JP5839855B2

JP5839855B2 - ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法

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Publication number: JP5839855B2
Application number: JP2011144508A
Authority: JP
Inventors: 加藤　隆久; 隆久加藤; 俊輔佐藤
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2011-06-29
Filing date: 2011-06-29
Publication date: 2016-01-06
Anticipated expiration: 2031-06-29
Also published as: JP2013009628A

Description

本発明は、微生物を用いて生産される３−ヒドロキシ酪酸（以下、３ＨＢとも記す）及び３−ヒドロキシヘキサン酸（以下、３ＨＨとも記す）を重合して得られるポリヒドロキシアルカノエート共重合体（以下、ＰＨＡとも記す）並びにその製造方法に関する。さらに詳しくは、３−ヒドロキシ酪酸単位と３−ヒドロキシヘキサン酸単位及び／又はその他のモノマー単位の共重合比率をコントロールする方法に関する。

ＰＨＡは、広範な微生物によって生成されるポリエステル型有機分子ポリマーである。ＰＨＡは生分解性を有する熱可塑性高分子である。また、ＰＨＡは再生可能資源から産生されうる。これらのことから、ＰＨＡを環境調和型素材または生体適合型素材として工業的に生産し、多様な産業で利用する試みが行われている。

現在までに数多くの微生物が、エネルギー貯蔵物質としてＰＨＡを菌体内に蓄積することが知られている。ＰＨＡの代表例としては３−ヒドロキシ酪酸（以下、３ＨＢとも記す）のホモポリマーであるポリ−３−ヒドロキシ酪酸（以下、Ｐ（３ＨＢ）とも記す）が挙げられる。Ｐ（３ＨＢ）は１９２５年にBacillus megateriumで最初に発見された。Ｐ（３ＨＢ）は熱可塑性高分子であり、自然環境中で生物的に分解されることから、環境にやさしいプラスチックとして注目されている。しかし、Ｐ（３ＨＢ）は結晶性が高いために硬くて脆い性質を持っていることから実用的には応用範囲が限られている。応用範囲を広げるためには、Ｐ（３ＨＢ）に柔軟性を付与することが必要であった。

その中で、３ＨＢとそれ以外のヒドロキシ酸、例えば、３−ヒドロキシ吉草酸（以下、３ＨＶとも記す）、３−ヒドロキシプロピオン酸（以下、３ＨＰとも記す）、３−ヒドロキシペンタン酸（以下、３ＨＣとも記す）、３−ヒドロキシヘキサン酸（以下、３ＨＨとも記す）、３−ヒドロキシオクタン酸（以下、３ＨＯとも記す）、３−ヒドロキシノナン酸（以下、３ＨＮとも記す）、３−ヒドロキシデカン酸（以下、３ＨＤとも記す）、３−ヒドロキシドデカン酸（以下、３ＨＤＤとも記す）などを重合して得られる共重合ポリエステルが精力的に研究されてきた（非特許文献１）。

その中でも、注目すべきものとして、３ＨＢと３ＨＨを重合して得られる共重合ポリエステル、特に３ＨＢと３ＨＨの共重合体（以下Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）とも記す）と、その製造方法についての研究がある（特許文献１、２）。これらに記載のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の製造方法は、土壌より単離されたAeromonas caviaeやAeromonas hydrophilaを用い、炭素源としてラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸等の脂肪酸や、グルコースを用いた方法であった。また、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の性質に関する研究もなされている（非特許文献２）。この報告では炭素数が１２個以上の脂肪酸を唯一の炭素源としてA. caviaeを培養し、３ＨＨ組成が１１〜１９ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を発酵生産している。このＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は、３ＨＨ組成が増加するにしたがって、Ｐ（３ＨＢ）の硬くて脆い性質から次第に柔軟な性質を示すようになり、それまでに報告されていた３ＨＢと３ＨＶからなる共重合体（以下Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）とも記す）を上回る柔軟性を示すことが明らかにされた。

また、A. caviaeのＰＨＡシンターゼ遺伝子をクローニングし、この遺伝子を乾燥菌体あたり９０％以上の高ＰＨＢ蓄積能を有するCupriavidus necator（旧分類：Ralstonia eutropha或いはAlcaligenes eutrophus）に導入した形質転換体を用い、脂肪酸を炭素源としてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産する報告がなされている（非特許文献３、特許文献３）。このなかで、オクタン酸ナトリウムを炭素源とすることで、３ＨＨ組成が１０〜２０ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）が生産できることが報告されている。さらに、上記形質転換体を用いてポリエステルを生産する際に、複数種の炭素源を用いる方法が開示され、炭素源として用いる油脂や脂肪酸の炭素数が、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の３ＨＨ組成に影響を与えることが明らかとなった（特許文献４）。これによれば、少なくとも２種類の炭素数の異なる油脂および／または脂肪酸を炭素源として用いることによって、３ＨＨ組成が１〜４０ｍｏｌ％のポリエステルを生産することが可能となり、種々の物性を有するＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）が生産できることが報告されている。しかしながら、本製造方法では、３ＨＨ組成制御のために高価なヘキサン酸、オクタン酸等の脂肪酸或いは対応する脂肪酸塩を添加する必要があり、また高濃度のヘキサン酸は細胞毒性を示すことから菌体生産性が低下する結果となり、工業生産に適用するには高コストとなるため実用には適していない。

一方で、培養中にリンを流加することで、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）中のバレレート反復単位に変換される効率を高める培養方法が提案されている（特許文献５）。この培養方法によれば、ナタネ油または粗トウモロコシ油、及びプロピオン酸を炭素源として、リン酸を流加することにより、プロピオン酸の取り込み効率を高めることが出来る。具体的には、細胞増殖が停止するか著しく減速した後に、リン酸と炭素源を、炭素総量（Ｃ）のリン総量（Ｐ）に対する重量比（以下Ｃ／Ｐ比と記す）を３００から６００までの範囲内に維持しながら添加することで、得られるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）の３ＨＶ組成をリン酸添加なしの場合（７．４ｍｏｌ％）と比べ、８．７ｍｏｌ％に高めることを可能とした。このリン酸及び炭素源の添加速度は、細胞乾燥重量を所期レベルに増加させるのに十分ではあるが、ＰＨＡ蓄積の抑制を伴う実質的な増殖を生じさせるには不十分な添加速度である。しかしながら、上述のように高価な脂肪酸を使用するため、低コストでの生産が困難である。

他にもＰＨＢ及びＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）の培養中にリン流加を行った例は報告されているが、何れもポリマー生産性を高める目的で実施されている（非特許文献４、５）。非特許文献５ではＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）の培養において、炭素源を１０〜３０ｇ／Ｌに保つように流加し、細胞増殖が停止した後に、菌体生産速度を一定値（０．０２ｇ／Ｌ・ｈ）に保つために必要なリン酸塩水溶液を一定速度（０．２ｍｇ−Ｐ／Ｌ・ｈ）にて添加することで、ポリマー含有率が最大となることが報告されているが、３ＨＶ組成に関するデータは示されていない。

また、培養期間を菌体増殖期とポリエステル蓄積期の２つのフェーズに分け、それぞれのフェーズで、炭素源として使用する油脂の比基質供給速度を一定に制御する培養を行うことにより、３ＨＨ組成を制御する培養方法が提案されている（特許文献６）。この培養方法によれば、高価な脂肪酸を使用せずに炭素源の流加速度を制御することにより、３ＨＨ組成を任意にコントロールすることが可能と報告されている。しかしながら本培養方法によれば、３ＨＨ組成を高めるためには炭素源の流加速度を低減させる必要があることからポリマー生産性が低下し、より柔軟性に富んだ高い３ＨＨ組成を有する共重合ポリマーを高生産するには課題があった。

今後、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）などの共重合ポリエステルのモノマー単位の組成比、特に３ＨＨ組成を任意の広い範囲でコントロールして共重合体を製造することができれば、硬い共重合体から柔らかい共重合体まで発酵生産可能となり、テレビの筐体などのように硬さを要求されるものから糸やフィルムなどのような柔軟性を要求されるものまで、幅広い分野への応用が期待できると考えられている。

特開平５−９３０４９号公報特開平７−２６５０６５号公報特開平１０−１０８６８２号公報特開２００１−３４００７８号公報特表平１１−５００００８号公報国際公開番号ＷＯ２００４／０３３６７０号

BIO/TECHNOLOGY 13, 142-150 (1995) Macromolecules 28, 4822-3 (1995) J. Bacteriol. 179(15), 4821-30 (1997) Process Biochemistry (Oxford) 34(2), 109-14 (1999) Applied Microbiology and Biotechnology 61(3), 257-60 (2003)

本発明は、高いポリマー生産性を実現し、かつ共重合ポリエステルの組成を任意に制御することができる安価なＰＨＡの製造方法を提供することを課題とする。また、高価な脂肪酸を炭素源として使用せず、少なくとも３ＨＢ及び３ＨＨを重合して得られる共重合ポリエステルの３ＨＨ組成を任意に制御でき、かつ高いポリマー生産性を実現する安価なＰＨＡの製造方法を提供することを課題とする。さらに、培養期間中に炭素源を変更することなく共重合ポリエステルの３ＨＨ組成を任意に制御する方法を提供することを課題とする。

本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、モノマーユニットとして少なくとも３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸を含む２種以上の構成要素よりなる共重合ポリエステルを生産する微生物を、天然油脂、分別油脂、合成油脂、及び、混合油脂からなる群から選ばれる少なくとも１種の油脂を炭素源として含む培地で培養し、かつ培養中に培地にリン化合物を添加することを特徴とするＰＨＡの製造方法を用いることにより、ポリマー生産性を高めるのみならず、炭素源として特に高価な脂肪酸などを使用しなくても３ＨＨ組成を任意の範囲内に良好に制御した共重合ポリエステルを生産することを見出し、本発明を完成するに至った。

即ち本発明の特徴の一つは、モノマーユニットとして少なくとも３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸を含む２種以上の構成要素よりなる共重合ポリエステルを生産する微生物を、天然油脂、分別油脂、合成油脂、及び、混合油脂からなる群から選ばれる少なくとも１種の油脂を炭素源として含む培地で培養し、かつ培養中に培地にリン化合物を添加することを特徴とするＰＨＡの製造方法である。

本発明の別の特徴の一つは、前記培地にリン化合物を添加する期間の単位時間当たりに添加する炭素源中の炭素総量（Ｃ）の単位時間当たりに添加するリン化合物中のリン総量（Ｐ）に対する重量比（Ｃ／Ｐ比）が１５０〜２００００であることを特徴とするＰＨＡの製造方法である。

本発明の別の特徴の一つは、前記Ｃ／Ｐ比が３００〜１２０００であることを特徴とするＰＨＡの製造方法である。

本発明の別の特徴の一つは、前記Ｃ／Ｐ比が６００超〜１６００であることを特徴とするＰＨＡの製造方法である。

本発明の別の特徴の一つは、前記リン化合物が、リン酸及び／又はリン酸塩を含むことを特徴とするＰＨＡの製造方法である。

本発明の別の特徴の一つは、前記共重合ポリエステルがＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）であるＰＨＡの製造方法である。

本発明の別の特徴の一つは、前記微生物が、カプリアヴィドゥス（Cupriavidus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、アエロモナス（Aeromonas）属、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、又は、エシュリキア（Escherichia）属のいずれかに属する微生物であるＰＨＡの製造方法である。

本発明の別の特徴の一つは、前記微生物が、ポリエステル重合酵素遺伝子を組み込んだ形質転換微生物であるＰＨＡの製造方法である。

本発明のＰＨＡの製造方法を用いることにより、高いポリマー生産性を実現し、かつ共重合ポリエステルの組成を任意に制御することができる安価なＰＨＡの製造方法を提供することができる。また、高価な脂肪酸を炭素源として使用せず、少なくとも３ＨＢ及び３ＨＨを重合して得られる共重合ポリエステルの３ＨＨ組成を任意に制御でき、かつ高いポリマー生産性を実現する安価なＰＨＡの製造方法を提供することができる。さらに、培養期間中に炭素源を変更することなく共重合ポリエステルの３ＨＨ組成を任意に制御する方法を提供することができる。

本発明は、モノマーユニットとして少なくとも３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸を含む２種以上の構成要素よりなる共重合ポリエステルを生産する微生物を、天然油脂、分別油脂、合成油脂、及び、混合油脂からなる群から選ばれる少なくとも１種の油脂を炭素源として含む培地で培養し、かつ培養中に培地にリン化合物を添加することを特徴とするＰＨＡの製造方法に関する。

本発明の共重合ポリエステルの組成をコントロールするＰＨＡの製造方法は、微生物を用いて生分解性の共重合ポリエステルを生産する際に適用される。

本発明のＰＨＡの製造方法が適用できる共重合ポリエステルとしては特に限定されず、少なくとも２種以上のモノマー単位を重合して得られる共重合ポリエステルであれば適用しうる。具体的には、３ＨＢと３ＨＨを重合して得られる共重合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）や、３ＨＢと３ＨＨと３ＨＶの３成分を重合して得られる共重合体、その他Pseudomonas属細菌によって生産されうる３ＨＢ、３ＨＨ、３ＨＯ、３ＨＤ、３ＨＤＤなどを重合して得られる共重合ポリマーをその代表的なものとして挙げる事ができる（Appl. Microbiol. Biotechnol. 47, 207-11 (1997)、Appl. Microbiol. Biotechnol. 49, 431-7 (1998)参照）。この中でも特に、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）が好ましい。

本発明に使用する微生物としては、モノマーユニットとして少なくとも３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸を含む２種以上の構成要素よりなる共重合ポリエステルを生産する限り特に制限なく、天然から単離された微生物、変異を導入した微生物、遺伝子操作を行った微生物や菌株の寄託機関（例えばＩＦＯ、ＡＴＣＣ等）に寄託されている微生物を使用できる。具体的には、カプリアヴィドゥス（Cupriavidus）属（旧分類：ラルストニア（Ralstonia）属或いはアルカリゲネス（Alcaligenes属））、アエロモナス（Aeromonas）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、又はエシェリキア（Escherichia）属のいずれかに属する微生物を好適に使用することが出来る。

また上記微生物が、野生型の状態では目的とする共重合体を生産できない、もしくはその生産量が低い場合には、上記微生物に、目的とする共重合ポリエステルの重合酵素遺伝子を導入して得られる形質転換体を用いることができる。形質転換体を作製する場合、ポリエステル重合酵素遺伝子を含む組換えベクターを利用するなどの一般的な方法を用いることができ、該ベクターには、その菌体内で自律的に増殖しうるプラスミドベクターを用いることができる。また、該ポリエステル重合酵素遺伝子を直接宿主の染色体に組み込んでも良い。

本発明の共重合ポリエステルの生産において使用されるポリエステル重合酵素遺伝子としては、特に限定されないが、A. caviaeより単離された遺伝子が好ましく、例えば特許文献３に記載されている遺伝子断片を用いることができる。微生物に組換えベクターを導入するには、公知の方法により行うことができる。例えば、接合法、カルシウム法やエレクトロポレーション法等を用いることができる。本発明に用いられる微生物の一例として、Cupriavidus necatorに、A. caviae由来のポリエステル重合酵素遺伝子を導入した、Cupriavidus necator PHB-4/pJRDEE32d13株（Appl. Microbiol. Biotechnol. 49, 333-6 (1998)参照）を好ましく用いることができる。

本発明の培養方法において、共重合ポリエステルの生産には、発酵原料として、価格、供給安定性、品質の安定性、菌体あるいはポリエステルの収率などの点から、安価な油脂を主要な炭素源として使用する。炭素源以外の栄養源としては、窒素源、リン化合物、無機塩類、そのほかの一般的な有機栄養源を含む培地が使用できる。生産コスト低減の観点からは高価な有機窒素源、例えばポリペプトン、イーストエキス、肉エキスなどの使用は最少量に留める方が好ましい。培養温度はその菌の生育可能な温度であればよいが、２０〜４０℃が好ましい。培養時間には特に制限はないが、１〜７日程度で良い。また、形質転換体を使用する際は、培養中にベクターに存在する耐性遺伝子に対応するカナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を添加しても良い。

本発明において炭素源として使用する油脂は、大豆油、コーン油、綿実油、パーム油、パーム核油、ヤシ油、落花生油などの比較的安定的に供給される天然油脂およびこれらの油脂を分別して得られる各画分、例えばパームＷオレイン油（パーム油を２回無溶媒分別した低融点画分）、パーム核油オレイン（パーム核油を１回無溶媒分別した低融点画分）などの分別油脂、またはこれら天然油脂やその画分を化学的あるいは生物化学的に処理した合成油、さらにはこれらを混合した混合油が使用できる。このなかでも、コストの点からは天然油脂を使用するのが好ましい。

本発明の方法において、リン源は、培養の全期間を通じて、或いは培養のあるフェーズ期間内で、連続的に、或いは間欠的に流加される。本明細書において培養全期間とは、本培養における培養開始から培養終了時までの全期間を意味し、培養全期間を通じて流加するということは、すなわち菌体増殖期とポリエステル蓄積期の両方の期間に流加を行うことである。またここでいう、培養の菌体増殖期やポリエステル蓄積期とは、培養期間を大きく２つのフェーズに分けた場合の、それぞれ、培地中にリンが十分量存在し、菌体増殖が活発に行われ、ポリエステルの蓄積速度が比較的小さい前半のフェーズ（菌体増殖期）と、培地中のリン濃度が低下し、菌体増殖が制限され、ポリエステルの蓄積速度が大きくなった後半のフェーズ（ポリエステル蓄積期）である。実質的には、培地中の残存リン濃度が５０ｐｐｍ以上である期間を菌体増殖期、５０ｐｐｍ未満となった後の期間をポリエステル蓄積期とすることができる。

本発明に用いるリン化合物としてはリン酸及び／又はリン酸塩を含むリン化合物を好適に用いることができる。

本発明の特徴の一つは、培地にリン化合物を添加する期間中、単位時間当たりに添加する炭素源中の炭素総量（Ｃ）の単位時間当たりに添加するリン化合物中のリン総量（Ｐ）に対する重量比（Ｃ／Ｐ比）を制御するＰＨＡの製造方法である。

好ましいＣ／Ｐ比は、使用するリン化合物及び炭素源の種類にもよるが、概ね１５０〜２００００、好ましくは３００〜１２０００、更に好ましくは６００超〜１６００である。

本発明において、培養中にリン源を流加することにより、生産される共重合ポリエステル、例えばＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の３ＨＨ組成が上昇することが初めて見出だされた。更にその流加期間及び／または流加速度を適宜変更することにより、３ＨＨ組成の上昇期間及び／または上昇率を制御することが可能となり、結果として所望の３ＨＨ組成を有する共重合ポリエステルを取得することが可能となる。ここでいう、３ＨＨ組成の上昇率とは以下の式で示されるものである。
３ＨＨ組成上昇率（ｍｏｌ％／ｇ／Ｌ）＝（３ＨＨ（ｔ２）−３ＨＨ（ｔ１））／（ＤＣＷ（ｔ２）−ＤＣＷ（ｔ１））
３ＨＨ（ｔ１）：時間ｔ１での３ＨＨ組成（ｍｏｌ％）
３ＨＨ（ｔ２）：時間ｔ２での３ＨＨ組成（ｍｏｌ％）
ＤＣＷ（ｔ１）：時間ｔ１での乾燥菌体重量（ｇ／Ｌ）
ＤＣＷ（ｔ２）：時間ｔ２での乾燥菌体重量（ｇ／Ｌ）
本発明の方法に用いられる窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩である無機窒素源、ペプトン、肉エキス、酵母エキスなどの有機窒素源が挙げられる。リン源としては、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸マグネシウム、リン酸などのリン化合物が挙げられる。またその他の無機塩類としては、例えば硫酸マグネシウム、塩化ナトリウムなどを用いることができる。そのほかの有機栄養源としては、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリンなどアミノ酸、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン類を用いることができる。しかしながら、生産コスト抑制の観点からは有機栄養源であるペプトン、肉エキス、酵母エキスおよびグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリンなどのアミノ酸、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミンの使用は最少量とすることが好ましい。

本発明において、共重合ポリエステルを微生物菌体から回収する方法は特に限定されず、公知の溶媒抽出法、物理的破砕法、化学的処理法などが採用でき、例えば、次のような方法が使用できる。培養終了後、培養液を遠心分離機などで菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄した後、乾燥させる。この乾燥菌体からクロロホルム等の有機溶剤を用いてポリエステルを抽出する。このポリエステルを含んだ有機溶剤溶液から濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてポリエステルを沈殿させる。濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてポリエステルを回収する。

得られたポリエステルのモノマーユニットの分析法としては、例えば、核磁気共鳴法、或いはモノマーをメチルエステル化した後、ガスクロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィーにより分析する方法などがある。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。以下の実施例においては、いずれも共重合ポリエステルとして、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産した。もちろん本発明はこれら実施例にその技術範囲を限定するものではなく、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）に限られるものではない。

例えば、用いる微生物やポリエステル重合酵素遺伝子、或いは炭素源の種類を変えることで、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）以外の他の共重合体を生産することが可能である。

（実施例１）
国際公開番号ＷＯ２００９−１４５１６４号公報表１記載のＰａｃ−ｂｋｔＢ／ＡＳ＋ｐＣＵＰ−６３１株を用い、次のように培養した。

種母培地の組成は１ｗ／ｖ％Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．２ｗ／ｖ％Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％ＫＨ_２ＰＯ_４、（ｐＨ６．８）とした。

前培養培地の組成は１．１ｗ／ｖ％Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％ＫＨ_２ＰＯ_４、１．２９ｗ／ｖ％（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．１ｗ／ｖ％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、２．５ｗ／ｖ％パーム核油オレイン、０．５ｖ／ｖ％微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ、１ｗ／ｖ％ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ＮｉＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏを溶かしたもの。）、とした。

ポリエステル生産培地の組成は０．３８５ｗ／ｖ％Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、０．０６７ｗ／ｖ％ＫＨ_２ＰＯ_４、０．２９１ｗ／ｖ％（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．１ｗ／ｖ％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ、１ｗ／ｖ％ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ＮｉＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏを溶かしたもの。）、０．０５ｗ／ｖ％ＢＩＯＳＰＵＭＥＸ２００Ｋ（消泡剤：コグニスジャパン社製）とした。炭素源としてはパーム核油を分別した低融点画分であるパーム核油オレインを用いた。流加用のリン酸塩水溶液としては、４．００ｗ／ｖ％Ｎａ_２ＨＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、０．６９ｗ／ｖ％ＫＨ_２ＰＯ_４となるよう調製したものを用いた。

ＫＮＫ−６３１株のグリセロールストック（５０μｌ）を種母培地（１０ｍｌ）に接種して２４時間培養し、１．８Ｌの前培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ−３００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３３℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎ．とし、ｐＨは６．７〜６．８の間でコントロールしながら２８時間培養した。ｐＨコントロールには７％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。

ＰＨＡの生産培養は４．３Ｌの生産培地を入れた１０Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ−１０００型）に前培養種母を５．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度２８℃、攪拌速度６００ｒｐｍ、通気量６Ｌ／ｍｉｎ．とし、ｐＨは６．７から６．８の間でコントロールした。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。炭素源は培養全般を通じ、パーム核油オレインを、比基質供給速度が０．１〜０．１２（ｇ油脂）×（ｇ正味乾燥菌体重量）^−１×（ｈ）^−１となるように流加した。ここで、比基質供給速度とは、単位時間に正味の菌体重量あたり供給される油脂の量、つまり、正味の乾燥菌体重量あたりの油脂流加速度として定義される培養変数である。また、正味の乾燥菌体重量とは、全乾燥菌体重量から含有するポリエステル重量を差し引いた乾燥菌体重量である。すなわち、比基質供給速度は以下の式より求められる値である。
比基質供給速度＝油脂流加速度（ｇ／ｈ）／正味の乾燥菌体重量（ｇ）＝単位時間あたりの油脂の供給量（ｇ／ｈ）／（全乾燥菌体重量（ｇ）−ポリエステル含有量（ｇ））
また、リン酸塩水溶液を培養２０時間目以降、Ｃ／Ｐ比が６００〜８００となるような流速にて連続的に添加した。培養は約６４時間行い、培養終了後、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。

得られた乾燥菌体約１ｇに１００ｍｌのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のポリエステルを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が約３０ｍｌになるまで濃縮後、約９０ｍｌのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置した。析出したポリエステルをろ別後、５０℃で３時間真空乾燥した。乾燥ポリエステルの重量を測定し、菌体内のポリマー含量を算出した。

共重合ポリエステルの３ＨＨ組成は以下のようにガスクロマトグラフィーによって測定した。

乾燥ポリエステルの約２０ｍｇに２ｍｌの硫酸−メタノール混液（１５：８５）と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱することでポリエステル分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに１．５ｇの炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えて中和し、炭酸ガスの発生がとまるまで放置した。４ｍｌのジイソプロピルエーテルを添加してよく混合した後、遠心して、上清中のポリエステル分解物のモノマーユニット組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。ガスクロマトグラフは島津製作所ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡＢＯＮＤ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。キャリアガスとしてＨｅを用い、カラム入口圧１００ｋＰａとし、サンプルは１μlを注入した。温度条件は、初発温度１００〜２００℃まで８℃／分の速度で昇温、さらに２００〜２９０℃まで３０℃／分の速度で昇温した。

細胞中に蓄積された共重合ポリエステルの含量は、加藤らの方法（Appl. Microbiol. Biotechnol. 45, 363 (1996)、Bull. Chem. Soc. 69, 515 (1996)）に従い、培養細胞からクロロホルムを用いて抽出し、乾燥後の重量を測定することで求めた。

（実施例２）
リン酸塩水溶液をＣ／Ｐ比が３００〜４００となるような流速で添加した点を除いて、実施例１と同様の条件で培養を実施した。

（実施例３）
リン酸塩水溶液をＣ／Ｐ比が２００〜３００となるような流速で添加した点を除いて、実施例１と同様の条件で培養を実施した。

（実施例４）
リン酸塩水溶液をＣ／Ｐ比が１２００〜１６００となるような流速で添加した点を除いて、実施例１と同様の条件で培養を実施した。

（実施例５）
培養液量５．４Ｌ、撹拌速度４００ｒｐｍ、通気量３．６Ｌ／ｍｉｎ．とした点を除いて、実施例１と同様の条件で培養を実施した。

（実施例６）
リン酸塩水溶液をＣ／Ｐ比が１００〜２００となるような流速で添加した点を除いて、実施例５と同様の条件で培養を実施した。

（比較例１）
培養中にリン酸塩水溶液を流加しないという変更点を除いて、実施例１と同様の条件で培養を実施した。

リン酸塩水溶液の添加が３ＨＨ組成に与える影響を表１に示した。

この結果から、培養中にリン酸塩水溶液を流加することにより、共重合ポリエステル中の３ＨＨ組成が上昇することが分かった。また、Ｃ／Ｐ比の低下に伴い、言い換えれば炭素源流加速度に対するリン流加速度を相対的に高めるにつれて、共重合ポリエステル中の３ＨＨ組成がより上昇することが明らかとなった。また、リン酸塩水溶液の流加により、ポリマー生産性が高まるが、Ｃ／Ｐ比が一定値以下となるとＰＨＢＨ生産性が低下することが明らかとなった。

（実施例７）
パーム核油オレインのかわりにパームＷオレイン油を用いた以外は実施例１と同様の培地・条件で培養を行い、表２に示す結果を得た。

（比較例２）
培養中にリン酸塩水溶液を流加しないという変更点を除いて、実施例７と同様の条件で培養を実施した。使用する炭素源が３ＨＨ組成に与える影響を表２に示した。

表２に示されているように、パームＷオレイン油を炭素源として用いた場合においても、パーム核油オレインを用いた場合と同様に、リン酸塩水溶液を流加することによって、ポリエステル中の３ＨＨ組成が向上することがわかった。しかしながら、同じリン酸塩水溶液供給条件下、３ＨＨ組成をパームＷオレイン油と実施例１のパーム核油オレインで比較すると、パームＷオレイン油の方が明らかに低く、同じリン酸塩水溶液供給条件下でも、基質として使用する油脂の違いによって、得られる３ＨＨ組成に差があることがわかった。

（実施例８）
培養に使用する菌株を国際公開公報ＷＯ２００８／０１０２９６号に記載のＫＮＫ−００５株とした点を除いて、実施例１と同様の条件で培養を行った。表３に結果を記した。

（比較例３）
培養中にリン酸塩水溶液を流加しないという変更点を除いて、実施例８と同様の条件で培養を実施した。使用する菌株の違いが３ＨＨ組成に与える影響を表３に示した。

上記結果から、使用菌株に拠らず、リン酸塩水溶液流加による３ＨＨ組成向上効果が認められることが分かった。

Claims

モノマーユニットとして少なくとも３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸を含む２種以上の構成要素よりなる共重合ポリエステルを生産するカプリアヴィドゥス（Cupriavidus）属に属する微生物を、天然油脂及び／又は分別油脂を炭素源として含む培地で培養し、かつ培養中に培地にリン化合物を添加することを特徴とするＰＨＡの製造方法であって、前記培地にリン化合物を添加する期間の単位時間当たりに添加する炭素源中の炭素総量（Ｃ）の単位時間当たりに添加するリン化合物中のリン総量（Ｐ）に対する重量比（Ｃ／Ｐ比）が６００超〜１６００であることを特徴とするＰＨＡの製造方法。
前記Ｃ／Ｐ比が６００超〜８００であることを特徴とする請求項１記載のＰＨＡの製造方法。
前記リン化合物が、リン酸及び／又はリン酸塩を含むことを特徴とする請求項１または２記載のＰＨＡの製造方法。
前記共重合ポリエステルがＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）である請求項１〜３いずれか一項に記載のＰＨＡの製造方法。
前記微生物が、ポリエステル重合酵素遺伝子を組み込んだ形質転換微生物である請求項１〜４いずれか一項に記載のＰＨＡの製造方法。