを含むキット９０３が提供される。図１３に示され、本明細書において記載されるように、キット９０３は、場合により、説明書９０１を含むことができる。構成要素が本明細書に記載される種々の付加的な特徴を含む、キット９０３の他の実施形態も想定される。

以下の実施例では、本明細書に記載される共役ポリマーを製造するため、およびその有効性を試験するための例示的な方法が提供される。これらの実施例は単に例示的な目的のためだけに提供され、本明細書中で提供される特許請求の範囲を限定しない。本明細書で開示および請求される方法は全て、本開示を考慮すれば過度の実験を行うことなく構成および実行することができる。特許請求の範囲の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される方法、ならびに方法のステップまたは一連のステップに、変化が適用され得ることは当業者に明らかであろう。当業者に明らかであるこのような置換および修飾は全て、添付される特許請求の範囲の趣旨、範囲および概念の中に包含されると見なされる。

実施例１：式（Ｉ）のポリマーの合成
実施例１ａ：この後の重合のためのモノマー、２，７−ジブロモ−９，９−ジ（２’，５’，８’，１１’，１４’，１７’，２３’，２６’，２９’，３２’，３５’−ドデカオキサオクタトリアコンタン−３８’−イル）フルオレン（Ａ）および９，９−ジ（２’，５’，８’，１１’，１４’，１７’，２０’，２３’，２６’，２９’，３２’，３５’−ドデカオキサオクタトリアコンタン−３８’−イル）−２，７−ジ（４”，４”，５”，５”−テトラメチル−１”，３”，２”−ジオキサボロラニル）フルオレン（Ｂ）の合成

ステップ１：２，７−ジブロモ−９，９−ジ（３’−ヒドロキシプロパニル）フルオレン
２，７−ジブロモフルオレン（９．７２ｇ、３０ｍｍｏｌ）、臭化テトラブチルアンモニウム（３００ｍｇ、０．９３ｍｍｏｌ）、およびＤＭＳＯ（１００ｍＬ）を窒素（ｇ）下で三つ口フラスコに添加した後、５０％のＮａＯＨ（１５ｍＬ、１８８ｍｍｏｌ）をシリンジにより添加した。混合物を８０℃に加熱し、３−ブロモプロパノール（６．７０ｍＬ、７７ｍｍｏｌ）を添加漏斗により液滴で添加し、反応混合物を８０℃でさらに２時間攪拌した。完了したら、混合物を室温まで冷却し、水（２５０ｍＬ）で失活させた。水層を酢酸エチル（１５０ｍＬ分を３回）で抽出した。有機層を合わせ、水で洗浄してから、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過した。溶媒を除去し、残渣をクロロホルム中で再結晶させて、淡黄色の針状結晶（９．２０ｇ、７０％）を得た。

ステップ２：２，７−ジブロモ−９，９−ジ（３’−メチルベンゼンスルホナトプロパニル）フルオレン
２，７−ジブロモ−９，９−ジ（３’−ヒドロキシプロパニル）フルオレン（５００ｍｇ、１．１４ｍｍｏｌ）を窒素（ｇ）下０℃においてジクロロメタン（５ｍＬ）中に溶解させた。この混合物に、塩化ｐ−トルエンスルホニル（６５０ｍｇ、３．４０ｍｍｏｌ）を添加した後、ピリジン（０．３９ｍＬ、４．７７ｍｍｏｌ）を添加した。反応を０℃で攪拌させ、自然のまま一晩室温まで上昇させた。反応を水（１５ｍＬ）で失活させた。真空での溶媒の除去の結果、固体が形成された。固体をろ過し、白色固体（７５８ｍｇ、８９％）を得た。

ステップ３：２，７−ジブロモ−９，９−ジ（２’，５’，８’，１１’，１４’，１７’，２３’，２６’，２９’，３２’，３５’−ドデカオキサオクタトリアコンタン−３８’−イル）フルオレン（Ａ）
ｍＰＥＧ１１アルコール（７７０ｍｇ、１．４９ｍｍｏｌ）を窒素下で０℃において無水ＴＨＦ（２ｍＬ）中に溶解させた。この混合物に、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（１．６３ｍｍｏｌ、１．６３ｍＬ、ＴＨＦ中１Ｍ）を添加した。１０分攪拌した後、１０ｍＬのＴＨＦ中の２，７−ジブロモ−９，９−ジ（３’−メチルベンゼンスルホナトプロパニル）フルオレン（５０４ｍｇ、０．６７３ｍｍｏｌ）をシリンジにより添加した。この混合物を室温にし、一晩攪拌した。反応混合物をＴＨＦで希釈した。不溶性の無機塩をろ過により除去した。ろ液を濃縮して粗生成物が得られ、これをカラムクロマトグラフィ（ＤＣＭ−ＭｅＯＨ）により精製して、無色の油（６０５ｍｇ、６２．５％）を得た。

ステップ４：９，９−ジ（２’，５’，８’，１１’，１４’，１７’，２０’，２３’，２６’，２９’，３２’，３５’−ドデカオキサオクタトリアコンタン−３８’−イル）−２，７−ジ（４”，４”，５”，５”−テトラメチル−１”，３”，２”−ジオキサボロラニル）フルオレン（Ｂ）
２，７−ジブロモ−９，９−ジ（２’，５’，８’，１１’，１４’，１７’，２３’，２６’，２９’，３２’，３５’−ドデカオキサオクタトリアコンタン−３８’−イル）フルオレン（１．５１０ｇ、１．５０１ｍｍｏｌ）、ビス（ピナコラト）ジボロン（８００ｍｇ、３．１５ｍｍｏｌ）、酢酸カリウム（６１９ｍｇ、６．３１ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ_２［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）］（５１．５ｍｇ、０．０６３ｍｍｏｌ）およびＤＭＳＯ（３０ｍＬ）をＮ_２下で混合した。混合物を８０℃で５．５時間加熱した。完了したら、ＤＭＦを蒸留し、水（５０ｍＬ）を添加した。生成物をＤＣＭ（３×４０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィ（ＤＣＭ−ＭｅＯＨ）により精製し、無色の油（１．０１５ｇ、６３％）を得た。

実施例１ｂ：モノマー（Ａ）および（Ｂ）の重合

２，７−ジブロモ−９，９−ジ（２’，５’，８’，１１’，１４’，１７’，２３’，２６’，２９’，３２’，３５’−ドデカオキサオクタトリアコンタン−３８’−イル）フルオレン（Ａ）（０．０８４ｍｍｏｌ、１２０ｍｇ）、９，９−ジ（２’，５’，８’，１１’，１４’，１７’，２０’，２３’，２６’，２９’，３２’，３５’−ドデカオキサオクタトリアコンタン−３８’−イル）−２，７−ジ（４”，４”，５”，５”−テトラメチル−１”，３”，２”−ジオキサボロラニル）フルオレン（Ｂ）（０．０８８ｍｍｏｌ、１３５ｍｇ）、およびパラジウムテトラ（トリフェニルホスフィン）（０．００３５ｍｍｏｌ、４ｍｇ）を、攪拌子を備えた丸底フラスコ中で混ぜ合わせた。次に、０．３５ｍＬの２Ｍの炭酸カリウム（水）および１．９ｍＬのテトラヒドロフランを添加し、フラスコにバキュームアダプターを取り付け、Schlenkラインにつないだ。３回のfreeze-pump-thaw（凍結−脱気−融解）サイクルを用いて混合物を脱気した。脱気した混合物を窒素下で勢い良く攪拌しながら１８時間、８０℃に加熱した。次に、反応混合物を冷却し、溶媒を回転蒸発により除去した。得られた半固体を約５０ｍＬの水で希釈し、ガラス繊維ろ紙によりろ過した。エタノールを添加して、溶媒を２０％のエタノール水に調整した。Ｇ−２５脱塩媒体により分取ゲル浸透クロマトグラフィを実施して、過剰の塩をポリマーから除去した。画分中の溶媒を回転蒸発により除去し、１００ｍｇのポリ［２，７｛９，９−ビス（２、５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５−ドデカオキサオクタトリアコンタン）フルオレン］を琥珀色の油として捕集した。

実施例２：鈴木カップリングによる式（Ｉ）の非対称性ポリマーの合成
実施例２ａ：この後の重合のための非対称性モノマー、２−ブロモ−９，９−ジ（２’，５’，８’，１１’，１４’，１７’，２０’，２３’，２６’，２９’，３２’，３５’−ドデカオキサオクタトリアコンタン−３８’−イル）−７−（４”，４”，５”，５”−テトラメチル−１”，３”，２”−ジオキサボロラン−２−イル）フルオレン（Ｃ）の合成

ステップ１：２−ジブロモ−７−ヨードフルオレン
２−ブロモフルオレン（１０．０１ｇ、４０．８４ｍｍｏｌ）、酢酸（１７０ｍＬ）、水（８ｍＬ）、ヨウ素（４．３４ｇ、１７．２０ｍｍｏｌ）、ヨウ素酸カリウム（２．１８ｇ、１０．１９ｍｍｏｌ）および硫酸（４ｍＬ）を窒素下で混合した。得られた混合物を８０℃で２時間加熱し、室温まで冷却した。ろ過および酢酸洗浄の後、所望の生成物である形成された沈殿物を捕集した（１３．６８ｇ、９０％）。

ステップ２：２−ジブロモ−９，９−ジ（３’ヒドロキシプロパニル）−７−ヨードフルオレン。
２−ジブロモ−７−ヨードフルオレン（２．１８６ｇ、５．８９２ｍｍｏｌ）、臭化テトラブチルアンモニウム（６０ｍｇ、０．１８６ｍｍｏｌ）、およびＤＭＳＯ（２５ｍＬ）を三つ口フラスコに窒素（ｇ）下で添加した後、５０％のＮａＯＨ（４ｍＬ、５０ｍｍｏｌ）をシリンジにより添加した。混合物を８０℃に加熱し、３−ブロモプロパノール（１．３３ｍＬ、１４．７ｍｍｏｌ）をゆっくり添加し、反応を８０℃でさらに１時間攪拌した。完了したら、混合物を室温まで冷却し、水で失活させた。ろ過の後、粗生成物として沈殿物を捕集した。粗生成物をカラムクロマトグラフィ（溶離液：ヘキサン−酢酸エチル）により精製し、淡黄色固体（２．１５ｇ、７５％）を得た。

ステップ３：２−ブロモ−９，９−ジ（３’−ヒドロキシプロパニル）−７−（４”，４”，５”，５”−テトラメチル−１”，３”，２”−ジオキサボロラン−２−イル）フルオレン
２−ジブロモ−９，９−ジ（３’ヒドロキシプロパニル）−７−ヨードフルオレン（２．４５４ｇ、５．０３７ｍｍｏｌ）、ビス（ピナコラト）ジボロン（１．４０７ｇ、５．５４１ｍｍｏｌ）、酢酸カリウム（１．４８３ｇ、１５．１１ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ_２（１２３ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）およびＤＭＳＯ（２５ｍＬ）をＮ_２下で混合した。混合物を８０℃で１．５時間加熱した。完了したら、混合物を室温まで冷却し、水（５０ｍＬ）で失活させた。生成物をＤＣＭ（３×４０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、濃縮した。粗生成物をカラムクロマトグラフィ（溶離液：ヘキサン−酢酸エチル）により精製し、青白い（ｐａｌｅ）固体（２．０９ｇ、８５％）を得た。

ステップ４：２−ブロモ−９，９−ジ（３’−メタンスルファノトプロパニル）−７−（４”，４”，５”，５”−テトラメチル−１”，３”，２”−ジオキサボロラン−２−イル）フルオレン
２−ブロモ−９，９−ジ（３’−ヒドロキシプロパニル）−７−（４”，４”，５”，５”−テトラメチル−１”，３”，２”−ジオキサボロラン−２−イル）フルオレン（２．２８０ｇ、４．６９４ｍｍｏｌ）および塩化ｐ−トルエンスルホニル（２．６８４ｇ、１４．０８ｍｍｏｌ）をＮ_２下で室温においてジクロロメタン中に溶解させた。トリエチルアミン（３．９５ｍＬ、２８．２ｍｍｏｌ）をシリンジによりゆっくり添加した。混合物を室温で一晩攪拌した。次に、混合物を濃縮し、カラムクロマトグラフィ（ヘキサン−ＥｔＯＡｃ）により精製して、青白い固体（２．６６ｇ、７２％）を得た。

ステップ５：２−ブロモ−９，９−ジ（２’，５’，８’，１１’，１４’，１７’，２０’，２３’，２６’，２９’，３２’，３５’−ドデカオキサオクタトリアコンタン−３８’−イル）−７−（４”，４”，５”，５”−テトラメチル−１”，３”，２”−ジオキサボロラン−２−イル）フッ素（Ｃ）
ｍＰＥＧ１１アルコール（３．３３１ｇ、６．４４８ｍｍｏｌ）を窒素下で０℃において無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）中に溶解させた。この混合物に、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（７．７４ｍｍｏｌ、７．７４ｍＬ、ＴＨＦ中１Ｍ）を添加した。１０分間攪拌した後、２０ｍＬの無水ＴＨＦ中の２−ブロモ−９，９−ジ（３’−メタンスルファノトプロパニル）−７−（４”，４”，５”，５”−テトラメチル−１”，３”，２”−ジオキサボロラン−２−イル）フッ素（２．０５２ｇ、２．５７９ｍｍｏｌ）をシリンジにより添加した。混合物を室温にさせ、一晩攪拌した。ＴＨＦを蒸発させた後、塩水（５０ｍＬ）を添加し、粗生成物をジクロロメタン（３×４０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を濃縮し、カラムクロマトグラフィ（ＤＣＭ−イソプロパノール）により精製して、無色のゲル様生成物（２．１６４ｇ、５７％）を得た。

実施例２ｂ：鈴木カップリング重合による非対称性ポリマーの合成

非対称性ポリマーは、実施例１ｂに記載される重合条件と同様の条件を用いて合成される。

実施例３：リンカーまたはキャッピング単位の合成
実施例３ａ：リンカーまたはキャッピング単位、Ｔｅｒｔ−ブチル４−（３，５−ジブロモフェノキシ）ブチルカルバメートの合成

ステップ１：４−（３，５−ジブロモフェノキシ）ブタン−１−アミン
１−（４’−フタルイミドブトキシ）３，５−ジブロモベンゼン（１．０ｇ、２．２０ｍｍｏｌ）を窒素下で５分間エタノール（４５ｍＬ）中に溶解させた。ヒドラジン一水和物（６１０ｍｇ、１２．１ｍｍｏｌ）を添加し、反応を８０℃で２時間還流させた。反応に、１ＭのＨＣｌ水（１７．７ｍＬ、１７．７ｍｍｏｌ）を添加し、１０５℃でさらに２時間還流させた。水層をジクロロメタン（２×１５０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせて、飽和ＮａＨＣＯ_３（３×）、水、および塩水で洗浄してから、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過した。溶媒の除去により、黄色の油（５６０ｍｇ、７８％）を得た。

ステップ２：Ｔｅｒｔ−ブチル４−（３，５−ジブロモフェノキシ）ブチルカルバメート
４−（３，５−ジブロモフェノキシ）ブタン−１−アミン（３９７ｍｇ、１．２３ｍｍｏｌ）を窒素下で無水ＴＨＦ（２４．６ｍＬ）中に溶解させた。ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネート（４２３ｍＬ、１．８４ｍｍｏｌ）を混合物に添加し、反応を４０℃で２時間還流させた。反応をジクロロメタン（２×５０ｍＬ）で抽出した後、有機層を合わせ、飽和ＮａＨＣＯ_３、水、および塩水で洗浄してから、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過した。溶媒を除去し、残渣をカラムクロマトグラフィ（９：１、ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）により精製し、白色固体（３０６ｍｇ、５９％）を得た。

実施例３ｂ：リンカーまたはキャッピング単位、Ｔｅｒｔ−ブチル−４−（２，７−ジブロモ−９−メチル−９Ｈ−フルオレン−９−イル）ブチルカルバメートの合成

ステップ１：２，７−ジブロモ−９−メチル−９Ｈ−フルオレン
２，７−ジブロモフルオレン（３０ｇ、９２．５９ｍｍｏｌ）を窒素下で無水ＴＨＦ（３００ｍＬ）中に溶解させ、−７８℃に冷却した。−７８℃の溶液に、ｎ−ブチルリチウム（４０．３６ｍＬ、１００．９ｍｍｏｌ）を５分間にわたって添加し、反応を１０分間攪拌させた。次に、反応にヨウ化メチル（６．２９ｍＬ、１００．９ｍｍｏｌ）を添加し、反応を−７８℃で２．０時間攪拌させた。反応をジクロロメタンおよび水の混合物中に注いだ。有機層を捕集し、水層をさらにジクロロメタンで抽出した。全ての有機層を合わせ、溶媒を真空により除去した。粗材料をヘキサンで砕き、ブフナー漏斗を用いてろ過し、白色固体（２２ｇ、７０％）を得た。^１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ＝７．６２（ｓ，２Ｈ）、７．５６−７．５８（ｄ，２Ｈ）、７．４８−７．５０（ｄｄ，２Ｈ）、３．９０−３．９４（ｑ，１Ｈ）、１．４９−１．５１（ｄ，３Ｈ）。

ステップ２：２−（４−（２，７−ジブロモ−９−メチル−９Ｈ−フルオレン−９−イル）ブチル）イソインドリン−１，３−ジオン
２，７−ジブロモ−９−メチル−９Ｈ−フルオレン（１０．０ｇ、２９．５８ｍｍｏｌ）を窒素下で５０ｍＬのＤＭＳＯ中に溶解させた。この混合物に、ＫＯＨ（２．０１ｇ、３５．７９ｍｍｏｌ）、水（１．５ｍＬ）、Ｎ−（４−ブロモブチル）フタルイミド（９．９３ｇ、３５．２ｍｍｏｌ）を添加し、反応を室温で２．０時間攪拌してから、５０℃で３．０時間攪拌した。反応を室温まで冷却し、ジクロロメタンで希釈した。有機層を塩水（２Ｘ）および水で洗浄した。溶媒の除去により固体が得られ、これをカラムクロマトグラフィ（７：３、ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）により精製して、白色固体（３．０８ｇ、２０％）を得た。^１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ＝７．８１−７．８３（ｍ，２Ｈ）、７．６８−７．７１（ｍ，２Ｈ）、７．４８−７．５１（ｍ，４Ｈ）、７．４１−７．４４（ｄｄ，２Ｈ）、３．４６−３．４９（ｔ，２Ｈ）、２．００−２．０４（ｐ，２Ｈ）、１．４７−１．４９（ｍ，２Ｈ）、１．４５（ｓ，３Ｈ）、０．６５−０．６８（ｍ，２Ｈ）。

ステップ３：４−（２，７−ジブロモ−９−メチル−９Ｈ−フルオレン−９−イル）ブタン−１−アミン．
２−（４−（２，７−ジブロモ−９−メチル−９Ｈ−フルオレン−９−イル）ブチル）イソインドリン−１，３−ジオン（３．０８、５．７１ｍｍｏｌ）を窒素下でエタノール（２５０ｍＬ）中に溶解させた。混合物にヒドラジン一水和物（２．７７ｍＬ、５７．１ｍｍｏｌ）を添加し、反応を８０℃で３．０時間還流させた。反応を室温まで冷却し、１ＭのＨＣｌ（約１００ｍＬ）を添加した。混合物を３０分間または固体が全て溶解されるまで攪拌した。ジクロロメタンを溶液に添加し、有機層を飽和ＮａＨＣＯ_３で３回抽出し、水で洗浄した。有機層を捕集し、真空により溶媒を除去して、黄色の油（２．３３ｇ、１００％）を得た。^１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ_２Ｃｌ_２）：δ＝７．５７（ｄ，２Ｈ）、７．５２（ｄ，２Ｈ）、７．４６−７．４８（ｄｄ，２Ｈ）、２．３９−２．４２（ｔ，２Ｈ）、１．９５−１．９８（ｔ，２Ｈ）、１．４４（ｓ，３Ｈ）、１．１７−１．２３（ｍ，２Ｈ）、０．５９−０．６５（ｍ，２Ｈ）。

ステップ４：ｔｅｒｔ−ブチル−４−（２，７−ジブロモ−９−メチル−９Ｈ−フルオレン−９−イル）ブチルカルバメート
４−（２，７−ジブロモ−９−メチル−９Ｈ−フルオレン−９−イル）ブタン−１−アミン（２．３９ｇ、５．８４ｍｍｏｌ）を窒素下で無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）中に溶解させた。この溶液に、ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジカルボネート（２．０１ｍＬ、８．７６ｍｍｏｌ）を添加し、反応を４０℃で３時間攪拌した。反応を室温まで冷却し、真空により濃縮した。粗固体をヘキサンにより砕き、ブフナー漏斗を用いてろ過して、所望の白色固体（２．３４ｇ、７９％）を得た。^１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ＝７．５３（ｄ，２Ｈ）、７．４５−７．４７（ｄ，４Ｈ）、４．３０（ｓ，１Ｈ）、２．８８−２．９０（ｑ，２Ｈ）、１．９３−１．９６（ｔ，２Ｈ）、１．４３（ｓ，３Ｈ）、１．４１（ｓ，９Ｈ）、１．２５−１．２８（ｍ，２Ｈ）、０．５９−０．６６（ｍ，２Ｈ）。

実施例４：リンカーまたはキャッピング単位の合成
実施例４ａ：Ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−ブロモフェノキシ）ブチルカルバメートの合成

ステップ１：Ｎ（４−（４−ブロモフェノキシ）ブチル）フタルイミド
４−ブロモフェノール（４．６４ｇ、２６．８ｍｍｏｌ）、Ｎ−（４−ブロモブチルフタルイミド）（６．３０ｇ、２２．３３ｍｍｏｌ）、Ｋ_２ＣＯ_３（１１．０９ｇ、８０．３８ｍｍｏｌ）、１８−クラウン−６（２６５ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）、およびアセトン（１００ｍＬ）を混ぜ合わせ、反応を窒素下で７０℃において一晩還流させた。反応を室温まで冷却し、真空により溶媒を除去した。粗混合物をジクロロメタン（２００ｍＬ）で希釈し、水（３Ｘ）で洗浄してから、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過した。溶媒を除去した後、ヘキサンにより砕いて、ブフナー漏斗を用いてろ過して、白色固体（６．０３ｇ、７１％）を得た。

ステップ２：４−（４−ブロモフェノキシ）ブタン−１−アミン
Ｎ（４−（４−ブロモフェノキシ）ブチル）フタルイミド（６．０１ｇ、１６．１ｍｍｏｌ）を窒素下でエタノール（２００ｍＬ）中に溶解させた後、ヒドラジン一水和物（７．８ｍＬ、１６１ｍｍｏｌ）を添加した。反応を８０℃で２時間還流させた。反応が完了（上層に固体が形成）したら、反応を室温まで冷却し、１ＭのＨＣｌ（５０ｍＬ）により中和した。固体が全て完全に溶解されるまで混合物を攪拌させ、ジクロロメタン（１５０ｍＬ）で希釈した。溶液を２回分の飽和ＮａＨＣＯ_３（２×）で抽出した。有機層を合わせて、塩水および水で洗浄してから、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過した。溶媒の除去により、黄色の油（２．９３ｇ、７５％）を得た。

ステップ３：Ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−ブロモフェノキシ）ブチルカルバメート
４−（４−ブロモフェノキシ）ブタン−１−アミン（１．０ｇ、４．０９ｍｍｏｌ）を窒素下で無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）中に溶解させ、溶液が均一になるまで攪拌した。ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジカルボネート（１．３４ｇ、６．１４ｍｍｏｌ）を添加し、反応を４０℃で２時間攪拌した。反応を水（３０ｍＬ）で失活させ、室温で１．０時間攪拌した。水層を酢酸エチル（５０ｍＬ×２）で抽出した。有機層を合わせて、飽和ＮａＨＣＯ_３、水、および塩水で洗浄してから、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過した。溶媒の除去により固体が得られ、これをカラムクロマトグラフィ（９：１、ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）により精製して、白色固体（１．０ｇ、７１％）を得た。

実施例４ｂ：ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−ブロモフェニル）ブタノエートの合成

ｔｅｒｔ−ブタノールを融解させ、２０ｍＬを丸底フラスコに添加した。この溶液に、ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−ジカルボネート（１．７９ｇ、８．２２ｍｍｏｌ）および４−（４−ブロモフェニル）酪酸（１．０ｇ、４．１１ｍｍｏｌ）を添加した。次に、反応にＤＭＡＰ（１５０．７ｍｇ、１．２３ｍｍｏｌ）を添加し、反応を室温で一晩攪拌した。反応を真空により濃縮し、酢酸エチル中に再溶解させた。有機層を１ＭのＨＣｌ、塩水、および水で洗浄した。溶媒を除去した後、粗固体をカラムクロマトグラフィ（２０：１、ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）により精製して、透明な油である所望の生成物（５７０ｍｇ、４６％）を得た。^１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ_２Ｃｌ_２）：δ＝７．３９−７．４１（ｄ，２Ｈ）、７．０３−７．０９（ｄ，２Ｈ）、２．５７−２．６０（ｔ，２Ｈ）、２．１８−２．２１（ｔ，２Ｈ）、１．８３−１．１８６（ｐ，２Ｈ）、１．４２（ｓ，９Ｈ）。

実施例４ｃ：４−（４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニル）ブタン酸の合成

４−（４−ブロモフェニル）酪酸（１０ｇ、４１．１３ｍｍｏｌ）、ビス（ピナコラト）ジボロン（１５．６７ｇ、６１．７０ｍｍｏｌ）、酢酸カリウム（１２．１１ｇ、１２３．４ｍｍｏｌ）、およびＤＭＳＯ（１００ｍＬ）を混ぜ合わせ、混合物を室温で１０分間窒素によりパージした。反応に窒素下でＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ_２を添加し、反応を室温でさらに２０分間再度窒素によりパージした。次に、反応を８０℃で一晩還流させた。室温まで冷却した後、反応を水で失活させ、１．０時間攪拌した。ブフナー漏斗を用いて、形成された固体をろ過した。粗固体をカラムクロマトグラフィ（８．５：１．５、ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）により精製した。所望の画分を捕集し、真空により濃縮し、ヘキサンにより砕き、ろ過して、所望の白色固体（６．７ｇ、５６％）を得た。

実施例５：リンカーまたはキャッピング単位、Ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェノキシ）ブチルカルバメートの合成

実施例４ａからのｔｅｒｔ−ブチル４−（４−ブロモフェノキシ）ブチルカルバメート（５００ｍｇ、１．４５ｍｍｍｏｌ）、酢酸カリウム（４２８ｍｇ、４．３６ｍｍｏｌ）、ビス（ピナコラト）ジボロン（７３７ｍｇ、２．９０ｍｍｏｌ）およびＤＭＳＯ（１２ｍＬ）を混ぜ合わせ、混合物を室温で１０分間窒素によりパージした。この混合物に、Pd(dppf)Ｃｌ_２（５９．３ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）を添加し、窒素下で室温においてさらに２０分間、溶液の攪拌を続けた。８０℃で３時間還流させた後、反応を室温まで冷却し、水（３０ｍＬ）で失活させた。水層をジクロロメタン（５０ｍＬ×２）で抽出した。有機層を合わせて、塩水で洗浄してから、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させろ過した。溶媒の除去により暗褐色油が得られ、これをカラムクロマトグラフィ（９：１、ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）により精製して、薄黄色の油（５３９ｍｇ、９５％）を得た。

実施例６：アリールハライドフェニルと、ＦＭＯＣ保護された第１級アミンとの間に長いオリゴエーテルスペーサーを有するリンカーまたはキャッピング単位の合成

４−（４−ブロモフェノキシ）ブタン−１−アミン＋オリゴエーテル−ＦＭＯＣ＋Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）
（９Ｈ−フルオレン−９−イル）メチル８０−（４−ブロモフェノキシ）−７５−オキソ−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０，３３，３６，３９，４２，４５，４８，５１，５４，５７，６０，６３，６６，６９，７２−テトラコサオキサ−７６−アザオクタコンチルカルバメート。４−（４−ブロモフェノキシ）ブタン−１−アミン（２１．５ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）、１−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）−３−オキソ−２，７，１０，１３，１６，１９，２２，２５，２８，３１，３４，３７，４０，４３，４６，４９，５２，５５，５８，６１，６４，６７，７０，７３，７６−ペンタコサオキサ−４−アザノナヘプタコンタン−７９−酸（１００ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ’−ジメチルアミノピリジン（５．４ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）を丸底フラスコ（窒素を流し、テフロン攪拌子を入れた）中で混ぜ合わせた。次に、５ｍＬの無水ジクロロメタンをシリンジにより添加した。Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（２３ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を第２のフラスコ（窒素を流し、テフロン攪拌子を入れた）に移し、５ｍＬの無水ジクロロメタンをシリンジにより添加した。第１の溶液を攪拌しながら、ジシクロヘキシルカルボジイミド溶液を液滴によりゆっくり添加した。次に、反応を一晩進行させた。翌日、反応からの固体をろ過し、ろ液をシリカ上に濃縮した。メタノールおよびジクロロメタンにおけるカラムクロマトグラフィにより、透明で粘性の油（８３．３ｍｇ、収率７１％）を得た。

実施例７：内部連結部位を有するポリマー、ポリ［２，７｛９，９−ビス（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５−ドデカオキサオクタトリアコンタン）フルオレン｝−ｃｏ−３，５−フェニルブト−１’−オキシ−４”−アミン］の合成
内部共役部位を共役ポリマー骨格に取り込むことは、２００７年１０月８日に出願され、米国特許出願公開第２００８／０２９３１６４号として公開された米国特許出願第１１／８６８，８７０号（この出願は参照によってその全体が本明細書中に援用される）に記載されている。そのプロトコールに基づき、修正された合成が提供されている。

２，７−ジブロモ−９，９−ジ（２’，５’，８’，１１’，１４’，１７’，２３’，２６’，２９’，３２’，３５’−ドデカオキサオクタトリアコンタン−３８’−イル）フルオレン（０．０８４ｍｍｏｌ、１２０ｍｇ）、９，９−ジ（２’，５’，８’，１１’，１４’，１７’，２０’，２３’，２６’，２９’，３２’，３５’−ドデカオキサオクタトリアコンタン−３８’−イル）−２，７−ジ（４”，４”，５”，５”−テトラメチル−１”，３”，２”−ジオキサボロラニル）フルオレン（０．０８８ｍｍｏｌ、１３５ｍｇ）、ｔｅｒｔ−ブチル−４−（３，５−ジブロモフェノキシ）ブチルカルバメート（０．００４４ｍｍｏｌ、２．０ｍｇ）、およびパラジウムテトラ（トリフェニルホスフィン）（０．００３５ｍｍｏｌ、４ｍｇ）を、攪拌子を備えた丸底フラスコ中で混ぜ合わせる。次に、０．３５ｍＬの２Ｍの炭酸カリウム（水）および１．９ｍＬのテトラヒドロフランを添加し、フラスコにバキュームアダプターを取り付け、Schlenkラインにつなぐ。混合物を３回のfreeze-pump-thawサイクルを用いて脱気する。脱気した混合物を窒素下で勢い良く攪拌しながら８０℃に１８時間加熱する。次に、反応混合物を冷却し、溶媒を回転蒸発により除去する。次に、ジオキサン中４ＭのＨＣｌを４ｍＬ添加し、混合物を４時間以上攪拌する。溶液を２Ｍの炭酸カリウム溶液により中和する。溶媒の大部分を再度回転蒸発により除去する。得られる半固体を約５０ｍＬの水で希釈し、ガラス繊維ろ紙によりろ過する。エタノールを添加して、溶媒を２０％のエタノール水に調整する。Ｇ−２５脱塩媒体により分取ゲル浸透クロマトグラフィを実施し、過剰の塩をポリマーから除去する。画分中の溶媒を回転蒸発により除去し、１００ｍｇのポリ［２，７｛９，９−ビス（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５−ドデカオキサオクタトリアコンタン）フルオレン｝−ｃｏ−３，５−ｔｅｒｔ−ブチル−４−（４−ブロモフェノキシ）アミン］を琥珀色の油として捕集する。

実施例８：内部連結部位を有するフェニレンビニレンコポリマーの合成

実施例７および１５に記載されるものに類似の修正された合成である。

実施例９：末端アミンキャッピング単位のみを有するポリマーの合成

２，７−（ポリ［２，７｛９，９−ビス（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５−ドデカオキサオクタトリアコンタン）フルオレン］）−ジフェン−４−オキシブチル−４’−アミン
２，７−ジブロモ−９，９−ジ（２’，５’，８’，１１’，１４’，１７’，２３’，２６’，２９’，３２’，３５’−ドデカオキサオクタトリアコンタン−３８’−イル）フルオレン（０．１６３ｍｍｏｌ、２３５ｍｇ）、９，９−ジ（２’，５’，８’，１１’，１４’，１７’，２０’，２３’，２６’，２９’，３２’，３５’−ドデカオキサオクタトリアコンタン−３８’−イル）−２，７−ジ（４”，４”，５”，５”−テトラメチル−１”，３”，２”−ジオキサボロラニル）フルオレン（０．１６３ｍｍｏｌ、２５０ｍｇ）、およびパラジウムテトラ（トリフェニルホスフィン）（０．００６５、７．５ｍｇ）を、攪拌子を備えた丸底フラスコ中で混ぜ合わせる。次に、０．７５ｍＬの２Ｍの炭酸カリウム（水）および３ｍＬのテトラヒドロフランを添加し、フラスコにバキュームアダプターを取り付ける。反応混合物をSchenkラインにつなげ、３回のfreeze-pump-thawサイクルを用いて脱気してから、窒素下で勢い良く攪拌しながら８０℃に１８時間に加熱する。０．５ｍＬのテトラヒドロフラン中のｔｅｒｔ−ブチル４−（４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェノキシ）ブチルカルバメート（０．０６４ｍｍｏｌ、２５ｍｇ）の溶液を３回のfreeze-pump-thawサイクルを用いて脱気してから、カニューレにより過剰の窒素圧力下で重合反応に添加する。反応を８０℃で攪拌しながらさらに４時間継続させる。次に、０．５ｍＬのＴＨＦ中のｔｅｒｔ−ブチル４−（４−ブロモフェノキシ）ブチルカルバメート（０．１９２ｍｍｏｌ、６６ｍｇ）の溶液を３回のfreeze-pump-thawサイクルを用いて脱気してから、カニューレにより過剰の窒素圧力下で重合反応に添加する。反応を一晩進行させた。反応混合物を冷却させ、溶媒を回転蒸発により除去した。４ｍＬ分のジオキサン中４ＭのＨＣｌを残渣に添加し、最低４時間攪拌した。溶液を２Ｍの炭酸カリウム（水）により中和してから、真空により溶媒を除去した。得られた残渣を２０％のエタノール水で約３０ｍＬに希釈し、ろ過した。Ｇ−２５脱塩媒体により分取ゲル浸透クロマトグラフィを実施して、ポリマーから過剰の塩を除去する。画分中の溶媒を回転蒸発により除去し、３３７ｍｇのポリマーを琥珀色の油として捕集する。

末端リンカー（アリールハライドまたはボロン酸エステル／酸）を付加する順序は逆でもよい。同様のプロセスを使用して、代替のリンカーまたは末端キャッピング単位を付加することができる。

実施例１０：単一の末端アミンキャッピング単位を有する鎖が統計的に濃縮されたポリマー、２−（ポリ［２，７｛９，９−ビス（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５−ドデカオキサオクタトリアコンタン）フルオレン］）−フェン−４−オキシブチル−４’−アミンの合成

２，７−ジブロモ−９，９−ジ（２’，５’，８’，１１’，１４’，１７’，２３’，２６’，２９’，３２’，３５’−ドデカオキサオクタトリアコンタン−３８’−イル）フルオレン（０．１６３ｍｍｏｌ、２３５ｍｇ）、９，９−ジ（２’，５’，８’，１１’，１４’，１７’，２０’，２３’，２６’，２９’，３２’，３５’−ドデカオキサオクタトリアコンタン−３８’−イル）−２，７−ジ（４”，４”，５”，５”−テトラメチル−１”，３”，２”−ジオキサボロラニル）フルオレン（０．１６３ｍｍｏｌ、２５０ｍｇ）、およびパラジウムテトラ（トリフェニルホスフィン）（０．００６５、７．５ｍｇ）を、攪拌子を備えた丸底フラスコ中で混ぜ合わせる。次に、０．７５ｍＬの２Ｍの炭酸カリウム（水）および３ｍＬのテトラヒドロフランを添加し、フラスコにバキュームアダプターを取り付ける。反応混合物をSchenkラインにつなぎ、３回のfreeze-pump-thawサイクルを用いて脱気してから、窒素下で勢い良く攪拌しながら８０℃に１８時間に加熱する。０．５ｍＬのテトラヒドロフラン中のｔｅｒｔ−ブチル４−（４−ブロモフェノキシ）ブチルカルバメート（０．０４９ｍｍｏｌ、１７ｍｇ）の溶液を３回のfreeze-pump-thawサイクルを用いて脱気してから、カニューレにより過剰の窒素圧力下で重合反応に添加する。反応を８０℃で攪拌しながらさらに４時間継続させる。次に、０．５ｍＬのＴＨＦ中のフェニルボロン酸（０．１５０ｍｍｏｌ、１８ｍｇ）の溶液を３回のfreeze-pump-thawサイクルを用いて脱気してから、カニューレにより過剰の窒素圧力下で重合反応に添加する。反応を一晩進行させた。反応混合物を冷却させ、溶媒を回転蒸発により除去した。４ｍＬ分のジオキサン中４ＭのＨＣｌを残渣に添加し、少なくとも４時間攪拌した。溶液を２Ｍの炭酸カリウム（水）により中和してから、溶媒を真空下で除去した。得られた残渣を２０％のエタノール水で約３０ｍＬに希釈し、ろ過した。Ｇ−２５脱塩媒体により分取ゲル浸透クロマトグラフィを実施して、過剰の塩をポリマーから除去する。画分中の溶媒を回転蒸発により除去し、３１５ｍｇのポリマーを琥珀色の油として捕集する。得られるポリマーは、１つのアミンリンカーを有する鎖の画分が濃縮された鎖と、２つのリンカーを有する鎖およびリンカーを有さない鎖とを含有する。

実施例１１：ポリマー鎖と第１級アミン連結基との間に長いオリゴエーテルスペーサー（２４の繰り返し）を有する、単一の末端キャッピング単位を有する鎖が統計的に濃縮されたポリマーの合成

２−（ポリ［２，７｛９，９−ビス（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５−ドデカオキサオクタトリアコンタン）フルオレン］）−フェン−４−オキシブチル−４’−アミン。２，７−ジブロモ−９，９−ジ（２’，５’，８’，１１’，１４’，１７’，２３’，２６’，２９’，３２’，３５’−ドデカオキサオクタトリアコンタン−３８’−イル）フルオレン（０．１６３ｍｍｏｌ、２３５ｍｇ）、９，９−ジ（２’，５’，８’，１１’，１４’，１７’，２０’，２３’，２６’，２９’，３２’，３５’−ドデカオキサオクタトリアコンタン−３８’−イル）−２，７−ジ（４”，４”，５”，５”−テトラメチル−１”，３”，２”−ジオキサボロラニル）フルオレン（０．１６３ｍｍｏｌ、２５０ｍｇ）、およびパラジウムテトラ（トリフェニルホスフィン）（０．００６５、７．５ｍｇ）を、攪拌子を備えた丸底フラスコ中で混ぜ合わせる。次に、０．７５ｍＬの２Ｍの炭酸カリウム（水）および３ｍＬのテトラヒドロフランを添加し、フラスコにバキュームアダプターを取り付ける。反応混合物をSchenkラインにつなぎ、３回のfreeze-pump-thawサイクルを用いて脱気してから、窒素下で勢い良く攪拌しながら８０℃で１８時間加熱する。０．５ｍＬのテトラヒドロフラン中のｔｅｒｔ−ブチル４−（４−ブロモフェノキシ）ブチルカルバメート（０．０４９ｍｍｏｌ、１７ｍｇ）の溶液を３回のfreeze-pump-thawサイクルを用いて脱気してから、カニューレにより過剰の窒素圧力下で重合反応に添加する。反応を８０℃で攪拌しながらさらに４時間継続させる。次に、０．５ｍＬのＴＨＦ中のフェニルボロン酸（０．１５０ｍｍｏｌ、１８ｍｇ）の溶液を３回のfreeze-pump-thawサイクルを用いて脱気してから、カニューレにより過剰の窒素圧力下で重合反応に添加する。反応を一晩進行させた。反応混合物を冷却させ、溶媒を回転蒸発により除去した。４ｍＬ分のジオキサン中４ＭのＨＣｌを残渣に添加し、最低でも４時間攪拌した。溶液を２Ｍの炭酸カリウム（水）により中和してから、溶媒を真空下で除去した。得られた残渣を２０％のエタノール水で約３０ｍＬに希釈し、ろ過した。Ｇ−２５脱塩媒体により分取ゲル浸透クロマトグラフィを実施して、過剰の塩をポリマーから除去する。画分中の溶媒を回転蒸発により除去して、３１５ｍｇのポリマーを琥珀色の油として捕集する。

実施例１２：重合反応中に添加される末端カルボン酸キャッピング単位を有する「非対称性ポリマーの合成

連結モノマーは、実施例９、１０および１１に記載されるように、重合反応中に添加される。カルボン酸基は後で、実施例２９で記載されるようにＮ−ヒドロキシスクシンイミジルなどの活性化エステルに転換することができる。

実施例１３：末端カルボン酸キャッピング単位が重合後に添加される非対称性ポリマーの合成

連結モノマーは、重合反応が完了し、ポリマーが精製された後に添加される。リンカーの添加は、実施例９、１０および１１に記載されるものと同様の反応条件下で行われる。カルボン酸基は後で、実施例２９で記載されるように、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルなどの活性化エステルに転換することができる。

実施例１４：分枝状ＰＥＧ基を有するポリマーの合成
実施例１４ａ：この後の重合のためのモノマー、（Ｄ）および（Ｅ）の合成

ステップ１：２，７−ジブロモ−９，９−ビス（３，５−ジメトキシベンジル）フルオレン
２，７−ジブロモフルオレン（４．１６ｇ、１２．８ｍｍｏｌ）および臭化テトラブチルアンモニウム（３６２ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）を、テフロン攪拌子を入れた丸底フラスコに添加した。次に、６０ｍＬのジメチルスルホキシドをフラスコに添加し、混合物を５分間攪拌した。５０％のＮａＯＨ水溶液（５．２ｍＬ）の一部を添加した後すぐに、臭化３，５−ジメトキシベンジル（７．１４ｇ、３１ｍｍｏｌ）を添加した。２時間の間に、溶液はオレンジ色から青色に変化する。反応を一晩攪拌する。得られる混合物を２００ｍＬの水中にゆっくり注いでから、３回の１００ｍＬ分のジクロロメタンで抽出する。有機層を合わせ、硫酸マグネシウム上で乾燥させてから、ろ過する。ヘキサンおよびジクロロメタンを溶離液として用いるカラムクロマトグラフィにより粗生成物を精製し、淡黄色の固体（６．６３ｇ、収率７９％）を得る。

ステップ２：２，７−ジブロモ−９，９−ビス（３，５−ジヒドロキシベンジル）−９Ｈ−フルオレン
攪拌子が入れられ、ゴムセプタムが備えらえた丸底フラスコに、２，７−ジブロモ−９，９−ビス（３，５−ジメトキシベンジル）−９Ｈ−フルオレン（１．３ｇ、２．０８ｍｍｏｌ）を添加した。フラスコを窒素で１０分間パージする。無水ジクロロメタン（２０ｍＬ）をカニューレによりフラスコに移し、固体が完全に溶解されるまで混合物を攪拌する。次に、溶液をドライアイス／アセトン浴で１０分間冷却する。常に攪拌しながらＢＢｒ_３（６．１ｍＬ、６３．３ｍｍｏｌ）をカニューレにより液滴で添加する。浴を室温まで温め、混合物を一晩攪拌する。１２５ｍＬの水をゆっくりと添加して反応を失活させる。次に、溶液を３回分の酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出する。有機層をＭｇＳＯ_３上で乾燥させ、ろ過し、シリカ上に乾燥させる。ジクロロメタン中の酢酸エチルを用いる粗生成物のフラッシュクロマトグラフィーにより、オフホワイトの結晶性固体（８００ｍｇ、収率６８％）が得られる。

ステップ３：２，７−ジブロモ−９，９−ビス（３，５−（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２−ウンデカオキサテトラトリアコンタン−３４−イル）ベンジル）−９Ｈ−フルオレン（Ｄ）
テフロン攪拌子が入れられ、還流冷却器が備えらえた丸底フラスコに、２，７−ジブロモ−９，９−ビス（３，５−ジヒドロキシベンジル）−９Ｈ−フルオレン（５３７ｍｇ、０．９４５ｍｍｏｌ）、２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２−ウンデカオキサテトラトリアコンタン−３４−イル４−メチルベンゼンスルホネート（２．７８８ｇ、４．１５６ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（１．５７ｇ、１１．３４ｍｍｏｌ）およびアセトン（８０ｍＬ）を移す。混合物を常に攪拌しながら一晩還流させる。次に、混合物を室温まで冷却させ、アセトンを真空下で除去する。３回分のジクロロメタンで抽出した後、有機層をＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、ろ過し、ろ液をシリカ上に濃縮する。メタノールおよびジクロロメタンを用いるカラムクロマトグラフィにより、わずかに着色した粘性油（１．６９ｇ、収率７０％）として生成物が得られる。

ステップ４：２，７−ジ（４”，４”，５”，５”−テトラメチル−１”，３”，２”−ジオキサボロラニル）−９，９−ビス（３，５−（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２−ウンデカオキサテトラトリアコンタン−３４−イル）ベンジル）−９Ｈ−フルオレン（Ｅ）
モノマー（Ｅ）は、実施例１に記載される条件と同様の条件を用いて合成される。

実施例１４ｂ：（Ｄ）および（Ｅ）の重合

（Ｄ）および（Ｅ）の重合は、実施例１ｂに記載される重合条件と同様の条件を用いて行われる。

実施例１５：中性塩基フェニレンビニレンコポリマーの合成

２，７−ジブロモ−９，９−ジ（２’，５’，８’，１１’，１４’，１７’，２３’，２６’，２９’，３２’，３５’−ドデカオキサオクタトリアコンタン−３８’−イル）フルオレン（０．２５ｍｍｏｌ）、１，４−ジビニルベンゼン（３２．３ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム（３ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）、トリ−オルト−トリルホスフィン、（１０ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）、および炭酸カリウム（１６２ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）を、テフロン被覆攪拌子を入れた小型丸底フラスコ中で５ｍＬのＤＭＦと混ぜ合わせる。フラスコにニードルバルブを取り付け、Schlenkラインにつなぐ。３回の凍結、脱気、および融解サイクルによって溶液を脱気する。次に、混合物を一晩１００℃に加熱する。次に、前述の実施例（９、１０および１１）で提供されるものと同様の（その場）プロトコールを用いて、あるいは重合後処理の後に別の反応セットとして修飾することによって、ポリマーを末端リンカーまたはキャッピング単位と反応させることができる。

実施例１６：分枝状フェニレンビニレンコポリマーの合成

２，７−ジブロモ−９，９−ビス（３，５−（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２−ウンデカオキサテトラトリアコンタン−３４−イル）ベンジル）−９Ｈ−フルオレン（６３６ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、１，４−ジビニルベンゼン（３２．３ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム（３ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）、トリ−オルト−トリルホスフィン、（１０ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）、および炭酸カリウム（１６２ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）を、テフロン被覆攪拌子を入れた小型丸底フラスコ中で５ｍＬのＤＭＦと混ぜ合わせた。フラスコにニードルバルブを取り付け、Schlenkラインにつないだ。溶液を３回の凍結、脱気、および融解サイクルによって脱気した。次に、混合物を一晩１００℃に加熱した。次に、実施例５で提供されるものと同様の（その場）プロトコールを用いて、あるいは、重合後処理の後に別の反応セットとして修飾することによって、ポリマーを末端リンカーまたはキャッピング単位と反応させることができる。

実施例１７：共有結合的共役のための官能性アミンを有する分枝状フェニレンビニレンコポリマーの合成
ポリ［２，７−ジビニル｛９，９−ビス（３，５−（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２−ウンデカオキサテトラトリアコンタン−３４−イル）ベンジル）−９Ｈ−フルオレン｝−ａｌｔ−１，４−ベンゼン−ｃｏ−４−フェノキシブチル−Ｎ−ｔ−ブチルカルバメート］

ステップ１：重合
２，７−ジブロモ−９，９−ビス（３，５−（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２−ウンデカオキサテトラトリアコンタン−３４−イル）ベンジル）−９Ｈ−フルオレン（６３６ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、１，４−ジビニルベンゼン（３２．３ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム（３ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）、トリ−オルト−トリルホスフィン、（１０ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）、および炭酸カリウム（１６２ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）を、テフロン被覆攪拌子を入れた小型丸底フラスコ中で５ｍＬのＤＭＦと混ぜ合わせた。フラスコにニードルバルブを取り付け、Schlenkラインにつないだ。溶液を３回の凍結、脱気、および融解サイクルによって脱気した。次に、混合物を一晩１００℃に加熱した。

ステップ２：リンカーの添加
翌朝、１ｍＬのＤＭＦの入った小型丸底フラスコにジビニルベンゼン（１０ｍｇ、０．０７７ｍｍｏｌ）を移した。フラスコにニードルバルブを取り付け、Schlenkラインにつないだ。溶液を３回の凍結、脱気、および融解サイクルによって脱気した。溶液を、ニードルバルブを介してカニューレにより重合反応に移した。この添加の後、反応を１００℃で一晩継続させた。翌日、ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−ブロモフェノキシ）ブチルカルバメート（５３ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）および１ｍＬのＤＭＦを小型丸底フラスコに移した。フラスコにニードルバルブを取り付け、Schlenkラインにつないだ。溶液を３回の凍結、脱気、および融解サイクルによって脱気した。溶液を、ニードルバルブを介してカニューレにより重合反応に移した。この添加の後、反応を１００℃で一晩継続させた。

ステップ３：後処理
次に、反応を冷却し、１００ｍＬの水で希釈する。水溶液をＧ−６ガラス繊維ろ紙により２回ろ過した。ろ液を蒸発乾固させ、ジクロロメタンで再希釈した。有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、ろ過した。ろ液を蒸発させて、琥珀色の油（３４２ｍｇ、収率５６％）を得た。

ジオキサン中４ＭのＨＣｌの４ｍＬ分をポリマー残渣に添加し、最低４時間攪拌した。溶液を２Ｍの炭酸カリウム（水）により中和してから、溶媒を真空下で除去した。得られた残渣を２０％のエタノール水で約３０ｍＬに希釈し、ろ過した。Ｇ−２５脱塩媒体により分取ゲル浸透クロマトグラフィを実施して、過剰の塩をポリマーから除去する。画分中の溶媒を回転蒸発により除去し、ポリマーを琥珀色の油として捕集する。

リンカーまたはキャッピング単位の添加ステップは、上記の重合反応において実施することもできるし、あるいは場合により、重合後処理の後の別の反応セットにおいて実行することもできる。後者の場合、ポリマーは、実施例で提供されるものと類似の条件下で反応される。他の実施形態では、末端モノマーの組み合わせと反応して、ポリマーに二官能性を導入し、ポリマーが２つ以上の実体と共役できるようにすることも可能である。

実施例１８：グリセロールベースのデンドリマーを有するフルオレンモノマーの合成

ステップ１：ジメチル３，３’−（２，７−ジブロモ−９Ｈ−フルオレン−９，９−ジイル）ジプロパノエート
２，７−ジブロモフルオレン（１ｇ、３．１ｍｍｏｌ）、メチルアクリレート（８６１ｍｇ、１０ｍｍｏｌ）臭化テトラブチルアンモニウム（１００ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）およびトルエン（５ｍＬ）を、テフロン被覆攪拌子を有する小型丸底フラスコに添加した。次に、２ｍＬの５０％のＮａＯＨ（水）を攪拌しながら添加する。反応を一晩進行させる。翌日、トルエン層をフラスコに移し、水層を２回分のトルエンで抽出する。有機層を合わせ、Ｍｇ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過する。シリカ（２ｇ）をろ液に添加し、溶液を蒸発させる。生成物は、カラムクロマトグラフィによる精製の後、白色固体（１．２３ｇ、収率８０％）として得られる。

ステップ２：３，３’−（２，７−ジブロモ−９Ｈ−フルオレン−９，９−ジイル）ジプロパン酸．ジメチル３，３’−（２，７−ジブロモ−９Ｈ−フルオレン−９，９−ジイル）ジプロパノエート（１．２３ｇ、２．５ｍｍｏｌ）を、テフロン被覆攪拌子が備えられた小型丸底フラスコに移す。ＴＨＦ：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ、３：２：１の混合物（１０ｍＬ）を添加し、混合物を１時間攪拌する。次に、１ＭのＮａＯＨ（水）の１ｍＬ分を添加し、混合物を一晩攪拌する。翌日、水層を単離し、２０ｍＬ分のジエチルエーテルで３回抽出する。次に、水層を約ｐＨ２に酸性化する。水層を２０ｍＬ分のジクロロメタンで３回抽出する。有機層を合わせ、Ｍｇ２ＳＯ４で乾燥させる。有機溶液をろ過し、溶媒を蒸発させて、生成物がオフホワイト固体（９４８ｍｇ、収率９０％）として得られる。

ステップ３：３，３’−（２，７−ジブロモ−９Ｈ−フルオレン−９，９−ジイル）ビス（Ｎ−（７，１５−ビス（（２，３−ジヒドロキシプロポキシ）メチル）−１，３，１９，２１−テトラヒドロキシ−５，９，１３，１７−テトラオキサヘンイコサン−１１−イル）プロパンアミド）
テフロン被覆攪拌子を備え、ゴムセプタムで密封された丸底フラスコ中で、３，３’−（２，７−ジブロモ−９Ｈ−フルオレン−９，９−ジイル）ジプロパン酸（５００ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）、１１−アミノ−７，１５−ビス（（２，３−ジヒドロキシプロポキシ）メチル）−５，９，１３，１７−テトラオキサヘンイコサン−１，３，１９，２１−テトラオール（１．９５４、３．３ｍｍｏｌ）（参考文献Heek, T., Fasting, C., Rest, C., Zhang, X., Wurthner, F., Haag, R.Chem.Commun., 2010,46, 1884-1886の通りに調製）、およびＮ，Ｎ’−ジメチルアミノピリジン（６１ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を混ぜ合わせる。フラスコにＮ２を流し、１０ｍＬの無水ジクロロメタンをシリンジにより添加した。混合物を攪拌して固体を溶解する。テフロン被覆攪拌子を備えた別の丸底フラスコに、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、９１０ｍｇ、４．４ｍｍｏｌ）を移し、フラスコをゴムセプタムにより密封する。次に、５ｍＬの無水ジクロロメタンをシリンジによりフラスコに移す。シリンジを用いて液滴でＤＣＣ溶液をフルオレン反応混合物に移す。反応を一晩反応させる。翌日、反応混合物をろ過する。ろ液をカラムクロマトグラフィにより精製して、透明油（１．２４ｇ、収率７０％）が得られる。

実施例１９：メチルＰＥＧ鎖でキャッピングされたフルオレンモノマーＰＡＭＡＭベースの樹状側鎖の合成

ステップ１：９，９’−（３，３’−ジアミド（テトラメチルＰＡＭＡＭＧ［２］）−２，７−ジブロモフルオレン（ｉ）
ジメチル３，３’−（２，７−ジブロモ−９Ｈ−フルオレン−９，９−ジイル）ジプロパノエート（１ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を、攪拌子を備え、ゴムセプタムで密封され丸底フラスコに移す。フラスコに窒素を流し、１０ｍＬの乾燥メタノールをシリンジによりフラスコに移し、固体を攪拌により溶解させる。エチレンジアミン（５．５ｍＬ、８２ｍｍｏｌ）をシリンジによりゆっくり添加し、混合物を２時間攪拌させる。セプタムを除去し、メタノールおよび未反応エチレンジアミンを真空下で除去する。さらに１０ｍＬ分のメタノールを添加し、攪拌してから、蒸発させて、任意の残存エチレンジアミンを除去した。次に、フラスコ中に残った残渣を再度セプタムで密封し、窒素を流し、乾燥メタノール（１０ｍＬ）を添加し、攪拌した。メチルアクリレート（７．２ｍＬ、８０ｍｍｏｌ）をシリンジによりゆっくり添加し、混合物を２時間攪拌させる。セプタムを再度除去し、メタノールおよびメチルアクリレートを真空下で除去する。１０ｍＬ分のトルエンを添加し、混合物を攪拌し、溶媒を真空下で除去して、オフホワイト固体（１．７９ｇ、定量的収率）が得られる。

ステップ２：９，９’−（３，３’−ジアミド（ＰＡＭＡＭＧ［２］四酸）−２，７−ジブロモフルオレン（ｉｉ）
９，９’−（３，３’−ジアミド（テトラメチルＰＡＭＡＭＧ［２］）−２，７−ジブロモフルオレン（ｉ）（１．７９ｇ、２ｍｍｏｌ）を、テフロン被覆攪拌子を備えた小型丸底フラスコに移す。ＴＨＦ：ＭｅＯＨ：Ｈ_２Ｏ、３：２：１の混合物（１０ｍＬ）を添加し、混合物を１時間攪拌する。次に、１ｍＬ分の１ＭのＮａＯＨ（水）を添加し、混合物を一晩攪拌する。翌日、水層を単離し、１回分２０ｍＬのジエチルエーテルで３回抽出する。次に、水層を約ｐＨ２に酸性化する。水層を１回分２０ｍＬのジクロロメタンで３回抽出する。有機層を合わせ、Ｍｇ_２ＳＯ_４で乾燥させる。有機溶液をろ過し、溶媒を蒸発させて、生成物がオフホワイトの固体（１．５１ｇ、収率９０％）として得られる。

ステップ３：９，９’−（３，３’−ジアミド（ＰＡＭＡＭＧ［２］Ｎ−（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３−オクタオキサペンタコサン−２５−イル）プロピオンアミジル）−２，７−ジブロモフルオレン（ｉｉｉ）
９，９’−（３，３’−ジアミド（ＰＡＭＡＭＧ［２］四酸）−２，７−ジブロモフルオレン（ｉｉ）（５００ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）、２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３−オクタオキサペンタコサン−２５−アミン（１．１５ｇ、３ｍｍｏｌ））、およびＮ，Ｎ’−ジメチルアミノピリジン（１２ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を、テフロン被覆攪拌子を備え、ゴムセプタムで密封され丸底フラスコ中で混ぜ合わせる。フラスコにＮ_２を流し、１０ｍＬの無水ジクロロメタンをシリンジにより添加した。混合物を攪拌して固体を溶解させる。テフロン被覆攪拌子を備えた別の丸底フラスコに、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、８２５ｍｇ、４．０ｍｍｏｌ）を移し、フラスコをゴムセプタムにより密封する。次に、５ｍＬの無水ジクロロメタンをシリンジによりフラスコに移す。ＤＣＣ溶液をシリンジにより液滴でフルオレン反応混合物に移す。反応を一晩反応させる。翌日、反応混合物をろ過する。ろ液をカラムクロマトグラフィにより精製して、透明油（９６７ｇ、収率７０％）が得られる。

実施例２０：トリヒドロキシベンゼン連結に基づいた高度に分枝状のＰＥＧ化側鎖を有するフルオレンモノマーの合成

ステップ１：メチル３，４，５−トリス（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２−ウンデカオキサテトラトリアコンタン−３４−イルオキシ）ベンゾエート（ｉｖ）
メチル３，４，５−トリヒドロキシベンゾエート（２００ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）、２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２−ウンデカオキサテトラトリアコンタン−３４−イル４−メチルベンゼンスルホネート（２．５８ｇ、３．８５ｍｍｏｌ）、および１８−クラウン−６（１００ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）を、テフロン被覆攪拌子を備えた丸底フラスコに移す。アセトン（１０ｍＬ）を添加し、フラスコに還流冷却器を備え付ける。混合物を常に攪拌しながら一晩還流させる。翌日、シリカ（４ｇ）を添加し、溶媒を蒸発させる。カラムクロマトグラフィによる精製後、透明油が得られる（８８７ｍｇ、収率４８％）。

ステップ２：３，４，５−トリス（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２−ウンデカオキサテトラトリアコンタン−３４−イルオキシ）−Ｎ−（２−アミノエチル）ベンズアミド（ｖ）
攪拌子を備え、ゴムセプタムで密封された丸底フラスコにメチル３，４，５−トリス（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２−ウンデカオキサテトラトリアコンタン−３４−イルオキシ）ベンゾエート（ｉｖ）（８８７ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）を移す。フラスコに窒素を流し、１０ｍＬの乾燥メタノールをシリンジによりフラスコに移し、固体を攪拌により溶解する。エチレンジアミン（０．７ｍＬ、１０．４ｍｍｏｌ）をシリンジによりゆっくり添加し、混合物を２時間攪拌させる。セプタムを除去し、メタノールおよび未反応エチレンジアミンを真空下で除去する。生成物は、油（８８６ｍｇ、定量的収率）として得られる。

ステップ３：］３，３’−（２，７−ジブロモ−９Ｈ−フルオレン−９，９−ジイル）ビス（Ｎ−（２−３，４，５−トリス（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２−ウンデカオキサテトラトリアコンタン−３４−イルオキシ）−ベンズアミジル−Ｎアミドエチル）プロパンアミド）（ｖｉ）
テフロン被覆攪拌子を備え、ゴムセプタムで密封された丸底フラスコ中で、３，４，５−トリス（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２−ウンデカオキサテトラトリアコンタン−３４−イルオキシ）−Ｎ−（２−アミノエチル）ベンズアミド（ｖ）（８８６ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）、３，３’−（２，７−ジブロモ−９Ｈ−フルオレン−９，９−ジイル）ジプロパン酸（１１２ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）、およびＮ，Ｎ’−ジメチルアミノピリジン（１２ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を混ぜ合わせる。フラスコにＮ_２を流し、１０ｍＬの無水ジクロロメタンをシリンジにより添加する。混合物を攪拌して固体を溶解する。テフロン被覆攪拌子を備えた別の丸底フラスコに、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、１４８ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）を移し、フラスコをゴムセプタムにより密封する。次に、５ｍＬの無水ジクロロメタンをシリンジによりフラスコに移す。ＤＣＣ溶液をシリンジにより液滴でフルオレン反応混合物に移す。反応を一晩反応させる。翌日、反応混合物をろ過する。ろ液をカラムクロマトグラフィにより精製して、透明油（９２４ｍｇ、収率７０％）が得られる。

実施例２１．生体分子または基質の共役のためのポリマー−色素標識を作製するために使用される二重末端キャッピングされたポリマー

ステップ１：ポリマーの一端にｔ−ＢＯＣ保護されたアミンペンダント基を有する非対称性の中性水溶性ポリマーの合成
２−ブロモ−７−（４”−フェノキシブチル−１−ｔｅｒｔ−ブチルカルバメート）−ポリ−２，７｛９，９−ビス（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５−ドデカオキサオクタトリアコンタン）フルオレン
２−ブロモ−９，９−ジ（２’，５’，８’，１１’，１４’，１７’，２０’，２３’，２６’，２９’，３２’，３５’−ドデカオキサオクタトリアコンタン−３８’−イル）−７−（４”，４”，５”，５”−テトラメチル−１”，３”，２”−ジオキサボロラン−２−イル）フルオレン（１．０ｇ、０．６７４ｍｍｏｌ）、３ｍＬのテトラヒドロフラン、および２ｍＬの２Ｍの炭酸カリウム（水）を、テフロン攪拌子を入れた小型丸底フラスコに移した。フラスコにセプタムを取り付け、Ａｒで１５分間スパージすることによって溶液を脱気した。パラジウムテトラ（トリフェニルホスフィン）（１５．６ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）をフラスコの口から添加し、ニードルバルブを備え、Schlenkラインに固定した還流冷却器にフラスコを移した。溶液を液体窒素により急速に固体に凍結させ、freeze-pump-thaw技術を用いてさらに脱気した。脱気したら、反応を常に攪拌しながら８０℃に加熱した。反応を一晩進行させた。翌日、１ｍＬのＴＨＦ中のｔｅｒｔ−ブチル４−（４−ブロモフェノキシ）ブチルカルバメート（３５ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を３回のfreeze-pump-thawサイクルを用いて脱気してから、過剰の窒素圧力下でカニューレにより重合反応に添加した。反応を一晩８０℃で継続させた。翌日、反応混合物を冷却し、溶媒の大部分を真空下で除去した。残りの材料を全部で約５０ｍＬのジクロロメタンにより小型三角フラスコに移した。溶液を３０分間攪拌した。約１ｇのＭｇＳＯ_４（無水）を溶液に添加し、混合物を波型ペーパーフィルタによりろ過した。ろ液を蒸発させ、４１０ｍｇ（収率４７％）の琥珀色の油を捕集した。

ステップ２：保護されたアミンペンダントの反対の端部にｔ−ブチルエステルを有する末端連結モノマーを付加するための合成
２−（４−（ｔｅｒｔ−ブチル１−フェノキシ−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４−オクタオキサヘプタコサン−２７−オアート））−７−（４”−フェノキシブチル−１−ｔｅｒｔ−ブチルカルバメート）−ポリ−２，７｛９，９−ビス（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５−ドデカオキサオクタトリアコンタン）フルオレン
２−ブロモ−７−（４”−フェノキシブチル−１−ｔｅｒｔ−ブチルカルバメート）−ポリ−２，７｛９，９−ビス（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５−ドデカオキサオクタトリアコンタン）フルオレン（４１０ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌの繰返し単位）、ｔｅｒｔ−ブチル１−（４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェノキシ）−３，６，９，１２，１５，１８，２１−ヘプタオキサテトラコサン−２４−オアート（３３ｍｇ、０．０４８ｍｍｏｌ）、２ｍＬのテトラヒドロフラン、および１．５ｍＬの２Ｍの炭酸カリウム（水）を、テフロン攪拌子が入れられた小型丸底フラスコに移した。フラスコにセプタムを取り付け、Ａｒで１５分間スパージすることによって溶液を脱気した。パラジウムテトラ（トリフェニルホスフィン）（１５ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）をフラスコの口から添加し、ニードルバルブを備え、Schlenkラインに固定した還流冷却器にフラスコを移した。溶液を液体窒素により急速に固体に凍結させ、freeze-pump-thaw技術を用いてさらに脱気した。脱気したら、反応を常に攪拌しながら８０℃に加熱した。反応を一晩進行させた。残りの材料を全部で約５０ｍＬのジクロロメタンにより小型三角フラスコに移した。溶液を３０分間攪拌した。約１ｇのＭｇＳＯ_４（無水）を溶液に添加し、混合物を波型ペーパーフィルタによりろ過した。ろ液を蒸発させ、３５１ｍｇ（収率７８％）の琥珀色の油を捕集した。

ステップ３：一端に第１級アミンおよび他端にｔ−ブチルエステルペンダントを有する中性水溶性ポリマーの合成
２−（４−（ｔｅｒｔ−ブチル１−フェノキシ−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４−オクタオキサヘプタコサン−２７−オアート））−７−（４”−フェノキシブチル−１−アミノ）−ポリ−２，７｛９，９−ビス（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５−ドデカオキサオクタトリアコンタン）フルオレン

２−（４−（ｔｅｒｔ−ブチル１−フェノキシ−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４−オクタオキサヘプタコサン−２７−オアート））−７−（４”−フェノキシブチル−１−ｔｅｒｔ−ブチルカルバメート）−ポリ−２，７｛９，９−ビス（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５−ドデカオキサオクタトリアコンタン）フルオレン（２３ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）および０．５ｍＬのジオキサン中４ＭのＨＣを、テフロン被覆攪拌子を有する１ドラムバイアル中で混ぜ合わせた。混合物を４時間攪拌した。混合物を２Ｍの炭酸カリウム（水）により中和した。次に、溶液を５０ｍＬのおよそ２０％のエタノール水で希釈し、Ｇ−６ガラス繊維ろ紙によりろ過した。４ｍＬの１０ＫＤカットオフ遠心分離機フィルタにおいて遠心分離によりろ液を脱塩した。保持物（retentate）を真空下で蒸発させ、１ｍＬ分のトルエンを２回添加し、真空下で除去して、残存する水をすべて除去した。粘性の琥珀色の液体を脱塩から回収した（２１ｍｇ、収率８５％）。

ステップ４：中性水溶性ポリマー上の第１級アミンペンダントに対するＮＨＳ官能化色素の結合
２−（４−（ｔｅｒｔ−ブチル１−フェノキシ−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４−オクタオキサヘプタコサン−２７−オアート））−７−（４”−フェノキシブチル−１−アミド−ＤＹＥ）−ポリ−２，７｛９，９−ビス（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５−ドデカオキサオクタトリアコンタン）フルオレン
２−（４−（ｔｅｒｔ−ブチル１−フェノキシ−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４−オクタオキサヘプタコサン−２７−オアート））−７−（４”−フェノキシブチル−１−アミノ）−ポリ−２，７｛９，９−ビス（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５−ドデカオキサオクタトリアコンタン）フルオレン（５１８ｕｇ、０．４μＭ）をガラスバイアル内で１００μＬの乾燥ジクロロメタン中に溶解させた。４−Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノピリジンの小さい結晶を添加した。別のバイアル内で、６５μｇ（０．０６ｕＭ）のＮＨＳ官能化DyLight 594(Pierce)を５０μＬの乾燥ジクロロメタン中に溶解させた。２つの溶液を合わせて、ホイル中に被覆して、密封バイアル中で４時間攪拌させた。次に、溶媒を蒸発させ、残りの材料を９５％のエタノール中に溶解させ、Sepharose ６カラムに注入した。残りの色素をポリマーから分離した。色素標識ポリマーの溶液を合わせた画分（約１００μｇ、収率２０％）から得た。

ステップ５：一方の端部においてカルボン酸ペンダントを形成するための、色素標識中性水溶性ポリマー上のｔ−ブチルエステルペンダントの加水分解
２−（４−（１−フェノキシ−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４−オクタオキサヘプタコサン−２７−酸））−７−（４”−フェノキシブチル−１−アミド−ＤＹＥ）−ポリ−２，７｛９，９−ビス（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５−ドデカオキサオクタトリアコンタン）フルオレン
ポリマーをジクロロメタン中でＺｎＢｒ_２と混ぜ合わせ、一晩攪拌した。翌日、水の一部を添加し、混合物を１時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、残渣を２０％のエタノール水中に溶解させた。次に、４ｍＬの１０ＫＤａカットオフ遠心分離機フィルタにおける遠心分離によってろ液を脱塩した。保持物を真空下で蒸発させ、１ｍＬ分のトルエンを２回添加し、真空下で除去して、残存する水をすべて除去した。

この実施例における第２の官能基（カルボン酸）の活性化（後の共役のため）は、実施例２９および他の実施例に記載されるものを含む多数の異なる方法を用いて、カルボン酸からアミンにそしてマレイミドに達成することができる。このような方法の１つは、単なる例として、以下のステップ６で与えられる。

ステップ６：色素標識中性水溶性ポリマーのカルボン酸ペンダントのＮＨＳ活性化
２−（４−（１−フェノキシ−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４−オクタオキサヘプタコサン−２７−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル））−７−（４”−フェノキシブチル−１−アミド−ＤＹＥ）−ポリ−２，７｛９，９−ビス（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５−ドデカオキサオクタトリアコンタン）フルオレン
２−（４−（１−フェノキシ−３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４−オクタオキサヘプタコサン−２７−酸））−７−（４”−フェノキシブチル−１−アミド−ＤＹＥ）−ポリ−２，７｛９，９−ビス（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５−ドデカオキサオクタトリアコンタン）フルオレンおよびＯ−（Ｎ−スクシンイミジル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラートおよびＤＩＰＥＡを乾燥アセトニトリル中で混ぜ合わせ、窒素下で３０分間反応させる。溶液を蒸発させ、固体を乾燥ジクロロメタン中に懸濁させる。固体をろ過し、ろ液を蒸発させて、ＮＨＳエステルが得られる。

さらなる実施形態では、提供される官能基（アミンおよびカルボン酸）と共に、一般に使用される種々の保護基を使用することができる。さらに、異なるキャッピングモノマーおよび保護基の組み合わせを用いて、共役のための異なる官能基を有するポリマーを生成することができる。別の実体のための色素標識化の除去または置換ステップの結果、共役のための２つの異なる官能基を有するポリマーが得られる。ＮＨＳ／アミン化学による色素の結合は、一般的に使用される様々な条件下で実施することができる。色素の結合は、他の官能基化学を用いて実施することもできる。

実施例２２．制御されていない鈴木条件を用いる非対称性ポリフルオレンの合成

ステップ１：重合
方法Ａ：丸底フラスコ内の２−ブロモ−９，９−ジ（２’，５’，８’，１１’，１４’，１７’，２０’，２３’，２６’，２９’，３２’，３５’−ドデカオキサオクタトリアコンタン−３８’−イル）−７−（４”，４”，５”，５”−テトラメチル−１”，３”，２”−ジオキサボロラン−２−イル）フルオレン（Ａ）（２．３ｇ、１．５ｍｍｏｌ）およびＴＨＦ（６ｍＬ）の攪拌混合物に、Ｋ_２ＣＯ_３水溶液（２Ｍ、４ｍＬ）を添加した。この混合物をアルゴンで１５分間脱気した。パラジウムテトラキス（トリフェニルホスフィン）（３８．５ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を混合物に添加し、フラスコを還流冷却器に取り付けた。３回のfreeze-pump-thawサイクルにより反応容器を脱気してから、８０℃に１２時間加熱した。

反応混合物を２３℃に冷却し、溶媒を回転蒸発により除去した。得られた残渣を三角フラスコに移し、２０％のＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ（７５ｍＬ）で希釈した。ＥＤＴＡ（３００ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を混合物に添加し、２３℃で１時間攪拌した。混合物をガラス繊維ろ紙によりろ過し、ろ紙を２０％のＥｔＯＨ／Ｈ_２Ｏで洗浄した。次に、得られたろ液を０．４５ｕｍのカップフィルタによりろ過した。

ろ過した反応混合物を、接線流ろ過（ＴＦＦ）を用いて精製し、ろ液の伝導率が０．０１ｍＳ／ｃｍ未満になるまで、１０，０００分子量カットオフ膜（再生セルロースPrep/Scale TFFカートリッジシステム、Millipore,Billerica,Mass.）を用いて２０％のエタノール中にダイアフィルタろ過した。次に、溶媒を真空下で除去し、ポリ［２，７｛９，９−ビス（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５−ドデカオキサオクタトリアコンタン）フルオレン］（Ｂ）をゲル様生成物（１．４１ｇ、７１％）として得た。ポリスチレン標準に対するＧＰＣ分析により決定された分子量（Ｍｎ＝５１，０００、Ｍｗ＝１０８，０００、Ｍｐ＝９０，０００、Ｄ＝２．１）。末端リンカーの取込みの程度は、まず酸をＮＨＳエステルに転換し（実施例２９で提供されるものと同様のプロトコール）、次にアミン官能性色素と反応させることにより決定した。遊離色素を精製した後、吸光係数およびポリマー分子量の違いを考慮に入れて、ポリマーに対する色素の比率を吸光度測定から決定した。

方法Ｂ：丸底フラスコ内の２−ブロモ−９，９−ジ（２’，５’，８’，１１’，１４’，１７’，２０’，２３’，２６’，２９’，３２’，３５’−ドデカオキサオクタトリアコンタン−３８’−イル）−７−（４”，４”，５”，５”−テトラメチル−１”，３”，２”−ジオキサボロラン−２−イル）フルオレン（Ａ）（２．３ｇ、１．５ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（６ｍＬ）の攪拌混合物に、Ｋ_２ＣＯ_３の水溶液（２Ｍ、４ｍＬ）を添加した。この混合物をアルゴンで１５分間脱気した。パラジウムテトラキス（トリフェニルホスフィン）（３８．５ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を混合物に添加し、フラスコを還流冷却器に取り付けた。３回のfreeze-pump-thawサイクルにより反応容器を脱気してから、８０℃に１２時間加熱した。後処理および精製は、前述の方法Ａと同様の方法で実施した。ポリスチレン標準に対するＧＰＣ分析により決定された分子量（Ｍｎ＝９６，０００、Ｍｗ＝２３１，０００、Ｍｐ＝１８５，０００、Ｄ＝２．４）。

方法Ｃ：丸底フラスコ内の２−ブロモ−９，９−ジ（２’，５’，８’，１１’，１４’，１７’，２０’，２３’，２６’，２９’，３２’，３５’−ドデカオキサオクタトリアコンタン−３８’−イル）−７−（４”，４”，５”，５”−テトラメチル−１”，３”，２”−ジオキサボロラン−２−イル）フルオレン（Ａ）（２００ｍｇ、０．１３５ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（７ｍＬ）の攪拌混合物に、Ｃｓ_２ＣＯ_３（２．０８ｇ、６．４ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物をアルゴンで１５分間脱気した。パラジウムテトラキス（トリフェニルホスフィン）（１５．６ｍｇ、１０ｍｏｌ％）を混合物に添加し、フラスコを還流冷却器に取り付けた。３回のfreeze-pump-thawサイクルにより反応容器を脱気してから、８０℃に１２時間加熱した。後処理および精製は、前述の方法Ａと同様の方法で実施した。ポリスチレン標準に対するＧＰＣ分析により決定された分子量（Ｍｎ＝９５，０００、Ｍｗ＝２１８，０００、Ｍｐ＝２０６，０００、Ｄ＝２．３）。

ステップ２：末端キャッピング
ポリ［２，７｛９，９−ビス（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５−ドデカオキサオクタトリアコンタン）フルオレン］（Ｂ）（１．００ｇ、０．７８３ｍｍｏｌ）を含有するフラスコ内に、ＴＨＦ（３．５ｍＬ）を用いて、−（４−ヨードフェニル）ブタン酸（２２７ｍｇ、０．７８３ｍｍｏｌ）を洗い流し入れた。Ｋ_２ＣＯ_３水溶液（２Ｍ、２．３ｍＬ）をフラスコに添加し、この混合物をアルゴンで１５分間脱気した。パラジウムテトラキス（トリフェニルホスフィン）（３６ｍｇ、４ｍｏｌ％）を混合物に添加し、フラスコを還流冷却器に取り付けた。３回のfreeze-pump-thawサイクルにより反応容器を脱気してから、８０℃に１２時間に加熱した。

反応混合物を２３℃に冷却し、溶媒を回転蒸発により除去した。得られた残渣を三角フラスコに移し、２０％のＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ（１５０ｍＬ）で希釈した。ＥＤＴＡ（５００ｍｇ）を混合物に添加し、２３℃で１時間攪拌した。混合物をガラス繊維ろ紙によりろ過し、ろ紙を２０％のＥｔＯＨ／Ｈ_２Ｏで洗浄した。次に、得られたろ液を０．４５ｕｍのカップフィルタによりろ過した。

ろ過した反応混合物を、接線流ろ過（ＴＦＦ）を用いて精製し、ろ液の伝導率が０．０１ｍＳ／ｃｍ未満になるまで、１０，０００分子量カットオフ膜（再生セルロースPrep/Scale TFFカートリッジシステム、Millipore,Billerica,Mass.）を用いて２０％のエタノール中にダイアフィルタろ過した。次に、溶媒を真空下で除去し４−（ポリ［２，７｛９，９−ビス（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５−ドデカオキサオクタトリアコンタン）フルオレン］イル）フェニル）ブタン酸（Ｃ）をゲル様生成物（３８８ｍｇ、３９％）として得た。ポリスチレン標準に対するＧＰＣ分析により決定された分子量（Ｍｎ＝８９，０００、Ｍｗ＝１９６，０００、Ｍｐ＝１２４，０００、Ｄ＝２．２）。末端リンカーの取込みの程度は、まず酸をＮＨＳエステルに転換し（実施例２９で提供されるものと同様のプロトコール）、次にアミン官能性色素と反応させることにより決定した。遊離色素を精製した後、吸光係数およびポリマー分子量の違いを考慮に入れて、ポリマーに対する色素の比率を吸光度測定から決定した。

ステップ３：アミンの活性化
４−（ポリ［２，７｛９，９−ビス（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５−ドデカオキサオクタトリアコンタン）フルオレン］イル）フェニル）ブタン酸（Ｃ）（２００ｍｇ、０．１５６ｍｍｏｌ）を２ｍＬのエタノール中に溶解させてから、４℃で攪拌しながら２３ｍＬのＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ５）に液滴で添加した。Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（５７６ｍｇ、３．００ｍｍｏｌ）を数回に分けて添加した後、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１１５ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）を１回で添加した。溶液を３０分間攪拌し、エチレンジアミン（０．５０１ｍＬ、７．５０ｍｍｏｌ）を液滴で添加し、反応混合物を室温で一晩攪拌した。次に、反応混合物をＧ２５脱塩カラムにより脱塩し、溶媒を回転蒸発により除去して、Ｎ−（２−アミノエチル）−４−（ポリ［２，７｛９，９−ビス（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５−ドデカオキサオクタトリアコンタン）フルオレン］イル）ブタンアミドを透明黄色の油（１９０ｍｇ、９５％）として得た。ポリスチレン標準に対するＧＰＣ分析により決定された分子量（Ｍｎ＝８９，０００、Ｍｗ＝１９６，０００、Ｍｐ＝１２４，０００、Ｄ＝２．２）。アミンの転換の程度は、実施例３８に記載される方法と同様にしてアミンポリマーをＮＨＳ活性色素と反応させることによって決定した。

実施例２３．鈴木重合を制御するためにリンカー修飾末端キャップを用いる非対称性ポリフルオレンの合成

ステップ１：重合／末端キャッピング／後処理
サイドアーム活栓（side-arm stopcock）を備えた丸底フラスコ内の２−ブロモ−９，９−ジ（２’，５’，８’，１１’，１４’，１７’，２０’，２３’，２６’，２９’，３２’，３５’−ドデカオキサオクタトリアコンタン−３８’−イル）−７−（４”，４”，５”，５”−テトラメチル−１”，３”，２”−ジオキサボロラン−２−イル）フルオレン（Ａ）（２．３ｇ、１．５５ｍｍｏｌ）、４−（４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニル）ブタン酸（Ｂ）（６．７ｍｇ、２ｍｏｌ％）、およびＤＭＦ（６ｍＬ）の攪拌混合物にＫ_２ＣＯ_３の水溶液（２Ｍ、４ｍＬ）を添加した。この混合物をアルゴンで２５分間脱気した。次に、パラジウムテトラキス（トリフェニルホスフィン）（３８．５ｍｇ、２ｍｏｌ％）を混合物に添加し、フラスコを還流冷却器に取り付けた。３回のfreeze-pump-thawサイクルにより反応容器をさらに脱気してから、８０℃に加熱した。

別に、サイドアーム活栓を備えた丸底フラスコ内で、４−（４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニル）ブタン酸（Ｂ）（２３０ｍｇ、０．７９３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３ｍＬ）中に溶解させた。この溶液をアルゴンで１５分間スパージし、還流冷却器に取り付け、３回のfreeze-pump thawサイクルにより脱気した。融解したら、２時間の反応時間の後、アルゴンを流したシリンジを用いて溶液を反応混合物に添加した。反応混合物を８０℃でさらに１２時間攪拌した。

反応混合物を２３℃に冷却し、溶媒を回転蒸発により除去した。得られた残渣を三角フラスコに移し、２０％のＥｔＯＨ／Ｈ_２Ｏ（７５ｍＬ）で希釈した。ＥＤＴＡ（３００ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）を混合物に添加し、２３℃で１時間攪拌した。混合物をガラス繊維ろ紙によりろ過し、ろ紙を２０％のＥｔＯＨ／Ｈ_２Ｏで洗浄した。次に、得られたろ液を０．４５ｕｍのカップフィルタによりろ過した。

接線流ろ過（ＴＦＦ）を用いて、ろ過した反応混合物を精製およびサイズ分別し、ろ液の伝導率が０．０１ｍＳ／ｃｍ未満になり、ＧＰＣによる保持物のＭ_ｎが７０，０００よりも大きくなるまで、３０，０００分子量カットオフ膜（ポリエーテルスルホンPrep/Scale TFFカートリッジシステム、Millipore, Billerica, Mass.）を用いて２０％のエタノール中にダイアフィルタろ過した。次に、溶媒を真空下で除去して、４−（ポリ［２，７｛９，９−ビス（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５−ドデカオキサオクタトリアコンタン）フルオレン］イル）フェニル）ブタン酸をゲル様生成物（１．４１ｇ、７１％）として得た。ポリスチレン標準に対するＧＰＣ分析により決定された分子量（Ｍｎ＝６８，０００、Ｍｗ＝１３４，０００、Ｍｐ＝１２２，０００、Ｄ＝１．９）。末端リンカーの取込みの程度は、まず酸をＮＨＳエステルに転換し（実施例２９で提供されるものと同様のプロトコール）、次にアミン官能性色素と反応させることにより決定した。遊離色素を精製した後、吸光係数およびポリマー分子量の違いを考慮に入れて、ポリマーに対する色素の比率を吸光度測定から決定した。

５０，０００ｇ／ｍｏｌｅを超える分子量を有するにもかかわらず、ポリマーは、１０ｍｇ／ｍＬを優に超える濃度で水およびリン酸緩衝食塩水溶液の両方に可溶性である。多くの共役実験において、提供されるポリマー（および同様の構造を有する本明細書に記載される他のポリマー）を５０ｍｇ／ｍＬ以上に濃縮したが、これは、中性共役ポリマーでは注目すべきことである。また中程度の分子量は、２，５００，０００Ｍ^−１ｃｍ^−１よりも大きい吸光係数を提供する。大きい吸光係数および６０％（ＰＢＳ）の量子収率は、生物学的アッセイにおいて使用する（フローサイトメトリーにおけるその使用を含む）ために非常に明るい蛍光レポーターを提供する。

ステップ２：アミンの活性化
４−（ポリ［２，７｛９，９−ビス（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５−ドデカオキサオクタトリアコンタン）フルオレン］イル）フェニル）ブタン酸（Ｃ）（５００ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を２ｍＬのエタノール中に溶解させてから、４℃において攪拌しながら２３ｍＬのＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ５）に液滴で添加した。Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩を数回に分けて添加した後、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．５２ｇ）を１回で添加した。溶液を３０分間攪拌し、エチレンジアミン（２．８ｍＬ）を液滴で添加し、反応混合物を室温で一晩攪拌した。次に、反応混合物をＧ２５脱塩カラムにより脱塩し、溶媒を回転蒸発により除去して、Ｎ−（２−アミノエチル）−４−（ポリ［２，７｛９，９−ビス（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５−ドデカオキサオクタトリアコンタン）フルオレン］イル）ブタンアミドを黄色の油（４５０ｍｇ、９０％）として得た。アミンの転換の程度は、実施例３８に記載される方法と同様にしてアミンポリマーをＮＨＳ活性色素と反応させることにより決定した。

実施例２４．ＰＥＧ修飾ポリフルオレンの山本重合

ステップ１：山本重合／後処理
ドライボックス内で、Ｎｉ（ＣＯＤ）_２（０．３８７ｇ、１．４１ｍｍｏｌ）、２，２’−ビピリジル（０．２２０ｇ、１．４１ｍｍｏｌ）、ＣＯＤ（０．１５２ｇ、１．４１ｍｍｏｌ）および無水ＤＭＦ（１６ｍｌ）をロングネック丸底フラスコに添加した。［００２５１］２，７−ジブロモ−９，９−ジ（２’，５’，８’，１１’，１４’，１７’，２３’，２６’，２９’，３２’，３５’−ドデカオキサオクタトリアコンタン−３８’−イル）フルオレン（Ａ）（１．００、０．６９６）を４０ｍｌのバイアル内に秤量し、無水ＤＭＦ（８ｍｌ）中に溶解させた。フラスコをセプタムで密封し、バイアルをセプタムスクリューキャップで閉鎖した。触媒混合物およびモノマー溶液をドライボックスから外へ移し、静的アルゴン下に置いた。反応フラスコを７０℃で４５分間加熱した。次に、アルゴンを流したシリンジによりモノマー溶液をバイアルから触媒混合物フラスコに迅速に移した。次に、反応混合物を７０℃で６時間加熱した。

反応混合物を冷却し、回転蒸発により溶媒を除去した。得られた黒色残渣を２０％のＥｔＯＨ（８０ｍＬ）中に再溶解させ、２４００ｒｐｍで１２時間遠心分離した。次に、上澄みをデカントし、０．４５ｕｍのカップフィルタによりろ過した。

接線流ろ過（ＴＦＦ）を用いて、ろ過した反応混合物を精製し、保持物のＧＰＣ分析が低分子量材料の不在を示すまで、１０，０００分子量カットオフ膜（ポリエーテルスルホンPrep/Scale TFFカートリッジシステム、Millipore, Billerica, Mass.）を用いて２０％のエタノール中にダイアフィルタろ過した。次に、溶媒を真空下で除去して、ポリ［２，７｛９，９−ビス（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５−ドデカオキサオクタトリアコンタン）フルオレン］（Ｂ）を粘性油（０．７００ｇ、７９％）として得た。ポリスチレン標準に対するＧＰＣ分析により決定された分子量（Ｍｎ＝６２，０００、Ｍｗ＝１２７，０００、Ｍｐ＝９３，０００、Ｄ＝２．０）。

ステップ２：末端キャッピング：末端キャッピングは、実施例２２、ステップ２と同様にして実施される。

ステップ３：アミンの活性化：アミンの活性化は、実施例２２、ステップ３と同様にして実施される。

実施例２５．２つの異なるリンカーを有するタンデムポリマーの合成

ステップ１：重合
ドライボックス内で、Ｎｉ（ＣＯＤ）_２（０．７６５ｇ、２．７８ｍｍｏｌ）、２，２’−ビピリジル（０．４３５ｇ、２．７８ｍｍｏｌ）、ＣＯＤ（０．３０１ｇ、２．７８ｍｍｏｌ）および無水ＤＭＦ（２０ｍｌ）をロングネック丸底フラスコに添加した。２，７−ジブロモ−９，９−ジ（２’，５’，８’，１１’，１４’，１７’，２３’，２６’，２９’，３２’，３５’−ドデカオキサオクタトリアコンタン−３８’−イル）フルオレン（Ａ）（１．８０、１．２６ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ−ブチル４−（２，７−ジブロモ−９−メチル−９Ｈ−フルオレン−９−イル）ブチルカルバメート（Ｂ）（０．０７１ｇ、０．１２６ｍｍｏｌ）を４０ｍｌのバイアル内に添加し、無水ＤＭＦ（３０ｍｌ）中に溶解させた。フラスコをセプタムで密封し、バイアルをセプタムスクリューキャップで閉鎖した。触媒混合物およびモノマー溶液をドライボックスから外へ移し、静的アルゴン下に置いた。反応フラスコを７０℃で４５分間加熱した。次に、アルゴンを流したシリンジによりモノマー溶液をバイアルから触媒混合物フラスコに迅速に移した。次に、反応混合物を７０℃に６時間加熱した。

接線流ろ過（ＴＦＦ）を用いて、ろ過した反応混合物を精製し、保持物のＧＰＣ分析が低分子量材料の不在を示すまで、１０，０００分子量カットオフ膜（ポリエーテルスルホンPrep/Scale TFFカートリッジシステム、Millipore, Billerica, Mass.）を用いて２０％のエタノール中にダイアフィルタろ過した。次に、溶媒を真空下で除去して、２，７−ジブロモ−ポリ−［２，７｛９，９−ビス（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５−ドデカオキサオクタトリアコンタン）フルオレン−ｃｏ−２，７−（９−メチル−９’−（ブチル−４−ｔ−ブチルカルバメート）フルオレン）］（Ｃ）を粘性油（１．３ｇ、４５％）として得た。ポリスチレン標準に対するＧＰＣ分析により決定された分子量（Ｍｎ＝７２，０００、Ｍｗ＝１５６，０００、Ｍｐ＝１３８，０００、Ｄ＝２．１）。

ステップ２：末端キャッピング
丸底フラスコ内の２，７−ジブロモ−ポリ−［２，７｛９，９−ビス（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５−ドデカオキサオクタトリアコンタン）フルオレン−ｃｏ−２，７−（９−メチル−９’−（ブチル−４−ｔ−ブチルカルバメート）フルオレン）］（Ｃ）（８００ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ）、４−（４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニル）ブタン酸（Ｄ）（１２０ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）、およびＤＭＦ（６ｍＬ）の攪拌混合物に、Ｋ_２ＣＯ_３水溶液（２Ｍ、４ｍＬ）を添加した。この混合物をアルゴンで１５分間脱気した。パラジウムテトラキス（トリフェニルホスフィン）（５０ｍｇ、６ｍｏｌ％）を混合物に添加し、フラスコを還流冷却器に取り付けた。３回のfreeze-pump-thawサイクルにより反応容器を脱気してから、８０℃で１２時間加熱した。

反応混合物を２３℃に冷却し、真空下で２ｍＬの容積まで濃縮した。粗反応混合物を三角フラスコに移し、２０％のＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ（７５ｍＬ）で希釈した。ＥＤＴＡ（３００ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）を混合物に添加し、２３℃で１時間攪拌した。混合物をガラス繊維ろ紙によりろ過し、ろ紙を２０％のＥｔＯＨ／Ｈ_２Ｏで洗浄した。次に、得られたろ液を０．４５ｕｍのカップフィルタによりろ過した。

接線流ろ過（ＴＦＦ）を用いて、ろ過した反応混合物を精製およびサイズ分別し、ろ液の伝導率が０．０１ｍＳ／ｃｍ未満になるまで、１０，０００分子量カットオフ膜（ポリエーテルスルホンPrep/Scale TFFカートリッジシステム、Millipore, Billerica, Mass.）を用いて２０％のエタノール中にダイアフィルタろ過した。次に、溶媒を真空下で除去して、４−（４−（２−ブロモ−ポリ−［２，７｛９，９−ビス（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５−ドデカオキサオクタトリアコンタン）フルオレン−ｃｏ−２，７−（９−メチル−９’−（ブチル−４−ｔ−ブチルカルバメート）フルオレン）］）フェニル）ブタン酸（Ｅ）を黄色の油（６６０ｍｇ、８２％）として得た。

ステップ３：リンカーの脱保護
丸底フラスコ内の４−（４−（２−ブロモ−ポリ−［２，７｛９，９−ビス（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５−ドデカオキサオクタトリアコンタン）フルオレン−ｃｏ−２，７−（９−メチル−９’−（ブチル−４−ｔ−ブチルカルバメート）フルオレン）］）フェニル）ブタン酸（Ｅ）（２００ｍｇ、０．１６９ｍｍｏｌ）およびジクロロメタン（１６ｍＬ）の攪拌溶液に、トリフルオロ酢酸（４ｍＬ）を液滴で添加した。反応混合物を室温で２時間攪拌してから、真空中で濃縮した。残渣を最小限の２０％のＥｔＯＨ中に再溶解させ、ｐＨ＝７になるまで１ＭのＨＣｌを溶液に添加した。次に、中和された溶液をＧ２５ゲルにより脱塩し、得られた材料を濃縮乾固して透明の淡黄色油（Ｆ）を得た。

色素の取込み、リンカーの活性化およびバイオコンジュゲーションの実施例は、さらなる実施例３８および関連の実施例に含有される。

実施例２６：重合反応を制御するために末端キャッピング単位を用いる２つの異なるリンカーを有するタンデムポリマーの合成

ステップ１：山本重合
ドライボックス内で、Ｎｉ（ＣＯＤ）_２（０．４３３ｇ、８．４０ｍｍｏｌ）、２，２’−ビピリジル（０．２４６ｇ、８．４０ｍｍｏｌ）、ＣＯＤ（０．１７０ｇ、８．４０ｍｍｏｌ）および無水ＤＭＦ（１５ｍｌ）をロングネック丸底フラスコに添加した。２，７−ジブロモ−９，９−ジ（２’，５’，８’，１１’，１４’，１７’，２３’，２６’，２９’，３２’，３５’−ドデカオキサオクタトリアコンタン−３８’−イル）フルオレン（Ａ）（１．００、０．６９６ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチル４−（２，７−ジブロモ−９−メチル−９Ｈ−フルオレン−９−イル）ブチルカルバメート（Ｂ）（０．０３７ｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）、およびｔｅｒｔ−ブチル４−（４−ブロモフェニル）ブタノエート（Ｃ）（０．００４ｇ、０．００７ｍｍｏｌ）を４０ｍｌのバイアル内に添加し、無水ＤＭＦ（１０ｍｌ）中に溶解させた。フラスコをセプタムで密封し、バイアルをセプタムスクリューキャップで閉鎖した。触媒混合物およびモノマー溶液をドライボックスから外へ移し、静的アルゴン下に置いた。反応フラスコを７０℃で４５分間加熱した。次に、アルゴンを流したシリンジにより、モノマー溶液をバイアルから触媒混合物フラスコに迅速に移した。次に、反応混合物を７０℃で６時間加熱した。

接線流ろ過（ＴＦＦ）を用いて、ろ過した反応混合物を精製し、保持物のＧＰＣ分析が低分子量材料の不在を示すまで、１０，０００分子量カットオフ膜（ポリエーテルスルホンPrep/Scale TFFカートリッジシステム、Millipore, Billerica, Mass.）を用いて２０％のエタノール中にダイアフィルタろ過した。次に、溶媒を真空下で除去して、ｔｅｒｔ−ブチル４−（４−（２−ブロモ−ポリ−［２，７｛９，９−ビス（２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２，３５−ドデカオキサオクタトリアコンタン）フルオレン−ｃｏ−２，７−（９−メチル−９’−（ブチル−４−ｔ−ブチルカルバメート）フルオレン）］）フェニル）ブタノエート（Ｄ）を粘性油（６６４ｇ、８０％）として得た。ポリスチレン標準に対するＧＰＣ分析により決定された分子量（Ｍｎ＝５０，０００、Ｍｗ＝８８，０００、Ｍｐ＝１７４，０００、Ｄ＝１．８）。

ステップ２：リンカー脱保護
丸底フラスコ内のポリマー（３００ｍｇ、Ｘｍｍｏｌ）およびジクロロメタン（２４ｍＬ）の攪拌溶液に、トリフルオロ酢酸（６ｍＬ）を液滴で添加した。反応混合物を室温で２時間攪拌してから、真空中で濃縮した。残渣を最小量の２０％のＥｔＯＨ中に再溶解させ、ｐＨ＝７になるまで１ＭのＨＣｌを溶液に添加した。次に、中和された溶液をＧ２５ゲルにより脱塩し、得られた材料を濃縮乾燥固させ、透明な薄オレンジ色の油（２６１ｍｇ、８７％）を得た。

実施例２７．生体分子または基質共役のためのポリマー−色素標識を作製するために使用される、内部共役部位および末端共役部位の両方を有する二重官能性の非対称性ポリマー

２−ブロモ−９，９−ジ（２’，５’，８’，１１’，１４’，１７’，２０’，２３’，２６’，２９’，３２’，３５’−ドデカオキサオクタトリアコンタン−３８’−イル）−７−（４”，４”，５”，５”−テトラメチル−１”，３”，２”−ジオキサボロラン−２−イル）フルオレンの鈴木重合は、実施例２３に記載される条件下で実施される（ｙ％は、重合を制御するために使用される末端リンカーのモル％であり、リンカーの高度の取込みを保証する）。この実施例のリンカーは、４−（４−（４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラン−２−イル）フェニル）ブタン酸である。この例では、第２の連結部位をポリマーに取り込むために、ｘモル％の内部リンカーも重合に添加される。内部リンカーを取り込むためのこの方法は、一般に、実施例２１、２５および２６に記載されている。内部リンカーは、示されたように、重合中に取り込まれなければならないが、実施例９、１０、１１および２１に記載されるように、末端リンカーは、別のステップで添加することが可能であり得ると予想される。

実施例２８：リンカー−官能化ポリマーの濃縮
リンカー−官能化ポリマーの合成は、リンカー官能性を有する鎖と有さない鎖の混合物をもたらし得る。共役効率は、共役のためのポリマーの純度が高いほど改善されることが予想されるので、この実施例で記載される方法は、リンカーを含有する鎖を濃縮することによって、これに対処する。

ＣＯＯＨ修飾ポリマーおよび非修飾ポリマーの混合物を含有するポリマーバッチについては：ポリマーを９５％のＥｔＯＨ中に溶解させてから、最終のＥｔＯＨ濃度が２０％になるまで水で希釈する。コンダクタンスが０．１ｍＳ／ｃｍよりも低くなるまで、１０ｋＤａのＭＷＣＯフィルタを用いてポリマーを脱塩する。ポリマー負荷がカラム容量に適していることを保証してQ-Sepharoseカラムに注入する。２０％のＥｔＯＨ水をカラムに通し、未結合ポリマーを洗い流す。結合高分子材料の放出を引き起こすために、２カラム容積の間、溶離緩衝液を２０％のＥｔＯＨ水中１ＭのＮａＣｌに変えることによって結合材料を放出する。濃縮された材料を捕集する。

ポリマーをQ-Sepharoseカラムなどの強アニオン交換体に通す。官能性カルボン酸基を有するポリマー鎖は強アニオン交換体と結合し、官能化されていないポリマーは結合するかわりに、洗い流されるであろう。非官能化ポリマーがカラムを通過した後、カラムを１ＭのＮａＣｌで洗浄し、酸基を媒体から選別することによって、酸官能化ポリマーの放出を引き起こす。この方法を用いることで、官能性ポリマーの割合は、カルボン酸基を有するポリマー鎖が２５％から、カルボン酸基を有するポリマー鎖が８０％を超えるまで増大することが示された。この官能性鎖の増大は、濃縮前と濃縮後のポリマー−色素コンジュゲートの吸光度比を分析することによって示された。この手順は、実施例３８にも記載されている。同様の手順は、アミン含有ポリマーの濃縮のためにも有効であった。その場合、伝導率が低下された（０．０１ｍＳ／ｃｍ未満）アニオン交換樹脂のSP Sephrose（または類似のもの）が充填される。

実施例２９：ＮＨＳ／アミンカップリングによるポリマー−ストレプトアビジンコンジュゲートの調製
実施例２９ａ：ポリマー修飾
ポリマー修飾−カルボン酸からアミンへの転換

１．３５ｇのカルボン酸末端ポリマーを９ｍＬのエタノール中に溶解させてから、８０ｍＬの４℃の５０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５）に攪拌しながら液滴で添加した。０．５２ｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを１回で添加した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドが溶解したら、２．３ｇのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩を数回に分けて添加した。溶液を３０分間攪拌した後、２．８ｍＬのエチレンジアミンを液滴で添加した。溶液を室温で一晩攪拌し、接線流ろ過（ＭＷＣＯ＝１０ｋＤａ）により精製した。収量１．２２ｇ（９０％）。

ポリマー修飾−アミンからカルボン酸への転換

７０ｍｇのアミン末端ポリマーを７ｍＬのＤＭＳＯ中に溶解させた。２．３ｍｇのＤＩＰＥＡをポリマー溶液に添加した。２．２ｍｇのＤＭＡＰを２２０μＬのＤＭＳＯ中に溶解させ、得られたポリマー溶液に添加した。５．５ｍｇの無水コハク酸を５５０μＬのＤＭＳＯ中に溶解させ、得られたポリマー溶液に添加した。溶液を室温で一晩攪拌した。次に、２５ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５）緩衝液を用いてAmicon Ultra遠心ろ過装置（ＭＷＣＯ＝１０ｋＤａ）により反応を精製した。収量６２ｍｇ（８９％）。

ポリマー修飾−カルボン酸からＮＨＳ−エステルへの転換

６０ｍｇのカルボン酸末端ポリマーを６００μＬのアセトニトリル中に溶解させた。１．２μｇのＤＩＰＥＡをポリマー溶液に添加した。２．８ｍｇのＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）ウロニウムを３７０μＬのアセトニトリル中に溶解させ、ポリマー溶液に添加した。溶液を室温で１５分間攪拌した。反応が完了したら、溶媒を減圧下で蒸発させた。収量５０ｍｇ（８３％）。

実施例２９ｂ：タンパク質−ポリマー共役
ストレプトアビジンタンパク質を５０ｍＭのＮａＨＣＯ_３（ｐＨ８．２）緩衝液中に溶解させ、１ｍｇ／ｍＬの溶液を作製する。ステップ２からの粗製の活性化ポリマー（１０〜１５当量または必要に応じて）溶液をストレプトアビジンタンパク質水溶液に添加し、必要であれば、タンパク質濃度を緩衝液で調整して添加される有機溶媒の容積が全容積の１０％未満であることを保証する。溶液を室温で３時間攪拌して、反応をAmicon Ultraフィルタ（ＭＷＣＯ＝１０ｋＤａ）に移し、ＤＭＦを除去する。２５ｍＭのＰＯ_４（ｐＨ６．５）緩衝液を用いてタンパク質を初期容積中に回収する。

タンパク質−ポリマーコンジュゲートの精製
１ｍＬのHiTrap SP Sepharose FFカラムを２０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ３）緩衝液で平衡化する。１ｍＬ（０．３〜１ｍｇ／ｍＬ）のストレプトアビジン−ポリマーコンジュゲートを２５ｍＭのＮａＨＰＯ_４（ｐＨ６．５）中に入れる。安定なベースラインが得られるまで、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ３）緩衝液を用いてカラム内にサンプルを流す。続いて、多数の１ｍＬアリコートサンプルを負荷および洗浄することができる。カラムを最低１０カラム容積の２０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ３）緩衝液で洗浄する。１０カラム容積の、０．６ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液中２０ｍＭのクエン酸ナトリウムでコンジュゲートを溶出させ、カラムを１０カラム容積の、溶離緩衝液中２０％のエタノールによりストリッピングする。溶出ピークをAmicon Ultraフィルタ（ＭＷＣＯ＝１０ｋＤａ）により濃縮して、容積を約２００μＬに減らす。０．６ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液中２０ｍＭのクエン酸ナトリウムにより、１０×３００ｍｍのSuperose １２カラムを平衡化する。２００μＬの濃縮ストレプトアビジン−ポリマーコンジュゲートを負荷し、０．６ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液中２０ｍＭのクエン酸ナトリウムにより溶出させる。Amicon Ultra遠心分離フィルタ（１０ｋＤのＭＷＣＯ）を用いて、画分を貯留し、緩衝液をＰＢＳ＋０．０５％のＮａＮ_３に交換する。およそ２μＭのストレプトアビジンにおける試験のために所望される濃度に溶離液を濃縮する。

精製タンパク質−ポリマーコンジュゲートの特徴付け
４〜２０％のアクリルアミドＴｒｉｓ−ＨＣｌＲｅａｄｙゲル（BioRad）を調製し、別のレーンにおいて、遊離ストレプトアビジンおよび遊離ポリマーと共にコンジュゲートをゲルに負荷する。２５ｍＭのＴｒｉｓ１９２ｍＭ、グリシンｐＨ８．３中でゲル電気泳動を実施し、クーマシーで染色して、タンパク質を可視化する。ゲルを３０分間染色してから、市販の脱染剤により一晩脱染する。また、アガロースゲル条件を使用して、ポリマー−ストレプトアビジンコンジュゲートを特徴付けた（その一例は、図２９に示される）。

代替の実施形態では、上記の例は、生体分子または色素（抗体および核酸を含むがこれらに限定されない）に対するポリマーの共役を可能にするように構成することができる。ポリマー上のアミンは、代替の架橋剤または修飾剤を用いて、マレイミドおよびカルボン酸（さらに活性化されてＮＨＳエステルを形成する）に転換される。特定の実施形態では、他の生体分子（ストレプトアビジン、抗体断片、核酸）に対する同じポリマーの共役は、マレイミド−チオール化学（生体分子上の遊離アミンを転換するためのＳＡＴＡリンカーの使用、あるいは遊離チオールを形成するための抗体のＴＣＥＰ（またはＤＰＰ）還元）を用いて容易にされる。

実施例３０：ヒドラジド／ベンズアルデヒドカップリングによるポリマー−ストレプトアビジンコンジュゲートの調製
ステップ１：ストレプトアビジン−４ＦＢ修飾
ストレプトアビジンタンパク質を１．７ｍｇ／ｍＬで再構成し、反応緩衝液、５０ｍＭのＮａＨＣＯ_３（ｐＨ８）に交換する。無水ＤＭＳＯ中の１５モル等量の二官能性ベンズアルデヒド／スクシンイミジルリンカー、Ｓ−４ＦＢ（Solulink, San Diego, CA）２０ｍｇ／ｍＬをストレプトアビジンに添加して、有機相が全容積の１０％未満であることを保証する。室温で４時間、反応を振とう機において混合し、続いて５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５）を用いてAmicon Ultraフィルタ、１０ｋＤのＭＷＣＯにより未反応リンカーをろ過し、２４００ｒｐｍで遠心分離し、洗浄を３回繰り返す。共役緩衝液、５０ｍＭのＮａＰＯ_４（ｐＨ６．５）中に１．７ｍｇ／ｍＬを目標として、ストレプトアビジンタンパク質をその初期容積中に回収する。

ステップ２：ポリマー修飾
末端アミン基（１モル等量）を有するポリマーをＤＭＦにより溶解させ、１０ｍｇ／ｍＬの溶液を作製する。２０モル等量の二官能性ヒドラジン／スクシンイミジルリンカー、ＳＨＴＨ（Solulink, San Diego, CA）を、無水ＤＭＳＯ中８０ｍｇ／ｍＬで、ポリマー溶液に添加する。１滴のＤＩＰＥＡをシリンジおよび２２ｇ針により反応に添加する。溶液を室温で４時間攪拌し、反応をAmicon Ultraフィルタ（ＭＷＣＯ＝１０ｋＤａ）に移し、２５ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５）緩衝液によりろ過する。次に、溶液を遠心分離する。フィルタを詰め替え、以下の洗浄緩衝液で洗浄する：
１×ＤＩＨ２Ｏ＋１滴の１ＭのＨＣｌ
１×ＤＩＨ２Ｏ＋１滴の１ＭのＮａＯＨ
３×５０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５）

ステップ３：タンパク質−ポリマー共役
１５当量のステップ２からの修飾ポリマーを所望の量のステップ１からの修飾タンパク質に添加する。最終濃度が１０ｍＭであるようにアニリンを反応に添加し、１２時間混合させる。反応をAmicon Ultraフィルタ（ＭＷＣＯ＝１０ｋＤａ）により精製してＤＭＦを除去し、２５ｍＭのＰＯ_４（ｐＨ６．５）緩衝液により回収する。

ステップ４：タンパク質−ポリマーコンジュゲートの精製
１ｍＬのHiTrap SP Sepharose FFカラムを２０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ３）緩衝液で平衡化する。１ｍＬ（０．３〜１ｍｇ／ｍＬ）のストレプトアビジン−ポリマーコンジュゲートを２５ｍＭのＮａＨＰＯ_４（ｐＨ６．５）中に入れる。安定なベースラインが得られるまで、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ３）緩衝液を用いてカラム内にサンプルを流す。続いて、多数の１ｍＬアリコートサンプルを負荷および洗浄することができる。カラムを最低１０カラム容積の２０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ３）緩衝液で洗浄する。１０カラム容積の、０．６ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液中２０ｍＭのクエン酸ナトリウムでコンジュゲートを溶出させ、カラムを１０カラム容積の、溶離緩衝液中２０％のエタノールによりストリッピングする。溶出ピークをAmicon Ultraフィルタ（ＭＷＣＯ＝１０ｋＤａ）により濃縮して、容積を約２００μＬに減らす。０．６ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液中２０ｍＭのクエン酸ナトリウムにより、１０×３００ｍｍのSuperose １２カラムを平衡化する。２００μＬの濃縮ストレプトアビジン−ポリマーコンジュゲートを負荷し、０．６ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液中２０ｍＭのクエン酸ナトリウムにより溶出させる。Amicon Ultra遠心分離フィルタ（１０ｋＤのＭＷＣＯ）を用いて、画分を貯留し、緩衝液をＰＢＳ＋０．０５％のＮａＮ_３に交換する。およそ２μＭのストレプトアビジンにおける試験のために所望される濃度に溶離液を濃縮する。

ステップ５：精製タンパク質−ポリマーコンジュゲートの特徴付け
４〜２０％のアクリルアミドTris-HCl Readyゲル（BioRad）を調製し、別のレーンにおいて、遊離ストレプトアビジンおよび遊離ポリマーと共にコンジュゲートをゲルに負荷する。２５ｍＭのＴｒｉｓ１９２ｍＭ、グリシンｐＨ８．３中でゲル電気泳動を実施し、クーマシーで染色して、タンパク質を可視化する。ゲルを３０分間染色してから、市販の脱染剤により一晩脱染する。

図１４の上の図は、式（Ｖｂ）のポリマーに対するストレプトアビジンの共役を漫画形式で描いている。図１４の下の図は、コンジュゲートの移動度が遊離タンパク質に対して遅れていることを示すアクリルアミドゲルのクーマシー染色であり、質量の増大が示される。中性ポリマー単独では染色の証拠は示されず、形式電荷がなく、ポリマーは電気泳動場を移動できない。

代替の実施形態では、上記の例は、生体分子または色素（抗体および核酸を含むがこれらに限定されない）に対するポリマーの共役を可能にするように構成することができる。ポリマー上のアミンは、代替の架橋剤または修飾剤を用いて、マレイミドおよびカルボン酸（さらに活性化されてＮＨＳエステルを形成する）に転換される。特定の実施形態では、他の生体分子（ストレプトアビジン、抗体断片、核酸）に対する同じポリマーの共役は、マレイミド−チオール化学（生体分子上の遊離アミンを転換するためのＳＡＴＡリンカーの使用、あるいは遊離チオールを形成するための抗体のＴＣＥＰ還元）およびＮＨＳ−アミン化学（ＮＨＳポリマーをタンパク質または核酸上のリジンと直接反応させる）を用いて容易にされる。

実施例３１：ビオチン標識ポリマーの調製

式（Ｖｃ）のアミン官能化ポリマーを無水ＤＭＦ中に１０ｍｇ／ｍＬで溶解させ、２つの部分に分ける。ＮＨＳ−ビオチン（９０μＬ中０．９ｍｇ、８８当量）（Pierce,20217）およびＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン（Pierce,21343）を１０ｍｇ／ｍＬ（１５０μＬ中１．５ｍｇ、８８当量）で無水ＤＭＦ中に溶解させる。ＮＨＳ−ビオチンおよびＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチン溶液をポリマー溶液の２つの部分に直ちに添加し、暗所の振とう機において一晩混合させた。

Amicon Ultra−４ｍＬ１０ｋＤのMWCOフィルタカートリッジを用いて、一連の洗浄ステップで溶液を洗浄することによって過剰の反応物を除去する：まず、カートリッジにおよそ半分まで水を充填し、続いて、反応溶液（ピペットにより）を水中に直接添加する。次に、カートリッジがいっぱいになるまで水を満たす。上下にピペッティングすることにより溶液を混合する。次に、カートリッジを２４００ｒｐｍで３０分間、あるいは容積が２５０μＬに減少するまで遠心分離する。次に、カートリッジに水を再充填し、１滴の１ＭのＨＣｌを添加する。溶液を混合し、２４００ｒｐｍで３０分間、あるいは容積が２５０μＬに減少するまで遠心分離する。次に、カートリッジに水を再充填し、１滴の１ＭのＮａＯＨを添加する。溶液を混合し、２４００ｒｐｍで３０分間、あるいは容積が２５０μＬに減少するまで遠心分離する。次にカートリッジに水を再充填し、混合し、２４００ｒｐｍで３０分間、あるいは容積が２５０μＬに減少するまで遠心分離する。この最終ステップを全部で５回繰り返す。

精製ビオチン標識ポリマーの特徴付け
０．２％のＢＳＡおよび０．０５％のＮａＮ_３を加えたＤＰＢＳ緩衝液中で、過剰のビオチン標識ポリマーをCy5標識ストレプトアビジンと共にインキュベートする。０．８％のアガロースゲルを調製し、別のレーンにおいて、遊離Cy5−ストレプトアビジンおよび遊離ビオチン化ポリマーと共に、コンジュゲートをゲルに負荷する。ゲル電気泳動を１０ｍＭのＮａＨＣＯ_３（ｐＨ１０）中で実施し、４５７ｎｍおよび６３５ｎｍレーザー励起によりTyphoonゲルイメージャーを用いて可視化する。図１５（下）には、遊離タンパク質に対して、ポリマー−ストレプトアビジン複合体の移動度の遅延が描かれ、質量の増大が示される。ポリマー単独では、形式電荷が欠けているためにそれ自体での移動度は少ししか示されない。

このプロトコールは、内部および末端の両方のアミンリンカーを含有する様々な共役ポリマーをうまくビオチン修飾するように構成される。

実施例３２：ビオチン化ミクロスフェアへの選択的結合による共有結合性ポリマーストレプトアビジンコンジュゲートの官能性試験
必要とされる材料：
１×ＴＢＳＴ：（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．５）、ビオチンミクロスフェア（ＴＢＳＴ中１０ｍｇ／ｍＬ）、ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ）、ＡｖＤＮ（２２０μＭ）、およびポリマー−ストレプトアビジン（ＳＡ）コンジュゲート：（ＳＡに関して１μＭ、５μＭで提供される）。

マスター混合物の調製：
標識化された１．５ｍＬのミクロチューブにおける調製：

両方のチューブを短時間ボルテックスし、進行する前に、負の対照ビーズを過剰のアビジンと共に２０〜３０分間プレインキュベートさせる。ビーズが沈降しないように、インキュベーションのために８００ＲＰＭにおける変速オービタルミキサーが提唱される。

ビーズのハイブリダイゼーション：
１０μＬの各マスター混合物を別々の標識化された１．５ｍｌのミクロチューブにピペットで入れた。２μＬのポリマー−ＳＡコンジュゲートをそれぞれに添加した。１０μＬのマスター混合物を含有し、ポリマーを含有しない付加的なチューブをブランクとして使用するために調製した。短時間ボルテックスし、全てのチューブをパルス回転させる。変速オービタルミキサーに移し、８００ＲＰＭで３０分間インキュベートする。

ビーズの処理／洗浄：
０．５ｍｌのＴＢＳＴを全てのサンプルおよび対照に添加し、短時間ボルテックスする。１２００ｇで２分間遠心分離し、ビーズペレットを乱さないように入念に４８０μｌの上澄みを除去する。０．５ｍｌのＴＢＳＴを全てのサンプルおよび対照に添加し、短時間ボルテックスする。１２００ｇで２分間遠心分離し、ビーズペレットを乱さないように入念に５００μｌの上澄みを除去する。ステップ３および４を繰り返す。Ｐ２００ピペットを用いて、ビーズペレットを乱すことなく残りの上澄みをできるだけ多く除去する。１００μＬのＴＢＳＴを添加し、短時間ボルテックスして、ビーズを再懸濁させる。

ビーズの測定：
１００μＬの正、負およびブランクビーズをBLACK ９６ウェルプレートに移す。バックグラウンドよりも高い測定可能なシグナルを達成するために必要とされるスリット幅および／または感度設定を用いて、ウェルを４３０ｎｍで励起し、４５０〜６５０ｎｍの範囲の発光を捕集する。正および負の対照のビーズの発光を比較する。

図１６は、ポリマーストレプトアビジンコンジュゲートがビオチン化ミクロスフェアに結合されたことを示す。蛍光光度計における４４０ｎｍでの励起は、実線の曲線によって示されるように、ポリマーからの発光をもたらした。破線の曲線は負の対照を表し、この場合、ポリマーストレプトアビジンコンジュゲートによる処理の前にビオチン結合部位を遮断するために、まずビオチンビーズを過剰のアビジンで処理した。

実施例３３：ビオチン化ミクロスフェアへの選択的結合、および共存されるストレプトアビジン−色素コンジュゲートにおける色素受容体へのＦＲＥＴによる共有結合性ポリマーストレプトアビジンコンジュゲートの官能性試験
必要とされる材料：
１×ＴＢＳＴ：５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．５。ビオチンミクロスフェア（ＴＢＳＴ中１０ｍｇ／ｍＬ）。Cy3-SA（１μＭまたは５０μｇ／ｍＬ）。ポリマー−ストレプトアビジン（ＳＡ）コンジュゲート：（ＳＡに関して１μＭ、５μＭで提供される）。

ビーズの調製およびハイブリダイゼーション：
標識化された１．５ｍＬのミクロチューブにおける調製：

全てのチューブを短時間ボルテックスし、８００ＲＰＭにおける少なくとも３０分間のインキュベーションのために変速オービタルミキサーに移す。

ビーズの測定：
１００μＬの全てのサンプルをBLACK ９６ウェルプレートに移す。バックグラウンドよりも高い測定可能なシグナルを達成するために必要とされるスリット幅および／または感度設定を用いて、ウェルを４３０ｎｍで励起し、４５０〜６５０ｎｍの範囲の発光を捕集する。４８０〜５００ｎｍの範囲のポリマーの発光および予想される５７０ｎｍにおけるCy3の発光を検出および記録する。

図１７は、ポリマーストレプトアビジンコンジュゲートがビオチン化ミクロスフェアに結合されたことを示す。蛍光光度計における４４０ｎｍでの励起は、実線の上側の曲線によって示されるように、異なるストレプトアビジンタンパク質に共役されたポリマーとCy3色素との間のエネルギー移動をもたらした。破線の曲線はビーズのみを示し、実線の下側の曲線は４４０ｎｍにおけるCy3−ストレプトアビジンコンジュゲートの直接励起を示す。

実施例３４：アビジン被覆ミクロスフェアへの選択的結合によるビオチン標識ポリマーの官能性試験
必要とされる材料：
１×ＴＢＳＴ：５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７。ＳＡミクロスフェア（ＴＢＳＴ中１０ｍｇ／ｍＬ）。ビオチン（１ｍＭ）。４４０ｎｍのビオチン−ポリマーコンジュゲート：（４６μＭ）。

全てのチューブを短時間ボルテックスし、８００ＲＰＭにおける２０〜３０分間のインキュベーションのために変速オービタルミキサーに移し、負の対照のビーズ上の全てのＳＡ部位をビオチンが遮断したことを保証する。１ｕＬのポリマー−ビオチンストックを正および負の両方の対照チューブに添加する。短時間ボルテックスし、変速オービタルミキサーに移し、８００ＲＰＭで３０分間インキュベートする。

ビーズの測定：
１００μＬの全てのサンプルをBLACK ９６ウェルプレートに移す。バックグラウンドよりも高い測定可能なシグナルを達成するために必要とされるスリット幅および／または感度設定を用いて、ウェルを４３０ｎｍで励起し、４５０〜６５０ｎｍの範囲の発光を捕集する。正および負の対照のビーズの発光を比較する。

図１８は、ビオチン修飾ポリマーがストレプトアビジンミクロスフェアに結合されたことを示す（上）。図１８（下）において、蛍光光度計における４４０ｎｍでの励起は、実線の上側の曲線よって示されるように、ポリマーからの発光をもたらした。下側の実線の曲線は負の対照を表し、この場合、ビオチン化ポリマーによる処理の前に結合部位を遮断するために、まずストレプトアビジンビーズを過剰のビオチンで処理した。下側の実線の曲線は、ビーズのみを表す。

実施例３５：ＦＲＥＴ特性およびポリマー修飾の官能基活性を検証するための、ビオチン標識ポリマーの色素標識ＳＡコンジュゲートへの選択的結合
必要とされる材料：
ビオチン−ポリマーコンジュゲート：（４６μＭ）。Cy3-SAコンジュゲート（１ｍｇ／ｍＬまたは１８．９μＭ）。BLACK ９６ウェルプレート。

ビオチン−ストレプトアビジン複合体の形成：
１．５ｍＬミクロチューブ内で、９．４μＬのビオチン−ポリマーコンジュゲートおよび２．９μＬのCy3-SAを混ぜ合わせる。混合物をボルテックスしてから、振とう機（ホイル下で）において０．５時間インキュベートする。より長いインキュベーション時間も適している。

機器の設定：
以下の設定を用いて、蛍光モードのBioTek Synergy 4においてモデル実験を行った。発光：５ｎｍステップで４００〜７５０ｎｍおよび感度レベル：５０。

プレートレイアウト：
BLACK ９６ウェルプレートにおいて、以下の表のように溶液を調製する。全ての他の材料を添加した後、最後に注意深くＡ＋Ｂ溶液を添加する。

図１９は、ビオチン修飾ポリマーが色素標識ストレプトアビジンに結合したことを示す（Cy3またはTexas Red−上）。蛍光光度計における４４０ｎｍでの励起は、そのそれぞれの発光波長における色素受容体からの発光（それぞれ、約５７０ｎｍおよび６２０ｎｍ、左下）およびポリマーからのいくらかの残存する発光（約５２０ｎｍ）をもたらした。滴定も実施して、ストレプトアビジンへのポリマーの結合を飽和させた（右下）。実線の曲線は、４４０ｎｍの励起におけるポリマーからのエネルギー移動による、ストレプトアビジン上のCy3標識からの発光を示す。点線の曲線は負の対照を表し、この場合、ビオチン化ポリマーによる処理の前に結合部位を遮断するために、まずストレプトアビジンを過剰のビオチンで処理した。

実施例３６：フローサイトメトリーで使用するためのポリマー−ストレプトアビジンコンジュゲート
ポリマーバイオコンジュゲートは、フローサイトメーターにおいてBecton Dickinson (BD) Biosciencesで定義されるような染色指標（Stain Index）によって評価される。例えば、H.Maeker and J. Trotter, BD Biosciences Application Note: “Selecting Reagents for Multicolour Flow Cytometry”, Sept 2009を参照されたい。染色指標はポリマーの輝度の尺度、非特異的結合を報告し、フローサイトメーターにおける分解能指標にも関連し得る。フローサイトメトリーは、特異的ミクロスフェアにおける特異的表現型の細胞または対象の分析物を測定する方法を提供する。これは一次抗体の直接標識化を用いて行うこともできるし、あるいはシグナル増幅が所望される場合には、アビジン−ポリマーコンジュゲートを用いる二次抗体またはアビジン−ビオチン複合体形成によって行うこともできる。

細胞染色の手順
対象の細胞を十分な量、試験条件当たり少なくとも１０^５で採取する。次に、細胞を２５０ｒｃｆで３分間スピンダウンさせ、ＤＰＢＳ＋０．２％のＢＳＡおよび０．０５％のＮａＮ３（染色緩衝液）中で洗浄してから、１×１０^７細胞／ｍＬで染色緩衝液中に再懸濁させる。

一次インキュベーションのために、対象の抗原に特異的な一次コンジュゲート（レポーター標識抗体）と共に細胞がインキュベートされ、陰性細胞は、負の非特異的結合参照としての機能を果たす。対象集団または確立された市販のコンジュゲートは、正の対照として使用される。一次ポリマーコンジュゲートは、１０〜３３０ｎＭの容積希釈濃度の４×１０^５の細胞アリコートと共に、４℃で３０分間インキュベートされる。一次インキュベーションに続いて、細胞を５容積の染色緩衝液で洗浄し、２５０ｒｃｆで３分間スピンダウンさせ、この洗浄を３回繰り返す。０．２％のＢＳＡ、０．０５％のＮａＮ_３を加えたＤＰＢＳ中、８×１０^５細胞／ｍＬで試験するために細胞を再懸濁させる。

二次抗体の標識化のために、対象の抗原に対する非標識一次抗体を、０．４ｕｇ／ｕＬ、または他の滴定量で、試験条件当たり４×１０^５の細胞と共に、４℃で３０分間インキュベートする。一次インキュベーションの後、細胞を５容積の染色緩衝液で洗浄し、２５０ｒｃｆで３分間スピンダウンさせ、この洗浄を３回繰り返す。種反応性（species reactive）の第２のポリマーコンジュゲートを、１０〜３３０ｎＭの容積希釈濃度の４×１０^５の細胞アリコートと共に、４℃で３０分インキュベートする。第２のインキュベーションの後、細胞を５容積の染色緩衝液で洗浄し、２５０ｒｃｆで３分間スピンダウンさせ、この洗浄を３回繰り返す。０．２％のＢＳＡ、０．０５％のＮａＮ_３を加えたＤＰＢＳ中、８×１０^５細胞／ｍＬで試験するために細胞を再懸濁させる。

ストレプトアビジン−ポリマーコンジュゲートの標識化のために、二次抗体の標識化について上記で詳述したように、非標識一次抗体の代わりに対象のマーカーに対するビオチン化一次抗体と共に、細胞をインキュベートする。一次洗浄の後、細胞を再懸濁させ、４×１０^５細胞アリコートに分割し、１〜１００ｎＭの容積希釈のストレプトアビジン−ポリマーコンジュゲートと共に、４℃で３０分間インキュベートする。第２のインキュベーションの後、細胞を５容積の染色緩衝液で洗浄し、２５０ｒｃｆで３分間スピンダウンさせ、この洗浄を３回繰り返す。８×１０^５細胞／ｍＬで試験するために、０．２％のＢＳＡ、０．０５％のＮａＮ_３を加えたＤＰＢＳ中で、細胞を再懸濁させる。さらなるシグナル増幅が所望される場合、細胞を非標識一次抗体と共にインキュベートしてから続いて、ストレプトアビジンコンジュゲートとのインキュベーションの前に、種反応性ビオチン化二次抗体を加える。インキュベーションステップ、洗浄プロトコールおよび試験プロトコールは、既に詳述した通りに行われるべきである。

これらのフロー試験手順は、Cyto-trol細胞におけるＣＤ４マーカーに特異的に開発された。細胞の調製およびインキュベーションプロトコールは細胞型によって異なり得るが、最適な染色、洗浄および取扱いプロトコールは、細胞型に特異的に開発されるべきである。抗体の作用濃度範囲は、Cyto-trol対照リンパ球およびWhole Lysed Blood（一次抗体のみの場合）において、ＣＤ４（３５〜５０％集団）およびＣＤ４５（８５％集団）マーカーの両方のために最適であると確認されている。これらの範囲と大きく異なる集団を有するマーカーは、提唱される滴定範囲から外れることもある。

試験は、同様のプロトコールに従う培養において増殖されたJurkat細胞株についても行った。これらの試験では、ＣＤ４５マーカーを使用した。陰性細胞集団が存在しないので、異なる負の対照手順を使用した。負の対照サンプルでは、一次インキュベーションステップから一次抗体を省略した。このステップおよびその後の全てのステップは、標準プロトコールに従って実施した。再度、市販の色素−抗体または色素−ストレプトアビジンコンジュゲートを正の対照として使用した。

フローサイトメトリー分析のための手順
フロー試験は、BD LSR IIフローサイトメーターにおいて０．５ｍＬ容積の試験管で行った。フロー試験は、流れ設備のスタッフによる較正粒子を用いるサイトメーターの毎日の較正から決定される電圧設定を用いて実施される。前方散乱対側方散乱によるリンパ球特異的ゲーティングは、バックグラウンド対照としての非染色細胞サンプルにおいて実施される。標準の二重（doublet）ゲーティングは、前方散乱および側方散乱の面積対幅プロファイルの両方に対して実施される。単一の色だけの場合、補正は必要とされない。全ての前方および側方散乱パラメータのデータを集め、ＢＤの標準Pacific Blueチャネルを用いて蛍光測定を行う。Pacific Blueデータは、４０８ｎｍ紫色レーザーおよび４５０／５０ＢＰフィルタによる励起を用いる。規定されるゲーティングパラメータ内の３０，０００事象についてサンプルを捕集する。

代表的実験：
流動中のポリマー性能の分析のために、Cyto-trol細胞、凍結乾燥ヒトリンパ球において、ＣＤ４マーキングを測定した。提供された再構成緩衝液中でCyto-trol細胞（Beckman Coulter）を再構成し、室温で１５分間膨潤させた。次に、細胞を２５０ｒｃｆで３分間スピンダウンさせ、０．２％のＢＳＡおよび０．０５％のＮａＮ_３を加えたＤＰＢＳ（染色／試験）中で洗浄してから、染色緩衝液中に１×１０^７細胞／ｍＬで再懸濁させた。細胞懸濁液を２つに分け、半分については、細胞を０．４ｕｇ／ｕＬのビオチン化抗ＣＤ４と共にインキュベートした。残りの半分については、負の対照として、細胞を染色緩衝液と共に３０分間インキュベートした。一次インキュベーションの後、細胞を５容積の染色緩衝液で洗浄し、２５０ｒｃｆで３分間スピンダウンさせ、この洗浄を３回繰り返す。細胞を前述の容積で染色緩衝液中に再懸濁させた。試験当たり４×１０^５の細胞を測定し、それに応じて分割し、実施例１９で調製したストレプトアビジン−フルオロフォアコンジュゲートを１００ｎＭで細胞の各アリコートと共に３０分間インキュベートして、アビジン−ビオチン複合の形成を可能にした。第２のインキュベーションの後、既に詳述したように、細胞を洗浄した。８×１０^５細胞／ｍＬで試験するために最終の細胞懸濁液を作製した。

フロー分析は、The Scripps Research Institute (ＴＳＲＩ) (San Diego, California)において、ＢＤＬＳＲＩＩフローサイトメーターで実施した。サイトメーターにおける蛍光チャネルのアライメントのためのRainbow蛍光粒子による日常的な較正はＴＳＲＩのスタッフによって実施され、スタッフの勧めにより全ての較正された電圧を使用した。全てのサンプルを４０８ｎｍ紫色レーザーで励起し、５２５／５０フィルタを用いてAmCyanチャネルポリマーコンジュゲートを測定した。全てのサンプルは、最初は、非染色細胞に参照される。図１４からのポリマーストレプトアビジンコンジュゲートは、集団の４４％として陽性細胞を有する、一次同定されたＣＤ４陽性細胞の特異的な二次標識化を示した。ポリマーストレプトアビジンコンジュゲートは正の染色指標を実証し、非染色細胞およびそのそれぞれの負の対照に関連して低い非特異的結合を示した（図２０．（Ａ））。これにより、ポリマーは、そのピーク吸光度が４４０ｎｍであるにもかかわらず、紫色レーザー励起によるフローサイトメトリーにおいて使用するために実行可能な蛍光材料であることの証拠が提供される。

Cyto-trol細胞における二次抗体ポリマーコンジュゲート
マレイミド−チオール共役および抗体のＴＣＥＰ部分還元のルートにより、アミン官能化４０５ポリマーをヤギ抗マウスＩｇＧκ１精製抗体に共役させた。ポリマーおよび共役手順は、実施例４６に具体的に提供されている。

特異的ヒト抗原の対照試験のために、コンジュゲートをCyto-trol細胞（Beckman Coulter）、固定および凍結乾燥リンパ球細胞集団において試験した。細胞染色は第２の細胞染色プロトコールに従った。ヒト抗原に対してマウス中で産生された非標識抗ＣＤ４（RPA-T4クローン、BD Biosciences）の存在下および非存在下（負の対照）で細胞をインキュベートした。一次抗体インキュベーションの洗浄が完了したら、一次同定されたＣＤ４陽性細胞の特異的標識化のために、細胞をポリマー標識ヤギ抗マウスコンジュゲートと共にインキュベートした。第２の標識化は、マウス種に対して産生された二次ヤギＩｇＧによるＦｃ認識およびマウス一次抗体の結合によって生じる。正の対照は、第２の標識化種として市販のPacific Blueヤギ抗マウスＩｇＧ（Invitrogen）と共にインキュベーションすることによって使用した。

図２０（Ｂ）は、第２の蛍光のコンジュゲートによるＣＤ４特異的細胞の特定的認識を示す。非染色細胞は負の対照および細胞の天然の自己蛍光を示し、一次標識化を伴わない細胞におけるポリマーコンジュゲートのインキュベーションは、非標識細胞のコンジュゲートの最低限の非特異的結合を示す。正の対照のPacific Blueヤギ抗マウスは、紫色励起により二次抗体で標識化されたＣＤ４のための市販の標準を示す。４０５ポリマー−ヤギ抗マウスコンジュゲート（赤色）は、ＣＤ４陽性細胞の正の同定、陰性細胞集団の最低限のシフトならびにPacific Blue標準の大きい蛍光シグナルおよび分解能を示す。

図２０（Ｃ）は、Jurkat細胞におけるストレプトアビジンポリマーコンジュゲートを示す。コンジュゲートは、実施例２９で定義されるプロトコールを用いて実施例１１で提供されるポリマーと共に作製した。ポリマーストレプトアビジンコンジュゲートの染色指標は、市販のPacific Blueストレプトアビジン対照コンジュゲートで得られる場合よりも１０倍を超えて高かった。

図２０（Ｄ）は、上記のプロトコールを用いてCyto-trol細胞において評価した一次モノクローナル抗体ポリマー（抗ＣＤ４、ＲＰＡ−Ｔ４）コンジュゲートを示す。コンジュゲートは、実施例４６で定義されるポリマーおよびプロトコールを用いて調製した。共役についての付加的詳細は、実施例３９においても見出すことができる。

実施例３７：ＥＤＣカップリングによる、
−ＣＯＯＨビーズに共役されたポリマーの調製
材料（ビーズ１００μＬ当たり）：
LodeStars−ＣＯＯＨ官能化磁性ビーズ（Varian, Inc. PL6727-0001）（spec’d ３０ｍｇ／ｍＬにおける１００μＬの懸濁液）。実施例１７からのアミン末端部を有するポリマー（１２５μＬ、２５ｍＭのＭＥＳｐＨ５中１．６μＭ、理論的なビーズ容量よりも１０倍過剰）。１０ｍＭのＮａＯＨ（２ｍＬ）。ＤＩＨ２Ｏ（３ｍＬ）。２５ｍＭの冷ＭＥＳ（ｐＨ５）。２５ｍＭの冷ＭＥＳ（ｐＨ５）中５０ｍｇ／ｍＬのＥＤＣ（１００μＬ）。２５ｍＭの冷ＭＥＳ（ｐＨ５）中５０ｍｇ／ｍＬのＮＨＳ（１００μＬ）。１００ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌｐＨ７．４（１ｍＬ）。遠心分離機および黒色平底９６ウェルプレート。

抗体容量は、１０ｕｇ／ｍｇのビーズにおいて与えられ、ポリマー／ｍＬビーズ（３０ｍｇ／ｍＬにおける）のアミンカップリング容量が与えられた。Varianのプロトコールにおいて与えられる抗体濃度を標的とするために、提唱される容量よりも１０倍過剰のポリマーを使用した。

ビーズの洗浄
ビーズを合計６００μＬとして洗浄してから、カップリングのために６×１００μＬサンプルに分けた。２×１ｍＬの１０ｍＭのＮａＯＨ、次に３×１ｍＬのＤＩＨ２Ｏでビーズを洗浄し、洗浄と洗浄の間に、チューブを３０００ｒｐｍで１分間遠心分離して、ビーズをペレットとして再捕集し、上澄みを廃棄し、次の洗浄においてビーズを再懸濁させた。最終の洗浄の後、ビーズを６００μＬの冷たい２５ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５）中に再懸濁させ、微量遠心管内に６×１００μＬの容積に等分した。ビーズを３０００ｒｐｍで１分間再度遠心分離し、上澄みを廃棄した。

ＥＤＣの活性化
１００μＬのＥＤＣ溶液を各反応セットに添加した。１００μＬのＮＨＳ溶液を各反応セットに添加した。ビーズをボルテックスにより再懸濁させてから、ローテータにおいて３０分間混合させた。ビーズを冷たい２５ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５）中で２回洗浄し、３０００ｒｐｍで１分間の遠心分離によりペレットにし、上澄みを廃棄した。ビーズを１２５μＬの冷たい２５ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５）中に再懸濁させた。

ポリマーカップリング
１２５μＬの１．６μＭのポリマーを添加した。サンプルをボルテックスし、十分に混合してから、ミキサーにおいてＲＴで３時間反応させた。３０００ｒｐｍで１分間の遠心分離によってビーズをペレットにし、上澄みを廃棄した。ビーズを１ｍＬの１００ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ中に再懸濁させて未反応−ＣＯＯＨ部位を遮断し、ボルテックスし、１時間混合した。

遠心分離によってビーズを再捕集し、１００μＬの２５ｍＭのＭＥＳ中に再懸濁させた。この時点で、いくつかのチューブの上澄みは黄色であり、４４０ｎｍにおいて著しい吸光度を有した。吸光度がベースラインになるまでビーズを６回洗浄した。ビーズを蛍光測定の前にさらに２日間静置し、溶液中で２日間静置したした後、上澄みは再度黄色になり、測定可能な吸光度を有した。吸光度が測定されなくなるまで、ビーズをらさらに３回洗浄し、合間に３０分間混合した。蛍光測定の２日後、上澄みは透明なままであり、測定可能な吸光度はなかった。

実施例３８：ポリマー−色素コンジュゲートの調製
実施例３８ａ：ポリマー末端におけるポリマー−色素コンジュゲートの調製

０．５ｍｇのアミン末端ポリマーを１５μＬのＤＭＳＯ中に溶解した。次にポリマー溶液を、５０ｍＭのＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３（ｐＨ８）緩衝液に交換し、ＵＶ−ＶＩＳ吸光度により決定されるように、緩衝液中約５ｍｇ／ｍＬで回収した。５０μｇのＮＨＳ−エステル色素（DyLight 594）を１０ｍｇ／ｍＬで無水ＤＭＳＯ中に溶解させ、次にこれを直ちに１２０μｇのポリマーに添加した。チューブを振とう機（６００〜８００ｒｐｍ）上で１時間混合し、続いて、２０％のＥｔＯＨ水で１００μＬに希釈した。混合物を０．６ＭのＮａＣｌおよび２０％のＥｔＯＨ中で３０ｃｍ Superdex 200 SEC カラムに添加し、ポリマー−色素コンジュゲートを未反応色素から分離した。色素の添加を用いて、ポリマーおよび色素の相対吸光係数に基づいて吸光度比を測定することによって、ポリマー構造中のリンカーの取込みを評価することができる。ポリマーの分子量を用いて、リンカーを含有するポリマー鎖の数を評価することが可能である。

付加的な実施形態において、カルボン酸側鎖を有するポリマーは、標準ＥＤＣ共役手順を用いて、あるいはまず実施例２９に記載されるものと同様のプロトコールを用いてＮＨＳエステルに転換することによって、アミン官能性色素により修飾される。マレイミド末端ポリマーに共役されたチオール色素も実証されている。どんな範囲の化学対も同様に作用して、ポリマーおよび色素を共役させることが予想され得る。

実施例３８ｂ：内部位置におけるポリマー−色素コンジュゲートの調製

グローブボックス内で、１００ｍｇの内部アミン官能性を有するポリマーを２０ｍＬの琥珀色シンチレーションバイアル中の１０ｍＬの無水ＤＭＳＯ中に溶解させた。０．３２ｍＬのＤＩＰＥＡをポリマー溶液に添加した。２４ｍｇのＮＨＳ−エステル色素（Cy3）を２．４ｍＬの無水ＤＭＳＯ中に溶解させ、ポリマー溶液に添加した。バイアルをしっかり密封してから、グローブボックスから取り出し、室温で４８時間攪拌した。次に、全ての遊離色素が除去されるまで、２０％のエタノール水を用いてAmicon Ultra遠心ろ過装置（ＭＷＣＯ＝３０ｋＤａ）により反応を精製した。０．１５ｍｇのサンプルを０．６ＭのＮａＣｌおよび２０％のエタノール中で３０ｃｍ Superdex 200 SECカラムに流すことによって、純度を検証した。収量９０ｍｇ（９０％）。

色素の添加を用いて、ポリマーおよび色素の相対吸光係数に基づいて吸光度比を測定することによって、ポリマー構造中のリンカーモノマーの取込みを評価することができる。上記のポリマーの場合、最終ポリマー中のフルオレンモノマー当たりのリンカーモノマー（または色素の結合）の比率は、一般に、重合反応において使用されるモノマーのモルフィード比と一致する。

カルボン酸側鎖を有するポリマーも、標準ＥＤＣ共役手順を用いて、あるいはまず実施例２９に記載されるものと同様のプロトコールを用いてＮＨＳエステルに転換することによって、アミン官能性色素により修飾することができる。

Cy3、DyLight 549、DyLight 633、FAM、FITC、Alexa 633、Alexa 647およびいくつかの他の色素を含む、様々な色素を共役させるために、類似の手順を使用することができる。カルボン酸側鎖を有するポリマーは、標準ＥＤＣ共役手順を用いて、アミン官能性色素により修飾することもできる。

図２１（Ａ）は、（左から右へ）FITC、Cy3、DyLight 594およびDyLight 633に共役された上記のポリマー構造を示す。ポリマー単独は、参照のために示される（一番左）。いずれの場合も、残留する供与体（ポリマー）発光の量が最小限であることに注意する。データは、多重用途のために異なる波長におけるいくつかの特徴的なシグナルを生成する能力を強調する。この実施形態では、単一の光源が５つの別個の発光波長を生成することができる。

実施例３８ｃ：ポリマータンデムコンジュゲートで使用するためのポリマーの励起に基づいたポリマー−色素コンジュゲートのエネルギー移動の評価
図２１（Ｂ）は、その吸収最大値近くで励起された色素（DyLight 594）（下側の曲線）と、４０５ｎｍで励起されたポリマー−色素コンジュゲート（上側の曲線）との蛍光の比較を示す。約６２０ｎｍでの色素発光は、同じモル濃度の色素において、直接色素励起に対して、ポリマー−色素コンジュゲートの方が５倍を超えて明るかった。このような実施形態では、エネルギー移動プロセスにおいて、開示されるポリマー供与体により提供されるシグナル増幅が強調される。左上角の絵は、色素共役に基づいた複合体の発光における目に見える色の変化を強調する。ポリマー溶液は色素が存在しないと青色を発光し、色素共役（精製後）の場合は赤色を発行する。

図２１（Ｃ）は、ベースポリマー（色素なし、４２０ｎｍ付近のピーク発光）の蛍光シグナルと、ポリマー−色素コンジュゲート（６２０ｎｍ付近のピーク発光）の蛍光シグナルとを比較する。DyLight 594色素は、上記のポリマーに共役されると、ポリマーの発光の９８％を消光する（実施例３８ｂ）。多重アッセイ形式では残りの供与体の発光はどれもバックグラウンドシグナルとして現れるので、これはポリマー材料の特徴である。色素をポリマー構造に直接共役させ、そして結合部位の数を変更する能力は、化学的設計によって制御することができる効率的な移動を提供する。

実施例３９：モノクローナル抗体（抗ＣＤ４）コンジュゲートの全溶解血液サンプル
におけるフロー試験
実施例４５、４６および４９に提供されるように、３つの異なる共役ルートを用いて、一次抗ＣＤ４抗体（ＲＰＡ−Ｔ４クローン）のポリマーコンジュゲートを生成した。１）ＳＭＣＣ（マレイミド／ＮＨＳクロスリンカー）を用いてマレイミド反応基に転換されたアミン修飾ポリマーと、ＳＡＴＡ（チオール／ＮＨＳクロスリンカー）をリジン（アミン）基と反応させることにより導入された抗体上のチオール基とを反応させる（ＣＪ１１−２、図２２）。２）ＳＭＣＣ（マレイミド）で修飾された同じポリマーと、抗体中のジスルフィド連結を部分的に還元するためにＴＣＥＰを用いて抗体上に導入されたチオール基とを反応させる（ＣＪ１３−２、図２２および図２０Ｄ）。３）ＮＨＳエステルを形成するためにＴＳＴＵで活性化されたカルボン酸末端ポリマーを、抗体上のリジン（アミン）基と直接反応させた（ＣＪ０４−２図２２）。全てのコンジュゲートを同じポリマー構造およびバッチから作製した。ポリマーは、実施例１２に示されるプロトコールを用いて、示されるカルボン酸キャッピング単位の代わりにアミン末端キャッピング単位により合成した。ＮＨＳ／アミン共役は、実施例４５に記載されるプロトコールにより行った。マレイミド／チオールの共役反応は、実施例４６および４９に記載されるようなプロトコールによるラインで行った。

図２２は、以下のよう行われたフローサイトメトリーにおけるこれらのコンジュゲートの性能を示す。健康なボランティアからの１００μＬの全ヒト血液をＦＡＣＳチューブに等分した（各サンプルに対して２通り）。抗体コンジュゲートを洗浄緩衝液（０．５％のＢＳＡおよび０．１％のアジ化ナトリウムを有するＰＢＳ）中に希釈し、指定される濃度で血液に添加した。サンプルを勢いよくボルテックスしてから、室温の暗所において１５〜３０分間インキュベートした。２ｍｌの１×BD FACS Lyse溶液を各サンプルに添加し、勢いよくボルテックスすることにより混合した後、室温の暗所においてさらに１０分間のインキュベーションを行った。サンプルを５００ｇで５分間遠心分離し、上澄みを傾けて除去し、廃棄した。サンプルをボルテックスし、３ｍｌの洗浄緩衝液（０．５％のＢＳＡおよび０．１％のアジ化ナトリウムを有するＰＢＳ）を添加した。遠心分離を５００ｇでさらに５分間繰り返した。得られた上澄みを傾けて除去し、廃棄し、残った細胞ペレットをボルテックスした。BD CSTビーズに対して設定および事前較正された紫色レーザーおよび４５０／５０ｎｍフィルタを備えた全ての紫色チャネルを獲得するBD LSRIIフローサイトメーターにおいてサンプルを流した。全てのポリマーコンジュゲートサンプル（CJ04-2、CJ11-2およびCJ13-1ライン）は、非染色細胞と比較して、最低限の非特異的結合を示した。さらに、全てのポリマーコンジュゲートは、両立可能な波長におけるフローサイトメトリーのために一般に使用される同じ抗体クローンの市販のPacific Blue対照コンジュゲートよりも著しく高い正のシグナルを生じた。このセットからの最良性能のコンジュゲートは、市販のPacific Blue対照抗体よりも６倍を超えて高い染色指標を提供する。

実施例４０：ポリマー−色素コンジュゲートの調製

ポリマーを色素、Dylight 594に共役させ、実施例３６に記載される方法と同様の方法で精製する。図２３は、色素（DyLight 594）およびポリマー−色素コンジュゲートの蛍光の比較を示す。色素は５９４ｎｍで励起させ、ポリマー−色素コンジュゲートは３８０ｎｍで励起させた。

実施例４１：ストレプトアビジン−共役ポリマーによる蛍光イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）
ヒトＩｇＧについてのイムノアッセイは、９６ウェルプレート形式における例証的なシステムとして開発された。さらなる実施形態において、同様の機能性は、懸濁ミクロスフェアおよびタンパク質チップマイクロアレイを含む他の形式において等しく適用可能であり得る。

ステップ１：試薬の調製
洗浄濃縮液は、７９．２ｇのＴｒｉｓ塩基プリセット結晶（ｐＨ７．７）、２２５ｇの塩化ナトリウムおよび０．５ｇのThimerosolを１０００ｍＬの脱イオン水中に溶解させることによって調製した。洗浄溶液は、１００ｍＬの洗浄濃縮液を２４００ｍＬの脱イオン水に添加することによって調製した。続いて、１０ｍＬの１０％のTriton X-100を添加した。基本アッセイ緩衝液は。１４．８ｇのＴｒｉｓ塩基プリセット結晶（ｐＨ７．７）、１８ｇの塩化ナトリウムおよび０．５ｇのThimerosolを２０００ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水（伝導率１８．２ｍΩｃｍ）中に溶解させることによって調製した。続いて、２ｍＬの１０％のＴｗｅｅｎ２０および１０ｇのウシ血清アルブミン画分Ｖ（本質的にガンマグロブリンを含まない）を添加した。溶液をろ過し、４℃で貯蔵した。

ステップ２：捕捉抗体被覆プレートの調製
Nunc white Maxisorp ９６ウェルプレートの表面に、ウェル当たり約１マイクログラムの濃度で捕捉抗体を被覆した。プレートを密封し、４℃で一晩貯蔵した。続いて、プレートを洗浄溶液で１回洗浄し、吸収紙でタップ乾燥（tapped dry）させた。他に言及されない限り、この実施例の全てのプレート洗浄は、自動マイクロタイタープレート洗浄機において実施した。二百五十（２５０）マイクロリットルのブロッキング緩衝液（２％のＢＳＡを含有する０．１ＭのＰＢＳ）を各ウェルに添加した。プレートを再密封し、使用するまで４℃で貯蔵した。

ステップ３：イムノアッセイ
捕捉抗体被覆マイクロタイタープレートを洗浄溶液で２回洗浄し、吸収紙でタップ乾燥させた。被覆プレートの適切なウェルに、二百（２００）μＬのアッセイ標準または実験的に未知のサンプルのいずれかを４通り添加した。プレートを振とう機において１８℃で２時間インキュベートした。続いて、プレートを洗浄溶液で３回洗浄し、吸収紙でタップ乾燥させ、２００μＬのビオチン化検出抗体を予め決定された最適濃度（アッセイ緩衝液中に希釈し、使用前にろ過する）で各ウェルに添加した。プレートをオービタルシェーカーにおいて周囲温度でさらに６０分間インキュベートした。次に、プレートを３回洗浄し、吸収紙でタップ乾燥させた。二百（２００）μＬの０．２ミクロンシリンジろ過したストレプトアビジン−ポリマーコンジュゲート（実施例３０で調製）を、アッセイ緩衝液において適切である予め決定された濃度に希釈した。ポリマーは、中性ＰＥＧ１１側鎖およびアミン共役部位を有するフルオレンポリマーであった。プレートをオービタルシェーカーにおいて周囲温度でさらに２時間インキュベートした。次に、プレートを６回洗浄し、タップ乾燥させ、１８０°回転させ、さらに６回再洗浄した。プレートを再度吸収紙でタップ乾燥させた。二百（２００）μＬのろ過した放出試薬（０．１Ｍの水酸化ナトリウム、２％のTriton X-100）を、マルチチャネルピペットを用いて添加し、プレートを周囲温度で６０分間振とうさせ、Victor蛍光光度計により蛍光を測定した。次に、プレートを密封し、４℃で一晩貯蔵し、翌朝Victor蛍光光度計において再度読み取った。Perkin ElmerのMulticalc Softwareを用いて蛍光カウントを分析し、アッセイ検出の下限を決定し、類似のパラメータを分類した。代替の条件も評価して、コンジュゲートをウェルプレート表面から放出して、蛍光の読取りを改善した。代表的なデータセットは図２４に示される。市販のＳＡ−色素コンジュゲートとの比較も行った。ポリマーコンジュゲートは、集合的な光学特性のために予想された通り、色素コンジュゲートと比べて優れた検出限界を実証した。

実施例４２：バイオコンジュゲーションのための活性官能性リンカーを有するパラ−フェニレンビニレンコポリマーの合成、共役および適用

フェニルブトキシアミノ末端を有するポリ（１，４−（ジ２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２−ウンデカオキサテトラトリアコンタン−３４−イル２，５−ジブロモテレフタレート）−ビニル−ａｌｔ−パラ（２−メトキシ−５−２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２−ウンデカオキサテトラトリアコンタン−３４−イルベンゼン）−ビニレン）
小型丸底フラスコ（テフロン攪拌子を備え、ニードルバルブが取り付けられている）内で、ジ−２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２−ウンデカオキサテトラトリアコンタン−３４−イル２，５−ジブロモテレフタレート（２．０ｇ、１．５２ｍｍｏｌ），３４−（４−メトキシ−２，５−ジビニルフェノキシ）−２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２−ウンデカオキサテトラトリアコンタン（１．１１ｇ、１．５２ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム（１３．６ｍｇ、０．０６１ｍｍｏｌ）、トリ−ｏ−トリルホスフィン（３７ｍｇ、０．１２１ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１ｍＬ、７．６ｍｍｏｌ）および４ｍＬのＤＭＦを混ぜ合わせ、Schlenkラインに移した。３回のfreeze-pump-thawサイクルにより溶液を脱気し、窒素下に置き、常に攪拌しながら一晩１００℃に加熱した。次に、ニードルバルブが取り付けられた小型丸底フラスコ内で、ジ−２，５，８，１１，１４，１７，２０，２３，２６，２９，３２−ウンデカオキサテトラトリアコンタン−３４−イル２，５−ジブロモテレフタレート（２．０ｇ、１．５２ｍｍｏｌ）（１００ｍｇ、５ｍｏｌ％）、酢酸パラジウム（５ｍｇ）、およびトリ−ｏ−トリルホスフィンおよび０．５ｍＬのＤＭＦを混ぜ合わせ、Schlenkラインに移した。３回のfreeze-pump-thawサイクルにより溶液を脱気し、室温に暖めてから、カニューレにより重合反応に移し、空気および水分を除去した。混合物を一晩反応させた。次に、小型丸底フラスコ（テフロン攪拌子子を備え、ニードルバルブが取り付けられている）内で、４−（４−ブロモフェノキシ）ブタン−１−アミン（４３ｍｇ、１５ｍｏｌ％）および０．５ｍＬのＤＭＦを混ぜ合わせ、Schlenkラインに移した。室温まで温めたら、溶液をカニューレにより重合反応に移し、空気および水分を除去した。混合物を一晩反応させた。翌日、反応を室温まで冷却し、トリエチルアミンの大部分を真空下で除去した。反応混合物を約３０ｍＬの水で希釈し、Ｇ６ガラス繊維ろ紙によりろ過した。ろ液をいくつかのAmiconフィルタ（１０ｋＤａカットオフ）に移し、ポリマーを濃縮し、ＤＭＦを除去した。残りの水を真空下で除去し、残渣を塩化メチレン中に抽出する。塩化メチレン溶液を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、ろ過した。溶媒を除去し、暗赤色の粘性油（約９００ｍｇ）が残された。

ポリマーは、ポリスチレン標準に対するＧＰＣ分析によって決定されるように、２０，４００ｇ／ｍｏｌのＭｎを有することが分かった。アミンリンカーの取込みは、実施例３８に記載されるような最終ポリマーに色素を共役させることによって検証した。

次に、ポリマーを以下のようにストレプトアビジンタンパク質に共役させた：アミンポリマーを５０ｍｇ／ｍｌで溶解させ、脱塩し、緩衝液を１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に交換した。吸光度によりポリマー濃度をアッセイし、２５モル等量のＳＭＣＣ（無水ＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍｌ）を添加た。反応を室温で６０分間混合してから、脱塩し、緩衝液を５ｍＭのＥＤＴＡを加えたＰＢＳ（ｐＨ７．０）に交換した後、ＳＡＭＳＡ−フルオレセイン色素試験によるポリマー濃度の決定およびマレイミド官能性の確認を繰り返した。２０モル等量のＳＡＴＡ（無水ＤＭＳＯ中５ｍｇ／ｍｌ）の添加によりストレプトアビジン（１００ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．５中５ｍｇ／ｍｌ）を活性化した。反応を室温で６０分間混合した後、１０％（ｖ／ｖ）の５０ｍＭのＥＤＴＡ、２．５ＭのヒドロキシルアミンｐＨ７．０により失活させた（室温で１５分より長い）。活性化タンパク質を脱塩し、緩衝液を活性化ポリマーと同じ緩衝液に交換した後、Ｅｌｌｍａｎ’ｓアッセイを実施し、チオールの取込みを確認および定量化した。活性化ポリマーおよびストレプトアビジンは両方とも遅延なしに以下のように使用した。１桁より多くモル過剰のＳＭＣＣ活性化ポリマーを、ＳＡＴＡ活性化ストレプトアビジンに添加し、２つを室温で２時間混合した後、２０モル等量のＮ−エチルマレイミドにより失活し、これを室温で１５分間混合した。イオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィを用いて、未反応ポリマーおよびストレプトアビジンのバイオコンジュゲ―トを精製した。適切な画分を貯留して、収量および性能を最大にしてから、限外ろ過により濃縮した。

コンジュゲートを試験し、その性能を、モデルLuminex xMapアッセイ（図２７、左）における目的で設計された市販のストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＳＡ−ＰＥ）コンジュゲートと比較した。ロバ抗マウスＩｇＧ抗体をxMapビーズに共有結合させた。次に、Luminex xMapアッセイ条件下でマウスＩｇＧの標準曲線滴定を実施した（図２７、右）。４ｍｇ／ｍＬの上記で調製したストレプトアビジン−フィコエリトリンまたはストレプトアビジン共役ポリマーコンジュゲート（濃度は厳密には調節されない）のいずれかを用いて、複製サンプルを検出した。次に、サンプルをLuminex instrumentにおいて読み取った。共役ポリマーを用いると、絶対シグナルはより低いことが分かった。これは、部分的に、ポリマースペクトルと機器の励起および発光の光学系との間の非理想的な一致と、市販のフィコエリトリン製品と比較して使用される検出試薬の濃度が推定的により低いこととに起因した。しかしながら、ポリマーからの比例するバックグラウンド（非特異的シグナル）も著しく低く、両方の検出形式（標準曲線における蛍光最高点／分析物の蛍光ゼロ濃度（ＭＦＩ／ゼロ）：２１．８ＰＥ、２６．６ポリマー）に対して非常に類似した検出下限が得られた。

実施例４３：ＤＰＰバンドギャップ修飾単位を有するフルオレンコポリマーの合成

２５ｍＬの丸底フラスコに、ＰＥＧ化ジブロモ−ＤＰＰモノマー（１１０ｍｍｏｌ）、ＰＥＧ化フルオレンジボロン酸エステル（１１０ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（２．４ｍＬ）溶媒、２ＭのＫ_２ＣＯ_３（１．６ｍＬ）およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（３．３ｍｍｏｌ）触媒を添加した。３回のfreeze-pump-thawサイクルにより混合物を脱気してから、アルゴン下で、８０℃で一晩攪拌した。得られた混合物を室温にし、水で希釈した。ジクロロメタン抽出の後ポリマーを捕集した。

得られたポリマーは、５２０ｎｍにおける吸収最大値および５９０ｎｍにおける発光最大値を有し、量子収率が水中で６％であることが分かった。ポリマーは、ポリスチレン標準に対するＧＰＣ分析により１６，０００と見積もられるＭＷを有し、水、メタノールおよびジクロロメタン中に可溶性であった。

末端リンカーの取込みは、上記の方法に類似しており、実施例９、１０および１１に記載される方法を含む方法を用いて実施することができる。

実施例４４：置換ジビニルベンゼンポリマーの合成

上記のポリマーを調製するために使用される方法は、実施例３８で提供される方法と類似していた。本明細書に記載されるジビニルベンゼンポリマーの調製のために一般的な方法は、当該技術分野において既知の反応および本明細書において見出される方法から誘導することができ、本明細書において提供される式中に見出される種々の部分の導入のために、当業者によって認識され得るように適切な試薬および条件の使用により反応は修正されてもよい。

実施例４５：一次抗体上のアミンへのポリマーの共役

ＮＨＳエステルポリマー−抗体コンジュゲートの生成のための手順
一次モノクローナル抗体、抗ＣＤ４（ＲＰＡ−Ｔ４クローン）を脱塩し、５０ｍＭのＮａＨＣＯ_３緩衝液（ｐＨ８．２）１ｍｇ／ｍＬに交換する。濃縮したＮＨＳ官能化ポリマーを無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に１００ｍｇ／ｍＬで溶解させる。ポリマー溶液を３０倍のモル過剰の抗体で抗体溶液中に添加し、ＲＴで３時間攪拌することによって混合させた。タンパク質濃度を緩衝液により調整した後、インキュベーションして、有機溶媒の容積が全容積の１０％未満であることを保証する。１０ＫＤａ MWCOフィルタデバイスによる限外ろ過の後、イオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィ技術を次に用いて、未反応ポリマーおよび抗体のバイオコンジュケートをそれぞれ精製した。適切な画分を貯留して収量を最大にし、緩衝液をＰＢＳ＋０．０５％のＮａＮ_３に交換し、上記のように限外ろ過によって同時に濃縮した。標識化の程度（上記のｐで示される）は、４０５ｎｍにおける吸光度および補正された２８０ｎｍ値によって決定した。実施例３９（図２２）で提供されるポリマーコンジュゲート（ＣＪ０４−０２）は、約２．０４のＦ／Ｐ（抗体当たりのポリマーの＃）を有した。このコンジュゲートは、染色指標の測定によって決定されるように、同じ抗体のPacific Blue対照コンジュゲートよりも３倍を超えて高い流動性能を実証した。

実施例４６：マレイミド／チオール化学を用いる、ポリマーの抗体への共役
部分的に還元された抗体へのポリマーマレイミド／チオール共役

二次抗体、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）をＰＢＳ＋１０ｍＭの酢酸中に再構成し、１．０ｍｇ／ｍＬにおいて、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．４）に脱塩／交換した。ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）を、１０ｍＭの最終ＴＣＥＰ濃度の６モル過剰で、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中に溶解させ、室温で３０分混合した。修飾されたタンパク質をＰＤ−１０脱塩カラムにより精製して過剰のＴＣＥＰを除去し、反応緩衝液（１０ｍＭのＥＤＴＡを有する１００ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ６．５反応緩衝液）に交換した。アミン活性化ポリマーを無水ＤＭＳＯ中に１０ｍｇ／ｍＬ溶解させ、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）リンカーと混合した。リンカーをＤＭＳＯ中５０ｍｇ／ｍＬ、２０モル過剰でポリマー溶液に添加し、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）により活性化した。反応をAmicon Ultra遠心分離フィルタにより精製し、反応緩衝液（１０ｍＭのＥＤＴＡを有する１００ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ６．５）に交換した。ジスルフィド反応の直後に、反応緩衝液中のマレイミド官能化ポリマーを１０ｍｇ／ｍＬで２０モル過剰の抗体に添加し、４時間混合させた。イオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィ技術を次に用いて、未反応ポリマーおよび抗体のバイオコンジュケートをそれぞれ精製した。標識化の程度（上記のｐで示される）は、４０５ｎｍにおける吸光度および補正された２８０ｎｍ値によって決定した。実施例３６（図２０Ｂ）で提供されるポリマーコンジュゲートは、約２のＦ／Ｐ（抗体当たりのポリマーの＃）を有した。このコンジュゲートは、染色指標の測定によって決定されるように、同じ抗体のpacific blue対照コンジュゲートよりも４倍を超えて高い流動性能を実証した。

チオール修飾抗体へのポリマーのマレイミド／チオール共役

二次抗体、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）をＰＢＳ＋１０ｍＭの酢酸中に再構成し、１００ｍＭのリン酸ｐＨ７．５緩衝液に脱塩／交換した。ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート）を無水ＤＭＳＯ中に溶解させ、１５モル過剰で添加し、室温で６０分間混合した。ヒドロキシルアミン溶液で失活させた後、修飾されたタンパク質をＰＤ−１０カラムにより脱塩し、過剰のＳＡＴＡを除去し、反応緩衝液（５ｍＭのＥＤＴＡ、ＰＢＳｐＨ７．０緩衝液）に交換した。アミン活性化ポリマーを無水ＤＭＳＯ中に１０ｍｇ／ｍＬで溶解させ、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）リンカーと混合した。リンカーをＤＭＳＯ中５０ｍｇ／ｍＬ、２０モル過剰でポリマー溶液に添加し、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）により活性化した。反応をAmicon Ultra遠心分離フィルタにより精製し、反応緩衝液（５ｍＭのＥＤＴＡ、ＰＢＳｐＨ７．０緩衝液）に交換した。抗体の活性化の直後、１０ｍｇ／ｍＬの反応緩衝液中のマレイミド官能化ポリマーを２０モル過剰の抗体に添加し、４時間混合させた。イオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィ技術を次に用いて、未反応ポリマーおよび抗体のバイオコンジュケートをそれぞれ精製した。標識化の程度（上記のｐで示される）は、４０５ｎｍにおける吸光度および補正された２８０ｎｍ値によって決定した。得られた精製コンジュゲートを、ＴＣＥＰ還元を用いて調製されたコンジュゲート（データは提供せず）について実施例３６に記載されてものと同様にして流動試験した。

実施例３９で定義されたポリマー構造を使用し、上記の実施に記載したものと同様にして、一次抗ＣＤ４（ＲＰＡ−Ｔ４）抗体コンジュゲートを調製した。３０当量のポリマーをＳＡＴＡ修飾抗体（CJ11-2、図２２）およびＴＣＥＰ還元抗体（CJ13-1、図２０Ｄおよび図２２）と反応させ、精製後にフローサイトメトリーアッセイにおいて試験するためにポリマーコンジュゲートを生成した。実施例２３および２６からのＳＭＣＣ修飾ポリマーも、ＴＣＥＰ還元法を用いて抗ＣＤ４（RPA-T4）および抗ＣＤ８（RPA-T8）抗体にうまく共役させた。ＴＣＥＰの代わりにＤＴＴ還元もうまく実施された。抗ＣＤ４および抗ＣＤ８コンジュゲートのフローサイトメトリーにおける性能は、実施例３９（図２２）に記載されるものと同様にして評価した。

実施例４７：ＤＮＡオリゴマーへのポリマーの共役

アルキン末端ＤＮＡオリゴへのClick共役のためのアジドポリマーの合成
無水ＤＭＦ（１００μＬ）中のアジドへキサン酸ＮＨＳエステル（２．５ｍｇ）の溶液を、無水ＤＭＦ（１００μＬ）中のアミン官能性ポリマー（９．９ｍｇ）の溶液にアルゴン下で添加した。次にジイソプロピルエチルアミン（２μＬ）を添加した。反応を室温で１５時間攪拌した。次に、水を添加し（０．８ｍＬ）、アジド修飾ポリマーをＮＡＰ−１０カラムにより精製した。溶離液を一晩凍結乾燥させた。収量９．４ｍｇ、９５％。

アジドポリマーへのClick共役のためのペンダントアルキン（ヘキシン）によるオリゴ合成
Applied Biosystems394自動ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機において、３’スペーサーSynBase（商標）CPG １０００カラムを用いて、３’プロパノールオリゴＡ８８８５（配列ＹＡＴＴＴＴＡＣＣＣＴＣＴＧＡＡＧＧＣＴＣＣＰ、ここで、Ｙ＝ヘキシニル基およびＰ＝プロパノール基）を合成した。酸触媒脱トリチル化、カップリング、キャッピングおよびヨウ素酸化の標準１．０μモルのホスホルアミダイトサイクルを使用した。標準モノマーのカップリング時間は４０秒であり、５’アルキンモノマーのカップリング時間は１０分であった。

固体支持体からオリゴを切断し、室温で６０分間の濃アンモニア水への暴露により脱保護した後、５５℃で５時間、密封チューブ内で加熱した。次に、標準条件下でオリゴをＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。収量３４ＯＤ。

溶液相Click共役：プローブ合成
塩化ナトリウム水（０．２Ｍ、２．５μＬ）中の脱気した硫酸銅五水和物（０．０６３ｍｇ）の溶液を、塩化ナトリウム水（０．２Ｍ、１２．５μＬ）中のトリス−ベンゾトリアゾールリガンド（０．５ｍｇ）およびアスコルビン酸ナトリウム（０．５ｍｇ）の脱気した溶液に添加した。続いて、塩化ナトリウム（０．２Ｍ、３０μＬ）中のオリゴＡ８８８５（５０ｎｍｏｌｅ）の脱気した溶液と、無水ＤＭＦ（５０μＬ）中のアジドポリマー（４．５ｍｇ）の脱気した溶液とをそれぞれ添加した。もう一度反応をアルゴンにより３０秒間脱気した後、チューブを密封し、５５℃で２時間インキュベートした。次に、水（０．９ｍＬ）を添加し、修飾されたオリゴをＮＡＰ−１０カラムにより精製した。溶離液を一晩凍結乾燥させた。ＰＡＧＥ精製を用いてコンジュゲートを別箇のバンドとして単離し、質量分析によって特徴付けをした。収率は１０〜２０％と見積もられる。

蛍光研究
オリゴ−ポリマーコンジュゲートを蛍光研究におけるプローブとして使用した。プローブを、３’端部においてダブシルによって標識されて蛍光消光剤としての役割を果たす標的Ａ８０９０（配列ＧＧＡＧＣＣＴＴＣＡＧＡＧＧＧＴＡＡＡＡＴ−Ｄａｂｃｙｌ）とハイブリッド形成させた。標的およびプローブをハイブリッド形成させ、Peltier制御された可変温度蛍光光度計において蛍光を監視した。蛍光を２℃／分の速度で３０℃〜８０℃の温度範囲にわたって５℃毎に走査した。図２５は、温度の上昇と共に蛍光強度または発光が増大することを示しており、プローブ−標的対が融解してポリマーおよび消光剤が分離し、蛍光が回収されることが示される。

核酸へのポリマーの共役は、実施例１４、４５および４６に記載されるプロトコールから適合される方法を用いて実施することもできる。

実施例４８：ポリマー抗体コンジュゲートの精製
実施例４５、４６および４９に記載されるプロトコールにより生成されたポリマー抗体コンジュゲートを、２段階法を用いて精製した。まずイオン交換を用いて、遊離した未反応ポリマーを除去する。本発明に記載されるポリマーは形式電荷を持たないので、イオン交換媒体に結合しない。しかしながら、タンパク質（抗体）は帯電基を含有し、一般に、精製のための種々のイオン交換媒体に結合する。提供される実施例では、コンジュゲート溶液（反応後）のｐＨおよび伝導率を低下させて、カチオン性交換樹脂に対する遊離抗体およびコンジュゲートの結合を改善する。コンジュゲートを負荷させた後、樹脂をベースラインまで洗浄して（２８０および４０７ｎｍの両方の吸光度で測定）、全ての遊離ポリマーが除去されることを保証する。結合した抗体およびポリマー抗体コンジュゲートは、ｐＨおよびイオン強度を上昇させることによって溶出させる。この分離の代表例は、図２６（左）において以下に提供されており、左側のピークは遊離ポリマーを表し、右側のピークは溶出したコンジュゲートおよび遊離タンパク質を表す。遊離ポリマーの除去は、同様の形で親和性クロマトグラフ法を用いて達成することもできる。ポリマーを除去しながら遊離タンパク質およびコンジュゲートを結合するために特定の親和性樹脂を使用することができる。

ポリマーを除去した後、コンジュゲート溶液を濃縮し、サイズ排除カラム上に負荷し、未反応または遊離抗体をポリマーから分離する。実施例４３および４４に記載されるポリマー組成物は、より低い分子量を有するにもかかわらず、抗体よりもはるかに早く溶出する。これは、剛性のポリマー構造の結果であることが予想される。従って、コンジュゲートはどの遊離抗体よりも十分前に溶出し、所望のコンジュゲートのベースライン付近の分離を提供する。分布の中央付近の画分の単離は、遊離抗体が含まれないことも保証する。この分離の代表例は、図２６（右）において以下に提供されており、左側のピークはコンジュゲートを表し、一番右側の小さいピークは遊離抗体を表す。個々の成分の保持時間は、独立した実験で検証した。

統合すると、精製は、遊離抗体および遊離ポリマーの両方を除去することを保証する。得られるコンジュゲートの純度は合理的に９５％よりも高いと見積もられる。貯留したサンプルを濃縮することができ、２８０および４０７ｎｍにおける吸光度により測定される濃度は、必ず２８０ｎｍにおけるポリマー吸光度を補正する。このような測定は、抗体に対するポリマーの標識化率（Ｆ／Ｐ）の決定も可能にする。

実施例４９：タンデムポリマーの色素の標識化およびリンカーの活性化

タンデム色素の共役
グローブボックス内で、９３ｍｇのタンデムポリマー（実施例２６から）を１５ｍｇ／ｍＬで、攪拌子を有するガラスバイアル中の無水ＤＭＳＯに溶解させた。２２．５ｍｇのCy3−ＮＨＳエステルも１５ｍｇ／ｍＬで無水ＤＭＳＯ中に溶解させ、ポリマー溶液に添加した後、０．３ｍＬジイソプロピルエチルアミンを添加した。室温で４８時間攪拌した後、溶液を２０％のＥｔＯＨ水により９０ｍＬに希釈し、Amicon Ultra−１５フィルタによって濃縮した。保持物を繰り返し希釈し、過剰のCy3が除去されるまで、フィルタにより濃縮した。収率９０％。標識化およびリンカー含量は、実施例３８において記載されるように、ポリマーおよび色素の吸光度を測定してその比率をとることによって検証した。

タンデムのアミン修飾（水性条件）
１００ｍｇのポリマー−色素コンジュゲートを１５０ｍｇ／ｍＬでエタノール中に溶解させた。これを４℃において６ｍＬの５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５）に液滴で添加した。３８ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを１回で添加し、溶液を攪拌して固体を溶解させた。溶解したら、１９２ｍｇのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩を数回に分けて攪拌しながら添加した。溶液を３０分間攪拌した後、３３μＬのエチレンジアミンを添加した。室温で一晩攪拌した後、２０％のＥｔＯＨ水により溶液を９０ｍＬに希釈し、Amicon Ultra−１５フィルタにより濃縮した。保持物を全部で４回繰り返し希釈し、フィルタにより濃縮して、不純物を除去した。収率９０％、転換率６０％。リンカーの転換は、実施例３８に記載されるように、第２の色素を末端アミンに共役させることによって検証した。

一次抗体へのタンデム共役
一次モノクローナル抗体、抗ＣＤ８（ＲＰＡ−Ｔ８クローン）を、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのリン酸、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝液に脱塩／交換した。ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）を水中に溶解させ、１２モル過剰で添加し、３０℃で９０分間混合した。ＰＤ−１０脱塩カラムにより修飾タンパク質を精製して、過剰のＴＣＥＰを除去し、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのリン酸１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝液に交換した。

アミン活性化タンデムポリマーをエタノール中に５０ｍｇ／ｍＬで溶解させ、この溶液を２容積の１００ｍＭのリン酸（ｐＨ７．５）緩衝液と混合した。

次にこの溶液を、ＰＤ−１０脱塩カラムを用いて、１００ｍＭのリン酸（ｐＨ７．５）緩衝液に脱塩／交換した。この溶液に、２５モル過剰のスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）リンカー（無水ＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍｌの溶液として調製）を添加した。得られた溶液を２０℃で６０分間ローラー混合した後、ＰＤ−１０脱塩カラムを用いて、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのリン酸、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝液に脱塩／交換した。ジスルフィド還元の直後に、マレイミド官能化ポリマーを抗体の２５モル過剰で添加し、２０℃で２時間混合させた。イオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィ技術を次に用いて、未反応ポリマーおよび抗体のバイオコンジュケートをそれぞれ精製した。標識化の程度（以下のｐで示される）は、吸光度および補正された２８０ｎｍ値により決定される。

多色実験におけるポリマータンデムコンジュゲートのフローサイトメトリー分析
得られた抗ＣＤ８タンデムコンジュゲートをフローサイトメーターにおいて補正ビーズおよび全血サンプルの両方について評価した。抗マウスＩｇＧ補正ビーズを使用して、抗体を捕捉し、コンジュゲートを対象とするもの以外の検出チャネル内に溢れ流れるシグナル（検出器は独特の発光フィルタを有する）を定量化した。図２８（左）は、コンジュゲートの発光（標識ＱＤｏｔＡ）に適合された６１０ｎｍフィルタを用いて発光が検出される紫色レーザーによってタンデムコンジュゲートが励起されたときに測定されるシグナルを示す。紫色励起レーザー（DAPI-AおよびAmCyan-A）と対になるフローサイトメーターの他のチャネルおよび４８８ｎｍレーザー（FITC-AおよびPE-A）から離れた２つのチャネルへのクロストークもこの図面のパネルに示される。データは、残留ポリマー（供与体）発光を特異的に検出する４５０／５０ｎｍフィルタ（DAPI-A）において最小クロストークを示す。上記の他のチャネルに対して、タンデム上のCy3レポーターからの著しくより高いシグナル（６１０ｎｍフィルタ）は、最小の補償（この例では最大６％以下であり、個別にはさらに低いことも多い）が必要とされることを示す。

続いて実施例３９に従い、これから開発された染色および分析プロトコールを用いて、健康なボランティアからの全ヒト血液において、他の標識抗体（抗ＣＤ３ Pacific Blue、抗ＣＤ４５フィコエリトリンおよび抗ＣＤ４フルオレセイン）により、タンデム抗ＣＤ８コンジュゲートを、４色フローアッセイで評価した。図２８（右）のデータは、タンデム標識と一般的な多色フローサイトメトリー計測手段、試薬およびプロトコールとの適合性を明白に示す。特に、ＣＤ８陽性リンパ球の強度および特異的染色が観察され、ＣＤ４陽性サブセット内では、ＣＤ８発現細胞および非発現細胞の容易な識別が明らかである。まとめると、データは、開示される本発明において記載されるような多色フローアッセイにおけるポリマー−色素タンデムコンジュゲートの実現性を強調する（例えば、図２０および図２２を参照）。

実施例５０：水溶性およびフローサイトメトリー用途についての非イオン性ポリマー側鎖の検証
水溶性共役ポリマーと細胞との相互作用を調査するために、一連の異なるポリフルオレンポリマーを生成した。これは、まず、異なる可溶化側鎖で置換（例えば、ＰＥＧ−、スルホネート−、第４級アミン−、双性イオン−置換）された様々なモノマーを合成し、次にこれを、鈴木カップリングを用いて重合することによって実行した。目的は、非特異的細胞結合と、生物学的アッセイにおいて使用される典型的な緩衝液、特にフローサイトメトリーにおいて使用されるもの（例えば、ＰＢＳおよびＤＰＢＳ）の中でのポリマーの溶解性との両方に対して側鎖が与える影響を決定することであった。

合成されたポリマー候補の数および特性の多様性により、フローサイトメトリー試験のためにそれぞれの精製コンジュゲートを生成するのは実用的ではないとされた。従って、細胞に対する非特異的結合へのその寄与に基づいて各候補ポリマーをスコア化するためにシステムを開発した。このようなシステムは、これらが共役した時点で十分に機能し得るかどうかについての予測値によりポリマーのランキングを可能にした。非特異的結合（ＮＳＢ）「指標」をJurkat細胞モデル（リンパ球細胞株）に対して開発した。これにおいて、細胞を固定濃度の各ポリマーと共にインキュベートし、洗浄し、フローにより分析した。図３３はこのような分析による結果を表示し、各ポリマー型によって発生されるシグナルの幅広い変動を示す。Ｐ９を除いて、図３３のポリマーは、ペンダントアミンのフタルアミド保護基で評価した。

データは、ＮＳＢにより純粋に発生されるシグナルに関してこれらのポリマーをランク付けする。相対的なＮＳＢのより正確な評価は、蛍光光度計で４０５ｎｍ励起を用いて染色緩衝液中で独立してアッセイされる場合に、ポリマーのそれぞれの形態の蛍光効率の差（量子収率の粗い評価）によってフローシグナルを調整しさらに規格化し、そして、４２０〜４６０ｎｍの範囲の発光を監視する（サイトメーターにおける４４０／４０ｎｍフィルタを評価するため）ことによって可能にされた。代表的なポリマーＰ５、Ｐ２、Ｐ９およびＰ１２は、非染色細胞（一番左の曲線、ｘ軸には強度が表される）に対して、ＮＳＢの増大を示した。

図３４のデータは続いて、アニオン性側鎖（Ｐ４で指定）も取り込んだポリマーに対して、中性、非イオン性のＰＥＧ側鎖（Ｐ２０で指定される）で生成されるポリマーの違いを強調する。データは、図３３の場合と同様、Jurkat細胞株を用いてフローサイトメトリー分析（BD LSR-IIサイトメーターにおける４０５ｎｍ励起）から集められたヒストグラムである。左側のパネルは、非染色細胞および負の対照（非特異的Pacific Blue標識のコンジュゲートにより処理された細胞）を示し、これらは、一番左の２つの曲線である。Pacific Blue対照については、非特異的染色はたとえあったとしても少ししか観察されなかった。しかしながら、この同じパネルにおいて、右側の曲線は、アニオン性Ｐ４ポリマーで処理された細胞を表し、図示されるように、シグナル（ｘ軸）の明らかなオフセットを有する。逆に、中性ポリマーＰ２０は、Pacific Blue対照と一致する未処理細胞からのオフセットをほとんど示さなかった。中央のパネルは、同じ細胞において試験された様々な範囲の異なるポリマーおよびポリマー側鎖の組み合わせを表す。

データは中性側鎖の利点を強調した。この利点はプレートベースのイムノアッセイおよびサイトメトリックビーズアレイ（データは示さず）を含む他のアッセイ形式にも変換されている。また、中性側鎖は、予想外に、既に製造されたイオン性側鎖を有するポリマーに対して、水溶液中の共役ポリマーの溶解性の著しい増大をもたらした。これは、中程度のイオン強度を含有する緩衝液（基本的な細胞プロトコールにおいて使用されるものなど）においても、特に当てはまった。また、溶液の量子収率は、恐らく、より高い水溶性（およびより少ない凝集）のために、増大することが分かり得る。緩衝液中の溶解性が低いと、タンパク質の共役もより難しくなり、Ｐ４から生成されるストレプトアビジンコンジュゲートは、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などの典型的なアッセイ緩衝液中に凝集の徴候を示した。これは、本明細書で開示される他の実施例において生成されるポリマーおよびコンジュゲートに当てはまらなかった。

実施例５１：ポリマー−アビジンコンジュゲートの精製および特徴付け
ポリマー−アビジンコンジュゲートのゲル分析
アビジン（ＡｖＤＮ）への成功した共役を検証するために、アガロースゲル電気泳動法を開発および使用し、ポリマーの共役の度合いの関数としてＡｖＤＮの相対移動度を査定した（図３５）。ゲルの負荷の前に、ポリマー−ＡｖＤＮコンジュゲートおよび遊離ＡｖＤＮに結合するビオチニル−フルオレセインにより共役反応を染色した。０．８％のアガロースゲルにおいて電気泳動を実施し、１０ｍＭのホウ酸ナトリウム（ｐＨ１１）の緩衝液中に注いで移動させた。ＵＶ照射下で（ポリマーを可視化するため）、および５３２ｎｍ励起（フルオレセインを可視化するため）によって、ゲルを可視化して、共役の度合いを査定した。ＵＶ照射下で、ポリマーに対して単一のバンドが観察された。５３２ｎｍの励起下では、非結合ビオチニル−フルオレセイン、未反応ＡｖＤＮ、およびポリマー−ＡｖＤＮコンジュゲートに対して、遊離ポリマーバンドと関係があるバンドが観察され、未反応ポリマーがポリマー−ＡｖＤＮコンジュゲートと同時に溶出されることが示された（図３５）。コンジュゲ―ションは、コンジュゲートバンドの強度によって確認した。

ゲル画像（図３５）の上部のキーは、どの成分が共役反応に含まれていたか、そして負荷および電気泳動の前にサンプルがビオチニルフルオレセインと共にプレインキュベートされたかどうかを示す。左の画像はＵＶ励起によってポリマーを可視化し、右の画像はフルオレセイン励起の結果を捕捉する。右の画像において、ヘテロ二官能性ＮＨＳ−エトキシ−マレイミドリンカー（ポリマーアミンを官能化するためにリンカーを使用したが、マレイミド−チオールカップリングの前に、Ｔｒａｕｔ試薬を用いてタンパク質アミンを部分的にチオールに転換した）の存在下で共役が実施された場合にビオチン化フルオレセインはポリマーに関連して見ることができるが、非存在下で実施された場合にはそうではない。略語：ＡｖＤＮ＝アビジンＤＮ、ＡＡ１＝ポリマー、リンカー＝反応に含まれたヘテロ二官能性ＮＨＳ−マレイミドリンカー、Ｂｉｏｔ−Ｆ＝電気泳動の前のビオチニルフルオレセイン予備染色。

精製：ＳＥＣクロマトグラフィによる未反応アビジンの除去
粗製コンジュゲート混合物をSuperdex 200サイズ排除カラムにおいて分画したが、画分は、ＵＶ吸光度（図３６、上）によって監視した。方法を検証するために、アガロースゲル電気泳動により画分を分析した。上記のように、この電気泳動法によって、アビジンがポリマーに結合した度合の可視化、そしてこの場合には、カラムからの各画分の組成の分析が可能になった。選択された画分をゲル負荷の前にビオチニル−フルオレセイン（アビジンに対して１モル等量）と共にインキュベートした後、マーカーとしてビオチニル−フルオレセインを別個に負荷した（一番左のレーン、図３６下）。０．８％のアガロースゲルにおいて電気泳動を実施し、１０ｍＭのホウ酸ナトリウム（ｐＨ１１）の緩衝液中に注いで移動させた。ゲルを５３２ｎｍ励起により可視化した。画分Ｃ２〜Ｃ６のフルオレセイン可視化バンドの遅延は精製ポリマー−アビジンコンジュゲートを示し、画分Ｃ８について観察される２つのバンドは、ポリマー−アビジンコンジュゲートおよび遊離アビジンの混合物を示す。画分Ｃ１０〜Ｄ２は遊離アビジンのみを示す。

ゲル分析による共役効率の評価
共役反応における最良のポリマー対ストレプトアビジン比を決定するために、ストレプトアビジンに対するポリマーのモル等量を０〜２４当量に変化させた。共役の後、電気泳動の前に共役生成物をビオチニル−フルオレセインと共にインキュベートした。ＵＶ照射および５３２ｎｍ励起によってゲルを可視化した（図３７）。ストレプトアビジンに対して０モル等量のポリマーでは、比較的高い移動度のバンドとして遊離ストレプトアビジンが観察された。ポリマーのモル等量が３当量から１２当量に増大されると、遊離ストレプトアビジンバンドの強度が低下し、ポリマー−ストレプトアビジンコンジュゲートバンドの強度が増大する。２４当量のポリマーでは、５３２ｎｍ励起によってコンジュゲートバンドのみが観察される。

フローサイトメトリーによる細胞分析におけるコンジュゲート性能に対する精製の影響
フローサイトメトリー性能に対する影響を決定するために、ポリマーストレプトアビジンコンジュゲート（実施例９で例示されるポリマー構造は図３８のＰ３０を示した）の精製を実施した。精製においてカチオン交換クロマトグラフィを実行して、過剰の遊離ポリマーの除去を改善した。未変化のポリマーは通過画分で溶出されたが、タンパク質のプロトン化アミンは媒体によって保持された。従って、ストレプトアビジンは、ポリマーに共役していても未反応であっても保持された。精製のこのイオン交換段階はステップグラジエントにより単純に保たれ、共役および未反応ＳＡの同時溶出をもたらした。さらなる分画は、続いて、遊離ＳＡからのコンジュゲートのより良い分解能を提供するサイズ排除クロマトグラフィによって可能とされた。この新しい精製法のフローサイトメトリーにおける性能利益は、ポリマー−ストレプトアビジンコンジュゲートと共にインキュベートされたＪｕｒｋａｔ細胞（フローサイトメトリーにより分析した）を用いて観察された。粗製サンプル（図３８−上）と精製コンジュゲート（図３８下）との間の比較を行った。市販のPacific Blue−ストレプトアビジンコンジュゲートは、輝度、非特異的結合、および染色指標のための比較対照として使用した。Jurkat細胞について全体の染色指標における約３倍の改善が示され、図３８に示されるヒストグラムに基づいてポリマーコンジュゲートおよびＰＢ−ＳＡの両方について類似のＮＳＢを有した。血液（データは示さず）における試験は、コンジュゲート精製の際に、ＰＢ−ＳＡと同様のレベルへのＮＳＢの著しい低下を示した。

別の実験では、類似のポリマー（実施例１１で例示）を用いて、様々なポリマー対ストレプトアビジン比を有するコンジュゲートがＳＥＣにより得られた。より高い比を有するものは、より低い標識化を有するものと比べて、流動性能を提供した。比は、３８５ｎｍ／２８０ｎｍにおける吸光度の比に基づいて決定した。ＰａｃｉｆｉｃＢｌｕｅ対照に対する相対的な性能は、１０．９倍高い染色指標（３．６の３８５／２８０比）から、Pacific Blueの１３．８倍の染色指標（４．７の３８５／２８０比）への増大を示した。

本発明の好ましい実施形態が本明細書において示され、説明されたが、このような実施形態が単なる例として提供されていることは、当業者には明らかであろう。本発明から逸脱することなく当業者には今、多数の変更、変化、および置換が思い描かれるであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態の種々の代替例が、本発明の実施において使用され得ることは理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにその等価物が包含されることが意図される。

Claims

式（Ｉａ）：

の構造を有する水溶性共役ポリマーであって、前記式中、
Ｒがそれぞれ独立して、（ＣＨ_２）_ｘ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙＯＣＨ_３（ここで、ｘはそれぞれ独立して０〜２０の整数であり、ｙはそれぞれ独立して０〜５０の整数である）、または１つもしくは複数のハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、もしくは（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｚＯＣＨ_３（ここで、ｚはそれぞれ独立して０〜５０の整数である）によって置換されているベンジルであり、
ＭＵが、ポリマー主鎖に沿って均等またはランダムに分配されたポリマー修飾単位またはバンドギャップ修飾単位であり、場合により、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、（ＣＨ_２）_ｘ’（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙ’ＯＣＨ_３（ここで、ｘ’はそれぞれ独立して０〜２０の整数であり、ｙ’は独立して０〜５０の整数である）、またはＣ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール基から選択される１つまたは複数の場合により置換され得る置換基によって置換されていてもよく、
任意リンカーＬ_１およびＬ_２がそれぞれ、ポリマー主鎖に沿って均等またはランダムに分配されたアリールまたはヘテロアリール基であり、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基で終結された１つまたは複数のペンダント鎖によって置換されており、
Ｇ_１およびＧ_２がそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキン、場合により置換され得るアリール、場合により置換され得るヘテロアリール、ハロゲン置換されたアリール、ボロン酸置換されたアリール、ボロン酸エステル置換されたアリール、ボロン酸エステル、ボロン酸、場合により置換され得るフッ素、およびアリールまたはヘテロアリール（アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基、分子または生体分子で終結された１つまたは複数のペンダント鎖によって置換されている）から選択され、
ここで、当該ポリマーが、Ｇ_１、Ｇ_２、Ｌ_１またはＬ_２内に、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、およびチオールから選択される少なくとも１つの官能基を含み、
ｎが、１〜１０，０００の整数であり、そして
ａ、ｂ、ｃおよびｄが、均等またはランダムにそれぞれが繰り返され得る構造内の各単位のモル％を定義し、ａが１０〜１００％のモル％であり、ｂが０〜９０％のモル％であり、ｃおよびｄがそれぞれ０〜２５％のモル％である、
水溶性共役ポリマー。
式（Ｉａ）：

の構造を有する水溶性共役ポリマーであって、前記式中、
Ｒがそれぞれ（ＣＨ_２）_３（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_１１ＯＣＨ_３であり、
ＭＵが、ポリマー主鎖に沿って均等またはランダムに分配されたポリマー修飾単位またはバンドギャップ修飾単位であり、場合により、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、（ＣＨ_２）_ｘ’（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙ’ＯＣＨ_３（ここで、ｘ’はそれぞれ独立して０〜２０の整数であり、ｙ’は独立して０〜５０の整数である）、またはＣ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール基から選択される１つまたは複数の場合により置換され得る置換基によって置換されていてもよく、
任意リンカーＬ_１およびＬ_２がそれぞれ、ポリマー主鎖に沿って均等またはランダムに分配されたアリールまたはヘテロアリール基であり、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基で終結された１つまたは複数のペンダント鎖によって置換されており、
Ｇ_１およびＧ_２がそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキン、場合により置換され得るアリール、場合により置換され得るヘテロアリール、ハロゲン置換されたアリール、ボロン酸置換されたアリール、ボロン酸エステル置換されたアリール、ボロン酸エステル、ボロン酸、場合により置換され得るフッ素、およびアリールまたはヘテロアリール（アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基、分子または生体分子で終結された１つまたは複数のペンダント鎖によって置換されている）から選択され、
ここで、当該ポリマーが、Ｇ_１、Ｇ_２、Ｌ_１またはＬ_２内に、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、およびチオールから選択される少なくとも１つの官能基を含み、
ｎが、１〜１０，０００の整数であり、そして
ａ、ｂ、ｃおよびｄが、均等またはランダムにそれぞれが繰り返され得る構造内の各単位のモル％を定義し、ａが１０〜１００％のモル％であり、ｂが０〜９０％のモル％であり、ｃおよびｄがそれぞれ０〜２５％のモル％である、
水溶性共役ポリマー。
式（Ｉａ）：

の構造を有する水溶性共役ポリマーであって、前記式中、
Ｒがそれぞれ独立して非イオン性側基であり、
ＭＵが、ポリマー主鎖に沿って均等またはランダムに分配されたポリマー修飾単位またはバンドギャップ修飾単位であり、場合により、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、（ＣＨ_２）_ｘ’（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙ’ＯＣＨ_３（ここで、ｘ’はそれぞれ独立して０〜２０の整数であり、ｙ’は独立して０〜５０の整数である）、またはＣ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール基から選択される１つまたは複数の場合により置換され得る置換基によって置換されていてもよく、
前記任意リンカーＬ_１またはＬ_２が、構造：

（＊＝不飽和骨格への共有結合のための部位）
を有するａ〜ｇからなる群から選択され、前記式中、
Ｒ’が独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、（Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル）ＮＨ_２、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、−［ＣＨ_２−ＣＨ_２］_ｒ’−Ｚ^１、もしくは（Ｃ_１〜Ｃ_１２）アルコキシ−Ｘ^１（ここで、Ｚ^１は−ＯＨまたは−ＣＯＯＨであり、Ｘ^１は−ＮＨ_２、−ＮＨＣＯＯＨ、−ＮＨＣＯＯＣ（ＣＨ_３）_３、−ＮＨＣＯ（Ｃ３〜Ｃ１２）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル−Ｎ−マレイミド、または−ＮＨＣＯ［ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ］_ｓ’（ＣＨ_２）_ｓ’ＮＨ_２であり、ｒ’は１〜２０の整数であり、そしてｓ’はそれぞれ独立して１〜２０の整数である）、（ＣＨ_２）_３（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｘ”ＯＣＨ_３（ここで、ｘ”は独立して０〜５０の整数である）、または場合により１つもしくは複数のハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、もしくは（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙ”ＯＣＨ_３（ここで、ｙ”はそれぞれ独立して０〜５０の整数である）によって置換されていてもよいベンジルであり、そしてＲ’がＲとは異なり、
ｋが、２、４、８、１２または２４であり、
Ｒ^１５が、構造：

（＊＝骨格への共有結合のための部位）
を有するｌ〜ｔからなる群から選択され、
Ｇ_１およびＧ_２がそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキン、場合により置換され得るアリール、場合により置換され得るヘテロアリール、ハロゲン置換されたアリール、ボロン酸置換されたアリール、ボロン酸エステル置換されたアリール、ボロン酸エステル、ボロン酸、場合により置換され得るフッ素、およびアリールまたはヘテロアリール（アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基、分子または生体分子で終結された１つまたは複数のペンダント鎖によって置換されている）から選択され、
ここで、当該ポリマーが、Ｇ_１、Ｇ_２、Ｌ_１またはＬ_２内に、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、およびチオールから選択される少なくとも１つの官能基を含み、
ｎが、１〜１０，０００の整数であり、そして
ａ、ｂ、ｃおよびｄが、均等またはランダムにそれぞれが繰り返され得る構造内の各単位のモル％を定義し、ａが１０〜１００％のモル％であり、ｂが０〜９０％のモル％であり、ｃおよびｄがそれぞれ０〜２５％のモル％である、
水溶性共役ポリマー。
式（Ｉａ）：

の構造を有する水溶性共役ポリマーであって、前記式中、
Ｒがそれぞれ独立して非イオン性側基であり、
ＭＵが、ポリマー主鎖に沿って均等またはランダムに分配されたポリマー修飾単位またはバンドギャップ修飾単位であり、場合により、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、（ＣＨ_２）_ｘ’（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙ’ＯＣＨ_３（ここで、ｘ’はそれぞれ独立して０〜２０の整数であり、ｙ’は独立して０〜５０の整数である）、またはＣ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール基から選択される１つまたは複数の場合により置換され得る置換基によって置換されていてもよく、
前記任意リンカーＬ_１またはＬ_２が、

であり、
Ｇ_１およびＧ_２がそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキン、場合により置換され得るアリール、場合により置換され得るヘテロアリール、ハロゲン置換されたアリール、ボロン酸置換されたアリール、ボロン酸エステル置換されたアリール、ボロン酸エステル、ボロン酸、場合により置換され得るフッ素、およびアリールまたはヘテロアリール（アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基、分子または生体分子で終結された１つまたは複数のペンダント鎖によって置換されている）から選択され、
ここで、当該ポリマーが、Ｇ_１、Ｇ_２、Ｌ_１またはＬ_２内に、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、およびチオールから選択される少なくとも１つの官能基を含み、
ｎが、１〜１０，０００の整数であり、そして
ａ、ｂ、ｃおよびｄが、均等またはランダムにそれぞれが繰り返され得る構造内の各単位のモル％を定義し、ａが１０〜１００％のモル％であり、ｂが９０％以下のモル％であり、ｃおよびｄがそれぞれ２５％以下のモル％である、
水溶性共役ポリマー。
式（Ｉａ）：

の構造を有する水溶性共役ポリマーであって、前記式中、
Ｒがそれぞれ独立して非イオン性側基であり、
ＭＵが、ポリマー主鎖に沿って均等またはランダムに分配されたポリマー修飾単位またはバンドギャップ修飾単位であり、場合により、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、（ＣＨ_２）_ｘ’（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙ’ＯＣＨ_３（ここで、ｘ’はそれぞれ独立して０〜２０の整数であり、ｙ’は独立して０〜５０の整数である）、またはＣ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール基から選択される１つまたは複数の場合により置換され得る置換基によって置換されていてもよく、
任意リンカーＬ_１およびＬ_２がそれぞれ、ポリマー主鎖に沿って均等またはランダムに分配されたアリールまたはヘテロアリール基であり、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基で終結された１つまたは複数のペンダント鎖によって置換されており、
Ｇ_１およびＧ_２がそれぞれ独立して、構造

を有し、前記式中、
Ｒ^１１が、結合、Ｃ_１〜Ｃ_２０アルキル、Ｃ_１〜Ｃ_２０アルコキシ、Ｃ_２〜Ｃ_２０アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_２０アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_２０シクロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_２０ハロアルキル、（ＣＨ_２）_ｘ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｐ（ＣＨ_２）_ｘ（ここで、ｘはそれぞれ独立して０〜２０の整数であり、ｐは独立して０〜５０の整数である）、アリール、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール、フェノキシ、アミド、アミノ、カルバメート、カルボキシレート、カルボネート、スルフィド、ジスルフィド、またはイミド基のいずれか１つまたはこれらの組み合わせであり、アミン、カルバメート、カルボキシレート、カルボン酸、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基で終結されており、
ここで、当該ポリマーが、Ｇ_１、Ｇ_２、Ｌ_１またはＬ_２内に、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、およびチオールから選択される少なくとも１つの官能基を含み、
ｎが、１〜１０，０００の整数であり、そして
ａ、ｂ、ｃおよびｄが、均等またはランダムにそれぞれが繰り返され得る構造内の各単位のモル％を定義し、ａが１０〜１００％のモル％であり、ｂが０〜９０％のモル％であり、ｃおよびｄがそれぞれ０〜２５％のモル％である、
水溶性共役ポリマー。
式（Ｉａ）：

の構造を有する水溶性共役ポリマーであって、前記式中、
Ｒがそれぞれ独立して非イオン性側基であり、
ＭＵが、ポリマー主鎖に沿って均等またはランダムに分配されたポリマー修飾単位またはバンドギャップ修飾単位であり、場合により、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、（ＣＨ_２）_ｘ’（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙ’ＯＣＨ_３（ここで、ｘ’はそれぞれ独立して０〜２０の整数であり、ｙ’は独立して０〜５０の整数である）、またはＣ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール基から選択される１つまたは複数の場合により置換され得る置換基によって置換されていてもよく、
任意リンカーＬ_１およびＬ_２がそれぞれ、ポリマー主鎖に沿って均等またはランダムに分配されたアリールまたはヘテロアリール基であり、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基で終結された１つまたは複数のペンダント鎖によって置換されており、
Ｇ_１およびＧ_２がそれぞれ独立して、構造：

（＊＝骨格への共有結合のための部位）
を有する１〜２７からなる群から選択され、前記式中、
Ｒ^１５が、構造：

を有するｌ〜ｔからなる群から選択され、
ｋが２、４、８、１２または２４であり、
ここで、当該ポリマーが、Ｇ_１、Ｇ_２、Ｌ_１またはＬ_２内に、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、およびチオールから選択される少なくとも１つの官能基を含み、
ｎが、１〜１０，０００の整数であり、そして
ａ、ｂ、ｃおよびｄが、均等またはランダムにそれぞれが繰り返され得る構造内の各単位のモル％を定義し、ａが１０〜１００％のモル％であり、ｂが０〜９０％のモル％であり、ｃおよびｄがそれぞれ０〜２５％のモル％である、
水溶性共役ポリマー。
式（Ｉａ）：

の構造を有する水溶性共役ポリマーであって、前記式中、
Ｒがそれぞれ独立して非イオン性側基であり、
ＭＵが、ポリマー主鎖に沿って均等またはランダムに分配されたポリマー修飾単位またはバンドギャップ修飾単位であり、場合により、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、（ＣＨ_２）_ｘ’（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙ’ＯＣＨ_３（ここで、ｘ’はそれぞれ独立して０〜２０の整数であり、ｙ’は独立して０〜５０の整数である）、またはＣ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール基から選択される１つまたは複数の場合により置換され得る置換基によって置換されていてもよく、
任意リンカーＬ_１およびＬ_２がそれぞれ、ポリマー主鎖に沿って均等またはランダムに分配されたアリールまたはヘテロアリール基であり、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基で終結された１つまたは複数のペンダント鎖によって置換されており、
Ｇ_１およびＧ_２が、

または

であり、
ここで、当該ポリマーが、Ｇ_１、Ｇ_２、Ｌ_１またはＬ_２内に、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、およびチオールから選択される少なくとも１つの官能基を含み、
ｎが、１〜１０，０００の整数であり、そして
ａ、ｂ、ｃおよびｄが、均等またはランダムにそれぞれが繰り返され得る構造内の各単位のモル％を定義し、ａが１０〜１００％のモル％であり、ｂが０〜９０％のモル％であり、ｃおよびｄがそれぞれ０〜２５％のモル％である、
水溶性共役ポリマー。
式（Ｉａ）：

の構造を有する水溶性共役ポリマーであって、前記式中、
Ｒがそれぞれ独立して非イオン性側基であり、
ＭＵが、構造：

（＊＝不飽和骨格への共有結合のための部位）
を有するａ’〜ｊ’からなる群から選択され、前記式中、
Ｒが非イオン性側基であり、
任意リンカーＬ_１およびＬ_２がそれぞれ、ポリマー主鎖に沿って均等またはランダムに分配されたアリールまたはヘテロアリール基であり、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基で終結された１つまたは複数のペンダント鎖によって置換されており、
Ｇ_１およびＧ_２がそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキン、場合により置換され得るアリール、場合により置換され得るヘテロアリール、ハロゲン置換されたアリール、ボロン酸置換されたアリール、ボロン酸エステル置換されたアリール、ボロン酸エステル、ボロン酸、場合により置換され得るフッ素、およびアリールまたはヘテロアリール（アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基、分子または生体分子で終結された１つまたは複数のペンダント鎖によって置換されている）から選択され、
ここで、当該ポリマーが、Ｇ_１、Ｇ_２、Ｌ_１またはＬ_２内に、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、およびチオールから選択される少なくとも１つの官能基を含み、
ｎが、１〜１０，０００の整数であり、そして
ａ、ｂ、ｃおよびｄが、均等またはランダムにそれぞれが繰り返され得る構造内の各単位のモル％を定義し、ａが１０〜１００％のモル％であり、ｂが０〜９０％のモル％であり、ｃおよびｄがそれぞれ０〜２５％のモル％である、
水溶性共役ポリマー。
式：

の構造を有する水溶性共役ポリマーであって、前記式中、
Ｒがそれぞれ独立して非イオン性側基であり、
Ｇ_１およびＧ_２がそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキン、場合により置換され得るアリール、場合により置換され得るヘテロアリール、ハロゲン置換されたアリール、ボロン酸置換されたアリール、ボロン酸エステル置換されたアリール、ボロン酸エステル、ボロン酸、場合により置換され得るフッ素、およびアリールまたはヘテロアリール（アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基、分子または生体分子で終結された１つまたは複数のペンダント鎖によって置換されている）から選択され、
ここで、当該ポリマーが、Ｇ_１またはＧ_２内に、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、およびチオールから選択される少なくとも１つの官能基を含み、
ｎが、１〜１０，０００の整数であり、
Ｇ_１またはＧ_２の少なくとも１つが官能性の結合部位を含む、
水溶性共役ポリマー。
式：

の構造を有し、Ｌ_１が官能性の結合部位を含む、請求項３または４に記載の水溶性共役ポリマー。
式：

の構造を有する水溶性共役ポリマーであって、前記式中、
Ｒがそれぞれ独立して非イオン性側基であり、
ＭＵが、ポリマー主鎖に沿って均等またはランダムに分配されたポリマー修飾単位またはバンドギャップ修飾単位であり、場合により、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、（ＣＨ_２）_ｘ’（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙ’ＯＣＨ_３（ここで、ｘ’はそれぞれ独立して０〜２０の整数であり、ｙ’は独立して０〜５０の整数である）、またはＣ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール基から選択される１つまたは複数の場合により置換され得る置換基によって置換されていてもよく、
Ｇ_１およびＧ_２がそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキン、場合により置換され得るアリール、場合により置換され得るヘテロアリール、ハロゲン置換されたアリール、ボロン酸置換されたアリール、ボロン酸エステル置換されたアリール、ボロン酸エステル、ボロン酸、場合により置換され得るフッ素、およびアリールまたはヘテロアリール（アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基、分子または生体分子で終結された１つまたは複数のペンダント鎖によって置換されている）から選択され、
ここで、当該ポリマーが、Ｇ_１またはＧ_２内に、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、およびチオールから選択される少なくとも１つの官能基を含み、
ｎが、１〜１０，０００の整数であり、そして
ａ及びｂが、均等またはランダムにそれぞれが繰り返され得る構造内の各単位のモル％を定義し、ａが１０〜１００％のモル％であり、ｂが０〜９０％のモル％であり、
Ｇ_１またはＧ_２の少なくとも１つが官能性の結合部位を含む、
水溶性共役ポリマー。
式：

の構造を有する水溶性共役ポリマーであって、前記式中、
任意リンカーＬ_１が、ポリマー主鎖に沿って均等またはランダムに分配されたアリールまたはヘテロアリール基であり、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基で終結された１つまたは複数のペンダント鎖によって置換されており、
Ｇ_１およびＧ_２がそれぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキン、場合により置換され得るアリール、場合により置換され得るヘテロアリール、ハロゲン置換されたアリール、ボロン酸置換されたアリール、ボロン酸エステル置換されたアリール、ボロン酸エステル、ボロン酸、場合により置換され得るフッ素、およびアリールまたはヘテロアリール（アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基、分子または生体分子で終結された１つまたは複数のペンダント鎖によって置換されている）から選択され、
ここで、当該ポリマーが、Ｇ_１、Ｇ_２、またはＬ_１内に、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、およびチオールから選択される少なくとも１つの官能基を含み、
ｎが、１〜１０，０００の整数であり、そして
ａおよびｃが、均等またはランダムにそれぞれが繰り返され得る構造内の各単位のモル％を定義し、ａが１０〜１００％のモル％であり、ｃが０〜２５％のモル％である、
水溶性共役ポリマー。
構造：

を有する水溶性共役ポリマーであって、前記式中、
Ｇ_１が、水素、ハロゲン、アルキン、場合により置換され得るアリール、場合により置換され得るヘテロアリール、ハロゲン置換されたアリール、ボロン酸置換されたアリール、ボロン酸エステル置換されたアリール、ボロン酸エステル、ボロン酸、場合により置換され得るフッ素、およびアリールまたはヘテロアリール（アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基、分子または生体分子で終結された１つまたは複数のペンダント鎖によって置換されている）から選択され、
ｎが、１〜１０，０００の整数である、
水溶性共役ポリマー。
構造：

を有する水溶性共役ポリマーであって、前記式中、
Ｇ_１が、水素、ハロゲン、アルキン、場合により置換され得るアリール、場合により置換され得るヘテロアリール、ハロゲン置換されたアリール、ボロン酸置換されたアリール、ボロン酸エステル置換されたアリール、ボロン酸エステル、ボロン酸、場合により置換され得るフッ素、およびアリールまたはヘテロアリール（アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基、分子または生体分子で終結された１つまたは複数のペンダント鎖によって置換されている）から選択され、
ｎが、１〜１０，０００の整数である、
水溶性共役ポリマー。
構造：

を有する水溶性共役ポリマーであって、前記式中、
Ｇ_１が、水素、ハロゲン、アルキン、場合により置換され得るアリール、場合により置換され得るヘテロアリール、ハロゲン置換されたアリール、ボロン酸置換されたアリール、ボロン酸エステル置換されたアリール、ボロン酸エステル、ボロン酸、場合により置換され得るフッ素、およびアリールまたはヘテロアリール（アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基、分子または生体分子で終結された１つまたは複数のペンダント鎖によって置換されている）から選択され、
ｎが、１〜１０，０００の整数である、
水溶性共役ポリマー。
構造：

を有する水溶性共役ポリマーであって、前記式中、
Ｇ_１が、水素、ハロゲン、アルキン、場合により置換され得るアリール、場合により置換され得るヘテロアリール、ハロゲン置換されたアリール、ボロン酸置換されたアリール、ボロン酸エステル置換されたアリール、ボロン酸エステル、ボロン酸、場合により置換され得るフッ素、およびアリールまたはヘテロアリール（アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基、分子または生体分子で終結された１つまたは複数のペンダント鎖によって置換されている）から選択され、
ｎが、１〜１０，０００の整数である、
水溶性共役ポリマー。
構造：

を有する水溶性共役ポリマーであって、前記式中、
Ｇ_１が、水素、ハロゲン、アルキン、場合により置換され得るアリール、場合により置換され得るヘテロアリール、ハロゲン置換されたアリール、ボロン酸置換されたアリール、ボロン酸エステル置換されたアリール、ボロン酸エステル、ボロン酸、場合により置換され得るフッ素、およびアリールまたはヘテロアリール（アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基、分子または生体分子で終結された１つまたは複数のペンダント鎖によって置換されている）から選択され、
ｎが、１〜１０，０００の整数である、
水溶性共役ポリマー。
構造：

を有する水溶性共役ポリマーであって、前記式中、
Ｇ_１が、水素、ハロゲン、アルキン、場合により置換され得るアリール、場合により置換され得るヘテロアリール、ハロゲン置換されたアリール、ボロン酸置換されたアリール、ボロン酸エステル置換されたアリール、ボロン酸エステル、ボロン酸、場合により置換され得るフッ素、およびアリールまたはヘテロアリール（アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、およびこれらの保護された基から選択される官能基、分子または生体分子で終結された１つまたは複数のペンダント鎖によって置換されている）から選択され、
ｎが、１〜１０，０００の整数であり、そして
ａおよびｃが、均等またはランダムにそれぞれが繰り返され得る構造内の各単位のモル％を定義し、ａが１０〜１００％のモル％であり、ｃが０〜２５％のモル％である、
水溶性共役ポリマー。
当該ポリマーがさらに、Cy3またはDylight 594色素であるシグナル伝達発色団を含む、請求項１８に記載の水溶性共役ポリマー。
当該ポリマーが二次色素レポーターおよび抗体に結合される、請求項１８に記載の水溶性共役ポリマー。
前記リンカー

が、当該ポリマー全体の１０％である、請求項１８に記載の水溶性共役ポリマー。
当該ポリマーがストレプトアビジン、抗体または核酸に結合され、直接蛍光レポーターとして使用される、請求項１ないし２１のいずれか１項に記載の水溶性共役ポリマー。
当該ポリマーが、抗体のヒンジ領域においてチオール基に結合される、請求項１ないし２１のいずれか１項に記載の水溶性共役ポリマー。
当該ポリマーが、ヘテロ二官能性リンカーによって修飾されたタンパク質のアミン基に結合される、請求項１ないし２１のいずれか１項に記載の水溶性共役ポリマー。
当該ポリマーが抗体に結合される、請求項１ないし２１のいずれか１項に記載の水溶性共役ポリマー。
前記ポリマー抗体コンジュゲートがフローサイトメトリーアッセイにおいて４０５ｎｍで励起され、その際、特異的シグナルが、Pacific Blueに結合された同じ抗体よりも少な
くとも３倍大きい、請求項２５に記載のポリマー抗体コンジュゲート。
当該ポリマーが９５％以上純粋である、請求項１ないし２１のいずれか１項に記載の水溶性共役ポリマー。
当該ポリマーが、異なる細胞マーカーまたは細胞型を同定するためにフローサイトメトリーアッセイにおいて使用される、請求項１ないし２１のいずれか１項に記載の水溶性共役ポリマー。
当該ポリマーが細胞内染色のために使用される、請求項１ないし２１のいずれか１項に記載の水溶性共役ポリマー。
４０，０００ｇ／ｍｏｌよりも大きい最小数平均分子量と、純水またはリン酸緩衝食塩水溶液中の５０ｍｇ／ｍＬよりも大きい水溶性とを含む、請求項１ないし２１のいずれか１項に記載の水溶性共役ポリマー。
２つの独特の材料に結合することができる少なくとも２つの独特のリンカーを含む、請求項１ないし２１のいずれか１項に記載の水溶性共役ポリマー。
センサー生体分子、バイオコンジュゲートおよび標的生体分子からなる群から選択される少なくとも１つの生体分子に結合されたポリマーを含む共役ポリマー複合体であって、
前記ポリマーが、それに垂下する少なくとも１つのバイオコンジュゲーション部位によって共有結合されており、前記ポリマーがシグナル伝達発色団を含むか、あるいはシグナル伝達発色団が場合によりポリマーまたはセンサー生体分子に共有結合されていてもよく、前記ポリマーが請求項１ないし２１のいずれか１項に記載の水溶性共役ポリマーである、共役ポリマー複合体。
前記センサー生体分子が、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、アビジンＤＮ、およびアビジンＤからなる群から選択される、請求項３２に記載の共役ポリマー複合体。
さらに、ビオチン標識抗体、ビオチン標識タンパク質、およびビオチン標識標的生体分子からなる群から選択される複合体に結合するように構成された、請求項３２に記載の共役ポリマー複合体。
前記センサー生体分子が抗体である、請求項３２に記載の共役ポリマー複合体。
前記シグナル伝達発色団および前記センサー生体分子がいずれも複数のリンカーを介して多発色団に共有結合される、請求項３２に記載の共役ポリマー複合体。
前記ポリマーまたは前記センサー生体分子に共有結合される場合、前記シグナル伝達発色団が有機色素である、請求項３２に記載の共役ポリマー複合体。
式（Ｉａ）：

の構造を有する水溶性共役ポリマーであって、前記式中、
Ｒがそれぞれ独立して、（ＣＨ_２）_ｘ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙＯＣＨ_３（ここで、ｘはそれぞれ独立して０〜２０の整数であり、ｙは独立して０〜５０の整数である）、または場合により１つもしくは複数のハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、もしくは（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｚＯＣＨ_３（ここで、ｚはそれぞれ独立して０〜５０の整数である）によって置換されていてもよいベンジルであり、
任意リンカーＬ_１またはＬ_２がそれぞれ、構造：

（＊＝不飽和骨格への共有結合のための部位）
を有するａ〜ｈからなる群から選択され、ここで、
Ｒ’が独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル、（Ｃ_１〜Ｃ_１２アルキル）ＮＨ_２、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２〜Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３〜Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１〜Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリール、Ｃ_２〜Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、−［ＣＨ_２−ＣＨ_２］_ｒ’−Ｚ^１、もしくは（Ｃ_１〜Ｃ_１２）アルコキシ−Ｘ^１（ここで、Ｚ^１は−ＯＨまたは−ＣＯＯＨであり、Ｘ^１は−ＮＨ_２、−ＮＨＣＯＯＨ、−ＮＨＣＯＯＣ（ＣＨ_３）_３、−ＮＨＣＯ（Ｃ３〜Ｃ１２）シクロアルキル（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル−Ｎ−マレイミド、または−ＮＨＣＯ［ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ］_ｓ’（ＣＨ_２）_ｓ’ＮＨ_２であり、ｒ’は１〜２０の整数であり、そしてｓ’はそれぞれ独立して１〜２０の整数である）、（ＣＨ_２）_３（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｘ”ＯＣＨ_３（ここで、ｘ”は独立して０〜５０の整数である）、または場合により１つもしくは複数のハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜Ｃ_１２アルコキシ、もしくは（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｙ”ＯＣＨ_３（ここで、ｙ”はそれぞれ独立して０〜５０の整数である）によって置換されていてもよいベンジルであり、そしてＲ’がＲとは異なり、
Ｒ^１５が、構造：

（＊＝骨格への共有結合のための部位）
を有するｌ〜ｔからなる群から選択され、そして、
ｋが、２、４、８、１２または２４であり、
ＭＵが、構造：

（＊＝不飽和骨格への共有結合のための部位）
を有するａ’〜ｋ’からなる群から選択されるポリマー修飾単位またはバンドギャップ修飾単位であり、ここで、
Ｒが非イオン性側基であり、
Ｇ_１およびＧ_２がそれぞれ独立して、構造：

を有する１〜３１からなる群から選択され、
ｎが、１〜１０，０００の整数であり、そして
ａ、ｂ、ｃおよびｄが、均等またはランダムにそれぞれが繰り返され得る構造内の各単位のモル％を定義し、ａが１０〜１００％のモル％であり、ｂが９０％以下のモル％であり、ｃおよびｄがそれぞれ２５％以下のモル％である、
水溶性共役ポリマー。