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JP5910977B2 - 検出装置及び検出方法 - Google Patents

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Description

本発明は、検出装置及び検出方法に関し、特に生体試料を検出することができる装置に関する。
光学顕微鏡により生きた（活性を有する）タンパク質、核酸などの生体試料の個々の運動を直接的に観察できるようになって以来、主として、光学顕微鏡を用いた測定により、生体試料の分子レベルの機能や活性を検査する方法が採用されている。個々の対象物となる分子を識別するためには、それら分子に蛍光色素、金コロイド又は微小粒子（ポリスチレンビーズ、磁気ビーズなど）の試薬が付加され、光学顕微鏡の分解能では見ることのできない大きさの分子の存在を可視化するといったことが行われる。
ところが、上記方法の場合、大型かつ高価な光学顕微鏡が必要であり、さらに生体試料を直接観察し生体試料の存在をカウントする必要があるので、高速かつ容易に検査をすることができない、という問題があった。
これに対し、生体試料を収容する複数の収容部を有するマイクロチャンバアレイと、当該収容部毎に対応して設けられた画素を有するＣＭＯＳイメージセンサとを備える生体試料の検出装置が開示されている（例えば、非特許文献１）。
Complementary Metal-Oxide-SemiconductorImage Sensor with Microchamber Array for Fluorescent Bead Counting, KiyotakaSasagawa, et al., JAPANESE JOURNAL OF APPLIED PHYSICS, 51 (2012) 02BL01
しかしながら、上記非特許文献１では全ての収容部の開口部は流路で連通しているため、収容部内に収容される生体試料や試薬の濃度が低くなってしまい、測定感度が低下してしまう、という問題があった。
そこで本発明は、高感度に生体試料を検出することができる検出装置及び検出方法を提供することを目的とする。
本発明に係る検出装置は、本体の内部に配置され、生体試料を含む親水性溶媒を充填する複数の収容部を有するマイクロチャンバーアレイと、前記収容部に対応して画素が設けられているイメージセンサとを備える検出装置において、前記本体は、前記収容部の開口部に連通している流通路と、前記流通路に連設されている疎水性溶媒供給部と、前記流通路に対し前記親水性溶媒が出入り可能な貫通穴とを有し、前記マイクロチャンバーアレイは、表面が疎水性を有し、前記疎水性溶媒供給部は外部から加えられた力によって疎水性溶媒を前記流通路に流入させることを特徴とする。
本発明に係る検出方法は、表面が疎水性を有するマイクロチャンバーアレイの複数の収容部に生体試料を含む親水性溶媒を充填する工程と、前記収容部に励起光を照射する工程と、前記試料の蛍光反応を前記収容部毎にイメージセンサで検出する工程とを備え、前記親水性溶媒を充填する工程は、前記収容部の開口部から前記親水性溶媒を流し込む工程と、前記開口部を疎水性溶媒で閉塞する工程とを有することを特徴とする。
本発明によれば、収容部の開口部を疎水性溶媒で封止し収容部に生体試料を含む親水性溶媒を閉じ込めるので、収容部内に収容される生体試料や試薬の濃度の低下を防いで測定感度を向上することができる。
第１実施形態に係る検出装置の全体構成を示す分解斜視図である。 第１実施形態に係る検出装置のイメージセンサ及びマイクロチャンバーアレイの構成を示す平面図であり、図２Ａはイメージセンサの平面図、図２Ｂはマイクロチャンバーアレイの平面図、図２Ｃはイメージセンサにマイクロチャンバーアレイを重ねた状態の平面図である。 第１実施形態に係る検出装置の製造方法を段階的に示す斜視図であり、図３ＡはイメージセンサにＳｉ基板を固定する段階、図３ＢはＳｉ基板上にＡｌ膜及びレジストを形成した段階、図３Ｃはレジストにパターンを形成した段階、図３ＤはＡｌ膜に貫通穴を形成した段階、図３ＥはＳｉ基板に貫通穴を形成した段階、図３Ｆはレジスト及びＡｌ膜を除去した段階を示す図である。 第１実施形態に係る検出装置の製造方法を段階的に示す斜視図であり、図４Ａはイメージセンサの裏面にＡｌのパターンを形成した段階、図４Ｂは外形を加工した段階、図４Ｃはポリイミド基板に検出装置を固定した段階、図４Ｄは検出装置を樹脂で覆った段階を示す図である。 第１実施形態に係る検出装置の使用状態を示す断面図であり、図５Ａは親水性溶媒をマイクロチャンバーアレイに導入した段階、図５Ｂは収容部に親水性溶媒を充填した段階、図５Ｂは疎水性溶媒で開口部を封止した段階を示す図である。 第１実施形態に係る検出装置の使用状態を示す図である。 第１実施形態に係る検出装置の励起光の入射角度とイメージセンサの検出画像とを示す図であり、図７Ａは入射角度が０度、図７Ｂは入射角度が４５度の場合である。 第１実施形態に係る検出装置の励起光の入射角度とイメージセンサにおける検出強度の関係を示すグラフである。 第１実施形態に係る検出装置で検出した結果を示す図であり、図９Ａはマイクロチャンバーアレイを上方からマイクロスコープで観察した画像、図９Ｂは１０分経過後のイメージセンサでの検出結果、図９Ｃは３０分経過後のイメージセンサでの検出結果、図９Ｄは６０分経過後のイメージセンサでの検出結果である。 第１実施形態に係る検出装置の検出時間と検出結果との関係を示すグラフであり、図１０Ａは検出装置により検出強度を測定した結果、図１０Ｂは従来の光学顕微鏡を用いて蛍光色素の濃度を検出した結果である。 第２実施形態に係る検出装置を示す断面図であり、図１１Ａは使用前の状態、図１１Ｂは使用状態（１）、図１１Ｃは使用状態（２）を示す図である。
（第１実施形態）
以下、図面を参照して本発明の実施形態について詳細に説明する。
図１に示す検出装置１は、イメージセンサ２と、干渉フィルタ３と、マイクロチャンバーアレイ４とを備える。検出装置１は、マイクロチャンバーアレイ４に生体試料を含む親水性溶媒４２を収容し、当該生体試料の蛍光反応をイメージセンサ２で検出する。
本実施形態の場合、生体試料とは例えばタンパク質、抗体、核酸などの生体分子やウイルス粒子等であり、試薬と反応する。試薬としては例えば、ＦＤＧ（フルオロデオキシグルコース）や、ビーズを用いることができる。
ビーズは、平均粒子径１μｍ〜４μｍであることが好ましい。ビーズの平均粒子径を小さくすることにより、ビーズをマイクロチャンバーアレイ４へ効率的に封入できると共に、マイクロチャンバーアレイ４の高密度化を図ることができる。なお、「平均粒子径」とは、ここでは電子顕微鏡観察又は動的光散乱法を用いて測定した数値をいう。
本実施形態の場合、検出装置１はイメージセンサ２上に干渉フィルタ３を介してマイクロチャンバーアレイ４が搭載されている。イメージセンサ２は、例えばＣＭＯＳセンサを用いることができる。イメージセンサ２は、所定の大きさの画素５が複数形成されていると共に、ボンディングパッド部７が設けられている。干渉フィルタ３は、接着剤によってイメージセンサ２の画素５上に固着されており、マイクロチャンバーアレイ４に照射される励起光がイメージセンサ２の画素５に入射することを防止する。
マイクロチャンバーアレイ４は、例えばガラス、シリコン、高分子樹脂等で形成された板状部材からなるチャンバー本体６と、当該チャンバー本体６に形成された複数の収容部８とを有する。チャンバー本体６は、表面が疎水性を有することが好ましい。疎水性とは、親油性と同じ意味であり、疎水性溶媒４４との親和性が親水性溶媒４２との親和性よりも高いことをいう。この場合チャンバー本体６表面は、例えば撥水性の樹脂、フッ素系高分子樹脂等を用いることができる。フッ素系高分子樹脂としては、高い疎水性を有し、かつ、生体試料に対する毒性が低いアモルファスフッ素樹脂等を好適に用いることができる。アモルファスフッ素樹脂としては、例えば、ＣＹＴＯＰ（登録商標）、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＡＦ２４００、及びＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＡＦ１６００から選択することができる。
収容部８は、チャンバー本体６表面から厚さ方向に穿設された貫通穴である。収容部８は、試薬と生体試料を効率的に反応させるため、生体試料及び試薬の濃度を十分に高くする必要があり、そのため容積がフェムトリットルクラスであることが好ましい。
図２Ａに示すようにイメージセンサ２は、所定の大きさを有する画素５が複数連設されている。本実施形態の場合、イメージセンサ２は１辺の長さが７．５μｍの正方形の画素５を複数有する。
図２Ｂに示すようにマイクロチャンバーアレイ４は、収容部８が所定の間隔を開けて連設されている。当該間隔は、入射した励起光を遮断し得る長さに設定される。本実施形態の場合、マイクロチャンバーアレイ４は１５μｍの間隔を開けて形成された収容部８を複数有する。
図２Ｃに示すように、マイクロチャンバーアレイ４は、１個の収容部８が１個の画素５に対応するようにイメージセンサ２上に固定される。
また本図には図示しないが、干渉フィルタ３と、マイクロチャンバーアレイ４及びイメージセンサ２の間の側壁に、黒色の染料を含有する遮蔽材を塗布するのが好ましい。これにより、干渉フィルタ３と、マイクロチャンバーアレイ４及びイメージセンサ２の間の隙間から励起光がイメージセンサ２の画素５に入射することを防ぐことができる。
次に、本実施形態に係る検出装置１の製造方法について説明する。まず、厚さ１５０μｍのイメージセンサ１１の画素５上に接着剤（本実施形態の場合、ＣＹＴＯＰ（登録商標））１４を２μｍの厚さに塗布する。次いで、１８０℃で加熱しながら一面に厚さ３μｍの干渉フィルタ３を設けた厚さ６０μｍのＳｉ基板１２を、干渉フィルタ３の表面を上記接着剤１４に重ね、干渉フィルタ３を介してＳｉ基板１２とイメージセンサ１１とを固定する（図３Ａ）。
次いで、Ｓｉ基板１２上に２００ｎｍの厚さのＡｌ膜１６を蒸着法により形成し、当該Ａｌ膜１６上にレジスト１８を設ける（図３Ｂ）。
次いで、レジスト１８にパターンを形成し貫通穴２０を穿設する（図３Ｃ）。ボンディングパッド部７を保護する厚膜レジスト２２を形成した後で、ウェットエッチングによりＡｌ膜１６に貫通穴２４を形成する（図３Ｄ）。
さらにドライエッチング（Deep Reactive Ion Etching : DRIE）によりＳｉ基板１２に貫通穴２６を形成する（図３Ｅ）。次いで、レジスト１８及びＡｌ膜１６を混酸（酢酸，リン酸，硝酸，純水(体積比4：4：1：1)）により除去する（図３Ｆ）。
次いで、ガラス基板２８上に載置してボンディングパッド部７を保護する厚膜レジスト３０を形成した後で、イメージセンサ１１の裏面にＡｌのパターン３２を形成し（図４Ａ）、さらにDRIEにより外形加工を施して検出装置１を得ることができる（図４Ｂ）。
形成された検出装置１は、ポリイミド基板３４上に固定され、ボンディングパッド部７においてワイヤボンディングされる（図４Ｃ）。
ボンディングワイヤ３６、及びボンディングパッド部７はエポキシ樹脂４０で覆われている。また、干渉フィルタ３と、マイクロチャンバーアレイ４及びイメージセンサ２の間に、黒色の染料を含有する遮蔽材３８が設けられている（図４Ｄ）。
次に、上記のように構成された検出装置１の動作及び効果を説明する。まず、生体試料と試薬とを含む親水性溶媒４２をマイクロチャンバーアレイ４の収容部８に導入する（図５Ａ）。親水性溶媒４２は例えば、水、親水性アルコール、親水性エーテル、ケトン、ニトリル系溶媒、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）からなる群より選択される少なくとも１つ又はこれを含む混合物等を用いることができる。
次いで、検出装置１を減圧環境下に放置することにより、脱気をする。これにより、収容部８内の空気を除去し、生体試料を含む親水性溶媒４２を収容部８に効率的に導入することができる（図５Ｂ）。
次いで収容部８の開口部１０周辺に疎水性溶媒４４を導入する（図５Ｃ）。疎水性溶媒４４は、親水性溶媒４２と混ざらない溶媒であればよく、例えば飽和炭化水素、不飽和炭化水素、芳香族炭化水素、シリコーンオイル、パーフルオロカーボン、ハロゲン系溶媒、及び疎水性イオン液体からなる群より選択される少なくとも１つ又はこれを含む混合物等を好適に用いることができる。
疎水性溶媒４４を収容部８の開口部１０周辺に導入することにより、各収容部８に疎水性溶媒４４により覆われた液滴を形成し、収容部８内に生体試料を封入することができる。これにより、生体試料をフェムトリットルクラスの収容部８に封入することができる。
次いで、検出装置１のマイクロチャンバーアレイ４に対し、光源４６から励起光を照射する（図６）。生体試料に結合した所定の酵素によって蛍光基質が分解されて蛍光物質が遊離する。この蛍光物質を干渉フィルタ３を介して各収容部８に対応する画素５Ａで検出する。一方、親水性溶媒が充填されなかった収容部及び収容部同士の間に対応する画素５Ｂ，５Ｃにおいて蛍光物質は検出されない。
これにより、検出装置１は、収容部８の開口部１０を疎水性溶媒４４で封止し収容部８に生体試料を含む親水性溶媒４２を閉じ込めるので、収容部８内に収容される生体試料や試薬の濃度の低下を防いで測定感度を向上することができる。
また、検出装置１は、試薬が収容されている収容部８の数と、生体試料を捕捉した試薬が収容されている収容部８の数とを検出して、試薬の全数のうちターゲット分子を捕捉した試薬の数の割合を算出することができる。これにより、ターゲット分子の濃度を定量化することが可能となる。
しかも、本実施形態の場合、イメージセンサ２は各収容部８に対応した画素５において各収容部８の試薬の有無及び生体試料を捕捉した試薬が収容されているか否かを検出することができるので、従来のように光学顕微鏡を必要とせず検出システムの小型化を図ることができると共に、検出作業の高速化を図ることができる。
次に、実際に製造した検出装置１を用いて行った評価について説明する。製造した検出装置１のマイクロチャンバーアレイ４は、厚さが６０μｍ、収容部８の有効長さが４μｍ、収容部８同士の間の間隔が１５μｍとなるように形成されている。イメージセンサ２は、チップサイズが１．２ｍｍ×３．６ｍｍのＣＭＯＳセンサを用い、画素５の１辺の長さが７．５μｍ、アレイサイズが１２０×２６８とした。
まず、励起光の適切な入射角度について確認した。励起光には水銀ランプからの白色光を青色干渉フィルタ（透過中心波長469nm，波長幅35nm）により選択した青色光を用いた。マイクロチャンバーアレイ４に対し照射する励起光は、図７に示すように、収容部８の開口部１０に対し斜め上方から照射するのが好ましい。すなわち収容部８の開口部１０に対し、垂直方向に励起光を照射した場合、イメージセンサ２の画素５に励起光が直接入射してしまう。これに対し、図７Ｂに示すように、収容部８の開口部１０に対し斜め上方から照射した場合、イメージセンサ２は当該励起光を検出しないので、より確実に蛍光物質を検出することができる。
図８は、励起光の入射角度とイメージセンサ２における検出強度の関係を示すグラフであり、●はマイクロチャンバーアレイ４あり、□はマイクロチャンバーアレイ４なしの結果である。入射角度は、鉛直方向を０度とし、当該鉛直方向の伸びる軸と励起光が入射する方向に平行な軸とのなす角をいう。この結果から入射角度を変えることによりマイクロチャンバーアレイ４が励起光を遮断し得ることが確認できた。
図９は、本実施形態に係る検出装置１で検出した結果を示す図である。なお、親水性溶媒４２としてリン酸緩衝液、生体試料としてβ−ｇａｌ（β-galactosidase：１０ｎＭ）、試薬としてＦＤＧ（４ｍＭ）を用いた。
図９Ａはマイクロチャンバーアレイ４を上方からマイクロスコープで観察した画像である。各収容部８が明るく光っていることから、各収容部８に試薬と反応した生体試料が収容されていることが確認される。
図９Ｂ〜図９Ｄは、図９Ａ中のＡにおける検出装置１の検出結果を示す。時間経過と共に蛍光反応が進み、それに伴い蛍光反応を検出する画素５が増加していることが確認された。
図１０Ａは検出装置１における検出時間と検出強度との関係を示すグラフである。この結果から、本実施形態に係る検出装置１は、従来の光学顕微鏡の結果（図１０Ｂ）と遜色のない検出結果を得られることが確認された。
（第２実施形態）
次に本発明の第２実施形態に係る検出装置１について図１１を参照して説明する。上記第１実施形態と同様の構成については同様の符号を付し、簡略のため説明を省略する。
本図に示す検出装置５０は、イメージセンサ２と、干渉フィルタ３（本図には図示しない）と、本体５２と、マイクロチャンバーアレイ４とを備える。
本体５２は、底面が開口しており、上面が閉塞している筒状の部材で構成されている。本体５２の底面の開口を塞ぐようにイメージセンサ２が設けられている。イメージセンサ２上に設けられたマイクロチャンバーアレイ４上には流通路５４が形成されている。流通路５４はマイクロチャンバーアレイ４の各収容部８とそれぞれの開口部１０を介して連通している。流通路５４及び全ての収容部８は親水性溶媒４２で満たされている。
流通路５４の一端には疎水性溶媒供給部５６が設けられている。疎水性溶媒供給部５６には疎水性溶媒４４が収容されている。疎水性溶媒供給部５６の本体５２上面には、外力で弾性変形可能な変形部６２が設けられている。
本体５２の上面には、流通路５４と外部とを連通する一対の貫通穴５８と、当該貫通穴５８を閉塞する蓋部６０とが着脱自在に設けられている。本体５２は、内部の高さＡが疎水性溶媒４４の油滴の大きさ以下であることが好ましい。内部の高さＡを油滴の大きさ以下とすることにより、疎水性溶媒４４と親水性溶媒４２が混ざり合わずに本図に示すように分離した状態で保持される。したがって、流通路５４と疎水性溶媒供給部５６との境界は互いを区画する部材を必要としない。通常、水中において安定な油滴の大きさは１００μｍ程度であるので、内部の高さＡは、１００μｍ以下であることが好ましい。
次に上記のように構成された検出装置５０の動作及び効果について説明する。まず、図１１Ｂに示すように、蓋部６０を取り外し、一方の貫通穴５８から生体試料と試薬６５を含む親水性溶媒４２を流通路５４内に導入する。これにより、試薬６５は各収容部８に収容される。
次いで、疎水性溶媒供給部５６の変形部６２に対し外部から力を付加し、変形部６２を弾性変形させる。この力により疎水性溶媒供給部５６に収容されていた疎水性溶媒４４が流通路５４内に流入し、各収容部８に疎水性溶媒４４により覆われた液滴を形成し、収容部８内に生体試料を封入することができる。
本実施形態に係る検出装置５０は、生体試料と試薬６５を含む親水性溶媒４２を導入した後、１回的な動作で収容部８内に生体試料を封入することができる。したがって疎水性溶媒４４を流入させる準備を省略することができるので、検査作業をより簡略化することができる。
なお、本実施形態では、流通路５４と疎水性溶媒供給部５６との境界は互いを区画する部材がない場合について説明したが、本発明はこれに限られない。例えば、流通路５４と疎水性溶媒供給部５６との境界に隔壁を設けることとしてもよい。当該隔壁は、変形部６２に付加された力によって破断可能に形成される。
これにより、生体試料と試薬６５とを含む親水性溶媒４２を流通路５４内に導入した段階では疎水性溶媒４４は隔壁によって疎水性溶媒供給部５６に確実に収容されている。そして、変形部６２に力を付加することによって、当該力が疎水性溶媒供給部５６に収容されている疎水性溶媒４４を介して隔壁に伝達される。伝達された力によって隔壁が破断すると、疎水性溶媒供給部５６に収容されていた疎水性溶媒４４が流通路５４内に流入し、各収容部８に疎水性溶媒４４により覆われた液滴を形成し、収容部８内に生体試料を封入することができる。
このように流通路５４と疎水性溶媒供給部５６との境界に隔壁を設けることにより、生体試料と試薬６５とを含む親水性溶媒４２を流通路５４内に導入した段階、すなわち試薬６５が各収容部８に収容される段階において疎水性溶媒４４が流通路５４内に進入することをより確実に防ぐことができるので、作業の確実性を向上することができる。
（変形例）
本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨の範囲内で適宜変更することが可能である。
上記第２実施形態では、一対の貫通穴５８を設けた場合について説明したが、本発明はこれに限らず、貫通穴５８は１個でもよい。
１ ：検出装置
２ ：イメージセンサ
４ ：マイクロチャンバーアレイ
５ ：画素
８ ：収容部
１０ ：開口部
４２ ：親水性溶媒
４４ ：疎水性溶媒
５４ ：流通路
５６ ：疎水性溶媒供給部
５８ ：貫通穴
６２ ：変形部

Claims (11)

  1. 本体の内部に配置され、生体試料を含む親水性溶媒を充填する複数の収容部を有するマイクロチャンバーアレイと、
    前記収容部に対応して画素が設けられているイメージセンサと、
    を備える検出装置において、
    前記本体は、
    前記収容部の開口部に連通している流通路と、
    前記流通路に連設されている疎水性溶媒供給部と、
    前記流通路に対し前記親水性溶媒が出入り可能な貫通穴と
    を有し、
    前記マイクロチャンバーアレイは、表面が疎水性を有し、
    前記疎水性溶媒供給部は外部から加えられた力によって疎水性溶媒を前記流通路に流入させる
    ことを特徴とする検出装置。
  2. 前記疎水性溶媒供給部と前記流通路の内部空間が接続されており、前記親水性溶媒が前記疎水性溶媒供給部に充填された前記疎水性溶媒と分離した状態で前記流通路に保持されていることを特徴とする請求項１に記載の検出装置。
  3. 前記本体の内部の高さが、前記疎水性溶媒の油滴の大きさ以下であることを特徴とする請求項１に記載の検出装置。
  4. 前記疎水性溶媒供給部と前記流通路の間に前記力によって破断可能な隔壁が設けられていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の検出装置。
  5. 前記疎水性溶媒供給部は外部から加えられた力によって弾性変形可能な変形部を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の検出装置。
  6. 前記流通路に前記試料を含まない前記親水性溶媒が充填されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の検出装置。
  7. 前記貫通穴を閉塞する開閉可能な蓋部が設けられていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の検出装置。
  8. 表面が疎水性を有するマイクロチャンバーアレイの複数の収容部に生体試料を含む親水性溶媒を充填する工程と、
    前記収容部に励起光を照射する工程と、
    前記試料の蛍光反応を前記収容部毎にイメージセンサで検出する工程と
    を備え、
    前記親水性溶媒を充填する工程は、
    前記収容部の開口部から前記親水性溶媒を流し込む工程と、
    前記開口部を疎水性溶媒で閉塞する工程と
    を有することを特徴とする検出方法。
  9. 前記親水性溶媒と前記疎水性溶媒とが境界に互いを区画する部材を介さずに分離した状態で保持されるように、前記親水性溶媒が充填されることを特徴とする請求項８に記載の検出方法。
  10. 前記親水性溶媒が疎水性溶媒の油滴の大きさ以下の高さを有する本体内に充填されることを特徴とする請求項８に記載の検出方法。
  11. 前記励起光を前記開口部に対し斜め上方から照射することを特徴とする請求項８〜１０のいずれか１項に記載の検出方法。
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