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JP6063398B2 - 抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体を検出するためのアッセイ - Google Patents

抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体を検出するためのアッセイ Download PDF

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Description

発明の詳細な説明
［関連出願の相互参照］
[0001]本出願は、２０１１年２月１７日提出の米国特許仮出願第６１／４４４，０９７号、２０１１年５月１０日提出の米国特許仮出願第６１／４８４，５９４号及び２０１１年６月１３日提出の米国特許仮出願第６１／４９６，５０１号の優先権を主張するものであり、前記特許文献の開示は参照によりあらゆる目的のためにその全体を本明細書に組み込む。
[0002]自己免疫障害は重大で広範な医学問題である。たとえば、関節リウマチ（ＲＡ）は、米国では２００万人以上が患っている自己免疫疾患である。ＲＡは関節の慢性炎症を引き起こし、典型的には関節破壊及び機能的障害を引き起こす潜在力のある進行性疾患である。関節リウマチの原因は分かっていないが、遺伝的素因、感染病原体及び環境要因がすべて前記疾患の原因と結び付けられてきた。活動性ＲＡでは、症状に疲労、食欲不振、微熱、筋肉痛、関節痛及び凝りが含まれる。また、前記疾患再発中には、関節は、滑膜の炎症のため頻繁に赤くなり、腫脹し、痛みを伴い圧痛がある。さらに、ＲＡは全身性疾患であるために、炎症は、目及び口の腺、肺粘膜、心膜並びに血管を含む関節以外の身体の器官及び領域を冒すことがある。
[0003]ＲＡ及び他の自己免疫障害の管理のための従来の治療には、速効性の「第一選択薬」及び遅反応性の「第二選択薬」が含まれる。第一選択薬は疼痛及び炎症を減少する。そのような第一選択薬の例には、アスピリン、ナプロキセン、イブプロフェン、エトドラク及び他の非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）並びに経口的に与えられる又は組織若しくは関節に直接注入される副腎皮質ステロイドが含まれる。第二選択薬は疾患寛解を促進し、進行性関節破壊を防ぎ、疾患修飾性抗リウマチ薬又はＤＭＡＲＤとも呼ばれる。第二選択薬の例には、金、ハイドロクロロキン、アザルフィジン並びにメトトレキサート、アザチオプリン、シクロホスファミド、クロラムブシル及びシクロスポリンなどの免疫抑制剤が含まれる。しかし、これらの薬剤の多くは有害な副作用があることがある。したがって、関節リウマチ及び他の自己免疫障害のための追加の療法が探し求められてきた。
[0004]腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）は単球及びマクロファージを含む多数の細胞型により産生され、最初はある種のマウス腫瘍の壊死を誘導するその能力に基づいて同定されたサイトカインである。その後に、カヘキシーに関連してカケクチンと名付けられた因子がＴＮＦαと同一であることが明らかにされた。ＴＮＦαは、ショック、敗血症、感染症、自己免疫疾患、ＲＡ、クローン病、移植片拒絶及び移植片対宿主病を含む、種々の他のヒト疾患及び障害の病態生理に結び付けられてきた。
[0005]種々のヒト障害においてヒトＴＮＦα（ｈＴＮＦα）が有害な役割を有するので、治療戦略はｈＴＮＦα活性を阻害又は相殺するように計画されてきた。特に、ｈＴＮＦαに結合し中和する抗体がｈＴＮＦα活性を阻害する手段として探し求められてきた。そのような抗体のもっとも初期のものの一部はマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であり、ｈＴＮＦαで免疫されたマウスのリンパ球から調製されたハイブリドーマにより分泌される（たとえば、Ｍｏｅｌｌｅｒらに与えられた米国特許第５，２３１，０２４号参照）。これらのマウス抗ｈＴＮＦα抗体は、多くがｈＴＮＦαに対して高親和性を示し、ｈＴＮＦα活性を中和することができたが、インビボでのその使用は、血清半減期が短いこと、ある種のヒトエフェクター機能を始動させることができないこと、及びヒトにおいてマウス抗体に対する望まれない免疫応答（「ヒト抗マウス抗体」（ＨＡＭＡ）反応）を誘発することなどの、ヒトにマウス抗体を投与することに付随する問題により制限されてきた。
[0006]最近になって、生物学的療法が関節リウマチなどの自己免疫障害の治療に適用されるようになった。たとえば、４種のＴＮＦα阻害剤、キメラ抗ＴＮＦα ｍＡｂであるレミケード（ＲＥＭＩＣＡＤＥ）（商標）（インフリキシマブ）、ＴＮＦＲ−Ｉｇ Ｆｃ融合タンパク質であるエンブレル（ＥＮＢＲＥＬ）（商標）（エタネルセプト）、ヒト抗ＴＮＦα ｍＡｂであるヒュミラ（ＨＵＭＩＲＡ）（商標）（アダリムマブ）、及びペグ化されたＦａｂ断片であるシムジア（ＣＩＭＺＩＡ）（登録商標）（セルトリズマブペゴール）が、関節リウマチの治療のためにＦＤＡにより承認されている。シムジア（登録商標）は、中等度から重度のクローン病（ＣＤ）の治療のためにも使用されている。そのような生物学的療法は、関節リウマチ、及びＣＤなどの他の自己免疫障害の治療における成功を実証したが、治療を受けたすべての対象がそのような療法に応答する、又は十分に応答するわけではない。さらに、ＴＮＦα阻害剤を投与すると、薬剤に対する免疫応答を誘導し、ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）、ヒト抗ヒト化抗体（ＨＡＨＡ）及びヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）などの自己抗体を産生することがある。そのようなＨＡＣＡ、ＨＡＨＡ又はＨＡＭＡ免疫応答は、前記薬剤を用いたさらなる治療の妨げとなる過敏感反応並びに免疫療法ＴＮＦα阻害剤の薬物動態及び体内分布の劇的変化に関連していることがある。したがって、ＴＮＦα阻害剤療法をモニターし処置決定を導くために、患者試料において抗ＴＮＦα生物製剤に対する自己抗体の存在を検出するアッセイの必要性が当技術分野には存在する。本発明はこの必要性を満たし、その上関係する利点も提供する。
[0007]本発明は、試料中の抗ＴＮＦα薬療法に対する自己抗体の存在又はレベルを検出し測定するためのアッセイを提供する。本発明は、前記薬剤に対する自己抗体（たとえば、ＨＡＣＡ及び／又はＨＡＨＡ）の存在又はレベルを検出するために療法を最適化し抗ＴＮＦα薬療法を受ける患者をモニターするのに有用である。本発明は、ＴＮＦα媒介疾患又は障害の治療のために、療法の選択、療法の最適化、及び／又は抗ＴＮＦα薬を受ける対象における毒性の減少を行うための方法も提供する。
[0008]一態様では、本発明は、試料中の抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の存在又はレベルを、前記試料中の前記抗ＴＮＦα薬からの干渉を受けずに検出するための方法であって、
（ａ）前記試料を酸に接触させて自己抗体と抗ＴＮＦα薬のあらかじめ形成された複合体を解離するステップであり、前記試料が抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体を有するか、有すると疑われるステップと、
（ｂ）前記あらかじめ形成された複合体の解離に続いて、前記試料を、標識された抗ＴＮＦα薬に接触させるステップと、
（ｃ）前記試料中の前記酸を中和して、前記標識された抗ＴＮＦα薬と前記自己抗体（すなわち、前記標識された抗ＴＮＦα薬と自己抗体は互いに共有結合していない）の標識された複合体（すなわち、免疫複合体又はコンジュゲート）を形成するステップと、
（ｄ）前記標識された複合体をサイズ排除クロマトグラフィーにかけて、前記標識された複合体を（たとえば、遊離の標識された抗ＴＮＦα薬から）分離するステップと、
（ｅ）前記標識された複合体を検出し、それによって前記試料中の抗ＴＮＦα薬からの干渉を受けずに前記自己抗体の存在又はレベルを検出するステップとを含む方法を提供する。
[0009]いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦα薬は、レミケード（商標）（インフリキシマブ）、エンブレル（商標）（エタネルセプト）、ヒュミラ（商標）（アダリムマブ）、シムジア（登録商標）（セルトリズマブペゴール）、シンポニー（ＳＩＭＰＯＮＩ）（登録商標）（ゴリムマブ、ＣＮＴＯ１４８）及びその組合せから成る群から選択される。
[0010]他の実施形態では、抗ＴＮＦα薬自己抗体には、ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）、ヒト抗ヒト化抗体（ＨＡＨＡ）及びヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）並びにその組合せが含まれるがこれらに限定されない。
[0011]ある種の代わりの実施形態では、ステップ（ａ）及び（ｂ）は同時に実施され、たとえば、試料は酸と標識された抗ＴＮＦα薬に同時に接触させる。ある種の他の代わりの実施形態では、ステップ（ｂ）はステップ（ａ）に先立って実施され、たとえば、試料は先ず標識された抗ＴＮＦα薬に接触させ、次に酸に接触させる。追加の実施形態では、ステップ（ｂ）及び（ｃ）は同時に実施され、たとえば、試料は標識された抗ＴＮＦα薬に接触させ、（たとえば、試料を１つ又は複数の中和剤に接触させることにより）同時に中和される。
[0012]特定の実施形態では、試料は、標識された抗ＴＮＦα薬、非標識抗ＴＮＦα薬及び抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体が平衡になってその間で複合体を形成することができるように、自己抗体と抗ＴＮＦα薬のあらかじめ形成された複合体を解離させるのに十分な量の酸に接触させる。
[0013]別の態様では、本発明は、抗ＴＮＦα薬を用いた１コースの療法を受ける対象において、療法の最適化及び／又は抗ＴＮＦα薬に対する毒性の減少を行うための方法であって、
（ａ）前記対象由来の試料中の前記抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の存在又はレベルを、前記試料中の前記抗ＴＮＦα薬からの干渉を受けずに検出するステップであり、
（ｉ）前記試料を酸に接触させて前記自己抗体と前記抗ＴＮＦα薬のあらかじめ形成された複合体を解離するサブステップで、前記試料が、抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体を有するか、有すると疑われるサブステップと、
（ｉｉ）前記あらかじめ形成された複合体の解離に続いて、前記試料を、標識された抗ＴＮＦα薬に接触させるサブステップと、
（ｉｉｉ）前記試料中の前記酸を中和して、前記標識された抗ＴＮＦα薬と前記自己抗体の標識された複合体（すなわち、免疫複合体又はコンジュゲート）を形成する（すなわち、前記標識された抗ＴＮＦα薬と自己抗体は互いに共有結合していない）サブステップと、
（ｉｖ）前記標識された複合体をサイズ排除クロマトグラフィーにかけて、前記標識された複合体を（たとえば、遊離の標識された抗ＴＮＦα薬から）分離するサブステップと、
（ｖ）前記標識された複合体を検出する（たとえば、それによって前記試料中の抗ＴＮＦα薬からの干渉を受けずに前記自己抗体の存在又はレベルを検出する）サブステップと
を含むステップと、
（ｂ）前記自己抗体の存在又はレベルに基づいて、前記対象のためのコースの療法のそれ以降の用量、又は異なるコースの療法を前記対象に施すべきかどうかを決定ステップと
を含み、それによって療法の最適化及び／又は前記抗ＴＮＦα薬に対する毒性の減少を行う、方法を提供する。
[0014]抗ＴＮＦα薬及び抗薬剤抗体を検出するための方法は、ＰＣＴ出願国際公開第２０１１／０５６５９０号パンフレットにさらに記載されており、前記特許文献の開示は参照によりあらゆる目的のためにその全体を本明細書に組み込む。
[0015]他の態様では、本発明は、対象におけるＴＮＦα媒介疾患又は障害の治療のための１コースの療法を選択する（たとえば、適切な抗ＴＮＦα薬を選択する）ための方法であって、
（ａ）前記対象から得られた試料を分析して、前記試料中の１つ又は複数のマーカーの存在、レベル又は遺伝子型を決定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）において決定された１つ又は複数のマーカーの存在、レベル又は遺伝子型に統計アルゴリズムを適用して疾患活動性／重症度指標を生み出すステップと、
（ｃ）前記疾患活動性／重症度指標に基づいて前記対象のための適切なコースの療法（たとえば、抗ＴＮＦα療法）を選択するステップと
を含む方法を提供する。
[0016]関連する態様では、本発明は、ＴＮＦα媒介疾患又は障害の治療のための１コースの療法を受ける対象において、療法の最適化及び／又は毒性の減少を行うための方法であって、
（ａ）前記対象から得られた試料を分析して、前記試料中の１つ又は複数のマーカーの存在、レベル又は遺伝子型を決定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）において決定された１つ又は複数のマーカーの存在、レベル又は遺伝子型に統計アルゴリズムを適用して疾患活動性／重症度指標を生み出すステップと、
（ｃ）前記疾患活動性／重症度指標に基づいて、前記対象のための前記コースの療法のそれ以降の用量、又は異なるコースの療法を前記対象に施すべきかどうかを決定するステップと
を含む方法を提供する。
[0017]特定の実施形態では、本発明の方法は、以下の範疇のバイオマーカー
（１）炎症マーカー
（２）増殖因子
（３）血清学（たとえば、免疫マーカー）
（４）サイトカイン及びケモカイン
（５）酸化ストレスのマーカー
（６）細胞表面受容体（たとえば、ＣＤ６４、他）
（７）シグナル伝達経路
（８）他のマーカー（たとえば、炎症経路遺伝子などの遺伝子マーカー）
のうちの１つ又は複数における１つ又は複数の特定のマーカーの存在、レベル（濃度（たとえば、全体）及び／又は活性化（たとえば、リン酸化））又は遺伝子型を検出、測定又は決定することを含む。
[0018]追加の実施形態では、患者試料（たとえば、抗ＴＮＦ薬療法中の患者由来の血清試料）において以下のマーカー：（９）抗ＴＮＦ薬レベル（たとえば、遊離の抗ＴＮＦα治療抗体のレベル）及び／又は（１０）抗薬剤抗体（ＡＤＡ）レベル（たとえば、抗ＴＮＦ薬剤に対する自己抗体のレベル）のうちの１つ又は両方の存在及び／又はレベルを検出、測定又は決定することも可能である。
[0019]特定の実施形態では、次に単一の統計アルゴリズム又は２つ若しくはそれよりも多い統計アルゴリズムの組合せを、試料において検出、測定又は決定されたマーカーの存在、濃度レベル、活性化レベル又は遺伝子型に適用して、それによって疾患活動性／重症度指標を生み出すことが可能である。
[0020]ある種の例では、試料は当技術分野で公知の任意の技法を使用してＰＢＭＣ及び／又はＰＭＮ細胞を単離することにより得られる。他の実施形態では、試料は、たとえば、消化管又は滑液組織の一部などの炎症部位由来の組織生検である。
[0021]したがって、いくつかの態様では、本発明の方法は、たとえば、初回治療に適切な抗ＴＮＦα療法を選択することにより、抗ＴＮＦα薬のそれ以降の用量を調整若しくは修正する（たとえば、増加又は減少する）時期若しくは方法を決定すること、抗ＴＮＦα薬（たとえば、初回の、増加した、減少した又は同じ用量で）をメトトレキサート（ＭＴＸ）及び／若しくはアザチオプリン（ＡＺＡ）などの１つ若しくは複数の免疫抑制剤と組み合わせる時期若しくは方法を決定すること、並びに／又は現在のコースの療法を変更する（たとえば、異なる抗ＴＮＦα薬に又はＩＬ−６受容体阻害モノクローナル抗体などの異なる機序を標的にする薬剤に切り換える）時期若しくは方法を決定することにより、抗ＴＮＦα薬療法を受けている患者又は受けようとしている患者のための処置決定を導くのに有用な情報を提供する。
[0022]本発明の他の目的、特長及び利点は、以下の詳細な説明及び図から当業者には明らかになるであろう。
サイズ排除ＨＰＬＣを使用してＴＮＦα−アレクサ（Ａｌｅｘａ）６４７とヒュミラ（商標）間の結合を検出する本発明のアッセイの例となる実施形態を示す図である。 ＴＮＦα−アレクサ６４７に結合しているヒュミラ（商標）の用量応答曲線を示す図である。 架橋アッセイとして知られる、ＨＡＣＡレベルを測定するための現在のＥＬＩＳＡベースの方法を示す図である。 レミケード（商標）に対して生成されるＨＡＣＡ／ＨＡＨＡの濃度を測定するための本発明の自己抗体検出アッセイの例となる概要を示す図である。 レミケード（商標）−アレクサ６４７に結合する抗ヒトＩｇＧ抗体の用量応答解析を示す図である。 レミケード（商標）−アレクサ６４７に結合する抗ヒトＩｇＧ抗体の第二の用量応答解析を示す図である。 レミケード（商標）−アレクサ６４７に結合する抗ヒトＩｇＧ抗体の用量応答曲線を示す図である。 正常なヒト血清及びＨＡＣＡ陽性血清におけるレミケード（商標）−アレクサ６４７免疫複合体形成を示す図である。 架橋アッセイ又は本発明の移動度シフトアッセイを使用して実施された２０人の患者血清試料からのＨＡＣＡ測定の概要を示す図である。 ＨＡＣＡの血清濃度を測定するための現在の方法の概要及び現在の方法の、本発明の新規のＨＡＣＡアッセイとの比較を示す図である。 正常な（ＮＨＳ）又はＨＡＣＡ陽性（ＨＰＳ）血清と一緒にインキュベートされたフルオロフォア（Ｆｌ）標識ＩＦＸのＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示す図である。インキュベーション混合物への漸増量のＨＡＣＡ陽性血清の添加により、ＩＦＸ−Ｆｌピークはもっと高い分子質量溶出位置、Ｃ１及びＣ２へ用量依存的に移動した。 移動度シフトアッセイにより決定された場合のＨＡＣＡ陽性血清の希釈率の増加に伴い生成される結合した及び遊離のＩＦＸ−Ｆｌの用量応答曲線を示す図である。（Ａ）漸増する希釈率のＨＡＣＡ陽性血清は３７．５ｎｇのＩＦＸ−Ｆｌと一緒にインキュベートされた。希釈率が高くなる（ＨＡＣＡが少なくなる）にしたがって、ＳＥ−ＨＰＬＣ解析において見出される遊離のＩＦＸ−Ｆｌは多くなった。（Ｂ）漸増する希釈率のＨＡＣＡ陽性血清は３７．５ｎｇのＩＦＸ−Ｆｌと一緒にインキュベートされた。希釈率が高くなる（ＨＡＣＡが少なくなる）にしたがって、ＳＥ−ＨＰＬＣ解析において見出されるＨＡＣＡ結合ＩＦＸ−Ｆｌは少なくなった。 正常な（ＮＨＳ）又はＩＦＸスパイクされた血清と一緒にインキュベートされたＴＮＦα−ＦｌのＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを示す図である。インキュベーション混合物への漸増量のＩＦＸスパイクされた血清の添加により、蛍光ＴＮＦαピークはもっと高い分子質量溶出位置へ用量依存的に移動した。 移動度シフトアッセイにより決定された場合のＩＦＸスパイクされた血清の希釈率の増加に伴い生成される、結合したＴＮＦα及び遊離のＴＮＦαの用量応答曲線を示す図である。インキュベーション混合物に添加されるＩＦＸの濃度が増加すると、遊離のＴＮＦαの百分率は減少するが、結合したＴＮＦαの百分率は増加する。 移動度シフトアッセイによる、異なる時点でのＩＦＸを用いて処置されたＩＢＤ患者における相対的ＨＡＣＡレベル及びＩＦＸ濃度の測定を示す図である。 患者管理−異なる時点でＩＦＸを用いて処置されたＩＢＤ患者の血清におけるＨＡＣＡレベル及びＩＦＸ濃度の測定を示す図である。 （Ａ）非中和自己抗体又は（Ｂ）ＨＡＣＡなどの中和自己抗体の存在を検出するための本発明のアッセイの例となる実施形態を示す図である。 ＨＡＣＡなどの中和自己抗体の存在を検出するための本発明のアッセイの代わりの実施形態を示す図である。 異なる量の抗ヒトＩｇＧの存在下で正常なヒト血清（ＮＨＳ）と一緒にインキュベートされたＦｌ標識ＡＤＬの移動度シフトプロファイルを示す図である。インキュベーション混合物への漸増量の抗ヒトＩｇＧの添加により、遊離のＦｌ−ＡＤＬピーク（ＦＡ）はもっと高い分子質量溶出位置、Ｃ１及びＣ２へ用量依存的に移動したが、内部標準（ＩＣ）は変化しなかった。 遊離のＦｌ−ＡＤＬのシフト上の抗ヒトＩｇＧの用量応答曲線を示す図である。漸増量の抗ヒトＩｇＧは３７．５ｎｇのＦｌ−ＡＤＬ及び内部標準と一緒にインキュベートされた。反応混合物に添加される抗体が多くなるにしたがって、内部標準に対する遊離のＦｌ−ＡＤＬの比は低くなった。 異なる量のＡＤＬの存在下で正常なヒト血清（ＮＨＳ）と一緒にインキュベートされたＦｌ標識ＴＮＦαの移動度シフトプロファイルを示す図である。Ｅｘ＝４９４ｎｍ；Ｅｍ＝５１９ｎｍ。インキュベーション混合物への漸増量のＡＤＬの添加により、遊離のＴＮＦ−Ｆｌピーク（ＦＴ）はもっと高い分子質量溶出位置へ用量依存的に移動したが、内部標準（ＩＣ）ピークは変化しなかった。 遊離のＴＮＦα−Ｆｌのシフト上のＡＤＬの用量応答曲線を示す図である。漸増量のＡＤＬは１００ｎｇのＴＮＦα−Ｆｌ及び内部標準と一緒にインキュベートされた。反応混合物に添加される抗体ＡＤＬが多くなるにしたがって、内部標準に対する遊離のＴＮＦα−Ｆｌの比は低くなった。 正常な（ＮＨＳ）又はプールされたＨＡＣＡ陽性患者血清と一緒にインキュベートされたＦｌ標識レミケード（ＩＦＸ）の移動度シフトプロファイルを示す図である。 正常な（ＮＨＳ）又はマウス抗ヒトＩｇＧ１抗体と一緒にインキュベートされたＦ１標識ヒュミラ（ＡＤＬ）の移動度シフトプロファイルを示す図である。 正常な（ＮＨＳ）又はプールされたＨＡＨＡ陽性患者血清と一緒にインキュベートされたＦ１標識ヒュミラ（ＡＤＬ）の移動度シフトプロファイルを示す図である。 酸解離ステップの効果の図解を示す図である。「Ａ」は標識されたレミケードを表し、「Ｂ」はＨＡＣＡを表し、「Ｃ」はレミケードを表している。 酸解離ステップなしの対数患者血清百分率の関数としての、遊離の標識されたインフリキシマブのパーセントを示す図である。 酸解離ステップのある対数患者血清百分率の関数としての、遊離の標識されたインフリキシマブのパーセントを示す図である。 患者症例１についての時間の関数としての、インフリキシマブを用いて処置された患者における血清ＩＦＸレベルを示す図である。 患者症例３についての時間の関数としての、インフリキシマブを用いて処置された患者における血清ＩＦＸレベルを示す図である。 患者症例３についての時間の関数としての、インフリキシマブを用いて処置された患者における血清ＴＮＦαレベルを示す図である。 患者症例１（Ａ）、患者症例２（Ｂ、Ｃ）及び患者症例４（Ｄ）についてのＦｌ標識ＩＦＸの移動度シフトプロファイルを示す図である。 患者症例５（Ａ）、患者症例６（Ｂ、Ｃ）及び患者症例７（Ｄ、Ｅ）についてのＦｌ標識ＩＦＸの移動度シフトプロファイルを示す図である。 異なる患者血清群におけるサイトカインレベルを示す図である。 異なる値でのゲイン設定をした蛍光検出器を使用する移動度シフトアッセイによるＴＮＦ−アレクサ４８８及びレミケードを含有する試料の解析を示す図である。 ＨＰＬＣ移動相（１×ＰＢＳ、水中０．１％ＢＳＡ）における正常なヒト血清（上パネル）及びＴＮＦ−アレクサ４８８（下パネル）について取られた等吸光度プロットを示す図である。励起波長はＹ軸上にプロットされ、発光波長はＸ軸上にプロットされている。 表示された設定で検出された正常ヒト血清（左）及び２５ｎｇのＴＮＦ−アレクサ４８８（右）のＨＰＬＣ解析を示す図である。正常ヒト血清からの蛍光の背景レベルは大幅に減少されている。 一定量のＴＮＦ−アレクサ４８８を含有し様々な量のレミケードを用いて滴定された試料のＨＰＬＣ解析により作成された標準曲線を示す図である。 移動度シフトアッセイ及びＥＬＩＳＡによる臨床試料におけるインフリキシマブ決定の比較を示す図である。濃灰色点はＨＡＣＡ陽性試料についてであり、淡灰色点はＨＡＣＡ陰性試料についてである。破線は、それぞれの方法での定量化の下限を表している。 移動度シフトアッセイ及びＥＬＩＳＡによる臨床試料におけるＨＡＣＡ決定の比較を示す図である。 移動度シフトアッセイ及びＥＬＩＳＡにより決定した場合のＨＡＣＡ陽性臨床試料の累積カウント数を示す図である。
Ｉ．序論
[0064]本発明は、サイズ排除クロマトグラフィー及び免疫複合体の平衡を可能にする酸解離を使用する均一移動度シフトアッセイが、抗ＴＮＦα薬に対して産生される自己抗体（たとえば、ＨＡＣＡ、ＨＡＨＡ、など）の存在又はレベルを測定するために特に有利であるという発見に一部基づいている。そのような自己抗体は抗薬剤抗体又はＡＤＡとしても知られている。その結果、それを必要とする対象に投与された抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の存在又はレベルは、対象試料中にも存在する投与された抗ＴＮＦα薬からの実質的な干渉を受けずに測定することが可能である。特に、対象試料は、高抗ＴＮＦα薬レベルからの実質的な干渉のない抗ＴＮＦα薬の存在下での自己抗体の存在又はレベルの測定を提供するのに十分な量の酸と一緒にインキュベートすることが可能である。
[0065]試料中の高抗ＴＮＦα薬レベル（たとえば、高インフリキシマブレベル）は抗薬剤抗体レベル（たとえば、ＨＡＣＡレベル）の測定に干渉する。ある種の高薬剤条件下では、試料中に存在する抗薬剤抗体は前記試料中に存在する非標識薬剤とも複合体を形成する。標識された薬剤、たとえば標識されたインフリキシマブを試料に接触させると、試料中に存在する抗薬剤抗体は、前記標識された薬剤と複合体を形成することから速度論的に捕捉される。このようにして、抗薬剤抗体と非標識薬剤のあらかじめ形成された複合体は、存在する抗薬剤抗体と標識された薬剤間の複合体の形成に依存する抗薬剤抗体の測定に干渉する。本明細書に記載される酸解離ステップにより、試料中に存在する抗薬剤抗体は非標識薬剤から解離して標識された薬剤とも非標識薬剤とも複合体を再形成することが可能になる。前記抗薬剤抗体を前記非標識薬剤から解離することにより、試料中に存在する抗薬剤抗体は標識された薬剤と非標識薬剤間で平衡を保つことができる。
[0066]図２７に示されるように、高レベルの抗ＴＮＦα薬（たとえば、インフリキシマブ）は、移動度シフトアッセイが酸解離ステップなしで実施される場合、抗薬剤抗体（たとえば、インフリキシマブ又はＡＴＩに対する抗体）の検出に干渉する。しかし、図２８は、酸解離とそれに続く均一溶液相結合反応速度が免疫複合体の平衡及び再形成を可能にするために、抗ＴＮＦα薬剤耐性が著しく増加し、抗薬剤抗体は高レベルの抗ＴＮＦα薬（たとえば、最大又は最小でも約６０μｇ／ｍＬ）の存在下で測定することが可能であることを示している。したがって、本発明のアッセイは、現在利用可能な方法よりも特に有利である。なぜならば、前記アッセイにより（たとえば、血液試料などの試料中の抗ＴＮＦα薬の低、中程度又は高レベルとは関係なく）抗ＴＮＦα薬を用いた療法中のどんな時期でも抗薬剤抗体の検出及び測定が可能になり、それによって薬剤のトラフ濃度での試料収集が必要な当技術分野の方法の大きな限界が克服されるからである。
[0067]ある種の態様では、本発明は有利である。なぜならば、本発明は、一部に、抗ＴＮＦα薬療法を受けている又は受けようとしている患者のための処置決定を導くのに有用な情報を提供することにより、インフリキシマブなどの抗ＴＮＦα薬の投与に伴う現在の限界に取り組み克服するからである。特に、本発明の方法は、初回治療のための適切な抗ＴＮＦα療法を選択することに、治療効果の最適化及び／若しくは毒性の減少を行う抗ＴＮＦα薬のそれ以降の用量を調整若しくは修正する（たとえば、増加又は減少させる）時期若しくは方法を決定することに、抗ＴＮＦα薬（たとえば、初回、増加した、減少した又は同じ用量で）をメトトレキサート（ＭＴＸ）若しくはアザチオプリン（ＡＺＡ）などの１つ若しくは複数の免疫抑制剤と組み合わせる時期若しくは方法を決定すること、並びに／又は現在のコースの療法を変更する（たとえば、異なる抗ＴＮＦα薬に又は異なる機序を標的にする薬剤に切り替える）時期若しくは方法を決定することに有用である。
[0068]したがって、本発明は、処置決定を導くことにより患者管理を改善する以下の方法、すなわち、
１．クローン病徴候：療法から利益を得る可能性がもっとも高い患者を処置する
２．抗治療抗体モニタリング（ＡＴＭ）＋バイオマーカーベースの疾患活性度指標
３．ＡＴＭ二段層化
４．薬物動態学モデリングを用いるＡＴＭ
５．応答をモニターし再発の危険を予測する
ａ．再発の危険が低い患者において長期維持療法を回避する
ｂ．粘膜治癒のマーカー
ｃ．療法選択：抗ＴＮＦ薬療法をＭＴＸ又はＡＺＡなどの免疫抑制剤と組み合わせるかどうか
６．生物製剤の患者選択
において特に有用である。
ＩＩ．定義
[0069]本明細書で使用されるように、以下の用語は他の方法で明確に述べられていなければ、その用語に属するとみなされる意味を有する。
[0070]本明細書で使用される用語「抗ＴＮＦα薬」又は「ＴＮＦα阻害剤」は、対象におけるＴＮＦα活性を減少させることになる、タンパク質、抗体、抗体断片、融合タンパク質（たとえば、Ｉｇ融合タンパク質又はＦｃ融合タンパク質）、多価結合タンパク質（たとえば、ＤＶＤ Ｉｇ）、小分子ＴＮＦαアンタゴニスト及び類似の天然存在若しくは天然非存在の分子、並びに／又はＴＮＦαとＴＮＦαの細胞表面受容体の相互作用を阻害すること、ＴＮＦαタンパク質産生を阻害すること、ＴＮＦα遺伝子発現を阻害すること、細胞からのＴＮＦα分泌を阻害すること、ＴＮＦα受容体シグナル伝達を阻害することなどにより、ＴＮＦα活性を直接的に若しくは間接的に阻害するその組換え形態及び／若しくは操作された形態を含む薬剤又は他の任意の手段を包含することが意図されている。用語「抗ＴＮＦα薬」又は「ＴＮＦα阻害剤」は、好ましくはＴＮＦα活性に干渉する薬剤を含む。抗ＴＮＦα薬の例には、制限なく、インフリキシマブ（レミケード（商標）、Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ）、ヒト抗ＴＮＦモノクローナル抗体アダリムマブ（Ｄ２Ｅ７／ヒュミラ（商標）、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、エタネルセプト（エンブレル（商標）、Ａｍｇｅｎ）、セルトリズマブペゴール（シムジア（登録商標）、ＵＣＢ，Ｉｎｃ．）、ゴリムマブ（シンポニー（登録商標）、ＣＮＴＯ１４８）、ＣＤＰ５７１（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）、ＣＤＰ８７０（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）、並びに、ＴＮＦα活性を阻害し、ＴＮＦα活性が有害である障害（たとえば、ＲＡ）に罹っている又は罹る危険のある対象に投与された場合、前記障害が治療される他の化合物が含まれる。
[0071]用語「ＴＮＦα」は、１７ｋＤａ分泌型及び２６ｋＤａ膜結合型として存在し、その生物活性型が非共有結合１７ｋＤａ分子の三量体で構成されているヒトサイトカインを含むことが意図されている。ＴＮＦαの構造は、たとえば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３３８：２２５〜２２８頁（１９８９）にさらに記載されている。用語ＴＮＦαは、ヒトＴＮＦα、組換えヒトＴＮＦα（ｒｈＴＮＦα）又はヒトＴＮＦαタンパク質に少なくとも約８０％同一であるＴＮＦαを含むことが意図されている。ヒトＴＮＦαは、３５個のアミノ酸（ａａ）細胞質ドメイン、２１個のａａ膜貫通セグメント及び１７７個のａａ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）から成る（Ｐｅｎｎｉｃａ，Ｄ．ら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７２４頁）。ＥＣＤ内では、ヒトＴＮＦαはアカゲザルＴＮＦαと９７％ａａ配列同一性を、ウシ、イヌ、コットンラット、ウマ、ネコ、マウス、ブタ及びラットＴＮＦαとは７１％〜９２％ａａ配列同一性を共有している。ＴＮＦαは標準組換え発現法により調製又は市販のもの（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２１０−ＴＡ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎ．）を購入することが可能である。
[0072]ある種の実施形態では、「ＴＮＦα」は「抗原」であり、これは抗ＴＮＦα薬が結合することができる分子又は分子の一部を含む。ＴＮＦαは１つ又は複数のエピトープを有することができる。ある種の例では、ＴＮＦαは、高度に選択的な方法で、抗ＴＮＦα抗体と反応することになる。抗体、抗ＴＮＦα抗体の断片又は領域に結合する好ましい抗原は、ヒトＴＮＦαの少なくとも５個のアミノ酸を含む。ある種の例では、ＴＮＦαは、抗ＴＮＦα抗体、その断片及び領域に結合することができるＴＮＦαのエピトープを有する十分な長さである。
[0073]用語「抗ＴＮＦα薬に対する応答性を予測する」は、抗ＴＮＦα薬を用いた対象の処置が前記対象において効果的になる又は効果的にはならない（たとえば、前記対象に測定可能な利益を与える）可能性を評価する能力を指すことが意図されている。特に、処置が効果的になる又はならない可能性を評価するそのような能力は、典型的には処置が始まり、有効性の指標（たとえば、測定可能な利益の指標）が対象において観察された後で発揮される。特に好ましい抗ＴＮＦα薬は、ＴＮＦα媒介疾患又は障害の治療においてヒトでの使用についてＦＤＡにより承認されている生物製剤であり、本明細書に記載される抗ＴＮＦα薬を含む。
[0074]用語「サイズ排除クロマトグラフィー」又は「ＳＥＣ」には、溶液中の分子がそのサイズ及び／又は流体力学的容積に基づいて分離されるクロマトグラフィー法が含まれる。前記方法はタンパク質及びそのコンジュゲートなどの大きな分子又は巨大分子複合体に適用される。典型的には、水溶液を使用してカラム中を通して試料を移動させる場合、その技法はゲル濾過クロマトグラフィーとして知られている。
[0075]用語「複合体」、「免疫複合体」、「コンジュゲート」及び「免疫コンジュゲート」には、抗ＴＮＦα薬に（たとえば、非共有結合的手段により）結合しているＴＮＦα、抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体に（たとえば、非共有結合的手段により）結合している抗ＴＮＦα薬及びＴＮＦαと抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の両方に（たとえば、非共有結合的手段により）結合している抗ＴＮＦα薬が含まれるが、これらに限定されない。
[0076]本明細書で使用されるように、用語「標識される」により修飾される実体には、任意の実体、分子、タンパク質、酵素、抗体、抗体断片、サイトカイン若しくは別の分子にコンジュゲートされている関連種又は経験的に検出可能である化学的実体が含まれる。標識された実体の標識として適切な化学種には、蛍光色素、たとえば、アレクサフルオル（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）（登録商標）６４７などのアレクサフルオル（登録商標）色素、量子ドット、光学色素、発光色素及び放射性核種、たとえば、１２５Ｉが含まれるが、これらに限定されない。
[0077]用語「有効量」には、それを必要とする対象において治療効果を達成することができる薬剤の用量並びに薬剤の生物学的に利用可能な量が含まれる。用語「生物学的に利用可能な」には、治療活性に利用可能である薬剤の投与される用量の一部が含まれる。たとえば、ＴＮＦαがその病態生理学に関与しているとされてきた疾患又は障害を治療するのに有用な薬剤の有効量は、その疾患又は障害に伴う１つ又は複数の症状を予防又は軽減することができる量であり得る。
[0078]語句「蛍光標識検出」には、蛍光標識を検出するための手段が含まれる。検出のための手段には、分光計、蛍光分光計、光度計及びＡｇｉｌｅｎｔ−１２００ ＨＰＬＣシステムなどの、しかしこれに限定されない、サイズ排除高速液体クロマトグラフィーなどの、しかしこれに限定されないクロマトグラフィー機器に一般的に組み込まれている検出装置が含まれるが、これらに限定されない。
[0079]語句「療法を最適化する」には、特定の療法の用量（たとえば、有効量又はレベル）及び／又は種類を最適化することが含まれる。たとえば、抗ＴＮＦα薬の用量を最適化するには、対象にそれ以降投与される抗ＴＮＦα薬の量を増加すること又は減少することが含まれる。ある種の例では、抗ＴＮＦα薬の種類を最適化するには、投与される抗ＴＮＦα薬を１つの薬剤から異なる薬剤（たとえば、異なる抗ＴＮＦα薬）に変更することが含まれる。他の例では、療法を最適化するには、抗ＴＮＦα薬の用量（たとえば、増加した量、減少させた量又は以前の用量と同じ用量）を免疫抑制薬と組み合わせて同時投与することが含まれる。
[0080]用語「同時投与する」には、１つの活性薬剤の生理効果の持続期間が第二の活性薬剤の生理効果と重なるように、１つよりも多い活性薬剤を投与することが含まれる。
[0081]用語「対象」、「患者」又は「個体」は典型的には、ヒトのことであるが、たとえば、他の霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ブタなどを含む他の動物のことでもある。
[0082]用語「１コースの療法」には、ＴＮＦα媒介疾患又は障害に伴う１つ又は複数の症状を軽減又は予防するために取られる任意の治療アプローチが含まれる。前記用語は、ＴＮＦα媒介疾患又は障害に罹った個人の健康を改善するのに有用な任意の化合物、薬剤、手順及び／又は投与計画を施すことを包含しており、本明細書に記載される治療薬剤のいずれも含まれる。当業者であれば、本発明の方法を使用して、ＴＮＦα、抗ＴＮＦα薬及び／又は抗薬剤抗体の存在又は濃度レベルに基づいて、１コースの療法又は現在のコースの療法の用量を変更する（たとえば、増加又は減少させる）ことが可能であることは認識されるであろう。
[0083]用語「免疫抑制薬」又は「免疫抑制剤」には、免疫抑制効果、たとえば、照射により又は代謝拮抗薬、抗リンパ球血清、抗体などの薬剤の投与によるのと同じような、免疫応答の予防又は減少を生じることができる任意の物質が含まれる。免疫抑制薬の例には、制限なく、アザチオプリン（ＡＺＡ）及びその代謝産物などのチオプリン薬；メトトレキサート（ＭＴＸ）などの代謝拮抗薬；シロリムス（ラパマイシン）；テムシロリムス；エベロリムス；タクロリムス（ＦＫ−５０６）；ＦＫ−７７８；抗リンパ球グロブリン抗体、抗胸腺細胞グロブリン抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ４抗体及び抗体毒素コンジュゲート；シクロスポリン；ミコフェノール酸；ミゾリビン一リン酸；スコパロン；グラチラマー酢酸；その代謝産物；薬学的に許容されるその塩；その誘導体；そのプロドラッグ；並びにその組合せが含まれる。
[0084]用語「チオプリン薬」には、アザチオプリン（ＡＺＡ）、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）又は治療効果を有するその任意の代謝産物が含まれ、制限なく、６−チオグアニン（６−ＴＧ）、６−メチルメルカプトプリンリボシド、６−チオイノシンヌクレオチド（たとえば、６−チオイノシン一リン酸、６−チオイノシン二リン酸、６−チオイノシン三リン酸）、６−チオグアニンヌクレオチド（たとえば、６−チオグアノシン一リン酸、６−チオグアノシン二リン酸、６−チオグアノシン三リン酸）、６−チオキサントシンヌクレオチド（たとえば、６−チオキサントシン一リン酸、６−チオキサントシン二リン酸、６−チオキサントシン三リン酸）、その誘導体、その類似体及びその組合せが含まれる。
[0085]用語「試料」には、個人から得られる任意の生体試料が含まれる。試料には、制限なく、全血、血漿、血清、赤血球、白血球（たとえば、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、多形核（ＰＭＮ）細胞）、乳管洗浄液、乳頭吸引液、リンパ（たとえば、リンパ節の播種性腫瘍細胞）、骨髄吸引液、唾液、尿、便（すなわち、糞便）、痰、気管支洗浄液、涙、微細針吸引液（たとえば、無作為乳頭周囲微細針吸引により収穫される）、他の任意の体液、炎症部位の生検などの組織試料（たとえば、針生検）、その細胞抽出物及びこれらの体液又は組織のうちの１つ又は複数由来の免疫グロブリン濃縮画分が含まれる。いくつかの実施形態では、試料は全血、血漿、血清若しくは細胞ペレットなどのその分画成分又はその免疫グロブリン濃縮画分である。当業者であれば、血清試料などの試料は解析に先立って希釈することが可能であることを認識するであろう。ある種の実施形態では、試料は、当技術分野で公知の任意の技法を使用してＰＢＭＣ及び／又はＰＭＮ細胞を単離することにより得られる。ある種の他の実施形態では、試料は、たとえば、消化管又は滑液組織の一部などの炎症部位由来などの組織生検である。
[0086]本発明の方法のステップは、必ずしもそれが提示される特定の順に実施する必要はない。当業者であれば、本発明の方法のステップの他の順序付けは本発明の範囲内に包含されることは理解していると考えられる。
[0087]角カッコ「［］」は、角カッコ内の種がその濃度によって言及されることを示している。
ＩＩＩ．実施形態の説明
[0088]本発明は、試料中の抗ＴＮＦα薬療法に対する自己抗体の存在又はレベルを検出し測定するためのアッセイを提供する。本発明は、療法を最適化し、前記薬剤に対する自己抗体（たとえば、ＨＡＣＡ及び／又はＨＡＨＡ）の存在又はレベルを検出するために抗ＴＮＦα薬療法を受けている患者をモニターするのに有用である。本発明は、ＴＮＦα媒介疾患若しくは障害の治療のために、療法の選択、療法の最適化及び／又は抗ＴＮＦα薬を受けている対象における毒性の減少を行うための方法も提供する。
[0089]一態様では、本発明は、試料中の抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の存在又はレベルを、前記試料中の抗ＴＮＦα薬からの干渉を受けずに検出するための方法であって、
（ａ）前記試料を酸に接触させて前記自己抗体と前記抗ＴＮＦα薬のあらかじめ形成された複合体を解離するステップであり、前記試料が抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体を有するか、有すると疑われると、
（ｂ）前記あらかじめ形成された複合体の解離に続いて、前記試料を、標識された抗ＴＮＦα薬に接触させるステップと、
（ｃ）前記試料中の前記酸を中和して、前記標識された抗ＴＮＦα薬と前記自己抗体（すなわち、前記標識された抗ＴＮＦα薬と自己抗体は互いに共有結合していない）の標識された複合体（すなわち、免疫複合体又はコンジュゲート）を形成するステップと、
（ｄ）前記標識された複合体をサイズ排除クロマトグラフィーにかけて前記標識された複合体を（たとえば、遊離の標識された抗ＴＮＦα薬から）分離するステップと、
（ｅ）前記標識された複合体を検出し、それによって前記試料中の抗ＴＮＦα薬からの干渉を受けずに前記自己抗体の存在又はレベルを検出するステップと
を含む方法を提供する。
[0090]いかなる特定の理論にも縛られずに、酸解離は自己抗体（抗薬剤抗体又はＡＤＡとしても知られている）と抗ＴＮＦα薬間のＫｄを変化させると考えられている。特に、酸解離はＡＤＡと抗ＴＮＦα薬間の結合を破壊することが理論付けられている。これらの結合には、水素結合、静電結合、ファンデルワールス力及び／又は疎水結合が含まれるが、これらに限定されない。酸を添加するとｐＨが増加し、したがって水素イオン濃度が増加する。水素イオンはこの時点で、前述の非共有結合的相互作用を競うことができる。この競合のためにＡＤＡと抗ＴＮＦα薬間のＫｄは低下する。
[0091]いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦα薬は、レミケード（商標）（インフリキシマブ）、エンブレル（商標）（エタネルセプト）、ヒュミラ（商標）（アダリムマブ）、シムジア（登録商標）（セルトリズマブペゴール）、シンポニー（登録商標）（ゴリムマブ、ＣＮＴＯ１４８）及びその組合せから成る群から選択される。
[0092]他の実施形態では、抗ＴＮＦα薬自己抗体には、ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）、ヒト抗ヒト化抗体（ＨＡＨＡ）及びヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）、並びにその組合せが含まれるが、これらに限定されない。
[0093]ある種の代わりの実施形態では、ステップ（ａ）及び（ｂ）は同時に実施され、たとえば、試料は酸と標識された抗ＴＮＦα薬に同時に接触させる。ある種の他の代わりの実施形態では、ステップ（ｂ）はステップ（ａ）に先立って実施され、たとえば、試料は先ず標識された抗ＴＮＦα薬に接触させ、次に酸に接触させる。追加の実施形態では、ステップ（ｂ）及び（ｃ）は同時に実施され、たとえば、試料は標識された抗ＴＮＦα薬に接触させ、（たとえば、試料を１つ又は複数の中和剤に接触させることにより）同時に中和される。
[0094]特定の実施形態では、試料は、標識された抗ＴＮＦα薬、非標識抗ＴＮＦα薬及び抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体が平衡になってその間で複合体を形成することができるように、自己抗体と抗ＴＮＦα薬のあらかじめ形成された複合体を解離させるのに十分な量の酸に接触させる。
[0095]好ましい実施形態では、本発明の方法は、試料中にも存在する抗ＴＮＦα薬からの実質的な干渉なしで自己抗体の存在又はレベルを検出することを含む。そのような実施形態では、試料は、高レベルの抗ＴＮＦα薬の存在下で自己抗体の検出及び／又は測定を可能にするのに十分な量の酸に接触させることが可能である。
[0096]いくつかの実施形態では、語句「高レベルの抗ＴＮＦα薬」には、約１０〜約１００μｇ／ｍＬ、約２０〜約８０μｇ／ｍＬ、約３０〜約７０μｇ／ｍＬ、又は約４０〜約８０μｇ／ｍＬの薬剤レベルが含まれる。他の実施形態では、語句「高レベルの抗ＴＮＦα薬」には、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００μｇ／ｍＬよりも多い又は等しい薬剤レベルが含まれる。
[0097]いくつかの実施形態では、酸は有機酸を含む。他の実施形態では、酸は無機酸を含む。追加の実施形態では、酸は有機酸と無機酸の混合物を含む。有機酸の非限定的例には、クエン酸、イソクエン酸、グルタミン酸、酢酸、乳酸、ギ酸、シュウ酸、尿酸、トリフルオロ酢酸、ベンゼンスルホン酸、アミノメタンスルホン酸、樟脳−１０−スルホン酸、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、プロパン酸、ブタン酸、グリセリン酸、コハク酸、リンゴ酸、アスパラギン酸及びその組合せが含まれる。無機酸の非限定的例には、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、ホウ酸、フッ化水素酸、臭化水素酸及びその組合せが含まれる。
[0098]ある種の実施形態では、酸の量は、酸又は酸の混合物の約０．０１Ｍ〜約１０Ｍ、約０．１Ｍ〜約５Ｍ、約０．１Ｍ〜約２Ｍ、約０．２Ｍ〜約１Ｍ又は約０．２５Ｍ〜約０．７５Ｍの濃度に一致する。他の実施形態では、酸の量は、酸又は酸の混合物の約０．０１Ｍ、０．０５Ｍ、０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、５Ｍ、６Ｍ、７Ｍ、８Ｍ、９Ｍ又は１０Ｍよりも大きい又は等しい濃度に一致する。酸のｐＨは、たとえば、約０．１、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０又は６．５であることが可能である。
[0099]いくつかの実施形態では、試料は、自己抗体と抗ＴＮＦα薬のあらかじめ形成された複合体を解離するのに十分な長さの時間、酸に接触させる。ある種の例では、試料は、約０．１時間〜約２４時間、約０．２時間〜約１６時間、約０．５時間〜約１０時間、約０．５時間〜約５時間、又は約０．５時間〜約２時間に及ぶ期間、酸に接触させる（たとえば、インキュベートする）。他の例では、試料は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、又は１０時間よりも長い又は等しい期間、酸に接触させる（たとえば、インキュベートする）。試料は、４℃、室温（ＲＴ）、又は３７℃で酸に接触させることが可能である。
[0100]ある種の実施形態では、酸を中和するステップは、試料のｐＨを上げて、標識された抗ＴＮＦα薬と抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体間の複合体並びに非標識抗ＴＮＦα薬と自己抗体間の複合体を形成させることを含む。いくつかの実施形態では、酸は、たとえば、強塩基、弱塩基、緩衝液、及びその組合せなどの１つ又は複数の中和剤を添加することにより中和される。当業者であれば、中和反応は必ずしも結果として生じるｐＨ７を意味しないことを認識するであろう。いくつかの例では、酸の中和により塩基性の試料が得られる。他の例では、酸の中和により酸性の試料が得られる（しかし、中和剤を添加するのに先立つ試料のｐＨよりも高い）。特定の実施形態では、中和剤は、ｐＨ約７．３のリン酸緩衝食塩水（たとえば、１０×ＰＢＳ）などのバッファーを含む。
[0101]いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、内部標準を、標識された抗ＴＮＦα薬と一緒に（たとえば、あらかじめ形成された複合体の解離前に、解離中に、又は後で）試料に接触させることをさらに含む。ある種の例では、内部標準は、たとえば、ビオシチン−アレクサ４８８などの標識された内部標準を含む。ある種の他の例では、標識された内部標準の量は、１００μＬの解析される試料あたり、約１ｎｇ〜約２５ｎｇ、約５ｎｇ〜約２５ｎｇ、約５ｎｇ〜約２０ｎｇ、約１ｎｇ〜約２０ｎｇ、約１ｎｇ〜約１０ｎｇ、又は約１ｎｇ〜約５ｎｇに及ぶ。追加の例では、標識された内部標準の量は、１００μＬの解析される試料あたり、約１ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、１５ｎｇ、２０ｎｇ、又は２５ｎｇよりも多い又は等しい。
[0102]本発明の方法の１つの非限定的例として、血清試料（たとえば、レミケード（ＩＦＸ）などの抗ＴＮＦα薬を用いた療法を受けている対象由来の血清）などの試料は、室温で１時間０．５Ｍクエン酸、ｐＨ３．０と一緒にインキュベートすることが可能である。（非標識）抗ＴＮＦα薬と抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体（たとえば、抗ＩＦＸ抗体（ＡＴＩ）などの抗薬剤抗体）間のあらかじめ形成された複合体の解離に続いて、標識された抗ＴＮＦα薬（たとえば、ＩＦＸ−アレクサ４８８）及び内部標準を添加し、反応混合物を１０×ＰＢＳ、ｐＨ７．３などの中和剤で（たとえば、直ちに）中和することが可能である。中和後、反応混合物は（たとえば、プレート撹拌機上で）室温でもう１時間インキュベートして、平衡させ、標識された又は非標識抗ＴＮＦα薬のどちらかと抗薬剤抗体間の免疫複合体の再形成を完了させることが可能である。次に、前記試料は濾過し、本明細書に記載されるＳＥＣ−ＨＰＬＣにより解析することができる。
[0103]特定の実施形態では、本発明の方法（たとえば、酸解離に続いて均一溶液相結合反応速度を含む）は、前記ＡＴＩを最大約６０μｇ／ｍＬのＩＦＸの存在下で測定することができるように、ＩＦＸ薬剤耐性を著しく増加させる。実施例１４及び図２７〜２８を参照されたい。言い換えると、本発明の方法は、高レベルの抗ＴＮＦα薬（たとえば、ＩＦＸ）の存在下で、しかしそれからの実質的な干渉を受けずに、ＡＴＩなどの抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体、並びに他の抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の存在又はレベルを検出することができる。
[0104]別の態様では、本発明は、抗ＴＮＦα薬を用いたコースの療法を受けている対象において療法の最適化及び／又は抗ＴＮＦα薬に対する毒性の減少を行うための方法であって、
（ａ）前記対象由来の試料中の抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の存在又はレベルを、前記試料中の前記抗ＴＮＦα薬からの干渉を受けずに検出するステップであり、
（ｉ）前記試料を酸に接触させて前記自己抗体と前記抗ＴＮＦα薬のあらかじめ形成された複合体を解離するサブステップで、前記試料が抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体を有するか、有すると疑われるサブステップと、
（ｉｉ）前記あらかじめ形成された複合体の解離に続いて、前記試料を、標識された抗ＴＮＦα薬に接触させるサブステップと、
（ｉｉｉ）前記試料中の前記酸を中和して、前記標識された抗ＴＮＦα薬と前記自己抗体の標識された複合体（すなわち、免疫複合体又はコンジュゲート）を形成する（すなわち、前記標識された抗ＴＮＦα薬と自己抗体は互いに共有結合していない）サブステップと、
（ｉｖ）前記標識された複合体をサイズ排除クロマトグラフィーにかけて前記標識された複合体を（たとえば、遊離の標識された抗ＴＮＦα薬から）分離するサブステップと、
（ｖ）前記標識された複合体を検出する（たとえば、それによって前記試料中の抗ＴＮＦα薬からの干渉を受けずに前記自己抗体の存在又はレベルを検出する）サブステップと
を含むステップと、
（ｂ）前記自己抗体の存在又はレベルに基づいて、前記対象のための１コースの療法のそれ以降の用量、又は異なるコースの療法を前記対象に施すべきかどうかを決定するステップと
を含み、それによって療法の最適化及び／又は前記抗ＴＮＦα薬に対する毒性の減少を行う、方法を提供する。
[0105]ある種の実施形態では、前記コースの療法のそれ以降の用量は、前記自己抗体の存在又はレベルに基づいて、増加、減少又は維持される。非限定的例として、前記コースの療法のそれ以降の用量は、試料中に高レベルの自己抗体が検出される場合は減少される。他の実施形態では、異なるコースの療法は、異なる抗ＴＮＦα薬、免疫抑制剤と一緒の現在のコースの療法、又は抗ＴＮＦα薬ではないコースの療法への切り替え（たとえば、抗ＴＮＦα治療抗体の使用を中断すること）を含む。非限定的例として、異なるコースの療法は、試料中に高レベルの自己抗体が検出される場合に施される。
[0106]ある種の代わりの実施形態では、ステップ（ｉ）及び（ｉｉ）は同時に実施され、たとえば、試料は酸と標識された抗ＴＮＦα薬に同時に接触させる。ある種の他の代わりの実施形態では、ステップ（ｉｉ）はステップ（ｉ）に先立って実施され、たとえば、試料は先ず標識された抗ＴＮＦα薬に接触させ、次に酸に接触させる。追加の実施形態では、ステップ（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）は同時に実施され、たとえば、試料は標識された抗ＴＮＦα薬に接触させ（たとえば、試料を１つ又は複数の中和剤に接触させることにより）、同時に中和される。
[0107]抗ＴＮＦα薬は、種々の検出可能な基（複数可）のいずれでも標識することが可能である。好ましい実施形態では、抗ＴＮＦα薬はフルオロフォア又は蛍光色素で標識される。フルオロフォア又は蛍光色素の非限定的例には、分子プローブカタログ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ）に収載されているフルオロフォア又は蛍光色素が含まれ、前記文献は参照により本明細書に組み込まれる（Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ−Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、第１０版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（２００５）参照）。そのような例となるフルオロフォア又は蛍光色素には、アレクサフルオル（登録商標）３５０、アレクサフルオル（登録商標）４０５、アレクサフルオル（登録商標）４３０、アレクサフルオル（登録商標）４８８、アレクサフルオル（登録商標）５１４、アレクサフルオル（登録商標）５３２、アレクサフルオル（登録商標）５４６、アレクサフルオル（登録商標）５５５、アレクサフルオル（登録商標）５６８、アレクサフルオル（登録商標）５９４、アレクサフルオル（登録商標）６１０、アレクサフルオル（登録商標）６３３、アレクサフルオル（登録商標）６３５、アレクサフルオル（登録商標）６４７、アレクサフルオル（登録商標）６６０、アレクサフルオル（登録商標）６８０、アレクサフルオル（登録商標）７００、アレクサフルオル（登録商標）７５０、及び／又はアレクサフルオル（登録商標）７９０などのアレクサフルオル（登録商標）色素、並びに塩化ダンシル（ＤＮＳ−Ｃｌ）、５−（ヨードアセトアミド）フルオレセイン（５−ＩＡＦ）、フルオレセイン５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン５−（及び６−）イソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、６−アクリロイル−２−ジメチルアミノナフタレン（アクリロダン）、７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３，−ジアゾール−４−イルクロライド（ＮＢＤ−Ｃｌ）、臭化エチジウム、ルシファーイエロー、５−カルボキシローダミン６Ｇハイドロクロライド、リサミンローダミンＢスルホニルクロライド、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）（商標）スルホニルクロリド、ボディピー（ＢＯＤＩＰＹ）（商標）、ナフタルアミンスルホン酸（たとえば、１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸（ＡＮＳ）、６−（ｐ−トルイジニル）ナフタレン−２−スルホン酸（ＴＮＳ）など）、アントロイル脂肪酸、ＤＰＨ、パリナリン酸、ＴＭＡ−ＤＰＨ、フルオレニル脂肪酸、フルオレセイン−ホスファチジルエタノールアミン、テキサスレッド−ホスファチジルエタノールアミン、ピレニル−ホスファチジルコリン、フルオレニル−ホスファチジルコリン、メロシアニン５４０、１−（３−スルホナトプロピル）−４−［β−［２［（ジ−ｎ−ブチルアミノ）−６ナフチル］ビニル］ピリジニウムベタイン（ナフチルスチリル）、３，３’ジプロピルチアジカルボシアニン（ｄｉＳ−Ｃ３−（５））、４−（ｐ−ジペンチルアミノスチリル）−１−メチルピリジニウム（ジ−５−ＡＳＰ）、Ｃｙ−３ヨードアセトアミド、Ｃｙ−５−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｃｙ−７−イソチオシアネート、ローダミン８００、ＩＲ−１２５、チアゾールオレンジ、アズールＢ、ナイルブルー、Ａｌフタロシアニン、オキサジン（Ｏｘａｘｉｎｅ）１、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ヘキスト３３３４２、ＴＯＴＯ、アクリジンオレンジ、エチジウムホモダイマー、Ｎ（エトキシカルボニルメチル）−６−メトキシキノリニウム（ＭＱＡＥ）、Ｆｕｒａ−２、カルシウムグリーン、カルボキシＳＮＡＲＦ−６、ＢＡＰＴＡ、クマリン、フィトフルオル（ｐｈｙｔｏｆｌｕｏｒ）、コロネン、金属リガンド複合体、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＲＳ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＤＹ６７６、ＤＹ６８０、ＤＹ６８２、ＤＹ７８０及びその混合物を含むが、これらに限定されない他のフルオロフォアが含まれるが、これらに限定されない。追加の適切なフルオロフォアには、酵素−補助因子、ランタニド、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、又はその変異体及び誘導体が含まれる。本発明の一実施形態では、特異的結合対の第二のメンバーは検出可能な基がそこに結合している。
[0108]典型的には、蛍光基は、ポリメチン、フタロシアニン、シアニン、キサンテン、フルオレン、ローダミン、クマリン、フルオレセイン及びボディピー（商標）を含む色素の範疇から選択されるフルオロフォアである。
[0109]一実施形態では、蛍光基は、約６５０〜約９００ｎｍ間の範囲で放射する近赤外（ＮＩＲ）フルオロフォアである。近赤外蛍光技術の使用は、生体基質の自己蛍光からバックグランドを実質的に取り除く又は減少するために、生物アッセイにおいては有利である。近ＩＲ蛍光技術の別の利点は、散乱強度が波長の逆の四乗に比例するために、励起光源からの散乱光が大幅に減少することである。低バックグランド蛍光及び低散乱により、高感度検出に欠かせない高いシグナル対ノイズ比が得られる。さらに、生物組織における近ＩＲ領域（６５０ｎｍ〜９００ｎｍ）の光学的に透明な窓のおかげで、ＮＩＲ蛍光は、生体成分の中を光が透過する必要があるインビボ画像化及び細胞内検出適用のための貴重な技術となっている。この実施形態での態様内で、蛍光基は好ましくは、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＲＳ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００、アレクサフルオル（登録商標）６６０、アレクサフルオル（登録商標）６８０、アレクサフルオル（登録商標）７００、アレクサフルオル（登録商標）７５０、アレクサフルオル（登録商標）７９０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＤＹ６７６、ＤＹ６８０、ＤＹ６８２及びＤＹ７８０から成る群から選択される。ある種の実施形態では、近赤外基は、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００、又はＤｙｎｏｍｉｃ ＤＹ６７６である。
[0110]蛍光標識化は、フルオロフォアの化学反応性誘導体を使用して実現される。一般的な反応基には、ＦＩＴＣ及びＴＲＩＴＣなどのアミン反応性イソチオシアネート誘導体（フルオレセイン及びローダミンの誘導体）、ＮＨＳ−フルオレセインなどのアミン反応性スクシンイミジルエステル及びフルオレセイン−５−マレイミドなどのスルフヒドリル反応性マレイミド活性化蛍光色素（ｆｌｕｏｒ）が含まれ、その多くが市販されている。これらの反応性色素のいずれかと抗ＴＮＦα薬が反応すれば、フルオロフォアと抗ＴＮＦα薬の間で安定な共有結合が形成される。
[0111]ある種の例では、蛍光標識化反応に続いて、標識された標的分子から未反応フルオロフォアのいずれも取り除く必要があることが多い。これは、フルオロフォアと標識されたタンパク質間のサイズ差を利用してサイズ排除クロマトグラフィーにより実現されることが多い。
[0112]反応性蛍光色素は多くの供給源から入手可能である。標的分子内の様々な官能基への結合のために異なる反応基を有する色素を得ることができる。色素は標識化反応を実施するための成分をすべて含有する標識化キットでも入手可能である。好ましい一態様では、アレクサフルオル（登録商標）６４７ Ｃ２マレイミドはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製（カタログ番号Ａ−２０３４７）のものが使用される。
[0113]抗ＴＮＦα薬に対する抗薬剤抗体（ＡＤＡ）の特異的免疫学的結合は、直接的に又は間接的に検出することができる。直接的標識には、抗体に結合している、蛍光又は発光タグ、金属、色素、放射性核種などが含まれる。ある種の例では、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）で標識されている抗ＴＮＦα薬は、試料中のＡＤＡの濃度レベルを決定するのに使用することが可能である。他の例では、試料中のＡＤＡに特異的である化学発光抗ＴＮＦα薬を使用する化学発光アッセイは、ＡＤＡ濃度レベルの感度の良い非放射性検出に適している。特定の例では、蛍光色素で標識されている抗ＴＮＦα薬も、試料中のＡＤＡの濃度レベルを決定するのに適している。蛍光色素の例には、制限なしに、アレクサフルオル（登録商標）色素、ＤＡＰＩ、フルオレセイン、ヘキスト３３２５８、Ｒ−フィコシアニン、Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッド及びリサミンが含まれる。蛍光色素に連結されている二次抗体は市販のものを購入することができ、たとえば、ヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣはＴａｇｏ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）から入手可能である。
[0114]間接的標識には、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼなどの当技術分野で周知の様々な酵素が含まれる。たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ検出システムは、４５０ｎｍで検出可能である過酸化水素の存在下で可溶性生成物を生じる発色基質であるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を用いて使用することが可能である。アルカリホスファターゼ検出システムは、たとえば、４０５ｎｍで容易に検出可能である可溶性生成物を生じる発色基質であるｐ−ニトロフェニルリン酸を用いて使用することが可能である。同様に、β−ガラクトシダーゼ検出システムは、４１０ｎｍで検出可能である可溶性生成物を生じる発色基質であるｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を用いて使用することが可能である。ウレアーゼ検出システムは、尿素ブロモクレゾールパープル（Ｓｉｇｍａ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）などの基質を用いて使用することが可能である。酵素に連結された有用な二次抗体は、いくつかの商業的供給源から入手することができ、たとえば、ヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ−アルカリホスファターゼはＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）から購入することができる。
[0115]直接的又は間接的標識からのシグナルは、たとえば、発色基質からの色を検出する分光光度計、１２５Ｉの検出用のγ線計数器などの放射線を検出する放射線計数器、又はある種の波長の光の存在下で蛍光を検出する蛍光光度計を使用して解析することが可能である。酵素連結抗体の検出では、ＥＭＡＸマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）などの分光光度計を製造業者の説明書に従って使用してＡＤＡレベルの定量解析を行うことができる。必要であれば、本発明のアッセイは自動化又はロボット制御で実施することが可能であり、複数の試料からのシグナルを同時に検出することができる。
[0116]ある種の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーが使用される。ＳＥＣの基本原理は、サイズの粒子が異なれば、異なる速度で固定相を溶出する（濾過される）ことである。このために、粒子の溶液はサイズに基づいて分離される。すべての粒子が同時に又はほぼ同時に負荷されるならば、同じサイズの粒子は一緒に溶出する。それぞれのサイズ排除カラムには、分離することができる分子量の範囲がある。排除限界はこの範囲の上端での分子量を定義しており、分子が大きすぎて固定相では捕捉できない範囲である。透過限界は分離の範囲の下端での分子量を定義しており、十分に小さなサイズの分子は固定相の細孔を完全に通ることができ、この分子質量より下の分子はすべて小さく、単一バンドとして溶出する。
[0117]ある種の態様では、溶離液は一定容量又は画分で収集される。粒子のサイズが類似しているほど、同じ画分に入って、別々に検出されない可能性は高くなる。好ましくは、収集された画分は分光分析法により検査されて溶出した粒子の濃度が決定される。典型的には、本発明において有用な分光分析検出法には、蛍光光度法、屈折率（ＲＩ）及び紫外線（ＵＶ）が含まれるが、これらに限定されない。ある種の例では、溶出容積は、分子の流体力学的容積の対数とはほぼ直線的に減少する（すなわち、重たい部分のほうが先に離れる）。
[0118]本発明は、試料中の抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の存在又はレベルを検出するためのキットをさらに提供する。特定の実施形態では、キットは以下の構成要素、酸（又は酸の混合物）、標識された抗ＴＮＦα薬（たとえば、標識された抗ＴＮＦα抗体）、標識された内部標準、中和剤（又はその混合物）、検出するための手段（たとえば、蛍光検出器）、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）機器、及び／又は前記キットを使用するための説明書のうちの１つ又は複数から構成される。
[0119]他の態様では、本発明は、対象におけるＴＮＦα媒介疾患又は障害の治療のための１コースの療法を選択する（たとえば、適切な抗ＴＮＦα薬を選択する）ための方法であって、
（ａ）前記対象から得られた試料を分析して、前記試料中の１つ又は複数のマーカーの存在、レベル又は遺伝子型を決定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）において決定された１つ又は複数のマーカーの存在、レベル又は遺伝子型に統計アルゴリズムを適用して疾患活動性／重症度指標を生み出すステップと、
（ｃ）前記疾患活動性／重症度指標に基づいて対象のための適切なコースの療法（たとえば、抗ＴＮＦα療法）を選択するステップとを含む方法を提供する。
[0120]関連する態様では、本発明は、ＴＮＦα媒介疾患又は障害の治療のための１コースの療法を受ける対象において療法の最適化及び／又は毒性の減少を行うための方法であって、
（ａ）前記対象から得られた試料を分析して、前記試料中の１つ又は複数のマーカーの存在、レベル又は遺伝子型を決定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）において決定された１つ又は複数のマーカーの存在、レベル又は遺伝子型に統計アルゴリズムを適用して疾患活動性／重症度指標を生み出すステップと、
（ｃ）前記疾患活動性／重症度指標に基づいて、前記対象のための前記コースの療法のそれ以降の用量、又は異なるコースの療法を前記対象に施すべきかどうかを決定するステップと
を含む方法を提供する。
[0121]いくつかの実施形態では、前記コースの療法は抗ＴＮＦα抗体を含む。ある種の例では、抗ＴＮＦα抗体は、レミケード（商標）（インフリキシマブ）、エンブレル（商標）（エタネルセプト）、ヒュミラ（商標）（アダリムマブ）、シムジア（登録商標）（セルトリズマブペゴール）、シンポニー（登録商標）（ゴリムマブ、ＣＮＴＯ１４８）及びその組合せから成る群から選択されるメンバーである。他の実施形態では、前記コースの療法は、抗ＴＮＦα抗体を免疫抑制剤と共に含む。
[0122]ある種の実施形態では、１つ又は複数のマーカーのレベルは、総レベル、活性化レベル、又はその組合せを含む。特定の例では、前記１つ又は複数のマーカーは、炎症マーカー、増殖因子、血清学マーカー、サイトカイン及び／又はケモカイン、酸化ストレスのマーカー、細胞表面受容体、シグナル伝達経路マーカー、遺伝子マーカー、抗ＴＮＦα抗体、抗薬剤抗体（ＡＤＡ）並びにその組合せから成る群から選択されるメンバーである。
[0123]いくつかの例では、炎症マーカーは、ＣＲＰ、ＳＡＡ、ＶＣＡＭ、ＩＣＡＭ、カルプロテクチン、ラクトフェリン、ＩＬ−８、ランテス、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、Ｓ１００Ａ１２、Ｍ２−ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）、ＩＦＮ、ＩＬ−２、ＴＧＦ、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２及びその組合せから成る群から選択されるメンバーである。他の例では、増殖因子は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ、ＦＧＦ７）、及びその組合せから成る群から選択されるメンバーである。さらに他の例では、血清学マーカーは、抗好中球抗体、抗菌抗体、抗サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）抗体、及びその組合せから成る群から選択されるメンバーである。追加の例では、サイトカインは、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、及びその組合せから成る群から選択されるメンバーである。他の例では、細胞表面受容体はＣＤ６４である。さらに他の例では、シグナル伝達経路マーカーは、シグナル伝達分子である。他の例では、遺伝子マーカーは、炎症経路遺伝子における変異である。
[0124]ある種の実施形態では、ステップ（ａ）は、試料中の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０又はそれよりも多いマーカーの存在、レベル、及び／又は遺伝子型を決定することを含む。ある種の例では、試料は、血清、血漿、全血、便、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、多形核（ＰＭＮ）細胞、及び組織生検から成る群から選択される。
[0125]他の実施形態では、統計アルゴリズムは、学習統計分類子システム（ｌｅａｒｎｉｎｇ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ ｓｙｓｔｅｍ）を含む。いくつかの例では、学習統計分類子システムは、ランダムフォレスト（ｒａｎｄｏｍ ｆｏｒｅｓｔ）、分類及び回帰木（ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｔｒｅｅ）、ブーステッド木（ｂｏｏｓｔｅｄ ｔｒｅｅ）、ニューラルネットワーク（ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ）、サポートベクターマシーン（ｓｕｐｐｏｒｔ ｖｅｃｔｏｒ ｍａｃｈｉｎｅ）、ジェネラルカイ二乗自動相互作用検出器モデル（ｇｅｎｅｒａｌ ｃｈｉ−ｓｑｕａｒｅｄ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｍｏｄｅｌ）、インターラクティブ木（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｔｒｅｅ）、多変量適応回帰スプライン（ｍｕｌｔｉａｄａｐｔｉｖｅ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｓｐｌｉｎｅ）、機械学習分類子（ｍａｃｈｉｎｅ ｌｅａｒｎｉｎｇ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）、及びその組合せから成る群から選択される。ある種の例では、統計アルゴリズムは、単一の学習統計分類子システムを含む。ある種の他の例では、統計アルゴリズムは、少なくとも２つの学習統計分類子システムの組合せを含む。いくつかの例では、前記少なくとも２つの学習統計分類子システムが縦一列で適用される。本発明において使用するのに適した統計アルゴリズム及び解析の非限定的例は、２０１１年１０月１８日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０５６７７７号に記載されており、前記特許文献の開示は、参照によりあらゆる目的のためにその全体を本明細書に組み込む。
[0126]いくつかの実施形態では、前記方法は、ステップ（ｃ）の選択又は決定からの結果を臨床医に送ることをさらに含む。他の実施形態では、ステップ（ｃ）は、対象のための最初のコースの療法を選択することを含む。
[0127]他の実施形態では、ステップ（ｂ）は、コースの療法中の初期に決定される１つ又は複数のマーカーの存在、レベル、又は遺伝子型に統計アルゴリズムを適用して、初期の疾患活動性／重症度指標を生み出すことをさらに含む。いくつかの例では、初期の疾患活動性／重症度指標は、ステップ（ｂ）で生じた疾患活動性／重症度指標と比較されて、前記コースの療法のそれ以降の用量又は異なるコースの療法を施すべきかどうかを決定する。ある種の実施形態では、前記コースの療法のそれ以降の用量は、ステップ（ｂ）で生じた疾患活動性／重症度指標に基づいて増加させる、減少させる又は維持される。いくつかの例では、異なるコースの療法は、異なる抗ＴＮＦα抗体を含む。他の例では、異なるコースの療法は、現在のコースの療法を免疫抑制剤と一緒に含む。
[0128]抗ＴＮＦα抗体及び抗薬剤抗体（ＡＤＡ）を検出するための方法は、本明細書及びＰＣＴ出願国際公開第２０１１／０５６５９０号パンフレットに記載されており、前記特許文献の開示は、参照によりあらゆる目的のためにその全体を本明細書に組み込む。特定の実施形態では、抗薬剤抗体の存在又はレベルは、標識された抗ＴＮＦα薬に試料を接触させるのに先立って、その間に及び／又はその後で試料を酸に接触させることによる酸解離ステップを含む本発明の方法に従って決定される。
[0129]別の態様では、本発明は、対象におけるＴＮＦα媒介疾患又は障害の経過を予測するための方法であって、
（ａ）前記対象から得られた試料を分析して、前記試料中の１つ又は複数のマーカーの存在、レベル又は遺伝子型を決定するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）において決定された１つ又は複数のマーカーの存在、レベル又は遺伝子型に統計アルゴリズムを適用して疾患活動性／重症度指標を生み出すステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）において生じた疾患活動性／重症度指標に基づいてＴＮＦα媒介疾患又は障害の経過を予測するステップとを含む方法を提供する。
[0130]いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、初期に決定されるマーカーのうちの１つ又は複数の存在、レベル、又は遺伝子型に統計アルゴリズムを適用して、初期の疾患活動性／重症度指標を生み出すステップをさらに含む。ある種の例では、初期の疾患活動性／重症度指標は、ステップ（ｂ）で生じた疾患活動性／重症度指標と比較されて、ＴＮＦα媒介疾患又は障害の経過を予測する。
[0131]本明細書に記載された方法に従い、抗ＴＮＦα薬療法を受けている対象の診断若しくは予後が判定される又はＴＮＦαが、たとえば、ショック、敗血症、感染症、自己免疫疾患、ＲＡ、クローン病、移植片拒絶及び移植片対宿主病、しかしこれらに限定されない病態生理に結び付けられてきた疾患及び障害を有すると診断された対象において抗ＴＮＦα薬への応答の尤度が予測されると、本発明は、診断、予後又は予測に基づいて１コースの療法を推奨することをさらに含むことがある。ある種の例では、本発明は、ＴＮＦα媒介疾患又は障害に伴う１つ又は複数の症状を治療するのに有用な治療的有効量の抗ＴＮＦα薬を対象に投与することをさらに含むことがある。治療的適用では、抗ＴＮＦα薬は単独で投与される或いは１つ若しくは複数の追加の抗ＴＮＦα薬及び／又は抗ＴＮＦα薬（たとえば、免疫抑制剤）に関連する副作用を減らす１つ若しくは複数の薬剤と組み合わせて同時投与されることが可能である。したがって、本発明は、適切な薬剤が適切な患者に適切な時期に与えられるように、処置決定を導き、療法選択及び抗ＴＮＦα薬についての最適化を知らせることにより臨床医が「個別化医療」を実践することを有利に可能にする。
ＩＶ．疾患活動性／重症度指標
[0132]ある種の態様では、本発明は、療法を選択し、療法を最適化し、毒性を減少させる及び／又は抗ＴＮＦα薬療法に対する治療的処置の有効性をモニターする正確度を改善するための１つ又は複数（たとえば、２、３、４、５、６、７個又はそれよりも多い）のバイオマーカーのアルゴリズムベースの解析を提供する。
[0133]非限定的例として、一実施形態における疾患活動性／重症度指標は、以下の範疇のバイオマーカー、
（１）炎症マーカー
（２）増殖因子
（３）血清学（たとえば、免疫マーカー）
（４）サイトカイン及びケモカイン
（５）酸化ストレスのマーカー
（６）細胞表面受容体（たとえば、ＣＤ６４、その他）
（７）シグナル伝達経路
（８）他のマーカー（たとえば、炎症経路遺伝子などの遺伝子マーカー）
のうちの１つ又は複数における１つ又は複数の特定のバイオマーカーの存在、レベル（濃度（たとえば、全体）及び／又は活性化（たとえば、リン酸化））又は遺伝子型を検出、測定又は決定することを含む。
[0134]追加の実施形態では、患者試料（たとえば、抗ＴＮＦα薬剤療法中の患者由来の血清試料）において以下のマーカー、（９）抗ＴＮＦα薬レベル（たとえば、遊離の抗ＴＮＦα治療抗体のレベル）及び／又は（１０）抗薬剤抗体（ＡＤＡ）レベル（たとえば、抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体のレベル）のうちの１つ又は両方の存在及び／又はレベルを検出、測定又は決定することも可能である。
[0135]本明細書に記載される単一の統計アルゴリズム又は２つ若しくはそれよりも多い統計アルゴリズムの組合せは、次に、前記試料において検出、測定、又は決定されたマーカーの存在、濃度レベル、活性化レベル、又は遺伝子型に適用され、それによって療法の選択し、療法の最適化、毒性の減少又は抗ＴＮＦα療法を用いた治療的処置の有効性のモニターを行うことが可能である。したがって、本発明の方法は、患者免疫状態を判定することにより、患者管理を決定することに有用である。
[0136]疾患の臨床的経過を理解すれば、臨床医はその炎症性疾患患者（たとえば、ＩＢＤ（たとえば、クローン病）、関節リウマチ（ＲＡ）、その他）のためにもっと情報に通じた処置決定を下すことができ、将来新しい薬剤開発を導くのを補助し得る。本明細書に記載される疾患活動性／重症度指標において使用するための理想的なバイオマーカー（複数可）は、前記疾患の危険のある個人を同定することができるほうがよく、疾患特異的であるほうがよい。さらに、前記バイオマーカー（複数可）は、疾患活動性を検出して治療の効果をモニターすることができるほうがよく、前記疾患の再発（ｒｅｌａｐｓｅ ｏｒ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）に対する予測値を有するほうがよい。しかし、疾患経過を予測することは、現在では疾患再発だけではなく拡大されているが、おそらくさらに重要なのは、手術を含む疾患合併症の予測因子が含まれることである。本発明は、疾患活動性及び／又は重症度の指標を提供し、寛解期にある患者における再発の危険を予測することができるために、特に有利である。さらに、本発明のバイオマーカー及び疾患活動性／重症度指標は、患者管理並びに治療意思決定についての非常に多くの示唆を有しており、それから利益を得る可能性がもっとも高いと考えられる患者に適切な療法を指示するのを支援又は補助し、再発の危険が低い患者における長期の維持療法の経費及び潜在的毒性を回避すると考えられる。
Ａ．炎症マーカー
[0137]炎症性疾患の疾患経過は典型的には、白血球数を使用する非侵襲的検査により炎症活性の点から測定されるが、この方法は特異性が低く疾患活動度との限られた相関を示す。
[0138]したがって、ある種の実施形態では、生化学マーカー、血清学マーカー、タンパク質マーカー、遺伝子マーカー、及び他の臨床的又は超音波検査的特徴を含む、種々の炎症マーカーは、療法の選択、療法の最適化、毒性の減少及び／又は生物製剤（たとえば、抗ＴＮＦα薬）などの１つ又は複数の治療薬を用いた治療的処置の有効性のモニターを行うための本発明の方法において特に有用である。ある種の態様では、本明細書に記載される方法は、１つ又は複数の炎症マーカー（たとえば、単独で又は他の範疇のバイオマーカーと組み合わせて）について決定された存在、濃度レベル、及び／又は遺伝子型へのアルゴリズム（たとえば、統計解析）の適用を利用して、疾患経過の予測、適切な抗ＴＮＦα薬療法の選択、抗ＴＮＦα薬療法の最適化、抗ＴＮＦα薬療法に伴う毒性の減少、又は抗ＴＮＦα薬を用いた治療的処置の有効性のモニターを行うのを支援又は補助する。
[0139]本発明において使用するのに適した炎症マーカーの非限定的例には、生化学、血清学及び、たとえば、サイトカイン、ケモカイン、急性期タンパク質、細胞接着分子、Ｓ１００タンパク質などのタンパク質マーカー、並びに／又は他の炎症マーカーが含まれる。
１．サイトカイン及びケモカイン
[0140]試料中の少なくとも１つのサイトカイン又はケモカインの存在又はレベルの決定は、本発明において特に有用である。本明細書で使用されるように、用語「サイトカイン」は、一定範囲の免疫系機能を調節する免疫細胞により分泌される種々のポリペプチド又はタンパク質のいずれでも含み、ケモカインなどの小サイトカインを包含する。用語「サイトカイン」はアディポサイトカインも含み、これは、たとえば、体重、造血、血管新生、創傷治癒、インスリン抵抗性、免疫応答及び炎症応答の調節において機能する脂肪細胞により分泌されるサイトカインの群を含む。
[0141]ある種の態様では、ＴＮＦα、アポトーシスのＴＮＦ関連弱い誘導物質（ＴＷＥＡＫ）、オステオプロテジェリン（ＯＰＧ）、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−２３、及びＩＬ−２７を含むが、これらに限定されない少なくとも１つのサイトカインの存在又はレベルは試料中において決定される。ある種の他の態様では、たとえば、ＣＸＣＬ１／ＧＲＯ１／ＧＲＯα、ＣＸＣＬ２／ＧＲＯ２、ＣＸＣＬ３／ＧＲＯ３、ＣＸＣＬ４／ＰＦ−４、ＣＸＣＬ５／ＥＮＡ−７８、ＣＸＣＬ６／ＧＣＰ−２、ＣＸＣＬ７／ＮＡＰ−２、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０、ＣＸＣＬ１１／Ｉ−ＴＡＣ、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１、ＣＸＣＬ１３／ＢＣＡ−１、ＣＸＣＬ１４／ＢＲＡＫ、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１７／ＤＭＣ、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１α、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１β、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ６／Ｃ１０、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３、ＣＣＬ８／ＭＣＰ−２、ＣＣＬ９／ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１１／エオタキシン、ＣＣＬ１２／ＭＣＰ−５、ＣＣＬ１３／ＭＣＰ−４、ＣＣＬ１４／ＨＣＣ−１、ＣＣＬ１５／ＭＩＰ−５、ＣＣＬ１６／ＬＥＣ、ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ、ＣＣＬ１８／ＭＩＰ−４、ＣＣＬ１９／ＭＩＰ−３β、ＣＣＬ２０／ＭＩＰ−３α、ＣＣＬ２１／ＳＬＣ、ＣＣＬ２２／ＭＤＣ、ＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ１、ＣＣＬ２４／エオタキシン−２、ＣＣＬ２５／ＴＥＣＫ、ＣＣＬ２６／エオタキシン−３、ＣＣＬ２７／ＣＴＡＣＫ、ＣＣＬ２８／ＭＥＣ、ＣＬ１、ＣＬ２及びＣＸ３ＣＬ１などの少なくとも１つのケモカインの存在又はレベルは試料中において決定される。ある種の追加の態様では、レプチン、アディポネクチン、レジスチン、活性又は全プラスミノーゲン活性化因子阻害剤−１（ＰＡＩ−１）、ビスファチン、及びレチノール結合タンパク質４（ＲＢＰ４）を含むが、これらに限定されない少なくとも１つのアディポサイトカインの存在又はレベルは試料中において決定される。好ましくは、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＦＮ（たとえば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、ＩＬ−１０、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ及び／又は他のサイトカイン若しくはケモカインの存在又はレベルが決定される。
[0142]ある種の例では、特定のサイトカイン又はケモカインの存在又はレベルは、たとえば、ハイブリダイゼーションアッセイ又は増幅ベースのアッセイなどのアッセイを用いてｍＲＮＡ発現レベルで検出される。ある種の他の例では、特定のサイトカイン又はケモカインの存在又はレベルは、たとえば、免疫アッセイ（たとえば、ＥＬＩＳＡ）又は免疫組織化学的アッセイを使用してタンパク質発現レベルで検出される。血清、血漿、唾液又は尿試料中の対象のサイトカイン又はケモカインの存在又はレベルを決定するのに適したＥＬＩＳＡキットは、たとえば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、Ｎｅｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＫＹ）、Ａｌｐｃｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓａｌｅｍ、ＮＨ）、Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎｓ，Ｉｎｃ．（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＣＨＥＭＩＣＯＮ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）、Ａｎｔｉｇｅｎｉｘ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＹ）、ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）、及び／又はＢｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）から入手可能である。
[0143]ヒトＩＬ−６ポリペプチド配列は、たとえば、ジェンバンク受託番号ＮＰ＿０００５９１に記載されている。ヒトＩＬ−６ ｍＲＮＡ（コード）配列は、たとえば、ジェンバンク受託番号ＮＭ＿０００６００に記載されている。当業者であれば、ＩＬ−６は、インターフェロンベータ２（ＩＦＮＢ２）、ＨＧＦ、ＨＳＦ及びＢＳＦ２としても知られていることは認識するであろう。
[0144]ヒトＩＬ−１βポリペプチド配列は、たとえば、ジェンバンク受託番号ＮＰ＿０００５６７に記載されている。ヒトＩＬ−１β ｍＲＮＡ（コード）配列は、たとえば、ジェンバンク受託番号ＮＭ＿０００５７６に記載されている。当業者であれば、ＩＬ−１βは、ＩＬ１Ｆ２及びＩＬ−１ベータとしても知られていることは認識するであろう。
[0145]ヒトＩＬ−８ポリペプチド配列は、たとえば、ジェンバンク受託番号ＮＰ＿０００５７５（配列番号１）に記載されている。ヒトＩＬ−８ ｍＲＮＡ（コード）配列は、たとえば、ジェンバンク受託番号ＮＭ＿０００５８４（配列番号２）に記載されている。当業者であれば、ＩＬ−８は、ＣＸＣＬ８、Ｋ６０、ＮＡＦ、ＧＣＰ１、ＬＥＣＴ、ＬＵＣＴ、ＮＡＰ１、３−１０Ｃ、ＧＣＰ−１、ＬＹＮＡＰ、ＭＤＮＣＦ、ＭＯＮＡＰ、ＮＡＰ−１、ＳＣＹＢ８、ＴＳＧ−１、ＡＭＣＦ−Ｉ、及びｂ−ＥＮＡＰとしても知られていることは認識するであろう。
[0146]ヒトＴＷＥＡＫポリペプチド配列は、たとえば、ジェンバンク受託番号ＮＰ＿００３８００及びＡＡＣ５１９２３に記載されている。ヒトＴＷＥＡＫ ｍＲＮＡ（コード）配列は、たとえば、ジェンバンク受託番号ＮＭ＿００３８０９及びＢＣ１０４４２０に記載されている。当業者であれば、ＴＷＥＡＫは、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１２（ＴＮＦＳＦ１２）、ＡＰＯ３リガンド（ＡＰＯ３Ｌ）、ＣＤ２５５、ＤＲ３リガンド、増殖因子誘導性１４（Ｆｎ１４）リガンド及びＵＮＱ１８１／ＰＲＯ２０７としても知られていることは認識するであろう。
２．急性期タンパク質
[0147]試料中の１つ又は複数の急性期タンパク質の存在又はレベルの決定も本発明において有用である。急性期タンパク質は、その血漿濃度が炎症に応答して増加（ポジティブ急性期タンパク質）又は減少（ネガティブ急性期タンパク質）する１クラスのタンパク質である。この応答は急性期反応と呼ばれる（急性期応答とも呼ばれる）。ポジティブ急性期タンパク質の例には、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、Ｄダイマータンパク質、マンノース結合タンパク質、アルファ１アンチトリプシン、アルファ１抗キモトリプシン、アルファ２マクログロブリン、フィブリノーゲン、プロトロンビン、第ＶＩＩＩ因子、フォンビルブランド因子、プラスミノーゲン、補体因子、フェリチン、血清アミロイドＰ成分、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、オロソムコイド（アルファ１酸性糖タンパク質、ＡＧＰ）、セルロプラスミン、ハプトグロビン及びその組合せが含まれるが、これらに限定されない。ネガティブ急性期タンパク質の非限定的例には、アルブミン、トランスフェリン、トランスサイレチン、トランスコルチン、レチノール結合タンパク質及びその組合せが含まれる。好ましくは、ＣＲＰ及び／又はＳＡＡの存在又はレベルが決定される。
[0148]ある種の例では、特定の急性期タンパク質の存在又はレベルは、たとえば、ハイブリダイゼーションアッセイ又は増幅ベースのアッセイなどのアッセイを用いてｍＲＮＡ発現レベルで検出される。ある種の他の例では、特定の急性期タンパク質の存在又はレベルは、たとえば、免疫アッセイ（たとえば、ＥＬＩＳＡ）又は免疫組織化学的アッセイを使用してタンパク質発現レベルで検出される。たとえば、Ａｌｐｃｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓａｌｅｍ、ＮＨ）から入手可能なサンドイッチ比色分析ＥＬＩＳＡアッセイを使用すれば、血清、血漿、尿又は便試料中のＣＲＰのレベルを決定することができる。同様に、Ｂｉｏｍｅｄａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から入手可能なＥＬＩＳＡキットを使用すれば、試料中のＣＲＰレベルを検出することができる。試料中のＣＲＰレベルを決定するための他の方法は、たとえば、米国特許第６，８３８，２５０号及び米国特許第６，４０６，８６２号並びに米国特許出願公開第２００６／００２４６８２号及び米国特許出願公開第２００６／００１９４１０号に記載されている。ＣＲＰレベルを決定するための追加の方法には、たとえば、免疫比濁アッセイ、急速免疫拡散アッセイ及び視覚的凝集アッセイが含まれる。血清、血漿、唾液、尿又は便などの試料中のＳＡＡの存在又はレベルを決定するのに適したＥＬＩＳＡキットは、たとえば、Ａｎｔｉｇｅｎｉｘ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＹ）、Ａｂａｚｙｍｅ（Ｎｅｅｄｈａｍ、ＭＡ）、ＵＳＣＮ Ｌｉｆｅ（Ｍｉｓｓｏｕｒｉ Ｃｉｔｙ、ＴＸ）、及び／又はＵ．Ｓ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ、ＭＡ）から入手可能である。
[0149]Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）は、炎症に応答している血液中に見出されるタンパク質である（急性期タンパク質）。ＣＲＰは典型的には、肝臓により及び脂肪細胞（アディポサイト）により産生される。ＣＲＰはタンパク質のペントラキシンファミリーのメンバーである。ヒトＣＲＰポリペプチド配列は、たとえば、ジェンバンク受託番号ＮＰ＿０００５５８に記載されている。ヒトＣＲＰ ｍＲＮＡ（コード）配列は、たとえば、ジェンバンク受託番号ＮＭ＿０００５６７に記載されている。当業者であれば、ＣＲＰは、ＰＴＸ１、ＭＧＣ８８２４４及びＭＧＣ１４９８９５としても知られていることは認識するであろう。
[0150]血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）タンパク質は、血漿中の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）に関連するアポリポタンパク質のファミリーである。ＳＡＡの異なるアイソフォームは、異なるレベルで構成的に（構成的ＳＡＡ）又は炎症刺激に応答して（急性期ＳＡＡ）発現される。これらのタンパク質は肝臓により優勢に産生される。無脊椎動物及び脊椎動物全体でこれらのタンパク質が保存されていることは、ＳＡＡがすべての動物において極めて重要な役割を果たしていることを示唆している。急性期血清アミロイドＡタンパク質（Ａ−ＳＡＡ）は炎症の急性期中に分泌される。ヒトＳＡＡポリペプチド配列は、たとえば、ジェンバンク受託番号ＮＰ＿０００３２２に記載されている。ヒトＳＡＡ ｍＲＮＡ（コード）配列は、たとえば、ジェンバンク受託番号ＮＭ＿０００３３１に記載されている。当業者であれば、ＳＡＡは、ＰＩＧ４、ＴＰ５３Ｉ４、ＭＧＣ１１１２１６及びＳＡＡ１としても知られていることは認識するであろう。
３．細胞接着分子（ＩｇＳＦ ＣＡＭ）
[0151]試料中の１つ又は複数の免疫グロブリンスーパーファミリー細胞接着分子の存在又はレベルの決定も本発明では有用である。本明細書で使用されるように、用語「免疫グロブリンスーパーファミリー細胞接着分子」（ＩｇＳＦ ＣＡＭ）には、１つ又は複数の免疫グロブリン様フォールドドメインを有し、細胞間接着及び／又はシグナル伝達において機能する細胞表面に位置する種々のポリペプチド又はタンパク質のいずれでも含まれる。多くの場合、ＩｇＳＦ ＣＡＭは膜貫通タンパク質である。ＩｇＳＦ ＣＡＭの非限定的例には、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ、たとえば、ＮＣＡＭ−１２０、ＮＣＡＭ−１２５、ＮＣＡＭ−１４０、ＮＣＡＭ−１４５、ＮＣＡＭ−１８０、ＮＣＡＭ−１８５、など）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ、たとえば、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＩＣＡＭ−４、及びＩＣＡＭ−５）、血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）、血小板内皮細胞接着分子−１（ＰＥＣＡＭ−１）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）、Ｌ１ＣＡＭとの相同性を有する細胞接着分子（Ｌ１の密接な相同体）（ＣＨＬ１）、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン（ＳＩＧＬＥＣ、たとえば、ＳＩＧＬＥＣ−１、ＳＩＧＬＥＣ−２、ＳＩＧＬＥＣ−３、ＳＩＧＬＥＣ−４、など）、ネクチン（たとえば、ネクチン−１、ネクチン−２、ネクチン−３、など）、及びネクチン様分子（たとえば、Ｎｅｃｌ−１、Ｎｅｃｌ−２、Ｎｅｃｌ−３、Ｎｅｃｌ−４、及びＮｅｃｌ−５）が含まれる。好ましくは、ＩＣＡＭ−１及び／又はＶＣＡＭ−１の存在及びレベルが決定される。
[0152]ＩＣＡＭ−１は、白血球及び内皮細胞の膜に低濃度で連続的に存在する膜貫通細胞接着タンパク質である。サイトカインが刺激されると、前記濃度は大幅に増加する。ＩＣＡＭ−１は、ＩＬ−１及びＴＮＦαにより誘導することができ、血管内皮、マクロファージ及びリンパ球により発現される。ＩＢＤでは、炎症性サイトカインが、ＩＣＡＭ−１及びＶＣＡＭ−１などの接着分子の発現を上方調節することにより炎症を引き起こす。接着分子の発現が増加すると、感染組織により多くのリンパ球が動員され、組織炎症が生じる（Ｇｏｋｅら、Ｊ．、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、３２：４８０頁（１９９７）及びＲｉｊｃｋｅｎら、Ｇｕｔ、５１：５２９頁（２００２）参照）。ＩＣＡＭ−１は細胞間接着分子１遺伝子（ＩＣＡＭ１；Ｅｎｔｒｅｚ ＧｅｎｅＩＤ：３３８３；ジェンバンク受託番号ＮＭ＿０００２０１）によりコードされ、細胞間接着分子１前駆体ポリペプチド（ジェンバンク受託番号ＮＰ＿０００１９２）のプロセシング後に産生される。
[0153]ＶＣＡＭ−１は、リンパ球、単球、好酸球及び好塩基球の血管内皮への接着を媒介する膜貫通型細胞接着タンパク質である。サイトカインによる内皮細胞におけるＶＣＡＭ−１の上方調節は遺伝子転写が増加した結果として起こる（たとえば、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）及びインターロイキン−１（ＩＬ−１）に応答して）。ＶＣＡＭ−１は血管細胞接着分子１遺伝子（ＶＣＡＭ１；Ｅｎｔｒｅｚ ＧｅｎｅＩＤ：７４１２）によりコードされ、転写物（ジェンバンク受託番号ＮＭ＿００１０７８（バリアント１）又はＮＭ＿０８０６８２（バリアント２））の差次的スプライシング及び前駆体ポリペプチドスプライスアイソフォーム（ジェンバンク受託番号ＮＰ＿００１０６９（アイソフォームａ）又はＮＰ＿５４２４１３（アイソフォームｂ））のプロセシング後に産生される。
[0154]ある種の例では、ＩｇＳＦ ＣＡＭの存在又はレベルは、たとえば、ハイブリダイゼーションアッセイ又は増幅ベースのアッセイなどのアッセイを用いてｍＲＮＡ発現レベルで検出される。ある種の他の例では、ＩｇＳＦ ＣＡＭの存在又はレベルは、たとえば、免疫アッセイ（たとえば、ＥＬＩＳＡ）又は免疫組織化学的アッセイを使用してタンパク質発現レベルで検出される。組織試料、生検、血清、血漿、唾液、尿又は便などの試料中のＩＣＡＭ−１及び／又はＶＣＡＭ−１の存在又はレベルを決定するのに適した抗体及び／又はＥＬＩＳＡキットは、たとえば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、及び／又はＡｂｃａｍ Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から入手可能である。
４．Ｓ１００タンパク質
[0155]試料中の少なくとも１つのＳ１００タンパク質の存在又はレベルの決定も本発明において有用である。本明細書で使用されるように、用語「Ｓ１００タンパク質」には、細胞型特異的発現及び２つのＥＦ−ハンドカルシウム結合ドメインの存在により特徴付けられる低分子量酸性タンパク質のファミリーの任意のメンバーが含まれる。ヒトには少なくとも２１の異なる種類のＳ１００タンパク質が存在する。前記名称は、Ｓ１００タンパク質が中性ｐＨの硫酸アンモニウム中で１００％可溶性であることに由来している。大半のＳ１００タンパク質は、非共有結合により結合している２つの同一のポリペプチドから成るホモ二量体である。Ｓ１００タンパク質はカルモジュリンに構造的には類似しているが、細胞特異的であり、環境要因に応じて異なるレベルで特定の細胞において発現されるという点で異なる。Ｓ１００タンパク質は、通常は、神経堤（たとえば、シュワン細胞、メラニン形成細胞、グリア細胞）に由来する細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、筋上皮細胞、マクロファージ、ランゲルハンス細胞、樹状細胞、及びケラチノサイトに存在する。Ｓ１００タンパク質は、タンパク質リン酸化の調節、転写因子、Ｃａ２＋恒常性維持、細胞骨格構成物の動力学、酵素活性、細胞増殖及び分化並びに炎症応答などの種々の細胞内及び細胞外機能に関与しているとされてきた。
[0156]カルグラニュリンは、腎臓上皮細胞及び好中球を含む複数の細胞型において発現されるＳ１００タンパク質であり、慢性炎症の状況下で浸潤性単球及び顆粒球に豊富に含まれている。カルグラニュリンの例には、制限なく、カルグラニュリンＡ（Ｓ１００Ａ８又はＭＲＰ−８としても知られている）、カルグラニュリンＢ（Ｓ１００Ａ９又はＭＲＰ−１４としても知られている）及びカルグラニュリンＣ（Ｓ１００Ａ１２としても知られている）が含まれる。
[0157]ある種の例では、特定のＳ１００タンパク質の存在又はレベルは、たとえば、ハイブリダイゼーションアッセイ又は増幅ベースのアッセイなどのアッセイを用いてｍＲＮＡ発現レベルで検出される。ある種の他の例では、特定のＳ１００タンパク質の存在又はレベルは、たとえば、免疫アッセイ（たとえば、ＥＬＩＳＡ）又は免疫組織化学的アッセイを使用してタンパク質発現レベルで検出される。血清、血漿又は尿試料中のカルグラニュリンＡ（Ｓ１００Ａ８）、カルグラニュリンＢ（Ｓ１００Ａ９）又はカルグラニュリンＣ（Ｓ１００Ａ１２）などのＳ１００タンパク質の存在又はレベルを決定するのに適したＥＬＩＳＡキットは、たとえば、Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ）、及びＨｙｃｕｌｔ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｂ．ｖ．（Ｕｄｅｎ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手可能である。
[0158]Ｓ１００Ａ８とＳ１００Ａ９の複合体であるカルプロテクチンは、好中球、単球及びケラチノサイトのサイトゾル中のカルシウム結合及び亜鉛結合タンパク質である。カルプロテクチンは、好中性顆粒球及びマクロファージにおける主要タンパク質であり、これらの細胞のサイトゾル画分中の全タンパク質の６０％も占めている。したがって、カルプロテクチンは、好中球代謝回転の代用マーカーである。便中のその濃度は、腸管粘膜の好中球浸潤の強度及び炎症の重症度と相関している。いくつかの例では、カルプロテクチンは、わずかな（５０〜１００ｍｇ）糞便試料を使用するＥＬＩＳＡを用いて測定することが可能である（たとえば、Ｊｏｈｎｅら、Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、３６：２９１〜２９６頁（２００１）参照）。
５．他の炎症マーカー
[0159]試料中のラクトフェリンの存在又はレベルの決定も本発明において有用である。ある種の例では、ラクトフェリンの存在又はレベルは、たとえば、ハイブリダイゼーションアッセイ又は増幅ベースのアッセイなどのアッセイを用いてｍＲＮＡ発現レベルで検出される。ある種の他の例では、ラクトフェリンの存在又はレベルは、たとえば、免疫アッセイ（たとえば、ＥＬＩＳＡ）又は免疫組織化学的アッセイを使用してタンパク質発現レベルで検出される。Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手可能なラクトフェリンＥＬＩＳＡキットを使用すれば、血漿、尿、気管支肺胞洗浄液、又は脳脊髄液試料中のヒトラクトフェリンを検出することができる。同様に、Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｓｗａｍｐｓｃｏｔｔ、ＭＡ）から入手可能なＥＬＩＳＡキットを使用すれば、血漿試料中のラクトフェリンのレベルを決定することができる。米国特許出願公開第２００４／０１３７５３６号には、便試料中の上昇したラクトフェリンレベルの存在を決定するためのＥＬＩＳＡアッセイが記載されている。同様に、米国特許出願公開第２００４／００３３５３７号には、便、粘液又は胆汁試料中の内在性ラクトフェリンの濃度を決定するためのＥＬＩＳＡアッセイが記載されている。いくつかの実施形態では、抗ラクトフェリン抗体の存在又はレベルは、たとえば、ラクトフェリンタンパク質又はその断片を使用して、試料中で検出することができる。
[0160]試料中のＭ１−ＰＫ及びＭ２−ＰＫなどの１つ又は複数のピルビン酸キナーゼアイソザイムの存在又はレベルの決定も本発明において有用である。ある種の例では、Ｍ１−ＰＫ及び／又はＭ２−ＰＫの存在又はレベルは、たとえば、ハイブリダイゼーションアッセイ又は増幅ベースのアッセイなどのアッセイを用いてｍＲＮＡ発現レベルで検出される。ある種の他の例では、Ｍ１−ＰＫ及び／又はＭ２−ＰＫの存在又はレベルは、たとえば、免疫アッセイ（たとえば、ＥＬＩＳＡ）又は免疫組織化学的アッセイを使用してタンパク質発現レベルで検出される。ピルビン酸キナーゼアイソザイムＭ１／Ｍ２は、ピルビン酸キナーゼ筋肉アイソザイム（ＰＫＭ）、ピルビン酸キナーゼＫ型、サイトゾル甲状腺ホルモン結合タンパク質（ＣＴＨＢＰ）、甲状腺ホルモン結合タンパク質１（ＴＨＢＰ１）、又はオーパ相互作用タンパク質３（ＯＩＰ３）としても知られている。
[0161]追加の実施形態では、試料中の１つ又は複数の増殖因子の存在又はレベルの決定も本発明において有用である。増殖因子の非限定的例には、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、などのトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）が含まれ、これらの増殖因子は下に詳細に記載されている。
６．炎症マーカーの例となるセット
[0162]特定の実施形態では、以下の炎症マーカー、
ａ．ＣＲＰ
ｂ．ＳＡＡ
ｃ．ＶＣＡＭ
ｄ．ＩＣＡＭ
ｅ．カルプロテクチン
ｆ．ラクトフェリン
ｇ．ＩＬ８
ｈ．ランテス
ｉ．ＴＮＦアルファ
ｊ．ＩＬ−６
ｋ．ＩＬ−１ベータ
ｌ．Ｓ１００Ａ１２
ｍ．Ｍ２−ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）
ｎ．ＩＦＮ
ｏ．ＩＬ２
ｐ．ＴＧＦ
ｑ．ＩＬ−１３
ｒ．ＩＬ−１５
ｓ．ＩＬ１２
ｔ．他のケモカイン及びサイトカイン
のうちの少なくとも１つ又は複数（たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は、たとえば、パネルなどのそれよりも多い）を検出して（たとえば、単独で又は他の範疇由来のバイオマーカーと組み合わせて）、疾患経過の予測の支援若しくは補助、並びに／又は療法の選択、療法の最適化、毒性の減少及び／若しくは抗ＴＮＦα薬療法に対する治療的処置の有効性をモニターする正確度の改善を行うことが可能である。
Ｂ．増殖因子
[0163]生化学マーカー、血清学マーカー、タンパク質マーカー、遺伝子マーカー、及び他の臨床的又は超音波検査特徴を含む種々の増殖因子は、療法の選択、療法の最適化、毒性の減少及び／又は生物製剤（たとえば、抗ＴＮＦα薬）などの１つ又は複数の治療薬を用いた治療的処置の有効性のモニターを行うための本発明の方法において使用するのに適している。ある種の態様では、本明細書に記載される方法は、１つ又は複数の増殖因子（たとえば、単独で又は他の範疇由来のバイオマーカーと組み合わせて）について決定された存在、濃度レベル、及び／又は遺伝子型へのアルゴリズム（たとえば、統計解析）の適用を利用して、疾患経過の予測、適切な抗ＴＮＦα薬療法の選択、抗ＴＮＦα薬療法の最適化、抗ＴＮＦα薬療法に伴う毒性の減少、又は抗ＴＮＦα薬を用いた治療的処置の有効性のモニターを行うのを支援又は補助する。
[0164]したがって、ある種の実施形態では、試料中の１つ又は複数の増殖因子の存在又はレベルの決定は本発明において有用である。本明細書で使用されるように、用語「増殖因子」には、細胞増殖及び／又は細胞分化を刺激することができる種々のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質のいずれでも含まれる。
[0165]ある種の態様では、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヘパリン結合上皮増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ、ＳＥＲＰＩＮＦ１としても知られている）、アンフィレギュリン（ＡＲＥＧ、シュワン腫由来増殖因子（ＳＤＧＦ）としても知られている）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、等）、エンドセリン−１（ＥＴ−１）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ、ＦＧＦ７としても知られている）、骨形成タンパク質（たとえば、ＢＭＰ１〜ＢＭＰ１５）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、β−神経増殖因子（β−ＮＧＦ）、神経栄養因子（たとえば、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ３）、ニューロトロフィン４（ＮＴ４）、等）、増殖分化因子−９（ＧＤＦ−９）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、及びトロンボポエチン（ＴＰＯ）を含むが、これらに限定されない少なくとも１つの増殖因子の存在又はレベルが試料において決定される。特定の実施形態では、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＥＴ−１、ＴＧＦ−β２及び／又はＴＧＦ−β３のうちの少なくとも１つの存在又はレベルが決定される。これらのマーカーは、対照においてよりも活性ＩＢＤにおいて有意に高いことが見出されており、これらのマーカーがＩＢＤにおける腸の管腔側の粘膜損傷後の治癒を促進するのに関与している可能性があることを示している。
[0166]ある種の例では、特定の増殖因子の存在又はレベルは、たとえば、ハイブリダイゼーションアッセイ又は増幅ベースのアッセイなどのアッセイを用いてｍＲＮＡ発現レベルで検出される。ある種の他の例では、特定の増殖因子の存在又はレベルは、たとえば、免疫アッセイ（たとえば、ＥＬＩＳＡ）又は免疫組織化学的アッセイを使用してタンパク質発現レベルで検出される。血清、血漿、唾液、又は尿試料中の増殖因子の存在又はレベルを決定するのに適したＥＬＩＳＡキットは、たとえば、Ａｎｔｉｇｅｎｉｘ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＹ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）、ＣＨＥＭＩＣＯＮ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）、Ｎｅｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＫＹ）、Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ）、Ａｌｐｃｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓａｌｅｍ、ＮＨ）、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）及び／又はＡｂａｚｙｍｅ（Ｎｅｅｄｈａｍ、ＭＡ）から入手可能である。
[0167]ヒト上皮増殖因子（ＥＧＦ）ポリペプチド配列は、たとえば、ジェンバンク受託番号ＮＰ＿００１９５４（配列番号１９）に記載されている。ヒトＥＧＦ ｍＲＮＡ（コード）配列は、たとえば、ジェンバンク受託番号ＮＭ＿００１９６３（配列番号２０）に記載されている。当業者であれば、ＥＧＦは、ベータウロガストロン、ＵＲＧ及びＨＯＭＧ４としても知られていることは認識するであろう。
[0168]ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ポリペプチド配列は、たとえば、ジェンバンク受託番号ＮＰ＿００１０２０５３７（配列番号２１）、ＮＰ＿００１０２０５３８、ＮＰ＿００１０２０５３９、ＮＰ＿００１０２０５４０、ＮＰ＿００１０２０５４１、ＮＰ＿００１０２８９２８及びＮＰ＿００３３６７に記載されている。ヒトＶＥＧＦ ｍＲＮＡ（コード）配列は、たとえば、ジェンバンク受託番号ＮＭ＿００１０２５３６６（配列番号２２）、ＮＭ＿００１０２５３６７、ＮＭ＿００１０２５３６８、ＮＭ＿００１０２５３６９、ＮＭ＿００１０２５３７０、ＮＭ＿００１０３３７５６及びＮＭ＿００３３７６に記載されている。当業者であれば、ＶＥＧＦは、ＶＰＦ、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦ−Ａ及びＭＧＣ７０６０９としても知られていることは認識するであろう。
[0169]特定の実施形態では、以下の増殖因子、ＧＭ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ、ＦＧＦ７）及び他の増殖因子のうちの少なくとも１つ又は複数（たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は、たとえば、パネルなどのそれよりも多い）を検出して（たとえば、単独で又は他の範疇由来のバイオマーカーと組み合わせて）、疾患経過の予測の支援若しくは補助、並びに／又は療法の選択、療法の最適化、毒性の減少及び／若しくは抗ＴＮＦα薬療法に対する治療的処置の有効性をモニターする正確度の改善を行うことが可能である。
Ｃ．血清学（免疫マーカー）
[0170]試料（たとえば、血清試料）中の自己抗体などの血清学又は免疫マーカーの決定も本発明において有用である。ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、他などの抗炎症分子に対する抗体は、炎症を制御する身体の能力を抑制することがあり、患者におけるこれらの抗体の存在又はレベルは、抗ＴＮＦα薬などの強力な免疫抑制薬物の使用を示している。粘膜治癒すれば、たとえば、ＯｍｐＣ、フラジェリン（ｃＢｉｒ−１、Ｆｌａ−Ａ、Ｆｌａ−Ｘ、等）、Ｉ２、及び他（ｐＡＮＣＡ、ＡＳＣＡ、等）などの細菌抗原に対する抗体の抗体力価が減少することがある。
[0171]したがって、ある種の態様では、本明細書に記載される方法は、１つ又は複数の免疫マーカー（たとえば、単独で又は他の範疇由来のバイオマーカーと組み合わせて）について決定された存在、濃度レベル、及び／又は遺伝子型へのアルゴリズム（たとえば、統計解析）の適用を利用して、疾患経過の予測、適切な抗ＴＮＦα薬療法の選択、抗ＴＮＦα薬療法の最適化、抗ＴＮＦα薬療法に伴う毒性の減少、又は抗ＴＮＦα薬を用いた治療的処置の有効性のモニターを行うのを支援又は補助する。
[0172]本発明において使用するのに適した血清学免疫マーカーの非限定的例には、抗好中球抗体、抗サッカロマイセス・セレビシエ抗体、及び／又は他の抗菌抗体が含まれる。
１．抗好中球抗体
[0173]試料中のＡＮＣＡレベル及び／又はｐＡＮＣＡの存在又は非存在の決定は本発明の方法において有用である。本明細書で使用されるように、用語「抗好中球細胞質抗体」又は「ＡＮＣＡ」には、好中球の細胞質及び／又は核成分に対する抗体が含まれる。ＡＮＣＡ活性は、好中球におけるＡＮＣＡ染色パターンに基づいていくつかの広い範疇、（１）核周囲強調表示のない細胞質好中球染色（ｃＡＮＣＡ）、（２）核の外縁周囲の核周囲染色（ｐＡＮＣＡ）、（３）核の内縁周囲の核周囲染色（ＮＳＮＡ）、及び（４）全好中球にわたり小斑点のある拡散染色（ＳＡＰＰＡ）に分けることが可能である。ある種の例では、ｐＡＮＣＡ染色はデオキシリボヌクレアーゼ処理に感受性である。用語ＡＮＣＡは、ｃＡＮＣＡ、ｐＡＮＣＡ、ＮＳＮＡ及びＳＡＰＰＡを含むが、これらに限定されないあらゆる種類の抗好中球反応性を包含する。同様に、用語ＡＮＣＡは、制限なく、免疫グロブリンＡ及びＧを含むあらゆる免疫グロブリンアイソタイプを包含する。
[0174]個人由来の試料中のＡＮＣＡレベルは、たとえば、アルコール固定化好中球を用いた酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの免疫アッセイを使用して決定することが可能である。ｐＡＮＣＡなどの特定の範疇のＡＮＣＡの存在又は非存在は、たとえば、間接蛍光抗体（ＩＦＡ）アッセイなどの免疫組織化学的アッセイを使用して決定することが可能である。好ましくは、試料中のｐＡＮＣＡの存在又は非存在は、デオキシリボヌクレアーゼ処理固定化好中球を用いる免疫蛍光アッセイを使用して決定される。固定化好中球に加えて、ＡＮＣＡレベルを決定するのに適しているＡＮＣＡに特異的な抗原には、制限なく、未精製又は部分的に精製された好中球抽出物；精製されたタンパク質、タンパク質断片又はヒストンＨ１若しくはそのＡＮＣＡ反応性断片などの合成ペプチド（たとえば、米国特許第６，０７４，８３５号参照）；ヒストンＨ１様抗原、ポリン抗原、バクテロイデス抗原、又はそのＡＮＣＡ反応性断片（たとえば、米国特許第６，０３３，８６４号参照）；分泌小胞抗原又はそのＡＮＣＡ反応性断片（たとえば、米国特許出願第０８／８０４，１０６号参照）；及び抗ＡＮＣＡイディオタイプ抗体が含まれる。当業者であれば、ＡＮＣＡに特異的な追加の抗原の使用は本発明の範囲内であることは認識するであろう。
２．抗サッカロマイセス・セレビシエ抗体
[0175]試料中のＡＳＣＡ（たとえば、ＡＳＣＡ−ＩｇＡ及び／又はＡＳＣＡ−ＩｇＧ）レベルの決定は本発明において有用である。本明細書で使用されるように、用語「抗サッカロマイセス・セレビシエ免疫グロブリンＡ」又は「ＡＳＣＡ−ＩｇＡ」には、サッカロマイセス・セレビシエと特異的に反応する免疫グロブリンＡアイソタイプの抗体が含まれる。同様に、用語「抗サッカロマイセス・セレビシエ免疫グロブリンＧ」又は「ＡＳＣＡ−ＩｇＧ」には、サッカロマイセス・セレビシエと特異的に反応する免疫グロブリンＧアイソタイプの抗体が含まれる。
[0176]試料がＡＳＣＡ−ＩｇＡ又はＡＳＣＡ−ＩｇＧに陽性かどうかの決定は、ＡＳＣＡに特異的である抗原を使用して行われる。そのような抗原は、ＡＳＣＡ−ＩｇＡ及び／又はＡＳＣＡ−ＩｇＧが特異的に結合しているいかなる抗原でも又は抗原の混合物でも可能である。ＡＳＣＡ抗体は最初はサッカロマイセス・セレビシエに結合するその能力により特徴付けられていたが、当業者であれば、ＡＳＣＡが特異的に結合している抗原は、サッカロマイセス・セレビシエから又は前記抗原がＡＳＣＡ抗体に特異的に結合することができさえすれば、種々の他の供給源から得ることが可能であることは理解するであろう。したがって、ＡＳＣＡに特異的であり、試料中のＡＳＣＡ−ＩｇＡ及び／又はＡＳＣＡ−ＩｇＧレベルを決定するのに使用することができる抗原の例となる供給源には、制限なく、サッカロマイセス又はカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）細胞などの全殺滅酵母細胞；ホスホペプチドマンナン（ＰＰＭ）などの酵母細胞壁マンナン；オリゴマンノシドなどのオリゴ糖；ネオ糖脂質；抗ＡＳＣＡイディオタイプ抗体；及び同類のものが含まれる。サッカロマイセス・セレビシエＳｕ１、Ｓｕ２、ＣＢＳ１３１５若しくはＢＭ１５６株などの酵母、又はカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）ＶＷ３２株の異なる種及び株は、ＡＳＣＡ−ＩｇＡ及び／又はＡＳＣＡ−ＩｇＧに特異的な抗原として使用するのに適している。ＡＳＣＡに特異的な精製された及び合成抗原も、試料中のＡＳＣＡ−ＩｇＡ及び／又はＡＳＣＡ−ＩｇＧのレベルを決定する際に使用するのに適している。精製された抗原の例には、制限なく、オリゴマンノシドなどの精製されたオリゴ糖抗原が含まれる。合成抗原の例には、制限なく、米国特許出願公開第２００３／０１０５０６０号に記載されているオリゴマンノシド、たとえば、Ｄ−Ｍａｎ β（１−２）Ｄ−Ｍａｎ β（１−２）Ｄ−Ｍａｎ β（１−２）Ｄ−Ｍａｎ−ＯＲ、Ｄ−Ｍａｎ α（１−２）Ｄ−Ｍａｎ α（１−２）Ｄ−Ｍａｎ α（１−２）Ｄ−Ｍａｎ−ＯＲ、及びＤ−Ｍａｎ α（１−３）Ｄ−Ｍａｎ α（１−２）Ｄ−Ｍａｎ α（１−２）Ｄ−Ｍａｎ−ＯＲ（Ｒは水素原子、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、又は随意に標識される連結基）などの合成オリゴマンノシドが含まれる。
[0177]酵母細胞壁マンナンの調製物、たとえば、ＰＰＭは、試料中のＡＳＣＡ−ＩｇＡ及び／又はＡＳＣＡ−ＩｇＧのレベルを決定するのに使用することができる。そのような水溶性表面抗原は、たとえば、高圧蒸気殺菌法を含む当技術分野で公知の任意の適切な抽出法により調製することが可能であり、又は市販のものを購入することができる（たとえば、Ｌｉｎｄｂｅｒｇら、Ｇｕｔ、３３：９０９〜９１３頁（１９９２）参照）。ＰＰＭの酸安定画分も本発明の統計アルゴリズムにおいて有用である（Ｓｅｎｄｉｄら、Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３：２１９〜２２６頁（１９９６））。試料中のＡＳＣＡレベルを決定するのに有用である例となるＰＰＭはＳ．ウバルム（ｕｖａｒｕｍ）株ＡＴＣＣ＃３８９２６由来である。
[0178]オリゴマンノシドなどの精製されたオリゴ糖抗原も、試料中のＡＳＣＡ−ＩｇＡ及び／又はＡＳＣＡ−ＩｇＧのレベルを決定するのに有用であることが可能である。精製されたオリゴマンノシド抗原は、好ましくは、たとえば、Ｆａｉｌｌｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１１：４３８〜４４６頁（１９９２）に記載されているネオ糖脂質に変換される。当業者であれば、ＡＳＣＡとのそのようなオリゴマンノシド抗原の反応性は、マンノシル鎖長（Ｆｒｏｓｈら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：１１９４〜１１９８頁（１９８５））、アノマー配置（Ｆｕｋａｚａｗａら、「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｆｕｎｇａｌ Ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｅ．Ｋｕｒｓｔａｋ（編）、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、３７〜６２頁（１９８９）；Ｎｉｓｈｉｋａｗａら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３４：８２５〜８４０頁（１９９０）；Ｐｏｕｌａｉｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２３：４６〜５２頁（１９９３）；Ｓｈｉｂａｔａら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２４３：３３８〜３４８頁（１９８５）；Ｔｒｉｎｅｌら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６０：３８４５〜３８５１頁（１９９２））、又は連鎖の位置（Ｋｉｋｕｃｈｉら、Ｐｌａｎｔａ、１９０：５２５〜５３５頁（１９９３））を変えることにより最適化することが可能であることを理解している。
[0179]本発明の方法において使用するのに適したオリゴマンノシドには、制限なく、マンノテトロース（ｍａｎｎｏｔｅｔｒａｏｓｅ）Ｍａｎ（１−３）Ｍａｎ（１−２）Ｍａｎ（１−２）Ｍａｎを有するオリゴマンノシドが含まれる。そのようなオリゴマンノシドは、たとえば、Ｆａｉｌｌｅら、上記参照に記載されているＰＰＭから精製することが可能である。ＡＳＣＡに特異的な例となるネオ糖脂質は、そのそれぞれのＰＰＭからオリゴマンノシドを放出し、続いて放出されたオリゴマンノシドを４−ヘキサデシルアニリン又は同種のものに結合させることにより構築することが可能である。
３．抗菌抗体
[0180]試料中の抗ＯｍｐＣ抗体レベルの決定も本発明において有用である。本明細書で使用されるように、用語「抗外膜タンパク質Ｃ抗体」又は「抗ＯｍｐＣ抗体」には、たとえば、ＰＣＴ特許出願国際公開第０１／８９３６１号パンフレットに記載される細菌外膜ポリンに対する抗体が含まれる。用語「外膜タンパク質Ｃ」又は「ＯｍｐＣ」とは、抗ＯｍｐＣ抗体と免疫反応性である細菌ポリンのことである。
[0181]個人由来の試料中に存在する抗ＯｍｐＣ抗体のレベルは、ＯｍｐＣタンパク質又はその免疫反応性断片などのその断片を使用して決定することが可能である。試料中の抗ＯｍｐＣ抗体レベルを決定するのに有用である適切なＯｍｐＣ抗原には、制限なしに、ＯｍｐＣタンパク質、ＯｍｐＣタンパク質と実質的に同じアミノ酸配列を有するＯｍｐＣポリペプチド、又はその免疫反応性断片などのその断片が含まれる。本明細書で使用されるように、ＯｍｐＣポリペプチドは一般に、ＣＬＵＳＴＡＬＷなどの配列アラインメントプログラムを使用して決定されるアミノ酸同一性に関して、ＯｍｐＣタンパク質と同一性が約５０％よりも大きい、好ましくは同一性が約６０％よりも大きい、さらに好ましくは同一性が約７０％よりも大きい、さらに好ましくはアミノ酸配列同一性が約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％よりも大きいアミノ酸配列を有するポリペプチドを言い表している。そのような抗原は、たとえば、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの腸内細菌からの精製により、ジェンバンク受託番号Ｋ００５４１などの核酸の組換え発現により、液相若しくは固相ペプチド合成などの合成手段により、又はファージディスプレイを使用することにより調製することが可能である。
[0182]試料中の抗Ｉ２抗体レベルの決定も本発明において有用である。本明細書で使用されるように、用語「抗Ｉ２抗体」には、たとえば、米国特許第６，３０９，６４３号に記載される細菌転写調節因子と相同性を共有する微生物抗原に対する抗体が含まれる。用語「Ｉ２」とは、抗Ｉ２抗体と免疫反応性である微生物抗原のことである。微生物Ｉ２タンパク質は、Ｃ．パスツリアヌム（ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）由来の予想されるタンパク質４、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のＲｖ３５５７ｃ、及びアクイフェックス・アエオリカス（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ）由来の転写調節因子とある程度の類似性の弱い相同性を共有する１００アミノ酸のポリペプチドである。Ｉ２タンパク質の核酸及びタンパク質配列は、たとえば、米国特許第６，３０９，６４３号に記載されている。
[0183]個人由来の試料中に存在する抗Ｉ２抗体のレベルは、Ｉ２タンパク質又はその免疫反応性断片などのその断片を使用して決定することが可能である。試料中の抗Ｉ２抗体レベルを決定するのに有用である適切なＩ２抗原には、制限なしに、Ｉ２タンパク質、Ｉ２タンパク質と実質的に同じアミノ酸配列を有するＩ２ポリペプチド、又はその免疫反応性断片などのその断片が含まれる。そのようなＩ２ポリペプチドは、Ｃ．パスツリアヌムタンパク質４よりもＩ２タンパク質に対して大きな配列類似性を示し、アイソタイプバリアント及びその相同体を含む。本明細書で使用されるように、Ｉ２ポリペプチドは一般に、ＣＬＵＳＴＡＬＷなどの配列アラインメントプログラムを使用して決定されるアミノ酸同一性に関して、天然に存在するＩ２タンパク質と同一性が約５０％よりも大きい、好ましくは同一性が約６０％よりも大きい、さらに好ましくは同一性が約７０％よりも大きい、さらに好ましくはアミノ酸配列同一性が約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％よりも大きいアミノ酸配列を有するポリペプチドを言い表している。そのようなＩ２抗原は、たとえば、微生物からの精製により、Ｉ２抗原をコードする核酸の組換え発現により、液相若しくは固相ペプチド合成などの合成手段により、又はファージディスプレイを使用することにより調製することが可能である。
[0184]試料中の抗フラジェリン抗体レベルの決定も本発明において有用である。本明細書で使用されるように、用語「抗フラジェリン抗体」には、たとえば、ＰＣＴ特許出願国際公開第０３／０５３２２０号パンフレット及び米国特許出願公開第２００４／００４３９３１号に記載される細菌鞭毛のタンパク質成分に対する抗体が含まれる。用語「フラジェリン」とは、抗フラジェリン抗体に免疫反応性である細菌鞭毛タンパク質のことである。微生物フラジェリンは、中空円筒に配置して線維を形成する細菌鞭毛に見出されるタンパク質である。
[0185]個人由来の試料中に存在する抗フラジェリン抗体のレベルは、フラジェリンタンパク質又はその免疫反応性断片などのその断片を使用して決定することが可能である。試料中の抗フラジェリン抗体レベルを決定するのに有用である適切なフラジェリン抗原には、制限なしに、Ｃｂｉｒ−１フラジェリン、フラジェリンＸ、フラジェリンＡ、フラジェリンＢ、その断片、及びその組合せなどのフラジェリンタンパク質、フラジェリンタンパク質と実質的に同じアミノ酸配列を有するフラジェリンポリペプチド、又はその免疫反応性断片などのその断片が含まれる。本明細書で使用されるように、フラジェリンポリペプチドは一般に、ＣＬＵＳＴＡＬＷなどの配列アラインメントプログラムを使用して決定されるアミノ酸同一性に関して、天然に存在するフラジェリンタンパク質と同一性が約５０％よりも大きい、好ましくは同一性が約６０％よりも大きい、さらに好ましくは同一性が約７０％よりも大きい、さらに好ましくはアミノ酸配列同一性が約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％よりも大きいアミノ酸配列を有するポリペプチドを言い表している。そのようなフラジェリン抗原は、たとえば、ヘリコバクター・ビリス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ Ｂｉｌｉｓ）、ヘリコバクター・ムステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、ブチリビブリオ・フィブリソルベンス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ）などの細菌及び盲腸に見出される細菌からの精製により、フラジェリン抗原をコードする核酸の組換え発現により、液相若しくは固相ペプチド合成などの合成手段により、又はファージディスプレイを使用することにより調製することが可能である。
Ｄ．酸化ストレスマーカー
[0186]試料中の酸化ストレスのマーカーの決定も本発明において有用である。酸化ストレスのマーカーの非限定的例には、タンパク質ベースの又はＤＮＡベースのマーカーが含まれ、前記マーカーはそれぞれタンパク質酸化及びＤＮＡ断片化を測定することにより検出することが可能である。酸化ストレスのマーカーの他の例には、マロンジアルデヒドなどの有機化合物が含まれる。
[0187]酸化ストレスは、活性酸素種の生成及び出現と反応中間体を直ちに解毒又は生じた損傷を修復する生物システムの能力間の不均衡を表す。組織の正常な酸化還元状態が乱されると、タンパク質、脂質及びＤＮＡを含む細胞のあらゆる成分に損傷を与える過酸化物及びフリーラジカルの生成を通じて中毒作用を引き起こすことがある。一部の反応性酸化種は酸化還元シグナル伝達と呼ばれる現象を通じてメッセンジャーとしての機能を果たすことさえある。
[0188]ある種の実施形態では、反応性酸化代謝物の誘導体（ＤＲＯＭ）、酸化型対還元型グルタチオンの比（Ｅｈ ＧＳＨ）、及び／又は酸化型対還元型システインの比（Ｅｈ ＣｙＳＨ）を使用して酸化ストレスを定量化することが可能である。たとえば、Ｎｅｕｍａｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、５３：１６５２〜１６５７頁（２００７）を参照されたい。チロシンホスファターゼ及びチオレドキシン関連タンパク質などのタンパク質中の高度に反応性のシステイン残基の酸化的修飾も、たとえば、質量分析（ＭＳ）などの技法を使用して検出又は測定することが可能である。たとえば、Ｎａｉｔｏら、Ａｎｔｉ−Ａｇｉｎｇ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、７（５）：３６〜４４頁（２０１０）を参照されたい。酸化ストレスの他のマーカーには、たとえば、Ｕｃｈｉｄａら、ＰＮＡＳ、９５（９）４８８２〜４８８７頁（１９９８）に記載されるタンパク質結合アクロレイン、有機ヒドロペルオキシドのレベルを反映する遊離の酸素ラジカル試験（ＦＯＲＴ）、及び還元型グルタチオン／グルタチオンジスルフィドカップル、（Ｅｈ）ＧＳＨ／ＧＳＳＧの酸化還元電位が含まれる。たとえば、Ａｂｒａｍｓｏｎら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、１７８（１）：１１５〜２１頁（２００５）を参照されたい。
Ｅ．細胞表面受容体
[0189]試料中の細胞表面受容体の決定も本発明において有用である。レミケード及びヒュミラなどの抗ＴＮＦα薬の半減期は高レベルの炎症に罹っている患者においては著しく減少する。免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｇ１及びＩｇＧ３に対する高親和性受容体であるＣＤ６４は、単核貪食細胞により大部分発現されている。静止多形核（ＰＭＮ）細胞はほとんどＣＤ６４を発現しないが、このマーカーの発現は、インターフェロン及び骨髄中の骨髄前駆体に作用する顆粒球コロニー刺激因子により上方調節される。ＣＤ６４のＩｇＧ複合体との架橋により、エンドサイトーシスによる免疫複合体の内部移行、オプソニン化された粒子の食作用、脱顆粒、酸化バーストの活性化、及びサイトカインの放出を含むいくつかの細胞応答が行使される。
[0190]したがって、ある種の態様では、本明細書に記載される方法は、ＣＤ６４などの１つ又は複数の細胞表面受容体（たとえば、単独で又は他の範疇のバイオマーカーと組み合わせて）について決定された存在、濃度レベル、及び／又は遺伝子型へのアルゴリズム（たとえば、統計解析）の適用を利用して、疾患経過の予測、適切な抗ＴＮＦα薬療法の選択、抗ＴＮＦα薬療法の最適化、抗ＴＮＦα薬療法に伴う毒性の減少、又は抗ＴＮＦα薬を用いた治療的処置の有効性のモニターを行うのを支援又は補助する。
Ｆ．シグナル伝達経路
[0191]試料中のシグナル伝達経路の決定も本発明において有用である。多形核（ＰＭＮ）細胞活性化、それに続く腸粘膜（ＲＡでは滑膜）への浸潤及び陰窩上皮への移動は、ＩＢＤの重要な特長とみなされている。糞便インジウム−１１１標識された白血球排泄により、循環から腸の罹患部分へのＰＭＮ細胞の移動がＩＢＤ患者では１０倍又はそれよりも多く増加していると推定されてきた。したがって、ある種の態様では、協同的酵素増強反応性免疫アッセイ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒｅａｃｔｉｖｅ ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ）（ＣＥＥＲ）などのアッセイを使用してシグナル伝達経路を測定することにより、血液又は組織炎症由来のＰＭＮ細胞の活性化を測定するのは、炎症疾患を理解する理想的な方法である。ＣＥＥＲ技術は、以下の特許文書、ＰＣＴ出願番号国際公開第２００８／０３６８０２号パンフレット、国際公開第２００９／０１２１４０号パンフレット、国際公開第２００９／１０８６３７号パンフレット、国際公開第２０１０／１３２７２３号パンフレット、国際公開第２０１１／００８９９０号パンフレット、及び国際公開第２０１１／０５００６９号パンフレット、並びにＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６６６２４に記載されており、これら特許文献はそれぞれが参照によりあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれている。
[0192]したがって、ある種の態様では、本明細書に記載される方法は、１つ又は複数のシグナル伝達経路における１つ又は複数のシグナル伝達分子（たとえば、単独で又は他の範疇のバイオマーカーと組み合わせて）について決定された存在、濃度レベル、及び／又は遺伝子型へのアルゴリズム（たとえば、統計解析）の適用を利用して、疾患経過の予測、適切な抗ＴＮＦα薬療法の選択、抗ＴＮＦα薬療法の最適化、抗ＴＮＦα薬療法に伴う毒性の減少、又は抗ＴＮＦα薬を用いた治療的処置の有効性のモニターを行うのを支援又は補助する。好ましい実施形態では、１つ又は複数のシグナル伝達経路における１つ又は複数のシグナル伝達分子の全体レベル及び／又は活性化（たとえば、リン酸化）レベルが測定される。
[0193]用語「シグナル伝達分子」又は「シグナル伝達物質」には、細胞が細胞外シグナル又は刺激を、典型的には細胞内の規則正しい順序の生化学反応を伴う応答に変換するプロセスを実行するタンパク質及び他の分子が含まれる。シグナル伝達分子の例には、ＥＧＦＲ（たとえば、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１／ＥｒｂＢ１、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ３、ＨＥＲ４／ＥｒｂＢ４）、ＶＥＧＦＲ１／ＦＬＴ１、ＶＥＧＦＲ２／ＦＬＫ１／ＫＤＲ、ＶＥＧＦＲ３／ＦＬＴ４、ＦＬＴ３／ＦＬＫ２、ＰＤＧＦＲ（たとえば、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ）、ｃ−ＫＩＴ／ＳＣＦＲ、ＩＮＳＲ（インスリン受容体）、ＩＧＦ−ＩＲ、ＩＧＦ−ＩＩＲ、ＩＲＲ（インスリン受容体関連受容体）、ＣＳＦ−１Ｒ、ＦＧＦＲ１〜４、ＨＧＦＲ１〜２、ＣＣＫ４、ＴＲＫ Ａ〜Ｃ、ｃ−ＭＥＴ、ＲＯＮ、ＥＰＨＡ１〜８、ＥＰＨＢ１〜６、ＡＸＬ、ＭＥＲ、ＴＹＲＯ３、ＴＩＥ１〜２、ＴＥＫ、ＲＹＫ、ＤＤＲ１〜２、ＲＥＴ、ｃ−ＲＯＳ、Ｖ−カドヘリン、ＬＴＫ（白血球チロシンキナーゼ）、ＡＬＫ（未分化リンパ腫キナーゼ）、ＲＯＲ１〜２、ＭＵＳＫ、ＡＡＴＹＫ１〜３、及びＲＴＫ１０６などの受容体チロシンキナーゼ；アミノ末端細胞外ドメイン（たとえば、ｐ９５ＥｒｂＢ２（ｐ９５ｍ）、ｐ１１０、ｐ９５ｃ、ｐ９５ｎ、等）が欠損している切断型ＨＥＲ２受容体、アミノ末端細胞外ドメインが欠損している切断型ｃＭＥＴ受容体、及びアミノ末端細胞外ドメインが欠損している切断型ＨＥＲ３受容体などの切断型の受容体チロシンキナーゼ；受容体チロシンキナーゼ二量体（たとえば、ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３；ｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ２；ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４との切断型ＨＥＲ３受容体；ＨＥＲ２／ＨＥＲ２；ＨＥＲ３／ＨＥＲ３；ＨＥＲ２／ＨＥＲ３；ＨＥＲ１／ＨＥＲ２；ＨＥＲ１／ＨＥＲ３；ＨＥＲ２／ＨＥＲ４；ＨＥＲ３／ＨＥＲ４、等）；ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｓｒｃ、Ｆｒｋ、Ｂｔｋ、Ｃｓｋ、Ａｂｌ、Ｚａｐ７０、Ｆｅｓ／Ｆｐｓ、Ｆａｋ、Ｊａｋ、Ａｃｋ、及びＬＩＭＫなどの非受容体チロシンキナーゼ；ＡＫＴ（たとえば、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３）、ＭＥＫ（ＭＡＰ２Ｋ１）、ＥＲＫ２（ＭＡＰＫ１）、ＥＲＫ１（ＭＡＰＫ３）、ＰＩ３Ｋ（たとえば、ＰＩＫ３ＣＡ（ｐ１１０）、ＰＩＫ３Ｒ１（ｐ８５））、ＰＤＫ１、ＰＤＫ２、ホスファターゼ及びテンシン相同体（ＰＴＥＮ）、ＳＧＫ３、４Ｅ−ＢＰ１、Ｐ７０Ｓ６Ｋ（たとえば、ｐ７０ Ｓ６キナーゼスプライスバリアントアルファＩ）、タンパク質チロシンホスファターゼ（たとえば、ＰＴＰ１Ｂ、ＰＴＰＮ１３、ＢＤＰ１、等）、ＲＡＦ、ＰＬＡ２、ＭＥＫＫ、ＪＮＫＫ、ＪＮＫ、ｐ３８、Ｓｈｃ（ｐ６６）、Ｒａｓ（たとえば、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ）、Ｒｈｏ、Ｒａｃ１、Ｃｄｃ４２、ＰＬＣ、ＰＫＣ、ｐ５３、サイクリンＤ１、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸（ＰＩＰ２）、ホスファチジルイノシトール３，４，５−三リン酸（ＰＩＰ３）、ｍＴＯＲ、ＢＡＤ、ｐ２１、ｐ２７、ＲＯＣＫ、ＩＰ３、ＴＳＰ−１、ＮＯＳ、ＧＳＫ−３β、ＲＳＫ１〜３、ＪＮＫ、ｃ−Ｊｕｎ、Ｒｂ、ＣＲＥＢ、Ｋｉ６７、パキシリン、ＮＦ−ｋＢ、並びにＩＫＫなどのチロシンキナーゼシグナル伝達カスケード成分；エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、アンドロゲン受容体、グルココルチコイド受容体、ミネラルコルチコイド受容体、ビタミンＡ受容体、ビタミンＤ受容体、レチノイド受容体、甲状腺ホルモン受容体、及びオーファン受容体などの核ホルモン受容体；それぞれ乳癌１（ＡＩＢ１）及び核受容体コリプレッサー１（ＮＣＯＲ）において増幅されたなどの核受容体コアクティベータ及びリプレッサー；並びにその組合せが含まれるが、これらに限定されない。
[0194]用語「活性化状態」とは、特定のシグナル伝達分子が活性化されているかどうかのことである。同様に、用語「活性化レベル」とは、特定のシグナル伝達分子がどの程度活性化されているかのことである。活性化状態は、典型的には、１つ又は複数のシグナル伝達分子のリン酸化、ユビキチン化、及び／又は複合体形成状態に一致する。活性化状態（丸括弧内に挙げられている）の非限定的例には、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ、リン酸化された（ｐ−）ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ：Ｓｈｃ、ユビキチン化された（ｕ−）ＥＧＦＲ、ｐ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；ＥｒｂＢ２（ｐ−ＥｒｂＢ２、ｐ９５ＨＥＲ２（切断型ＥｒｂＢ２）、ｐ−ｐ９５ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ２：Ｓｈｃ、ＥｒｂＢ２：ＰＩ３Ｋ、ＥｒｂＢ２：ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ２：ＥｒｂＢ４）；ＥｒｂＢ３（ｐ−ＥｒｂＢ３、切断型ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ３：ＰＩ３Ｋ、ｐ−ＥｒｂＢ３：ＰＩ３Ｋ、ＥｒｂＢ３：Ｓｈｃ）；ＥｒｂＢ４（ｐ−ＥｒｂＢ４、ＥｒｂＢ４：Ｓｈｃ）；ｃ−ＭＥＴ（ｐ−ｃ−ＭＥＴ、切断型ｃ−ＭＥＴ、ｃ−Ｍｅｔ：ＨＧＦ複合体）；ＡＫＴ１（ｐ−ＡＫＴ１）；ＡＫＴ２（ｐ−ＡＫＴ２）；ＡＫＴ３（ｐ−ＡＫＴ３）；ＰＴＥＮ（ｐ−ＰＴＥＮ）；Ｐ７０Ｓ６Ｋ（ｐ−Ｐ７０Ｓ６Ｋ）；ＭＥＫ（ｐ−ＭＥＫ）；ＥＲＫ１（ｐ−ＥＲＫ１）；ＥＲＫ２（ｐ−ＥＲＫ２）；ＰＤＫ１（ｐ−ＰＤＫ１）；ＰＤＫ２（ｐ−ＰＤＫ２）；ＳＧＫ３（ｐ−ＳＧＫ３）；４Ｅ−ＢＰ１（ｐ−４Ｅ−ＢＰ１）；ＰＩＫ３Ｒ１（ｐ−ＰＩＫ３Ｒ１）；ｃ−ＫＩＴ（ｐ−ｃ−ＫＩＴ）；ＥＲ（ｐ−ＥＲ）；ＩＧＦ−１Ｒ（ｐ−ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＧＦ−１Ｒ：ＩＲＳ、ＩＲＳ：ＰＩ３Ｋ、ｐ−ＩＲＳ、ＩＧＦ−１Ｒ：ＰＩ３Ｋ）；ＩＮＳＲ（ｐ−ＩＮＳＲ）；ＦＬＴ３（ｐ−ＦＬＴ３）；ＨＧＦＲ１（ｐ−ＨＧＦＲ１）；ＨＧＦＲ２（ｐ−ＨＧＦＲ２）；ＲＥＴ（ｐ−ＲＥＴ）；ＰＤＧＦＲＡ（ｐ−ＰＤＧＦＲＡ）；ＰＤＧＦＲＢ（ｐ−ＰＤＧＦＲＢ）；ＶＥＧＦＲ１（ｐ−ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ１：ＰＬＣγ、ＶＥＧＦＲ１：Ｓｒｃ）；ＶＥＧＦＲ２（ｐ−ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ２：ＰＬＣγ、ＶＥＧＦＲ２：Ｓｒｃ、ＶＥＧＦＲ２：硫酸ヘパリン、ＶＥＧＦＲ２：ＶＥ−カドヘリン）；ＶＥＧＦＲ３（ｐ−ＶＥＧＦＲ３）；ＦＧＦＲ１（ｐ−ＦＧＦＲ１）；ＦＧＦＲ２（ｐ−ＦＧＦＲ２）；ＦＧＦＲ３（ｐ−ＦＧＦＲ３）；ＦＧＦＲ４（ｐ−ＦＧＦＲ４）；ＴＩＥ１（ｐ−ＴＩＥ１）；ＴＩＥ２（ｐ−ＴＩＥ２）；ＥＰＨＡ（ｐ−ＥＰＨＡ）；ＥＰＨＢ（ｐ−ＥＰＨＢ）；ＧＳＫ−３β（ｐ−ＧＳＫ−３β）；ＮＦ−ｋＢ（ｐ−ＮＦ−ｋＢ、ＮＦ−ｋＢ−ＩｋＢアルファ複合体及び他）；ＩｋＢ（ｐ−ＩｋＢ、ｐ−Ｐ６５：ＩｋＢ）；ＩＫＫ（ホスホＩＫＫ）；ＢＡＤ（ｐ−ＢＡＤ、ＢＡＤ：１４−３−３）；ｍＴＯＲ（ｐ−ｍＴＯＲ）；Ｒｓｋ−１（ｐ−Ｒｓｋ−１）；Ｊｎｋ（ｐ−Ｊｎｋ）；Ｐ３８（ｐ−Ｐ３８）；ＳＴＡＴ１（ｐ−ＳＴＡＴ１）；ＳＴＡＴ３（ｐ−ＳＴＡＴ３）；ＦＡＫ（ｐ−ＦＡＫ）；ＲＢ（ｐ−ＲＢ）；Ｋｉ６７；ｐ５３（ｐ−ｐ５３）；ＣＲＥＢ（ｐ−ＣＲＥＢ）；ｃ−Ｊｕｎ（ｐ−ｃ−Ｊｕｎ）；ｃ−Ｓｒｃ（ｐ−ｃ−Ｓｒｃ）；パキシリン（ｐ−パキシリン）；ＧＲＢ２（ｐ−ＧＲＢ２）、Ｓｈｃ（ｐ−Ｓｈｃ）、Ｒａｓ（ｐ−Ｒａｓ）、ＧＡＢ１（ｐ−ＧＡＢ１）、ＳＨＰ２（ｐ−ＳＨＰ２）、ＧＲＢ２（ｐ−ＧＲＢ２）、ＣＲＫＬ（ｐ−ＣＲＫＬ）、ＰＬＣγ（ｐ−ＰＬＣγ）、ＰＫＣ（たとえば、ｐ−ＰＫＣα、ｐ−ＰＫＣβ、ｐ−ＰＫＣδ）、アデュシン（ｐ−アデュシン）、ＲＢ１（ｐ−ＲＢ１）、及びＰＹＫ２（ｐ−ＰＹＫ２）が含まれる。
[0195]以下の表は、全体レベル及び／又は活性化（たとえば、リン酸化）レベルを試料において決定し（たとえば、単独で又は他の範疇由来のバイオマーカーと組み合わせて）、疾患経過の予測、適切な抗ＴＮＦα薬療法の選択、抗ＴＮＦα薬療法の最適化、抗ＴＮＦα薬療法に伴う毒性の減少、又は抗ＴＮＦα薬を用いた治療的処置の有効性のモニターを行うのを支援又は補助することができるシグナル伝達分子の追加の例を提供している。
Figure 0006063398
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Ｇ．遺伝子マーカー
[0196]試料中の（たとえば、単独での又は他の範疇由来のバイオマーカーと組み合わせての）１つ又は複数の遺伝子マーカーにおける対立遺伝子バリアント（たとえば、ＳＮＰ）の存在又は非存在の決定も、疾患経過の予測、適切な抗ＴＮＦα薬療法の選択、抗ＴＮＦα薬療法の最適化、抗ＴＮＦα薬療法に伴う毒性の減少、又は抗ＴＮＦα薬を用いた治療的処置の有効性のモニターを行うのを支援又は補助するための本発明の方法において有用である。
[0197]遺伝子マーカーの非限定的例には、炎症経路遺伝子及び表３に記載されているように遺伝子型を同定することができる対応するＳＮＰのいずれでも（たとえば、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子、ＩＬ１２／ＩＬ２３経路遺伝子、等）が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、少なくとも１つの対立遺伝子バリアント、たとえば、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子における一塩基多型（ＳＮＰ）、及び／又はＩＬ１２／ＩＬ２３経路の１つ若しくは複数の遺伝子の存在又は非存在が決定される。たとえば、Ｂａｒｒｅｔｔら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、４０：９５５〜６２頁（２００８）及びＷａｎｇら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、８４：３９９〜４０５頁（２００９）を参照されたい。
Figure 0006063398
Figure 0006063398
Figure 0006063398
Figure 0006063398
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[0198]本発明において有用である追加のＳＮＰには、たとえば、ｒｓ２１８８９６２、ｒｓ９２８６８７９、ｒｓ１１５８４３８３、ｒｓ７７４６０８２、ｒｓ１４５６８９３、ｒｓ１５５１３９８、ｒｓ１７５８２４１６、ｒｓ３７６４１４７、ｒｓ１７３６１３５、ｒｓ４８０７５６９、ｒｓ７７５８０８０、及びｒｓ８０９８６７３が含まれる。たとえば、Ｂａｒｒｅｔｔら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、４０：９５５〜６２頁（２００８）を参照されたい。
１．ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５
[0199]ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子におけるＳＮＰなどの対立遺伝子バリアントの存在又は非存在の決定は、本発明において特に有用である。本明細書で使用されるように、用語「ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５バリアント」又は「ＮＯＤ２バリアント」には、野生型ＮＯＤ２遺伝子と比べた場合１つ若しくは複数の変化を含有するＮＯＤ２遺伝子のヌクレオチド配列又は野生型ＮＯＤ２ポリペプチド配列と比べた場合１つ若しくは複数の変化を含有するＮＯＤ２ポリペプチドのアミノ酸配列が含まれる。ＮＯＤ２は、ＣＡＲＤ１５としても知られるが、第１６染色体上のＩＢＤ１遺伝子座に位置付けられ、ポジショナルクローニング（Ｈｕｇｏｔら、Ｎａｔｕｒｅ、４１１：５９９〜６０３頁（２００１））並びに位置的候補遺伝子戦略（Ｏｇｕｒａら、Ｎａｔｕｒｅ、４１１：６０３〜６０６頁（２００１）；Ｈａｍｐｅら、Ｌａｎｃｅｔ、３５７：１９２５〜１９２８頁（２００１））により同定されてきた。ＩＢＤ１遺伝子座は、炎症性腸疾患では高マルチポイント連鎖スコアー（ｍｕｌｔｉｐｏｉｎｔ ｌｉｎｋａｇｅ ｓｃｏｒｅ）（ＭＬＳ）を有している（１６ｑ１２におけるマーカーＤ１６Ｓ４１１でＭＬＳ＝５．７）。たとえば、Ｃｈｏら、Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓ．、３：１８６〜１９０頁（１９９７）；Ａｋｏｌｋａｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、９６：１１２７〜１１３２頁（２００１）；Ｏｈｍｅｎら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、５：１６７９〜１６８３頁（１９９６）；Ｐａｒｋｅｓら、Ｌａｎｃｅｔ、３４８：１５８８頁（１９９６）；Ｃａｖａｎａｕｇｈら、Ａｎｎ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、６２：２９１〜８頁（１９９８）；Ｂｒａｎｔら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１１５：１０５６〜１０６１頁（１９９８）；Ｃｕｒｒａｎら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１１５：１０６６〜１０７１頁（１９９８）；Ｈａｍｐｅら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、６４：８０８〜８１６頁（１９９９）；及びＡｎｎｅｓｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、７：５６７〜５７３頁（１９９９）を参照されたい。
[0200]ヒトＮＯＤ２のｍＲＮＡ（コード）及びポリペプチド配列は、たとえば、それぞれジェンバンク受託番号ＮＭ＿０２２１６２及びＮＰ＿０７１４４５に記載されている。さらに、ＮＯＤ２を含む、ヒト第１６染色体クローンＲＰ１１−３２７Ｆ２２の完全な配列は、たとえば、ジェンバンク受託番号ＡＣ００７７２８に記載されている。さらに、他の種由来のＮＯＤ２の配列はジェンバンクデータベースに見ることができる。
[0201]ＮＯＤ２タンパク質は、アミノ末端カスパーゼ動員ドメイン（ＣＡＲＤ）を含有しており、このドメインはＮＦ−カッパＢ（ＮＦ−κＢ）、及びいくつかのカルボキシ末端ロイシン豊富な反復ドメインを活性化することができる（Ｏｇｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６：４８１２〜４８１８頁（２００１））。ＮＯＤ２は、アポトーシス調節因子Ａｐａｆ−１／ＣＥＤ−４及び１クラスの植物病耐性遺伝子産物と構造相同性を有する（Ｏｇｕｒａら、上記参照）。植物病耐性遺伝子産物に類似して、ＮＯＤ２は、アミノ末端エフェクタードメイン、ヌクレオチド結合ドメイン及びロイシン豊富な反復（ＬＲＲ）を有する。野生型ＮＯＤ２は核因子ＮＦ−カッパＢを活性化して、この核因子を細菌性リポ多糖に対して応答性にする（ＬＰＳ；Ｏｇｕｒａら、上記参照；Ｉｎｏｈａｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６：２５５１〜２５５４頁（２００１））。ＮＯＤ２はＬＰＳに対する細胞間受容体として機能することができ、ロイシン豊富な反復は応答性に必要とされる。
[0202]ＮＯＤ２のコード領域における３つの一塩基多型での変化は既に記載されている。これらの３つのＳＮＰは、Ｒ７０２Ｗ（「ＳＮＰ８」）、Ｇ９０８Ｒ（「ＳＮＰ１２」）及び１００７ｆｓ（「ＳＮＰ１３」）と表示されており、ＮＯＤ２遺伝子のカルボキシ末端領域に位置している（Ｈｕｇｏｔら、上記参照）。本発明において使用するのに適したＮＯＤ２遺伝子内のＳＮＰ８、ＳＮＰ１２及びＳＮＰ１３、並びに追加のＳＮＰのさらなる記載は、たとえば、米国特許第６，８３５，８１５号、米国特許第６，８５８，３９１号、及び米国特許第７，５９２，４３７号、並びに米国特許出願公開第２００３／０１９０６３９号、米国特許出願公開第２００５／００５４０２１号、及び米国特許出願公開第２００７／００７２１８０号に見られる。
[0203]いくつかの実施形態では、ＮＯＤ２バリアントは、ＮＯＤ２遺伝子座のコード領域に、たとえば、ＮＯＤ２ポリペプチドのカルボキシ末端部分のいくつかのロイシン豊富な反復をコードする領域内に位置している。ＮＯＤ２のロイシン豊富な反復領域に位置しているそのようなＮＯＤ２バリアントには、制限なく、Ｒ７０２Ｗ（「ＳＮＰ８」）及びＧ９０８Ｒ（「ＳＮＰ１２」）が含まれる。本発明において有用なＮＯＤ２バリアントは、野生型ＮＯＤ２ポリペプチドによるＮＦ−カッパＢ活性化と比べた場合ＮＦ−カッパＢを活性化する能力が減少しているＮＯＤ２ポリペプチドもコードすることができる。非限定的例として、ＮＯＤ２バリアント１００７ｆｓ（「ＳＮＰ１３」）は、ＬＰＳ刺激に対する応答でＮＦ−カッパＢを誘導する能力が減少している切断型ＮＯＤ２ポリペプチドを生じる（Ｏｇｕｒａら、Ｎａｔｕｒｅ、４１１：６０３〜６０６頁（２００１））。
[0204]本発明において有用であるＮＯＤ２バリアントは、たとえば、Ｒ７０２Ｗ、Ｇ９０８Ｒ、又は１００７ｆｓであることが可能である。Ｒ７０２Ｗ、Ｇ９０８Ｒ、及び１００７ｆｓはＮＯＤ２のコード領域内に位置している。一実施形態では、本発明の方法は、Ｒ７０２Ｗ ＮＯＤ２バリアントを用いて実行される。本明細書で使用されるように、用語「Ｒ７０２Ｗ」には、ＮＯＤ２遺伝子のエクソン４内の一塩基多型が含まれ、これはＮＯＤ２タンパク質のアミノ酸７０２をコードするトリプレット内に存在する。野生型ＮＯＤ２対立遺伝子は、ＡＣ００７７２８配列の１３８，９９１位にシトシン（ｃ）残基を含有しており、これはアミノ酸７０２でアルギニンをコードしているトリプレット内に存在する。Ｒ７０２Ｗ ＮＯＤ２バリアントは、ＡＣ００７７２８配列の１３８，９９１位にチミン（ｔ）残基を含有しており、ＮＯＤ２タンパク質のアミノ酸７０２でアルギニン（Ｒ）からトリプトファン（Ｗ）置換を生じる。したがって、このＮＯＤ２バリアントは「Ｒ７０２Ｗ」又は「７０２Ｗ」と表示され、Ｈｕｇｏｔら、上記参照の以前の付番方式に基づいて「Ｒ６７５Ｗ」と表示することもできる。さらに、Ｒ７０２Ｗバリアントは、「ＳＮＰ８」対立遺伝子又はＳＮＰ８での「２」対立遺伝子としても知られている。Ｒ７０２Ｗ又はＳＮＰ８のＮＣＢＩ ＳＮＰ ＩＤ番号は、ｒｓ２０６６８４４である。Ｒ７０２Ｗ ＮＯＤ２バリアント及び他のＮＯＤ２バリアントの存在は、たとえば、対立遺伝子識別アッセイ又は配列解析により都合よく検出することができる。
[0205]本発明の方法は、Ｇ９０８Ｒ ＮＯＤ２バリアントを用いて実行することもできる。本明細書で使用されるように、用語「Ｇ９０８Ｒ」には、ＮＯＤ２遺伝子のエクソン８内の一塩基多型が含まれ、これはＮＯＤ２タンパク質のアミノ酸９０８をコードするトリプレット内に存在する。アミノ酸９０８はＮＯＤ２遺伝子のロイシン豊富な反復領域内に位置している。野生型ＮＯＤ２対立遺伝子は、ＡＣ００７７２８配列の１２８，３７７位にグアニン（ｇ）残基を含有しており、これはアミノ酸９０８でグリシンをコードしているトリプレット内に存在する。Ｇ９０８Ｒ ＮＯＤ２バリアントは、ＡＣ００７７２８配列の１２８，３７７位にシトシン（ｃ）残基を含有しており、ＮＯＤ２タンパク質のアミノ酸９０８でグリシン（Ｇ）からアルギニン（Ｒ）置換を生じる。したがって、このＮＯＤ２バリアントは「Ｇ９０８Ｒ」又は「９０８Ｒ」と表示され、Ｈｕｇｏｔら、上記参照の以前の付番方式に基づいて「Ｇ８８１Ｒ」と表示することもできる。さらに、Ｇ９０８Ｒバリアントは、「ＳＮＰ１２」対立遺伝子又はＳＮＰ１２での「２」対立遺伝子としても知られている。Ｇ９０８Ｒ ＳＮＰ１２のＮＣＢＩ ＳＮＰ ＩＤ番号は、ｒｓ２０６６８４５である。
[0206]本発明の方法は、１００７ｆｓ ＮＯＤ２バリアントを用いて実行することもできる。このバリアントは、ＮＯＤ２タンパク質の１０番目のロイシン豊富な反復にフレームシフトを生じる一ヌクレオチドの挿入物であり、後に中途終止コドンが続く。ＮＯＤ２タンパク質のこうして生じる切断は、細菌リポ多糖への応答によるＮＦ−カッパＢの活性化を妨げるように思われる（Ｏｇｕｒａら、上記参照）。本明細書で使用されるように、用語「１００７ｆｓ」には、ＮＯＤ２遺伝子のエクソン１１内の一塩基多型が含まれ、これはＮＯＤ２タンパク質のアミノ酸１００７をコードするトリプレット内に存在する。１００７ｆｓバリアントは、ＡＣ００７７２８配列の１２１，１３９位に付加されたシトシンを含有しており、アミノ酸１００７でフレームシフト変異を生じる。したがって、このＮＯＤ２バリアントは「１００７ｆｓ」と表示され、Ｈｕｇｏｔら、上記参照の以前の付番方式に基づいて「３０２０ｉｎｓＣ」又は「９８０ｆｓ」と表示することもできる。さらに、１００７ｆｓ ＮＯＤ２バリアントは、「ＳＮＰ１３」対立遺伝子又はＳＮＰ１３での「２」対立遺伝子としても知られている。１００７ｆｓ又はＳＮＰ１３のＮＣＢＩ ＳＮＰ ＩＤ番号は、ｒｓ２０６６８４７である。
[0207]当業者であれば、特定のＮＯＤ２バリアント対立遺伝子又は他の多型対立遺伝子は、たとえば、１３４７−０２と呼ばれる個人などのＣｅｎｔｒｅ ｄ’Ｅｔｕｄｅ ｄｕ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｅ Ｈｕｍａｉｎ（ＣＥＰＨ）リファレンス個人と比較して（Ｄｉｂら、Ｎａｔｕｒｅ、３８０：１５２〜１５４頁（１９９６））、たとえば、ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から得られる市販のリファレンスＤＮＡを使用して都合よく定義することが可能であることを認識する。さらに、ＳＮＰに関する特定の情報は、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のｄｂＳＮＰから入手することができる。
[0208]ＮＯＤ２バリアントは、ＮＯＤ２遺伝子座の非コード領域でも位置付けることができる。非コード領域には、たとえば、イントロン配列並びに５’及び３’非翻訳配列が含まれる。ＮＯＤ２遺伝子の非コード領域に位置するＮＯＤ２バリアント対立遺伝子の非限定的例はＪＷ１バリアントであり、これは、Ｓｕｇｉｍｕｒａら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、７２：５０９〜５１８頁（２００３）及び米国特許出願公開第２００７／００７２１８０号に記載されている。ＮＯＤ２遺伝子の３’非翻訳領域に位置するＮＯＤ２バリアント対立遺伝子の例には、制限なく、ＪＷ１５及びＪＷ１６バリアント対立遺伝子が含まれ、これは米国特許出願公開第２００７／００７２１８０号に記載されている。ＮＯＤ２遺伝子の５’非翻訳領域（たとえば、プロモーター領域）に位置するＮＯＤ２バリアント対立遺伝子の例には、制限なく、ＪＷ１７及びＪＷ１８バリアント対立遺伝子が含まれ、これは米国特許出願公開第２００７／００７２１８０号に記載されている。
[0209]本明細書で使用されるように、用語「ＪＷ１バリアント対立遺伝子」には、ＮＯＤ２遺伝子の介在配列８（イントロン８）のヌクレオチド１５８に遺伝的変異が含まれる。ＡＣ００７７２８配列との関連では、ＪＷ１バリアント対立遺伝子は１２８，１４３位に位置している。イントロン８のヌクレオチド１５８での遺伝的変異は、一塩基置換、複数塩基置換、又は１つ若しくは複数のヌクレオチドの欠失若しくは挿入であることが可能であるが、これらに限定されない。イントロン８の野生型配列は１５８位にシトシンを有する。非限定的例として、ＪＷ１バリアント対立遺伝子は、イントロン８のヌクレオチド１５８で、シトシン（ｃ）からアデニン（ａ）、シトシン（ｃ）からグアニン（ｇ）、又はシトシン（ｃ）からチミン（ｔ）置換を有することがある。一実施形態では、ＪＷ１バリアント対立遺伝子は、ＮＯＤ２イントロン８のヌクレオチド１５８でのシトシン（ｃ）からチミン（ｔ）への変化である。
[0210]用語「ＪＷ１５バリアント対立遺伝子」には、ＡＣ００７７２８配列のヌクレオチド位置１１８，７９０でのＮＯＤ２の３’非翻訳領域における遺伝的変異が含まれる。ヌクレオチド１１８，７９０での遺伝的変異は、一塩基置換、複数塩基置換、又は１つ若しくは複数のヌクレオチドの欠失若しくは挿入であることが可能であるが、これらに限定されない。野生型配列は１１８，７９０位にアデニン（ａ）を有する。非限定的例として、ＪＷ１５バリアント対立遺伝子は、ヌクレオチド１１８，７９０で、アデニン（ａ）からシトシン（ｃ）、アデニン（ａ）からグアニン（ｇ）、又はアデニン（ａ）からチミン（ｔ）置換を有することがある。一実施形態では、ＪＷ１５バリアント対立遺伝子は、ヌクレオチド１１８，７９０でのアデニン（ａ）からシトシン（ｃ）への変化である。
[0211]本明細書で使用されるように、用語「ＪＷ１６バリアント対立遺伝子」には、ＡＣ００７７２８配列のヌクレオチド位置１１８，０３１でのＮＯＤ２の３’非翻訳領域における遺伝的変異が含まれる。ヌクレオチド１１８，０３１での遺伝的変異は、一塩基置換、複数塩基置換、又は１つ若しくは複数のヌクレオチドの欠失若しくは挿入であることが可能であるが、これらに限定されない。野生型配列は１１８，０３１位にグアニン（ｇ）を有する。非限定的例として、ＪＷ１６バリアント対立遺伝子は、ヌクレオチド１１８，０３１で、グアニン（ｇ）からシトシン（ｃ）、グアニン（ｇ）からアデニン（ａ）、又はグアニン（ｇ）からチミン（ｔ）置換を有することがある。一実施形態では、ＪＷ１６バリアント対立遺伝子は、ヌクレオチド１１８，０３１でのグアニン（ｇ）からアデニン（ａ）への変化である。
[0212]用語「ＪＷ１７バリアント対立遺伝子」には、ＡＣ００７７２８配列のヌクレオチド位置１５４，６８８でのＮＯＤ２の５’非翻訳領域における遺伝的変異が含まれる。ヌクレオチド１５４，６８８での遺伝的変異は、一塩基置換、複数塩基置換、又は１つ若しくは複数のヌクレオチドの欠失若しくは挿入であることが可能であるが、これらに限定されない。野生型配列は１５４，６８８位にシトシン（ｃ）を有する。非限定的例として、ＪＷ１７バリアント対立遺伝子は、ヌクレオチド１５４，６８８で、シトシン（ｃ）からグアニン（ｇ）、シトシン（ｃ）からアデニン（ａ）、又はシトシン（ｃ）からチミン（ｔ）置換を有することがある。一実施形態では、ＪＷ１７バリアント対立遺伝子は、ヌクレオチド１５４，６８８でのシトシン（ｃ）からチミン（ｔ）への変化である。
[0213]本明細書で使用されるように、用語「ＪＷ１８バリアント対立遺伝子」には、ＡＣ００７７２８配列のヌクレオチド位置１５４，４７１でのＮＯＤ２の５’非翻訳領域における遺伝的変異が含まれる。ヌクレオチド１５４，４７１での遺伝的変異は、一塩基置換、複数塩基置換、又は１つ若しくは複数のヌクレオチドの欠失若しくは挿入であることが可能であるが、これらに限定されない。野生型配列は１５４，４７１位にシトシン（ｃ）を有する。非限定的例として、ＪＷ１８バリアント対立遺伝子は、ヌクレオチド１５４，４７１で、シトシン（ｃ）からグアニン（ｇ）、シトシン（ｃ）からアデニン（ａ）、又はシトシン（ｃ）からチミン（ｔ）置換を有することがある。一実施形態では、ＪＷ１８バリアント対立遺伝子は、ヌクレオチド１５４，４７１でのシトシン（ｃ）からチミン（ｔ）への変化である。
[0214]本発明の方法は、ＮＯＤ２遺伝子座のコード領域又は非コード領域（たとえば、イントロン又はプロモーター領域）に位置しているこれらの又は他のＮＯＤ２バリアント対立遺伝子を用いて実行することが可能であることが理解される。本発明の方法は、ＳＮＰ８、ＳＮＰ１２、とＳＮＰ１３対立遺伝子、及び他のコード並びに非コード領域バリアントを含むが、これらに限定されない、１つ、２つ、３つ、４つ又はそれよりも多いＮＯＤ２バリアントの存在を決定することを含むことができることがさらに理解される。
Ｖ．実施例
[0215]本発明は、具体例によりさらに詳細に説明されることになる。以下の例は説明目的で提供され、いかなる形でも本発明を限定することを意図していない。当業者であれば、変化させる又は改変させても実質的に同じ結果を生じることができる種々の重要性が低いパラメータを容易に認識するであろう。
実施例１．抗ＴＮＦα生物製剤のレベルを測定するための新規の移動度シフトアッセイ。
[0216]この実施例は、抗ＴＮＦα薬の蛍光的に標識されたＴＮＦαへの結合を検出するサイズ排除クロマトグラフィーを使用して患者試料（たとえば、血清）中の抗ＴＮＦα薬濃度を測定するための新規の均一なアッセイを説明する。前記アッセイは、洗浄ステップの必要性をなくし、バックグランド及び血清干渉問題を減少させる可視及び／又はＩＲスペクトルでの検出を可能にするフルオロフォアを使用し、高感度な蛍光標識検出のために患者における低力価の抗ＴＮＦα薬を検出する能力を増加させ、液相反応として起こり、それによってＥＬＩＳＡプレートなどの固体表面への結合によるエピトープのいかなる変化の可能性も減らすので、有利である。
[0217]一例となる実施形態では、ＴＮＦαはフルオロフォア（たとえば、アレクサ６４７）で標識され、前記フルオロフォアは可視及びＩＲスペクトルのどちらか又は両方で検出することが可能である。標識されたＴＮＦαは液相反応においてヒト血清と一緒にインキュベートされ、血清中に存在する抗ＴＮＦα薬を結合させる。標識されたＴＮＦαは、液相反応において既知の量の抗ＴＮＦα薬と一緒にインキュベートさせて、標準曲線を作成することも可能である。インキュベーションに続いて、試料はサイズ排除カラムに直接負荷される。抗ＴＮＦα薬が標識されたＴＮＦαに結合すると、標識されたＴＮＦα単独と比べてピークが左側に移動する。次に、血清試料中に存在する抗ＴＮＦα薬の濃度は標準曲線及び対照と比較することができる。
[0218]図１は、サイズ排除ＨＰＬＣを使用してＴＮＦα−アレクサ６４７とヒュミラ（商標）（アダリムマブ）間の結合を検出する本発明のアッセイの例を示している。図１に示されるように、ヒュミラ（商標）のＴＮＦα−アレクサ６４７への結合により、ＴＮＦα−アレクサ６４７ピークは左側に移動した。
[0219]図２は、ＴＮＦα−アレクサ６４７へのヒュミラ（商標）結合の用量応答曲線を示している。特に、図２Ａは、ヒュミラ（商標）がサイズ排除クロマトグラフィーアッセイにおいてＴＮＦα−アレクサ６４７の移動を用量依存的に増加させたことを示している。図２Ｂは、１％のヒト血清が存在してもサイズ排除クロマトグラフィーアッセイにおけるＴＮＦα−アレクサ６４７の移動に対して著しい効果はなかったことを示している。図２Ｃは、プールされたＲＦ陽性血清が存在してもサイズ排除クロマトグラフィーアッセイにおけるＴＮＦα−アレクサ６４７の移動に対して著しい効果はなかったことを示している。
[0220]したがって、この実施例は、ヒュミラ（商標）などの抗ＴＮＦα薬を受ける患者をモニターする本発明の有用性、すなわち（１）適切な薬剤投与量の決定を導く、（２）薬剤の薬物動態を評価する、たとえば、薬物が身体から除去される速度が速すぎるかどうかを判定する、及び（３）処置決定、たとえば、現在の抗ＴＮＦα薬を異なるＴＮＦα阻害剤に又は別の種類の療法に切り替えるかどうかを導くことを実証している。
実施例２．ＨＡＣＡ及びＨＡＨＡレベルを測定するための新規の移動度シフトアッセイ。
[0221]この実施例は、患者試料（たとえば、血清）中の自己抗体（たとえば、ＨＡＣＡ及び／又はＨＡＨＡ）濃度を測定するための、これらの自己抗体の蛍光的に標識された抗ＴＮＦα薬への結合を検出するサイズ排除クロマトグラフィーを使用する新規の均一なアッセイを説明する。前記アッセイは、低親和性ＨＡＣＡ及びＨＡＨＡを取り除く洗浄ステップの必要性をなくし、バックグランド及び血清干渉問題を減少させる可視及び／又はＩＲスペクトルでの検出を可能にするフルオロフォアを使用し、高感度な蛍光標識検出のために患者における低力価のＨＡＣＡ及びＨＡＨＡを検出する能力を増加させ、液相反応として起こり、それによってＥＬＩＳＡプレートなどの固体表面への結合によるエピトープのいかなる変化の可能性も減らすので、有利である。
[0222]ＴＮＦα阻害剤に対して産生される自己抗体（たとえば、ＨＡＣＡ、ＨＡＨＡ、等）を測定することの臨床的有用性は、ＨＡＣＡが、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、及び１０ｍｇ／ｋｇインフリキシマブを用いて処置された関節リウマチ患者の５３％、２１％、及び７％において検出されたことにより例証される。インフリキシマブがメトトレキサートと組み合わされると、抗体の発生率は１５％、７％、及び０％低くなり、これは併用の免疫抑制剤療法が抗薬剤応答を低下させるのに効果的であることを示しているが、高用量の抗ＴＮＦα抗体が耐性をもたらすことがあることも示している。クローン病では、はるかに高い発生率が報告されており、５回目の注入後、患者の６１％がＨＡＣＡを有していた。ＨＡＣＡが存在すると、臨床応答は短縮された。Ｒｕｔｇｅｅｒｔｓ、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３４８：６０１〜６０８頁（２００３）を参照されたい。インフリキシマブ及びＨＡＣＡレベルが１５５件の患者において２００５年から２００８年までの３年の期間にわたって測定された遡及研究では、炎症性腸疾患に罹った患者の２２．６％（Ｎ＝３５）においてＨＡＣＡが検出されたことが示された。Ａｆｉｆら、「Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｕｔｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉ−Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｗｅｅｋ；２００９年５月３０日〜６月３日、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬで公開された論文を参照されたい。前記筆者らは、臨床症状のみに基づいて処置を変えるのは不適切な管理をもたらすことがあると結論付けていた。
[0223]均一な移動度シフトアッセイは、患者試料中の自己抗体（たとえば、ＨＡＣＡ及び／又はＨＡＨＡ）濃度を測定するための図３に示される架橋アッセイなどの現在の方法よりも有利である。なぜならば、本発明の方法は、非特異的結合及びＥＬＩＳＡプレートからの固相干渉を受けずに、抗ＴＮＦα薬からの干渉を受けずに（たとえば、架橋アッセイでは、ＨＡＣＡ測定値は抗ＴＮＦα薬トラフレベルで取らなければならない）、かつ抗体の多価に対するいかなる依存性もなしで（たとえば、ＩｇＧ４抗体は、二重特異性であり同じ抗原に交差結合することができないために、架橋アッセイを使用しても検出されない）ＨＡＣＡなどの自己抗体の濃度を測定することができるからである。したがって、本発明は、現在の方法よりも、少なくとも以下の利点を有する、すなわち、抗原の固体表面への結合を回避する（変性が回避される）こと、ＩｇＧ４効果を取り除くこと、治療抗体トラフ問題を克服すること、親和性の弱い抗体を検出すること、無関係なＩｇＧの非特異的結合を取り除くこと、並びに検出の感度及び特異性を増加させることである。
[0224]一例となる実施形態では、抗ＴＮＦα薬（たとえば、レミケード（商標））は、フルオロフォア（たとえば、アレクサ６４７）で標識され、前記フルオロフォアは可視及びＩＲスペクトルのどちらか又は両方で検出することが可能である。標識された抗ＴＮＦα薬は液相反応においてヒト血清と一緒にインキュベートされ、血清中に存在するＨＡＣＡ及びＨＡＨＡを結合させる。標識された抗ＴＮＦα薬は、液相反応において既知の量の抗ＩｇＧ抗体と一緒にインキュベートさせて、標準曲線を作成することも可能である。インキュベーションに続いて、試料はサイズ排除カラムに直接負荷される。自己抗体が標識された抗ＴＮＦα薬に結合すると、標識された薬剤単独と比べてピークが左側に移動する。次に、血清試料中に存在するＨＡＣＡ及びＨＡＨＡの濃度は標準曲線及び対照と比較することができる。図４は、レミケード（商標）に対して産生されるＨＡＣＡ／ＨＡＨＡの濃度を測定するための本発明の自己抗体検出アッセイの例となる概略を示している。ある種の例では、抗ＨＡＣＡ／ＨＡＨＡレベルは、レミケード（商標）を用いた現在の療法をヒュミラ（商標）などの別の抗ＴＮＦα薬に切り替えるほうがよいことを示している。
[0225]このアッセイの原理は、複合体の分子量の増加による、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）上での抗体結合アレクサ６４７標識レミケード複合体対遊離のアレクサ６４７標識レミケードの移動度シフトに基づいている。
[0226]この実施例でのクロマトグラフィーはＡｇｉｌｅｎｔ−１２００ＨＰＬＣシステム上で実施され、分子量分画範囲５，０００〜７００，０００のＢｉｏ−Ｓｅｐ ３００×７．８ｍｍ ＳＥＣ−３０００カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）及び１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４の移動相を流速０．５ｍＬ／分で、６５０ｎｍでのＵＶ検出を用いて使用した。１００μＬ試料容積が解析ごとにカラム上に負荷される。
[0227]抗体結合アレクサ６４７標識レミケード複合体は、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．３溶出バッファー中で既知の量の抗体とアレクサ６４７標識レミケードをＳＥ−ＨＰＬＣ解析前の１時間、室温でインキュベートすることにより形成される。
[0228]図５は、本発明のサイズ排除クロマトグラフィーアッセイを使用して検出されたレミケード（商標）−アレクサ６４７への抗ヒトＩｇＧ抗体結合の用量応答解析を示している。レミケード（商標）−アレクサ６４７に抗ＩｇＧ抗体が結合したことにより、レミケード（商標）−アレクサ６４７ピークは左側へ移動した。図６は、本発明のサイズ排除クロマトグラフィーアッセイを使用して検出された、レミケード（商標）−アレクサ６４７への抗ヒトＩｇＧ抗体結合の第二の用量応答解析を示している。レミケード（商標）−アレクサ６４７ピークの左側への移動により示されるように、抗ＩｇＧ抗体の量が多いほど、抗ＩｇＧ／レミケード（商標）−アレクサ６４７複合体の形成は用量依存的に増加した。図７は、レミケード（商標）−アレクサ６４７への抗ＩｇＧ抗体の結合の用量応答曲線を示している。
[0229]図８は、１００μｌの注入試料を用いた本発明のサイズ排除クロマトグラフィーアッセイを使用して検出された、正常なヒト血清及びＨＡＣＡ陽性血清におけるレミケード（商標）−アレクサ６４７免疫複合体形成を示している。図８で示されるように、レミケード（商標）−アレクサ６４７に患者試料中に存在するＨＡＣＡが結合したことにより、レミケード（商標）−アレクサ６４７ピークは左側へ移動した。したがって、本発明のサイズ排除クロマトグラフィーアッセイは、レミケード（商標）の存在下でＨＡＣＡを測定し、患者が治療中に利用することが可能であり、弱いＨＡＣＡ結合も強いＨＡＣＡ結合も測定し、寄せ集めの読取り移動度シフトアッセイであり、ＨＡＣＡと平衡する標識されたレミケード（商標）及びレミケード（商標）を使用する他のアプローチにまで拡張することができるので、特に有利である。
[0230]図９は、架橋アッセイ又は本発明の移動度シフトアッセイを使用して実施された２０件の患者血清試料からのＨＡＣＡ測定値の概要を提供している。この比較研究により、本方法が現在の方法よりも感度が増加していることが示されている。なぜならば、架橋アッセイを使用して測定された場合ＨＡＣＡに陰性であった３件の試料が、本発明の移動度シフトアッセイを使用して測定された場合、実際にはＨＡＣＡ陽性であったからである（患者番号ＳＫ０７０７０３０５、ＳＫ０７０７０５９５、及びＳＫ０７１１００３５参照）。
[0231]したがって、この実施例は、抗ＴＮＦα薬（たとえば、レミケード（商標））を受けた患者をモニターして前記薬剤に対する自己抗体（たとえば、ＨＡＣＡ及び／又はＨＡＨＡ）の存在又はレベルを検出することにおける本発明の有用性を示している。なぜならば、そのような免疫応答は、過敏性反応並びに前記薬剤を用いたさらなる治療を不可能にする前記抗ＴＮＦα薬の薬物動態及び生体分布の劇的変化と関連することがあるからである。
[0232]結論として、実施例１及び２は、ＴＮＦα及び抗ＴＮＦα抗体はアレクサ６４７で効率的に標識することが可能であることを示している。標識されたＴＮＦα−アレクサ６４７が抗ＴＮＦα抗体と一緒にインキュベートされると、標識されたＴＮＦα／抗ＴＮＦα抗体複合体の保持時間は移動し、前記移動を引き起こす抗ＴＮＦα抗体の量はＨＰＬＣを用いて定量することができた。さらに、標識された抗ＴＮＦα抗体が抗ヒトＩｇＧ抗体と一緒にインキュベートされると、標識された抗ＴＮＦα抗体／抗ＩｇＧ抗体複合体の保持時間は移動し、前記移動を引き起こす抗ＩｇＧ抗体の量はＨＰＬＣを用いて定量することができた。さらに、前記アッセイシステムにおける低血清含有量は、ＨＰＬＣ解析に対してほとんど影響がないことが明らかにされた。最後に、標準曲線は抗ＴＮＦα抗体及びＨＡＣＡ／ＨＡＨＡアッセイのために作成することが可能であり、これを使用して患者血清抗ＴＮＦα抗体又はＨＡＣＡ／ＨＡＨＡレベルを定量することができた。有利なことに、本発明は、ある種の態様において、薬剤と前記薬剤に対する抗体の両方を測定するために開発された均一な寄せ集め読取りアッセイなどの移動度シフトアッセイを提供する。標準曲線は、抗ＴＮＦα生物製剤レミケード及びヒュミラについて、並びにレミケードに対するＨＡＣＡ抗体についても作成された。移動度シフトアッセイフォーマットは、ＥＬＩＳＡとは違って、固体表面への抗原のコーティングをなくし、無関係なＩｇＧの非特異的結合による影響を受けない。前記アッセイフォーマットは簡単であるが、感度がよく、患者血清中のすべての抗ＴＮＦα生物製剤（たとえば、レミケード、ヒュミラ、エンブレル及びシムジア）並びに中和抗体（抗レミケード（商標））を検出するのに使用することができる。
実施例３．新規の移動度シフトアッセイを使用する患者血清中のヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）及びインフリキシマブ（ＩＦＸ）レベルの測定。
要約
[0233]背景：インフリキシマブ（ＩＦＸ）は、関節リウマチ（ＲＡ）及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などの自己免疫疾患を治療するのに効果的であることが明らかにされているＴＮＦαに対するキメラモノクローナル抗体療法である。しかし、薬効を減少させる又は有害作用を誘導することがあるヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）の検出を通じて、一部のＩＦＸ処置された患者にＩＦＸに対する抗体が見つかった。個々の患者においてＨＡＣＡ及びＩＦＸレベルをモニターすれば、ＩＦＸを用いた投薬及び処置を最適化するのに役立つことがある。ＨＡＣＡを検出するための現在の方法は固相アッセイに基づいており、このアッセイは、循環におけるＩＦＸの存在がＨＡＣＡの存在をマスクすることがあり、したがって、測定はＩＦＸの投与の後少なくとも８週間たたないと行うことができないことにより制限される。さらに、この時間経過は、血液循環中の高分子量免疫複合体の急速なクリアランスのため、アッセイをさらに混乱させる。これらの欠点を克服するために、我々は、ＩＦＸを用いて処置されている患者において血清ＩＦＸ及びＨＡＣＡレベルを測定する新しい方法を開発し評価した。
[0234]方法：ＩＦＸを用いて処置されている患者由来の血清中のＨＡＣＡ及びＩＦＸレベルを測定するために、新規の非放射性標識液相サイズ排除（ＳＥ）−ＨＰＬＣ移動度シフトアッセイが開発された。免疫複合体（たとえば、ＴＮＦα／ＩＦＸ又はＩＦＸ／ＨＡＣＡ）、遊離のＴＮＦα又はＩＦＸ、及び結合／遊離の比は、高感度で分解し計算することが可能である。ＩＦＸ又はＨＡＣＡの血清濃度は、異なる濃度のＩＦＸ又はプールされたＨＡＣＡ陽性血清と一緒にインキュベートすることにより作成された標準曲線を用いて決定された。この新規のアッセイを使用して、我々は、再発していたＩＦＸを用いて処置されたＩＢＤ患者から収集された血清中のＩＦＸ及びＨＡＣＡレベルを測定し、その結果を従来の架橋ＥＬＩＳＡアッセイにより得られた結果と比較した。
[0235]結果：用量応答曲線は高感度の新規のアッセイから作成された。ＨＡＣＡの検出は過剰ＩＦＸの存在下で実証された。ＩＦＸを用いて処置された患者由来の１１７件の血清試料の内、６５件の試料が検出限界を超えるＩＦＸレベルを有していることが分かり平均は１１．０＋６．９ｍｇ／ｍＬであった。ＨＡＣＡレベルは、３３件（２８．２％）の試料が陽性であることが分かり、架橋ＥＬＩＳＡアッセイは２４件の陽性試料しか検出しなかった。架橋アッセイにより決定された試料から我々は９件の偽陰性と９件の偽陽性も同定した。ＨＡＣＡレベルは、ＩＦＸ処置の進行中１１件の患者において増加しているのが見つかり、ＩＦＸレベルは著しく減少しているのが分かった。
[0236]結論：ＩＦＸを用いて処置されている患者由来の血清中のＩＦＸ及びＨＡＣＡレベルを測定するために、新規の非放射性標識液相移動度シフトアッセイが開発された。前記アッセイは高感度で精度があり、得られた結果は再現性があった。この新規のアッセイは、患者が治療中にＨＡＣＡ及びＩＦＸレベルを測定するのに有利に使用することが可能である。
序論
[0237]腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）は、クローン病（ＣＤ）及び関節リウマチ（ＲＡ）などの自己免疫疾患の病変形成において極めて重要な役割を果たしている。インフリキシマブ（ヒト−マウスキメラモノクローナルＩｇＧ１κ）又はアダリムマブ（完全ヒトモノクローナル抗体）などの治療抗体でＴＮＦαを遮断すると、ＣＤ及びＲＡにおいて疾患活動度が減少することは十分に裏付けられている。しかし、前記患者の約３０〜４０％が抗ＴＮＦα療法に応答せず、一部の患者は、十分な応答が欠けているせいでもっと高い用量又は投与回数調整を必要とする。個々の患者における薬剤生物有用性及び薬物動態の差異が、治療の失敗の一因となることがある。薬剤の免疫原性は、患者にＨＡＣＡ／ＨＡＨＡを発症させるが、軽いアレルギー応答からアナフィラキシーショックまでの広範な有害反応をもたらすおそれがある。これらの問題は、現在では、多くの研究者、薬剤管理機関、健康保険会社及び製薬会社により認識されている。さらに、１つの抗ＴＮＦα薬に二次応答失敗した多くの患者は他の抗ＴＮＦα薬への切り替えから利益を受けており、治療のために使用されるタンパク質に対して特異的に向けられた中和抗体の役割を示唆している（Ｒａｄｓｔａｋｅら、Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．、６８（１１）：１７３９〜４５（２００９））。したがって、薬剤及びＨＡＣＡ／ＨＡＨＡレベルについての患者のモニタリングは、薬剤投与が個々の患者に合わせて行うことができ長期の療法は、患者への危険がほとんど又は全くなしで効果的に経済的に与えることができることを目的に是認される（Ｂｅｎｄｔｚｅｎら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、４４（７）：７７４〜８１頁（２００９））。
[0238]いくつかの酵素結合免疫アッセイが使用されて、薬剤及びＨＡＣＡ／ＨＡＨＡの循環レベルを評価してきた。図１０は、本発明の新規のＨＡＣＡアッセイと比べたＨＡＣＡの測定に利用可能である現在のアッセイの概要を提供している。現在の方法論の１つの限界は、循環内に測定可能な量の薬剤が存在する場合に抗体レベルは測定が困難であることである。ＩＦＸの投与の後少なくとも８週間たたないと測定を実施することができないＨＡＣＡを検出するための現在の固相法とは対照的に、本発明の新規のアッセイは、ＩＦＸを用いた処置を受けている間に患者由来の血清中のＨＡＣＡ及びＩＦＸレベルを測定することができる非放射性標識液相サイズ排除（ＳＥ）−ＨＰＬＣアッセイである。
[0239]以下の、（１）臨床試験におけるＰＫ研究のため、（２）生物製剤に対する患者の免疫応答をモニターすることは臨床試験中にＦＤＡから要求されることがある、（３）ＨＡＣＡ又はＨＡＨＡを測定することにより生物製剤に対する患者の応答をモニターして、患者ごとに薬剤投与量を導くため、及び（４）最初の薬剤が失敗した場合に異なる生物製剤に切り替えるための指針として使用するため、が患者における抗ＴＮＦα生物製剤及びＴＮＦα生物製剤に対する抗体の血清濃度を測定する理論的根拠である。
方法
[0240]患者血清中のインフリキシマブ（ＩＦＸ）レベルのＳＥ−ＨＰＬＣ解析。ヒト組換えＴＮＦαは、製造業者の使用説明書に従ってフルオロフォア（たとえば、アレクサフルオル（登録商標）４８８などの「Ｆｌ」）で標識された。標識されたＴＮＦαは、室温で１時間、異なる量のＩＦＸ又は患者血清と一緒にインキュベートされた。１００μＬ容積の試料は、ＨＰＬＣシステム上でサイズ排除クロマトグラフィーにより解析された。ＦＬＤを使用して、その保持時間に基づいて遊離のＴＮＦα−Ｆｌ及び結合ＴＮＦα−Ｆｌ免疫複合体をモニターした。血清ＩＦＸレベルは標準曲線から計算された。
[0241]患者血清中のＨＡＣＡレベルのＳＥ−ＨＰＬＣ解析。精製されたＩＦＸはＦｌで標識された。標識されたＩＦＸは、室温で１時間、異なる希釈度のプールされたＨＡＣＡ陽性血清又は希釈された患者血清と一緒にインキュベートされた。１００μＬ容積の試料は、ＨＰＬＣシステム上でサイズ排除クロマトグラフィーにより解析された。ＦＬＤを使用して、その保持時間に基づいて遊離のＩＦＸ−Ｆｌ及び結合ＩＦＸ−Ｆｌ免疫複合体をモニターした。結合と遊離ＩＦＸ−Ｆｌの比を使用して、ＨＡＣＡレベルを決定した。
[0242]血清中のＨＡＣＡを測定するための移動度シフトアッセイ法手順。このアッセイの原理は、複合体の分子量の増加による、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）上でのＨＡＣＡ結合Ｆｌ標識インフリキシマブ（ＩＦＸ）複合体対遊離のＦｌ標識ＩＦＸの移動度シフトに基づいている。前記クロマトグラフィーはＡｇｉｌｅｎｔ−１２００ＨＰＬＣシステム上で実施され、分子量分画範囲５，０００〜７００，０００のＢｉｏ−Ｓｅｐ ３００×７．８ｍｍ ＳＥＣ−３０００カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）及び１×ＰＢＳ、ｐＨ７．３の移動相を流速０．５〜１．０ｍＬ／分で、ＦＬＤ検出を用いて使用した。１００μＬ試料容積が解析ごとにカラム上に負荷される。ＨＡＣＡ結合Ｆｌ標識ＩＦＸ複合体は、ＳＥ−ＨＰＬＣ解析前に室温で１時間、ＩＦＸ処置患者由来血清とＦｌ標識ＩＦＸを１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４溶出バッファー中でインキュベートすることにより形成される。前記アッセイは、アッセイを検証するために、リウマトイド因子及びＴＮＦβなどの変化する干渉薬剤の存在下でも実行された。
結果
[0243]図１１は、高分子量複合体の移動度シフトのせいによる遊離のＩＦＸ−ＦｌからのＨＡＣＡ結合ＩＦＸ−Ｆｌ複合体の分離を示している。パネルｃ及びｄに見られるように、蛍光ピークの保持時間は２１．８分から１５．５〜１９．０分に移動した。ＨＡＣＡが反応混合物中により多く存在するにしたがって、クロマトグラムに残る遊離のＩＦＸ−Ｆｌは少なくなり、形成される免疫複合体は多くなる。図１２は、ＨＡＣＡの添加により引き起こされる蛍光ピーク移動の用量応答曲線を示している。ＨＡＣＡ陽性試料を使用して、血清の１対１０００希釈度でのピーク移動を検出することができた。
[0244]図１３は、高分子量複合体の移動度シフトのせいによる遊離のＴＮＦα−ＦｌからのＩＦＸ結合ＴＮＦα−Ｆｌ複合体の分離を示している。パネルｃ及びｄに見られるように、蛍光ピークの保持時間は２４分から１３〜１９．５分に移動した。ＩＦＸが反応混合物中により多く存在するにしたがって、クロマトグラムに残る遊離のＴＮＦα−Ｆｌは少なくなり、形成される免疫複合体は多くなる。図１４は、ＩＦＸの添加により引き起こされるＴＮＦα−Ｆｌピークシフトの用量応答曲線を示している。添加されたＩＦＸに基づいて、検出限界は血清中１０ｎｇ／ｍＬのＩＦＸである。
[0245]本発明の新規の移動度シフトアッセイは、架橋アッセイにより測定されたＨＡＣＡ陽性及び陰性患者由来の血清試料を試験することにより検証された（表４）。このアッセイを使用して、５０件の健康な対象及びＩＦＸを用いて処置された１１７件のＩＢＤ患者由来の血清試料を解析した。５０件の健康な対象試料すべてが検出限界を下回るＩＦＸレベルを有しており、６５件の患者試料は平均ＩＦＸ濃度１１．０μｇ／ｍｌを有している。表５は、架橋アッセイ及び移動度シフトアッセイにより測定された健康な対照とＩＦＸを用いて処置されたＩＢＤ患者の血清中のＨＡＣＡレベルを示している。架橋アッセイは移動度シフトアッセイよりも検出したＨＡＣＡ陽性患者は少なく、偽陰性は多く並びに偽陽性も多かった。
Figure 0006063398
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[0246]図１５は、ＩＦＸ処置の進行中のＩＢＤ患者におけるＨＡＣＡレベルとＩＦＸ濃度の関係を示している。ＨＡＣＡは、ＩＦＸ処置中一部の患者では早くもＶ１０（３０週）で検出することができ、増加し続けた。図１６は、本発明のアッセイを使用してＩＦＸの存在下でＨＡＣＡを検出することが可能であることを示している。血清中のさらに高いレベルのＨＡＣＡは、検出することができたさらに低いレベルのＩＦＸと関連していた（たとえば、生物有用性を減少させた）。したがって、ＩＦＸを用いた処置中のＨＡＣＡの初期の検出は内科医及び／又は患者が他の抗ＴＮＦ薬に切り替える又はＩＦＸの用量を増加するよう導くことができる。
[0247]前記アッセイは、アッセイ内及びアッセイ間精度（ＣＶパラメータに基づく）並びに干渉薬剤への感受性の点で確認された。この解析は下に提示されている。
Figure 0006063398
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結論
[0248]抗ＴＮＦα生物製剤はフルオロフォア（「Ｆｌ」）で容易に標識することができ、ＨＡＣＡ／ＨＡＨＡを測定するために使用される移動度シフトアッセイフォーマットは、典型的なＥＬＩＳＡのような固体表面への抗原のコーティングも複数の洗浄及びインキュベーションステップもない均一アッセイである。Ｆｌ標識されたＩＦＸとＨＡＣＡ陽性血清とのインキュベーションにより免疫複合体が形成され、ＳＥ−ＨＰＬＣにおいて遊離のＦｌ標識されたＩＦＸと比べて異なる位置に溶出し、したがって、ＨＡＣＡの量を定量することができる。他の血清成分の存在は移動度シフトアッセイにほとんど影響がない。移動度シフトアッセイフォーマットは、ＥＬＩＳＡとは違って、無関係なＩｇＧの非特異的結合により影響を受けることはなく、ＩｇＧ４アイソタイプを検出する。健康な血清試料はＦｌ標識ＩＦＸの移動度シフトを引き起こすことはなく、ＩＦＸを用いて処置された患者の２８．２％は、本発明のアッセイによりＨＡＣＡを有することが分かった。したがって、本明細書に記載されるアッセイフォーマットは、非常に感度がよく、患者血清中のすべての生物製剤（たとえば、レミケード、ヒュミラ、エンブレル及びシムジア）並びにその抗体（たとえば、抗レミケード、抗ヒュミラ、抗エンブレル及び抗シムジア）を検出するのに適用することができる。とりわけ、本発明の移動度シフトアッセイを使用してＩＦＸの存在下でＨＡＣＡを検出することができるので、ＩＦＸを用いた処置中でのＨＡＣＡの初期の検出は、内科医及び／又は患者が他の抗ＴＮＦ薬に切り替える又はその後のＩＦＸの用量を増加するよう導くことができる。
[0249]我々は、ＩＦＸを用いて処置された患者から得られた血清試料中のＩＦＸ及びＨＡＣＡレベルを測定するための新規の非放射性標識液相ＳＥ−ＨＰＬＣアッセイを開発した。前記新規のアッセイは高感度、正確性、精度を有し、その結果は高度に再現性があり、このためにこのアッセイは多数のヒト血清試料の定期検査に適している。新しいアッセイフォーマットは、ＥＬＩＳＡとは違って、固体表面への抗原のコーティングをなくし無関係なＩｇＧの非特異的結合による影響を受けない。本明細書に記載されるアッセイフォーマットのこれらの利点は、試験の偽陰性及び偽陽性結果を減らす。有利なことに、本発明のアッセイフォーマットは非常に感度がよく、患者が治療中に血清中に存在するすべての生物製剤並びにその抗体を検出するのに使用することができる。
実施例４．新規の移動度シフトアッセイを使用する患者血清中の中和と非中和ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）間の区別。
[0250]この実施例は、患者試料（たとえば、血清）中の自己抗体（たとえば、ＨＡＣＡ）濃度を測定するための、及びそのような自己抗体が中和自己抗体なのか非中和自己抗体なのかを、蛍光的に標識されたＴＮＦαの存在下で蛍光的に標識された抗ＴＮＦα薬へのこれらの自己抗体の結合を検出するサイズ排除クロマトグラフィーを使用して決定するための新規の均一なアッセイを例示している。これらのアッセイは有利である。なぜならば、低親和性ＨＡＣＡを取り除く洗浄ステップの必要性をなくし、バックグランド及び血清干渉問題を減少させる可視及び／又はＩＲスペクトル上での検出を可能にする別個のフルオロフォアを使用し、蛍光標識検出の高感度のため力価が低い患者における中和又は非中和ＨＡＣＡを検出する能力を増加させ、液相反応として起こり、それによってＥＬＩＳＡプレートなどの固体表面への結合によるエピトープのいかなる変化の可能性も減少させるからである。
[0251]一例となる実施形態では、抗ＴＮＦα薬（たとえば、レミケード（商標））はフルオロフォア「Ｆ１」（たとえば、図１７Ａ参照）で標識され、前記フルオロフォアは可視及びＩＲスペクトル上のどちらか又は両方で検出することが可能である。同様に、ＴＮＦαはフルオロフォア「Ｆ２」（たとえば、図１７Ａ参照）で標識され、前記フルオロフォアも可視及びＩＲスペクトル上のどちらか又は両方で検出することが可能であり、「Ｆ１」と「Ｆ２」は異なるフルオロフォアである。標識された抗ＴＮＦα薬は液相反応においてヒト血清と一緒にインキュベートされ、標識されたＴＮＦαは反応に添加されて、標識された抗ＴＮＦα薬、標識されたＴＮＦα、及び／又は血清中に存在するＨＡＣＡ間で複合体（すなわち、免疫複合体）を形成させる。インキュベーションに続いて、試料はサイズ排除カラム上に直接負荷される。自己抗体（たとえば、ＨＡＣＡ）と標識されたＴＮＦαが標識された抗ＴＮＦα薬に結合すれば、自己抗体と標識された抗ＴＮＦα薬（たとえば、図１７Ａにおける「免疫複合体２」）間の二元複合体、標識された薬剤単独、又は標識されたＴＮＦα単独と比べてピーク（たとえば、図１７Ａにおける「免疫複合体１」）の左側への移動が生じる。自己抗体（たとえば、ＨＡＣＡ）、標識されたＴＮＦα、及び標識された抗ＴＮＦα薬のこの三元複合体が存在すれば、血清試料中に存在する自己抗体は非中和型の自己抗体（たとえば、ＨＡＣＡ）であることが示され、前記自己抗体は抗ＴＮＦα抗体とＴＮＦα間の結合に干渉しない。特定の一実施形態では、図１７Ａに示されるように、非中和ＨＡＣＡが血清中に存在すれば、移動はＦ１−レミケード（商標）とＦ２−ＴＮＦαの両方で観察されることになり、免疫複合体１と免疫複合体２のピークは増加し、遊離のＦ１−レミケード（商標）と遊離のＦ２−ＴＮＦαのピークは減少する。しかし、自己抗体（たとえば、ＨＡＣＡ）、標識されたＴＮＦαと標識された抗ＴＮＦα薬の三元複合体の非存在下で自己抗体（たとえば、ＨＡＣＡ）と標識された抗ＴＮＦα薬間の二元複合体（たとえば、図１７Ｂにおける「免疫複合体２」）が存在すれば、血清試料中に存在する自己抗体は中和型の自己抗体（たとえば、ＨＡＣＡ）であることが示され、前記自己抗体は抗ＴＮＦα抗体とＴＮＦα間の結合に干渉する。特定の一実施形態では、図１７Ｂに示されるように、中和ＨＡＣＡが血清中に存在すれば、移動はＦ１−レミケード（商標）で観察されることになり、免疫複合体２のピークは増加し、遊離のＦ１−レミケード（商標）のピークは減少し、遊離のＦ２−ＴＮＦαのピークには何の変化もない。ある種の例では、中和ＨＡＣＡが存在すれば、レミケード（商標）を用いた現在の療法はヒュミラ（商標）などの別の抗ＴＮＦα薬に切り替えるほうがよいことが示される。
[0252]代わりの実施形態では、標識された抗ＴＮＦα薬は先ず液相反応においてヒト血清と一緒にインキュベートされて、標識された抗ＴＮＦα薬と血清中に存在するＨＡＣＡ間の複合体（すなわち、免疫複合体）を形成させる。インキュベーションに続いて、試料は第１のサイズ排除カラム上に直接負荷される。自己抗体（たとえば、ＨＡＣＡ）が標識された抗ＴＮＦα薬に結合すれば、標識された薬剤単独と比べてピーク（たとえば、図１８における「免疫複合体２」）の左側への移動が生じる。次に、標識されたＴＮＦαが反応に添加されて、前記ＴＮＦαが自己抗体（たとえば、ＨＡＣＡ）に取って代わって（たとえば、競合して）、標識された抗ＴＮＦα薬に結合し、それによって標識された抗ＴＮＦα薬と標識されたＴＮＦα間の複合体（すなわち、免疫複合体）を形成させることができるかどうかを決定する。インキュベーションに続いて、試料は第２のサイズ排除カラム上に直接負荷される。標識された抗ＴＮＦα薬が標識されたＴＮＦαに結合すれば、標識されたＴＮＦα単独と比べてピーク（たとえば、図１８における「免疫複合体３」）の左側への移動が生じる。標識されたＴＮＦαの添加により自己抗体（たとえば、ＨＡＣＡ）と標識された抗ＴＮＦα薬間の結合が妨げられたら、血清試料中に存在する自己抗体は中和型の自己抗体（たとえば、ＨＡＣＡ）であることが示され、前記自己抗体は抗ＴＮＦα抗体とＴＮＦα間の結合に干渉する。ある種の例では、中和ＨＡＣＡが存在すれば、レミケード（商標）を用いた現在の療法はヒュミラ（商標）などの別の抗ＴＮＦα薬に切り替えるほうがよいことが示される。
実施例５．新規の均一移動度シフトアッセイを使用する患者血清におけるアダリムマブに対するヒト抗薬剤抗体（ＡＤＡ）の解析。
[0253]背景及び目的：インフリキシマブ（ＩＦＸ）、アダリムマブ（ヒュミラ（商標））及びセルトリズマブなどのＴＮＦαに対するモノクローナル抗体は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）及び他の炎症性障害を治療するのに効果的であることが明らかにされている。抗薬剤抗体（ＡＤＡ）は薬効を下げ及び／又は有害作用を誘導することがある。しかし、ＡＤＡは、キメラ抗体インフリキシマブで処置された患者においてだけではなく、ヒト化抗体アダリムマブで処置された患者においても見つかっている。個々の患者においてＡＤＡ及び薬剤レベルをモニターすれば、患者の治療と投薬を最適化するのを補助し得る。我々は、血清において患者由来のＨＡＣＡ（ヒト抗キメラ抗体）とＩＦＸの両方を正確に測定する非放射性標識液相均一移動度シフトアッセイを開発した。このアッセイ法は、ＨＡＣＡを検出するための現在の固相アッセイの大きな限界、すなわち、循環におけるＩＦＸの存在下ではＨＡＣＡを正確に検出することができないことを克服する。本研究では、ヒト化抗体医薬アダリムマブで処置された患者において血清ＡＤＡ及び薬剤レベルを測定するためのこの新しい方法を評価した。
[0254]方法：移動度シフトアッセイは、サイズ排除分離による遊離の抗原対抗原抗体免疫複合体の保持時間の移動に基づいていた。フルオロフォア標識アダリムマブ又はＴＮＦα及び内部標準は血清試料と混合され、ＡＤＡ又は薬剤の存在下で遊離のアダリムマブ及びＴＮＦαの移動度シフトを測定した。遊離のアダリムマブ又はＴＮＦα対内部標準の比の変化は免疫複合体形成の指標となる。ＡＤＡ又はアダリムマブの血清濃度は、異なる濃度の抗ヒトＩｇＧ抗体又は精製されたアダリムマブと一緒にインキュベートすることにより作成された標準曲線を用いて決定された。移動度シフトアッセイを使用して、我々は、アダリムマブを用いて処置され応答しなくなったＩＢＤ患者から収集された血清中のアダリムマブ及びＡＤＡレベルを測定した。
[0255]結果：用量応答曲線は、標識されたアダリムマブの移動度シフトの測定のために抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて作成された。前記アッセイの検出限界は、抗ヒトＩｇＧの１ｎｇであった。５０件の健康な対照由来の血清はＡＤＡについて試験され、試料すべてが検出限界を下回るＡＤＡレベルを有していた（すなわち、遊離の標識されたアダリムマブの移動はなかった）。ＡＤＡの検出は、外因的に添加されたアダリムマブの存在下でも実証された。アダリムマブを用いて処置された患者における薬剤濃度を測定するために、標識されたＴＮＦαの移動度シフトに関して異なる量のアダリムマブを用いて標準曲線を作成し、アダリムマブの検出限界は１０ｎｇであった。
[0256]結論：本発明の非放射性標識液相均一移動度シフトアッセイを適用して、アダリムマブを用いて処置された患者由来の血清試料中のＡＤＡ及びアダリムマブレベルを測定した。前記アッセイは、高感度及び正確度で再現性があることが分かり、前記アッセイを使用してアダリムマブを用いて処置された患者由来の血清試料中のＡＤＡレベルを評価することができる。
実施例６．新規で独自の移動度シフトアッセイを使用する患者血清におけるアダリムマブに対する抗薬剤抗体（ＡＤＡ）の解析。
要約
[0257]背景：インフリキシマブ（ＩＦＸ）及びアダリムマブ（ＡＤＬ）などの抗ＴＮＦα薬は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を治療するのに効果的であることが明らかにされている。しかし、処置を受けている患者におけるＡＤＡの誘発は薬効を下げ及び／又は有害作用を誘導することがある。実際、ＡＤＡは、ＩＦＸで処置された患者においてだけではなく、ＡＤＬで処置された患者においても見つかっている。個々の患者においてＡＤＡ及び薬剤レベルをモニターすれば、患者の治療と投薬を最適化するのに役立つことがある。我々は、血清においてＨＡＣＡ（ヒト抗キメラ抗体）とＩＦＸ処置を受けた患者由来のＩＦＸの両方を正確に測定する独自の移動度シフトアッセイを開発した。このアッセイは、ＨＡＣＡを検出するための現在の固相アッセイの大きな限界、すなわち、循環におけるＩＦＸの存在下ではＨＡＣＡを正確に検出することができないことを克服する。本研究では、完全ヒト抗体医薬ＡＤＬで処置された患者において血清ＡＤＡ及び薬剤レベルを測定するためのこの新しいアッセイを評価した。
[0258]方法：移動度シフトアッセイは、サイズ排除クロマトグラフィーによる抗原抗体免疫複合体対遊離の抗原の保持時間の移動に基づいていた。フルオロフォア標識ＡＤＬ又はＴＮＦα及び内部標準は血清試料と混合され、ＡＤＡ又は薬剤の存在下で標識されたＡＤＬ及びＴＮＦαの移動度シフトを測定した。遊離のＡＤＬ又はＴＮＦα対内部標準の比の変化は免疫複合体形成の指標となる。ＡＤＡ又はＡＤＬの血清濃度は、異なる濃度の抗ヒトＩｇＧ抗体又は精製されたＡＤＬと一緒にインキュベートすることにより作成された標準曲線を用いて決定された。このアッセイを使用して、我々は、ＡＤＬを用いて処置されたＩＢＤ患者から収集された血清中のＡＤＬ及びＡＤＡレベルを測定した。
[0259]結果：用量応答曲線は、標識されたＡＤＬの移動度シフトの測定のために抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて作成された。前記アッセイの検出限界は、抗ヒトＩｇＧの１０ｎｇであった。１００件の健康な対照由来の血清はＡＤＡについて試験され、試料すべてが検出限界を下回るＡＤＡレベルを有していた（遊離の標識されたＡＤＬの移動はなかった）。ＡＤＡの検出は、ＡＤＬを用いて処置された１１４件のＩＢＤ患者試料から５件において実証された。ＡＤＬを用いて処置された患者における薬剤濃度を測定するために、標識されたＴＮＦαのシフトに関して異なる量のＡＤＬを用いて検出限界１０ｎｇで、標準曲線を作成した。
[0260]結論：我々の独自の非放射性標識液相均一移動度シフトアッセイを適用して、ＡＤＬを用いて処置された患者由来の血清中のＡＤＡ及びＡＤＬレベルを測定した。前記アッセイは、高感度及び正確度で再現性があり、前記アッセイはＡＤＬを用いて処置された患者由来の血清試料中のＡＤＡレベルを評価するのに有用である。
序論
[0261]インフリキシマブ（ＩＦＸ）、エタネルセプト、アダリムマブ（ＡＤＬ）及びセルトリズマブペゴールなどの抗腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）生物製剤は、クローン病（ＣＤ）及び関節リウマチ（ＲＡ）を含むいくつかの自己免疫疾患における疾患活動度を減少させることが明らかにされている。しかし、一部の患者は抗ＴＮＦα療法に応答せず、他の患者は十分な応答の欠如のため、より高用量若しくはより高頻度の投薬を必要とし、さもないと注入反応を発症する。
[0262]患者に薬剤に対する抗体を作らせる治療抗体の免疫原性は、治療及び注入反応の失敗の一因となることがある。ＩＦＸのようなキメラ抗体は、ＡＤＬなどの完全ヒト化抗体と比べて抗体産生を誘導する高い潜在力を有する。ＲＡ患者におけるＩＦＸに対する抗体（ＨＡＣＡ）の保有率は１２％〜４４％のばらつきがあり、患者血清中のＩＦＸのレベル及び治療応答に反比例するように思われる。完全ヒト化ＡＤＬはマウス又はキメラ抗体ほど免疫原性ではないと考えられるが、いくつかの研究では、ヒト抗ヒト化抗体（ＨＡＨＡ）の形成が報告されており、ＲＡ及びＣＤ患者において１％〜８７％の抗体産生の保有率が明らかにされている（Ａｉｋａｗａら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ Ａｎｔｉ−ＴＮＦ−ａｌｐｈａ ａｇｅｎｔｓ ｉｎ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｒｅｖ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３８（２〜３）：８２〜９頁（２０１０））。
[0263]１つの抗ＴＮＦα薬に対する二次応答しなかった多くの患者は、別の抗ＴＮＦα薬に切り替える又は投薬量及び／若しくは投与回数を増やすことから利益を得ることがある。したがって、薬剤及び抗薬剤抗体（ＡＤＡ）レベルについての患者のモニタリングは、薬剤投与を個々の患者に合わせて行うことができることを目的に是認される。このアプローチは、是認された場合は用量調整を、又はＡＤＡレベルが存在する場合には薬物療法の停止を可能にする（Ｂｅｎｄｔｚｅｎら、Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ：ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、４４（７）：７７４〜８１頁（２００９）；Ａｆｉｆら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｔｉｌｉｔｙ ｏｆ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ−ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、１０５（５）：１１３３〜９頁（２０１０））。
[0264]ＨＡＣＡ及びＨＡＨＡを測定するいくつかのアッセイが開発されている。現在の方法論の限界の１つは、ＡＤＡレベルは循環中に高レベルの薬剤が存在する場合には信頼して測定することができないことである。
[0265]我々は、血清中の薬剤の存在により影響されることのないＡＤＬを用いて処置された患者由来の血清中のＡＤＡ及びＡＤＬレベルを測定する独自の非放射性標識液相移動度シフトアッセイを開発した。
方法
[0266]フルオロフォア（Ｆｌ）標識されたＡＤＬは患者血清と一緒にインキュベートされて免疫複合体を形成した。Ｆｌ標識された小ペプチドは、それぞれの反応に内部標準として含まれた。異なる量の抗ヒトＩｇＧを使用して、血清ＡＤＡレベルを決定するための標準曲線を作成した。遊離のＦｌ標識されたＡＤＬは、サイズ排除クロマトグラフィーによりその分子量に基づいて抗体結合複合体から分離された。それぞれの試料由来の遊離のＦｌ標識されたＡＤＬ対内部標準の比を使用して、標準曲線からＨＡＨＡ濃度を外挿した。類似の方法論を使用して、Ｆｌ標識されたＴＮＦαを用いて患者血清試料中のＡＤＬレベルを測定した。
結果
[0267]図１９は、高分子量複合体の移動度シフトによる遊離のＦｌ−ＡＤＬからの抗ヒトＩｇＧ結合Ｆｌ−ＡＤＬ複合体の分離を示している。パネルｃからｈに見られるように、蛍光ピークの保持時間は１０．１分から７．３〜９．５分に移動した。反応混合物に添加される抗ヒトＩｇＧが多くなるにしたがって、クロマトグラムに残る遊離のＡＤＬは少なくなり、形成される免疫複合体は多くなる（ｈからｃ）。内部標準の保持時間は１３．５分である。
[0268]図２０は、抗ヒトＩｇＧの添加により引き起こされる蛍光ピーク移動の用量応答曲線を示している。抗ヒトＩｇＧの濃度を増やすと、免疫複合体の形成のため遊離のＡＤＬ対内部標準の比は減少する。アッセイ感度は抗ヒトＩｇＧの１０ｎｇ／ｍｌである。内部標準「Ｆｌ−ＢｉｏＣｙｔ」は、緑色蛍光アレクサフルオル（登録商標）４８８フルオロフォアとビオチン及びアルデヒド固定性第一級アミン（リジン）を組み合わせたアレクサフルオル（登録商標）４８８ビオシチン（ＢｉｏＣｙｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に相当する。
[0269]図２１は、高分子量複合体の移動度シフトによる遊離のＴＮＦα−ＦｌからのＡＤＬ結合ＴＮＦα−Ｆｌ複合体の分離を示している。パネルｃ及びｊに見られるように、蛍光ピークの保持時間は１１．９分から６．５〜１０．５分に移動した。反応混合物に添加されるＡＤＬが多くなるにしたがって、クロマトグラムに残る遊離のＴＮＦα−Ｆｌピークは少なくなり、形成される免疫複合体は多くなる。
[0270]図２２は、ＡＤＬの添加により引き起こされるＴＮＦα−Ｆｌピーク移動の用量応答曲線を示している。添加されたＡＤＬに基づいて、検出限界は血清中ＡＤＬの１０ｎｇ／ｍＬである。
[0271]表６は、１００件の健康な対象及びＡＤＬを用いて処置された１１４件のＩＢＤ患者由来の血清試料が、本発明の移動度シフトアッセイを使用してＡＤＡ及びＡＤＬレベルについて解析されたことを示している。１００件の健康な対象試料すべてが検出限界を下回るＡＤＡレベルを有し（遊離のＦｌ−ＡＤＬの移動はなかった）、１１４件の患者試料から５件が０．０１２〜＞２０μｇ／ｍｌのＡＤＡ濃度を有していた。１００件の健康な対象試料におけるＡＤＬレベルの平均は０．７６±１．０μｇ／ｍｌ（範囲０から９．４μｇ／ｍｌ）であった。ＡＤＬを用いて処置された患者由来の１１４件の血清試料におけるＡＤＬレベルの平均は、１０．８±１７．８μｇ／ｍｌ（範囲０〜１３９μｇ／ｍｌ）であった。５件のＡＤＡ陽性試料からの４件のＡＤＬのレベルは検出不能であった。
Figure 0006063398
結論
[0272]ＨＡＣＡ／ＩＦＸを測定するために使用される移動度シフトアッセイフォーマットは、固体表面への抗原のコーティングのない及び典型的なＥＬＩＳＡのような複数の洗浄もインキュベーションステップもない均一なアッセイである。このアッセイを適用して、ＡＤＡ及び抗ＴＮＦ薬を測定することができる。アッセイの感度（μｇ／ｍｌ範囲で）は、ＥＬＩＳＡ法（ｍｇ／ｍｌ範囲で）と比べると患者血清を用いたＡＤＡとＡＤＬ測定の両方で高い。健康な対照血清試料はＦｌ標識ＡＤＬの移動度シフトを引き起こさず、ＡＤＬを用いて処置された患者の４．３％がこのアッセイによりＡＤＡを有することが分かった。健康な対照血清試料はＦｌ標識ＴＮＦαの移動度シフトを引き起こし、これはＴＮＦαの可溶性の遊離受容体の存在のせいだった可能性があるが、ＡＤＬを用いて処置された患者におけるＡＤＬの平均ははるかに高かった（１０．８対０．７６ｍｇ／ｍｌ）。患者がＡＤＬ処置を受けている間にＡＤＡが初期検出されＡＤＬ薬剤レベルがモニタリングされると、内科医はＡＤＬの投薬を最適化するか、適切な場合には別の抗ＴＮＦα薬に切り替え、それによって患者疾患の総括管理を最適化することができるようになる。
Figure 0006063398
[0273]健康な対照血清試料はＦｌ標識ＡＤＬの移動度シフトを引き起こさない。予備研究では、０．４μｇ／ｍｌ ＡＤＬを有する患者の９．５２％がこのアッセイではＡＤＡを有することが分かった。
実施例７：レミケード（商標）及びヒト抗薬剤抗体の濃度レベルを決定する。
[0274]この実施例は、血清試料中の抗ＴＮＦα薬、たとえば、レミケード（商標）（インフリキシマブ）のレベルを決定するための並びにヒト抗薬剤抗体、たとえば、レミケード（商標）（インフリキシマブ）に対するヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）のレベルを決定するための方法を説明する。
[0275]ステップ１：試料中のレミケード（商標）（インフリキシマブ）の濃度レベルを決定する。
[0276]一例となる実施形態では、ＴＮＦαはフルオロフォア（たとえば、アレクサ６４７）で標識され、前記フルオロフォアは可視及び蛍光スペクトルのどちらか又は両方により検出することが可能である。標識されたＴＮＦαは液相反応においてヒト血清と一緒にインキュベートされ、血清中に存在する抗ＴＮＦα薬を結合させる。標識されたＴＮＦαは液相反応において既知の量の抗ＴＮＦα薬と一緒にインキュベートされ、標準曲線を作成することも可能である。インキュベーションに続いて、試料はサイズ排除カラム上に直接負荷される。標識されたＴＮＦαに抗ＴＮＦα薬が結合すれば、標識されたＴＮＦα単独と比べてピークは左側へ移動する。次に、血清試料中に存在する抗ＴＮＦα薬の濃度は、標準曲線及び対照と比較することができる。
[0277]患者血清中のレミケード（商標）（インフリキシマブ）レベルのＳＥ−ＨＰＬＣ解析。ヒト組換えＴＮＦαは、製造業者の使用説明書に従って、フルオロフォア、アレクサフルオル（登録商標）４８８で標識された。標識されたＴＮＦαは、室温で１時間、異なる量のレミケード（商標）又は患者血清と一緒にインキュベートされた。１００μＬ容積の試料はＨＰＬＣシステム上でサイズ排除クロマトグラフィーにより解析された。蛍光標識検出を使用して、遊離の標識されたＴＮＦα及び結合した標識されたＴＮＦα免疫複合体をその保持時間に基づいてモニターした。血清レミケード（商標）レベルは標準曲線から計算された。
[0278]以下の式はこのアッセイに関係している。
式Ｉ：標識されたＴＮＦα＋レミケード（商標）→（標識されたＴＮＦα・レミケード（商標））複合体
式ＩＩ：［レミケード（商標）］存在する標識されたＴＮＦαなし＝［（標識されたＴＮＦα・レミケード（商標））複合体］
式ＩＩＩ：［レミケード（商標）］＝［（標識されたＴＮＦα・レミケード（商標））複合体］／［標識されたＴＮＦα］×［標識されたＴＮＦα］
[0279]ステップ１では、既知の量の標識されたＴＮＦαはレミケード（商標）含有血清試料に接触させる。標識されたＴＮＦαとレミケード（商標）は複合体、（標識されたＴＮＦα・レミケード（商標））複合体を形成する、式Ｉ参照。レミケード（商標）のほとんどすべてが標識されたＴＮＦαと複合体を形成することになるので、標識されたＴＮＦαの導入前に存在するレミケード（商標）の濃度は、標識されたＴＮＦα・レミケード（商標）複合体の測定された濃度に等しい、式ＩＩ参照。レミケード（商標）の濃度レベルは、比［（標識ＴＮＦα・レミケード（商標））複合体］／［標識されたＴＮＦα］に［標識されたＴＮＦα］を掛けることにより計算される、式ＩＩＩ参照。比［（標識ＴＮＦα・レミケード（商標））複合体］／［標識されたＴＮＦα］は、サイズ排除ＨＰＬＣからの溶出時間の関数としてのシグナル強度のプロットから、（標識ＴＮＦα・レミケード（商標））複合体ピークの曲線下面積を積分し、この数を前記プロットから標識されたＴＮＦαピークの曲線下面積の得られた積分で割ることにより得られる。［標識されたＴＮＦα］は先験的に分かっている。
[0280]ステップ２：ヒト抗キメラ抗体ＨＡＣＡのレベルを決定する。
[0281]一例となる実施形態では、抗ＴＮＦα薬、たとえば、レミケード（商標）はフルオロフォア、たとえば、アレクサ６４７で標識され、前記フルオロフォアは可視及び蛍光スペクトルのどちらか又は両方により検出することが可能である。標識された抗ＴＮＦα薬は液相反応においてヒト血清と一緒にインキュベートされ、血清中に存在するいかなるＨＡＣＡも結合させる。標識された抗ＴＮＦα薬は液相反応において既知の量の抗ＩｇＧ抗体又はプールされた陽性患者血清と一緒にインキュベートされ、標準曲線を作成することも可能である。インキュベーションに続いて、試料はサイズ排除カラム上に直接負荷される。標識された抗ＴＮＦα薬に自己抗体が結合すれば、標識された薬剤単独と比べてピークは左側へ移動する。次に、血清試料中に存在するＨＡＣＡの濃度は、標準曲線及び対照と比較することができる。
[0282]患者血清中のＨＡＣＡレベルのＳＥ−ＨＰＬＣ解析。精製されたレミケード（商標）はフルオロフォアで標識された。標識されたレミケード（商標）は、室温で１時間、異なる希釈度のプールされたＨＡＣＡ陽性血清又は希釈された患者血清と一緒にインキュベートされた。１００μＬ容積の試料はＨＰＬＣシステム上でサイズ排除クロマトグラフィーにより解析された。蛍光標識検出を使用して、遊離の標識されたレミケード（商標）及び結合した標識されたレミケード（商標）免疫複合体をその保持時間に基づいてモニターした。結合と遊離の標識されたレミケード（商標）の比を使用して、下に記載される通りにＨＡＣＡレベルを決定した。
[0283]血清中のＨＡＣＡを測定するための移動度シフトアッセイ法手順。このアッセイの原理は、複合体の分子量の増加による、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）上での、遊離のアレクサ６４７標識レミケード（商標）に対する抗薬剤抗体、たとえば、ＨＡＣＡとアレクサ６４７標識レミケード（商標）の複合体の移動度シフトに基づいている。前記クロマトグラフィーはＡｇｉｌｅｎｔ−１２００ＨＰＬＣシステム上で実施され、分子量分画範囲５，０００〜７００，０００のＢｉｏ−Ｓｅｐ ３００×７．８ｍｍ ＳＥＣ−３０００カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）及び１×ＰＢＳ、ｐＨ７．３の移動相を流速０．５〜１．０ｍＬ／分で、蛍光標識検出、たとえば、６５０ｎｍでのＵＶ検出を用いて使用した。Ｂｉｏ−Ｓｅｐ ３００×７．８ｍｍ ＳＥＣ−３０００カラム付のＡｇｉｌｅｎｔ−１２００ＨＰＬＣシステムの前には、Ｂｉｏ−Ｓｅｐ ７５×７．８ｍｍ ＳＥＣ−３０００である分析プレカラムがある。１００μＬ試料容積が解析ごとにカラム上に負荷される。ＨＡＣＡと標識されたレミケード（商標）複合体の複合体は、ＳＥ−ＨＰＬＣ解析前に室温で１時間、レミケード（商標）処置患者由来血清と標識されたレミケード（商標）を１×ＰＢＳ、ｐＨ７．３溶出バッファー中でインキュベートすることにより形成される。
[0284]以下の式はこのアッセイに関係している。
式ＩＶ：レミケード（商標）＋標識されたレミケード（商標）＋ＨＡＣＡ→（レミケード（商標）・ＨＡＣＡ）複合体＋（標識されたレミケード（商標）・ＨＡＣＡ）複合体
式Ｖ：［レミケード（商標）］／［レミケード（商標）・ＨＡＣＡ複合体］＝［標識されたレミケード（商標）］／［標識されたレミケード（商標）・ＨＡＣＡ複合体］
式ＶＩ：［ＨＡＣＡ］＝［レミケード（商標）・ＨＡＣＡ］複合体＋［標識されたレミケード（商標）・ＨＡＣＡ］複合体
式ＶＩＩ：［レミケード（商標）・ＨＡＣＡ複合体］＝［レミケード（商標）］×［標識されたレミケード（商標）・ＨＡＣＡ複合体］／［標識されたレミケード（商標）］
式ＶＩＩＩ：［標識されたレミケード（商標）・ＨＡＣＡ複合体］＝［標識されたレミケード（商標）］×［標識されたレミケード（商標）・ＨＡＣＡ複合体］／［標識されたレミケード（商標）］
式ＩＸ：［レミケード（商標）］有効量＝［レミケード（商標）］−［ＨＡＣＡ］
[0285]ヒト抗ＴＮＦα薬抗体、たとえば、ＨＡＣＡの濃度レベルを決定する。既知の濃度の標識されたレミケード（商標）が血清試料に添加される。ＨＡＣＡはレミケード（商標）又は標識されたレミケード（商標）のいずれかと複合体を形成する、式ＩＶ参照。前記［レミケード（商標）］は上のステップ１において決定される。標識されたレミケード（商標）・ＨＡＣＡ複合体の曲線下面積を積分し、この数字を遊離の標識されたレミケード（商標）の曲線下面積について得られる積分で割ることにより、［標識されたレミケード（商標）・ＨＡＣＡ複合体］対［標識されたレミケード（商標）］の比が得られる。［レミケード（商標）］対［レミケード（商標）・ＨＡＣＡ複合体］の比は、［標識されたレミケード（商標）］対［標識されたレミケード（商標）・ＨＡＣＡ複合体］の比に等しい、式Ｖ参照。ＨＡＣＡはレミケード（商標）と標識されたレミケード（商標）の両方と平衡し複合体を形成するので、ＨＡＣＡの総量は、レミケード（商標）・ＨＡＣＡ複合体の量と標識されたレミケード（商標）・ＨＡＣＡ複合体の量の合計に等しい、式ＶＩ参照。［レミケード（商標）］対［レミケード（商標）・ＨＡＣＡ複合体］の比は、［標識されたレミケード（商標）］対［標識されたレミケード（商標）・ＨＡＣＡ複合体］の比に等しいので、［レミケード（商標）−ＨＡＣＡ］複合体と［標識されたレミケード（商標）−ＨＡＣＡ複合体］の両方は、比［標識されたレミケード（商標）・ＨＡＣＡ複合体］／［標識されたレミケード（商標）］に、それぞれステップ１において決定されたレミケード（商標）の濃度量と先験的に分かっている標識されたレミケード（商標）の濃度量を掛けることにより決定される、式ＶＩＩ及びＶＩＩＩ参照。したがって、ＨＡＣＡの総量は、（１）ステップ１からの［レミケード（商標）］掛ける［標識されたレミケード（商標）・ＨＡＣＡ複合体］／［標識されたレミケード（商標）］と（２）先験的に分かっている［標識されたレミケード（商標）］掛ける［標識されたレミケード（商標）・ＨＡＣＡ複合体］／［標識されたレミケード（商標）］の合計に等しい。
[0286]レミケード（商標）の効果的濃度レベルを決定する。ＨＡＣＡはレミケード（商標）と複合体を形成するので、血清試料中で利用できる有効量のレミケード（商標）は、ステップ１から測定されたレミケード（商標）の量−ステップ２から測定されるＨＡＣＡの量である、式ＩＸ参照。
[0287]例となる計算。Ｖ１０上の患者ＪＡＧでは、［レミケード（商標）］は７．５μｇ／ｍｌと決定された、図１６ｃ参照。この結果は、ステップ１に従い式Ｉ〜ＩＩＩを使用することにより得られた。７．５μｇ／ｍｌは３０ｎｇ／４μＬに等しい。４μＬの試料をステップ２での測定で使用したために、合計で３０．０ｎｇのレミケード（商標）が解析された試料中に存在していた。Ｖ１０上の患者ＪＡＧについての比［標識されたレミケード（商標）・ＨＡＣＡ］複合体／［標識されたレミケード（商標）］は０．２５であった、図１６ｂ参照。試料に導入された［標識されたレミケード（商標）］は３７．５ｎｇ／１００μＬであった。１００μＬの標識されたレミケード（商標）をステップ２での測定で使用したために、合計で３７．５ｎｇの標識されたレミケード（商標）が解析された試料中に存在していた。式ＶＩＩを使用して、レミケード（商標）・ＨＡＣＡ複合体の総量は３０ｎｇ掛ける０．２５であり、これは７．５ｎｇの標識されたレミケード（商標）・ＨＡＣＡ複合体に等しい。式ＶＩＩＩを使用して、標識されたレミケード（商標）・ＨＡＣＡ複合体の総量は３７．５ｎｇ掛ける０．２５であり、これは９．４ｎｇの標識されたレミケード（商標）・ＨＡＣＡ複合体に等しい。式ＶＩを使用して、ＨＡＣＡの総量は９．４ｎｇと７．５ｎｇの合計に等しく、これは１６．９ｎｇのＨＡＣＡに等しい。１６．９ｎｇのＨＡＣＡが４μＬの試料中に存在していた。［ＨＡＣＡ］は１６．９ｎｇ／４μＬであり、これは４．２３μｇ／ｍｌに等しい。式ＩＸを使用して、レミケード（商標）の有効量は、ステップ１から決定された７．５μｇ／ｍｌのレミケード（商標）−ステップ２から決定された４．２３μｇ／ｍｌのＨＡＣＡに等しい。この例となる計算では、効果的な［レミケード（商標）］は３．２７μｇ／ｍｌに等しかった。
実施例８：ヒュミラ（商標）及びヒト抗薬剤抗体の濃度レベルを決定する。
[0288]この実施例は、血清試料中のヒュミラ（商標）のレベルを決定するための並びにヒト抗ヒト抗体（ＨＡＨＡ）のレベルを決定するための方法を説明する。
[0289]ステップ１：試料中のヒュミラ（商標）の濃度レベルを決定する。
[0290]一例となる実施形態では、ＴＮＦαはフルオロフォア（たとえば、アレクサ６４７）で標識され、前記フルオロフォアは可視及び蛍光スペクトルのどちらか又は両方により検出することが可能である。標識されたＴＮＦαは液相反応においてヒト血清と一緒にインキュベートされ、血清中に存在する抗ＴＮＦα薬を結合させる。標識されたＴＮＦαは液相反応において既知の量の抗ＴＮＦα薬と一緒にインキュベートされ、標準曲線を作成することも可能である。インキュベーションに続いて、試料はサイズ排除カラム上に直接負荷される。標識されたＴＮＦαに抗ＴＮＦα薬が結合すれば、標識されたＴＮＦα単独と比べてピークは左側へ移動する。次に、血清試料中に存在する抗ＴＮＦα薬の濃度は、標準曲線及び対照と比較することができる。
[0291]患者血清中のヒュミラ（商標）レベルのＳＥ−ＨＰＬＣ解析。ヒト組換えＴＮＦαは、製造業者の使用説明書に従って、フルオロフォア、アレクサフルオル（登録商標）４８８で標識された。標識されたＴＮＦαは、室温で１時間、異なる量のヒュミラ（商標）又は患者血清と一緒にインキュベートされた。１００μＬ容積の試料はＨＰＬＣシステム上でサイズ排除クロマトグラフィーにより解析された。蛍光標識検出を使用して、遊離の標識されたＴＮＦαと結合した標識されたＴＮＦα免疫複合体をその保持時間に基づいてモニターした。血清ヒュミラ（商標）レベルは標準曲線から計算された。
[0292]以下の式はこのアッセイに関係している。
式Ｘ：標識されたＴＮＦα＋ヒュミラ（商標）→（標識されたＴＮＦα・ヒュミラ（商標））複合体
式ＸＩ：［ヒュミラ（商標）］＝［（標識されたＴＮＦα・ヒュミラ）複合体］
式ＸＩＩ：［ヒュミラ（商標）］＝［（標識ＴＮＦα・ヒュミラ（商標））複合体］／［標識されたＴＮＦα］×［標識されたＴＮＦα］
[0293]ステップ１では、既知の量の標識されたＴＮＦαはヒュミラ（商標）含有血清試料に接触させる。標識されたＴＮＦαとヒュミラ（商標）は複合体、（標識されたＴＮＦα・ヒュミラ（商標））複合体を形成する、式Ｘ参照。ヒュミラ（商標）のほとんどすべてが標識されたＴＮＦαと複合体を形成することになるので、標識されたＴＮＦαの導入前に存在する［ヒュミラ（商標）］は、測定された［（標識されたＴＮＦα・ヒュミラ（商標））複合体］に等しい、式ＸＩ参照。［ヒュミラ（商標）］は、比［（標識ＴＮＦα・ヒュミラ（商標））複合体］／［標識されたＴＮＦα］に［標識されたＴＮＦα］を掛けることにより計算される、式ＸＩＩ参照。標識されたＴＮＦαについての曲線下面積及び（標識されたＴＮＦα・ヒュミラ（商標））複合体についての曲線下面積を積分し、（標識されたＴＮＦα・ヒュミラ（商標））複合体について得られた積分を、標識されたＴＮＦαについて得られた積分で割ることにより、［（標識ＴＮＦα・ヒュミラ（商標））複合体］対［標識されたＴＮＦα］の比が得られる。［標識されたＴＮＦα］は先験的に分かっている。
[0294]ステップ２：ヒト抗ヒト抗体、たとえば、ＨＡＨＡのレベルを決定する。一例となる実施形態では、抗ＴＮＦα薬、たとえば、ヒュミラ（商標）はフルオロフォア、たとえば、アレクサ６４７で標識され、前記フルオロフォアは可視及び蛍光スペクトルのどちらか又は両方により検出することが可能である。標識された抗ＴＮＦα薬は液相反応においてヒト血清と一緒にインキュベートされ、血清中に存在するどんなＨＡＨＡも結合させる。標識された抗ＴＮＦα薬は液相反応において既知の量の抗ＩｇＧ抗体又はプールされた陽性患者血清と一緒にインキュベートされ、標準曲線を作成することも可能である。インキュベーションに続いて、試料はサイズ排除カラム上に直接負荷される。標識された抗ＴＮＦα薬に自己抗体が結合すれば、標識された薬剤単独と比べてピークは左側へ移動する。次に、血清試料中に存在するＨＡＨＡの濃度は、標準曲線及び対照と比較することができる。
[0295]患者血清中のＨＡＨＡレベルのＳＥ−ＨＰＬＣ解析。精製されたヒュミラ（商標）は、フルオロフォアで標識された。標識されたヒュミラ（商標）は、室温で１時間、異なる希釈度のプールされたＨＡＨＡ陽性血清又は希釈された患者血清と一緒にインキュベートされた。１００μＬ容積の試料はＨＰＬＣシステム上でサイズ排除クロマトグラフィーにより解析された。蛍光標識検出を使用して、遊離の標識されたヒュミラ（商標）及び結合した標識されたヒュミラ（商標）免疫複合体をその保持時間に基づいてモニターした。結合と遊離の標識されたヒュミラ（商標）の比を使用して、下に記載される通りにＨＡＨＡレベルを決定した。
[0296]血清中のＨＡＨＡを測定するための移動度シフトアッセイ手順。このアッセイの原理は、複合体の分子量の増加による、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）上での、抗体、たとえば、ＨＡＨＡ、結合アレクサ６４７標識ヒュミラ（商標）複合体対遊離のアレクサ６４７標識ヒュミラ（商標）の移動度シフトに基づいている。前記クロマトグラフィーはＡｇｉｌｅｎｔ−１２００ＨＰＬＣシステムで実施され、分子量分画範囲５，０００〜７００，０００のＢｉｏ−Ｓｅｐ ３００×７．８ｍｍ ＳＥＣ−３０００カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）及び１×ＰＢＳ、ｐＨ７．３の移動相を流速０．５〜１．０ｍＬ／分で、蛍光標識検出、たとえば、６５０ｎｍでのＵＶ検出を用いて使用した。Ｂｉｏ−Ｓｅｐ ３００×７．８ｍｍ ＳＥＣ−３０００カラム付のＡｇｉｌｅｎｔ−１２００ＨＰＬＣシステムの前には、Ｂｉｏ−Ｓｅｐ ７５×７．８ｍｍ ＳＥＣ−３０００である分析プレカラムがある。１００μＬ試料容積が解析ごとにカラム上に負荷される。ＨＡＨＡ結合標識されたヒュミラ（商標）複合体は、ＳＥ−ＨＰＬＣ解析前に室温で１時間、ヒュミラ処置患者由来血清と標識されたヒュミラ（商標）を１×ＰＢＳ、ｐＨ７．３溶出バッファー中でインキュベートすることにより形成される。
式ＸＩＩＩ：ヒュミラ（商標）＋標識されたヒュミラ（商標）＋ＨＡＨＡ→（ヒュミラ（商標）・ＨＡＨＡ）複合体＋（標識されたヒュミラ（商標）・ＨＡＨＡ）複合体
式ＸＩＶ：［ヒュミラ（商標）］／［ヒュミラ（商標）・ＨＡＨＡ複合体］＝［標識されたヒュミラ（商標）］／［標識されたヒュミラ（商標）・ＨＡＨＡ複合体］
式ＸＶ：［ＨＡＨＡ］＝［ヒュミラ（商標）・ＨＡＨＡ複合体］＋［標識されたヒュミラ（商標）・ＨＡＨＡ複合体］
式ＸＶＩ：［ヒュミラ（商標）・ＨＡＨＡ複合体］＝［ヒュミラ（商標）］×［標識されたヒュミラ（商標）・ＨＡＨＡ複合体］／［標識されたヒュミラ（商標）］
式ＸＶＩＩ：［標識されたヒュミラ（商標）・ＨＡＨＡ複合体］＝［標識されたヒュミラ（商標）］×［標識されたヒュミラ（商標）・ＨＡＨＡ複合体］／［標識されたヒュミラ（商標）］
式ＸＶＩＩＩ：［ヒュミラ（商標）］有効量＝［ヒュミラ（商標）］−［ＨＡＨＡ］
[0297]ステップ２についての計算。既知の濃度の標識されたヒュミラ（商標）が血清試料に添加される。ＨＡＨＡはヒュミラ（商標）又は標識されたヒュミラ（商標）のいずれかと複合体を形成する、式ＸＩＩＩ参照。前記［ヒュミラ（商標）］は上に記載されるステップ１において決定される。標識されたヒュミラ（商標）・ＨＡＨＡ複合体についての曲線下面積と標識されたヒュミラ（商標）についての曲線下面積を積分し、標識されたヒュミラ（商標）・ＨＡＨＡ複合体について得られた積分を、標識されたヒュミラ（商標）について得られた積分で割ることにより、［標識されたヒュミラ（商標）・ＨＡＨＡ複合体］対［標識されたヒュミラ（商標）］の比が得られる。［ヒュミラ（商標）］対［ヒュミラ（商標）・ＨＡＨＡ複合体］の比は、［標識されたヒュミラ（商標）］対［標識されたヒュミラ（商標）・ＨＡＨＡ複合体］の比に等しい、式ＸＩＶ参照。ＨＡＨＡはヒュミラと標識されたヒュミラ（商標）の両方と平衡し複合体を形成するので、ＨＡＨＡの総量は、ヒュミラ（商標）・ＨＡＨＡ複合体と標識されたヒュミラ（商標）・ＨＡＨＡ複合体の量の合計に等しい、式ＸＶ参照。［ヒュミラ（商標）］対［ヒュミラ（商標）・ＨＡＨＡ複合体］の比は、［標識されたヒュミラ］対［標識されたヒュミラ（商標）・ＨＡＨＡ複合体］の比に等しいので、［ヒュミラ（商標）−ＨＡＨＡ複合体］と［標識されたヒュミラ（商標）−ＨＡＨＡ複合体］の両方の濃度は、比［標識されたヒュミラ・ＨＡＨＡ複合体］／［標識されたヒュミラ］に、それぞれステップ１において決定された［ヒュミラ（商標）］と先験的に分かっている［標識されたヒュミラ（商標）］を掛けることにより決定される、式ＸＶＩ及びＸＶＩＩ参照。ＨＡＨＡはヒュミラ（商標）と複合体を形成するので、血清試料中で利用できるヒュミラ（商標）の有効量は、ステップ１から測定されたヒュミラの量−ステップ２から測定されたＨＡＨＡの量である、式ＸＶＩＩＩ参照。
[0298]例となる計算。患者ＳＬ０３２４６０１３では（図２５参照）、［ヒュミラ（商標）］は１６．９μｇ／ｍｌと決定された、図２５参照。この結果は、ステップ１に従い式Ｘ〜ＸＩＩを使用することにより得られた。１６．９μｇ／ｍｌは６７．６ｎｇ／４μＬに等しい。４μＬの試料をステップ２での測定で使用したために、合計で６７．６ｎｇのヒュミラ（商標）が解析された試料中に存在していた。患者ＳＬ０３２４６０１３についての比［標識されたヒュミラ（商標）・ＨＡＨＡ］複合体／［標識されたヒュミラ（商標）］は０．０５５であった、図２５参照。試料に導入された［標識されたヒュミラ（商標）］は３７．５ｎｇ／１００μＬであった。１００μＬの標識されたヒュミラ（商標）をステップ２での測定で使用したために、合計で３７．５ｎｇの標識されたヒュミラ（商標）が解析された試料中に存在していた。式ＸＶＩを使用して、ヒュミラ（商標）・ＨＡＨＡ複合体の総量は６７．６ｎｇ掛ける０．０５５であり、これは３．７１ｎｇの標識されたヒュミラ（商標）・ＨＡＨＡ複合体に等しい。式ＸＶＩＩを使用して、標識されたヒュミラ（商標）・ＨＡＨＡ複合体の総量は３７．５ｎｇ掛ける０．０５５であり、これは２．０６ｎｇの標識されたヒュミラ（商標）・ＨＡＨＡ複合体に等しい。式ＸＶを使用して、ＨＡＨＡの総量は３．７１ｎｇと２．０６ｎｇの合計に等しく、これは５．７７ｎｇのＨＡＨＡに等しい。５．７７ｎｇのＨＡＨＡが４μＬの試料中に存在していた。［ＨＡＨＡ］は５．７７ｎｇ／４μＬであり、これは１．４４μｇ／ｍｌに等しい。式ＸＶＩＩＩを使用して、ヒュミラ（商標）の有効量は、ステップ１から決定された１６．９９μｇ／ｍｌのヒュミラ（商標）−ステップ２から決定された１．４４μｇ／ｍｌのＨＡＨＡに等しい。この例となる計算では、効果的な［ヒュミラ（商標）］は１５．４６μｇ／ｍｌに等しかった。
実施例９：レミケード（商標）、標識されたレミケード（商標）、ヒュミラ、又は標識されたヒュミラのいずれかとＨＡＣＡ又はＨＡＨＡの複合体の量を決定する。
[0299]この実施例は、内部標準に準拠してレミケード（商標）、標識されたレミケード（商標）、ヒュミラ、又は標識されたヒュミラ（商標）のいずれかとＨＡＣＡ又はＨＡＨＡの複合体の量を決定するための方法を説明する。
[0300]内部標準、たとえば、ビオシチン−アレクサ４８８を使用すれば、血清人工物及び実験ごとの変動を同定し適切に解析することができる。内部標準、たとえば、ビオシチン−アレクサ４８８の量は、解析される１００μＬあたり約５０〜約２００ｐｇである。
[0301]フルオロフォア（Ｆｌ）標識ヒュミラ（商標）は患者血清と一緒にインキュベートされて、免疫複合体を形成した。Ｆｌ標識小ペプチド、たとえば、ビオシチン−アレクサ４８８は、それぞれの反応に内部標準として含まれた。一例では、異なる量の抗ヒトＩｇＧが使用されて、血清ＨＡＨＡレベルを決定する標準曲線を作成した。別の例では、精製されたＨＡＨＡで較正済みの滴定されプールされた陽性患者血清を使用して、血清ＨＡＨＡレベルを決定する標準曲線を作成した。さらに別の例では、実施例７に記載された方法を使用して、血清ＨＡＨＡレベルを決定する標準曲線を作成した。遊離の標識されたヒュミラは、サイズ排除クロマトグラフィーによりその分子量に基づいて抗体結合複合体から分離された。それぞれの試料由来の遊離の標識されたヒュミラ対内部標準の比を使用して、ＨＡＨＡ濃度を標準曲線から外挿した。類似の方法論を使用して、患者血清試料中のヒュミラレベルを、標識されたＴＮＦαで測定した。
[0302]標識された薬剤、すなわち、標識されたレミケード（商標）又は標識されたヒュミラ対内部標準の初期比は１００に等しい。図２３及び２４に描かれているように、標識された薬剤対内部標準の比が９５を下回ると、標識された薬剤は、抗薬剤結合化合物、たとえば、ＨＡＣＡ、ＨＡＨＡと複合体化されていると推測される。［標識された薬剤］対［内部標準］の比は、標識された薬剤についての及び内部標準についての曲線下面積を積分し、次に標識された薬剤について得られた積分を内部標準について得られた積分で割ることにより得られる。
実施例１０：複合体化した抗ＴＮＦα薬対非複合体化抗ＴＮＦα薬の比を決定する。
[0303]複合体化した抗ＴＮＦα薬対非複合体化抗ＴＮＦα薬の比は、複合体化した抗ＴＮＦα薬と非複合体化抗ＴＮＦα薬の両方についての曲線下面積を積分し、次に複合体化した抗ＴＮＦα薬について得られた積分を非複合体化抗ＴＮＦα薬について得られた積分で割ることにより得られる。
[0304]一実施形態では、非複合体化抗ＴＮＦα薬は、試料中に約０ｎｇ〜１００ｎｇのレベルを有するレミケード（商標）である。標識されたレミケード（商標）の量は約３７．５ｎｇである。
[0305]内部標準、たとえば、ビオシチン−アレクサ４８８を使用すれば、血清人工物及び実験ごとの変動を同定し適切に解析することができる。内部標準、たとえば、ビオシチン−アレクサ４８８の量は、解析される１００μＬあたり約５０〜約２００ｐｇである。
[0306]標識された抗ＴＮＦα薬、たとえば、レミケード（商標）、又はヒュミラ（商標）対標識された内部標準の比は、標識された抗ＴＮＦα薬と標識された内部標準の両方についての曲線下面積を積分し、次に標識された抗ＴＮＦα薬について得られた積分を、標識された内部標準について得られた積分で割ることにより得られる。
[0307]比［（標識された抗ＴＮＦα薬・自己抗体）複合体］／［内部標準］は、サイズ排除ＨＰＬＣからの溶出時間の関数としてのシグナル強度のプロットから（標識された抗ＴＮＦα薬・自己抗体）複合体ピークについての曲線下面積を積分し、この数を前記プロットからの内部標準ピークについての曲線下面積の得られた積分で割ることにより得られる。いくつかの実施形態では、標識された抗ＴＮＦα薬は標識されたレミケード（商標）である。いくつかの他の実施形態では、標識された抗ＴＮＦα薬は標識されたヒュミラ（商標）である。
実施例１１：遊離と複合体化した標識されたＴＮＦαの比を決定する。
[0308]この実施例は、内部標準に準拠して標識されたＴＮＦαとレミケード（商標）又はヒュミラ（商標）のいずれかとの複合体の量を決定するための方法を説明する。
[0309]内部標準、たとえば、ビオシチン−アレクサ４８８を使用すれば、血清人工物及び実験ごとの変動を同定し適切に解析することができる。内部標準、たとえば、ビオシチン−アレクサ４８８の量は、解析される１００μＬあたり約１〜約２５ｎｇである。
[0310]一実施形態では、非複合体化標識されたＴＮＦαは、試料中約５０ｎｇ〜１５０ｎｇのレベルを有する。ある種の例では、標識されたＴＮＦαの量は約１００．０ｎｇである。
[0311]フルオロフォア（Ｆｌ）標識されたＴＮＦαは患者血清と一緒にインキュベートされて免疫複合体を形成した。Ｆｌ標識された小ペプチド、たとえば、ビオシチン−アレクサ４８８は、それぞれの反応に内部標準として含まれた。標準曲線は、既知の濃度の精製された抗ＴＮＦα薬にスパイクし、次に曲線から外挿することにより作成され、濃度をμｇ／ｍＬ単位で決定した。
[0312]標識されたＴＮＦα対内部標準の初期比は１００に等しい。標識されたＴＮＦα対内部標準の比が９５を下回ると、標識されたＴＮＦαは抗ＴＮＦα薬、たとえば、レミケード（商標）、ヒュミラ（商標）と複合体化していると推定される。［標識されたＴＮＦα］対［内部標準］の比は、標識されたＴＮＦαについての及び内部標準についての曲線下面積を積分し、次に標識されたＴＮＦαについて得られた積分を内部標準について得られた積分で割ることにより得られる。
実施例１２：抗ＴＮＦα薬及び／又は抗薬剤抗体（ＡＤＡ）レベルを測定することにより抗ＴＮＦα薬療法を最適化する。
[0313]この実施例は、抗ＴＮＦα薬療法を受けている対象由来の試料中の抗ＴＮＦα薬（たとえば、遊離の抗ＴＮＦα治療抗体のレベル）及び／又は抗薬剤抗体（ＡＤＡ）（たとえば、抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体のレベル）の量（たとえば、濃度レベル）を測定することにより、抗ＴＮＦα薬療法を最適化し、抗ＴＮＦα薬療法に伴う毒性を減少させ、及び／又は抗ＴＮＦα薬を用いた治療的処置の有効性をモニターするための方法を説明している。したがって、本実施例に記載される方法は、たとえば、抗ＴＮＦα薬のそれ以降の用量を調整若しくは修正する（たとえば、増加又は減少させる）時期若しくは方法を決定することにより、抗ＴＮＦα薬を（たとえば、増加した、減少した又は同じ用量で）メトトレキサート（ＭＴＸ）若しくはアザチオプリンなどの１つ若しくは複数の免疫抑制剤と組み合わせる時期若しくは方法を決定することにより、及び／又は現在のコースの療法を変える（たとえば、異なる抗ＴＮＦα薬に切り替える）時期若しくは方法を決定することにより処置決定を導くのに有用な情報を提供する。
[0314]説明するだけの目的で、以下のシナリオは、抗ＴＮＦα薬療法を受けている対象由来の試料中の抗ＴＮＦα薬（たとえば、遊離の抗ＴＮＦα治療抗体のレベル）及び／又はＡＤＡ（たとえば、抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体のレベル）のレベルに基づいて、本発明の方法が療法を最適化し、毒性（たとえば、副作用）を最小化又は減少させることを有利に可能にする方法を実例説明する。抗ＴＮＦα薬及びＡＤＡのレベルは、本明細書に記載される新規のアッセイを用いて測定することが可能である。
[0315]シナリオ番号１：高レベルの抗ＴＮＦα薬と低レベルの抗薬剤抗体（ＡＤＡ）。
[0316]薬剤レベル＝１０〜５０ｎｇ／１０μｌ；ＡＤＡレベル＝０．１〜２ｎｇ／１０μｌ。このプロファイルを有する患者試料は、ビジット１０（「Ｖ１０」）での患者ＢＡＢ及びＪＡＡ由来の試料を含む。図１６ｂ参照。
[0317]抗ＴＮＦα薬療法を受けていてこの特定のプロファイルを有する患者は、アザチオプリン（ＡＺＡ）のような免疫抑制薬を抗ＴＮＦα薬（たとえば、インフリキシマブ）と共に用いて処置するほうがよい。
[0318]シナリオ番号２：中レベルの抗ＴＮＦα薬と低レベルのＡＤＡ。
[0319]薬剤レベル＝５〜２０ｎｇ／１０μｌ；ＡＤＡレベル＝０．１〜２ｎｇ／１０μｌ。このプロファイルを有する患者試料は、Ｖ１０での患者ＤＧＯ、ＪＡＧ及びＪＪＨ由来の試料を含む。図１６ｂ参照。
[0320]抗ＴＮＦα薬療法を受けていてこの特定のプロファイルを有する患者は、アザチオプリン（ＡＺＡ）のような免疫抑制薬をさらに高用量の抗ＴＮＦα薬（たとえば、インフリキシマブ）と共に用いて処置するほうがよい。当業者であれば、薬物療法が最適化されるように、現在のコースの療法を調整して得られる適切なさらに高用量又はさらに低用量、たとえば、現在の用量の少なくとも約１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０若しくは１００倍、又は少なくとも約１／１．５、１／２、１／２．５、１／３、１／３．５、１／４、１／４．５、１／５、１／５．５、１／６、１／６．５、１／７、１／７．５、１／８、１／８．５、１／９、１／９．５、１／１０、１／１５、１／２０、１／２５、１／３０、１／３５、１／４０、１／４５、１／５０若しくは１／１００倍であるそれ以降の用量については承知している。
[0321]シナリオ番号３：中レベルの抗ＴＮＦα薬と中レベルのＡＤＡ。
[0322]薬剤レベル＝５〜２０ｎｇ／１０μｌ；ＡＤＡレベル＝０．５〜１０ｎｇ／１０μｌ。このプロファイルを有する患者試料は、ビジット１０（「Ｖ１０」）での患者ＪＭＭ及びビジット１４（「Ｖ１４」）での患者Ｊ−Ｌ由来の試料を含む。図１６ｂ参照。
[0323]抗ＴＮＦα薬療法を受けていてこの特定のプロファイルを有する患者は、異なる薬剤を用いて処置するほうがよい。非限定的例として、インフリキシマブ（ＩＦＸ）療法中で中レベルのＩＦＸ及びＡＤＡ（すなわち、ＨＡＣＡ）を有する患者は、アダリムマブ（ヒュミラ（商標））を用いた療法に切り替えるほうがよい。
[0324]シナリオ番号４：低レベルの抗ＴＮＦα薬と高レベルのＡＤＡ。
[0325]薬剤レベル＝０〜５ｎｇ／１０μｌ；ＡＤＡレベル＝３．０〜５０ｎｇ／１０μｌ。このプロファイルを有する患者試料は、図１６ｂにおけるＶ１４でのすべての患者由来の試料を含む。
[0326]抗ＴＮＦα薬療法を受けていてこの特定のプロファイルを有する患者は、異なる薬剤を用いて処置するほうがよい。非限定的例として、インフリキシマブ（ＩＦＸ）療法中で低レベルのＩＦＸ及び高レベルのＡＤＡ（すなわち、ＨＡＣＡ）を有する患者は、アダリムマブ（ヒュミラ（商標））を用いた療法に切り替えるほうがよい。
実施例１３．ＨＰＬＣ移動度シフトアッセイによる患者血清試料中のヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）の測定。
[0327]この実施例は、患者血清試料中のレミケードに対する抗体のレベルを定量することを目的とする高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）手順を説明する。
[0328]ＨＰＬＣ移動度アッセイの原理は、サイズ排除ＨＰＬＣクロマトグラフィーにおける抗原−抗体免疫複合体対遊離の抗原の保持時間の移動に基づいている。標準、対照及び患者試料は、蛍光標識されたレミケード及び蛍光標識された内部標準の添加に先立って、１時間、酸解離されて、循環しているレミケードの効果を減少させる。次に、すべての反応物は中和され、１時間インキュベートされて免疫複合体の形成を可能にする。サイズ排除カラム上への注入に先立って、すべての反応物は濾過され、保存温度４℃でＨＰＬＣシステム上に負荷される。レミケードに結合しているＨＡＣＡはサイズ排除クロマトグラフィーにより遊離のレミケードから分離される。ＨＡＣＡの量は、遊離の標識されたレミケードピークの面積対標識された内部標準ピークの面積の比により決定される。
[0329]血液は患者から静脈穿刺により収集することができる。以下の追加の材料、クロマソルブ（Ｃｈｒｏｍａｓｏｌｖ）ＨＰＬＣ水；１．２ｍＬのマイクロタイターチューブ；Ｎｕｎｃ９６ウェル試料プレート；１０×ＰＢＳ ｐＨ７．４；レミケード−アレクサフルオル４８８／ビオシチン−アレクサフルオル４８８；１Ｌ無菌フィルターシステム；マルチスクリーンＨＴＳ、ＧＶ９６ウェル濾過プレート；ＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ−Ｓ３０００ガードカラム、７５×７．８ｍｍ；ＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ−Ｓ３０００分析カラム、３００×７．８ｍｍ；０．０５％Ｎａアジド／ＨＰＬＣ水；検出器廃棄物キャピラリー；ＨＰＬＣバイアル；ＨＰＬＣ試料インサート；マルチスクリーンＨＴＳバキュームマニフォールド；Ａｇｉｌｅｎｔ１２００ ＨＰＬＣシステムを用いることができる。
[0330]ＨＰＬＣ移動相（ＰＢＳの１×溶液 ｐＨ７．３±０．１）が調製される。２００ｍＬの１０×ＰＢＳ ｐＨ７．４はメスシリンダー内で１７５０ｍｌのＨＰＬＣ水と組み合わされる。得られた液のｐＨが決定され、１Ｎ ＨＣｌを用いて調整される。総容積はＨＰＬＣ水で２０００ｍＬまで増やされる。得られた液は０．２２μＭ膜で濾過される。ＨＰＬＣシステム用のＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ−Ｓ３０００ガードカラム及びＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ−Ｓ３０００分析カラムが使用される。ＵＶ検出器は、２８０ｎｍ及び２１０ｎｍで記録するように設定される。
[0331]標準、対照及び患者試料が調製される。標準、対照及び患者血清試料が希釈される。血清試料、標準及び対照は氷上、０．５ｍＬウェルドＮｕｎｃ９６ウェルプレートで調製される。血清試料を最初に、続いて０．５Ｍクエン酸 ｐＨ３．０、最後にＨＰＬＣ水を添加するのがよい。標準、対照及び試料は、プレート振盪器上、室温で１時間インキュベートされ、試料の完全な解離を可能にする。プレートはインキュベーション中ホイルで覆われる。レミケード−アレクサフルオル４８８／ビオシチン−アレクサフルオル４８８が添加される。指定容積のＨＰＬＣ水中レミケード−アレクサフルオル４８８／ビオシチン−アレクサフルオル４８８が調製される。６μＬのＨＰＬＣ水が適切なウェルに添加される。レミケード−アレクサフルオル４８８／ビオシチン−アレクサフルオル４８８が適切なウェルに添加される。
[0332]アスコルビン酸又は酢酸を含むがこれらに限定されない他の有機酸が、このアッセイで使用するのに適していることもある。
[0333]試料を中和する。指定容積の１０×ＰＢＳ ｐＨ７．４が適切なウェルに添加される。試料はピペットを６回上下させることにより混合される。標準、対照及び試料は、プレート振盪器上、室温で１時間インキュベートされ、免疫複合体の完全な形成を可能にする。プレートはインキュベーション中ホイルで覆われる。インキュベートされた混合物は、直ちにＨＰＬＣバイアルに移さない場合は４℃冷蔵庫に移される。
[0334]カラム標準は新しい試料プレートで調製され、１５μＬのカラム標準及び２８５μＬの移動相が同じ所与のウェルに添加される。標準、対照及び試料は、２％血清まで希釈される。指定容積のそれぞれの標準、対照及び試料は新しい試料プレートの適切なウェル中に移される。同じ試料プレートに、調製されたカラム標準が添加される。指定容積の１０×ＰＢＳ ｐＨ７．４が適切なウェルに添加される。指定容積のＨＰＬＣ水が適切なウェルに添加される。試料はピペットを６回上下させることにより混合される。試料は０．２μｍのマルチスクリーン濾過プレートで濾過される。収集プレートは濾過プレート下に加えられる。２９５μＬの試料は濾過プレートのそれぞれの位置に移される。付着した濾過プレートは試料及び収集プレートと一緒にバキュームマニフォールドに加えられる。試料は収集プレート内に濾過される。標準、対照及び試料はＨＰＬＣバイアル内に移される。
[0335]ピペットを使用して、２５０μＬの標準、対照及び試料をラベルを貼ったＨＰＬＣインサートバイアル中に移す。標準、対照及び試料はＨＰＬＣ上に負荷される。ＨＰＬＣパラメータは以下を含んでいてもよい。すなわち、注入量：１００μＬ；流速：１．０ｍＬ／分の溶出バッファーＡ；停止時間：２０分；ポスト時間：オフ；最小圧力：０バール；最大圧力：４００バール；サーモスタット：オフ；ＤＡＤパラメータは２１０ｎｍ及び２８０ｎｍと４ｎｍ及びリファレンスオフ；ピーク幅（応答時間）：＞０．１分（２ｓ）；スリット：４ｎｍ；ＦＬＤパラメータ 励起：４９４ｎｍ、発光：５１９ｎｍ；１バイアルあたり１注入；試料ごとに１００μｌ注入量である。
実施例１４．ＨＡＣＡ酸解離アッセイ。
[0336]図２６に示されるように、酸解離ステップは、成分種の濃度レベルを測定するのに先立って複合体化した種の適切な平衡化を可能にする。高薬剤レベルは、ＨＡＣＡなどの抗薬剤抗体の検出に干渉することがある。図２６に表されるように、酸解離ステップは、標識された薬剤「Ａ」又は非標識薬剤「Ｃ」のどちらかと抗薬剤抗体ＨＡＣＡ「Ｂ」の複合体の平衡化を可能にする。酸を導入してＢＣ複合体を解離させたのち、高レベルのＡを添加してもよい。後で、試料は希釈されてもよく、「ＡＢ」の濃度が測定されてもよい。酸解離ステップの後の「ＢＣ」の濃度は、「Ａ」及び「Ｂ」の既知の又は測定された量に基づいて計算することができる。図２７及び図２８は、それぞれ、酸解離ステップありの及びなしの対数患者血清百分率の関数としての、遊離の標識されたインフリキシマブのパーセントを示している。
[0337]以下の材料、レミケード−アレクサ４８８／ビオシチン−アレクサ４８８；正常ヒト血清；ＨＡＣＡ陽性対照（ＨＰＣ）；カラム標準；１０×ＰＢＳ；１×ＰＢＳ ｐＨ７．３；マルチスクリーン濾過プレート；試料プレート；１Ｎ ＨＣｌ；０．５Ｍクエン酸をこのアッセイで用いることができる。ＮＨＳにおけるＨＰＣ滴定が調製される。２倍の段階希釈は、３５μｌの試料を３５μｌのＮＨＳに移すことにより調製される。以下の溶液はこの実施例で使用するために調製することができる。
溶液１：９０μｌの２５％ＨＰＣ／７５％ＮＨＳ
溶液２：９０μｌの１２．５％ＨＰＣ／８７．５％ＮＨＳ
溶液３：９０μｌの６．２５％ＨＰＣ／９３．７５％ＮＨＳ
試料は、本明細書に記載される解析前、解析中、及び解析後、氷上で保存しておいてよい。
[0338]以下の溶液が調製される。
溶液４：バッファー液
溶液５：カラム標準溶液
溶液６：２％ＮＨＳ
溶液７：２％ＮＨＳ＋３７．５レミケード−アレクサ４８８／ビオシチン−アレクサ４８８
[0339]９６ウェル試料プレートにおいて、これらの溶液に血清試料、クエン酸、ＨＰＬＣ水が添加される。血清試料がそれぞれのウェルに添加される。０．５Ｍクエン酸 ｐＨ３．０がそれぞれのウェルに添加される。ＨＰＬＣ水がそれぞれのウェルに添加される。
[0340]以下のものを含む一連の試料が調製される。
溶液８：バッファー
溶液９：１５μＬカラム標準及び２８５μＬ １×ＰＢＳ ｐＨ７．３
溶液１０：２％ＮＨＳ
溶液１１：２％ＮＨＳ＋３７．５レミケード−アレクサ４８８／ビオシチン−アレクサ４８８
溶液１２：２％ＨＰＣ＋０％ＮＨＳ＋３７．５レミケード−アレクサ４８８／ビオシチン−アレクサ４８８
溶液１３：１％ＨＰＣ＋１％ＮＨＳ＋３７．５レミケード−アレクサ４８８／ビオシチン−アレクサ４８８
溶液１４：０．５％ＨＰＣ＋１．５％ＮＨＳ＋３７．５レミケード−アレクサ４８８／ビオシチン−アレクサ４８８
溶液１５：０．２５％ＨＰＣ＋１．７５％ＮＨＳ＋３７．５レミケード−アレクサ４８８／ビオシチン−アレクサ４８８
溶液１６：０．１２５％ＨＰＣ＋１．８７５％ＮＨＳ＋３７．５レミケード−アレクサ４８８／ビオシチン−アレクサ４８８
溶液１７：０．０６３％ＨＰＣ＋１．９３７％ＮＨＳ＋３７．５レミケード−アレクサ４８８／ビオシチン−アレクサ４８８
溶液１８：０．０３１％ＨＰＣ＋１．９６９％ＮＨＳ＋３７．５レミケード−アレクサ４８８／ビオシチン−アレクサ４８８
溶液１９：０．０１６％ＨＰＣ＋１．９８４％ＮＨＳ＋３７．５レミケード−アレクサ４８８／ビオシチン−アレクサ４８８
溶液２０：２％ＨＰＣ＋０％ＮＨＳ＋３７．５レミケード−アレクサ４８８／ビオシチン−アレクサ４８８
溶液２１：高対照
溶液２２：中対照
溶液２３：低対照
溶液２４：２％ＮＨＳ
溶液２５：２％ＮＨＳ＋３７．５レミケード−アレクサ４８８／ビオシチン−アレクサ４８８
すべての試料は、５．５μＬ ０．５Ｍ ｐＨ３クエン酸及び１０．９μＬ ＨＰＬＣ水を添加された。
[0341]４５０μＬの０．０７４ｍｇ／ｍＬレミケード−アレクサ４８８／ビオシチン−アレクサ４８８が調製される。６μＬのＨＰＬＣ水が３つの別々のウェルに添加される。６μＬの０．０７４ｍｇ／ｍＬレミケード−アレクサフルオル４８８／ビオシチン−アレクサフルオル４８８が残っているウェルに添加される。
[0342]試料を中和する。２７．６μＬの１０×ＰＢＳ ｐＨ７．３がウェルのうちの１つを除いてすべてのウェルに添加される。試料はピペットを６回上下させることにより混合される。試料は、プレート振盪器上、暗所で、室温で１時間インキュベートされる。１５μＬのカラム標準が、２７．６μＬの１０×ＰＢＳ ｐＨ７．３が添加されていないウェルに添加される。２８５μＬの１×ＰＢＳ ｐＨ７．３が、２７．６μＬの１０×ＰＢＳ ｐＨ７．３が添加されていないウェルに添加される。試料は２％血清まで希釈される。
[0343]１８．４μＬのそれぞれの試料は新しい試料プレートの対応するウェルに移される。標準が作製されたのと同じ試料プレートを使用して、２２．６μＬの１０×ＰＢＳが、２７．６μＬの１０×ＰＢＳ ｐＨ７．３が添加されていないウェルを除いてすべてのウェルに添加される。２５４μＬのＨＰＬＣ水が、２７．６μＬの１０×ＰＢＳ ｐＨ７．３が添加されていないウェルを除いてすべてのウェルに添加される。試料はピペットを上下させることにより混合される。２９５μＬの標準、対照及び試料は９６ウェル濾過プレートに移される。ピペットを使用して、２５０μＬの標準、対照及び試料がＨＰＬＣインサートバイアル内に移される。
実施例１５．抗ＴＮＦα療法を用いて再発した患者の患者症例１。
[0344]最初の試験では、血清中のＨＡＣＡは示されず、急速に消えていくＩＦＸレベルが示された。ＩＦＸの半減期は４６．９時間と計算された。ＩＦＸの用量及び回数は増加された。前記患者は応答した。時間の関数としてのＩＦＸのレベルの図示について図２９を参照されたい。
[0345]３か月後、患者は再発し、患者は再試験されてＨＡＣＡは低く、検出可能なＩＦＸはないことが分かった。試験されたサイトカインはすべて正常範囲内であった。
Figure 0006063398
[0346]提案された処置はアザチオプリンであり、代わりの抗ＴＮＦ薬療法に切り替えてもよい。さらに、患者のモニタリングを継続して、他の抗薬剤抗体（ＡＤＡ）が形成されているかどうかを調べる。
実施例１６．抗ＴＮＦα療法を用いて再発した患者の患者症例２。
[0347]最初の試験に続く４か月、８日の間隔を開けて収集された２件の試料が試験された。ＨＡＣＡレベルは高くＩＦＸレベルは検出可能ではなかった。推奨されるのは、患者は代わりの抗ＴＮＦ療法に切り替えるほうがよいことである。
Figure 0006063398
実施例１７．抗ＴＮＦα療法を用いて再発した患者の患者症例３。
[0348]ＩＦＸ濃度は、標識されたＴＮＦαに対する異なる濃度のＩＦＸの反応により作成された標準曲線を用いて計算された。１１日目由来の試料は１対２５希釈度で３．８μｇ／ｍｌであった（少なくとも３半減期）。時間の関数としてのインフリキシマブの血清レベルの図示について、図３０を参照されたい。時間の関数としてのＴＮＦαの血清レベルの図示について、図３１を参照されたい。推奨される処置は、ＩＦＸを免疫抑制薬と組み合わせる、又は代わりの抗ＴＮＦ薬に切り替えてもよい。
実施例１８．抗ＴＮＦα療法を用いて再発した患者の患者症例４。
[0349]患者は、高ＨＡＣＡであり、ＩＦＸは検出可能ではないことが分かった。ＴＮＦαレベルは上昇し、試験された他のサイトカインはすべて正常範囲内であった。提案される処置は、代わりの抗ＴＮＦ療法への切り替えである。
Figure 0006063398
[0350]図３２は、患者症例１（Ａ）；患者症例２（Ｂ、Ｃ）；及び患者症例４（Ｄ）についてのＦｌ標識されたＩＦＸの移動度シフトプロファイルを示している。
実施例１９．抗ＴＮＦα療法を用いて再発した患者の患者症例５。
[0351]患者は、低ＨＡＣＡであり、ＩＦＸレベルは検出可能ではないことが分かった。ＴＮＦαレベルは非常に高く、試験された他のサイトカインレベルはすべて正常範囲内であった。提案される療法は、ＩＦＸの用量若しくは投薬回数を増やす又は代わりの抗ＴＮＦ薬への切り替えと免疫抑制薬の追加である。さらに、提案される療法は、患者のモニタリングを継続して、ＨＡＣＡ／ＡＤＡレベルが増加しているかどうかを調べることである。
Figure 0006063398
実施例２０．抗ＴＮＦα療法を用いて再発した患者の患者症例６。
[0352]患者は、中ＨＡＣＡレベル及び低ＩＦＸレベルであることが分かった。ＩＬ−１β及びＩＬ−６レベルは非常に高かった。ＩＦＮ−γはわずかに上昇し、ＴＮＦαは正常範囲内であった。提案される処置は、異なる抗ＴＮＦα薬への又は異なる機序を標的にする薬剤（たとえば、アクテムラ（トシリズマブ）などのＩＬ−６受容体阻害モノクローナル抗体）を用いた療法への切り替えと免疫抑制薬の追加である。
Figure 0006063398
実施例２１．抗ＴＮＦα療法を用いて再発した患者の患者症例７。
[0353]患者は、低ＨＡＣＡレベルであることが分かった。低レベルのＩＦＸが検出された。ＩＦＮ−γレベルは高く、試験された他のサイトカインレベルはすべて正常範囲内であった。提案される処置は、ＩＦＸの用量を増やす又は異なる機序を標的にする薬剤（たとえば、フォントリズマブなどの抗ＩＮＦγ抗体）を用いた療法への切り替えである。代わりに、提案される処置は、免疫抑制薬を追加することでもよい。
Figure 0006063398
[0354]図３３は、患者症例５（Ａ）；患者症例６（Ｂ、Ｃ）；及び患者症例７（Ｄ、Ｅ）についてのＦｌ標識されたＩＦＸの移動度シフトプロファイルを示している。
実施例２２．異なる患者血清群におけるサイトカインレベル。
[0355]この実施例は、正常対照、インフリキシマブ処置ＵＣ、ヒュミラ処置ＣＤ及びＨＡＣＡ陽性血清試料におけるＩＦＮγ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＴＮＦαなどの、しかしこれらに限定されないサイトカインのレベルを説明する。図３４に示されるように、ＨＡＣＡ陽性患者血清は、典型的には、試験されたすべてのサイトカイン（たとえば、ＩＦＮγ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６及びＴＮＦα）のレベルが高くなっていた。ＩＦＸに対する自己抗体（すなわち、ＨＡＣＡ）及び高レベルのサイトカインの存在に基づいて、これらの患者は代わりの抗ＴＮＦ薬に切り替えたほうがよく、免疫抑制薬と組み合わせてもよい。
実施例２３：酸解離アッセイによるＨＡＣＡ標準の定量。
[0356]この実施例は、一定量のレミケード（商標）−アレクサフルオル４８８及び変化する量の非標識レミケード（商標）を用いて実施例１４に記載される酸解離アッセイを使用する標準試料中のＨＡＣＡの定量を説明する。特に、２５Ｕ／ｍＬ〜１００Ｕ／ｍＬに及ぶＨＡＣＡ濃度は、数桁にわたる非標識レミケード（商標）の存在下で決定することが可能である。低濃度標準（２５Ｕ／ｍＬ）、中濃度標準（５０Ｕ／ｍＬ）、及び高濃度標準（１００Ｕ／ｍＬ）におけるＨＡＣＡの決定のためのデータは、それぞれ表８、９、及び１０に提示されている。それぞれの試料中の非標識レミケード（商標）の濃度は、実施例１に記載される移動度シフトアッセイを使用して決定された。酸解離及び平衡化に続いて、所与の試料中の得られたＨＡＣＡ／レミケード（商標）−アレクサフルオル４８８複合体はＳＥ−ＨＰＬＣにより決定され、総ＨＡＣＡは実施例７に提示される計算に従って計算された。それぞれの解析におけるＨＡＣＡの回復のパーセント（標準における既知濃度のＨＡＣＡに基づいて）が提示される。
Figure 0006063398
Figure 0006063398
Figure 0006063398
実施例２４：抗ＴＮＦ薬療法のための新しいパラダイム。
[0357]抗ＴＮＦ薬療法のための既存のパラダイムは、患者試料において決定される薬剤レベル及びＨＡＣＡレベルに基づいており、以下の表１１に概要が述べられている。
Figure 0006063398
[0358]しかし、このパラダイムは、ＨＡＣＡ判定保留患者における薬剤レベルの高い変動性により混乱する。
[0359]本発明の治療パラダイムは、１つ又は複数のバイオマーカーのアルゴリズムベースの解析から導かれる疾患活動度／重症度指標を利用して、抗ＴＮＦ薬を用いた、療法の選択、療法の最適化、毒性の減少、治療的処置の有効性のモニター、又はこれらの組合せを行う。ある種の態様では、この新しいパラダイムに基づいて講じられる措置は、以下の表１２において様々な説明に役立つシナリオについての概要である。
Figure 0006063398
[0360]中範囲ＨＡＣＡレベルの患者に対する治療措置に続いて疾患活動度の変化をモニターすることが可能であることは注目される。ある種の例では、高ＨＡＣＡレベルは、その状態の免疫学的性質のため、他のパラメータにもかかわらず、療法の変化を引き起こすことがある。
実施例２５：組織試料における低レベルのレミケードの検出。
[0361]関節リウマチ（ＲＡ）に罹った患者は、治療の進行中に１００ｎｇ／ｍＬ未満のレミケードに応答することが明らかにされている。患者血清中でレミケードの存在を検出し、ＥＬＩＳＡフォーマットに関する問題の多くを回避する、本明細書で議論されているレミケードＨＰＬＣ移動度シフトアッセイが開発されている。ある種の態様では、本発明のアッセイについての現在の定量の下限（ＬＬＯＱ）は約０．４９μｇ／ｍＬであり、ほとんどの患者の解析が可能である。我々の現在の調査では、蛍光検出器の様々なパラメータを調整することにより（発光波長を５２５ｎｍに切り替え、ＰＭＴＧａｉｎを１６まで増加させる）、レミケードＨＰＬＣ移動度シフトアッセイは、血清中のわずか５０ｎｇ／ｍＬのレミケードを定量的に検出することが可能であり、再現性も高いことが示されている。実際、このレベルの感度であれば、わずかな（＜１０ｍｇ）組織試料中でのレミケードレベルの解析は可能である。組織内のレミケードの検出により、炎症部位へ到達したレミケードの量についての我々の知見は増強され、薬剤の薬物動態及び機序的な詳細に関するさらに多くの情報がもたらされる。
方法
[0362]患者組織由来のタンパク質の単離は全細胞抽出により実現される。１〜１０ｍｇ切片の組織はチューブ内に置かれ、次に低温環境において凍結される。その後、低温試料はＣｏｖａｒｉｓ ＣｒｙｏＰｒｅｐ機械的組織破壊器を使用してホモジナイズされる。粉砕後、試料は、哺乳動物プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ）を含有する約３００μＬの抽出バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．２５％デオキシコール酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を含有するチューブに移される。次に、試料は直ちにＣｒｙｏＰｒｅｐ機器の超音波部に移されて、超音波処理によりさらに破壊される。次に、試料は氷上で４５分間インキュベートされて、細胞成分を完全に解離させる。抽出物は４℃で１５分間、高速で遠心分離される。上清はアリコートされ、−８０℃で凍結される。タンパク質濃度はＬｏｗｒｙタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して定量される。２００μＬアリコートは解凍され、次に５．０ｎｇの蛍光的に標識された組換えＴＮＦα（ＴＮＦ−アレクサ４８８）が添加される。室温で１時間のインキュベーション後、溶液は平衡状態になり、増加していく分子量の様々なＴＮＦ−アレクサ４８８／レミケード複合体が形成されている。濾過後、試料はＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ＢｉｏＳｅｐ Ｓ−３０００ ＨＰＬＣサイズ排除カラム上に注入される。このリアルタイム液相アッセイは、形成された複合体のサイズに基づいて、遊離のＴＮＦからレミケード−ＴＮＦ複合体を分離する。
[0363]現在の定量の下限は大多数の患者に適しているが、ＲＡ患者において使用するためには感度を上げる必要性がある（上記参照）。一態様では、前記アッセイは、ＨＰＬＣサイズ排除カラム上への１００μＬ注入液中での２５ｎｇのＴＮＦ−アレクサ４８８の検出に依存している。検出方法としての蛍光の使用は、励起及び発光波長の最適化並びに光電子倍増管（ＰＭＴ）のゲインを増やす能力に柔軟性を与える。レミケードアッセイの確認のために使用される現在の設定は、
ＦＬＤλＥｘ＝４９４、λＥｍ＝５１９
ＰＭＴＧａｉｎ＝１２
である。これらの設定は、アレクサフルオル４８８基の公表されている波長並びにＡｇｉｌｅｎｔ １２００シリーズＦＬＤの通常ＰＭＴＧａｉｎ設定に基づいて選択された。ＰＭＴＧａｉｎを増加させると、シグナルとノイズが増加するが、ある係数まではシグナルの増加のほうがノイズの増加よりも高い。ゲインからゲインまでのステップは、係数２に等しい。最適化すべき最も重要なパラメータは、励起と発光波長であり、公表されている最大値は有用な出発点であるが、励起は化合物それ自体並びに特定の機器特徴に依存しているために波長を最適化する必要がある場合が多い。
[0364]低量のレミケードを検出した場合、ＴＮＦ−アレクサ４８８とレミケードの複合体を反映する特定のピークが９．２分の保持時間で生じる。一態様では、このピークの高さがバックグランドの少なくとも３倍になり、複数の反復試験にわたるまでの計算された血清濃度が２０％未満の変動係数を有することが重要である。ある種の実施形態では、この特定のレミケード−ＴＮＦアレクサ４８８ピーク対通常のヒト血清バックグランドのシグナル対ノイズが、したがって、前記アッセイの感度を上げるための出発点である。
[0365]感度を上げるために、ＰＭＴＧａｉｎ並びに励起と発光波長は、増幅プロットと等吸光度プロットの結果に基づいて最適化された。レミケードは、それぞれ４９４ｎｍ及び５１９ｎｍの現在の励起及び発光波長を使用して、１２〜１８に及ぶ異なるＰＭＴＧａｉｎレベルでＴＮＦ−アレクサ４８８の希釈物の存在下で滴定された。
[0366]図３５は、標準量のＴＮＦ−アレクサ４８８並びにレミケード−ＴＮＦ複合体を反映するＲｔ＝９．２分での小ピークを示している（上パネル）。ＴＮＦ−アレクサ４８８の量を２．５ｎｇまで減少すると、４％正常ヒト血清からのバックグランドが、遊離のＴＮＦピーク並びにレミケード−ＴＮＦ複合体を反映する９．２分でのピークの分解能に干渉し始めることは明らかである（中間パネル）。ＰＭＴＧａｉｎを１８まで増加すると（下パネル）、シグナルとノイズが等しく増加する（データはすべてのＰＭＴレベルで類似している）。
[0367]正常ヒト血清からのバックグランド蛍光は、現在の設定を使用する低レベルのレミケードの定量に干渉することはデータから明らかである。前記アッセイの感度を上げるために、ＦＬＤ設定の追加の修正が血清バックグランドシグナルを減少させるのには必要である。これを調べるために、等吸光度プロットからの結果に基づいて異なる励起及び発光波長で実験が実施された。等吸光度プロットは、正常ヒト血清、ＴＮＦ−アレクサ４８８、移動相（１×ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ）及び水から取られた。
[0368]図３６は、Ｙ軸にプロットされた励起波長とＸ軸にプロットされた発光波長を示している。正常ヒト血清（上パネル）及びＴＮＦ−アレクサ４８８（下パネル）についてのプロットを比較すると、励起と発光最大値（プロット中のｖ字型領域の頂点）の両方における著しい重複が示されている。発光波長を少なくとも５２５ｎｍまで移動させれば、おそらく、正常血清バックグランドを減少させつつ、ＴＮＦ−アレクサ４８８についての高感度は維持されるであろう。発光波長は５２５ｎｍに設定され、次にＴＮＦ−アレクサ４８８並びに正常ヒト血清バックグランドを調べる実験が繰り返された。ＴＮＦ−アレクサ４８８は、４％ＮＨＳの存在下で注入され、シグナル対ノイズが評価された。
[0369]図３７は、指定された設定を使用するＨＰＬＣによる正常ヒト血清（左パネル）及び２５ｎｇのＴＮＦ−アレクサ４８８（右パネル）の解析を示している。正常ヒト血清からの蛍光のバックグランドレベルは大幅に減少している。血清からのバックグランド蛍光のレベルが減少していることを実証した後、アッセイのシグナル対ノイズが、１２〜１８に及ぶいくつかの異なるＰＭＴＧａｉｎレベルで評価された。下の表１３に提示されている解析の結果により、１６のＰＭＴＧａｉｎが著しい利益を与えることが確証される。
Figure 0006063398
[0370]次に、前記アッセイの感度は、図３８に示されるプロットなどの標準曲線を作成することにより調べられた。注入液あたり２．５ｎｇのＴＮＦ−アレクサ４８８が使用され、レミケードは、５０ｎｇ／ｍＬ〜５．８６μｇ／ｍＬの範囲で滴定されて検出限界を確立した。保持時間９．２でのピークは、シグナル対ノイズの判定として再びモニターされ、３対１のピーク高を繰り返し生じた（ｎ＝２０）最低濃度を使用して、ＬＯＱを計算した。このような解析の結果は、以下の表に提示されている。
Figure 0006063398
[0371]発光波長を５２５ｎｍに移動させ、ＰＭＴｇａｉｎを１６まで増やすことにより、レミケードＨＰＬＣ移動度シフトアッセイは、今や血清中のわずか５０ｎｇ／ｍＬのレミケードを定量的に検出することができ、再現性も高い。さらに最適化すれば、感度をさらに上げ得るが、新しいフォーマットは、非常に低いレミケード血清濃度でも応答を示すＲＡ患者の解析を可能にするほうがよい。低レミケードレベルと患者応答の相関関係、臨床成績、及び関連するバイオマーカーが、さらに個別化された治療へのアプローチのための決定を下す。
実施例２６：移動度シフトアッセイ対ＥＬＩＳＡの臨床研究解析。
[0372]初期研究は、数週間にわたりインフリキシマブを用いて処置された活動性ＣＤ患者（Ｎ＝１１７）及びＵＣ患者（Ｎ＝１０）由来の試料を使用して上記の通りに実施された。移動度シフトアッセイデータはＥＬＩＳＡ結果と比較された。
[0373]図３９に示されるように、両方の方法は試料中のインフリキシマブの決定では相関していた（定量の下方限界よりも上で収集されたデータでは、相関係数＝０．８１２、ｐ＜２．２×１０−１６）。ＥＬＩＳＡによりインフリキシマブ陰性であると判定された試料のうちの６％は、移動度シフトアッセイによりインフリキシマブ陽性であることが示された。移動度シフトアッセイによりインフリキシマブ陰性であると判定された試料のうち、ＥＬＩＳＡによりインフリキシマブ陽性であると判定されたものはなかった。移動度シフトアッセイにより判定された場合、４件のインフリキシマブ陰性試料はＨＡＣＡ陽性であることが分かった。図４０に示されるように、ＥＬＩＳＡと移動度シフトアッセイデータはＨＡＣＡの決定についても相関していた。ＥＬＩＳＡによりＨＡＣＡ陰性と判定された試料のうち３７件が、移動度シフトアッセイによりＨＡＣＡ陽性であることが分かった。
[0374]ＨＡＣＡ陽性試料の週当たりの累積計数は図４１に示されるように時間をかけて作表された。移動度シフトアッセイ（図４１、上トレース）とＥＬＩＳＡ（図４１、下トレース）のデータは６０週間後には収束し始めるが、初期時点では移動度シフトアッセイのほうがＨＡＣＡ陽性検体の高い計数を生じた。フィッシャー直接検定が、様々な時点で収集されたデータに適用された。前記検定により決定されたｐ値は、４６週目、５０週目、及び６６週目でそれぞれ０．０３８１、０．０２４０、及び０．６７９１であった。まとめると、臨床研究では、移動度シフトアッセイがＥＬＩＳＡにおける変動性及び干渉制限を克服していることが示されている。前記技術は、関節リウマチ及び炎症性腸疾患などの病状のための広範囲のタンパク質治療にも適用可能である。治療戦略を立てる際に薬剤レベル及び抗薬剤抗体の正確な検出が決定的に必要であることを考慮すると、移動度シフトアッセイは患者治療のより良好な管理を可能にする。
実施例２７：患者血清中のヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）及びインフリキシマブ（ＩＦＸ）レベルの測定のための新規の均一な移動度シフトアッセイの評価。
[0375]背景：炎症性腸疾患（ＩＢＤ）及び関節リウマチ（ＲＡ）などの炎症性疾患の治療に利用可能である抗体ベースのバイオ療法の一覧表は着実に増加している。しかし、ある種の患者は、薬剤薬物動態の変化、薬効の減少／消滅、及び薬物有害反応を含む広範な結果を引き起こすことがある抗薬剤抗体（ＡＤＡ）を産生する。抗体薬及びＡＤＡレベルについての患者のモニタリングは、医薬品開発過程中にＦＤＡから要求されるだけではなく、これらの薬物を用いた治療中の適切な患者管理のためにも極めて重要である。ＡＤＡ及び薬物レベルの評価には異なる方法が利用可能であり、これには固相免疫アッセイ、放射性免疫沈降法（ＲＩＰＡ）及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が含まれる。しかし、これらの方法には、抗原固定化又は標識化による遮蔽された／変化したエピトープ、種特異性及びアイソタイプ検出を定義することができないこと、低親和性抗体を検出できないこと、専用装置又は放射性標識された試薬の必要性、並びに試料中での低い薬物耐性を含む、多くの不都合が観察される。我々は、ＩＦＸを用いて処置された患者由来の血清中のＨＡＣＡ及び薬物レベルを測定するための非放射性標識液相均一移動度シフトアッセイを開発した。この方法は、ＨＡＣＡ及び薬物レベルを測定するための現在の方法の限界のうちの多くを克服する。
[0376]方法：移動度シフトＨＡＣＡアッセイを実施するため、アレクサ４８８負荷対照を含有するアレクサフルオル４８８（アレクサ４８８）標識されたインフリキシマブ（ＩＦＸ）はＨＡＣＡ陽性血清と一緒にインキュベートされ、平衡状態に達するままにする。平衡後、次に反応混合物はＨＰＬＣカラム上に注入される。遊離のアレクサ４８８−ＩＦＸ及び免疫複合体は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）ＨＰＬＣにより分離され、それぞれの分離されたピークの蛍光強度が蛍光検出器（ＦＬＤ）により測定される。遊離のアレクサ４８８−ＩＦＸピーク面積対アレクサ４８８内部標準ピーク面積の比の変化は、形成された免疫複合体の量を示す。異なる希釈度のＨＡＣＡ陽性血清を使用して標準曲線を作成し、これを非対称を説明する５パラメータロジスティックモデルにフィットさせる。試料中のＨＡＣＡの量は標準曲線から計算される。アレクサ４８８標識されたＴＮＦαを利用してＩＦＸに結合させ、精製されたＩＦＸを標準として使用すること以外は、類似の方法論及び解析を使用して血清中のＩＦＸレベルを測定する。我々は、ＨＡＣＡとＩＦＸアッセイの両方に完全方法確認を実施し、臨床試料試験結果をＥＬＩＳＡ法から得られた結果と比較した。
[0377]結果：移動度シフトＨＡＣＡアッセイの確認により、血清試料における定量の下方限界６．７５Ｕ／ｍｌが明らかにされ、これは３５．４ｎｇ／ｍｌに相当し、この値は産業要件（２５０〜５００ｎｇ／ｍｌ）よりも低い。定量の線形範囲は６．７５〜１５０Ｕ／ｍｌである。アッセイ内及びアッセイ間精度決定により１５％未満の変動係数が得られ、前記アッセイの正確度は２０％以内である。アッセイにおけるＩＦＸ薬物耐性は試験血清において最大１００μｇ／ｍｌである。治療レベルのアザチオプリン（ＡＺＡ）及びメトトレキサート（ＭＴＸ）、リウマトイド因子の存在（７７４ＩＵ／ｍｌ）、正常レベルの免疫グロブリン、ＴＮＦ並びに可溶性ＴＮＦ受容体は前記アッセイにおいては著しい干渉はしない。１００件の薬物未投与健康な対象由来の血清試料が試験されて、６．７５Ｕ／ｍｌ（平均＋１．６５ＳＤ）のカットオフポイントを設定した。架橋ＥＬＩＳＡにより解析された１００件のＨＡＣＡ陽性血清試料も、移動度シフトアッセイにより評価された。全体として、ＨＡＣＡレベルに関して２つの方法間には強い相関関係が存在する（スピアマンのロー＝０．３３７、ｐ＝０．０１９６）。しかし、新しい方法は、架橋ＥＬＩＳＡから２３件の偽陽性試料を同定することができた。類似の結果は、移動度シフトＩＦＸアッセイの確認から得られた。
[0378]結論：これらの研究の結果は、患者血清試料中のＨＡＣＡ及びＩＦＸを測定することでの移動度シフトアッセイの優位性を実証している。この方法を適用して、アダリムマブを用いて処置されている患者などの患者血清試料中の他の生物製剤及びＡＤＡを検出することも可能である。
[0379]前述の発明は理解の明確性を目的にして図解と実施例によりある程度詳細に記載されてきたが、当業者であれば、添付されている特許請求の範囲内である種の変化と修正を実行し得ることは認識するであろう。さらに、本明細書に提供された参考文献のそれぞれが、それぞれの参考文献が個別に参照により組み込まれている場合と同じ程度にその全体が参照により組み込まれている。

Claims (12)

  1. 試料中の抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体の存在又はレベルを、前記試料中の前記抗ＴＮＦα薬からの干渉を受けずに検出するための方法であって、
    （ａ）前記試料を酸に接触させて、前記自己抗体と前記抗ＴＮＦα薬のあらかじめ形成された複合体を解離するステップであり、前記試料が前記抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体を有するか、有すると疑われる試料である、ステップと、
    （ｂ）前記あらかじめ形成された複合体の解離に続いて、前記試料を、標識された抗ＴＮＦα薬に接触させるステップであって、場合により、ステップ（ｂ）が、標識された内部標準を前記試料に接触させるサブステップをさらに含むステップと、
    （ｃ）前記試料中の前記酸を中和して、前記標識された抗ＴＮＦα薬と前記自己抗体の標識された複合体を形成するステップと、
    （ｄ）前記標識された複合体をサイズ排除クロマトグラフィーにかけて、前記標識された複合体を分離するステップと、
    （ｅ）前記標識された複合体を検出し、それによって前記試料中の前記抗ＴＮＦα薬からの干渉を受けずに前記自己抗体の存在又はレベルを検出するステップと
    を含む方法。
  2. 前記試料が０．１Ｍ〜５Ｍの濃度の酸に接触される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記酸が、１つ又は複数の中和剤を前記試料に添加することにより中和される、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記試料が、前記抗ＴＮＦα薬を用いた療法を受けている対象から得られる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記複合体が最初に溶出され、続いて遊離の標識された抗ＴＮＦα薬が溶出される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記抗ＴＮＦα薬が、フルオロフォア又は蛍光色素で標識される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記抗ＴＮＦα薬が、インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムマブ、セルトリズマブペゴール、ゴリムマブ、ＣＮＴＯ１４８及びその組合せから成る群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記抗ＴＮＦα薬に対する自己抗体が、ヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）、ヒト抗ヒト化抗体（ＨＡＨＡ）、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）及びその組合せから成る群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記酸が有機酸、無機酸、又はその混合物を含み、場合により前記有機酸がクエン酸を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記自己抗体の存在又はレベルが、高レベルの前記抗ＴＮＦα薬の存在下で検出され、場合により前記高レベルの前記抗ＴＮＦα薬が１０〜１００μｇ／ｍＬの抗ＴＮＦα薬レベルに相当する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記サイズ排除クロマトグラフィーがサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記試料が血清である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
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