CN114236139A - 一种TNF-α生物制剂的抗体检测试剂盒、制备方法 - Google Patents
一种TNF-α生物制剂的抗体检测试剂盒、制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种TNF‑α生物制剂的抗体检测试剂盒、制备方法，涉及免疫检测技术领域。该试剂盒包括抗体捕获器件和抗体检测器件，抗体捕获器件包括包被有TNF‑α生物制剂的固相载体，抗体检测器件为固定功能性片段的纤维素膜或偶联了功能性片段的结合物；功能性片段为TNF‑α生物制剂的TNF‑α生物制剂的可变区、重链可变区或互补决定区。本发明克服了现有技术中的假阳性和假阴性缺陷。发明人设置小分子量的检测抗原如TNF‑α生物制剂的可变区、重链可变区或互补决定区具有位阻小，容易与抗抗体的Fab结合的优点，使检测灵敏度更高，达到TNF‑α生物制剂药物的伴随诊断目的。由此避免了假阴性的现象出现。
Description
技术领域
本发明涉及免疫检测技术领域，具体而言，涉及一种TNF-α生物制剂的抗体检测试剂盒、制备方法。
背景技术
肿瘤坏死因子α(TNFα)主要是由单核细胞、巨噬细胞等炎症细胞产生的一种细胞因子，最初是基于其诱导某些小鼠肿瘤坏死的能力而得名。后来发现TNFα涉及多种其他人类疾病和病症，包括休克、败血症、感染、自身免疫疾病、类风湿关节炎、克罗恩病、移植排斥和移植物抗宿主疾病的病理生理学。
以TNFα为靶点而设计的生物制剂，包括TNFα的单抗(如Remicade(英夫利昔单抗、人鼠嵌合)、Humira(人源化阿达木单抗)、Cimzia(赛妥珠单抗))。其中Cimzia(赛妥珠单抗，聚乙二醇化的Fab片段)被FDA批准用于治疗类风湿性关节炎、炎症性肠病(IBD)、银屑病和强制性脊柱炎等。尽管临床实践证明此类生物制剂在治疗上述疾病时获得良好的疗效，但不是所有的患者均有效，有些患者一开始就无效(原发性无效)，更多的患者是开始时有效，但在使用多次后产生耐药而无效(继发无效)。进一步的研发发现，继发无效者跟体内产生抗生物制剂药物的抗体有关，因此，检测血液中抗生物制剂的抗体是一项重要的伴随诊断，其中抗英夫利昔单抗的抗体检测被临床指南推荐。
抗TNFα的生物制剂抗体的检测方法主要是通过免疫学反应而进行，包括间接法或双抗原夹心法。专利201180042537.9用治疗性单抗的Fab包被固相载体捕获目标抗体形成的免疫复合物，用标记方法检测免疫复合物的含量，这种方法属于间接法。专利201180060851.X，用治疗性抗体捕获样本中的抗抗体，分子排阻方法区分具体的抗抗体，原理是用全长的单抗捕获后高效液相检测，属于间接法加液相法。对于ELISA、管式化学发光等有洗涤步骤的检测方案中，间接法是高效有效的检测方法。但对于像层析检测缺乏洗涤步骤的检测方案中，间接法由于受样本中存在大量的无关抗体干扰，导致假阳性等检测失真。双抗原夹心法能有效避免样本中无关抗体的干扰。比如专利200780002957.8公布的抗药物抗体的测定中，提到以双抗原桥连免疫测定法，即用药物抗体的混合物作为捕获抗原，并以药物抗体的混合物作为检测抗原。专利201510788470.3，用生物素化的TNFα单抗作为捕获抗原，AP标记的TNFα单抗作为检测抗体，其原理实质是用两个全长单抗形成双抗原夹心。然而现有的双抗原夹心法专利都存在假阴性的问题。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种TNF-α生物制剂的抗体检测试剂盒、制备方法以解决上述技术问题。
发明人创造性地发现，双抗原夹心法技术方案中，导致假阴性结果的根源在于：没有充分考虑到捕获后形成的免疫复合物与检测抗原的结合效率问题，使得即便是阳性样本中的目标抗体与捕获抗原结合形成了免疫复合物，也无法高灵敏度地与检测抗原结合，从而导致后续检测时对于阳性样本检测结果误判(造成假阴性)。
本发明是这样实现的：
本发明提供了一种TNF-α生物制剂的抗体检测试剂盒，其包括抗体捕获器件和抗体检测器件，抗体捕获器件包括固相载体，抗体检测器件为纤维素膜或带有可被检测的标记物的功能性片段；且在固相载体上包被有TNF-α生物制剂，在纤维素膜上固定有不带标记物的功能性片段；功能性片段为TNF-α生物制剂的可变区、重链可变区或互补决定区。
本发明克服了现有技术中的假阳性和假阴性缺陷。用TNFα生物制剂作为捕获抗原，由于空间接触面大，更容易捕获到样本中的抗TNF-α生物制剂的抗体(即抗抗体)，具有捕获效率高的优点。通过在捕获器件上包被TNFα生物制剂，避免了假阳性的发生。
捕获后形成的抗原-抗体复合物本身具有较大的位阻，如果抗体检测器件上包被生物制剂，由于生物制剂(即检测抗原)的分子量较大，则导致检测器件上包被的生物制剂较难与捕获后形成的复合物中抗TNF-α生物制剂的抗体的另一个Fab结合。因此，发明人设置小分子量的检测抗原如TNF-α生物制剂的可变区、重链可变区或互补决定区具有位阻小，容易与抗抗体的Fab结合的优点，使检测灵敏度更高，达到TNF-α生物制剂药物的伴随诊断目的。由此也避免了后续对于样本检测结果的误判，避免了假阴性的现象出现。
在一种可选的实施方式中，上述功能性片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。上述可变区(Fv)的检测抗原为：由重链可变区和轻链可变区通过连接肽或二硫键连接以保持Fv的稳定性的Fv(可变区)。互补决定区包含重链互补决定区中的CDR1、CDR2及CDR3和轻链互补决定区中的CDR1、CDR2及CDR3。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能性片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本发明公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的功能性片段。
上述抗体的功能性片段还可以通过本领域技术人员所知的重组遗传学技术(如基因重组的方法重组表达)或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述TNF-α生物制剂选自TNF-α的单抗药物。
在一种可选的实施方式中，TNF-α的单抗药物选自英夫利昔单抗(Infliximab)、阿达木单抗(Adalimumab)、赛妥珠单抗(Certolizumab Pegol)或戈利木单抗(Golimumab)。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述固相载体选自荧光微球、乳胶微球、树脂微球、磁性微球、胶体金颗粒、量子点、微孔板或微孔膜。上述胶体金即四氯金酸经还原剂还原后得到的胶体溶液。在其他实施方式中，上述胶体金也可以是其他的胶体物质，例如胶体碳、胶体银或胶体硒。
在一种可选的实施方式中，上述量子点为核壳型量子点，如ZnS/CdSe或ZnS/CdTe形成的量子点。根据需要，上述量子点可以调整为单一化合物形成的量子点，如硒化镉(CdSe)、硫化锌(ZnS)、碲化镉(CdTe)、硫化镉(CdS)、硒化锌(ZnSe)、磷化铟(InP)或砷化铟(InAs)，或是CdSe核上包裹一层ZnS或CdS组成的纳米晶或半导体纳米晶等物质中的一种。
在一种可选的实施方式中，固相载体上包被的TNF-α生物制剂上修饰有亲和素或生物素。需要说明的是，在一种可选的实施方式中，也可以根据需要在TNF-α生物制剂上选择不修饰亲和素或生物素。
在一种可选的实施方式中，荧光微球选自时间分辨荧光微球，磁性微球选自磁珠。
在一种可选的实施方式中，固相载体上包被有TNF-α生物制剂全长。用TNFα生物制剂全长作为捕获抗原，由于空间接触面大，更容易捕获到样本中的抗TNF-α生物制剂的抗体(即抗抗体)，具有捕获效率高的优点。通过在捕获器件上包被TNFα生物制剂全长，可以更好地避免假阳性的发生。
在一种可选的实施方式中，时间分辨荧光微球选自时间分辨荧光物质与乳胶或纳米颗粒的结合物，时间分辨荧光物质为镧系元素、镧系元素与乳胶的结合物、镧系元素的螯合物中的一种；镧系元素可以为铕，铽，钐或镝中的任意一种。
可被检测的标记物是指具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或探测到的特性例如发光、显色、放射性等特性的一类物质，通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述可被检测的标记物包括不限于荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂或纳米颗粒类标记物。
在一种可选的实施方式中，荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B(TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)。
在一种可选的实施方式中，催化底物显色的酶包括不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。
在一种可选的实施方式中，放射性同位素包括不限于212Bi、131I、111In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P、94mTc、99mTc、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、121Sn、161Tb、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F。
在一种可选的实施方式中，化学发光试剂包括不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物或过氧草酸盐及其衍生物。
在一种可选的实施方式中，纳米颗粒类标记物包括不限于纳米颗粒和胶体。
在一种可选的实施方式中，胶体包括不限于胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶；在一种可选的实施方式中，胶体金属包括不限于胶体金、胶体银、胶体碳或胶体硒。
在一种可选的实施方式中，纳米颗粒包括不限于有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒或稀土络合物纳米颗粒。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述纤维素膜上还固定有质控抗体作为质控T线，且功能性片段与质控抗体分别间隔设置。
在一种可选的实施方式中，纤维素膜包括不限于醋酸纤维素膜或硝酸纤维素膜。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述英夫利昔单抗的重链可变区和轻链可变区分别如SEQ ID NO.1-2所示，其可变区(Fv)包含通过二硫键连接的重链可变区和轻链可变区。
英夫利昔单抗的互补决定区包括：CDR-VH1、CDR–VH2、CDR–VH3、CDR-VL1、CDR–VL2和CDR–VL3；
CDR-VH1：NHWMN；CDR–VH2：EIRSKSINSATHYAESVKG；CDR–VH3：NYYGSTYDY；
CDR-VL1：RASQFVGSSIH；CDR-VL2：YASESMS；CDR-VL3：QQSHSWPFT。
阿达木单抗的重链可变区和轻链可变区分别如SEQ ID NO.3-4所示，其可变区(Fv)包含通过二硫键连接的重链可变区和轻链可变区。阿达木单抗的互补决定区包括：CDR-VH1、CDR–VH2、CDR–VH3、CDR-VL1、CDR–VL2和CDR–VL3；
CDR-VH1：DYAMH；CDR–VH2：AITWNSGHIDYADSVEG；CDR–VH3：VSYLSTASSLDY；
CDR-VL1：RASQGIRNYLA；CDR-VL2：AASTLQS；CDR-VL3：QRYNRAPYT。
戈利木单抗的重链可变区和轻链可变区分别如SEQ ID NO.5-6所示，其可变区(Fv)包含通过二硫键连接的重链可变区和轻链可变区。戈利木单抗的互补决定区包括：CDR-VH1、CDR–VH2、CDR–VH3、CDR-VL1、CDR–VL2和CDR–VL3；
CDR-VH1：SYAMH；CDR–VH2：FMSYDGSNKKYADSVKG；CDR–VH3：DRGIAAGGNYYYYGMDV；
CDR-VL1：RASQSVYSYLA
CDR-VL2：DASNRAT
CDR-VL3：QQRSNWPPFT。
赛妥珠单抗的重链可变区和轻链可变区分别如SEQ ID NO.7-8所示，其可变区(Fv)包含通过二硫键连接的重链可变区和轻链可变区。赛妥珠单抗的互补决定区包括：CDR-VH1、CDR–VH2、CDR–VH3、CDR-VL1、CDR–VL2和CDR–VL3；
CDR-VH1：DYGMN；CDR–VH2：WINTYIGEPIYADSVKG；CDR–VH3：GYRSYAMDY。
CDR-VL1：KASQNVGTNVA；CDR-VL2：SASFLYS；CDR-VL3：QQYNIYPLT。
需要说明的是，在其他的实施例中，本发明提供的TNF-α生物制剂的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列可以与上述对应重链可变区和轻链可变区可以具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。
本发明还提供了一种TNF-α生物制剂的抗体检测试剂盒的制备方法，其包括：将TNF-α生物制剂固定在固相载体上作为抗体捕获器件，将功能性片段结合或固定在纤维素膜上或者对功能性片段进行标记物标记作为抗体检测器件。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述当固相载体选自微孔板时，在将TNF-α生物制剂固定在微孔板前，还包括将链霉亲和素包被在微孔板上，然后将修饰有生物素的TNF-α生物制剂与包被有链霉亲和素的微孔板进行孵育。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述TNF-α生物制剂的抗体检测试剂盒为定量检测试剂盒或定性检测试剂盒。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述TNF-α生物制剂的抗体检测试剂盒为时间分辨荧光免疫层析检测试剂盒、胶体金免疫层析检测试剂盒、量子点荧光免疫层析检测试剂盒、酶联免疫检测试剂盒或化学发光检测试剂盒。
本发明具有以下有益效果：
本发明克服了现有技术中的假阳性和假阴性缺陷。用TNFα生物制剂作为捕获抗原，由于空间接触面大，更容易捕获到样本中的抗TNF-α生物制剂的抗体(即抗抗体)，具有捕获效率高的优点。通过在捕获器件上包被TNFα生物制剂，避免了假阳性的发生。
捕获后形成的抗原-抗体复合物本身具有较大的位阻，如果抗体检测器件上包被生物制剂，由于生物制剂(即检测抗原)的分子量较大，则导致检测器件上包被的生物制剂较难与捕获后形成的复合物中抗TNF-α生物制剂的抗体的另一个Fab结合。因此，发明人设置小分子量的检测抗原如TNF-α生物制剂的可变区、重链可变区或互补决定区具有位阻小，容易与抗抗体的Fab结合的优点，使检测灵敏度更高，达到TNF-α生物制剂药物的伴随诊断目的。由此也避免了后续对于样本检测结果的误判，避免了假阴性的现象出现。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为是本发明抗英夫利昔抗体时间分辨荧光免疫层析试纸的装置图；
图2是本发明抗阿达木抗体胶体金免疫层析试纸的装置图；
图3是本发明抗戈利木单抗量子点荧光免疫层析试纸的装置图；
图4是本发明抗赛妥珠单抗酶联免疫测定试剂盒检测原理图；
图5是本发明抗戈利木单抗化学发光测定试剂盒检测原理图；
图6是本发明抗英夫利昔抗体时间分辨荧光免疫层析试剂盒校准曲线回归图；
图7是本发明抗阿达木抗体胶体金免疫层析试剂盒校准曲线回归图；
图8是本发明抗戈利木单抗量子点荧光免疫层析试剂盒校准曲线回归图；
图9是本发明抗赛妥珠单抗酶联免疫测定试剂盒校准曲线回归图；
图10是本发明抗戈利木单抗化学发光测定试剂盒校准曲线回归图。
附图标记：1-样品垫；2-结合垫；3-硝酸纤维素膜；4-检测线；5-质控线；6-吸水膜；7-背衬底板。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明的工作原理，1)用TNF-α生物制剂固定固相载体，用于捕获待检样本中的抗抗体，TNF-α生物制剂分子空间作用面大，能高效捕获样本中的抗抗体，形成抗原-抗体复合物；2)用TNF-α生物制剂的可变区、重链可变区或互补决定区作为检测抗原，由于分子小，能有效克服位阻，与抗原-抗体复合物中抗体的另一个Fab结合，形成抗原-抗体-抗原复合物，该复合物用周知的显色方法进行定量或定性检测。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了抗英夫利昔抗体时间分辨荧光免疫层析定量检测试剂盒制备方法。
本实施例提供了一种抗英夫利昔抗体免疫层析试纸，如图1所示，该试纸是在背衬底板7上设置有硝酸纤维素膜3、样品垫1、结合垫2和吸水膜6，样品垫1叠压在结合垫2一端，结合垫2另一端和吸水膜6分别叠压在硝酸纤维素膜3的两端上；该结合垫2上包被有时间分辨荧光微球标记的英夫利昔单抗和时间分辨荧光微球标记的羊抗鸡IgY抗体2；该硝酸纤维素膜3上设有检测线4(T线)和质控线5(C线)，检测线4(T线)包被有英夫利昔的重链可变区，质控线5(C线)包被有鸡IgY抗体。
英夫利昔的重链可变区序列如下：evkleesggglvqpggsmklscvasgfifsnhwmnwvrqspekglewvaeirsksinsathyaesvkgrftisrddsksavylqmtdlrtedtgvyycsrnyygstydywgqgttltvss。
免疫层析试纸的制备方法如下：
1)时间分辨荧光微球的标记
取时间分辨荧光微球500μL(300nm)(1％原液)，13000rpm,4℃离心10min，弃上清。加入10mg/ml的EDC，反应15min；离心，弃上清，加硼酸盐缓冲液(20mM，pH8.0)1000μL，超声10秒混匀；加入标记抗体(英夫利昔单抗或羊抗鸡IgY)120μg(标记浓度120μg/mL)，室温反应2h；离心，弃上清，加入封闭液，反应1h；离心，弃上清，加入1000μL硼酸盐缓冲液，超声混匀，做好标签，4℃保存待用。
2)样品垫、结合垫的处理
聚酯膜用含有表面活性剂的缓冲液(配方：20mM pH 8.0BB，其中含有2％BSA、1％酪蛋白、2％吐温-20、1％S9和5％海藻糖)浸泡进行预封闭，37℃干燥过夜，制备得到结合垫；取制备好的结合垫，以金标HM3035喷金划膜仪，将标记有时间分辨荧光微球的英夫利昔单抗和羊抗鸡IgY抗体混合后，以5μL/cm喷至预处理过宽为1cm的结合垫上，37℃干燥，干燥时间至少3小时，制备得到特异性结合垫。
玻璃纤维素膜用含有表面活性剂的缓冲液(配方：100mM pH 7.4PB，其中含有2％NaCl，2％BSA、0.5％酪蛋白、0.1％吐温-20、0.5％S9和5％蔗糖)浸泡进行预封闭后，37℃干燥过夜，裁切为30*1.5cm制备得到样品垫。
3)硝酸纤维素膜(NC膜)的包被
氨基酸合成方法合成英夫利昔单抗的重链可变区，经验证，用该合成多肽包被酶标板，能与抗英夫利昔单抗抗体反应。
将NC膜贴至背衬底板的指定位置，用50mM的pH 7.4磷酸盐缓冲液将英夫利昔的重链可变区(Hv)稀释至1.5mg/mL，用于制备T线；50mM的pH7.4磷酸盐缓冲液将鸡IgY抗体稀释至0.5mg/mL，用于制备C线；按1μL/cm划液量，通过金标HM3035喷金划膜仪将上述两种稀释后的抗体均匀的划至NC膜上制备T线和C线；将划好的NC膜放置于37℃干燥箱中干燥过夜。
4)组装
将步骤2)结合垫叠压在步骤3)得到的硝酸纤维素膜的一端，并将吸水膜固定叠压在硝酸纤维素膜的另一端，最后将步骤2)得到的样品垫叠压在结合垫另一端，用裁膜仪按每条4mm的宽度进行裁剪，并装入层析条壳体中，即得成品。
5)检测
将血清稀释20倍，取60μL加入加样孔，反应10min后置于荧光读数仪检测。与标准品或参考品的数值比较，判断待检样本中抗抗体的含量。
本实施例之中，时间分辨荧光物质乳胶微球为含铕乳胶微球，即时间分辨荧光物质为镧系元素铕与乳胶的结合物。在其他实施方式中，根据需要，所述时间分辨荧光物质可以调整为镧系元素、镧系元素与乳胶的结合物、镧系元素的螯合物中的一种；镧系元素可以为铕，铽，钐或镝中的一种。
实施例2
本实施例提供了一种抗阿达木抗体胶体金免疫层析测定试剂盒及其制备方法。
本实施例提供的抗阿达木抗体免疫层析试纸如图2所示，该试纸是在背衬底板7上设置有硝酸纤维素膜3、样品垫1、结合垫2和吸水膜6，样品垫1叠压在结合垫2一端，结合垫2另一端和吸水膜6分别叠压在硝酸纤维素膜3的两端上；该结合垫2上包被有胶体金标记的生物素化阿达木单抗和羊抗鸡IgY抗体2；该样品垫1含有链霉亲和素；该硝酸纤维素膜3上设有检测线4(T线)和质控线5(C线)，检测线4(T线)包被有阿达木的可变区(Fv)，质控线5(C线)包被有鸡IgY抗体。
阿达木的可变区(Fv)包含通过二硫键连接的阿达木单抗重链可变区和阿达木单抗轻链可变区，其中阿达木单抗重链可变区序列如下：
evqlvesggglvqpgrslrlscaasgftfddyamhwvrqapgkglewvsaitwnsghidyadsvegrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycakvsylstassldywgqgtlvtvss；
阿达木单抗轻链可变区序列如下：
diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgirnylawyqqkpgkapklliyaastlqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedvatyycqrynrapytfgqgtkveik。
制备方法如下：
1)胶体金的制备
将制备胶体金所用的圆底烧瓶及玻璃试剂瓶洗净，于次强酸洗液中浸泡后，彻底洗净，烘干。取洁净的圆底烧瓶，向其中添加100mL超纯水，加入1mL 1％氯金酸，煮沸。迅速向其中加入2mL 1％柠檬酸钠，待颜色变成紫红色后，继续反应10min，停止加热。冷却后，加超纯水至100mL，4度备用。
2)标记抗体的生物素化
取1mg阿达木单抗置于5mL离心管中，加入50μL 10mg/mL的活化生物素(Sulfo-NHS-LC-Bintin)，补加0.02M PBS至体积为1mL，室温反应1小时，将反应液取出，以0.02MPBS透析过夜。将生物素化阿达木单抗抗体取出，加入0.03％Proclin300防腐，4度备用。
3)胶体金的标记
取10mL制备好的胶体金，加入300μL 0.2M碳酸钾混匀后，加入150μg生物素化阿达木单抗或羊抗鸡IgY反应室温30min，加入1％BSA封闭30min。12000rpm 4℃离心30min，取沉淀以1mL重悬溶液(配方：20mM pH 8.0BB，其中含有2％BSA、2％吐温-20和5％蔗糖)溶解，4度备用。
3)样品垫、结合垫的处理
以金标HM3035喷金划膜仪，将标记胶体金的生物素化阿达木全长和未生物素化的羊抗鸡IgY抗体混合后，以4μL/cm喷至宽为1cm*30cm的玻璃纤维垫上，37℃干燥3小时，制备得到胶体金结合垫。
玻璃纤维素膜用含有链霉亲和素的缓冲液(配方：100mM pH 7.4PB，其中含有1％链霉亲和素，1％BSA、0.5％酪蛋白、0.5％S9和2％蔗糖)浸泡进行预封闭后，37℃干燥过夜，裁切为30*1.5cm制备得到样品垫。
4)硝酸纤维素膜(NC膜)的包被
氨基酸合成方法合成阿达木单抗的可变区，经验证，用该合成多肽包被酶标板，能与抗阿达木单抗抗体反应。
将NC膜贴至背衬底板的指定位置，用50mM的pH 7.4磷酸盐缓冲液将阿达木的可变区(Fv)稀释至1.5mg/mL，用于制备T线；50mM的pH7.4磷酸盐缓冲液将鸡IgY抗体稀释至0.5mg/mL，用于制备C线；按1μL/cm划液量，通过喷金划膜仪将上述两种稀释后的抗体均匀的划至NC膜上制备T线和C线；将划好的NC膜放置于37℃干燥箱中干燥过夜。
5)组装
将步骤2)结合垫叠压在步骤3)得到的硝酸纤维素膜的一端，并将吸水膜固定叠压在硝酸纤维素膜的另一端，最后将步骤2)得到的样品垫叠压在结合垫另一端，用裁膜仪按每条4mm的宽度进行裁剪，并装入层析条壳体中，即得成品。
6)检测
将血清稀释20倍，取60μL加入加样孔，反应10min后置于胶体金读数仪检测。与标准品或参考品的数值比较，判断待检样本中抗抗体的含量。
本实施例之中，所述胶体金，即四氯金酸经还原剂还原后得到的胶体溶液；根据需要，所述标记物可以调整为胶体碳、胶体银、胶体硒中的任意一种。
实施例3
本实施例提供了一种抗戈利木单抗量子点荧光免疫层析测定试剂盒制备方法。
抗戈利木单抗抗体免疫层析试纸如图3所示，该试纸是在背衬底板7上设置有硝酸纤维素膜3、样品垫1、结合垫2和吸水膜6，样品垫1叠压在结合垫2一端，结合垫2另一端和吸水膜6分别叠压在硝酸纤维素膜3的两端上；该结合垫2上包被有量子点标记的戈利木单抗和羊抗鸡IgY抗体；该硝酸纤维素膜3上设有检测线4(T线)和质控线5(C线)，检测线4(T线)包被有戈利木单抗的重链可变区，质控线5(C线)包被有鸡IgY抗体。
戈利木单抗的重链可变区序列如下：sklqvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgfifssyamhwvrqapgnglewvafmsydgsnkkyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycardrgiaaggnyyyygmdvwgqgttvtvss。
制备方法如下：
1)量子点的标记
取市售量子点100μL，13000rpm,4℃离心10min，离心，弃上清，加入MES buffer1000μL，超声混匀，称量20mg EDC和20mg NHS缓慢加入微球混合液中，及时超声混匀，反应15分钟；离心，弃上清，加硼酸盐缓冲液(20mM，pH8.0)，超声混匀；加入标记抗体(戈利木单抗或羊抗鸡IgY)100μg(标记浓度100μg/mL)，室温反应2h；离心，弃上清，加入封闭液，冰水超声混匀，室温反应1h；离心，弃上清，加入1000μL硼酸盐缓冲液(20mM PH8.0)，超声混匀，做好标签，4℃保存待用。
2)样品垫、结合垫的处理
聚酯膜用含有表面活性剂的缓冲液(配方：20mM pH 8.0BB，其中含有2％BSA、2％吐温-20、1％S9和5％海藻糖)浸泡进行预封闭，37℃干燥过夜，制备得到结合垫；取制备好的结合垫，以金标HM3035喷金划膜仪，将标记有量子点的戈利木单抗和羊抗鸡IgY抗体混合后，以4μL/cm喷至预处理过宽为1cm的结合垫上，37℃干燥，干燥时间至少3小时，制备得到特异性结合垫。
玻璃纤维素膜用含有表面活性剂的缓冲液(配方：100mM pH 7.4PB，其中含有1％BSA、0.5％酪蛋白、0.1％吐温-20、0.5％S9和2％蔗糖)浸泡进行预封闭后，37℃干燥过夜，裁切为30*1.5cm制备得到样品垫。
3)硝酸纤维素膜(NC膜)的包被
氨基酸合成方法合成戈利木单抗的重链可变区，经验证，用该合成多肽包被酶标板，能与抗戈利木单抗抗体反应。
将NC膜贴至背衬底板的指定位置，用50mM的pH 7.4磷酸盐缓冲液将戈利木单抗的重链可变区(Hv)稀释至1.5mg/mL，用于制备T线；50mM的pH7.4磷酸盐缓冲液将鸡IgY抗体稀释至0.5mg/mL，用于制备C线；按1μL/cm划液量，通过金标HM3035喷金划膜仪将上述两种稀释后的抗体均匀的划至NC膜上制备T线和C线；将划好的NC膜放置于37℃干燥箱中干燥过夜。
4)组装
将步骤2)结合垫叠压在步骤3)得到的硝酸纤维素膜的一端，并将吸水膜固定叠压在硝酸纤维素膜的另一端，最后将步骤2)得到的样品垫叠压在结合垫另一端，用裁膜仪按每条4mm的宽度进行裁剪，并装入层析条壳体中，即得成品。
5)检测
将血清稀释20倍，取60μL加入加样孔，反应10min后置于荧光读数仪检测。与标准品或参考品的数值比较，判断待检样本中抗抗体的含量。
本实施例之中，所述量子点为核壳型量子点，ZnS/CdSe或ZnS/CdTe形成的量子点。根据需要，所述量子点可以调整为单一化合物形成的量子点，如硒化镉(CdSe)、硫化锌(ZnS)、碲化镉(CdTe)/硫化镉(CdS)等其中的任意一种。
实施例4
本实施例提供了一种抗赛妥珠单抗酶联免疫测定试剂盒制备方法。
抗赛妥珠单抗酶联免疫检测试剂盒包括酶标板、生物素化赛妥珠单抗，抗赛妥珠抗体校准品、抗赛妥珠抗体质控品、酶结合物、清洗液、终止液。所述酶结合物为辣根过氧化物酶(HRP)标记的赛妥珠互补决定区(CDRs)。该酶标板包被有链霉亲和素。
赛妥珠互补决定区(CDRs)包括重链互补决定区和轻链互补决定区。其中重链互补决定区中：CDR-VH1：DYGMN；CDR-VH2：WINTYIGEPIYADSVKG；CDR-VH3：GYRSYAMDY。
轻链互补决定区中：CDR-VL1：KASQNVGTNVA；CDR-VL2：SASFLYS；CDR-VL3：QQYNIYPLT。各互补决定区之间通过连接肽连接，连接肽选自GGGGSGGGGSGGGGS。
制备方法以及检测方法参照图4所示，具体的制备如下：
1)赛妥珠单抗的生物素化
取1mg赛妥珠单抗置于5mL离心管中，加入50μL 10mg/mL的活化生物素(Sulfo-NHS-LC-Bintin)，补加0.02M PBS至体积为1mL，室温反应1小时，将反应液取出，以0.02MPBS透析过夜。将生物素化赛妥珠单抗取出，加入0.03％Proclin300防腐，4度备用。
2)HRP标记赛妥珠互补决定区(CDRs)
氨基酸合成方法合成赛妥珠单抗的互补决定区，经验证，用该合成多肽包被酶标板，能与抗赛妥珠单抗抗体反应。
称取5mg HRP置于5mL离心管中，加入1mL纯水溶解，加入1mL NaIO4溶液(10mg/mL，现用现配)，4度避光反应30min。加入0.02mL乙二醇，室温反应15min。将上述溶液透析后取出。将1mg赛妥珠互补决定区加入上述活化好的溶液中，室温避光反应2小时，加0.2mLNaBH4溶液(5mg/mL，现用现配)，混匀，以0.05M CB透析过夜。将标记好的酶标抗体取出，加入等体积甘油，置于-20℃保存备用。
3)包被酶标板
将CB缓冲液稀释链霉亲和素至1μg/mL，每孔100μL包被微孔板，37℃2h。吸去包被液，用含2％BSA的封闭缓冲液每孔200μL，37℃孵育2小时，拍去封闭液，37度烘干备用。
4)包被生物素化赛妥珠单抗
用中性磷酸盐缓冲液稀释生物素化赛妥珠单抗至1μg/mL，每孔100μL，37℃2h。洗板3次，用含2％BSA的封闭缓冲液每孔200μL，37℃孵育2小时，拍去封闭液，37度烘干备用。
5)把待检血清样本稀释100倍，每孔100μL加入微孔板，37度孵育2小时，洗板4次。
6)加入HRP标记赛妥珠互补决定区(CDRs)，孵育1小时，洗板4次。
7)微孔板中加入HRP酶的底物TMB，孵育15分钟，加入终止液HCL溶液终止显色反应，用450nm波长检测OD值，与标准品或参考品的OD值比较，判断待检样本中抗抗体的含量。
实施例5
本实施例提供了一种抗戈利木单抗抗体化学发光测定试剂盒制备方法。
抗戈利木单抗抗体化学发光检测试剂盒包括生物素化戈利木单抗、抗戈利木单抗抗体校准品、抗戈利木单抗抗体质控品、吖啶酯标记的戈利木重链可变区、磁微粒试剂、激发液和清洗液。
戈利木单抗重链可变区的序列如下：sklqvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgfifssyamhwvrqapgnglewvafmsydgsnkkyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycardrgiaaggnyyyygmdvwg
制备及检测步骤如下：
1)戈利木单抗的生物素化
取1mg戈利木单抗置于5mL离心管中，加入50μL 10mg/mL的活化生物素(Sulfo-NHS-LC-Bintin)，补加0.02M PBS至体积为1mL，室温反应1小时，将反应液取出，以0.02MPBS透析过夜。将生物素化戈利木全长抗体取出，加入0.03％Proclin300防腐，4度备用。
2)吖啶酯标记戈利木重链可变区(Hv)
氨基酸合成方法合成戈利木单抗的重链可变区，经验证，用该合成多肽包被酶标板，能与抗戈利木单抗抗体反应。
取2mg戈利木重链可变区(Hv)，按抗体：吖啶酯＝1:10～50摩尔比加入已活化的吖啶酯，室温反应30min。将反应液以0.05M CB溶液透析后取出，加入等体积甘油，置于-20℃保存备用。
3)检测步骤
本方法利用吖啶酯化学发光免疫分析技术-结合生物素-亲和素磁颗粒分离技术实现抗单抗体检测。其检测原理如图5：将样本(稀释20倍)和链霉亲和素磁微粒(1)及生物素化戈利木单抗(2)混合，得到链霉亲和素磁珠-生物素化戈利木单抗-样本复合物(3)，洗涤后，加入吖啶酯标记的戈利木重链可变区(Hv)进行反应后，形成链霉亲和素磁珠-生物素化戈利木单抗-样本-吖啶酯标记戈利木Hv复合物。加入发光激发液，测定发光强度，与标准品或参考品的数值比较，判断待检样本中抗抗体的含量。
实验例1
本实验例对实施例1提供的试剂盒进行定量检测以检验其性能。
1.1标准曲线制作
1.1.1取抗英夫利昔抗体校准品一套，具体值见表1。
表1
1.1.2检测方法
取校准品60μL，直接加入层析条中样品窗口；10分钟之后，用时间分辨荧光定量分析仪定量检测信号值。
每个校准品检测2次，取T/C值的平均值。具体结果见表2。
表2
1.1.3标准曲线制备
根据上述检测结果，以T/C值为X轴，以浓度值为Y轴，进行线性回归，得到线性方程：y＝77.666x-18.729，R2＝0.9965，曲线见图6。
1.2精密度测试：
1.2.1取制备好的10张层析条，配置一个浓度(100ng/mL)的抗英夫利昔抗体工作校准品；
1.2.2取60μL校准品，直接加入试剂条加样孔中；
1.2.3待校准品层析10min之后，用时间分辨荧光定量分析仪进行检测，根据上述线性方程测得10个试剂条的结果，结果如表3，说明本方法的抗英夫利昔抗体时间分辨荧光免疫层析测定试剂盒精密度良好。
表3
1.3与其他的方法相比：
以英夫利昔单抗标记微球，以英夫利昔单抗包被NC膜为方法2；以英夫利昔fab标记微球，以英夫利昔fab包被NC膜为方法3。三种方法，除标记抗体和包被抗体不同，其他条件相同，三种结果对比如表4。
表4
| 本实施例 | 方法2 | 方法3 | |
| 检出限 | ＜4ng/ml | ＜10ng/ml | ＜20ng/ml |
| 检测范围 | 4-500ng/ml | 10-500ng/ml | 20-400ng/ml |
| 线性R2 | 0.9965 | 0.9892 | 0.9902 |
| 精密度 | 5.53％ | 17.31％ | 14.62％ |
| 非特异背景干扰 | 低 | 高 | 低 |
实验例2
本实验例对实施例2提供的试剂盒进行定量检测以检验其性能。
2.1标准曲线制作
2.1.1取抗阿达木抗体校准品一套，具体值见表5。
表5
2.1.2检测方法
取校准品60μL，直接加入层析条中样品窗口；10分钟之后，用胶体金读数仪检测信号值。每个校准品检测2次，取T/C值的平均值。具体结果见表6。
表6
2.1.3标准曲线制备
根据上述检测结果，以T/C值为X轴，以浓度值为Y轴，进行线性回归，得到线性方程：y＝236.43x-23.977，R2＝0.996，曲线见图7。
2.2精密度测试：
2.2.1取制备好的10张层析条，配置一个浓度(50ng/mL)的抗阿达木抗体工作校准品；
2.2.2取60μL校准品，直接加入试剂条加样孔中；
2.2.3待校准品层析10min之后，用胶体金读数仪进行检测，根据上述线性方程测得10个试剂条的结果，结果如表7，说明本方法的抗阿达木抗体胶体金免疫层析测定试剂盒精密度良好。
表7
2.3与其他的方法相比：
以本实施例为对照，以阿达木单抗标记胶体金，以阿达木单抗包被NC膜为方法2；以阿达木fab标记胶体金，以阿达木fab包被NC膜为方法3。三种方法，除标记抗体和包被抗体不同，其他条件相同，结果对比如表8。
表8
| 本实施例 | 方法2 | 方法3 | |
| 检出限 | ＜5ng/ml | ＜10ng/ml | ＜30ng/ml |
| 检测范围 | 5-500ng/ml | 10-500ng/ml | 30-400ng/ml |
| 线性R2 | 0.996 | 0.9883 | 0.9891 |
| 精密度 | 5.57％ | 16.77％ | 13.36％ |
| 非特异背景干扰 | 低 | 高 | 低 |
实验例3
本实验例对实施例3提供的试剂盒进行定量检测以检验其性能。
3.1标准曲线制作
3.1.1取抗戈利木单抗抗体校准品一套，具体值见表9。
表9
3.1.2检测方法
取校准品60μL，直接加入层析条中样品窗口；10分钟之后，用荧光定量分析仪检测信号值。每个校准品检测2次，取T/C值的平均值。具体结果见表10。
表10
3.1.3标准曲线制备
根据上述检测结果，以T/C值为X轴，以浓度值为Y轴，进行曲线拟合，得到曲线方程：y＝160.29x2+72.168x-0.1583，R2＝0.9993，曲线见图8。
3.2精密度测试：
3.2.1取制备好的10张层析条，配置一个浓度(50ng/mL)的抗戈利木单抗抗体工作校准品；
3.2.2取60μL校准品，直接加入试剂条加样孔中；
3.2.3待校准品层析10min之后，用荧光定量分析仪进行检测，根据上述方程测得10个试剂条的结果，结果如表11，说明本方法的抗戈利木单抗抗体量子点荧光免疫层析测定试剂盒精密度良好。
表11
3.3与其他的方法相比：
以戈利木单抗标记量子点，以戈利木单抗包被NC膜为方法2；以戈利木单抗fab标记量子点，以戈利木单抗fab包被NC膜为方法3。三种方法，除标记抗体和包被抗体不同，其他条件相同，三种结果对比如表12。
表12
| 本实施例 | 方法2 | 方法3 | |
| 检出限 | ＜5ng/ml | ＜10ng/ml | ＜20ng/ml |
| 检测范围 | 5-500ng/ml | 10-500ng/ml | 20-200ng/ml |
| 线性R2 | 0.9993 | 0.9862 | 0.9911 |
| 精密度 | 5.91％ | 15.67％ | 12.76％ |
| 非特异背景干扰 | 低 | 高 | 低 |
实验例4
本实验例对实施例4提供的试剂盒进行定量检测以检验其性能。
4.1检测方法
4.1.1取抗赛妥珠抗体校准品一套，具体值见表13。
表13
4.1.2检测步骤
1)将校准品及质控品，每孔100μL加入微孔板，37度孵育2h，洗板4次。
2)加入HRP标记赛妥珠单抗的互补决定区，孵育1h，洗板4次。
3)微孔板中加入HRP酶的底物TMB，孵育15min，加入终止液终止显色反应，用450nm波长检测OD值，判断试剂盒性能。具体结果见表14。
表14
检测数值如下表：
4.1.3标准曲线
根据上述检测结果，以OD值为X轴，以浓度值为Y轴，进行曲线拟合，得到曲线方程：y＝39.02x2+74.984x-6.4689，R2＝0.9982，曲线见图9。
4.2精密度测试：
根据检测的精密度质控品的OD值，以曲线方程进行计算结果值，结果如表15，说明本方法的抗赛妥珠抗体酶联免疫测定试剂盒精密度良好。
表15
4.3与其他的方法相比：
以赛妥珠单抗标记HRP，以赛妥珠单抗包被微孔板为方法2；以赛妥珠fab标记HRP，以赛妥珠fab包被微孔板为方法3。三种方法，除标记抗体和包被抗体不同，其他条件相同，三种结果对比如表16。
表16
| 本实施例 | 方法2 | 方法3 | |
| 检出限 | ＜5ng/ml | ＜20ng/ml | ＜20ng/ml |
| 检测范围 | 5-500ng/ml | 20-500ng/ml | 20-200ng/ml |
| 线性R2 | 0.9982 | 0.9833 | 0.9796 |
| 精密度 | 2.9％ | 13.41％ | 11.17％ |
| 非特异背景干扰 | 低 | 高 | 低 |
实验例5
本实验例对实施例5提供的试剂盒进行定量检测以检验其性能。
5.1检测方法
5.1.1取抗戈利木单抗抗体校准品一套，具体值见表17。
表17
5.1.2检测步骤
1)分别取20μL校准品、20μL链霉亲和素磁微粒、50μL生物素化戈利木单抗加入微孔中混合，37度孵育15min，清洗3次。
2)加入吖啶酯标记戈利木重链可变区(Hv)，37度孵育15min，清洗3次。
3)加入发光激发液，测定发光强度。具体结果见表18。
表18
5.1.3标准曲线
根据上述检测结果，以浓度值的对数值为X轴，以发光值的对数值为Y轴，进行线性回归，得到线性方程：y＝0.9601x+2.9521，R2＝0.9959，曲线见图10。
5.2精密度测试：
取20μL精密度质控品、20μL链霉亲和素磁微粒、50μL生物素化戈利木单抗加入微孔中混合，37度孵育15min，清洗3次；加入吖啶酯标记戈利木重链可变区(Hv)，37度孵育15min，清洗3次；加入发光激发液，测定发光强度。根据上述曲线方程，计算结果值。结果如表15，说明本方法的抗戈利木抗体化学发光免疫测定试剂盒精密度良好。具体结果见表19。
表19
5.3与其他的方法相比：
以戈利木单抗标记吖啶酯，以戈利木单抗标记生物素为方法2；以戈利木fab标记吖啶酯，以戈利木fab标记生物素为方法3。三种方法，除标记吖啶酯的抗体和标记生物素的抗体不同，其他条件相同，三种结果对比如表20。
表20
| 本实施例 | 方法2 | 方法3 | |
| 检出限 | ＜5ng/ml | ＜10ng/ml | ＜10ng/ml |
| 检测范围 | 5-500ng/ml | 10-500ng/ml | 10-200ng/ml |
| 线性R2 | 0.9959 | 0.9763 | 0.9896 |
| 精密度 | 4.35％ | 11.61％ | 10.16％ |
| 非特异背景干扰 | 低 | 高 | 低 |
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州和锐生物科技有限公司
<120> 一种TNF-α生物制剂的抗体检测试剂盒、制备方法
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn His
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ala
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Thr Asp Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Phe Val Gly Ser Ser
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Met Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Thr Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Trp Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Val Lys
100 105
<210> 3
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 5
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Ser Lys Leu Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
1 5 10 15
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe
20 25 30
Ser Ser Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Ala Phe Met Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Lys Tyr Ala
50 55 60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
65 70 75 80
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Ile Ala Ala Gly Gly Asn Tyr Tyr
100 105 110
Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
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<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Ala Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu
1 5 10 15
Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val
20 25 30
Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
35 40 45
Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
65 70 75 80
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn
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Trp Pro Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Thr
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Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
115
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<213> 人工序列
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
Claims (10)
1.一种TNF-α生物制剂的抗体检测试剂盒，其特征在于，其包括抗体捕获器件和抗体检测器件，所述抗体捕获器件包括固相载体，所述抗体检测器件为纤维素膜或带有可被检测的标记物的功能性片段；且在所述固相载体上包被有TNF-α生物制剂，在所述纤维素膜上固定有不带标记物的所述功能性片段；所述功能性片段TNF-α生物制剂的可变区、重链可变区或互补决定区。
2.根据权利要求1所述的TNF-α生物制剂的抗体检测试剂盒，其特征在于，所述TNF-α生物制剂选自TNF-α的单抗药物；
优选地，所述TNF-α的单抗药物选自英夫利昔单抗(Infliximab)、阿达木单抗(Adalimumab)、赛妥珠单抗(Certolizumab Pegol)或戈利木单抗(Golimumab)。
3.根据权利要求1或2所述的TNF-α生物制剂的抗体检测试剂盒，其特征在于，所述固相载体选自荧光微球、乳胶微球、树脂微球、磁性微球、胶体金颗粒、量子点、微孔板或微孔膜；
优选地，所述固相载体上包被的TNF-α生物制剂上修饰有亲和素或生物素；
优选地，所述荧光微球选自时间分辨荧光微球，所述磁性微球选自磁珠；
优选地，所述固相载体上包被有TNF-α生物制剂全长。
4.根据权利要求1或2所述的TNF-α生物制剂的抗体检测试剂盒，其特征在于，所述可被检测的标记物选自荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂或纳米颗粒类标记物；
优选地，所述荧光染料选自荧光素类染料及其衍生物、罗丹明类染料及其衍生物、Cy系列染料及其衍生物、Alexa系列染料及其衍生物和蛋白类染料及其衍生物；
优选地，所述催化底物显色的酶选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶；
优选地，所述放射性同位素选自212Bi、131I、111In、90Y、186Re、211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P、94mTc、99mTc、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、121Sn、161Tb、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F；
优选地，所述化学发光试剂选自鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物或过氧草酸盐及其衍生物；
优选地，所述纳米颗粒类标记物选自纳米颗粒和胶体；
优选地，所述胶体选自胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶；优选地，所述胶体金属选自胶体金、胶体银、胶体碳或胶体硒；
优选地，所述纳米颗粒选自有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒或稀土络合物纳米颗粒。
5.根据权利要求1或2所述的TNF-α生物制剂的抗体检测试剂盒，其特征在于，所述纤维素膜上还固定有质控抗体作为质控T线，且所述功能性片段与所述质控抗体分别间隔设置；
优选地，所述纤维素膜选自醋酸纤维素膜或硝酸纤维素膜。
6.根据权利要求1或2所述的TNF-α生物制剂的抗体检测试剂盒，其特征在于，所述英夫利昔单抗的重链可变区和轻链可变区分别如SEQ ID NO.1-2所示，其可变区(Fv)包含通过连接肽或二硫键连接的重链可变区和轻链可变区；
所述英夫利昔单抗的互补决定区包括：CDR-VH1、CDR–VH2、CDR–VH3、CDR-VL1、CDR–VL2和CDR–VL3；
CDR-VH1：NHWMN；CDR–VH2：EIRSKSINSATHYAESVKG；CDR–VH3：NYYGSTYDY；
CDR-VL1：RASQFVGSSIH；CDR-VL2：YASESMS；CDR-VL3：QQSHSWPFT；
所述阿达木单抗可变区(Fv)包含通过连接肽或二硫键连接的重链可变区和轻链可变区；所述阿达木单抗的重链可变区和轻链可变区分别如SEQ ID NO.3-4所示，所述阿达木单抗的互补决定区包括：CDR-VH1、CDR–VH2、CDR–VH3、CDR-VL1、CDR–VL2和CDR–VL3；
CDR-VH1：DYAMH；CDR–VH2：AITWNSGHIDYADSVEG；CDR–VH3：VSYLSTASSLDY；CDR-VL1：RASQGIRNYLA；CDR-VL2：AASTLQS；CDR-VL3：QRYNRAPYT；
所述戈利木单抗可变区(Fv)包含通过连接肽或二硫键连接的重链可变区和轻链可变区；所述戈利木单抗的重链可变区和轻链可变区分别如SEQ ID NO.5-6所示，所述戈利木单抗的互补决定区包括：CDR-VH1、CDR–VH2、CDR–VH3、CDR-VL1、CDR–VL2和CDR–VL3；
CDR-VH1：SYAMH；CDR–VH2：FMSYDGSNKKYADSVKG；CDR–VH3：DRGIAAGGNYYYYGMDV；CDR-VL1：RASQSVYSYLA；CDR-VL2：DASNRAT；CDR-VL3：QQRSNWPPFT；
所述赛妥珠单抗可变区(Fv)包含通过连接肽或二硫键连接的重链可变区和轻链可变区；所述赛妥珠单抗的重链可变区和轻链可变区分别如SEQ ID NO.7-8所示，所述赛妥珠单抗的互补决定区包括：CDR-VH1、CDR–VH2、CDR–VH3、CDR-VL1、CDR–VL2和CDR–VL3；
CDR-VH1：DYGMN；CDR–VH2：WINTYIGEPIYADSVKG；CDR–VH3：GYRSYAMDY；CDR-VL1：KASQNVGTNVA；CDR-VL2：SASFLYS；CDR-VL3：QQYNIYPLT。
7.根据权利要求1或2所述的TNF-α生物制剂的抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述TNF-α生物制剂的抗体检测试剂盒为定量检测试剂盒或定性检测试剂盒。
8.根据权利要求1或2所述的TNF-α生物制剂的抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述TNF-α生物制剂的抗体检测试剂盒为时间分辨荧光免疫层析检测试剂盒、胶体金免疫层析检测试剂盒、量子点荧光免疫层析检测试剂盒、酶联免疫检测试剂盒或化学发光检测试剂盒。
9.一种如权利要求1-8任一项所述的TNF-α生物制剂的抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，其包括：将TNF-α生物制剂固定在固相载体上作为抗体捕获器件，将不带标记物的功能性片段结合或固定在纤维素膜上或者对功能性片段进行标记物标记作为抗体检测器件。
10.根据权利要求9所述的TNF-α生物制剂的抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，当所述固相载体选自微孔板时，在将TNF-α生物制剂固定在所述微孔板前，还包括将链霉亲和素包被在所述微孔板上，然后将修饰有生物素的TNF-α生物制剂与包被有链霉亲和素的微孔板进行孵育。
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