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JP5816558B2 - Ｃａｄｍ１に特異的な完全ヒト抗体 - Google Patents

Ｃａｄｍ１に特異的な完全ヒト抗体 Download PDF

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Description

（関連出願）
本出願は、2009年3月5日に出願の米国仮出願第61/209471号及び2009年3月5日に出願の米国仮出願第61/209390号の利益を主張するものであり、この両方は引用によりその全てが本明細書に組み込まれる。
(発明の分野)
本発明は、全般的に、免疫学及び分子生物学の分野に関する。より詳しくは、本明細書に提供するのは、抗体、特にFc受容体への結合増加及び／又はADCCに対する効力増加を生じさせる改変抗体、及び免疫抱合体、免疫グロブリン様細胞接着因子CADM1に対して指示された他の治療的タンパク質、当該抗体及び治療的タンパク質をコードする核酸、発明のモノクローナル抗体及び他の治療的タンパク質を調製する方法、並びに疾患、例えばCADM1発現/活性により媒介される癌、及び／又は従ってリガンドの異常な発現/活性と関連する癌の治療方法である。
（本発明の背景）
細胞接着分子は、通常、カドヘリン、インテグリン、セレクチンとして、又は免疫グロブリン（Ig）スーパーファミリーのメンバーとして同定される。免疫グロブリンスーパーファミリー分子には、免疫系の細胞表面抗原受容体、共受容体及び共刺激分子、リンパ球に対する抗原提示に関与する分子、細胞接着分子、及びいくつかのサイトカイン受容体を含む。Igスーパーファミリー細胞接着分子は、脊椎動物において100超の分子を構成し、NCAM（神経細胞接着因子）、L1ファミリーCAM、ICAMS（細胞内細胞接着分子）、VCAMS（血管細胞接着因子）、SIGLEC（CD22及びCD83を含む、シアル酸結合Ig様レクチン）、ネクチン、CD2、CD48を含む。
免疫グロブリンスーパーファミリー分子CADM1は、複数の研究グループによってはじめて特徴づけられた。その結果、該分子は、科学文献において、細胞接着分子1、シナプス細胞接着分子（synCAM）、精子形成免疫グロブリンスーパーファミリー分子（sgIGSF）、IGSF4、BL2、ST17、NECL2、RA175及びCADM1Aを含む多くの名称により同定される。はじめに、腫瘍抑制因子として更に作用することが報告され、これは、TSLC1としても公知である(Murakamiらの文献, Nature Genetics 27(4):427 (2001))。
接着活性のためにCa+2又はMg+2などの二価のカチオンを必要とするカドヘリン及びインテグリンとは異なり、Igスーパーファミリー分子は、典型的には、Ca+2又はMg+2とは独立である。CADM1構造は、3つの免疫グロブリン様モチーフを有する細胞外ドメイン、1つの疎水性膜貫通αヘリックス、及びDAL-1を介してアクチン線維を結合する細胞内ドメイン、及びPDZ結合モチーフを含む短いC末端細胞質尾部を有するものとして特徴づけられる。2つのCADM1アイソフォームであるNM_014333及びNM_001098517が公知であり、該後者は27アミノ酸の欠失を有する。分析は、CADM1の細胞質ドメインに対応するアミノ酸配列が5種の哺乳動物において同一であり、かつ脊椎動物において高度に保存されていることを示し、これは通常の細胞間相互作用におけるCADM1の重要な役割を示唆する。マウスCADM1オルソログ（AAQ023810）は、ヒトCADM1に97%の同一性を示す。(Fukamiらの文献, Gene 295:7-12 (2002))。
CADM1は、神経細胞及びマスト細胞（Itoらの文献 J Pharmacol Sci.;102(1):1-5 (2006)）、肺胞細胞（Itoらの文献 Histol Histopathol. 18(4):1321-9 (2003)）、膵臓分泌細胞（Shingaiらの文献 J Biol Chem.; 278(37):35421-7 (2003)）、（Wakayamaらの文献, Blood;101(7):2601-8 (2003)）において発現される。また、肝細胞癌（HCC）とも関連する。CADM1は、胎児及び硬化性成人胆管細胞において発現するようであるが、無病成人胆管には無い（Itoらの文献, Hepatology;45(3):684-94 (2007)）。それは、グリア芽細胞腫及び肺癌と関連していることが更に報告される。
プロモータメチル化を介して、及び遺伝子座のヘテロ接合の欠失を介して、CADM1不活性化を結果的に生じる2つの機構が確認された。CADM1プロモータのメチル化は、報告によると、肺癌、食道癌、膵臓癌、乳癌、及び前立腺癌を含む腫瘍、特に攻撃行動を有する腫瘍におけるCADM1発現の欠失を結果的に生じる。(Murakamiらの文献, Mol Cancer. 4:28 (2005))。
（本発明の要旨）
本発明は、抗体、特にFc受容体への結合増加及び／又はADCCに対する効力増加を生じさせ、それゆえCADM1に対して指示された改変抗体及び免疫抱合体、当該抗体及び治療的タンパク質をコードする核酸、抗CADM1モノクローナル抗体及び他の治療的タンパク質を調製する方法、並びに疾患、例えばCADM1媒介型障害、例えばヒトの癌、例えば小細胞肺癌、成人T細胞白血病、非小細胞肺癌（扁平上皮癌及び腺癌を含む）、メラノーマ、乳癌、結腸直腸癌、卵巣癌、前立腺癌、神経内分泌癌、例えば肺、副腎、下垂体、胃腸管、腎臓、肝臓（肝細胞癌を含む）、膵臓（インスリノーマおよびグルカゴノーマを含む）の神経内分泌癌、グリア芽細胞腫、及びカルチノイド腫瘍、例えば膵臓、肺、胃腸管、肝臓又は腎臓のカルチノイド腫瘍などの治療方法を提供することにより、それらに関連する需要に対処する。
従って、本発明は、1以上の骨形態形成タンパク質及び受容体に結合し、それゆえ1以上の望ましい機能特性を呈する、単離されたモノクローナル抗体、特にマウス、キメラ、ヒト化、及び完全ヒトモノクローナル抗体を提供する。当該特性には、例えば、ヒトCADM1への高親和性特異的結合を含む。本発明の抗体、タンパク質及び組成物を使用して様々なCADM1媒介性疾患を治療するための方法も提供する。
本発明は、配列番号19、20又は21に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号22、23又は24に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体により認識されるヒトCADM1上のエピトープを結合する、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分、抗体断片、又は抗体模倣体を提供する。いくつかの実施態様において、単離された抗体は、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4アイソタイプの全長抗体である。
いくつかの実施態様において、本発明の抗体は、以下からなる群から選択される：全抗体、抗体断片、ヒト化抗体、単鎖抗体、免疫抱合体、Fc受容体への結合増加及び／又はADCCに対する効力増加を生じさせる改変抗体、及び二重特異性抗体。好ましい実施態様において、本発明の抗体は、Fc受容体への結合増加及び／又はADCCに対する効力増加を生じさせる免疫抱合体又は改変抗体である。抗体断片は、以下からなる群から選択できる：ユニボディ、ドメイン抗体、及びナノボディ。いくつかの実施態様において、本発明の免疫抱合体は、治療剤を含む。本発明の別の態様において、治療剤は、細胞毒又はラジオアイソトープである。
いくつかの実施態様において、本発明の抗体は、以下からなる群から選択される：アフィボディ、DARPin、アンチカリン、アビマー、バーサボディ、及びデュオカリン。
本発明のいくつかの態様において、抗体は、50Nm未満、10Nm未満又は1Nm未満のEC50でヒトCADM1に結合する。
選択的実施態様において、本発明の組成物は、単離された抗体又は抗原結合部分及び医薬として許容し得る担体を含む。
他の態様において、本発明の抗体は、請求項１記載の単離された抗体又は抗原結合部分及び医薬として許容し得る担体を含む組成物である。
いくつかの実施態様において、本発明は、ヒトCADM1上のエピトープを結合する単離された抗体の重鎖若しくは軽鎖又は抗原結合部分をコードする単離された核酸分子を含む。他の本発明の態様は、当該核酸分子を含む発現ベクター及びそのようなものを含む宿主細胞を含む。
いくつかの実施態様において、本発明は、抗CADM1抗体を調製するための方法を提供し、前記方法は以下の工程を含む：本発明の抗体をコードする1以上の核酸分子を含む宿主細胞を得ること；宿主細胞培地で該宿主細胞を培養すること；1以上の核酸分子が発現される宿主細胞培養条件を提供すること；及び、該宿主細胞から、又は宿主細胞培地から抗体を回収すること。
他の実施態様において、本発明は、CADM1を発現する標的細胞に関連する疾患を治療又は予防するための方法であって、対象に、抗CADM1抗体又はその抗原結合部分を、該疾患を治療又は予防するのに有効な量で投与する工程を含む前記方法に関する。いくつかの態様において、本発明の抗体又はその抗原結合部分により治療又は予防される疾患は、ヒトの癌からなる群から選択される。いくつかの実施態様において、本発明の抗体により治療又は予防される疾患は、以下からなる群から選択される癌である：小細胞肺癌、成人T細胞白血病、非小細胞肺癌（扁平上皮癌及び腺癌を含む）、メラノーマ、乳癌、結腸直腸癌、卵巣癌、前立腺癌、神経内分泌癌、例えば肺、副腎、下垂体、胃腸管、腎臓、肝臓（肝細胞癌を含む）、膵臓（インスリノーマ及びグルカゴノーマを含む）の神経内分泌癌、グリア芽細胞腫、及びカルチノイド腫瘍、例えば膵臓、肺、胃腸管、肝臓又は腎臓のカルチノイド腫瘍。
他の実施態様において、本発明は、CADM1を発現する標的細胞に関連する疾患の治療又は予防における使用のための抗CADM1抗体又はその抗原結合部分に関する。いくつかの態様において、本発明の抗体又はその抗原結合部分により治療又は予防される疾患は、ヒトの癌である。いくつかの実施態様において、本発明の抗体により治療又は予防される疾患は、以下からなる群から選択される癌である：小細胞肺癌、成人T細胞白血病、非小細胞肺癌（扁平上皮癌及び腺癌を含む）、メラノーマ、乳癌、結腸直腸癌、卵巣癌、前立腺癌、神経内分泌癌、例えば、肺、副腎、下垂体、胃腸管、腎臓、肝臓（肝細胞癌を含む）、膵臓（インスリノーマ及びグルカゴノーマを含む）の神経内分泌癌、グリア芽細胞腫、及びカルチノイド腫瘍、例えば、膵臓、肺、胃腸管、肝臓又は腎臓のカルチノイド腫瘍。
他の実施態様において、本発明は、CADM1を発現する標的細胞に関連する疾患の治療又は予防における使用のための医薬の製造のための抗CADM1抗体又はその抗原結合部分の使用に関する。いくつかの態様において、本発明の医薬により治療又は予防される疾患は、ヒトの癌である。いくつかの実施態様において、本発明の医薬により治療又は予防される疾患は、以下からなる群から選択される癌である：小細胞肺癌、成人T細胞白血病、非小細胞肺癌（扁平上皮癌及び腺癌を含む）、メラノーマ、乳癌、結腸直腸癌、卵巣癌、前立腺癌、神経内分泌癌、例えば、肺、副腎、下垂体、胃腸管、腎臓、肝臓（肝細胞癌を含む）、膵臓（インスリノーマ及びグルカゴノーマを含む）の神経内分泌癌、グリア芽細胞腫、及びカルチノイド腫瘍、例えば、膵臓、肺、胃腸管、肝臓又は腎臓のカルチノイド腫瘍。
他の実施態様において、本発明は、以下からなる群から選択される重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗体により認識されるヒトCADM1上のエピトープを結合する単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分、抗体断片、又は抗体模倣体である：配列番号19に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号22に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列；配列番号20に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号23に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列；配列番号21に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列、及び配列番号24に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列。更なる態様において、抗体は、以下からなる群から選択される：全抗体、抗体断片、ヒト化抗体、単鎖抗体、免疫抱合体、Fc受容体への結合増加及び／又はADCCに対する効力増加を生じさせる改変抗体、及び二重特異性抗体。好ましい態様において、抗体は、Fc受容体への結合増加及び／又はADCCに対する効力増加を生じさせる免疫抱合体又は改変抗体である。本発明の更なる態様において、抗体断片は、以下からなる群から選択される：ユニボディ、ドメイン抗体、及びナノボディ。いくつかの実施態様において、抗体模倣体は、以下からなる群から選択される：アフィボディ、DARPin、アンチカリン、アビマー、バーサボディ、及びデュオカリン。更なる実施態様において、組成物は、単離された抗体又は抗原結合部分及び医薬として許容し得る担体を含む。
いくつかの実施態様において、本発明は、本発明の抗体の単離された抗体の重鎖若しくは軽鎖又はその抗原結合部分をコードする単離された核酸分子であり、更なる態様において、当該核酸を含む発現ベクター、及び当該発現ベクターを含む宿主細胞を含み得る。
本発明の別の実施態様は、本発明の抗体の任意の1つの抗体又はその抗原結合部分を発現するハイブリドーマである。
本発明の他の態様は、本発明の抗体を生産する方法に関し、当該生産方法は以下の工程を含む：CADM1ペプチドでヒト免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニック動物を免疫すること；前記トランスジェニック動物からB細胞を回収すること；前記B細胞からハイブリドーマを作成すること；CADM1を結合する抗体を発現するハイブリドーマを選択すること；及び、前記選択されたハイブリドーマからCADM1を結合する前記抗体を回収すること。
他の実施態様において、抗CADM1抗体を生産する方法は、以下の工程を含む：
CADM1ペプチドでヒト免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニック動物を免疫すること；
前記トランスジェニック動物のB細胞からmRNAを回収すること；
前記mRNAをcDNAに変換すること；
前記cDNAによりコードされる抗CADM1抗体がファージの表面に提示されるようにファージにおいて前記cDNAを発現させること；
抗CADM1抗体を提示するファージを選択すること；
前記抗CADM1免疫グロブリンをコードする前記選択されたファージから核酸分子を回収すること；
宿主細胞において前記回収された核酸分子を発現させること；及び、
CADM1を結合する前記宿主細胞から抗体を回収すること。
本発明のいくつかの態様において、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分は、配列番号19、20又は21に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号22、23又は24に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体により認識される配列番号43又は44のアミノ酸配列を有するCADM1ポリペプチド上のエピトープを結合する。
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び実施例から明らかであり、これらは限定として解釈されるべきではない。本出願の全体にわたって引用される全ての引用文献、Genbankエントリ、特許及び公開特許出願の内容は、明示的に引用により本明細書に組み込まれる。
PTA021_A1ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号25）及びアミノ酸配列（配列番号19）を示す。CDR1（配列番号1）、CDR2（配列番号4）及びCDR3（配列番号7）領域が詳細に描写され、V、D及びJ生殖細胞系列誘導体が示される。
PTA021_A1ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号28）及びアミノ酸配列（配列番号22）を示す。CDR1（配列番号10）、CDR2（配列番号13）及びCDR3（配列番号16）領域が詳細に描写され、V及びJ生殖細胞系列誘導体が示される。
PTA021_A2ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号26）及びアミノ酸配列（配列番号20）を示す。CDR1（配列番号2）、CDR2（配列番号5）及びCDR3（配列番号8）領域が詳細に描写され、V及びJ生殖細胞系列誘導体が示される。
PTA021_A2ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号29）及びアミノ酸配列（配列番号23）を示す。CDR1（配列番号11）、CDR2（配列番号14）及びCDR3（配列番号17）領域が詳細に描写され、V及びJ生殖細胞系列誘導体が示される。
PTA021_A3ヒトモノクローナル抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号27）及びアミノ酸配列（配列番号21）を示す。CDR1（配列番号3）、CDR2（配列番号6）及びCDR3（配列番号9）領域が詳細に描写され、V、D及びJ生殖細胞系列誘導体が示される。
PTA021_A3ヒトモノクローナル抗体の軽鎖可変領域のヌクレオチド配列（配列番号30）及びアミノ酸配列（配列番号24）を示す。CDR1（配列番号12）、CDR2（配列番号15）及びCDR3（配列番号18）領域が詳細に描写され、V及びJ生殖細胞系列誘導体が示される。
ヒト生殖細胞系列VH 2-05アミノ酸配列（配列番号31）及びヒト生殖細胞系列JH JH5bアミノ酸配列（配列番号37）とPTA021_A1（配列番号19）の重鎖可変領域とのアミノ酸配列のアライメントを示す。
ヒト生殖細胞系列VH 2-05アミノ酸配列（配列番号32）及びヒト生殖細胞系列JH 5bアミノ酸配列（配列番号38）とPTA021_A2（配列番号20）の重鎖可変領域とのアミノ酸配列のアライメントを示す。
ヒト生殖細胞系列VH 2-05アミノ酸配列（配列番号33）及びヒト生殖細胞系列JH 5bアミノ酸配列（配列番号39）とPTA021_A3（配列番号21）の重鎖可変領域とのアミノ酸配列のアライメントを示す。
ヒト生殖細胞系列VK L15アミノ酸配列（配列番号34）及びヒト生殖細胞系列JK 4アミノ酸配列（配列番号40）とPTA021_A1（配列番号22）の軽鎖可変領域とのアミノ酸配列のアライメントを示す。
ヒト生殖細胞系列Vk L15アミノ酸配列（配列番号35）及びヒト生殖細胞系列JK 4アミノ酸配列（配列番号41）とPTA021_A2（配列番号23）の軽鎖可変領域とのアミノ酸配列のアライメントを示す。
ヒト生殖細胞系列Vk L15アミノ酸配列（配列番号36）及びヒト生殖細胞系列JK 4アミノ酸配列（配列番号42）とPTA021_A3（配列番号24）の軽鎖可変領域とのアミノ酸配列のアライメントを示す。
NCI-H69小細胞肺癌細胞におけるPTA021_A1、PTA021_A2及びPTA021_A3でのFACS分析の結果を示す。
それぞれNCI-H69及びDMS79小細胞肺癌細胞におけるPTA021_A1、PTA021_A2及びPTA021_A3でのFACS分析の結果を示す。
SKOV3卵巣癌細胞におけるPTA021_A3でのFACS分析の結果を示す。
A549非小細胞肺癌細胞におけるPTA021_A3でのFACS分析の結果を示す。
786-O腎細胞種細胞及びSkMel28メラノーマ細胞におけるPTA021_A3でのFACS分析の結果を示す。
NCI-H69及びDMS79小細胞肺癌細胞におけるPTA021_A3及びPTA021_A3の非フコシル化されたバージョン（nf）でのFACS分析の結果を示す。
それぞれDMS79及びNC1-H69細胞株でのPTA021_A1、PTA021_A2及びPTA021_A3により媒介される抗体依存性細胞傷害活性（ADCC）を示す。
それぞれDMS79及びNCI-H69細胞におけるPTA021_A1、PTA021_A2及びPTA021_A3でのHum-ZAPアッセイの結果を示す。
マウス異種移植モデルのHepG2腫瘍サイズにおけるフコシル化又は非フコシル化PTA021_A3抗体を使用する治療の効果を示すグラフを表す。
マウス異種移植モデルのHepG2腫瘍サイズにおけるPTA021_A3-式M抱合体での治療の効果を示すグラフを表す。
マウス異種移植モデルのDMS79腫瘍サイズにおける0.3umol/kg投与量のPTA021_A3-式M抱合体での治療の効果を示すグラフを表す。 マウス異種移植モデルのDMS79腫瘍サイズにおける0.1及び0.03umol/kgの投与量のPTA021_A3-式M抱合体での治療の効果を示すグラフを表す。当該研究は60日目で完了する。
それぞれ、HepG2、786-O及びDMS79細胞におけるPTA021_A3及び非フコシル化PTA021_A3のADCC活性を示すグラフを表す。
マウス異種移植モデルのDMS79腫瘍サイズにおける、PTA021_A3抗体単独での又はシスプラチンと組み合わせての治療の効果を示すグラフを表す。
カニクイザルマカクにおけるPTA021_A3及びPTA021_A3の非フコシル化バージョン（NF）の探索毒物学研究における雄サル及び雌サルについてのそれぞれの体重データを示す。
カニクイザルマカクにおけるPTA021_A3及びPTA021_A3の非フコシル化バージョン（NF）の探索毒物学研究における雄サル及び雌サルについてのそれぞれのグルコースデータを示す。
カニクイザルマカクにおけるPTA021_A3及びPTA021_A3の非フコシル化バージョン（NF）の探索毒物学研究における雄サル及び雌サルについてのそれぞれのアラニントランスアミナーゼデータを示す。
カニクイザルマカクにおけるPTA021_A3及びPTA021_A3の非フコシル化バージョン（NF）の探索毒物学研究における雄サル及び雌サルについてのそれぞれのアスパラギン酸トランスアミナーゼデータを示す。
カニクイザルマカクにおけるPTA021_A3及びPTA021_A3の非フコシル化バージョン（NF）の探索毒物学研究における雄サル及び雌サルについてのそれぞれのアルカリホスファターゼデータを示す。
カニクイザルマカクにおけるPTA021_A3及びPTA021_A3の非フコシル化バージョン（NF）の探索毒物学研究における雄サル及び雌サルについてのそれぞれの乳酸デヒドロゲナーゼデータを示す。
カニクイザルマカクにおけるPTA021_A3及びPTA021_A3の非フコシル化バージョン（NF）の探索毒物学研究における雄サル及び雌サルについてのそれぞれのRBCデータを示す。
カニクイザルマカクにおけるPTA021_A3及びPTA021_A3の非フコシル化バージョン（NF）の探索毒物学研究における雄サル及び雌サルについてのそれぞれのWBCデータを示す。
(発明の詳細な説明)
本発明は、高親和性でCADM1に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体、具体的にはヒトモノクローナル抗体、より具体的にはFc受容体への結合増加及び／又はADCCに対する効力増加を生じさせる免疫抱合体及び改変抗体に関する。ある種の実施態様において、本発明の抗体は、特定の重鎖及び軽鎖生殖細胞系列配列に由来し、及び／又は特定のアミノ酸配列を含むCDR領域などの特定の構造的特徴を含む。本発明は、単離された抗体、Fc受容体への結合増加及び／又はADCCに対する効力増加を生じさせる改変抗体、免疫抱合体、二重特異性分子、アフィボディ、ドメイン抗体、ナノボディ、及びユニボディ、前記分子を生産する方法、並びに前記分子及び医薬担体を含む医薬組成物を提供する。本発明は、該分子を使用して、例えば、小細胞肺癌、並びに神経内分泌膵臓癌、肺カルチノイド及び胃腸カルチノイドなどの腫瘍において発現されるCADM1などの、CADM1を検出する方法、並びにCADM1の発現に関連する疾患を治療する方法にも関する。
本発明がより容易に理解できるように、特定の用語が最初に定められる。追加的な定義は、詳細な説明の全体にわたって記載される。
用語「CADM1」、「IGSF4」、「免疫グロブリンスーパーファミリー、メンバー4D」、「細胞接着分子1」、「肺癌の腫瘍抑制因子1」、「TSLC1」、「BL2」、「ST17」、「シナプス細胞接着分子」、「シンカム1」、「ネクチン様タンパク質2」及び「NECL2」は互換的に使用され、かつヒトCADM1の異型、アイソフォーム及び種ホモログを含み、CADM1アイソフォーム1（Genbankアクセッション番号NM_014333）及び2（Genbankアクセッション番号NM_001098517）を含む。2つのアイソフォームがPCT出願（OBT整理番号：OGL-P121PCT）においてOGTA025a及びOGTA025bとして同定され、これらは引用によりその全てが本明細書に組み込まれる。本開示に係るヒト抗体は、特定の事例において、ヒト以外の種由来のCADM1と交差反応できる。ある種の実施態様において、抗体は、1以上のヒトCADM1に完全に特異的であり得、かつ非ヒトの種又は他のタイプの交差反応性を呈することができない。例示的なヒトCADM1の完全なアミノ酸配列は、Genbankアクセッション番号NM_014333を有する。
用語「免疫応答」とは、例えば、病原体の侵入、病原体に感染した細胞若しくは組織、癌細胞、又は自己免疫若しくは病理学的炎症の場合には正常なヒト細胞若しくは組織に係るヒト身体への選択的損傷、破壊又は排除をもたらす、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、及び前記細胞により生産される可溶性巨大分子又は肝臓（抗体、サイトカイン及び補体を含む）の作用をいう。
「シグナル伝達経路」とは、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達に役割を果たす様々なシグナル伝達分子間の生化学的関係をいう。本明細書で使用される句「細胞表面受容体」には、例えば、シグナルを受信できる分子及び分子の複合体、並びに細胞の原形質膜を介する当該シグナルの伝達を含む。本発明の「細胞表面受容体」の例は、CADM1受容体である。
本明細書にいう用語「抗体」には、全抗体及び任意の抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）又はその単鎖を含む。「抗体」とは、ジスルフィド結合によって相互結合された少なくとも2つの重(H)鎖及び2つの軽(L)鎖を含み得る糖タンパク質又はその抗原結合部分をいう。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてVHと略記される）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、3つのドメイン、CH1、CH2及びCH3を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてVL又はVKと略記される）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、1つのドメイン、CLを含む。VH及びVL/VK領域は、フレームワーク領域（FR）と称されるより保存された領域で仕切られた、相補性決定領域（CDR）と称される超可変性の領域に更に再分割できる。各VH及びVL/VKは、3つのCDR及び4つのFRから構成され、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端まで配置される：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系（例えば、エフェクター細胞）の様々な細胞、及び古典的補体系の第一成分（Clq）を含む宿主組織又は因子に免疫グロブリンの結合を伝達できる。
本明細書で使用される用語抗体の「抗原結合部分」又は単に「抗体部分」とは、抗原（例えば、CADM1）に特異的に結合する能力を保持する抗体の1以上の断片をいう。抗体の抗原結合機能は全長抗体の断片により実行できることが示された。用語抗体の「抗原結合部分」内に包含される結合断片の例には、以下のものを含む：（i）VL/VK、VH、CL及びCH1ドメインから構成されている一価の断片である、Fab断片；(ii)ヒンジ領域でジスルフィド結合により連結された2つのFab断片を含む二価断片である、F(ab')2断片；（iii）基本的にヒンジ領域の一部を有するFabである、Fab'断片（基礎免疫学（FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY）(Paul編, 第3版 1993を参照されたい）；（iv）VH及びCH1ドメインから構成されているFd断片；（v）抗体の1つのアームのVL及びVHドメインから構成されているFv断片；（vi）VHドメインから構成されているdAb断片（Wardらの文献, (1989) Nature 341:544-546）；（vii）単離された相補性決定領域（CDR）；及び、（viii）1つの可変ドメイン及び2つの定常ドメインを含む重鎖可変領域である、ナノボディ。さらに、Fv断片の2つのドメイン、VL/VK及びVHは別々の遺伝子によってコードされるが、これらは、組換え法を使用して、VL/VK及びVH領域が対になって一価の分子を形成する単一タンパク質鎖として作成されることを可能にする合成リンカーによって連結できる（単鎖Fv（scFv）として公知）。例えば、Birdらの文献 (1988) Science 242:423-426;及び、Hustonらの文献 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)を参照されたい。当該単鎖抗体は、用語抗体の「抗原結合部分」内に包含されることも意図される。これらの抗体断片は当業者に公知の従来の技術を使用して得られ、該断片は、インタクト（intact）抗体として同様式で有用性について選別される。
本明細書で使用される「単離された抗体」には、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体をいうことが意図される（例えば、CADM1を特異的に結合する単離された抗体は、CADM1以外の抗原を特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、CADM1を特異的に結合する単離された抗体は、他の種からのCADM1分子などの他の抗原に交差反応性を有することができる。さらに、単離された抗体は、他の細胞成分及び／又は化学物質を実質的に含まなくてもよい。
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」とは、単一分子組成の抗体分子の調製物をいう。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性及び親和性を示す。
本明細書で使用される用語「ヒト抗体」には、フレームワーク及びCDR領域の両方がヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことを意図する。さらに、抗体が定常領域を含む場合、該定常領域もヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基を含み得る（例えば、インビトロのランダム若しくは部位特異的突然変異導入によって、又はインビボの体細胞突然変異によって導入される突然変異）。しかしながら、本明細書で使用される用語「ヒト抗体」は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含むことを意図しない。
用語「ヒトモノクローナル抗体」とは、フレームワーク及びCDR領域の両方がヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する単一の結合特異性を示す抗体をいう。一実施態様において、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合されたヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物（例えば、トランスジェニックマウス）から得られるB細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
本明細書で使用される用語「組換えヒト抗体」には、組換え手段により調製され、発現され、作成され、又は単離される全てのヒト抗体を含み、例えば、(a)ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニック動物又は染色体導入動物（例えば、マウス）から単離した抗体（更に以下に記載する）、(b)例えばトランスフェクトーマからヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から単離される抗体、(c)組換えのコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離される抗体、及び(d)他のDNA配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングに関与する任意の他の手段により調製され、発現され、作成され、又は単離される抗体を含む。当該組換えヒト抗体は、フレームワーク及びCDR領域がヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかしながら、ある種の実施態様において、当該組換えヒト抗体は、インビトロ突然変異導入（又は、ヒトIg配列の動物トランスジェニックが使用される場合には、インビボ体細胞変異）に供することができ、それゆえ、該組換え抗体のVH及びVL/VK領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列VH及びVL/VK配列に由来及び関連する一方で、インビボでヒト抗体生殖細胞系列レパートリに天然には存在し得ない配列である。
本明細書で使用される「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス（例えば、IgM又はIgG1）をいう。
句「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」は、本明細書において、用語「抗原に特異的に結合する抗体」と互換的に使用される。
用語「ヒト抗体誘導体」とは、ヒト抗体の任意の修飾形態をいう（例えば、該抗体及び別の薬剤又は抗体の抱合体）。
用語「ヒト化抗体」とは、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するCDR配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体をいうことを意図する。さらなるフレームワーク領域修飾は、ヒトフレームワーク配列内でなし得る。
用語「キメラ抗体」は、可変領域配列がある種に由来し、かつ定常領域配列が別の種に由来する抗体、例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来し、かつ定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体をいうことを意図する。
本明細書で使用される「ヒトCADM1に特異的に結合する」抗体は、50Nm以下、10Nm以下、又はより好ましくは1Nm以下のEC50でヒトCADM1に結合する抗体をいうことを意図する。
本明細書に使用される用語タンパク質又は細胞に「実質的に結合しない」は、タンパク質若しくは細胞に結合しない、又は高親和性で結合しないこと、すなわち1×10-6M以上、より好ましくは1×10-5M以上、より好ましくは1×10-4M以上、より好ましくは1×10-3M以上、又はより更に好ましくは1×10-2M以上のKDでタンパク質又は細胞に結合することを意味する。
本明細書で使用される用語「EC50」は、50%の最大応答/効果をもたらす濃度を定量することにより化合物の効力をいうことを意図する。
本明細書で使用される用語「Kassoc」又は「Ka」は特定の抗体-抗原相互作用の相互作用速度をいうことを意図し、本明細書で使用される用語「Kdis」又は「Kd」は特定の抗体-抗原相互作用の解離速度をいうことを意図する。本明細書で使用される用語「KD」は解離定数をいうことを意図し、これはKaに対するKdの比（すなわち、Kd/Ka）から得られ、モル濃度(M)として表現される。抗体についてのKD値は、当該技術分野においてよく確立された方法を使用して決定できる。抗体のKDを決定する好ましい方法は、表面プラスモン共鳴を使用すること、好ましくはBiacore（登録商標）システムなどのバイオセンサシステムを使用することである。
本明細書で使用されるIgG抗体についての用語「高親和性」とは、標的抗原に対し1×10-7M以下、好ましくは5×10-8M以下、さらにより好ましくは1×10-8M以下、さらにより好ましくは5×10-9M以下、及びさらにより好ましくは1×10-9M以下のKDを有する抗体をいう。しかしながら、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプに対して変化し得る。例えば、IgMアイソタイプについての「高親和性」結合とは、10-6M以下、より好ましくは10-7M以下、さらにより好ましくは10-8M以下のKDを有する抗体をいう。
用語「エピトープ」又は「抗原決定基」とは、免疫グロブリン又は抗体が特異的に結合する抗原上の部位をいう。エピトープは、隣接するアミノ酸又はタンパク質の三次フォールディングにより並置される非隣接アミノ酸の両方から形成され得る。隣接するアミノ酸から形成されるエピトープは典型的には変性溶媒への曝露で保持されるが、三次フォールディングにより形成されるエピトープは典型的には変性溶媒での処理で失われる。エピトープは、典型的には、固有の空間コンフォメーションに少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15個のアミノ酸を含む。エピトープの空間コンフォメーションを決定する方法には、X線結晶学及び二次元核磁気共鳴などの当該技術分野の技術並びに本明細書に記載されているものを含む（例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris編 (1996)を参照されたい)。
したがって、本明細書に記載されている抗体（すなわち、PTA021_A1、PTA021_A2及びPTA021_A3）と同じエピトープに結合する（すなわち、認識する）抗体も本発明によって包含される。同じエピトープに結合する抗体は、統計的に有意な様式で標的抗原に対する参照抗体と交差競合する（すなわち、結合を競合的に阻害する）それらの能力により同定できる。競合阻害は、例えば抗体が、同一若しくは構造的に類似のエピトープ（例えば、重複エピトープ）、又は結合する場合に抗体との間に立体障害を引き起こす空間的に近位のエピトープに結合する場合に、発生し得る。
競合阻害は、試験中の免疫グロブリンが共通の抗原への参照抗体の特異的結合を阻害するルーチンアッセイを使用して決定できる。例えば下記のような数多くの型の競合結合測定が公知である：固相直接又は間接放射免疫測定法（RIA）、固相直接又は間接エンザイムイムノアッセイ（EIA）、サンドイッチ競合アッセイ（Stahliらの文献, Methods in Enzymology 9:242 (1983)を参照されたい）；固相直接ビオチン-アビジンEIA（Kirklandらの文献, J. Immunol. 137:3614 (1986)を参照されたい)；固相直接ラベルアッセイ、固相直接ラベルサンドイッチアッセイ（Harlow及びLaneの文献, 「抗体：研究室マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）」, Cold Spring Harbor Press (1988)を参照されたい）；I-125ラベルを使用する固相直接ラベルRIA（Morelらの文献, Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)を参照されたい)；固相直接のビオチン-アビジンEIA（Cheungらの文献, Virology 176:546 (1990)）；及び、直接ラベルRIA。(Moldenhauerらの文献, Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)を参照されたい)。典型的には、当該アッセイは、ラベルしていない試験免疫グロブリン及びラベル参照免疫グロブリンのいずれかを有する固体表面又は細胞に結合された精製抗原の使用が関与する。競合阻害は、試験免疫グロブリンの存在下で該固体表面又は細胞に結合するラベルの量を決定することで測定される。通常、試験免疫グロブリンは、過剰に存在する。通常、競合抗体が過剰に存在する場合、これは共通の抗原への参照抗体の特異的結合を少なくとも50-55%、55-60%、60-65%、65-70% 70-75%又はそれらを上回って阻害するであろう。
他の技術には、例えば、エピトープの原子解像度を提供する抗原：抗体複合体の結晶のX線解析などのエピトープマッピング法を含む。他の方法は、抗原配列内のアミノ酸残基の修飾による結合の欠失がしばしばエピトープ成分の指標とみなされる場合、抗原断片又は抗原の変異させたバリエーションへの該抗体の結合をモニタする。加えて、エピトープマッピングのための計算連結法を使用することもできる。これらの方法は、コンビナトリアルファージディスプレイペプチドライブラリからの親和性単離特異的ショートペプチドに対する関心対象抗体の能力に依存する。該ペプチドは、それから、ペプチドライブラリを選別するために使用される抗体に対応するエピトープの定義のためのリードとみなされる。エピトープマッピングについて、高次構造的に不連続なエピトープをマップすることを示す計算アルゴリズムも開発された。
本明細書で使用される用語「対象」には、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。用語「非ヒト動物」には、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物及び非哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。
本発明の様々な態様は、以下のサブセクションにより詳細に記載されている。
（抗CADM1抗体）
本発明の抗体は、該抗体の特定の機能的特徴又は特性によって特徴づけられる。例えば、抗体は、ヒトCADM1に特異的に結合する。好ましくは、本発明の抗体は、高親和性で、例えば8×10-7M以下、より典型的には1×10-8M以下のKDでCADM1に結合する。本発明の抗CADM1抗体は、好ましくは以下の特徴の1以上を呈する：50Nm以下、10Nm以下、又はより好ましくは1Nm以下のEC50でヒトCADM1に結合する；CADM1を発現するヒト細胞に結合する。
一実施態様において、抗体は、好ましくは、CADM1に存在し、他のタンパク質には存在しない抗原エピトープに結合する。抗体は、典型的には、CADM1を結合するが、他のタンパク質に結合しない、又は低親和性で、例えば1×10-6M以上、より好ましくは1×10-5M以上、より好ましくは1×10-4M以上、より好ましくは1×10-3M以上、さらにより好ましくは1×10-2M以上のKDでタンパク質に結合する。好ましくは、抗体は、関連するタンパク質には結合せず、例えば、抗体はICAM、VCAM又は他の細胞接着分子に実質的に結合しない。一実施態様において、抗体は、CADM1を発現する細胞に内在化できる。抗体内在化を評価する標準的アッセイは当該技術分野において公知であり、例えば、HumZap内在化アッセイを含む。
CADM1に対する抗体の結合能力を評価する標準的アッセイは当該技術分野において公知であり、例えば、ELISA、ウエスタンブロット、RIA、及びフローサイトメトリー解析を含む。適切なアッセイは、実施例において詳述する。抗体の結合カイネティクス（例えば、結合能）は、当該技術分野において公知の標準的アッセイによって、例えばBiacore（登録商標）システム分析によっても評価できる。Raji又はDaudi B細胞腫瘍細胞への結合を評価するために、Raji（ATCC保管番号CCL-86）又はDaudi（ATCC保管番号CCL-213）細胞は、米国培養細胞株保存機関などの一般利用可能な供給源から得ることができ、フローサイトメトリー解析などの標準的アッセイに使用できる。
（モノクローナル抗体PTA021_A1、PTA021_A2、PTA021_A3）
本発明の好ましい抗体は、実施例1、2及び3に記載されるように単離され、構造的に特徴づけられた、ヒトモノクローナル抗体PTA021_A1、PTA021_A2及びPTA021_A3である。PTA021_A1、PTA021_A2及びPTA021_A3のVHアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号19、20及び21に示される。PTA021_A1、PTA021_A2及びPTA021_A3のVKアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号22、23及び24に示される。
これらの抗体の各々がCADM1に結合し得る場合、VH及びVK配列を「混合して適合させ」、本発明の他の抗CADM1結合分子を作成することができる。当該「混合して適合させ」た抗体のCADM1結合は、上記の及び実施例に記載した結合アッセイ（例えば、ELISA）を使用して試験できる。好ましくは、VH及びVK鎖を混合して適合させる場合、特定のVH/VK対からのVH配列は、構造的に類似のVH配列と置換される。同様に、好ましくは、特定のVH/VK対からのVL配列は、構造的に類似のVK配列と置換される。
したがって、1つの態様において、本発明は、以下を含む単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する：
配列番号19、20及び21からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び、
配列番号22、23及び24からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
ここで、該抗体は、CADM1、好ましくはヒトCADM1を特異的に結合する。
好ましい重鎖及び軽鎖の組合せには、以下のものを含む：
配列番号19のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号22のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；又は、
配列番号20のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び、配列番号23のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は、
配列番号21のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び、配列番号24のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。
別の態様において、本発明は、PTA021_A1、PTA021_A2及びPTA021_A3又はそれらの組み合わせの重鎖及び軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3を含む抗体を提供する。PTA021_A1、PTA021_A2及びPTA021_A3のVH CDR1のアミノ酸配列は、配列番号1、2及び3に示される。PTA021_A1、PTA021_A2及びPTA021_A3のVH CDR2のアミノ酸配列は、配列番号4、5及び6に示される。PTA021_A1、PTA021_A2及びPTA021_A3のVH CDR3のアミノ酸配列は、配列番号7、8及び9に示される。PTA021_A1、PTA021_A2及びPTA021_A3のVK CDR1のアミノ酸配列は、配列番号10、11及び12に示される。PTA021_A1、PTA021_A2及びPTA021_A3のVK CDR2のアミノ酸配列は、配列番号13、14及び15に示される。PTA021_A1、PTA021_A2及びPTA021_A3のVK CDR3のアミノ酸配列は、配列番号16、17及び18に示される。CDR領域は、Kabatシステムを使用して詳細に描写される（Kabat, E. A.,らの文献 (1991) 「免疫学的関心対象タンパク質の配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）」, 第5版, 米国保健社会福祉省, NIH公報第91-3242号）。
これらの抗体の各々がCADM1に結合でき、かつ抗原結合特異性が主にCDR1、CDR2及びCDR3領域により提供される場合、VH CDR1、CDR2及びCDR3配列並びにVK CDR1、CDR2及びCDR3配列を「混合して適合させ」（すなわち、異なる抗体からのCDRを混合して適合させ得るが、各抗体は、VH CDR1、CDR2及びCDR3並びにVK CDR1、CDR2及びCDR3を含まなければならない）、本発明の他の抗CADM1結合分子を作成することができる。当該「混合して適合させ」た抗体のCADM1結合は、上記の及び実施例に記載される結合アッセイ（例えば、ELISA、Biacore（登録商標）解析）を使用して試験できる。好ましくは、VH CDR配列を混合して適合させる場合、特定のVH配列からのCDR1、CDR2及び／又はCDR3配列は、構造的に類似のCDR配列と置換される。同様に、VK CDR配列を混合して適合させる場合、特定のVk配列からのCDR1、CDR2及び／又はCDR3配列は、好ましくは、構造的に類似のCDR配列と置換される。新規なVH及びVK配列が、モノクローナル抗体PTA021_A1、PTA021_A2及びPTA021_A3について本明細書に開示されるCDR配列から構造的に類似の配列を有する1以上のVH及び／又はVL/VK CDR領域配列を置換することにより作成できることは、当業者にとって容易に明らかであろう。
したがって、別の態様において、本発明は、以下を含む単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する：
配列番号1、2及び3からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR1；
配列番号4、5及び6からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR2；
配列番号7、8及び9からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域CDR3；
配列番号10、11及び12からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR1；
配列番号13、14及び15からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR2；
及び、配列番号16、17及び18からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域CDR3；
ここで、該抗体は、CADM1、好ましくはヒトCADM1を特異的に結合する。
好ましい実施態様において、抗体は、以下のものを含む：
配列番号1を含む重鎖可変領域CDR1；
配列番号4を含む重鎖可変領域CDR2；
配列番号7を含む重鎖可変領域CDR3；
配列番号10を含む軽鎖可変領域CDR1；
配列番号13を含む軽鎖可変領域CDR2；及び、
配列番号16を含む軽鎖可変領域CDR3。
別の好ましい実施態様において、抗体は、以下のものを含む：
配列番号2を含む重鎖可変領域CDR1；
配列番号5を含む重鎖可変領域CDR2；
配列番号8を含む重鎖可変領域CDR3；
配列番号11を含む軽鎖可変領域CDR1；
配列番号14を含む軽鎖可変領域CDR2；及び、
配列番号17を含む軽鎖可変領域CDR3。
別の好ましい実施態様において、抗体は、以下のものを含む：
配列番号3を含む重鎖可変領域CDR1；
配列番号6を含む重鎖可変領域CDR2；
配列番号9を含む重鎖可変領域CDR3；
配列番号12を含む軽鎖可変領域CDR1；
配列番号15を含む軽鎖可変領域CDR2；及び、
配列番号18を含む軽鎖可変領域CDR3。
CDR1及び／又はCDR2領域から独立して、CDR3ドメインが単独で同族の抗原についての抗体の結合特異性を測定でき、かつ、共通のCDR3配列に基づき同じ結合特異性を有する複数の抗体を予測通り作成できることは、公知技術である。例えば、以下の文献を参照されたい：Klimkaらの文献, British J. of Cancer 83(2)252-260 (2000)（マウス抗CD30抗体Ki-4の重鎖可変ドメインCDR3のみを使用する、ヒト化抗CD30抗体の産生を記載する）；
Beiboerらの文献, J. Mol. Biol. 296:833-849 (2000)（親マウスMOC-31抗-EGP-2抗体の重鎖CDR3配列のみを使用する、組換え上皮糖タンパク質-2（EGP-2）抗体を記載する）；
Raderらの文献, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:8910-8915 (1998)（マウス抗インテグリンαvβ3抗体LM609の重鎖及び軽鎖可変CDR3ドメインを使用するヒト化抗インテグリンαvβ3抗体のパネルを記載し、各抗体メンバーは、CDR3ドメインの外側に特徴的な配列を含み、かつ高い親和性で又は親マウス抗体より高い親和性を有する親マウス抗体と同じエピトープを結合できる）；Barbasらの文献, J. Am. Chem. Soc. 116:2161-2162 (1994)（該CDR3ドメインが、結合する抗原に最も重大な貢献を提供することを記載する）；
Barbasらの文献, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:2529-2533 (1995)（抗破傷風トキソイドFabの重鎖へのヒト胎盤DNAに対する3つのFab（SI-1、SI-40、及びSI-32）の重鎖CDR3配列を移植し、これにより既存の重鎖CDR3を置換することを記載し、これはCDR3ドメイン単独が結合特異性を与えたことを実証する）；及び、Ditzelらの文献, J. Immunol. 157:739-749 (1996)（単一特異的IgG破傷風トキソイド-結合Fab p313抗体の重鎖に対する親の多特異性Fab LNA3の重鎖CDR3のみの転移が、該親Fabの結合特異性を保持するのに十分であったという移植研究を記載する）。これら引用文献の各々は、引用によりその全てが本明細書に組み込まれる。
したがって、本発明は、ヒト又は非ヒト動物に由来する抗体からの1以上の重鎖及び／又は軽鎖CDR3ドメインを含むモノクローナル抗体を提供し、該モノクローナル抗体はCADM1に特異的に結合できる。特定の態様において、本発明は、マウス又はラット抗体などの非ヒトの抗体からの1以上の重鎖及び／又は軽鎖CDR3ドメインを含むモノクローナル抗体を提供し、該モノクローナル抗体はCADM1に特異的に結合できる。いくつかの実施態様において、非ヒトの抗体からの1以上の重鎖及び／又は軽鎖CDR3ドメインを含む本発明の抗体は、(a)競合的に結合でき；（b）機能的特徴を保持し；(c)同じエピトープに結合し；及び／又は、（d）対応する親非ヒト抗体に類似の結合能を有する。
他の態様において、本発明は、非ヒト動物から得られるヒト抗体などのヒト抗体からの1以上の重鎖及び／又は軽鎖CDR3ドメインを含むモノクローナル抗体を提供し、該ヒト抗体はCADM1に特異的に結合できる。他の態様において、本発明は、非ヒト動物から得られたヒト抗体などの第1のヒト抗体からの1以上の重鎖及び／又は軽鎖CDR3ドメインを含むモノクローナル抗体を提供し、該第1のヒト抗体は、CADM1に特異的に結合でき、かつ該第1のヒト抗体からのCDR3ドメインは、CADM1に特異的に結合できる第2のヒト抗体を生成するように、CADM1に対する結合特異性が欠如するヒト抗体のCDR3ドメインを置換する。いくつかの実施態様において、第1のヒト抗体からの1以上の重鎖及び／又は軽鎖CDR3ドメインを含む本発明の抗体は、(a)競合的に結合でき；（b）機能的特徴を保持し；(c)同じエピトープに結合し；及び／又は、（d）対応する親の第1のヒト抗体と類似の結合能を有する。好ましい実施態様では、第1のヒト抗体は、PTA021_A1、PTA021_A2又はPTA021_A3である。
（特定の生殖細胞系列配列を有する抗体）
ある種の実施態様において、本発明の抗体は、特定の生殖細胞系列重鎖免疫グロブリン遺伝子からの重鎖可変領域、及び／又は特定の生殖細胞系列軽鎖免疫グロブリン遺伝子からの軽鎖可変領域を含む。
例えば、好ましい実施態様において、本発明は、ヒトVH 2-05遺伝子の製品又はヒトVH 2-05遺伝子に由来する重鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供し、該抗体はCADM1を特異的に結合する。さらに別の好ましい実施態様において、本発明は、ヒトVK L15遺伝子の製品又はヒトVK L15遺伝子に由来する軽鎖可変領域を含む単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供し、該抗体はCADM1を特異的に結合する。さらに別の好ましい実施態様において、本発明は、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供し、該抗体は：ヒトVH 2-05遺伝子の製品又はヒトVH 2-05遺伝子（該遺伝子は、それぞれ配列番号31、32又は33に記載されるアミノ酸配列をコードする）に由来する重鎖可変領域を含み；ヒトVK L15遺伝子の製品又はヒトVK L15遺伝子（該遺伝子は、それぞれ配列番号34、35又は36に記載されるアミノ酸配列をコードする）に由来する軽鎖可変領域を含み；かつ、CADM1、好ましくはヒトCADM1に特異的に結合する。VH及びVH 2-05のVK及びVK L15を有する抗体の例は、それぞれPTA021_A1、PTA021_A2及びPTA021_A3である。
本明細書で使用されるヒト抗体は、抗体の可変領域がヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子を使用するシステムから得られる場合、特定の生殖細胞系列配列の「製品」であるか、又は特定の生殖細胞系列配列に「由来する」、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域を含む。当該システムには、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを関心対象の抗原で免疫すること、又は関心対象の抗原を用いてファージに提示されるヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリをスクリーニングすることを含む。ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列の「製品」又はヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に「由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖細胞系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較すること、及びヒト抗体の配列に最も近い配列（すなわち、最も大きな%同一性）であるヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列を選択することなどによって同定できる。特定のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列の「製品」又は特定のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に「由来する」ヒト抗体は、例えば、天然存在型体細胞突然変異、又は部位特異的突然変異の意図的な導入に起因する、生殖細胞系列配列と比較してのアミノ酸の差異を含み得る。しかしながら、選択されたヒト抗体は、典型的には、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列にアミノ酸配列において少なくとも90%同一であり、他の種（例えば、マウス生殖細胞系列配列）の生殖細胞系列免疫グロブリンアミノ酸配列と比較した場合、ヒト抗体をヒトのものであると同定するアミノ酸残基を含む。特定の場合において、ヒト抗体は、生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列に対してアミノ酸配列で少なくとも95%、又はさらに少なくとも96%、97%、98%又は99%同一であり得る。典型的には、特定のヒト生殖細胞系列配列に由来するヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と10アミノ酸以下の差異を示す。特定の場合において、ヒト抗体は、生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と5以下、又は4、3、2以下若しくは1のアミノ酸差異を示し得る。
（相同抗体）
さらに別の実施態様において、本発明の抗体は、本明細書に記載されている好ましい抗体のアミノ酸配列に相同であるアミノ酸配列を含む重鎖及び軽鎖可変領域を含み、該抗体は、本発明の抗CADM1抗体の所望の機能特性を保持する。
例えば、本発明は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供し：該重鎖可変領域は、配列番号19、20及び21からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%相同であるアミノ酸配列を含み；該軽鎖可変領域は、配列番号22、23及び24からなる群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも80%相同であるアミノ酸配列を含み；かつ、該抗体は、10Nm以下のEC50でヒトCADM1に結合する。
抗体は、ヒトCADM1をトランスフェクトされたCHO細胞に結合することもできる。
各種実施態様において、抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体であり得る。
他の実施態様において、VH及び／又はVKアミノ酸配列は、上記の配列に85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%相同であり得る。上記配列のVH及びVK領域に高い（すなわち、80%以上）相同性を有するVH及びVK領域を有する抗体は、配列番号25、26、27、28、29及び30をコードする核酸分子の突然変異導入（例えば、部位特異的又はPCR媒介型突然変異導入）によって得ることができ、その後、本明細書に記載される機能的アッセイを使用する当該保持された機能について当該コードされた改変抗体が試験される。
本明細書で使用される2つのアミノ酸配列間の相同率は、当該2つの配列間の同一率に等しい。2つの配列間の同一率は、該配列により共有される同じ位置の数の関数（すなわち、相同率＝同じ位置の数／位置の総数×100）であり、これには該2つの配列の最適なアライメントのために導入されることが必要であるギャップの数及び各ギャップの長さが考慮される。2つの配列間の配列の比較及び同一率の決定は、下記の非限定的な実施例において説明するように、数学的アルゴリズムを使用して達成できる。
2つのアミノ酸配列間の同一率は、PAM120重み残基表（weight residue table）、12のギャップ長ペナルティ及び4のギャップペナルティを使用し、ALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み込まれているE. Meyers及びW. Millerのアルゴリズムを使用して決定できる（Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)）。さらに、2つのアミノ酸配列間の同一率は、Blossum 62マトリクス又はPAM250マトリクス、並びに16、14、12、10、8、6若しくは4のギャップ重み及び1、2、3、4、5若しくは6の長さ重みを使用し、GCGソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで利用可能）におけるGAPプログラムに組み込まれたNeedleman及びWunsch（J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)）アルゴリズムを使用して決定できる。
さらに又は選択的に、本発明のタンパク質配列は、更に公共データベースに対して検索を実行する「問い合わせ配列」として使用して、例えば、関連配列を同定することができる。当該検索は、Altschulらの文献 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10に係るXBLASTプログラム（バージョン2.0）を使用して実行できる。BLASTタンパク質検索を、XBLASTプログラム、スコア= 50、文字長= 3を用いて実行し、本発明の抗体分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較のためのギャップ配列を得るために、Gapped BLASTを、Altschulらの文献, (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402にて説明したように、利用できる。BLAST及びGapped BLASTプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、XBLAST及びNBLAST）のデフォルトパラメータを使用できる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照されたい。
（保存的修飾を有する抗体）
ある種の実施態様において、本発明の抗体は、CDR1、CDR2及びCDR3配列を含む重鎖可変領域、並びにCDR1、CDR2及びCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含み、これらのCDR配列の1以上は、本明細書に記載される好ましい抗体（例えば、PTA021_A1、PTA021_A2又はPTA021_A3）に基づく特定のアミノ酸配列又はその保存的修飾を含み、ここで該抗体は、本発明の抗CADM1抗体の所望の機能特性を保持する。したがって、本発明は、CDR1、CDR2及びCDR3配列を含む重鎖可変領域、並びにCDR1、CDR2及びCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供し：該重鎖可変領域CDR3配列は、配列番号7、8及び9のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列並びにその保存的修飾を含み；該軽鎖可変領域CDR3配列は、配列番号16、17及び18のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列並びにその保存的修飾を含み；かつ、該抗体は、1nM以下のEC50でヒトCADM1に結合する。
抗体は、ヒトCADM1をトランスフェクトされたCHO細胞に結合することもできる。
好ましい実施態様において、重鎖可変領域CDR2配列は、配列番号4、5及び6のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列並びにその保存的修飾を含み；かつ、軽鎖可変領域CDR2配列は、配列番号13、14及び15のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列並びにその保存的修飾を含む。別の好ましい実施態様において、重鎖可変領域CDR1配列は、配列番号1、2及び3のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列並びにその保存的修飾を含み；かつ、軽鎖可変領域CDR1配列は、配列番号10、11及び12のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列並びにその保存的修飾を含む。
各種実施態様において、抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体であり得る。
本明細書で使用される用語「保存的配列修飾」とは、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に著しい効果を及ぼさない、又は変更しない、アミノ酸の修飾をいうことを意図する。当該保存的修飾は、アミノ酸の置換、追加及び削除を含む。修飾は、部位特異的突然変異導入及びPCR媒介型突然変異導入などの、公知技術の標準的な方法によって本発明の抗体に導入できる。保存的アミノ酸置換は、当該アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。従って、本発明の抗体のCDR領域の中の1以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーから他のアミノ酸残基で置換でき、該改変抗体は、本明細書に記載される機能的アッセイを使用して保持された機能について試験できる。
配列番号1、2又は3の重鎖CDR1配列は、1以上の保存的配列修飾（例えば1、2、3、4、5若しくはそれらより多いアミノ酸の置換、追加又は削除）を含むことができ；配列番号10、11又は12の軽鎖CDR1配列は、1以上の保存的配列修飾（例えば1、2、3、4、5若しくはそれらより多いアミノ酸の置換、追加又は削除）を含むことができ；配列番号4、5又は6に示される重鎖CDR2配列は、1以上の保存的配列修飾（例えば1、2、3、4、5若しくはそれらより多いアミノ酸の置換、追加又は削除）を含むことができ；配列番号13、14又は15に示される軽鎖CDR2配列は、1以上の保存的配列修飾（例えば1、2、3、4、5若しくはそれらより多いアミノ酸の置換、追加又は削除）を含むことができ；配列番号7、8又は9に示される重鎖CDR3配列は、1以上の保存的配列修飾（例えば1、2、3、4、5若しくはそれらより多いアミノ酸の置換、追加又は削除）を含むことができ；及び／又は、配列番号16、17又は18に示される軽鎖CDR3配列は、1以上の保存的配列修飾（例えば1、2、3、4、5若しくはそれらより多いアミノ酸の置換、追加又は削除）を含むことができる。
（本発明の抗CADM1抗体と同じエピトープに結合する抗体）
別の実施態様において、本発明は、本発明のCADM1モノクローナル抗体のいずれかと同じヒトCADM1上のエピトープに結合する抗体（すなわち、CADM1への結合について、本発明のモノクローナル抗体のいずれかと交差競合する能力を有する抗体）を提供する。好ましい実施態様において、結合についての交差競合の研究のための参照抗体は、モノクローナル抗体PTA021_A1（それぞれ、配列番号19及び22に示すVH及びVK配列を有する）、モノクローナル抗体PTA021_A2（それぞれ、配列番号20及び23に示すVH及びVK配列を有する）、又はモノクローナル抗体PTA021_A3（それぞれ、配列番号21及び24に示すVH及びVK配列を有する）であり得る。当該交差競合抗体は、標準的なCADM1結合実験においてPTA021_A1、PTA021_A2又はPTA021_A3と交差競合するそれらの能力に基づいて同定できる。例えば、BIAcore分析、ELISA分析又はフローサイトメトリーは、本発明の抗体との結合について交差競合することを実証するために使用できる。例えば、ヒトCADM1へのPTA021_A1、PTA021_A2又はPTA021_A3の結合を阻害する試験抗体の能力は、該試験抗体が、ヒトCADM1への結合についてPTA021_A1、PTA021_A2又はPTA021_A3と競合でき、それゆえPTA021_A1、PTA021_A2又はPTA021_A3と同じヒトCADM1上のエピトープに結合することを実証する。好ましい実施態様において、PTA021_A1、PTA021_A2又はPTA021_A3と同じヒトCADM1上のエピトープに結合する抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。当該ヒトモノクローナル抗体は、実施例にて説明したように調製し、単離できる。
（改変抗体及び修飾抗体）
本発明の抗体は、本明細書に開示されるVH及び／又はVL配列の1以上を有する抗体を使用して更に調製でき、これは修飾抗体を改変する出発物質として使用でき、当該修飾抗体は、出発抗体と比較して、特性を変更できる。抗体は、一方又は両方の可変領域（すなわち、VH及び／又はVL）内、例えば1以上のCDR領域内、及び／又は1以上のフレームワーク領域内の1以上のアミノ酸を修飾することにより改変できる。さらに又は選択的に、抗体は、例えば抗体のエフェクタ機能を変更するために、定常領域内の残基を修飾することにより改変できる。
ある種の実施態様において、CDR移植を使用して、抗体の可変領域を改変できる。抗体は、主に6つの重鎖及び軽鎖相補性決定領域（CDR）に位置するアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。このため、CDR内のアミノ酸配列は、CDRの外側配列より、個々の抗体間で多様である。CDR配列は、大部分の抗体-抗原相互作用の原因となるので、異なる特性を有する異なる抗体由来のフレームワーク配列上に移植される特定の天然存在型抗体由来のCDR配列を含む発現ベクターを構築することにより、特定の天然存在型抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Riechmann, L.らの文献 (1998) Nature 332:323-327; Jones, P.らの文献 (1986) Nature 321:522-525; Queen, C.らの文献 (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033; Winterに対する米国特許5,225,539,並びにQueenらに対する米国特許5,530,101; 5,585,089; 5,693,762及び6,180,370を参照されたい）。
したがって、本発明の別の実施態様は、それぞれ、配列番号1、2及び3、配列番号4、5及び6、並びに配列番号7、8及び9からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDR1、CDR2及びCDR3配列を含む重鎖可変領域、並びに、それぞれ、配列番号10、11及び12、配列番号13、14及び15、並びに配列番号16、17及び18からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDR1、CDR2及びCDR3配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分に関する。従って、当該抗体は、モノクローナル抗体PTA021_A1、PTA021_A2又はPTA021_A3のVH 及びVK CDR配列を含み、更にこれらの抗体由来の異なるフレームワーク配列を含み得る。
当該フレームワーク配列は、公共DNAデータベース又は公表文献から得られることが可能であり、これには生殖細胞系列抗体遺伝子配列を含む。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子についての生殖細胞系列DNA塩基配列は、以下に見出すことができる：「VBase」ヒト生殖細胞系列配列データベース（www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseにてインターネットで利用可能）、並びにKabat, E. A.らの文献(1991)「免疫学的関心対象のタンパク質配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）」,第5版, 米国保健社会福祉省, NIH公報番号91-3242; Tomlinson, I. M.らの文献 (1992) 「ヒト生殖細胞系列VH配列のレパートリーは、異なる超可変ループを有するVHセグメントの50群について明らかにする（The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops）」 J. Mol. Biol. 227:776-798; 及びCox, J. P. L.らの文献 (1994) 「ヒト生殖細胞系列VHセグメントのディレクトリは、それらの使用における強力なバイアスを明らかにする（A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage）」 Eur. J. Immunol.24:827-836。これらの内容は引用によりその全てが明示的に本明細書に組み込まれる。別の例として、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列DNA塩基配列は、Genbankデータベースに見出すことができる。例えば、HCo7 HuMAbマウスに見出される以下の重鎖生殖細胞系列配列は、添付のGenbankアクセッション番号において利用できる：1-69（NG_0010109、NT_024637及びBC070333）、3-33（NG_0010109及びNT_024637）及び3-7（NG_0010109及びNT_024637）。別の例として、HCo12 HuMAbマウスに見出される以下の重鎖生殖細胞系列配列は、添付のGenbankアクセッション番号において利用できる：1-69（NG_0010109、NT_024637及びBC070333）、5-51（NG_0010109及びNT_024637）、4-34（NG_0010109及びNT_024637）、3-30.3（CAJ556644）及び3-23（AJ406678）。
抗体タンパク質配列は、当業者に周知のGapped BLAST（Altschulらの文献 (1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402）と称される1つの配列類似性検索法を使用して、編集されたタンパク質配列データベースに対して比較される。BLASTは、抗体配列とデータベース配列間の統計的に有意なアライメントが、整列配置された文字の高いスコアリングセグメント対（HSP）を含む可能性があるという点で、帰納的なアルゴリズムである。スコアが拡張又はトリミングにより改善できないセグメント対は、ヒットと称される。簡潔にいうと、VBASE起源（http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase1/list2.php）のヌクレオチド配列は翻訳され、FR3フレームワーク領域を介するFR1間の及びこれを含む領域は保持される。データベース配列は、98残基の平均長を有する。タンパク質の全長さに渡って正確に一致する重複配列は、取り除かれる。オフにされている低複雑性フィルタ以外のデフォルト標準パラメータでプログラムblastp及びBLOSUM62の置換マトリクスを使用するタンパク質のBLAST検索は、トップ5についてフィルタリングし、生じた配列マッチをヒットする。ヌクレオチド配列は6フレーム全てで翻訳され、該データベース配列のマッチセグメントにおいて終止コドンがないフレームは潜在的なヒットとみなされる。これは、6フレーム全ての抗体配列を翻訳するBLASTプログラムtblastxを使用して順次確認し、それらの翻訳を、6フレーム全てで動的に翻訳されるVBASEヌクレオチド配列と比較する。
その同一性は、該配列の全長に渡る該抗体配列とタンパク質データベース間の正確なアミノ酸マッチである。陽性（同一性+置換マッチ）は同一ではないが、BLOSUM62置換マトリクスによってガイドされたアミノ酸置換である。抗体配列が、同じ同一性を有する2つのデータベース配列を適合させる場合、大部分の陽性を有するヒットは、マッチする配列ヒットであると決定されるだろう。
本発明の抗体における使用のための好ましいフレームワーク配列は、本発明の選択された抗体によって使用されるフレームワーク配列に構造的に類似するもの、例えば、本発明の好ましいモノクローナル抗体によって使用されるVH 2-05フレームワーク配列（配列番号31）及び／又はVK L15フレームワーク配列（配列番号34）に類似のものである。VH CDR1、CDR2及びCDR3配列、並びにVK CDR1、CDR2及びCDR3配列は、そのフレームワーク配列が由来する生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子に見出されるのと同一の配列を有するフレームワーク領域に移植でき、又は該CDR配列は、生殖細胞系列配列と比較して1以上の突然変異を含むフレームワーク領域に移植できる。例えば、特定の事例において、抗体の抗原結合能力を維持するか又は強化するためにフレームワーク領域内で残基を変異させることが有益であることが見出されている（例えば、Queenらに対する米国特許5,530,101; 5,585,089; 5,693,762及び6,180,370を参照されたい）。
可変領域修飾の別の型は、VH及び／又はVK CDR1、CDR2及び／又はCDR3領域内でアミノ酸残基を変異させ、これにより関心対象抗体の1以上の結合特性（例えば、親和性）を改良することである。部位特異的突然変異導入又はPCR媒介型突然変異導入を実施して突然変異を導入でき、抗体結合に対する効果又は関心対象他の機能特性は、本明細書に記載され、及び実施例において提供されるインビトロ又はインビボ分析で評価できる。好ましくは、保存的修飾（先に論述した）が導入される。突然変異は、アミノ酸の置換、追加又は削除であり得るが、好ましくは置換である。さらに、典型的には、CDR領域内の1、2、3、4又は5以下の残基が変更される。
したがって、別の実施態様において、本開示は、以下のものを含む重鎖可変領域を含む単離された抗CADM1モノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する： (a) 配列番号1、2及び3からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号1、2及び3と比較して1、2、3、4若しくは5のアミノ酸置換、削除又は追加を有するアミノ酸配列を含むVH CDR1領域； (b) 配列番号4、5及び6からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号4、5及び6と比較して1、2、3、4若しくは5のアミノ酸置換、削除又は追加を有するアミノ酸配列を含むVH CDR2領域； (c) 配列番号7、8及び9からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号7、8及び9と比較して1、2、3、4若しくは5のアミノ酸置換、削除又は追加を有するアミノ酸配列を含むVH CDR3領域； (d) 配列番号10、11及び12からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号10、11及び12と比較して1、2、3、4若しくは5のアミノ酸置換、削除又は追加を有するアミノ酸配列を含むVK CDR1領域； (e) 配列番号13、14及び15からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号13、14及び15と比較して1、2、3、4若しくは5のアミノ酸置換、削除又は追加を有するアミノ酸配列を含むVK CDR2領域；及び、(f) 配列番号16、17及び18からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号16、17及び18と比較して1、2、3、4若しくは5のアミノ酸置換、削除又は追加を有するアミノ酸配列を含むVK CDR3領域。
本発明の改変抗体には、例えば抗体の特性を改良するために、VH及び／又はVK内でフレームワーク残基に修飾がなされたものを含む。典型的には、当該フレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を減少させるためになされる。例えば、1つのアプローチは、対応する生殖細胞系列配列に1以上のフレームワーク残基を「戻し突然変異導入（backmutate）」することである。より具体的には、体細胞突然変異を受けた抗体は、該抗体が誘導される生殖細胞系列配列と異なるフレームワーク残基を含み得る。当該残基は、該抗体フレームワーク配列を、該抗体が誘導される生殖細胞系列配列と比較することにより同定できる。例えば、PTA021_A1について、Kabat番号付けシステムを使用すると、VHのアミノ酸残基#30（FR3内）はアスパラギン（配列番号19）であるのに対し、対応するVH 2-05生殖細胞系列配列におけるこの残基はセリン（配列番号31）である。フレームワーク領域配列をそれらの生殖細胞系列構成に戻すために、体細胞突然変異は、例えば部位特異的突然変異導入又はPCR媒介型突然変異導入によって生殖細胞系列配列に「戻し突然変異導入」できる（例えば、PTA021_A1のVHの残基#30は、アスパラギンからセリンに「戻し突然変異導入」できる）。
別の例として、PTA021_A1について、VHのアミノ酸残基#54はアスパラギン酸（配列番号19）であるのに対し、対応するVH 2-05生殖細胞系列配列のこの残基はアスパラギン（配列番号31）である。フレームワーク領域配列をそれらの生殖細胞系列構成に戻すために、例えば、PTA021_A1のVHの残基#54は、アスパラギン酸からアスパラギンに「戻し突然変異導入」できる。当該「戻し突然変異導入された」抗体は、本発明により包含されることも意図される。
別の例として、PTA021_A1について、VKのアミノ酸残基#50はグリシン（配列番号22）であるのに対し、対応するVK L15生殖細胞系列配列のこの残基はアラニン（配列番号34）である。フレームワーク領域配列をそれらの生殖細胞系列構成に戻すために、例えば、PTA021_A1のVKの残基#50は、グリシンからアラニンに「戻し突然変異導入」できる。当該「戻し突然変異導入された」抗体は、本発明により包含されることも意図される。
別の例として、PTA021_A1について、VKのアミノ酸残基#77はアスパラギン（配列番号22）であるのに対し、対応するVK L15生殖細胞系列配列のこの残基はセリン（配列番号34）である。フレームワーク領域配列をそれらの生殖細胞系列構成に戻すために、例えば、PTA021_A1のVKの残基#77は、アスパラギンからセリンに「戻し突然変異導入」できる。当該「戻し突然変異導入された」抗体は、本発明により包含されることも意図される。
別の例として、PTA021_A2について、VHのアミノ酸残基#54はアスパラギン酸（配列番号20）であるのに対し、対応するVH 2-05生殖細胞系列配列のこの残基はアスパラギン（配列番号32）である。フレームワーク領域配列をそれらの生殖細胞系列構成に戻すために、例えば、PTA021_A2のVHの残基#54は、アスパラギン酸からアスパラギンに「戻し突然変異導入」できる。当該「戻し突然変異導入された」抗体は、本発明により包含されることも意図される。
さらに別の例として、PTA021_A2について、VHのアミノ酸残基#89はイソロイシン（配列番号20）であるのに対し、対応するVH 2-05生殖細胞系列配列のこの残基はスレオニン（配列番号32）である。フレームワーク領域配列をそれらの生殖細胞系列構成に戻すために、例えば、PTA021_A2のVHのFR1内の残基#89は、イソロイシンからスレオニンに「戻し突然変異導入」できる。当該「戻し突然変異導入された」抗体は、本発明により包含されることも意図される。
別の例として、PTA021_A3について、VHのアミノ酸残基#54はアスパラギン酸（配列番号21）であるのに対し、対応するVH 2-05生殖細胞系列配列のこの残基はアスパラギン（配列番号33）である。フレームワーク領域配列をそれらの生殖細胞系列構成に戻すために、例えば、PTA021_A3のVHの残基# 54は、アスパラギン酸からアスパラギンに「戻し突然変異導入」できる。当該「戻し突然変異導入された」抗体は、本発明により包含されることも意図される。
別の例として、PTA021_A3について、VKのアミノ酸残基#77はアスパラギン（配列番号24）であるのに対し、対応するVK L15生殖細胞系列配列のこの残基はセリン（配列番号36）である。フレームワーク領域配列をそれらの生殖細胞系列構成に戻すために、例えば、PTA021_A1のVKの残基#77は、アスパラギンからセリンに「戻し突然変異導入」できる。当該「戻し突然変異導入された」抗体は、本発明により包含されることも意図される。
フレームワーク修飾の別の型は、フレームワーク領域内で、又は1以上のCDR領域内でさえ1以上の残基を変異させてT細胞エピトープを除去することが必要であり、これにより該抗体の潜在的免疫原性が低減される。このアプローチは、「脱免疫化（deimmunization）」とも呼ばれ、Carrらによる米国特許公開番号20030153043においてさらに詳細に記載される。
フレームワーク又はCDR領域内でなされる修飾の追加又は変更態様において、本発明の抗体は、Fc領域内に修飾を含むように改変し、典型的には、抗体の1以上の機能特性、例えば血清半減期、補体結合、Fc受容体結合、及び／又は抗原依存的細胞傷害活性を変更することができる。さらに、本発明の抗体は、化学修飾し（例えば、1以上の化学部分を抗体に付けることができる）、又はその糖鎖付加を変更するように修飾して、再び該抗体の1以上の機能特性を変更することができる。これらの実施態様の各々は、さらに下記に詳述されている。Fc領域における残基の番号付けは、KabatのEUインデックスのものである。
一実施態様において、CH1のヒンジ領域は、該ヒンジ領域におけるシステイン残基の数が変更される（例えば、増加し、又は減少される）ように、修飾される。このアプローチは、Bodmerらによる米国特許第5,677,425号に更に記載される。CH1のヒンジ領域におけるシステイン残基の数は、例えば、軽鎖及び重鎖のアセンブリを促進する、又は抗体の安定性を増加若しくは減少させるように、変更される。
別の実施態様において、抗体のFcヒンジ領域は、抗体の生物学的半減期を減少させるために変異導入される。より具体的には、1以上のアミノ酸突然変異は、該抗体が、天然型の（native）Fc-ヒンジドメインSpA結合に比較して損なわれたブドウ球菌プロテインA（SpA）を有するように、Fc-ヒンジ断片のCH2-CH3ドメイン境界領域に導入される。このアプローチは、Wardらによる米国特許第6,165,745号においてさらに詳細に記載される。
別の実施態様において、抗体は、その生物学的半減期を増加させるために修飾される。様々なアプローチが可能である。例えば、以下の突然変異の1以上が導入できる：Wardに対する米国特許第6,277,375号に記載される、T252L、T254S、T256F。選択的に、生物学的半減期を増加させるために、抗体は、Prestaらによる米国特許番号5,869,046及び6,121,022に記載されるように、IgGのFc領域のCH2ドメインの2つのループから取得されるサルベージ受容体結合エピトープを含むように、CH1又はCL領域内で変更できる。
別の実施態様において、抗体は、引用によりその全てが本明細書に組み込まれるWO/2007/059782に記載されるように、ユニボディとして生産される。
さらに他の実施態様において、Fc領域は、抗体のエフェクタ機能を変更するために、少なくとも1つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換することによって、変更される。例えば、アミノ酸残基234、235、236、237、297、318、320及び322から選択される1以上のアミノ酸は、該抗体が、エフェクタリガンドに対して変更された親和性を有するが、親抗体の抗原結合能力を保持するように、異なるアミノ酸残基で置換できる。親和性が変更されるエフェクタリガンドは、例えば、Fc受容体又は補体のC1成分であり得る。このアプローチは、米国特許番号5,624,821及び5,648,260（両方ともWinterらによる）においてより詳細に記載される。
別の例において、アミノ酸残基329、331及び322から選択される1以上のアミノ酸は、該抗体が、改変されたC1q結合、及び／又は低減若しくは滅失された補体依存細胞毒性（CDC）を有するように、異なるアミノ酸残基で置換できる。このアプローチは、Idusogieらによる米国特許第6,194,551号により詳細に記載される。
別の例において、アミノ酸位231及び239における1以上のアミノ酸残基が変更され、これにより補体を固定する抗体の能力が変更される。このアプローチは、BodmerらによるPCT公報WO 94/29351に更に記載される。
さらに別の例において、Fc領域は、抗体依存性細胞傷害作用（ADCC）を媒介する抗体の能力を増加させるために、及び／又は以下の位置で1以上のアミノ酸を修飾することによってFcγ受容体についての抗体の親和性を増加させるために、修飾される：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438又は439。このアプローチは、PrestaによるPCT公報WO 00/42072において更に記載される。さらに、FcγR1、FcγRII、FcγRIII及びFcRnについてのヒトIgG1上の結合部位がマップされ、改良型の結合を有する異型が記載されている（Shields, R.L.らの文献 (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604を参照されたい）。256、290、298、333、334及び339位での特定の突然変異は、FcγRIIIへの結合を改良することを示した。さらに、以下の組合せ変異体は、FcγRIII結合を改良することを示した：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A及びS298A/E333A/K334A。
さらに別の実施態様において、抗体の糖鎖付加が修飾される。例えば、無糖鎖化された（aglycoslated）抗体を作成できる（すなわち、該抗体は、糖鎖付加を欠失する）。糖鎖付加は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加させるように、変更できる。当該炭水化物の修飾は、例えば、該抗体配列内の1以上の糖鎖付加部位を変更することにより達成できる。例えば、1以上の可変領域フレームワーク糖鎖付加部位の除去を生じる1以上のアミノ酸置換を作成でき、これによりその部位で糖鎖付加が除去される。当該無糖鎖化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させることができる。当該アプローチは、Coらによる米国特許番号5,714,350及び6,350,861により詳細に記載される。
さらに又は選択的に、糖鎖付加の変更型を有する抗体、例えば、減少したフコシル残基量を有する低フコシル化（hypofucosylated）抗体、又は増加した分岐GlcNac構造を有する抗体を作成できる。当該変更された糖鎖付加パターンは、抗体のADCC能力を増加させることが実証された。当該炭水化物の修飾は、例えば、変更された糖鎖付加機構を有する宿主細胞において抗体を発現させることにより達成できる。変更された糖鎖付加機構を有する細胞は当該技術分野において説明されており、本発明の組換え抗体を発現する宿主細胞として使用し、これにより変更された糖鎖付加を有する抗体を生産することができる。例えば、細胞株Ms704、Ms705及びMs709は、当該Ms704、Ms705及びMs709細胞株において発現した抗体がそれらの炭水化物においてフコースを欠失するように、フコシル基転移酵素遺伝子であるFUT8（α(1,6)フコシル基転移酵素）を欠失する。Ms704、Ms705、及びMs709 FUT8-/-細胞株は、2つの置換ベクターを使用して、CHO/DG44細胞におけるFUT8遺伝子の標的化破壊によって作成された（Yamaneらによる米国特許公報番号20040110704、及びYamane-Ohnukiらの文献 (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22を参照されたい）。別の例として、HanaiらによるEP 1,176,195は、機能的に破壊されたFUT8遺伝子（これはフコシルトランスフェラーゼをコードする）を有する細胞株を記載し、このようにして当該細胞株において発現される抗体は、α1,6結合関連酵素を減少させ、又は除去することにより、低フコシル化を呈する。Hanaiらの文献はまた、抗体のFc領域に結合するN-アセチルグルコサミンにフコースを添加することについて低い酵素活性を有する細胞株、又は酵素活性を有しない細胞株、例えばラット骨髄腫細胞株YB2/0（ATCC CRL 1662）を記載する。PrestaによるPCT公報WO 03/035835は、フコースをAsn(297)結合した炭水化物に結合させる能力が低下した異型CHO細胞株であるLec13細胞を記載し、当該宿主細胞において発現される抗体には低フコシル化が生じる（Shields, R.L.らの文献 (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照されたい）。UmanaらによるPCT公報WO 99/54342は、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β(1,4)-N-アセチルグルコサミン転移酵素III（GnTIII））を発現するように改変された細胞株を記載し、当該改変細胞株において発現された抗体は、該抗体のADCC活性増加をもたらす分岐GlcNac構造の増加を呈する（Umanaらの文献 (1999) Nat. Biotech. 17:176-180も参照されたい）。選択的に、抗体のフコース残基は、フコシダーゼ酵素を使用して切断できる。例えば、フコシダーゼα-L-フコシダーゼは、抗体からフコシル残基を除去する（Tarentino, A.L.らの文献 (1975) Biochem. 14:5516-23）。
本発明により意図される本明細書記載の抗体の別の修飾は、ペグ化である。抗体をペグ化し、例えば、抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を増加させることができる。抗体をペグ化するために、該抗体又はその断片は、典型的には、1以上のPEG基が抗体又は抗体断片に付着する条件下で、ポリエチレングリコール（PEG）、例えばPEGの反応性エステル又はアルデヒド誘導体と反応させる。好ましくは、ペグ化は、反応性PEG分子（又は、類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応を介して実施される。本明細書で使用される用語「ポリエチレングリコール」には、モノ(C1-C10)アルコキシ-又はアリールオキシ-ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール-マレイミドなどの他のタンパク質を誘導体化するために使用されるPEGの任意の形態を含むことを意図する。ある種の実施態様において、ペグ化される抗体は、無糖鎖化された（aglycosylated）抗体である。タンパク質をペグ化する方法は、当該技術分野において公知であり、本発明の抗体に適用できる。例えば、NishimuraらによるEP 0 154 316、及びIshikawaらによるEP 0 401 384を参照されたい。
（抗体の物性）
本発明の抗体は、抗CADM1抗体の様々な物性によって更に特徴づけできる。様々なアッセイを使用して、これらの物性に基づき、異なるクラスの抗体を検出及び／又は区別することができる。
いくつかの実施態様において、本発明の抗体は、軽鎖又は重鎖可変領域いずれかに1以上の糖鎖付加部位を含み得る。可変領域の1以上の糖鎖付加部位の存在は、変更された抗原結合に起因して、抗体の免疫原性の増加、又は抗体のpKの変化を結果的に生じ得る（Marshallらの文献 (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala FA及びMorrison SL の文献 (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallickらの文献 (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro RGの文献 (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekhらの文献 (1985) Nature 316:452-7; Mimuraらの文献 (2000) Mol Immunol 37:697-706)。糖鎖付加は、N-X-S/T配列を含むモチーフで発生することは公知である。可変領域糖鎖付加は、抗体を切断してFabを生成するGlycoblotアッセイを使用して試験でき、その後、過ヨウ素酸酸化及びシッフ塩基形成を測定するアッセイを使用して糖鎖付加について試験する。選択的に、可変領域糖鎖付加は、Dionex光クロマトグラフィ（Dionex-LC）を使用して試験でき、これはFabから糖を単糖に切断し、個々の糖含有量を分析するものである。ある場合においては、可変領域糖鎖付加を含まない抗CADM1抗体を有することが好ましい。これは、技術分野において周知の標準的方法を使用して、可変領域の糖鎖付加モチーフを含まない抗体を選択することによって、又は当該糖鎖付加のモチーフ内で残基を変異させることによって、達成できる。
糖鎖付加の例として、PTA021_A1について、Kabat番号付けシステムを使用して、VHのアミノ酸残基#30（FR3内）は、アスパラギン（配列番号19）である。これは潜在的な糖鎖付加部位であり、この残基はグルタミンに変異させ得る。
好ましい実施態様において、本発明の抗体は、アスパラギン異性部位を含まない。脱アミド化又はイソアスパラギン酸の効果は、それぞれ、N-G又はD-G配列に起こり得る。脱アミド化又はイソアスパラギン酸の効果は、主鎖よりもむしろ側鎖カルボキシ末端を離れてねじれ構造を生成することによって抗体の安定性を減少させる、イソアスパラギン酸の生成を生じる。イソアスパラギン酸の生成は、イソアスパラギン酸について試験する逆相HPLCを使用する、イソ-クワントアッセイ（iso-quant assay）を使用して測定できる。
各抗体は、固有の等電点（pI）を有するが、通常、抗体は、6〜9.5のpH範囲にある。IgG1抗体についてのpIは典型的には7-9.5のpH範囲にあり、IgG4抗体についてのpIは典型的には6-8のpH範囲にある。抗体は、この範囲外にあるpIを有し得る。効果が一般に知られていないにもかかわらず、正常範囲外のpIを有する抗体は、インビボ条件下で若干のアンフォールディング及び不安定性を有し得るという推測がある。等電点は、キャピラリー等電点電気泳動アッセイを使用して試験でき、これはpH勾配を生成し、精度の増加のためにレーザー焦点化を利用できるものである（Janiniらの文献 (2002) Electrophoresis 23:1605-11; Maらの文献 (2001) Chromatographia 53:S75-89; Huntらの文献 (1998) J Chromatogr A 800:355-67)。ある場合においては、正常範囲にあるpI値を含む抗CADM1抗体有することが好ましい。これは、当該技術分野において周知の標準的な方法を使用して、正常範囲にpIを有する抗体を選択することによって、又は帯電表層残基を変異させることによって、達成できる。
各抗体は、熱安定性の指標である融解温度を有する（Krishnamurthy R及びManning MCの文献 (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71）。より高い熱安定性は、インビボで、より大きな全体的抗体安定性を示す。抗体の融点は、示差走査熱量測定などの技術を使用して測定できる（Chenらの文献 (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlandoらの文献 (1999) Immunol Lett 68:47-52）。TM1は、抗体の第一のアンフォールディングの温度を示す。TM2は、抗体の完全なアンフォールディングの温度を示す。通常、本発明の抗体のTM1は、60℃超、好ましくは65℃超、さらに好ましくは70℃超であることが好ましい。選択的に、抗体の熱安定性は、円二色性を使用して測定できる（Murrayらの文献 (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9）。
好ましい実施態様において、抗体は、急速に分解しないものが選択される。抗CADM1抗体の断片化は、当該技術分野においてよく理解されているように、キャピラリー電気泳動法（CE）及びMALDI-MSを使用して測定できる（Alexander AJ及びHughes DEの文献 (1995) Anal Chem 67:3626-32）。
別の好ましい実施態様において、抗体は、最小の凝集効果を有するものが選択される。凝集は、不必要な免疫応答及び／又は変更された若しくは好ましくない薬物動態特性の引き金を導き得る。通常、抗体は、25%以下、好ましくは20%以下、さらに好ましくは15%以下、さらにより好ましくは10%以下、及びさらにより好ましくは5%以下の凝集が許容され得る。凝集は、サイズ排除カラム（SEC）高性能液体クロマトグラフィ（HPLC）及び光散乱を含む当該技術分野において周知のいくつかの技術で測定し、モノマー、ダイマー、トリマー又はマルチマーを同定することができる。
（抗体を改変する方法）
上記のように、本明細書に開示されるVH及びVK配列を有する抗CADM1抗体は、VH及び／又はVK配列又はそれに付着する定常領域を修飾することにより、新規な抗CADM1抗体を生成するために使用できる。従って、別の本発明の態様において、本発明の抗CADM1抗体、例えばPTA021_A1、PTA021_A2又はPTA021_A3の構造的特徴は、ヒトCADM1に結合することなどの本発明の抗体の少なくとも1つの機能特性を保持する構造的に関連した抗CADM1抗体を生成するために使用される。例えば、PTA021_A1、PTA021_A2若しくはPTA021_A3又はその突然変異体の1以上のCDR領域を、公知のフレームワーク領域及び／又は他のCDRと組換え的に結合させ、上記のように、本発明の追加的な組換え的に改変された抗CADM1抗体を生成することができる。他のタイプの修飾は、以前の節に記載されるものを含む。改変方法についての出発物質は、本明細書に提供されている1以上のVH及び／又はVK配列、又はその1以上のCDR領域である。改変抗体を生成するために、本明細書に提供されている1以上のVH及び／又はVK配列又はその1以上のCDR領域を有する抗体を実際に調製する（すなわち、タンパク質として発現させる）必要はない。むしろ、当該配列に含まれる情報が、元の配列に由来する「第二世代の」配列を生成する出発物質として使用され、その後、該「第二世代の」配列はタンパク質として調製され、発現される。
したがって、別の実施態様において、本発明は、以下を含む抗CADM1抗体を調製するための方法を提供する：
以下を提供すること：(i) 配列番号1、2及び3からなる群から選択されるCDR1配列、配列番号4、5及び6からなる群から選択されるCDR2配列、及び／又は配列番号7、8及び9からなる群から選択されるCDR3配列を含む重鎖可変領域抗体配列；及び／又は(ii) 配列番号10、11及び12からなる群から選択されるCDR1配列、配列番号13、14及び15からなる群から選択されるCDR2配列、及び／又は配列番号16、17及び18からなる群から選択されるCDR3配列を含む軽鎖可変領域抗体配列；
重鎖可変領域抗体配列及び／又は軽鎖可変領域抗体配列内の少なくとも1つのアミノ酸残基を変更して、少なくとも1つの改変抗体配列を生成すること；及び、
タンパク質として該改変抗体配列を発現させること。
標準な分子生物学技術を使用して、改変抗体配列を調製し、発現させることができる。
好ましくは、改変抗体配列によりコードされる抗体は、本明細書に記載される抗CADM1抗体の機能特性の1つ、いくつか若しくは全部を保持するものであり、当該機能特性には以下のもの含むがこれらに限定されるものではない：1×10-7M以下のKDを有するヒトCADM1への結合；CADM1をトランスフェクトされたヒトCHO細胞への結合。
改変抗体の機能特性は、当該技術分野において利用可能な及び／又は本明細書に記載される標準的アッセイ、例えば実施例に記載されているアッセイ（例えば、フローサイトメトリー、結合アッセイ）を使用して評価できる。
本発明の改変抗体の方法の特定の実施態様において、突然変異は、抗CADM1抗体コード配列の全部又は一部に沿ってランダムに又は選択的に導入でき、その結果として生じる修飾された抗CADM1抗体は、本明細書に記載されるような結合活性及び／又は他の機能特性について選別できる。突然変異法は、当該技術分野において記載されている。例えば、ShortによるPCT公報WO 02/092780は、飽和突然変異導入、合成ライゲーションアセンブリ、又はこれらの組み合わせを使用して抗体突然変異を生成し、選別する方法を記載する。選択的に、LazarらによるPCT公報WO 03/074679は、抗体の生理化学的特性を最適化するための計算スクリーニング法を使用する方法を記載する。
（本発明の抗体をコードする核酸分子）
本発明の別の態様は、本発明の抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、細胞全体において、細胞可溶化物において、又は部分的に精製されたか若しくは実質的に純粋な形態において、存在してもよい。核酸は、アルカリ/SDS処理、塩化セシウムバンディング、カラムクロマトグラフィ、アガロースゲル電気泳動、及び当該技術分野において周知の他のものを含む標準的な方法によって、他の細胞成分又は他の汚染物質（例えば、他の細胞核酸又はタンパク質）から精製される場合、「単離されている」又は「実質的に純粋にされている」。F. Ausubelら編 (1987) 「分子生物学の最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」, Greene Publishing and Wiley Interscience, New Yorkを参照されたい。本発明の核酸は、例えば、DNA又はRNAであることができ、イントロン配列を含んでよく又は含まなくてもよい。好ましい実施態様において、核酸は、cDNA分子である。
本発明の核酸は、標準的な分子生物学技術を使用して得ることができる。ハイブリドーマ（例えば、更に後述するようにヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスから調製されたハイブリドーマ）により発現された抗体について、該ハイブリドーマによって生成される抗体の軽鎖及び重鎖をコードするcDNAは、標準的なPCR増幅又はcDNAクローニング技術によって得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリ（例えば、ファージディスプレイ技術を使用して）から得られる抗体について、該抗体をコードする核酸は、該ライブラリから回収できる。
本発明の好ましい核酸分子は、PTA021_A1、PTA021_A2又はPTA021_A3モノクローナル抗体のVH及びVL配列をコードするものである。PTA021_A1、PTA021_A2及びPTA021_A3のVH配列をコードするDNA塩基配列は、それぞれ配列番号25、26及び27に示される。PTA021_A1、PTA021_A2及びPTA021_A3のVK配列をコードするDNA塩基配列は、それぞれ配列番号28、29及び30に示される。
本発明の他の好ましい核酸は、配列番号25、26、27、28、29、及び30に示される配列のうちの1つと、少なくとも80%の配列同一性、例えば少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%又は少なくとも99%の配列同一性を有する核酸であり、当該核酸は、本発明の抗体又はその抗原結合部分をコードする。
2つの核酸配列間の同一率は、ギャップの数及び各ギャップの長さを考慮した場合にヌクレオチドが同一である配列の位置の数であり、これらは当該2つの配列の最適な整列のために導入されることを必要とする。配列の比較及び2つの配列間の同一率の決定は、上記のMeyers及びMillerのアルゴリズム又はAltschulのXBLASTプログラムなどの数学的アルゴリズムを使用して達成できる。
本発明のなお更なる好ましい核酸は、配列番号25、26、27、28、29、及び30に示される核酸配列の1以上のCDR-コード部分を含む。この実施態様において、核酸は、PTA021_A1、PTA021_A2若しくはPTA021_A3の重鎖CDR1、CDR2及び／又はCDR3配列、又はPTA021_A1、PTA021_A2若しくはPTA021_A3の軽鎖CDR1、CDR2及び／又はCDR3配列をコードできる。
配列番号25、26、27、28、29、又は30の当該CDR-コード部分（VH及びVK 配列）と少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%又は少なくとも99%の配列同一性を有する核酸も本発明の好ましい核酸である。当該核酸は、非CDRコード領域及び／又はCDR-コード領域における配列番号25、26、27、28、29、又は30の対応する部分と異なることができる。当該差異がCDR-コード領域にある場合、核酸によりコードされる核酸CDR領域は典型的には、PTA021_A1、PTA021_A2又はPTA021_A3の対応するCDR配列に比較して、本明細書で定義される1以上の保存的配列修飾を含む。
いったんVH及びVKセグメントをコードするDNA断片が得られたら、これらのDNA断片を標準的な組換えDNA技術で更に操作し、例えば可変域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子に、Fab断片遺伝子に、又はscFv遺伝子に変換できる。これらの操作において、VK-又はVH-コードDNA断片は、別のタンパク質（例えば抗体定常領域又は可撓性リンカー）をコードする別のDNA断片に機能的に連結される。この文脈において使用される用語「機能的に連結される」とは、2つのDNA断片が、該2つのDNA断片によりコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように、連結されることを意味することを意図する。
VH領域をコードする単離されたDNAは、VH-コードDNAを、重鎖定常領域（CH1、CH2及びCH3）をコードする別のDNA分子に機能的に連結することによって、全長重鎖遺伝子に変換できる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野において公知であり（例えば、Kabat, E. A.らの文献(1991)「免疫学的関心対象のタンパク質配列」,第5版, 米国保健社会福祉省、NIH公開番号91-3242を参照されたい）、これらの領域を包含するDNA断片は標準的なPCR増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM又はIgD定常領域であり得るが、最も好ましくはIgG1又はIgG4定常領域である。Fab断片重鎖遺伝子について、該VH-コードDNAは、重鎖CH1定常領域のみをコードする別のDNA分子に機能的に連結できる。
VL/VK領域をコードする単離されたDNAは、VL-コードDNAを、軽鎖定常領域（CL）をコードする別のDNA分子に機能的に連結することによって、全長軽鎖遺伝子（並びにFab軽鎖遺伝子）に変換できる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野において公知であり（例えばKabat, E. A.らの文献(1991)「免疫学的関心対象のタンパク質配列」,第5版, 米国保健社会福祉省、NIH公開番号91-3242を参照されたい）、これらの領域を包含するDNA断片は標準的なPCR増幅によって得ることができる。好ましい実施態様において、軽鎖定常領域は、κ又はλ定常領域であり得る。
scFv遺伝子を生成するために、VH-及びVL/VK-コードDNA断片は、可撓性リンカーをコードする、例えばアミノ酸配列（Gly4-Ser）3をコードする別の断片に機能的に連結され、このようにして該VH及びVL/VK配列は、可撓性リンカーで連結されたVL/VK及びVHドメインとともに隣接する単鎖タンパク質として発現できるようになる（例えば、Birdらの文献 (1988) Science 242:423-426；Hustonらの文献 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883;McCaffertyらの文献, (1990) Nature 348:552-554を参照されたい。)。
（モノクローナル抗体の産生）
本発明のモノクローナル抗体（mAbs）は、従来のモノクローナル抗体方法論（例えば、Kohler及びMilsteinの文献 (1975) Nature 256:495記載の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術）を含む、様々な技術によって産生できる。体細胞ハイブリダイゼーション手順が好ましいものの、原理的には、モノクローナル抗体を産生する他の技術、例えばウイルス性又は癌化性のBリンパ球形質転換を利用できる。
ハイブリドーマを調製するための好ましい動物系は、マウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ産生は、非常によく確立した手順である。免疫プロトコル及び融合のための免疫された脾細胞の単離技術は、当該技術分野において公知である。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）及び融合手順も公知である。
本発明のキメラ又はヒト化抗体は、上記の通りに調製される非ヒトモノクローナル抗体の配列に基づいて調製できる。重鎖及び軽鎖免疫グロブリンをコードするDNAは、関心対象の非ヒトハイブリドーマから得ることができ、標準的な分子生物学技術を使用して非マウス（例えば、ヒト）免疫グロブリン配列を含むように改変できる。例えば、キメラ抗体を生成するために、マウス可変領域は、当該技術分野において公知の方法を使用して、ヒト定常領域に連結できる（例えば、Cabillyらへの米国特許4,816,567を参照されたい）。ヒト化抗体を生成するために、マウスCDR領域は、当該技術分野において公知の方法を使用して、ヒトフレームワークに挿入できる（例えば、Winterへの米国特許5,225,539、及びQueenらへの米国特許5,530,101; 5,585,089; 5,693,762及び6,180,370を参照されたい）。
好ましい実施態様において、本発明の抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。CADM1に対して指示される当該ヒトモノクローナル抗体は、マウス系よりもむしろヒト免疫系の部分を保有するトランスジェニックマウス又は導入染色体マウスを使用して産生できる。これらのトランスジェニック及び導入染色体マウスには、それぞれHuMAb Mouse（登録商標）及びKM Mouse（登録商標）系統のマウスとして本明細書において称されるマウスを含み、本明細書において「ヒトIgマウス」と集合的に称される。
HuMAb Mouse（登録商標）系統（Medarex（登録商標）社）は、内因性のμ及びκ鎖座を不活性にする標的突然変異と共に、再編成されていないヒト重鎖（μ及びγ）及びκ軽鎖免疫グロブリン配列ををコードするヒト免疫グロブリン遺伝子小座（miniloci）を含む（例えば、Lonbergらの文献 (1994) Nature 368(6474): 856-859を参照されたい）。したがって、該マウスは、マウスIgM又はκの発現減少を呈し、免疫に応答して、導入されたヒト重鎖及び軽鎖導入遺伝子は、クラススイッチング及び体細胞突然変異を受け、高親和性ヒトIgGκモノクローナル抗体を産生する（Lonberg, N.らの文献 (1994)、上記；Lonberg, N.の文献 (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101;Lonberg, N.及びHuszar, D.の文献 (1995) Intern.Rev. Immunol.13:65-93、並びにHarding, F.及びLonberg, N.の文献 (1995) Ann.N.Y. Acad. Sci. 764:536-546を再考察されたい)。HuMAb Mouse（登録商標）の調製及び使用、並びに当該マウスにより保有されるゲノム修飾は、以下に、更に記載される：Taylor, L.らの文献 (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295;Chen, J.らの文献 (1993) International Immunology 5:647-656;Tuaillonらの文献 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724;Choiらの文献 (1993) Nature Genetics 4:117-123;Chen, J.らの文献 (1993) EMBO J. 12:821-830;Tuaillonらの文献 (1994) J. Immunol.152:2912-2920;Taylor, L.らの文献 (1994) International Immunology 6:579-591;及びFishwild, D.らの文献 (1996) Nature Biotechnology 14:845-851。これらの内容の全ては引用によりその全てが具体的に本明細書に組み込まれる。更に以下のものを参照されたい：Lonberg及びKayへの米国特許5,545,806；5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,789,650;5,877,397;5,661,016;5,814,318;5,874,299;及び5,770,429;Suraniらへの米国特許 5,545,807;Lonberg及びKayへのPCT公報WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 及びWO 99/45962;並びにKormanらへのPCT公報番号WO 01/14424。
別の実施態様において、本発明のヒト抗体は、導入遺伝子及び導入染色体のヒト免疫グロブリン配列を保有するマウス、例えばヒト重鎖導入遺伝子及びヒト軽鎖染色体導入を保有するマウスを使用して、抗体産生できる。このマウスは、本明細書において、「KM Mouse（登録商標）」系統のマウスと称され、IshidaらへのPCT公報WO 02/43478において詳述されている。
更に、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替的なトランスジェニック動物系は、当該技術分野において利用可能であり、本発明の抗CADM1抗体を産生するために使用できる。例えば、Xenomouse（Amgen社）と称される代替的なトランスジェニック系が使用でき；当該マウスは、例えば、Kucherlapatiらによる米国特許5,939,598;6,075,181;6,114,598;6,150,584及び6,162,963に記載されている。
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替的な導入染色体動物系は、当該技術分野において利用可能であり、本発明の抗CADM1抗体を産生するために使用できる。例えば、「TCマウス」と称されるヒト重鎖導入染色体及びヒト軽鎖導入染色体（tranchromosome）を保有するマウスを使用でき；当該マウスは、Tomizukaらの文献 (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727に記載されている。さらにまた、ヒト重鎖及び軽鎖導入染色体を保有するウシが当該技術分野に記載されており（Kuroiwaらの文献 (2002) Nature Biotechnology 20:889-894及びPCT出願番号WO/2002/092812）、本発明の抗CADM1抗体を産生するために使用できる。
本発明のヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のスクリーニングライブラリについてのファージディスプレイ法を使用しても調製できる。ヒト抗体を単離する当該ファージディスプレイ法は、当該技術分野において確立されている。例えば以下のものを参照されたい：Ladnerらへの米国特許5,223,409;5,403,484;及び5,571,698;Dowerらへの米国特許5,427,908及び5,580,717;McCaffertyらへの米国特許5,969,108及び6,172,197;並びに、Griffithsらへの米国特許5,885,793;6,521,404;6,544,731;6,555,313;6,582,915及び6,593,081。
本発明のヒトモノクローナル抗体は、ヒト抗体反応が免疫処置に応じて産生され得るように、ヒト免疫細胞が再構成されたSCIDマウスを使用して調製することもできる。当該マウスは、例えば、Wilsonらへの米国特許5,476,996及び5,698,767に記載されている。
（ヒトIgマウスの免疫）
ヒトIgマウスが本発明のヒト抗体を産生するために使用される場合、当該マウスは、Lonberg, N.らの文献 (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D.らの文献 (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851;並びにPCT公報WO 98/24884及びWO 01/14424に記載されるように、CADM1抗原及び／又は組換え型CADM1の精製若しくは富化調製物、又はCADM1発現細胞又はCADM1融合タンパク質で免疫できる。好ましくは、マウスは、初回免疫時に6〜16週齢である。例えば、CADM1抗原の精製若しくは組換え調製物（5〜50μg）は、ヒトIgマウスに腹膜内免疫するのに使用できる。
CADM1に対する完全ヒトモノクローナル抗体を生成する詳細な手順は、下記の実施例1に記載されている。様々な抗原に接した累積的な経験は、当該トランスジェニックマウスが、はじめに完全フロイントアジュバント中の抗原で腹膜内（IP）免疫され、その後、不完全フロイントアジュバント中の抗原で1週おきにIP免疫（合計6回まで）される場合に応答することが示された。しかしながら、フロイントアジュバント以外のアジュバントも有効であることも見出される。さらに、アジュバントの非存在下で細胞全体が高度に免疫原性であることが見出される。免疫応答は、後眼窩ブリードにより得られている血漿サンプルを用いる一連の免疫プロトコルに渡ってモニタできる。血漿はELISA（後述するように）で選別でき、抗CADM1ヒト免疫グロブリンの充分な力価をもつマウスを融合に使用できる。マウスは、屠殺及び脾臓の除去の３日前に、抗原を用いて静注で追加免疫できる。各免疫につき2〜3の融合が実施される必要があり得ると予測される。典型的には、6〜24匹のマウスが、各抗原について免疫を受ける。一実施態様において、HCo7、HCo12又はHCo17ヒト重鎖導入遺伝子系統を有するマウス系統を使用できる。選択的に又はさらに、KM Mouse（登録商標）系統を使用できる。さらに、これらの系統の2以上をともにかけあわせて、複数の異なるヒト重鎖導入遺伝子を有する単一マウスにすることができる。
（ヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの生成）
本発明のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを生成するため、免疫したマウスからの脾細胞及び／又はリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞株などの適当な不死化細胞株に融合できる。結果として生じるハイブリドーマは、抗原-特異抗体の産生に関してスクリーニングできる。例えば、免疫したマウスからの脾臓リンパ球の単一細胞浮遊液は、50% PEGを用いて、1/6の数のP3X63-Ag8.653非分泌マウス骨髄腫細胞（ATCC、CRL 1580）に融合できる。選択的に、免疫したマウスからの脾臓リンパ球の単一細胞浮遊液は、CytoPulseラージチャンバ細胞融合エレクトロポレータ（CytoPulse Sciences社、Glen Burnie Maryland）を使用する電界系電気融合法を使用して融合できる。細胞は平底マイクロタイタープレートに約2×105で播いた後、20% 胎児Clone Serum、18% 「653」条件培地、5% origen（IGEN）、4mM L-グルタミン、1mM ピルビン酸ナトリウム、5mM HEPES、0.055mM 2-メルカプトエタノール、50単位/ml ペニシリン、50mg/ml ストレプトマイシン、50mg/ml ゲンタマイシン及び1X HAT（Sigma; HATは融合の24時間後に加えられる）を含む選択培地で2週間インキュベーションする。約2週間後、該細胞は、HATがHTで置換された培地で培養できる。個々のウェルはそれから、ヒトモノクローナルIgM及びIgG抗体についてのELISAで選別できる。いったん示量性のハイブリドーマ増殖が発生したならば、培地は通常、10〜14日後に観察できる。抗体分泌ハイブリドーマを再播種して、さらに選別でき、ヒトIgGに未だ陽性である場合は、該モノクローナル抗体を限界希釈法によって少なくとも2回サブクローン化できる。それから安定サブクローンをインビトロで培養し、特徴づけのための組織培地において少量の抗体を生成できる。
ヒトモノクローナル抗体を精製するために、選択されたハイブリドーマは、モノクローナル抗体精製のための2リットルのスピナー-フラスコにおいて培養できる。プロテインA-セファロース（Pharmacia、Piscataway、N.J.）を用いるアフィニティークロマトグラフィの前に、上清を濾過し、濃縮できる。溶出されたIgGは、ゲル電気泳動及び高性能液体クロマトグラフィによりチェックして、純度を保証することができる。緩衝液はPBSに交換でき、濃度は1.43吸光係数を使用してOD280により決定できる。該モノクローナル抗体を分注し、-80℃で保存できる。
（モノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの生産）
また、本発明の抗体は、例えば、当該技術分野において周知の組換えDNA技術及び遺伝子トランスフェクション法の組合せ（例えば、Morrison, S.の文献 (1985) Science 229:1202）を使用して、宿主細胞トランスフェクトーマにおいて産生され得る。
例えば、抗体又はその抗体断片を発現させるために、部分又は全長軽鎖及び重鎖をコードするDNAを標準的な分子生物学技術（例えば、関心対象抗体を発現するハイブリドーマを使用するPCR増幅又はcDNAクローン化）によって得ることができ、該DNAは、当該遺伝子が転写及び翻訳制御配列に機能的に連結されるように発現ベクターに挿入できる。この文脈において、用語「機能的に連結する」とは、ベクター内の転写及び翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写及び翻訳を制御するそれらの意図された機能に貢献するように、抗体遺伝子がベクターにライゲーションされることを意味することを意図する。発現ベクター及び発現制御配列は、使用する発現宿主細胞に適合性であるように選ばれる。抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は、別々のベクターに挿入でき、又はより典型的には、両方の遺伝子は同じ発現ベクターに挿入される。抗体遺伝子は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片及びベクター上の相補制限部位でのライゲーション、又は制限部位がない場合にはブラントエンドライゲーション）によって発現ベクターに挿入される。本明細書に記載されている抗体の軽鎖及び重鎖可変領域を使用して、該VHセグメントが該ベクターにおいてCHセグメントに機能的に連結され、かつ該VKセグメントが該ベクターにおいてCLセグメントに機能的に連結されるように、所望のアイソタイプの重鎖定常及び軽鎖定常領域を既にコードする発現ベクターに前記領域を挿入することにより、任意の抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を生成することができる。さらに又は選択的に、組換え発現ベクターは、宿主細胞から抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードできる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、ベクターにクローン化できる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は非相同シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド）であり得る。
抗体鎖遺伝子に加え、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞において抗体鎖遺伝子の発現を制御する制御配列を保有する。用語「制御配列」とは、抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を制御するプロモータ、エンハンサ及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。当該制御配列は、例えば、Goeddelの文献（Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)）に記載されている）。制御配列の選択を含む発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、要求されるタンパク質の発現レベルなどの因子に依存し得ることは、当業者に認識されるであろう。哺乳動物宿主細胞発現についての好ましい制御配列には、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメント、例えばサイトメガロウイルス（CMV）、サルウイルス40（SV40）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモータ（AdMLP））及びポリオーマに由来するプロモータ及び／又はエンハンサを含む。選択的に、ユビキチンプロモータ又はβ-グロビンプロモータなどの非ウイルス制御配列を使用できる。更に、制御エレメントは、SV40初期プロモータ及びヒトT細胞白血病ウイルス1型の長末端反復からの配列を含むSRαプロモータ系などの異なる源からの配列から構成された（Takebe, Y.らの文献 (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472）。
抗体鎖遺伝子及び制御配列に加え、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞においてベクターの複製を制御する配列（例えば、複製開始点）及び選択可能なマーカー遺伝子などの更なる配列を保有できる。選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を促進する（例えば全てAxelらによる米国特許番号4,399,216、4,634,665及び5,179,017を参照されたい）。例えば、典型的には、選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、G418、ハイグロマイシン又はメトトレキセートなどの薬剤への耐性を与える。好ましい選択可能なマーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝子（メトトレキセート選択/増幅を用いるdhfr-宿主細胞用に）及びneo遺伝子（G418選択のために）を含む。
軽鎖及び重鎖の発現について、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターは、標準的な技術によって宿主細胞にトランスフェクションされる。用語「トランスフェクション」の様々な形態は、原核生物又は真核生物宿主細胞への外来性DNAの導入のために共通に使用される幅広い様々な技術（例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿、DEAE-デキストラントランスフェクションなど）を含むことを意図する。原核生物又は真核生物宿主細胞において本発明の抗体を発現させることが理論的に可能であるにもかかわらず、真核細胞及び最も好ましくは哺乳動物宿主細胞における抗体の発現が最も好ましい。なぜなら、当該真核細胞及び特に哺乳動物細胞は適切に折り畳まれ、免疫学的に活性な抗体をアセンブルして分泌することが原核細胞より可能性が高いからである。抗体遺伝子の原核生物発現は、高収率の活性抗体の生産に効果がないことが報告されている（Boss, M. A.及びWood, C. R.の文献 (1985) Immunology Today 6:12-13）。
本発明の組換え抗体を発現するための好ましい哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO細胞）（例えばR. J. Kaufman及びP. A. Sharpの文献 (1982) J. Mol. Biol. 159:601-621に記載されたDHFR選択可能マーカーとともに使用される、Urlaub及びChasinの文献, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載されたdhfr- CHO細胞を含む）、NSO骨髄腫細胞、COS細胞及びSP2細胞を含む。特に、NSO骨髄腫細胞を用いた使用について、別の好ましい発現系は、WO 87/04462（Wilsonに対する）、WO 89/01036（Bebbingtonに対する）及びEP 338,841（Bebbingtonに対する）に開示されるGS遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入される場合、該抗体は、宿主細胞における抗体の発現、又は好ましくは宿主細胞が培養される培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な時間宿主細胞を培養することによって生産される。抗体は、標準的なタンパク質精製法を使用して培地から回収できる。
（抗原に結合する抗体の特徴づけ）
本発明の抗体は、例えば、標準的なELISAによってCADM1に結合することについて試験できる。簡潔にいうと、マイクロタイタープレートは、0.25μg/mlの精製CADM1のPBS溶液で被覆した後、5% ウシ血清アルブミンPBS溶液でブロックする。抗体の希釈剤（例えば、CADM1-免疫したマウスからの血漿の希釈剤）を各ウェルに加え、37℃で1〜2時間インキュベートする。プレートは、PBS/Tweenで洗浄した後、37℃で1時間アルカリホスファターゼに抱合化した第２の試薬（例えば、ヒト抗体について、ヤギ-抗ヒトIgG Fc特異的ポリクローナル試薬））とともにインキュベートする。洗浄後、プレートをpNPP基質（1mg/ml）で発現させ、OD405-650で分析する。好ましくは、最も高い力価を開発するマウスが、融合に使用される。
上記のELISAアッセイは、CADM1免疫原に陽性反応性を示すハイブリドーマについて試験するために使用することもできる。CADM1に高い結合活性で結合するハイブリドーマをサブクローン化し、更に特徴づける。親細胞の反応性（ELISAによる）を保持する各ハイブリドーマからの1のクローンは、-140℃で保存された5-10バイアルの細胞バンクを作成するために、及び抗体精製のために、選択できる。
抗CADM1抗体を精製するために、選択されたハイブリドーマは、モノクローナル抗体精製のために2リットルのスピナー-フラスコで増殖させることができる。上清は、プロテインA-セファロース（Pharmacia, Piscataway, NJ）を用いるアフィニティークロマトグラフィの前に濾過し、濃縮できる。溶出されたIgGは、純度を保証するために、ゲル電気泳動及び高性能液体クロマトグラフィによりチェックできる。緩衝液をPBSに交換でき、濃度を1.43吸光係数を使用するOD280で決定できる。モノクローナル抗体を分注し、-80℃で保存できる。
選択された抗CADM1モノクローナル抗体が固有のエピトープに結合するか否かを測定するために、各抗体は、市販の試薬（Pierce, Rockford, IL)を使用してビオチン化できる。ラベルしていないモノクローナル抗体及びビオチン化されたモノクローナル抗体を使用して本発明の抗体に結合することを競合させるための研究は、上記の通りにCADM1被覆ELISAプレートを使用して実施できる。ビオチン化mAb結合は、ストレプ（strep）-アビジン-アルカリホスファターゼプローブで検出できる。
精製された抗体のアイソタイプを決定するために、アイソタイプELISAは、特定のアイソタイプの抗体に特異的な試薬を使用して実施できる。例えば、ヒトモノクローナル抗体のアイソタイプを決定するために、マイクロタイタープレートのウェルは1μg /mlの抗ヒト免疫グロブリンで終夜4℃で被覆できる。1% BSAでブロックした後、該プレートを1μg/ml以下の試験モノクローナル抗体又は精製アイソタイプコントロールと1〜2時間室温で反応させる。それから、該ウェルをヒトIgG1又はヒトIgM特異的アルカリホスファターゼ抱合化プローブのいずれかと反応させることができる。プレートは、上記の通りに現像され、解析される。
抗CADM1ヒトIgGは、ウエスタンブロッティングにより、CADM1抗原との反応性について更に試験できる。簡潔にいうと、CADM1を調製し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動に供することができる。電気泳動後、分離された抗原をニトロセルロース膜に転写し、10% ウシ胎仔血清でブロックし、試験されるモノクローナル抗体でプローブする。ヒトIgG結合は、抗ヒトIgGアルカリホスファターゼを使用して検出でき、BCIP/NBT基質錠剤（Sigma Chem社, St. Louis, Mo.）を用いて現像できる。
本発明の抗体の結合特異性はまた、CADM1を発現する細胞に対する抗体の結合をモニタリングすることにより、例えばフローサイトメトリーにより、測定できる。典型的には、CHO細胞株などの細胞株は、CADM1の膜貫通形態をコードする発現ベクターを用いてトランスフェクトできる。いくつかの実施態様において、アミノ末端HAタグ（配列番号43）を有する全長CADM1分子は、CHO細胞株の細胞表面に発現する。トランスフェクトされたタンパク質は、タグに対する抗体を使用する検出のための、好ましくはN末端のmyc-タグなどのタグを含み得る。CADM1への本発明の抗体の結合は、トランスフェクトされた細胞を抗体とインキュベートすること、及び結合した抗体を検出することにより測定できる。トランスフェクトされたタンパク質上のタグに対する抗体の結合は、ポジティブコントロールとして使用できる。
CADM1についての本発明の抗体の特異性は、CADM1への結合が測定される同法を使用して、該抗体が他のタンパク質、例えばTSLL2/CADM1C又は免疫グロブリンスーパーファミリーの他のメンバーに結合するか否かを測定することによって、更に研究できる。
（抗体-パートナー分子抱合体）
好ましい態様において、本発明による抗CADM1抗体及びパートナー分子を含む抱合体が提供され、該抱合体は式(a)により表され
Z[(XZ)aC(XD)bD]m (a)
式中、Zは本発明による抗体であり；Dは、パートナー分子であり；かつ、(XZ)aC(XD)bは、それらがはじめの2つのエレメントを連結するので、「リンカー部分」又は「リンカー」と集合的に称される。該リンカーにおいて、Cは、パートナー分子Dの意図された生物学的作用の部位で切断されるように設計された切断可能基であり；XZ及びXDは、それらがそれぞれZ及びC並びにC及びDの間に間隔を置くので、スペーサ部分（又は「スペーサ」）と称され；下つき添字a及びbは、独立に、0又は1であり（すなわち、XZ及び／又はXDの存在は、任意である）；かつ、下つき添字mは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10（好ましくは1、2、3、又は4）である。上述の用語の各々は、本明細書の以下においてさらに詳細に定義される。
抗体Zは、その抗原が位置する標的組織又は細胞に結合することにより、標的化機能を担い、これは該抱合体をその場所に方向付ける。好ましくは、標的組織又は細胞は腫瘍又は癌細胞であり、抗原は腫瘍関連又は腫瘍特異性抗原である。標的組織又は細胞での基Cの開裂は、その意図された生物学的機能を発揮するためにパートナー分子Dを放出する。ある場合において、抱合体はエンドサイトーシスによって標的細胞に内在化され、開裂は標的細胞内で起こる。この様式において、パートナー分子Dの正確な送達は作用部位で達成され、必要とされる投与が低減される。また、パートナー分子Dは通常、その抱合状態において生物学的に不活性であり（又は著しく活性が低く）、これにより非標的組織又は細胞に対する望ましくない毒性が低減される。抗癌剤はしばしば低い治療指数を有する高度に有毒な化合物であるので、これは重要な考慮事項である。
下つき添字mにより反映されるように、抗体Zの各分子は、部位の数に応じて複数のパートナー分子Dによって抱合化できる。前者は抱合化に利用でき、実験条件が利用される。当業者には明らかなように、抗体Zの各分子がパートナー分子Dの整数個に抱合されるが、該抱合体の調製物は、抗体Zに対するパートナー分子Dの非整数比率について分析でき、これは統計学的平均を反映する。
（抗体Z）
抗体Z上のいくつかの異なる反応基の任意の1つは、リジン残基におけるε-アミノ基、ペンダント炭化水素部分、カルボン酸基、ジスルフィド基及びチオール基を含む、抱合化部位として使用できる。各タイプの反応基は、いくらか利点を有するがいくらかの相殺限界を有するトレードオフを表す。抱合化に適する抗体反応基上の再調査については、例えばGarnettの文献, Adv. Drug Delivery Rev. 53 (2001), 171-216、並びにDubowchik及びWalkerの文献, Pharmacology & Therapeutics 83 (1999), 67-123を参照されたく、これらの開示は引用により本明細書に組み込まれる。
一実施態様において、抗体Zは、リジンε-アミノ基を介して抱合化される。大部分の抗体は複数の露出したリジンε-アミノ基を有し、これは当該技術分野において公知の技術を使用してアミド、尿素、チオ尿素又はカルバミン酸エステル結合を介して抱合化でき、ヘテロ二官能基剤を用いた修飾を含む（本明細書の以下に更に記載される）。しかしながら、どの及びどれくらいのε-アミノ基が反応して、抱合化調製物における潜在的なバッチ間変動をもたらすかを制御することは困難である。また、抱合化は、抗体の天然型の立体構造を維持することに重要なプロトン化されたε-アミノ基の中和を引き起こす可能性があり、又は抗原結合部位の近くで若しくは当該部位のリジンで起こる場合があり、これらはいずれも望ましくない存在である。
別の実施態様において、抗体Zは、多くの抗体がグリコシル化されるように、炭化水素側鎖を介して抱合化できる。炭化水素側鎖は過ヨウ素酸塩で酸化してアルデヒド基を生成することができ、これは順次、セミカルバゾン、オキシム又はヒドラゾンなどのイミン基を形成するためにアミンと反応できる。必要に応じて、イミン基は、シアノボロハイドライドナトリウムで還元し、より安定な結合を生成することができる。炭化水素側鎖を介する抱合化における追加的な開示については、例えばRodwellらの文献, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83, 2632-2636 (1986)を参照されたく；当該開示は引用により本明細書に組み込まれる。リジンε-アミノ基を用いるので、抱合化部位の位置及び化学量論に関する懸念がある。
さらに別の実施態様において、抗体Zは、カルボン酸基を介して抱合化できる。一実施態様において、末端カルボン酸基を官能化してカルボヒドラジドを生成し、これをそれからアルデヒド担持抱合化部分と反応させる。Fischらの文献, Bioconjugate Chemistry 1992, 3, 147-153を参照されたい。
さらに別の実施態様において、抗体Zは、抗体Z上のシステイン残基の硫黄及び抱合体の他の部分上の硫黄を架橋するジスルフィド基を介して抱合化できる。いくつかの抗体（IgGアイソタイプなど）は、例えばヒンジ領域において、遊離チオール基を欠くが、ジスルフィド基を有する。このような場合、遊離チオール基は、天然型ジスルフィド基の還元によって生成できる。このようにして生成したチオール基をそれから抱合化に使用できる。例えば、Packardらの文献, Biochemistry 1986, 25, 3548-3552;Kingらの文献, Cancer Res. 54, 6176-6185 (1994);及び、Doroninaらの文献, Nature Biotechnol.21(7), 778-784 (2003)を参照されたく；当該開示は引用により本明細書に組み込まれる。また、抱合化位置、及び化学量論、並びに抗体の天然型の立体構造の破壊の可能性に関する懸念がある。
さらに別の好ましい実施態様において、抗体Zは、アクセプタ部分へのチオール基の求核付加生成物を介して抱合化される。好ましいアクセプタ部分はマレイミド基であり、抗体チオール基とのその反応が以下に図示される：
Figure 0005816558
多くの方法が、天然のジスルフィド結合を壊すことなく遊離チオール基を抗体に導入するために開発され、当該方法は本発明の抗体Zで実施できる。利用される方法に応じて、特定の位置に予測可能な数の遊離スルフヒドリルを導入することが可能であり得る。1つのアプローチにおいて、システインが別のアミノ酸で置換された変異抗体が調製される。例えば以下を参照されたい：Eigenbrotらの文献, US 2007/0092940 A1;Chilkotiらの文献, Bioconjugate Chem. 1994, 5, 504-507;Urnovitzらの文献, US 4,698,420 (1987);Stimmelらの文献, J. Biol. Chem., 275 (39), 30445-30450 (2000);Bamらの文献, US 7,311,902 B2 (2007);Kuanらの文献, J. Biol. Chem., 269 (10), 7610-7618 (1994);Poonらの文献, J. Biol. Chem., 270 (15), 8571-8577 (1995)。別の方法において、余剰システインがC末端に加えられる。例えば以下を参照されたい：Cumberらの文献, J. Immunol., 149, 120-126 (1992);Kingらの文献, Cancer Res., 54, 6176-6185 (1994);Liらの文献, Bioconjugate Chem., 13, 985-995 (2002);Yangらの文献, Protein Engineering, 16, 761-770 (2003);及び、Olafsonらの文献, Protein Engineering Design & Selection, 17, 21-27 (2004)。遊離システインを導入する好ましい方法は、Kingにより2007年8月22日に出願された米国仮出願番号第60/957,271号において教示されたものであり、そのなかで、システイン担持アミノ酸配列は、抗体の重鎖のC末端に加えられる。この方法は、抗原結合部位から離れた公知の位置に、公知の数のシステイン残基（重鎖当たり1個）を導入する。この段落において引用された文書の開示は、引用によりその全てが本明細書に組み込まれる。
さらに別の実施態様において、リジンε-アミノ基は、ε-アミノ基をチオール又はジスルフィド基へと変換する2-イミノチオラン又はN-スクシンイミジル-3-（2-ピリジルジチオ）プロピオナート（SPDP）などのヘテロ二官能性試薬で修飾でき、これはいわば、システイン代用物を生成する。しかしながら、この方法は、固有のε-アミノ基に関連する同じ抱合化位置及び化学量論的制限に悩まされる。
（パートナー分子D）
パートナー分子Dは、治療剤又はマーカーであり得る。前者である場合、これは、例えば、細胞毒、非細胞毒薬剤（例えば、免疫抑制薬）、放射性薬剤、別の抗体、又は酵素若しくはその活性断片、例えばアブリン、リシンA、シュードモナス属外毒素又はジフテリア毒素；腫瘍壊死因子又はインターフェロン−γなどのタンパク質；又は、生体応答修飾因子、例えば、リンフォカイン、インターロイキン-1（「IL-1」）、インターロイキン-2（「IL-2」）、インターロイキン-6（「IL-6」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「GM-CSF」）、顆粒球コロニー刺激因子（「G-CSF」）、又は他の成長因子など；であり得る。後者である場合、これは、放射ラベル、蛍光ラベル、又は基質に対する検出可能な修飾を触媒する酵素などの検出可能なシグナルを生成する任意の部分であり得る。診断的に又は治療的使用のために抗体に抱合化できる放射性同位元素の例には、ヨウ素131、インジウム111、イットリウム90及びルテチウム177を含むがこれらに限定されない。放射性免疫抱合体を調製する方法は、当該技術分野において確立されている。放射性免疫抱合体の例には、市販のZevalin（登録商標）（IDEC Pharmaceuticals）及びBexxar（登録商標）を含み、類似の方法を使用して本発明の抗体を使用する放射性免疫抱合体を調製することができる。
細胞毒又は細胞毒性薬剤には、細胞に有害である（例えば、殺す）任意の薬剤を含む。例には、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、1-デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、並びにその類似体又はホモログを含む。
パートナー分子Dが治療剤である場合、治療剤の適切な種類には、代謝拮抗薬、アルキル化剤、DNA副溝結合剤、DNAインターカレータ、DNAクロスリンカー、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、核外移行阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼI又はII阻害剤、ヒートショックタンパク質阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗生物質、及び抗有糸分裂剤を含む。適切な治療剤の例には、アクチノマイシンD、アントラサイクリン、アントラマイシン（AMC）、オーリスタチン（auristatin）、ブレオマイシン、ブスルファン、カリケアマイシン、カンプトセシン、カルマスティン、クロラムブシル、シス-ジクロロジアミンプラチナ(II)（DDP）、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、サイトカラシンB、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デカルバジン、1-デヒドロテストステロン、ジブロモマンニトール、ジヒドロキシアントラシンジオン、ドキソルビシン、エメチン、エポチロン、臭化エチジウム、エトポシド、5-フルオロウラシル、ゲムシタビン、糖質コルチコイド、グラミシジンD、イマチニブ、イリノテカン、β-ラパコン、リドカイン、ロムスチン、マイタンシン、メクロレタミン、メルファラン、6-メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトラマイシン、マイトマイシンC、ミトキサントロン、パクリタキセル、プロカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、リシン、ストレプトゾトシン、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（SAHA）、タリソマイシン、テノポシド、テトラカイン、チオテパ、6-チオグアニン、ツブリシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、及びその類似体、ホモログ又は誘導体を含む。
好ましくは、パートナー分子Dは、オーリスタチン（特にMMAE及びMMAF）、エンジイン抗生物質（特にカリケアマイシン及びCalichDMH）、ドキソルビシン、マイタンシノイド（特にDM1及びDM4）、シュードモナス属外毒素A（特にその切断型）、DNA副溝結合アルキル剤（特にCC-1065及びデュオカルマイシンの類似体）、及びその類似体又は誘導体からなる群から選択される細胞毒である。カリケアマイシン抗体抱合体の例は、市販されている（Mylotarg（登録商標）; American Home Products）。当業者は、前述の細胞毒が大部分、天然物であり、そのいくつかの修飾（すなわち、誘導体化）がそれらを抱合化の調製に供するのに望ましい場合がある又は必要であり得ることを認識するであろう。
好ましいDNA副溝結合アルキル剤は、CC-1065の類似体又は誘導体及び構造的に関連したデュオカルマイシンであり、それらの適切な例は以下に開示されている：Ngらの文献, US 7,087,600 B2 (2006);Ngらの文献, US 6,989,452 B2 (2006);Ngらの文献, US 7,129,261 B2 (2006);Ngらの文献, WO 02/096910 A1 (2002);Boydらの文献, US 2006/0024317 A1 (2006);Chenらの文献, US 2006/0004081 A1 (2006);Gangwarらの文献, US 2006/0247295 A1 (2006);Boydらの文献, WO 2007/038658 A2 (2007);Gangwarらの文献, WO 2007/051081 A1 (2007);Gangwarらの文献, WO 2007/059404 A2 (2007);Sufiらの文献, WO 2008/083312 A2 (2008);及び、2008年2月20日に出願されたChenらの文献, PCT出願番号PCT/US2008/054362。当該開示は引用により本明細書に組み込まれる。そのような好ましいパートナー分子Dは、式(b)により表すことができる：
Figure 0005816558
 式中、
環系Aは、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のヘテロアリール、置換若しくは非置換のヘテロシクロアルキル基、例えばフェニール又はピロールであり；
E及びGは、独立に、H、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のヘテロアルキル、ヘテロ原子、又は単結合であるか、又はE及びGは結合して、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のヘテロアリール、及び置換若しくは非置換のヘテロシクロアルキルから選択される環系を形成し；
XはO、S又はNR23であり、式中、R23はH、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のヘテロアルキル、又はアシルであり；
R3は、(=O)又はOHであり；
R4、R4'、R5及びR5'は、独立に、H、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のヘテロアリール、置換若しくは非置換のヘテロシクロアルキル、ハロゲン、NO2、NR15R16、NC(O)R15、OC(=O)NR15R16、OC(=O)OR15、C(=O)R15、SR15、OR15、CR15=NR16又はO(CH2)nN(CH3)2であり、式中、nは1から20の整数であり、又はR4、R4'、R5及びR5'の任意の隣接する対は、それらが結合する炭素原子と共に結合して、4〜6員の置換若しくは非置換のシクロアルキル又はヘテロシクロアルキル環系を形成し；
R15及びR16は、独立に、H、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のヘテロアルキル、置換若しくは非置換のアリール、置換若しくは非置換のヘテロアリール、置換若しくは非置換のヘテロシクロアルキル、又は置換若しくは非置換のペプチジルであり、式中、R15及びR16はそれらが結合する窒素原子と共に任意に結合して、2以上のヘテロ原子を任意に含む4〜6員の置換若しくは非置換のヘテロシクロアルキル環系を形成し；
R6は、存在又は不在のいずれかである単結合であり；
R7はCH2-X1又は-CH2-であり、但し、R6が存在する場合、R6及びR7が結合してシクロプロピル環を形成し；
かつ、X1は、脱離基、例えばCl、Br、F、メシラート又はトシラートである。
式(b)のパートナー分子は、R3、R4、R4'、R5及びR5'のうちの1つを介して、好ましくはR3（R3がOHである場合）又はR4を介して、より好ましくはR4を介して、抱合化できる。また、R3は、本明細書の以下に述べられるように、プロドラッグ化部分を保有できる。
式(b)の好ましいパートナー分子は、式(c)により表される：
Figure 0005816558
 式中、
R3、R4、R4'、R5、R5'、R6及びR7は、先に定義したとおりであり；
Zは、O、NH、又はN（低級アルキル）であり；
かつ、R1、R1'、R2及びR2'は、独立に、H、置換若しくは非置換の低級アルキル、シアノ、アルコキシ、ハロゲン、C(=O)R8、又はCO2R8であり、式中、R8は、NR9R10又はOR9であり、式中、R9及びR10は、独立に、H、置換若しくは非置換のアルキル、又は置換若しくは非置換のヘテロアルキルである。
より好ましい実施態様は、式(d)に示される：
Figure 0005816558
 式中、X1は先に定義したとおりであり、かつ、X2は以下のものである
Figure 0005816558
 。
具体的なパートナー分子Dの例は、式(e)により表される：
Figure 0005816558
 。
パートナー分子Dが細胞毒である場合、これはプロドラッグ化、すなわち、活性化させるために除去が必要とされるプロドラッグ部分をそれに結合させることができる。好ましくは、プロドラッグ基は、(1)細胞毒を抱合体から切断するためのものとは異なる反応機構によって除去され、(2)抱合体が血漿中を循環する間、除去されないか又はゆっくりとのみ除去されるが、(3)標的組織又は細胞で効率的に除去される。従って、抱合体が標的組織又は細胞に到達する前に偶発的に切断される場合、細胞毒は、その未だ不活性なプロドラッグ形態で放出され、非標的組織又は細胞に対する細胞毒性をなくすか又は低減する。すなわち、細胞毒を活性化する第2の開裂の必要性が安全係数を提供する。式（b）、(c)、(d)又は(e)による細胞毒の例において、プロドラッグ基の結合についての好ましい部位は、「4」で標識した位置にある。基Cの開裂及びプロドラッグ部分の除去の両方が酵素により媒介される安全係数を上昇させるために、異なる酵素が関与することが好ましい。
プロドラッグ基の非限定的な例には、エステル、カルバミン酸エステル、リン酸エステル、及びグリコシドを含む。具体的に説明するために、式(b)〜(e)の細胞毒における4-位ヒドロキシルは、以下のプロドラッグ部分でプロドラッグ化できる：
Figure 0005816558
 。
パートナー分子Dは、マーカーであることもできる。マーカーは、検出可能なシグナル（例えば放射ラベル、蛍光ラベル、又は基質に対し検出可能な修飾を触媒する酵素）を生成する任意のラベルであり得る。マーカー（レポーター基又は検出可能なラベルとも称される）は、イムノアッセイ、生体医学的研究、及び医科的診断の分野において周知であり、分光学的、光化学的、生化学的、免疫学的、電気的、光学的、又は化学的手段により検出できる。マーカーは、好ましくは、放射性同位元素、蛍光若しくは化学発光薬剤又はその前駆体、発色団、酵素、又はこれらの組み合わせである。適切な酵素の例は、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、及びグルコースオキシダーゼである。蛍光剤には、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどを含む。化学発光化合物には、ルシフェリン、及び2,3-ジヒドロフタラジンジオン、例えばルミノールを含む。
（リンカー -(XZ)aC(XD)b-）
上記したように、本発明の抱合体のリンカー部分は、最高3つの要素：切断可能基C、並びに任意のスペーサXZ及びXDを含む。
切断可能基Cは、抱合体が血漿の体循環にある間は比較的安定であるが、いったん該抱合体が意図された作用のその部位に到達したならば容易に切断されるように、選択される。好ましくは、抱合体は、標的細胞表面に提示される抗原に抗体Zが結合するとすぐに、標的細胞によってエンドサイトーシスによって内在化される。その後、基Cの開裂は、標的細胞の小嚢体（vesicular body）（初期エンドソーム、後期エンドソーム、又は特にリソソーム）で発生する。
一実施態様において、基Cは、pH感受性基である。血漿のpHは、中性より僅かに上であるが、リソソーム内部のpHは酸性であり、約5である。従って、開裂が酸触媒される基Cは、血漿での速度よりもリソソーム内部で数桁速い速度で開裂するであろう。適切な酸感受性基の例にはシス-アコニチルアミド及びヒドラゾンを含み、以下の文献に記載される：Shenらの文献, US 4,631,190 (1986);Shenらの文献, US 5,144,011 (1992);Shenらの文献, Biochem. Biophys.Res.Commun.102, 1048-1054 (1981)、及びYangらの文献, Proc. Natl Acad. Sci (USA), 85, 1189-1193 (1988)。当該記載は引用により本明細書に組み込まれる。
別の実施態様において、基Cは、ジスルフィドである。ジスルフィドは、周囲チオール濃度に依存する速度で、チオール-ジスルフィド交換機構により切断できる。グルタチオン及び他のチオールの細胞内濃度はそれらの血清濃度より高いので、ジスルフィドの開裂速度は細胞内でより速いであろう。更に、チオール-ジスルフィド交換の速度は、ジスルフィドの立体的及び電子的特徴の調整により調節でき（例えば、アルキル-アリールジスルフィド対アルキル-アルキルジスルフィド；アリール環の置換、その他）、これは強化された血清安定性又は具体的な開裂速度を有するジスルフィド結合の設計を可能にする。抱合体におけるジスルフィド切断可能基に関する追加的な開示については、例えば以下のものを参照されたい：Thorpeらの文献, Cancer Res. 48, 6396-6403 (1988);Santiらの文献, US 2005/0287155 A1 (2005);Ngらの文献, US 6,989,452 B2 (2006);Ngらの文献, WO 2002/096910 A1 (2002);Boydらの文献, US 2006/0024317 A1 (2006);及び、Sufiらの文献, WO 2008/083312 A2 (2008)。当該開示は引用により本明細書に組み込まれる。
好ましい基Cは、血清のプロテアーゼによるものとは対照的に、意図された反応部位でプロテアーゼにより優先的に切断されるペプチド結合を含む。典型的には、基Cは、1〜20個のアミノ酸、好ましくは1〜6個のアミノ酸、より好ましくは1〜3個のアミノ酸を含む。アミノ酸は、天然型及び／又は非天然型α-アミノ酸であり得る。天然アミノ酸は、遺伝コードによりコードされるもの、並びにそれから誘導体化されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、シトルリン、及びO-ホスホセリンである。用語アミノ酸には、アミノ酸類似体及び模倣体も含む。類似体は、R基が天然アミノ酸内に見出されるものでないことを除き、天然型アミノ酸の同じ一般的なH2N(R)CHCO2H構造を有する化合物である。類似体の例には、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、及びメチオニンメチルスルホニウムを含む。アミノ酸模倣体は、α-アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが、それと類似の様式で機能する化合物である。用語「非天然型アミノ酸」は「D」立体化学的形態を表すことを意図し、天然アミノ酸は「L」形態のものである。
好ましくは、基Cは、プロテアーゼについての開裂認識配列であるアミノ酸配列を含む。多くの開裂認識配列は、当該技術分野において公知である。例えば、Matayoshiらの文献 Science 247:954 (1990);Dunnらの文献 Meth.Enzymol.241:254 (1994);Seidahらの文献 Meth.Enzymol.244:175 (1994);Thornberryの文献, Meth.Enzymol.244:615 (1994);Weberらの文献 Meth.Enzymol.244:595 (1994);Smithらの文献 Meth.Enzymol.244:412 (1994);及び、Bouvierらの文献 Meth.Enzymol.248:614 (1995)を参照されたく、当該記載は引用により本明細書に組み込まれる。
細胞によって内在化されることを意図しない抱合体について、基Cは、それが標的組織の近傍の細胞外マトリクスに存在するプロテアーゼ（例えば、死につつある細胞により放出されるプロテアーゼ又は腫瘍関連プロテアーゼ）により切断されるように、選択できる。典型的な細胞外腫瘍関連プロテアーゼは、チメット（thimet）オリゴペプチダーゼ（TOP）及びCD10である。
細胞によって内在化されるように設計されている抱合体について、基Cは、好ましくは、エンドソーム又はリソソームプロテアーゼ（特に後者）による開裂のために選択されるアミノ酸配列を含む。当該プロテアーゼの非限定的な例は、カテプシンB、C、D、H、L及びS（特にカテプシンB）を含む。カテプシンBは、配列-AA2-AA1-で優先的にペプチドを切断し、ここでAA1は塩基性又は強く水素を結合するアミノ酸（例えばリジン、アルギニン又はシトルリン）であり、AA2は疎水性アミノ酸（例えばフェニルアラニン、バリン、アラニン、ロイシン又はイソロイシン）、例えばVal-Cit（ここでCitはシトルリンを意味する）又はVal-Lysである。（本明細書において、アミノ酸配列は、文脈が他に明示しない限り、H2N-AA2-AA1-CO2Hのように、NからC方向に記載される。）カテプシン切断可能基に関する追加的情報については、以下を参照されたい：Dubowchikらの文献, Biorg.Med.Chem. Lett.8, 3341-3346 (1998);Dubowchikらの文献, Bioorg.Med.Chem. Lett., 8 3347-3352 (1998);及び、Dubowchikらの文献, Bioconjugate Chem. 13, 855-869 (2002)。当該開示は引用により組み込まれる。
一実施態様において、基Cは、2個のアミノ酸配列-AA2-AA1-を含むペプチドであり、ここでAA1はリジン、アルギニン又はシトルリンであり、かつAA2はフェニルアラニン、バリン、アラニン、ロイシン又はイソロイシンである。別の実施態様において、Cは、
Figure 0005816558
 からなる群から選択される1〜5個のアミノ酸の配列から構成されている。
単一アミノ酸を含む切断可能基Cの調製及び設計は、2008年2月20日に出願されたChenらの文献、PCT出願番号PCT/US2008/054362において更に論述され、当該開示は引用により本明細書に組み込まれる。
基Cは、光切断可能なもの、例えば、露光で切断されるニトロベンジルエーテルであることもできる。
基Cは、抗体Z又はパートナー分子Dに直接結合できる；すなわち、スペーサXZ及びXDは、場合によっては、不存在であり得る。例えば、基Cがジスルフィドである場合、2つの硫黄のうちの1つは、抗体Z上のシステイン残基又はその代用物であり得る。又は、基Cは、炭化水素側鎖上のアルデヒドに結合されるヒドラゾンであり得る。又は、基Cは、抗体Zのリジンε-アミノ基と形成されたペプチド結合であり得る。
存在する場合、スペーサXZは、基Cと抗体Zとの間に空間的分離を提供する。これは、前者が後者による抗原結合を立体配置的に妨げないようにするためであり、又は後者が前者の開裂を立体配置的に妨げないようにするためである。更に、スペーサXZは、増加した溶解性又は減少した凝集特性を抱合体に付与するために使用できる。スペーサXZは、1以上のモジュラセグメントを含むことができ、これを任意の数の組合せでアセンブルできる。スペーサXZについての適切なセグメントの例は、以下の通りである：
Figure 0005816558
 式中、下つき添字rは、1〜24、好ましくは2〜4である。これらのセグメントを組み合わせ、例えば以下のスペーサXZを生成できる：
Figure 0005816558
 。
スペーサXDは、存在する場合、基Cとパートナー分子Dとの間に空間単離を提供する。これは、後者が立体配置的に又は電気的に前者の開裂を妨げないようにするためである。スペーサXDは、追加的な分子質量及び化学官能性を抱合体に導入するのに役立つこともできる。通常、更なる質量及び官能性は、抱合体の血清半減期及び他の特性に影響を及ぼす。従って、スペーサ基の賢明な選択により、抱合体の血清半減期を調節できる。スペーサXDは、スペーサXZの文脈で先に述べたように、モジュラセグメントから組み立てることもできる。
スペーサXZ又はXDのいずれか、又は両方は、自己犠牲部分（self-immolating moiety）を含み得る。簡潔にいうと、自己犠牲部分は、(1) 基C、及び抗体Z又はパートナー分子Dのいずれかに結合し、かつ(2) 基Cの開裂が、場合によって、それ自身を抗体Z又はパートナー分子Dから結合を切断する自己犠牲部分を結果的に生じる反応系列を開始するような構造を有する部分である。換言すれば、抗体Z又はパートナー分子D（基Cの開裂）から遠位部位での反応が、同様にXZ-Z又はXD-D結合を断裂させる。自己犠牲部分の存在はスペーサXDの場合に望ましい。これは、抱合体の開裂後、スペーサXD又はその部分がパートナー分子Dに結合したままである場合、後者の生体活性が損なわれ得るからである。切断可能基Cがポリペプチドである場合、自己犠牲部分の使用は特に好ましい。
パートナー分子D上のヒドロキシル又はアミノ基に結合される典型的な自己犠牲部分(i)〜(v)は以下に示すものである：
Figure 0005816558
 。
各例において、自己犠牲部分は、点線a及びbの間の構造であり、文脈を提供するように示されている隣接する構造的特徴を伴う。自己犠牲部分(i)及び(v)はパートナー分子D-NH2に結合するが（すなわち、パートナー分子Dは、アミノ基を介して抱合化される）、自己犠牲部分（ii）、（iii）及び（iv）はパートナー分子D-OHに結合する（すなわち、パートナー分子Dは、ヒドロキシル基を介して抱合化される）。点線bでのアミド結合の開裂（すなわち、基Cはペプチドである）は、アミン窒素としてアミド窒素を放出し、これは場合によって、点線aで結合の開裂、及びパートナー分子D-OH又はD-NH2の結果的放出を生じる反応系列を開始させる。自己犠牲部分に関する追加的な開示については、以下を参照されたい：Carlらの文献, J. Med.Chem., 24 (3), 479-480 (1981);Carlらの文献, WO 81/01145 (1981);Dubowchikらの文献, Pharmacology & Therapeutics, 83, 67-123 (1999);Firestoneらの文献, US 6,214,345 B1 (2001);Tokiらの文献, J. Org.Chem. 67, 1866-1872 (2002);Doroninaらの文献, Nature Biotechnology 21 (7), 778-784 (2003) (erratum, p. 941);Boydらの文献, WO 2005/112919 (2005);Boydらの文献, WO 2007/038658 (2007);Sufiらの文献, WO 2008/083312 A2 (2008);Fengの文献, US 7,375,078 B2 (2008)；及び、Senterらの文献, US 2003/0096743 A1 (2003)。当該開示は引用により組み込まれる。
（抱合体の例）
本発明の抗体Z(SH)m（式中、mは1、2、3、4、又は5である）によって生成される抱合体の例を以下に示す。抱合体A-1からA-6及びA-8からA-15は、切断可能基Cがペプチド結合を含む抱合体である。抱合体A-7及びA-16は、切断可能基Cがヒドラゾンである抱合体である。抱合体A-17及びA-18は、切断可能基Cがジスルフィドである抱合体である。抱合体A-1からA-2、A-5からA-9、A-11からA-14、及びA-16において、パートナー分子Dは、それに結合するプロドラッグ部分を有する細胞毒である。抱合体A-10、A-11、A-14及びA-15は、自己犠牲部分を有する抱合体である（抱合体A-10の場合、2つ）。抱合体A-1からA-8及びA-10からA-18は、モジュラセグメントを有するスペーサの使用を描写する。
Figure 0005816558
Figure 0005816558
Figure 0005816558
Figure 0005816558
Figure 0005816558
前記の式に存在する場合、HalはCl又はBrであり、R30は以下に示されるカルボキシエステラーゼ切断可能カルバミン酸エステルプロドラッグ基である：
Figure 0005816558
 。
（抱合体の調製）
本発明の抱合体は、好ましくは、最初にパートナー分子D及びリンカー(XZ)aC(XD)bを結合して部分D-(XZ)aC(XD)b-R31（式中、R31は抗体Z上の官能基と反応することに適する官能基である。）を形成し、抱合体を形成することにより調製される。適切な基R21の例には、以下を含む：
Figure 0005816558
 式中、R32は、Cl、Br、F、メシラート又はトシラートであり、かつR33は、Cl、Br、I、F、OH、-O-Nスクシンイミジル、-O-(4-ニトロフェニル）、-O-ペンタフルオロフェニル、又は-O-テトラフルオロフェニルである。適切な部分D-(XZ)aC(XD)b-R31の調製は以下に開示されている：Ngらの文献, US 7,087,600 B2 (2006);Ngらの文献, US 6,989,452 B2 (2006);Ngらの文献, US 7,129,261 B2 (2006);Ngらの文献, WO 02/096910 A1 (2002);Boydらの文献, US 2006/0024317 A1 (2006);Chenらの文献, US 2006/0004081 A1 (2006);Gangwarらの文献, US 2006/0247295 A1 (2006);Boydらの文献, WO 2007/038658 A2 (2007);Gangwarらの文献, WO 2007/051081 A1 (2007);Gangwarらの文献, WO 2007/059404 A2 (2007);Sufiらの文献, WO 2008/083312 A2 (2008);及び、2008年2月20日に出願されたChenらの文献, PCT出願番号PCT/US2008/054362。当該開示は引用により本明細書に組み込まれる。
好ましい実施態様（式M）において、R31はマレイミド基であり、抗体Z上の官能基は、抱合体A-2を使用する以下に図示するチオール基であり、式中、HalはCl及び抗体Z(SH)mである：
Figure 0005816558
以下は、遊離チオール基の抗体への、そのリジンε-アミノ基と2-イミノチオランとの反応、及びその後の薬剤-リンカー部分D-(XZ)aC(XD)b-R31（式中、R31はマレイミドである）との反応による導入に基づく手順を実例で示す。はじめに、抗体は、50mM NaCl及び2mM DTPAを含み、5〜10mg/mLまで濃縮された0.1M リン酸緩衝液（pH 8.0）に緩衝液交換される。チオール化は、抗体への2-イミノチオランの付加により達成される。付加される2-イミノチオランの量は、予備実験により決定でき、抗体により変化する。予備実験において、増加用量設定した2-イミノチオランを抗体に加え、室温で1時間、抗体とインキュベーションの後、該抗体をセファデックスG-25カラムを使用して50mM pH 6.0のHEPES緩衝液にて脱塩し、導入されるチオール基の数は、ジチオジピリジン（DTDP）との反応によって迅速に決定される。DTDPとチオール基の反応は、チオピリジンの遊離を結果的に生じ、これは分光器で324nmにてモニタできる。0.5〜1.0mg/mLのタンパク質濃度のサンプルが典型的には使用される。280nMの吸光度を使用してサンプルのタンパク質濃度を正確に決定することができ、その後、各サンプル（0.9mL）のアリコートは、室温で10分間0.1mL DTDP（エタノールの5mM 原液）とインキュベートする。緩衝液単独のブランクサンプル及びDTDPも並べてインキュベートする。10分後、324nmの吸光度が測定され、チオール基の数は19,800 M-1のチオピリジンについての吸光係数を使用して定量される。
典型的には、抗体当たりの3つのチオール基のチオール化レベルが、この手順において望ましい。例えば、いくつかの抗体については、これは、15倍モル過剰の2-イミノチオランの添加、及びその後の室温での1時間のインキュベーションにより達成できる。抗体は、それから所望のモル比で2-イミノチオランとインキュベートし、それから抱合化緩衝液（5mM グリシン及び2mM DTPAを含む50mM pH 6.0HEPES緩衝液）に脱塩する。チオール化された物質を氷上に維持しながら、導入されたチオールの数を上記の通りに定量化する。
導入されたチオールの数の検証後、薬剤-リンカー部分D-(XZ)aC(XD)b-R31は、チオール当たり3倍モル過剰で添加される。抱合反応は、終濃度5% ジメチルスルホキシド（DMSO）又は類似の代替溶媒も含む抱合化緩衝液で進めさせる。一般に、薬剤-リンカー原液は、100% DMSOに溶解させる。原液は、直接、チオール化された抗体に添加され、これは、終濃度10%にするために添加される十分なDMSOを有するか、又は終濃度10%のDMSOを含む抱合化緩衝液に前希釈され、その後、等量のチオール化された抗体に追加される。
抱合化反応混合物は、撹拌しながら2時間室温でインキュベートする。インキュベーションの後、該抱合化反応混合物を遠心単離し、0.2μmフィルタを通して濾過する。抱合体の精製は、多くの方法を使用するクロマトグラフィによって達成できる。1つの方法において、抱合体は、5mM グリシン及び50mM NaClを含む50mM pH 7.2のHEPES緩衝液で前平衡したセファクリルS200カラム上のサイズ排除クロマトグラフィを使用して精製される。クロマトグラフィは、28cm/時間の線流速で実施される。抱合体を含む画分を回収し、プールし、濃縮する。代替法において、精製は、イオン交換クロマトグラフィで達成できる。条件は抗体によって変更し、いずれの場合においても最適化されるべきである。例えば、抗体-薬剤抱合体反応混合物は、5mM グリシンを含む50mM pH 5.5 HEPESで前平衡されたSP-セファロースカラムに適用される。抗体抱合体は、pH 5.5の平衡緩衝液中0〜1MのNaCl勾配を使用して溶出される。抱合体を含む関連した画分をプールし、配合緩衝液（5mM グリシン及び100mM NaClを含む50mM pH 7.2のHEPES緩衝液）に対して透析する。
当業者は、上記の条件及び方法論が例示的かつ非限定的であり、抗体を抱合化する他のアプローチが当該技術分野において公知でありかつ本発明に使用可能であることを認識するであろう。
（ADEPT）
別の実施態様において、本発明による抗体は、抗体に指示された酵素プロドラッグ療法（ADEPT）における使用のために酵素に抱合化される。ADEPTにおいて、酵素は、それが抱合される抗体によって腫瘍部位に誘導される。そこで、該酵素は引き続いて投与されたプロドラッグに作用し、対応する活性薬剤を局所的に放出する。例えばMeltonらの文献, J. Natl Cancer Inst. 88(3/4), 153-165 (1996)を参照されたい。ADEPTにおける使用のために抱合化できる例示的な酵素には、カルボキシペプチダーゼA及びG2、アルカリホスファターゼ、β-グルクロニダーゼ、β-ラクタマーゼ、β-グルコシダーゼ、ペニシリンアミダーゼ、アミノペプチダーゼ、シトシンデアミナーゼ、及びニトロレダクターゼを含む。
ADEPTは抗体からの酵素の放出を必要としないので、抗体と酵素との間の切断可能基の存在は義務的でない。従って、ADEPT抱合体は、式(f)により表すことができる
Z-X-D (f)
式中、Zは本発明の抗体であり；Dは酵素であり、かつXはZ及びDを連結するリンカーである。
（免疫抱合体）
1以上の細胞毒を含む免疫抱合体は、「免疫毒素」と称する。
細胞毒は、当該技術分野において利用可能なリンカー技術を使用して、本発明の抗体に抱合化できる。抗体に細胞毒を抱合化するために使用されるリンカー型の例には、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィド、及びペプチド含有リンカーを含むがこれらに限定されない。リンカーは、例えば、リソソーム区画内の低いpHによって開裂されやすい、又はカテプシン（例えば、カテプシンB、C、D）などの腫瘍組織において優先的に発現されるプロテアーゼなどのプロテアーゼによって開裂されやすいものを選択できる。
（二重特異性分子）
別の態様において、本発明は、本発明の抗CADM1抗体を含む二重特異性分子又はその断片を特徴とする。本発明の抗体又はその抗原結合部分は、別の機能的分子、例えば別のペプチド又はタンパク質（例えば、受容体についての別の抗体又はリガンド）に誘導体化又は抱合化して、少なくとも2つの異なる結合部位又は標的分子に結合する二重特異性分子を生成することができる。本発明の抗体は、実際に、複数の他の機能的分子に誘導体化又は抱合化して、3以上の異なる結合部位及び／又は標的分子に結合する多特異性分子を生成することができ；当該多特異性分子は、本明細書で使用される用語「二重特異性分子」に包含されることも意図する。本発明の二重特異性分子を生成するために、本発明の抗体は、1以上の他の結合分子、例えば別の抗体、抗体断片、ペプチド又は結合模倣体に機能的に（例えば、化学共役、遺伝的融合、非共有的会合、その他により）結合でき、このようにして二重特異性分子が生じる。
したがって、本発明には、CADM1についての少なくとも1つの第1の結合特異性、及び第2の標的エピトープについての第2の結合特異性を含む、二重特異性分子を含む。本発明の特定の実施態様において、第2の標的エピトープは、Fc受容体、例えばヒトFcγRI（CD64）又はヒトFcα受容体（CD89）である。従って、本発明には、FcγR又はFcαR発現エフェクター細胞（例えば、単球、マクロファージ、又は多形核細胞（PMN））、及びCADM1を発現する標的細胞の両方に結合できる二重特異性分子を含む。これらの二重特異性分子は、CADM1発現細胞をエフェクター細胞に標的化させ、Fc受容体媒介型エフェクター細胞活性、例えばCADM1発現細胞の貪食反応、抗体依存性細胞媒介型細胞毒性（ADCC）、サイトカイン放出、又はスーパーオキシドアニオンの生成を誘発する。
二重特異性分子が多特異性である本発明の実施態様において、該分子は、抗Fc結合特異性及び抗CADM1結合特異性に加え、第3の結合特異性を更に含み得る。一実施態様において、第3の結合特異性は、抗促進因子（EF）部分、例えば、細胞毒性活性に関与する表面タンパク質に結合し、これにより標的細胞に対して免疫応答を増加させる分子である。「抗促進因子部分」は、所与の分子（例えば、抗原又は受容体）に結合して、これによりFc受容体又は標的細胞抗原への結合決定因子の効果の促進を結果的に生じる、抗体、機能的な抗体断片又はリガンドであり得る。「抗促進因子部分」は、Fc受容体又は標的細胞抗原を結合できる。選択的に、抗促進因子部分は、第１及び第２の結合特異性が結合する実体と異なる実体に結合できる。例えば、抗促進因子部分は、細胞毒性T細胞を結合できる（例えば、標的細胞に対して増加した免疫応答を結果的に生じるCD2、CD3、CD8、CD28、CD４、CD40、ICAM-1又は他の免疫細胞を介して）。
一実施態様において、本発明の二重特異性分子は、少なくとも1つの抗体又はその抗体断片を結合特異性として含み、これには例えばFab、Fab'、F(ab')2、Fv、Fd、dAb又は単鎖Fvが含まれる。抗体は、軽鎖若しくは重鎖ダイマー、又はFvなどの任意のその最小断片、又はLadnerらによる米国特許第4,946,778号（当該内容は引用により本明細書に明示的に組み込まれる）に記載されている単鎖構築物でもあり得る。
一実施態様において、Fcγ受容体に対する結合特異性は、モノクローナル抗体によって提供され、その結合はヒト免疫グロブリンG（IgG）により遮断されない。本明細書で使用される用語「IgG受容体」とは、1番染色体に位置する8つのγ-鎖遺伝子の任意のものをいう。これらの遺伝子は、合計12個の膜貫通又は可溶性受容体アイソフォームをコードし、これらは3つのFcγ受容体クラス、すなわちFcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）及びFcγRIII（CD16）に分類される。好ましい実施態様において、Fcγ受容体は、ヒト高親和性FcγRIである。ヒトFcγRIは72kDaの分子であり、これは単量体型IgG（108〜109 M-1）の高親和性を示す。
特定の好ましい抗Fcγモノクローナル抗体の生産及び特徴づけは、PCT公報WO 88/00052、及びFangerらに対する米国特許第4,954,617号に記載され、その教示は引用により本明細書に完全に組み込まれる。これらの抗体は、受容体のFcγ結合部位とは別の部位でFcγRI、FcγRII又はFcγRIIIのエピトープに結合し、それゆえ、それらの結合は、生理的レベルのIgGによって実質的には遮断されない。本発明に有用な具体的抗FcγRI抗体は、mAb 22、mAb 32、mAb 44、mAb 62及びmAb 197である。mAb 32を産生するハイブリドーマは、米国培養細胞株保存機関 （ATCCアクセッション番号HB9469）から入手可能である。他の実施態様において、抗Fcγ受容体抗体は、モノクローナル抗体22（H22）のヒト化形態である。H22抗体の生産及び特徴づけは、Graziano, R.F.らの文献 (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002、及びTempestらによるPCT公報WO 94/10332に記載されている。H22抗体産生細胞株は、HA022CL1の命名の下に米国培養細胞株保存機関に寄託され、アクセッション番号CRL 11177を有する。
さらに他の好ましい実施態様において、Fc受容体に対する結合特異性は、ヒトIgA受容体、例えば、Fc-α受容体（FcαRI（CD89））に結合する抗体によって提供され、その結合は好ましくは、ヒト免疫グロブリンA（IgA）によって遮断されない。用語「IgA受容体」は、19番染色体に位置する1つのα-遺伝子（FcαRI）の遺伝子産物を含むことを意図する。この遺伝子は、55〜110kDaのいくつかの選択的にスプライシングされた膜貫通アイソフォームをコードすることが公知である。FcαRI（CD89）は、単球/マクロファージ、好酸性顆粒球及び好中性顆粒球に構成的に発現するが、非エフェクタ細胞集団にはない。FcαRIは、IgA1及びIgA2の両方について中程度の親和性（〜5×107 M-1）を有し、これはG-CSF又はGM-CSFなどのサイトカインへの曝露で増加する（Morton, H.C.らの文献 (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440）。IgAリガンド結合ドメインの外側でFcαRIを結合するA3、A59、A62及びA77として同定される4つのFcαRI特異的モノクローナル抗体が記載されている（Monteiro, R.C.らの文献 (1992) J. Immunol. 148:1764)。
FcαRI及びFcγRIは、本発明の二重特異性分子における使用のための好ましいトリガー受容体である。これはFcαRI及びFcγRIが、(1) 主に免疫エフェクター細胞（例えば、単球、PMN、マクロファージ及び樹状細胞）で発現し；(2)高レベル（例えば、細胞当たり5,000〜100,000）で発現し；(3)細胞毒性活性（例えば、ADCC、貪食反応）のメディエータであり；かつ、（4）それらに標的化された自己抗原を含む抗原の抗原提示の促進を媒介する；からである。
ヒトモノクローナル抗体は好ましいが、本発明の二重特異性分子に利用できる他の抗体は、マウス、キメラ及びヒト化モノクローナル抗体である。
本発明の二重特異性分子は、当該技術分野において公知の方法を使用して、構成的結合特異性（例えば、抗FcR及び抗CADM1結合特異性）を抱合化することにより調製できる。例えば、二重特異性分子の各結合特異性は、別々に生成し、それから互いに抱合化できる。結合特異性がタンパク質又はペプチドである場合、様々なカップリング剤又はクロスリンカーが共有結合抱合化のために使用できる。クロスリンカーの例には、プロテインA、カルボジイミド、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオ酢酸塩（SATA）、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸) （DTNB）、o-フェニレンジマレイミド（oPDM）、N-スクシンイミジル-3-（2-ピリジルジチオ）プロピオナート（SPDP）、及びスルホスクシンイミジル4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシラート（sulfo-SMCC）を含む（Karpovskyらの文献 (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MAらの文献 (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA-82:8648を参照されたい）。他の方法は、以下に記載されるものを含む：Paulusの文献 (1985) Behring Ins.Mitt.No. 78, 118-132;Brennanらの文献 (1985) Science 229:81-83, 及びGlennieらの文献 (1987) J. Immunol.139:2367-2375。好ましい抱合化剤は、SATA及びsulfo-SMCCであり、両方ともPierce Chemical社(Rockford, IL)から入手可能である。
結合特異性が抗体である場合、それらは、該2つの重鎖のC末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合を介して抱合化できる。特に好ましい実施態様において、ヒンジ領域は、抱合化の前に、奇数の、好ましくは1つのスルフヒドリル残基を含むように修飾される。
選択的に、両方の結合特異性は、同じベクターにコードでき、同じ宿主細胞において発現及びアセンブルできる。この方法は、特に、二重特異性分子がmAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab')2又はリガンド×Fab融合タンパク質である場合に、有用である。本発明の二重特異性分子は、1つの単鎖抗体及び結合決定因子を含む単鎖分子、又は2つの結合決定因子を含む単鎖二重特異性分子であり得る。二重特異性分子は、少なくとも2つの単鎖分子を含み得る。二重特異性分子を調製する方法は、例えば以下に記載されている：米国特許5,260,203;5,455,030;4,881,175;5,132,405;5,091,513;5,476,786;5,013,653;5,258,498;及び5,482,858。これらの全ては引用により本明細書に明示的に組み込まれる。
それらの特異標的に対する二重特異性分子の結合は、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）、放射免疫測定法（RIA）、FACS分析、バイオアッセイ（例えば、成長阻害）、又はウエスタンブロットアッセイにより確認できる。これらのアッセイの各々は、一般に、具体的関心対象のタンパク質-抗体抱合体の存在を、該関心対象抱合体に対する特異的なラベル化試薬（例えば、抗体）を利用することによって、検出する。例えば、FcR-抗体抱合体は、例えば、抗体-FcR抱合体を認識し、これに特異的に結合する酵素連結抗体又は抗体断片を使用して検出できる。選択的に、該複合体は、様々な他のイムノアッセイのいずれかを使用して検出できる。例えば、抗体を放射ラベルし、放射免疫測定法（RIA）に使用できる（例えば、Weintraub, B.の文献, 「放射免疫測定法の原理（Principles of Radioimmunoassays）」, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986を参照されたく、当該記載は引用により本明細書に組み込まれる）。放射性同位元素は、γカウンタ又はシンチレーションカウンタの使用、又はオートラジオグラフィなどの手段によって検出できる。
（抗体断片及び抗体模倣体）
本発明は、従来型抗体に限定されず、抗体断片及び抗体模倣体の使用を介して実施できる。以下に詳述されるように、広範な抗体断片及び抗体模倣の技術が今日までに当該技術分野において開発されており、かつ広く知られている。ドメイン抗体、ナノボディ及びユニボディなどの多くのこれらの技術は、従来型の抗体構造の断片、又は他の修飾を使用するが、従来型の抗体結合を模倣するものの異なる機構から生成されかつ機能する結合構造を利用するアフィボディ、DARPins、アンチカリン、アビマー及びバーサボディなどの代替技術も存在する。
ドメイン抗体(dAb)は、抗体の最も小さな機能的結合単位であり、ヒト抗体の重(VH)鎖又は軽(VL)鎖のいずれかの可変領域に対応する。ドメイン抗体は、およそ13kDaの分子量を有する。Domantisは、完全ヒトVH及びVL dAbの一連の大きくかつ高度に機能的なライブラリー(各ライブラリーにおいて10,000,000,000超の異なる配列)を開発し、これらのライブラリーを治療標的に特異的なdAbを選択するために使用する。多くの従来型抗体とは対照的に、ドメイン抗体は、細菌、酵母及び哺乳動物細胞系において、十分に発現する。ドメイン抗体に関する更なる詳細及びその生産方法は、以下を参照することによって得ることができる：米国特許6,291,158;6,582,915;6,593,081;6,172,197;6,696,245;米国特許出願第2004/0110941号；欧州特許出願第1433846号、並びに欧州特許第0368684号及び第0616640号；WO05/035572、WO04/101790、WO04/081026、WO04/058821、WO04/003019及びWO03/002609。これらの各々は、引用によりその全てが本明細書に組み込まれる。
ナノボディは、天然存在型重鎖抗体の固有の構造及び機能特性を含む抗体から誘導された治療的タンパク質である。当該重鎖抗体は、1つの可変ドメイン（VHH）及び2つの定常ドメイン（CH2及びCH3）を含む。重要なことに、クローンを生成されかつ単離されたVHHドメインは、元の重鎖抗体の完全な抗原結合能を保持する完全に安定なポリペプチドである。ナノボディは、ヒト抗体のVHドメインと高い相同性を有し、活性を全く欠失することなく更にヒト化できる。重要なことに、ナノボディは、低い免疫原性潜在性を有し、これはナノボディリード化合物を用いる霊長類研究において確認された。
ナノボディは、従来型抗体の効果を、小分子薬剤の重要な特徴と組み合わせる。従来型抗体の様に、ナノボディは、高い標的特異性、その標的についての高親和性、及び低い固有の毒性を示す。しかしながら、小分子薬剤の様に、それらは、酵素を阻害し、受容体溝に容易にアクセスできる。さらにまた、ナノボディは、極めて安定であり、注入以外の手段により投与でき（例えば、引用によりその全てが本明細書に組み込まれるWO 04/041867を参照されたい）、製造するのが容易である。ナノボディの他の利点には、それらの小さなサイズの結果として一般的でない又は隠れたエピトープを認識すること、固有の三次元に起因して高親和性及び選択性でタンパク質標的の腔又は活性部位に結合すること、薬剤様式柔軟性、半減期の調整、並びに創薬の容易さ及び早さを含む。
ナノボディは単一遺伝子によりコードされ、ほとんど全ての原核生物及び真核生物宿主、例えば大腸菌（例えば、US 6,765,087（引用によりその全てが本明細書に組み込まれる）を参照されたい）、カビ（例えば、アスペルギルス又はトリコデルマ）、及び酵母（例えばサッカロマイセス、クルイヴェロマイシス、ハンゼヌラ、又はピキア）（例えば、US 6,838,254（引用によりその全てが本明細書に組み込まれる）を参照されたい）において、効率的に生産できる。生産プロセスは計測可能であり、キログラム単位量のナノボディが生産された。ナノボディは従来型抗体に比較して優れた安定性を呈するので、それらは長期間有効の既製溶液として製剤化できる。
ナノクローン法（例えば、WO 06/079372（引用によりその全てが本明細書に組み込まれる）を参照されたい）は、B細胞の自動化されたハイスルーアウト選択に基づいて、所望の標的に対してナノボディを生成する権利化された方法であり、本発明の背景において使用できる。
ユニボディは、別の抗体断片技術である；しかしながら、これは、IgG4抗体のヒンジ領域の除去に基づく。ヒンジ領域の削除は、従来型のIgG4抗体の基本的に半分のサイズであり、かつIgG4抗体の二価結合領域よりもむしろ一価結合領域を有する分子を生じる。また、IgG4抗体が不活性であり、それゆえ免疫系と相互反応しないことは周知であり、これは免疫応答が望ましくない疾患の治療のために有利であり得、この効果がユニボディに受け渡される。例えば、ユニボディは、それらが結合した細胞を阻害又は抑制するが殺さないように機能し得る。さらに、癌細胞に結合するユニボディは、それらが増殖することを促進しない。さらに、ユニボディは従来型のIgG4抗体の約半分のサイズであるので、それらは潜在的に有利な有効性でより大きな固形腫瘍により良好な分布を示すことができる。ユニボディは全IgG4抗体と、同程度の速度で該本体からクリアされ、全抗体と同程度の親和性でそれらの抗原に結合できる。ユニボディの更なる詳細は、特許WO2007/059782（これは引用によりその全てが本明細書に組み込まれる）を参照することで得ることができる。
アフィボディ分子は、ブドウ球菌プロテインAのIgG結合ドメインの1つに由来する58アミノ酸残基のタンパク質ドメインに基づく親和性タンパク質の新規なクラスを表す。この3つのヘリックス束ドメインは、コンビナトリアルファージミドライブラリの構築物についての足場として使用され、そこから、所望の分子を標的化するアフィボディ異型は、ファージディスプレイ技術を使用して選択できる、（Nord K, Gunneriusson E, Ringdahl J, Stahl S, Uhlen M, Nygren PAの文献, 「αヘリカル細菌受容体ドメインのコンビナトリアルライブラリから選択された結合タンパク質（Binding proteins selected from combinatorial libraries of an α-helical bacterial receptor domain）」, Nat Biotechnol 1997;15:772-7；Ronmark J, Gronlund H, Uhlen M, Nygren PAの文献, 「プロテインAのコンビナトリアルエンジニアリング由来のヒト免疫グロブリン A-(IgA)-特異リガンド（Human immunoglobulin A-(IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A）」, Eur J Biochem 2002;269:2647-55）。低分子量(6kDa)と相俟ってアフィボディー分子の単純な強い構造は、広範な用途、例えば、検出試薬として（Ronmark J, Hansson M, Nguyen Tらの文献, 「大腸菌で産生されたアフィボディ-Fcキメラの構築及び特徴づけ（Construction and characterization of Affibody-Fc chimeras produced in Escherichia coli）」, J Immunol Methods 2002;261:199-211）、及び受容体相互作用を阻害すること（Sandstorm K, Xu Z, Forsberg G, Nygren PAの文献, 「コンビナトリアルタンパク質工学により開発されたCD28-結合アフィボディリガンドによるCD28-CD80共刺激シグナルの阻害（Inhibition of the CD28-CD80 co-stimulation signal by a CD28-binding Affibody ligand developed by combinatorial protein engineering）」, Protein Eng 2003;16:691-7）にそれらを適切化させる。アフィボディーの更なる詳細及びその生産方法は、引用によりその全てが本明細書に組み込まれる米国特許第5831012号を参照することによって得ることができる。
ラベル化アフィボディは、アイソフォームの富化を決定するためのイメージング用途に有用でもあり得る。
DARPin（設計されたアンキリンリピートタンパク質）は、非抗体ポリペプチドの結合能力を活用するために開発された抗体模倣DRP（設計されたリピートタンパク質）技術の1つの例である。アンキリン又はロイシンリッチリピートタンパク質などのリピートタンパク質は、遍在性の結合分子であって、抗体とは異なり、細胞内外において発生する。これらの固有のモジュラ構造は、構造単位を繰り返すこと（リピート）を特徴とし、これらは一緒に積み重なり、可変かつモジュラ標的結合表面を示す細長いリピートドメインを形成する。このモジュラリティに基づいて、高度に多様化された結合特異性を有するポリペプチドのコンビナトリアルライブラリを生成できる。この戦略には、可変的表面残基及びリピートドメインへのこれらのランダムなアセンブリを示す自家和合性リピートのコンセンサス設計を含む。
DARPinは非常な高収率で細菌性発現系において生成でき、それらは公知の最も安定タンパク質に属する。ヒト受容体、サイトカイン、キナーゼ、ヒトプロテアーゼ、ウイルス、及び膜タンパク質を含む幅広い範囲の標的タンパク質に対し高度に特異的な高親和性DARPinが選択された。一桁ナノモル〜ピコモル濃度範囲のアフィニティを有するDARPinを得ることができる。
DARPinは、ELISA、サンドイッチELISA、フローサイトメトリー解析（FACS）、免疫組織化学（IHC）、チップ適用、親和性精製、又はウエスタンブロッティングを含む、広範な用途に使用されている。DARPinは、例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP）に融合された細胞内マーカータンパク質として、細胞内区画において高度に活性であることも判明した。DARPinは、pM範囲のIC50でウイルス侵入を阻害するために更に使用された。DARPinは、タンパク質-タンパク相互作用を遮断するのに理想的であるのみならず、酵素も阻害する。プロテアーゼ、キナーゼ、及び輸送体はうまく阻害され、多くの場合、アロステリック阻害様式であった。腫瘍及び非常に活発な腫瘍対血液の比における非常に速くかつ特異的な富化は、DARPinをインビボ診断法又は治療アプローチによく適合化させる。
DARPin及び他のDRP技術に関する追加的情報は、米国特許出願公開番号第2004/0132028号及び国際特許出願公開番号WO 02/20565に見出すことができ、その両方は引用によりその全てが本明細書に組み込まれる。
アンチカリンは、さらなる抗体模倣の技術である。しかしながら、この場合においては、結合特異性は、ヒト組織及び体液において自然にかつ豊富に発現される低分子量タンパク質のファミリーであるリポカリンに由来する。リポカリンは、化学的感受性又は不溶性化合物の生理的輸送及び貯蔵にインビボで関連する機能の範囲を実施するために進化した。リポカリンは、タンパク質の一方の末端で4つのループを支持する高度に保存されたβ-バレルを含む、堅固な固有の構造を有する。これらのループは結合ポケットへの入口を形成し、該分子のこの部分における立体構造的差異は、個々のリポカリン間の結合特異性における変動を説明する。
超可変ループの全体構造は、保存されたβ-シートによって支持されているが、フレームワークは、免疫グロブリン、すなわちサイズに関して抗体とはかなり異なり、単一の免疫グロブリンドメインよりわずかに大きい160〜180個のアミノ酸の単一ポリペプチド鎖から構成されるリポカリンを暗示する。
リポカリンはクローン化され、これらのループは、アンチカリンを生成するように遺伝子操作に供される。構造的に多様なアンチカリンのライブラリが生成され、アンチカリンディスプレイは、結合機能の選択及びスクリーニング、及びそれに続く原核生物又は真核生物系における更なる解析のための可溶タンパク質の発現及び生産を可能にする。研究は、実質的に任意のヒト標的タンパク質に特異的であるアンチカリンを開発でき、単離でき、ナノモル以上の範囲の結合親和性を得ることができることを成功裏に実証した。
アンチカリンは、二重標的化タンパク質（いわゆるデュオカリン）として形式化することもできる。デュオカリンは、標準的な製造プロセスを使用して1つの容易に生成されるモノマー性タンパク質において2つの別々の治療標的を結合すると共に、その2つの結合ドメインの構造的方向性に関わらずに標的特異性及び親和性を保持する。
単一分子を介する複数標的の変調は、単一の原因因子より多くのものが関与することが知られている疾患において特に利点がある。さらに、デュオカリンなどの二価又は多価の結合様式は、疾患の細胞表面分子の標的化、シグナル伝達経路におけるアゴニスト効果の媒介、又は細胞表面受容体の結合及びクラスタリングを介して促進された内在化効果の誘導に顕著な潜在能を有する。さらにまた、デュオカリンの高い固有の安定性は、モノマー性アンチカリンと同等であり、柔軟な剤形及びデュオカリンに対する送達可能性を提供する。
アンチカリンに関する追加的情報は、米国特許第7,250,297号及び国際特許出願公開番号WO 99/16873に見出すことができ、その両方は引用によりその全てが本明細書に組み込まれる。
本発明の背景において有用な別の抗体模倣技術は、アビマーである。アビマーは、インビトロエクソンシャフリング及びファージディスプレイによってヒト細胞外受容体ドメインの大きなファミリーから進化し、結合及び阻害特性を有する多ドメインタンパク質を生成する。複数の独立する結合ドメインを連結することは、親和性を生成することが示されており、従来型の単一エピトープ結合タンパク質に比較して改善された親和性及び特異性を生じる。他の可能的利点には、大腸菌における複数標的特異的分子の簡便かつ効率的な生産を含み、これは耐熱性及びプロテアーゼに対する抵抗性が改良されている。ナノモル以下の親和性を有するアビマーが様々な標的に対して得られている。
アビマーに関する追加的情報は、特許出願公開番号2006/0286603、2006/0234299、2006/0223114、2006/0177831、2006/0008844、2005/0221384、2005/0164301、2005/0089932、2005/0053973、2005/0048512、2004/0175756に見出すことができ、これらの全ては引用によりその全てが本明細書に組み込まれる。
バーサボディは、本発明の背景において利用できる別の抗体模倣技術である。バーサボディは、15%超のシステインを有する3〜5kDaの小さなタンパク質であり、これは高いジスルフィド密度足場を形成し、典型的なタンパク質が有する疎水性コアを置換する。疎水性コアを含む多数の疎水性アミノ酸の置換は、少数のジスルフィドによる、より小さく、より親水性で（より少ない凝集及び非特異的結合）、プロテアーゼ及び熱に対するより高い耐性、及びT細胞エピトープの低密度を有するタンパク質を生じる。これは、MHC提示に最も貢献する残基は疎水性であるからである。これらの特性のうちの4つ全ては、免疫原性に効果を及ぼすことが周知であり、共にそれらは、免疫原性の大きな減少を引き起こすと予測される。
バーサボディについてのインスピレーションは、ヒル、ヘビ、クモ、サソリ、カタツムリ及びアネモネによって産生される天然の注射可能なバイオ医薬品から来ており、これは予想外に低い免疫原性を呈することが公知である。サイズ、疎水性、タンパク分解性抗原プロセシング、及びエピトープ密度を改変し、スクリーニングすることにより選択された天然型タンパク質ファミリーから開始することは、天然の注射可能なタンパク質の平均をはるかに下回るレベルに最小化させる。
バーサボディの構造を与えられた場合、これらの抗体模倣体は、多価性、多特異性、半減期メカニズムの多様性、組織標的化モジュール、及び抗体Fc領域の欠如を含む、多用途的様式を提供する。さらにまた、バーサボディは、高収率で大腸菌において生産され、その親水性及び小型のため、バーサボディは高度に可溶性であり、高濃度に製剤化できる。バーサボディは非常に熱安定であり（煮沸可能）、有効期間の延長を提供する。
バーサボディに関する追加的情報は、米国特許出願公開番号第2007/0191272号（引用によりその全てが本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。
先に提供した抗体断片及び抗体模倣技術の詳細な説明は、本願明細書の文脈において使用できる全ての技術の総合的なリストであることを意図しない。例えば、かつ制限のためでなく、Quiらの文献, Nature Biotechnology, 25(8) 921-929 (2007)（引用によりその全てが本明細書に組み込まれる）に概説されているような相補決定領域の融合などの選択的ポリペプチドに基づく技術、並びに米国特許5,789,157、5,864,026、5,712,375、5,763,566、6,013,443、6,376,474、6,613,526、6,114,120、6,261,774及び6,387,620（これらの全ては引用により本明細書に組み込まれる）に記載されるRNAアプタマー技術などの核酸に基づく技術を含む様々な更なる技術が、本発明の背景において利用できる。
（医薬組成物）
別の態様において、本発明は、組成物、例えば本発明のモノクローナル抗体若しくはその抗原結合部分の1つ又は組合せを含み、医薬として許容し得る担体と共に製剤化される医薬組成物を提供する。当該組成物は、本発明の抗体の1つ又は（例えば、2以上の異なる）組合せ、又は免疫抱合体又は二重特異性分子を含み得る。例えば、本発明の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合する、又は相補活性を有する抗体（又は免疫抱合体又は二重特異性）の組合せを含み得る。
本発明の医薬組成物は、併用療法、すなわち他の薬剤と組み合わせても投与できる。例えば、併用療法には、少なくとも1つの他の抗炎症剤又は免疫抑制剤と組み合わせて本発明の抗CADM1抗体を含み得る。併用療法に使用できる治療剤の例は、本発明の抗体の使用に係る以下の節において更に詳細に記載される。
本明細書で使用される「医薬として許容し得る担体」には、任意の及び全ての溶媒、分散媒、被覆剤、抗細菌剤及び抗菌剤、等張吸収遅延剤、及び生理的に適合性のその他のものを含む。好ましくは、担体は、静脈投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、又は表皮投与（例えば、注射又は注入によって）に適する。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち抗体、免疫抱合体又は二重特異性分子は、化合物を酸の作用、及び化合物を不活性化し得る他の自然条件から保護する物質で被覆することができる。
本発明の医薬化合物は、1以上の医薬として許容し得る塩を含み得る。「医薬として許容し得る塩」とは、親化合物の所望の生体活性を保持し、かつ任意の望ましくない毒物学的効果を与えない塩をいう（例えば、Berge, S.M.らの文献 (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19を参照されたい）。当該塩の例には、酸付加塩及び塩基付加塩を含む。酸付加塩には、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの無毒性無機酸由来のもの、並びに脂肪族のモノ及びジカルボン酸、フェニル基置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族及び芳香族スルホン酸などの非毒性有機酸由来のものを含む。塩基付加塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属に由来するもの、並びにN,N'-ジベンジルエチレンジアミン、N-メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの無毒性有機アミンに由来するものを含む。
本発明の医薬組成物には、医薬として許容し得る抗酸化剤も含み得る。医薬として許容し得る抗酸化剤の例には、以下のものを含む： (1)水溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど； (2)油溶性抗酸化剤、例えばアスコルビルパルミテート、ブチルヒドロキシアニソール（BHA）、ブチルヒドロキシトルエン（BHT）、レシチン、没食子酸プロピル、α-トコフェロールなど；及び、(3)金属キレート化剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ソルビトール、酒石酸、リン酸など。
本発明の医薬組成物に利用できる適切な水性及び非水性の担体の例には、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）及び適切なこれらの混合物、オリーブ油などの植物性油、並びにオレイン酸エチルなどの注射可能有機エステルを含む。適当な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆物質の使用により、分散剤の場合に要求される粒径の維持により、及び界面活性剤の使用により、維持できる。
これらの組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などの助剤を含むこともできる。微生物の存在の予防は、上記滅菌手順によって、並びに様々な抗細菌剤及び抗菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸など）の包含によっての両方で、確保できる。また、糖、塩化ナトリウム及びその他同類のものなどの等張剤を組成物に含ませることが望ましい場合がある。加えて、注射可能な医薬形態の長期吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤の包含によってもたらし得る。
医薬として許容し得る担体には、無菌の水溶液又は分散剤、及び無菌の注射可能溶液又は分散剤の即時調製物についての滅菌粉を含む。医薬として活性な物質についての当該媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野において公知である。任意の従来型媒体又は薬剤が活性化合物と適合しない場合を除き、本発明の医薬組成物におけるその使用は包含される。補助活性化合物を組成物に組み込むこともできる。
治療組成物は、典型的には、製造及び貯蔵条件下において無菌かつ安定でなければならない。組成物は、高薬剤濃度に適する溶液、ミクロエマルジョン、リポソーム又は他の秩序構造体として製剤化できる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）及び適切なこれらの混合物を含む溶媒又は分散剤であり得る。適当な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆剤の使用により、分散剤の場合において要求される粒径の維持により、及び界面活性剤の使用により、維持できる。多くの場合において、組成物に等張剤、例えば糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチン）を組成物に含ませることによってもたらし得る。
無菌の注射可能な溶液は、必要に応じて、先に列挙した成分の1つ又は組合せと共に必要量の活性化合物を適切な溶媒に組込んだ後、滅菌精密濾過により調製できる。通常、分散剤は、基本的な分散媒、及び先に列挙したものからの要求される他の成分を含む無菌ビヒクルに活性化合物を組み込むことにより調製される。無菌の注射可能な溶液の調製について、無菌粉の場合、好ましい調製法は、減圧乾燥及び凍結乾燥法（凍結乾燥）であり、これらは予め無菌濾過した溶液から活性成分及び任意の追加の所望の成分の粉を産生する。
単一剤形を生成するために担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は、処理される対象及び具体的な投与様式によって変化する。単一剤形を生成するために担体物質を組み合わせることができる活性成分の量は、通常、治療効果をもたらす組成物のその量である。通常、100％のうち、この量は、医薬として許容し得る担体との組み合わせで、活性成分の約0.01％から約99％、好ましくは約0.1％から約70％、最も好ましくは活性成分の約1％から約30％の範囲である。
投与計画は、最適な所望の反応（例えば、治療反応）を提供するように調整する。例えば、単一ボーラスを投与でき、いくつかの分割用量が時間にわたって投与でき、又は治療的な状況の緊急性により示されるのに比例して低減でき又は増加できる。投与の容易さ及び投与量の均一性についての用量単位形態で非経口組成物を製剤化することは、特に有利である。本明細書で使用される用量単位形態とは、処理される対象についての単位投与量として適切な物理的に別の単位をいい；各単位は、要求される医薬担体に関連して所望の治療効果を生成するために算出される活性化合物の予め定められた量を含む。本発明の用量単位形態について、本明細書は、(a) 活性化合物固有の特性、及び達成すべき特定の治療効果、並びに（b）個人における感受性の治療について当該活性化合物を合成する当該技術分野に固有の制限によって記載され、これらに直接的に依存する。
抗体の投与について、投与量は、宿主体重の約0.0001から100mg/kg及びより一般的には0.01〜5mg/kgにわたる。例えば、投与量は、0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重若しくは10mg/kg体重、又は1〜10mg/kgの範囲内であり得る。例示的な治療計画は、週1回、2週ごとに1回、3週ごとに1回、4週ごとに1回、月1回、3ヵ月ごとに1回、又は3〜6ヵ月ごとに1回、投与を伴う。本発明の抗CADM1抗体についての好ましい投与計画には、以下の投与スケジュールの1つを使用して与えられる抗体を用いる静脈内投与を介する1mg/kg体重又は3mg/kg体重を含む： (i) 6回の投与につき4週ごと、その後3ヵ月ごと； (ii)3週ごと； (iii) いったん3mg/kg体重、その後3週ごとに1mg/kg体重。
いくつかの方法において、異なる結合特異性を有する2以上のモノクローナル抗体は同時に投与され、その場合において、投与される各抗体の用量は示される範囲内にある。抗体は、通常、複数回投与される。単一投与の間隔は、例えば、週ごと、月ごと、3ヵ月ごと又は年ごとであり得る。また、間隔は、患者の標的抗原に対する抗体の測定血中濃度を測定することにより示されるように、不規則であり得る。いくつかの方法において、投与量は、約1〜1000μg/ml 、及びいくつかの方法においては約25〜300μg/mlの血漿抗体濃度を達成するように調整される。
選択的に、抗体は、徐放製剤として投与でき、その場合において、比較的頻度の低い投与が要求される。投与量及び頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変更する。一般に、ヒト抗体は、最も長い半減期を示し、以下、ヒト化抗体、キメラ抗体、及び非ヒト抗体が続く。投与の用量及び頻度は、治療が予防的か治療的かに依存して変更できる。予防用途において、比較的低い用量が、長期に渡り、比較的まれな間隔で投与される。一部の患者は、残りの生涯にわたって治療を受け続ける。治療用途において、比較的短い間隔における比較的高い用量はしばしば、疾患の進行が低減又は終結するまで、及び好ましくは患者が疾患の症状の部分的又は完全な寛解を示すまで、要求される。その後、患者は、予防投与計画を受けることができる。
本発明の医薬組成物における活性成分の実際の用量レベルは、患者に有毒であることなく、具体的な患者、組成物及び投与様式について所望の治療反応を達成するのに効果的である活性成分の量を得るように変更できる。選択される用量レベルは、利用される本発明の具体的組成物又はそのエステル、塩又はそのアミドの活性、投与経路、投与時間、利用される具体的化合物の排出の速度、治療期間、利用される具体的組成物との組み合わせで使用される他の薬剤、化合物及び／又は物質、年齢、性別、体重、状態、全般的健康状態、及び治療される患者の病歴、及び医療業界で周知の同様の因子を含む、様々な薬物動態因子に依存するであろう。
本発明の抗CADM1抗体の「治療的に有効な用量」は、好ましくは、病徴の重篤度の減少、病徴がない期間の頻度及び期間の増加、又は疾患苦痛による機能障害又は身体障害の予防を生じる。例えば、CADM1+腫瘍の治療について、「治療的に有効な用量」は、好ましくは、無治療対象に比較して、少なくとも約20%、より好ましくは少なくとも約40%、さらにより好ましくは少なくとも約60%、及びさらにより好ましくは少なくとも約80%、細胞増殖又は腫瘍増殖を阻害する。腫瘍増殖を阻害する化合物の能力は、ヒト腫瘍における有効性が予測される動物のモデル系で評価できる。選択的に、組成物のこの特性は、細胞増殖を阻害する化合物の能力を検討することにより評価でき、当該阻害はインビトロで当業者に公知のアッセイで測定できる。治療化合物の治療上有効量は、腫瘍サイズを減少させることができ、又は対象の症状を寛解させることができる。当業者は、対象のサイズ、対象の症状の重篤度、及び具体的組成物又は選択される投与経路などの因子に基づいて当該量を決定できる。
本発明の組成物は、当該技術分野において公知の様々な方法の1以上を使用し、1以上の投与経路を介して投与できる。当業者に認識されるように、投与経路又は様式は、所望の結果によって変化する。本発明の抗体についての投与の好ましい経路には、例えば注射又は注入による投与の静脈経路、筋肉内経路、皮内経路、腹腔内経路、皮下経路、脊髄経路、又は他の非経口経路を含む。本明細書で使用される句「非経口投与」は、通常は注射による腸内投与及び局所投与以外の投与様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊椎内、硬膜外及び胸骨内の注射及び注入がを含むがこれらに限定されない。
選択的に、本発明の抗体は、例えば、鼻腔内的に、経口的に、経膣的に、直腸的に、舌下的に又は局所的に、局所投与、表皮性投与又は粘膜投与経路などの非非経口（non-parenteral）経路を介して投与できる。
活性化合物は、迅速な放出から該化合物を保護する担体とともに調製でき、それは例えば放出制御製剤であり、インプラント、経皮パッチ及びマイクロカプセル化された送達系が含まれる。生体分解可能な生体適合性のポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸が使用できる。当該製剤の調製についての多くの方法が特許権を得、又は一般に当業者に公知である。例えば、「徐放及び制御放出薬剤送達系（Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems）」, J.R. Robinson編, Marcel Dekker社, New York, 1978を参照されたい。
治療組成物は、当該技術分野において公知の医療器具を用いて投与できる。例えば、好ましい実施態様において、本発明の治療組成物は、針のない皮下注射装置で投与でき、例えば当該装置は以下に開示されている：米国特許5,399,163;5,383,851;5,312,335;5,064,413;4,941,880;4,790,824;又は4,596,556。本発明において有用な周知のインプラント及びモジュールの例には、以下のものを含む：米国特許第4,487,603号（制御速度で薬物を分注するための移植可能マイクロ注入ポンプを記載する）；米国特許第4,486,194号（皮膚を介して薬剤を投与するための治療装置を記載する）；米国特許第4,447,233号（正確な注入速度で薬剤を送達するための薬剤注入ポンプを記載する）；米国特許第4,447,224号（連続薬剤送達についての可変流（variable flow）移植可能注入装置を記載する）；米国特許第4,439,196号（多室区画を有する浸透圧薬剤送達系を記載する）；及び、米国特許第4,475,196号（浸透圧薬剤送達系を記載する）。これらの特許は、引用により本明細書に組み込まれる。多くの他のこのようなインプラント、送達系、及びモジュールが、当業者に公知である。
ある種の実施態様において、本発明のヒトモノクローナル抗体は、インビボで適切な分布を保証するように調製できる。例えば、脳血液関門（BBB）は、多くの高度に親水性な化合物を排除する。本発明の治療化合物がBBB（必要に応じて）を通ることを保証するために、それらは、例えば、リポソームに製剤化できる。リポソームを製造する方法については、例えば、米国特許4,522,811；5,374,548；及び5,399,331を参照されたい。リポソームは、特定の細胞又は器官に選択的に輸送され、それゆえ標的化薬剤送達を促進する1以上の部分を含み得る（例えばV.V. Ranadeの文献 (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685を参照されたい)。典型的な標的化部分には以下のものを含む：葉酸又はビオチン（例えば、Lowらに対する米国特許5,416,016を参照されたい）；マンノシド（Umezawaらの文献, (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038)；抗体（P.G. Bloemanらの文献 (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owaisらの文献 (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180)；界面活性剤プロテインA受容体（Briscoeらの文献 (1995) Am. J. Physiol. 1233:134)；p120（Schreierらの文献 (1994) J. Biol. Chem. 269:9090）；K. Keinanen; M.L. Laukkanenの文献 (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidlerの文献 (1994) Immunomethods 4:273も参照されたい。
（使用及び方法）
本発明の抗体、特にヒト抗体、抗体組成物及び方法は、CADM1媒介型障害の診断及び治療を含む、多数のインビトロ及びインビボでの診断的及び治療的有用性を有する。例えば、これらの分子は、インビトロで若しくはエクスビボで培養細胞に投与でき、又は例えばインビボでヒト対象に投与して様々な障害を治療し、予防し及び診断することができる。本明細書で使用される用語「対象」は、ヒト及び非ヒト動物を含むことを意図する。非ヒト動物には、全ての脊椎動物、例えば哺乳動物及び非哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、及び爬虫類を含む。好ましい対象には、CADM1活性により媒介される障害を有するヒト患者を含む。方法は、特に、異所性CADM1発現に関連する障害を有するヒト患者を治療することに適する。CADM1に対する抗体が別の薬剤と共に投与される場合、当該2つの剤は、順次又は同時にのいすれかで投与できる。
CADM1に対する本発明の抗体の特異的結合を与えられた場合、本発明の抗体を使用して細胞表面上のCADM1発現を特異的に検出することができ、さらにこれを使用してイムノアフィニティー精製を介してCADM1を精製することができる。
さらに、様々な腫瘍細胞においてCADM1の発現が与えられた場合、本発明のヒト抗体、抗体組成物及び方法を使用して、腫瘍形成性障害、例えば、CADM1を発現する腫瘍細胞の存在により特徴づけられた障害（例えば、小細胞肺癌、成人T細胞白血病、肺、副腎、下垂体、胃腸管、腎臓、肝臓（肝細胞癌を含む）、膵臓（インスリノーマ及びグルカゴノーマを含む）、グリア芽細胞腫のものを含む神経内分泌癌、及び膵臓、肺、胃腸管、肝臓又は腎臓のものを含むカルチノイド腫瘍を含む）を有する対象を治療できる。
一実施態様において、本発明の抗体（例えば、ヒトモノクローナル抗体、多特異性及び二重特異性分子及び組成物）を使用して、CADM1のレベル又はその膜表面上にCADM1を含む細胞におけるレベルを検出することができ、そのレベルはそれから具体的病徴に関連付けることができる。選択的に、抗体を使用してCADM1機能を阻害又は遮断でき、これを順次、特定の病徴の予防又は寛解と関連づけることができ、これにより疾患のメディエータとしてCADM1が関連付けられる。これは、抗体とCADM1の間に複合体の形成を可能にする条件下で、サンプル及びコントロールサンプルを抗CADM1抗体と接触させることにより達成できる。抗体とCADM1の間に形成される任意の複合体は、サンプル及びコントロールにおいて検出され、比較される。
別の実施態様において、本発明の抗体（例えば、ヒト抗体、多特異性及び二重特異性分子及び組成物）は、はじめにインビトロで治療的又は診断使用に関連する結合活性について試験できる。例えば、本発明の組成物は、以下の実施例に記載されるフローサイトメトリーアッセイを使用して試験できる。
本発明の抗体（例えば、ヒト抗体、多特異性及び二重特異性分子、免疫抱合体及び組成物）は、CADM1関連疾患の療法及び診断においてさらなる有用性を有する。例えば、ヒトモノクローナル抗体、多特異性又は二重特異性分子及び免疫抱合体を使用して、以下の生体活性の1以上をインビボ又はインビトロで誘発できる：CADM1を発現する細胞の増殖を阻害し及び／又は殺すこと；ヒトエフェクター細胞の存在下でCADM1を発現する細胞の貪食反応又はADCCを媒介すること、又はCADM1に結合するCADM1リガンドを遮断すること。
具体的実施態様において、抗体（例えば、ヒト抗体、多特異性及び二重特異性分子及び組成物）は、インビボで、様々なCADM1関連の疾患を治療し、予防し、又は診断するために使用される。CADM1関連疾患の例には、とりわけ、小細胞肺癌、神経内分泌性膵臓癌、肝癌、肺カルチノイド、及び胃腸カルチノイドを表すヒト癌組織を含む。
インビボ及びインビトロで本発明の抗体組成物（例えば、ヒトモノクローナル抗体、多特異性及び二重特異性分子並びに免疫抱合体）を投与する適切な経路は、当該技術分野において公知であり、当業者により選択できる。例えば、抗体組成物は、注射（例えば、静脈又は皮下）により投与できる。使用する分子の適切な用量は、対象の年齢及び体重並びに抗体組成物の濃度及び／又は製剤に依存する。
前記したように、本発明のヒト抗CADM1抗体は、1又は他のより多くの治療剤（例えば、細胞毒性薬剤、放射性毒性薬剤又は免疫抑制剤）とともに共投与できる。抗体は、薬剤に（免疫複合体として）連結でき、又は薬剤とは別に投与できる。後者（別投与）の場合、抗体は、薬剤の前に、後に若しくは同時に投与でき、又は他の公知の療法、例えば抗癌療法、例えば放射線とともに共投与できる。当該治療剤には、とりわけ、抗腫瘍薬、例えばドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン硫酸ブレオマイシン、カルマスチン、クロラムブシル、及びシクロホスファミドヒドロキシウレアを含み、これらは単独では、患者に有毒性又は準毒性であるレベルでのみ有効である。シスプラチンは4週ごとに1回、100mg/kg用量として静注投与され、アドリアマイシンは21日ごとに1回、60〜75mg/ml用量として静注投与される。本発明のヒト抗CADM1抗体又はその抗原結合断片と化学療法剤との共投与は、ヒト腫瘍細胞に細胞毒性効果を与える異なる機構を介して作用する2つの抗癌剤を提供する。当該共投与は、薬剤耐性の進行に起因する課題、又は抗体によって不活性にされる腫瘍細胞の抗原性における変化を解決できる。
本発明の標的特異的エフェクター細胞、例えば組成物（例えば、ヒト抗体、多特異性及び二重特異性分子）に連結されたエフェクター細胞も治療剤として使用できる。標的化のためのエフェクター細胞は、マクロファージ、好中球又は単球などのヒト白血球であり得る。他の細胞には、好酸球、NK細胞、及び他のIgG-又はIgA-受容体担持細胞を含む。必要に応じて、エフェクター細胞は、治療される対象から得ることができる。標的特異的エフェクター細胞は、生理的に許容し得る溶液における細胞懸濁液として投与できる。投与される細胞数は、108〜109のオーダーであり得るが、治療的な目的に応じて変化する。一般に、量は、標的細胞（例えば、CADM1を発現する腫瘍細胞）において局在化を得ること、及び例えば貪食反応による細胞殺害に効果を及ぼすのに十分である。投与経路は、変更することもできる。
標的特異的エフェクター細胞を用いる療法は、標的細胞の除去のための他の技術と組み合わせて実施できる。例えば、本発明の組成物（例えば、ヒト抗体、多特異性及び二重特異性分子）を使用する抗腫瘍療法、及び／又はこれらの組成物を備えたエフェクター細胞は、化学療法と組み合わせて使用できる。さらに、組合せ免疫治療を使用して、腫瘍細胞拒絶に2つの異なる細胞毒性エフェクタ集団を向けることができる。例えば、抗-Fc-γRI又は抗CD3に連結された抗CADM1抗体は、IgG-又はIgA-受容体特異的結合剤と組み合わせて使用できる。
本発明の二重特異性及び多特異性分子を使用して、例えば細胞表面上の受容体のキャップ形成及び除去によって、エフェクター細胞上のFcγR又はFcγRレベルを調節することもできる。抗Fc受容体の混合物は、この目的のためにも使用できる。
また、補体を結合するIgG1、-2若しくは-3又はIgM由来の部分などの補体結合部位を有する本発明の組成物（例えば、ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体、多特異性及び二重特異性分子並びに免疫抱合体）は、補体存在下で使用できる。一実施態様において、本発明の結合剤を用いる標的細胞及び適切なエフェクター細胞を含む細胞集団のエクスビボ治療は、補体又は補体を含む血清の添加によって補足できる。本発明の結合剤で被覆された標的細胞の貪食反応は、補体タンパク質の結合により改善できる。別の実施態様において、本発明の組成物（例えば、ヒト抗体、多特異性及び二重特異性分子）で被覆した標的細胞は、補体によっても溶解できる。さらに別の実施態様において、本発明の組成物は、補体を活性化させない。
本発明の組成物（例えば、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体、多特異性及び二重特異性分子並びに免疫抱合体）は、補体と共にも投与できる。ある種の実施態様において、本開示は、ヒト抗体、多特異性又は二重特異性分子及び血清又は補体を含む組成物を提供する。これらの組成物は、補体がヒト抗体、多特異性又は二重特異性分子に密接に近接して位置する場合、有利であり得る。選択的に、本発明のヒト抗体、多特異性又は二重特異性分子及び補体又は血清は、別に投与できる。
本発明の抗体組成物（例えば、ヒト抗体、二重特異性又は多特異性分子、又は免疫抱合体）及び使用についての指示を含むキットも本発明の範囲内にある。該キットは、1以上の追加的な試薬、例えば免疫抑制試薬、細胞毒性薬剤又は放射性毒性薬剤、又は1以上の追加的な本発明のヒト抗体（例えば、第1のヒト抗体とは別のCADM1抗原のエピトープに結合する相補活性を有するヒト抗体）を更に含み得る。
したがって、本発明の抗体組成物により治療される患者は、ヒト抗体の治療効果を促進又は強化する細胞毒性薬剤又は放射性毒性薬剤などの別の治療剤をさらに（本発明のヒト抗体の投与の前、同時に、又は後に）投与できる。
他の実施態様において、対象は、例えば、対象をサイトカインで治療することによるFcγ又はFcγ受容体の発現又は活性を調節する（例えば、促進する又は阻害する）薬剤でさらに治療できる。多特異性分子を用いる治療の間の投与についての好ましいサイトカインには、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターフェロン-γ（IFN-γ）及び腫瘍壊死因子（TNF）を含む。
本発明の組成物（例えば、ヒト抗体、多特異性及び二重特異性分子）は、例えば当該細胞をラベル化するために、FcγR又はCADM1を発現する標的細胞に使用することもできる。当該使用について、結合剤を、検出できる分子に連結できる。従って、本発明は、Fc受容体、例えばFcγR、又はCADM1を発現する細胞をエクスビボ又はインビトロで局在化させる方法を提供する。検出可能なラベルは、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素又は酵素補因子であり得る。
具体的実施態様において、本発明は、サンプルのCADM1抗原の存在を検出するための方法、又はCADM1抗原の量を測定する方法であって、サンプル及びコントロールサンプルを、CADM1に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体若しくはその抗原結合部分と、該抗体又はその部分とCADM1との間の複合体の形成を可能にする条件下で接触させることを含む、前記方法を提供する。複合体の形成がそれから検出され、ここで、コントロールサンプルと比較しての該サンプルとの複合体形成の差異が該サンプルにおけるCADM1抗原の存在を示す。
他の実施態様において、本発明は、対象におけるCADM1媒介障害、例えばヒト癌を治療するための方法を提供し、該癌には、小細胞肺癌、神経内分泌癌（肺、副腎、下垂体、胃腸管、腎臓、肝臓、膵臓（インスリノーマ及びグルカゴノーマを含む）のものを含む）及びカルチノイド腫瘍（膵臓、肺、胃腸管、肝臓又は腎臓のものを含む）を含む。
さらに別の実施態様において、本発明の免疫抱合体を使用して、化合物（例えば、治療剤、ラベル、細胞毒、放射毒性免疫阻害剤、その他）を、当該化合物を抗体に連結することによってCADM1細胞表面受容体を有する細胞に標的化できる。例えば、抗CADM1抗体は、米国特許番号6,281,354及び6,548,530、米国特許公報番号20030050331、20030064984、20030073852、及び20040087497に記載された、又はWO 03/022806において刊行された毒素化合物のいずれかに抱合化できる。従って、本発明は、CADM1を発現する細胞をエクスビボ又はインビボで（例えば、検出可能なラベル、例えば放射性同位元素、蛍光化合物、酵素又は酵素補因子で）局在化させるための方法も提供する。選択的に、免疫抱合体は、CADM1に細胞毒又は放射性毒を標的化することによってCADM1細胞表面受容体を有する細胞を殺すために使用できる。
本発明は以下の実施例において更に例証されるが、これは更なる限定として解釈されるべきではない。本出願の全体にわたって引用される全ての図面並びに全ての文献、特許及び公開された特許出願の内容は、引用により明示的に本明細書に組み込まれる。
（実施例１）：CADM1抗原に対するヒトモノクローナル抗体の生成
非CADM1ポリペプチド（hisタンパク質）（配列番号44）に連結されたCADM1の細胞外ドメイン（CADM1 ECD）から構成される組換え融合タンパク質を、標準的な組換え方法によって生成し、免疫用抗原として使用した（下記を参照されたい）。
（トランスジェニックHuMAbマウス（登録商標）及びKMマウス（登録商標）系統）
CADM1に対する完全ヒトモノクローナル抗体は、トランスジェニックHuMAbマウス（登録商標）のHCo7及びHCo27系統並びにトランスジェニック導入染色体マウスのKM系統を使用して調製され、これらの各々はヒト抗体遺伝子を発現する。これらのマウス系統の各々において、内因性マウスκ軽鎖遺伝子は、Chenらの文献 (1993) EMBO J. 12:811-820に記載されるようにホモ接合的に破壊され、内因性のマウス重鎖遺伝子はPCT公報WO 01/09187の実施例1に記載されるようにホモ接合的に破壊された。これらのマウス系統の各々は、Fishwildらの文献 (1996) Nature Biotechnology 14:845-851に記載されるように、ヒトκ軽鎖導入遺伝子（KCo5）を保有する。HCo7系統は、以下に記載されるように、HCo7ヒト重鎖導入遺伝子を保有する：米国特許5,545,806;5,625,825;及び5,545,807。HCo27系統は、PCT公報WO 01/09187に記載されるように、HCo27ヒト重鎖導入遺伝子を保有する。KMマウス（登録商標）系統はPCT公報WO 02/43478に記載されるように、SC20導入染色体を含む。
（HuMab及びKMの免疫）
CADM1に対する完全ヒトモノクローナル抗体を生成するために、HCo7、HCo27及びKMマウス系統のHuMAbマウスを、精製された組換えCADM1-ECD-hisタンパク質で免疫した。これらのマウスの全般的免疫計画は、Lonberg, N.らの文献 (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D.らの文献 (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851及びPCT公報WO 98/24884に記載されている。マウスは、抗原の第1の注入の際、6〜16週齢であった。CADM1-ECD-hisタンパク質の精製組換え調製物（5〜50μg）を使用して、HuMab及びKMマウス（登録商標）を免疫した。
トランスジェニックマウスは、Ribiアジュバント中抗原を用いて、腹膜内に（IP）、皮下に、（Sc）、又は足蹠（FP）を介し、3〜21日の間隔で（合計9回までの免疫）、免疫した。免疫応答は、後眼窩ブリードによりモニタリングされた。血漿は（後述する）ELISAにより選別され、充分な力価の抗CADM1ヒト免疫グロブリン（immunogolobulin）を有するマウスが融合に使用された。マウスは、屠殺及び脾臓の除去の3日及び2日前に、抗原を用いて静注で追加免疫された。典型的には、各抗原について10〜20の融合が実施された。数十匹のマウスが各抗原について免疫された。
（抗CADM1抗体を産生するHuMAbマウス（登録商標）又はKMマウス（登録商標）動物の選択）
CADM1を結合した抗体を産生するHuMAbマウス（登録商標）又はKMマウス（登録商標）動物を選択するために、免疫したマウスからの血清は、Fishwild, D.らの文献 (1996)（上記）により記載されるELISAによって試験された。簡潔にいうと、マイクロタイタープレートは、50μl/ウェルの1〜2μg/ml精製組換えCADM1-PBS溶液で終夜4℃インキュベートして被覆した後、200μg/ml の5% ニワトリ血清PBS/Tween（0.05%）溶液でブロッキングした。CADM1で免疫したマウスからの血漿の希釈物を各ウェルに添加し、室温で1〜2時間インキュベートした。プレートをPBS/Tweenで洗浄した後、室温で1時間、西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）で抱合化したヤギ-抗-ヒトIgG Fcポリクローナル抗体とインキュベートした。洗浄後、プレートは、ABTS基質（Moss社, 製品: ABTS-1000）で現像し、OD415-495で分光光度計により分析した。抗CADM1抗体のうち最も高い力価を発現したマウスを融合に使用した。融合を後記するように実施し、ハイブリドーマ上清は、ELISA及びFACSにより抗CADM1活性について試験した。
（CADM1に対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの生成）
HuMAbマウス（登録商標）及び／又はKMマウス（登録商標）から単離されたマウス脾細胞は、Cyto Pulse大チャンバ選別融合エレクトロポレータ（Cyto Pulse Sciences社, Glen Burnie, MD）を使用する電界系電気融合を使用して、マウス骨髄腫細胞株と融合した。簡潔にいうと、免疫したマウスからの脾臓リンパ球の単一細胞浮遊液を、同数のSp2/0非分泌マウス骨髄腫細胞（ATCC、CRL 1581）に融合させた。細胞は平底マイクロタイタープレートに約2×104/ウェルの密度でまき、これをその後、10% ウシ胎児血清、10% P388D1（ATCC、CRL TIB-63）馴化培地、3-5% origen（IGEN）DMEM（高グルコース、L-グルタミン及びピルビン酸ナトリウムを有するMediatech、CRL 10013）、並びに5mM HEPES、0.055mM 2-メルカプトエタノール、50mg/ml ゲンタマイシン及び1×HAT（Sigma, CRL P-7185）を含む選択培地において、インキュベートした。1〜2週後に、細胞を、HATがHTで置換された培地で培養した。細胞を播種した約10〜14日後、個々のウェルからの上清は、最初にそれらがヒトg,k抗体を含むかどうかについて選別した。ヒトg,kについて陽性とスコア化された上清は、その後、ヒト抗CADM1モノクローナルIgG抗体についてのELISA及びFACS（上記）で選別した。抗体分泌ハイブリドーマは、24ウェルプレートに移し、再び選別し、ヒト抗CADM1 IgGモノクローナル抗体についてさらに陽性である場合、限界希釈法によって少なくとも二回サブクローン化した。それから、安定サブクローンをインビトロで培養し、さらなる特徴付けのために組織培地中の少量の抗体を生成した。
KMマウス（登録商標）から産生されたハイブリドーマクローンPTA021_A1、PTA021_A2及びPTA021_A3が更なる解析のために選択された。
（実施例2）：ヒトモノクローナル抗体 PTA021_A1、PTA021_A2又はPTA021_A3の構造的特徴づけ
PTA021_A1、PTA021_A2及びPTA021_A3モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖可変領域をコードするcDNA配列は、標準的なPCR技術を使用して、それぞれPTA021_A1、PTA021_A2及びPTA021_A3ハイブリドーマから得られ、標準的なDNA塩基配列決定技術を使用して配列決定した。
抗体配列は、1以上の残基で生殖細胞系列残基へ復帰させるように突然変異導入することができる。例えば、PTA021_A1重鎖可変領域は、糖鎖付加部位（例えば、N30Q突然変異）を除去するために特定の部位（例えば、残基30）で生殖細胞系列配列を反映するように、突然変異導入することができる。
PTA021_A1の重鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ、図1A並びに配列番号19及び25において示される。
PTA021_A1の軽鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ、図1B並びに配列番号28及び22において示される。
公知のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン重鎖配列に対するPTA021_A1 重鎖免疫グロブリン配列の比較は、PTA021_A1 重鎖がヒト生殖細胞系列VH 2-05由来のVHセグメント、ヒト生殖細胞系列6-6由来のDセグメント、及びヒト生殖細胞系列JH 5b由来のJHセグメントを利用することを実証した。生殖細胞系列VH 2-05配列に対するPTA021_A1 VH配列の整列は図4に示す。CDR領域決定のKabatシステムを使用するPTA021_A1 VH配列の更なる解析は、それぞれ図1A及び4並びに配列番号1、4及び7に示される重鎖CDR1、CDR2及びCDR3領域の描写をもたらした。
公知のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン軽鎖配列に対するPTA021_A1軽鎖免疫グロブリン配列の比較は、PTA021_A1軽鎖が、ヒト生殖細胞系列VK L15 由来のVKセグメント及びヒト生殖細胞系列JK 4由来のJKセグメントを利用することを実証した。生殖細胞系列VK L15配列に対するPTA021_A1 VK配列の整列は、図7に示されている。CDR領域決定のKabatシステムを使用するPTA021_A1 VK配列の更なる解析は、それぞれ図1B及び7並びに配列番号10、13及び16に示される軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3領域の描写をもたらした。
PTA021_A2の重鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ、図2A並びに配列番号26及び20において示される。
PTA021_A2の軽鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ、図2B並びに配列番号29及び23において示される。
公知のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン重鎖配列に対するPTA021_A2 重鎖免疫グロブリン配列の比較は、PTA021_A2 重鎖が、ヒト生殖細胞系列VH 2-05由来のVHセグメント、ヒト生殖細胞系列6-6由来のDセグメント、及びヒト生殖細胞系列JH 5b由来のJHセグメントを利用することを実証した。生殖細胞系列VH 2-05配列に対するPTA021_A2 VH配列の整列は、図5に示されている。CDR領域決定のKabatシステムを使用するPTA021_A2 VH配列の更なる解析は、それぞれ、図2A及び5並びに配列番号2、5及び8において重鎖CDR1、CDR2及びCDR3領域の描写をもたらした。
公知のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン軽鎖配列に対するPTA021_A2軽鎖免疫グロブリン配列の比較は、PTA021_A2軽鎖が、ヒト生殖細胞系列VK L15由来のVKセグメント及びヒト生殖細胞系列JK 4由来のJKセグメントを利用することを実証した。生殖細胞系列VK L15配列に対するPTA021_A2 VL配列の整列は、図8に示されている。CDR領域決定のKabatシステムを使用するPTA021_A2 VK配列の更なる解析は、それぞれ図2B及び8並びに配列番号11、14及び17に示すように軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3領域の描写をもたらした。
PTA021_A3の重鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ、図3A並びに配列番号27及び21において示される。
PTA021_A3の軽鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれ、図3B並びに配列番号30及び24において示される。
公知のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン重鎖配列に対するPTA021_A3 重鎖免疫グロブリン配列の比較は、PTA021_A3 重鎖が、ヒト生殖細胞系列VH 2-05由来のVHセグメント、ヒト生殖細胞系列6-6由来のDセグメント、及びヒト生殖細胞系列JH JH5b由来のJHセグメントを利用することを実証した。生殖細胞系列VH 2-05配列に対するPTA021_A3 VH配列の整列は、図6に示されている。CDR領域決定のKabatシステムを使用するPTA021_A3 VH配列の更なる解析は、それぞれ図3A及び6並びに配列番号3、6及び9に示すように重鎖CDR1、CDR2及びCDR3領域の描写をもたらした。
公知のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン軽鎖配列に対するPTA021_A3軽鎖免疫グロブリン配列の比較は、PTA021_A3軽鎖が、ヒト生殖細胞系列VK L15由来のVKセグメント及びヒト生殖細胞系列JK 4由来のJKセグメントを利用することを実証した。生殖細胞系列VK L15配列に対するPTA021_A3 VL配列の整列は、図9に示されている。CDR領域決定のKabatシステムを使用するPTA021_A3 VL配列の更なる解析は、それぞれ図3B及び9並びに配列番号12、15及び18に示すように軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3領域の描写をもたらした。
（実施例３）：CADM1モノクローナル抗体フローサイトメトリー研究に係る結合特性の特徴づけ
この実施例において、細胞表面CADM1に対するmAbs PTA021_A1、PTA021_A2、PTA021_A3及びPTA021_A3の非フコシル化バージョン（NF）の結合が、フローサイトメトリーにより検討された。
細胞表面CADM1タンパク質に結合する抗体の能力を試験するために、抗体を以下の異なるCADM1発現細胞とインキュベートした：NCI-H69（ATCC命名HTB-119（商標））、ヒト小細胞肺癌細胞株；DMS79（ATCC命名CRL-2049（商標））、ヒト小細胞肺癌系統；SKOV3（ATCC命名HTB-77（商標））、ヒト卵巣癌細胞株；A549（ATCC命名CCL-185（商標））、ヒト非小細胞肺癌細胞株；SkMel28（ATCC命名HTB-72（商標））、ヒトメラノーマ細胞株、及び786-O（ATCC命名CRL-1932（商標））、ヒト腎細胞種細胞株。フローサイトメトリー研究のために、PTA021_A1、PTA021_A2、PTA021_A3及びPTA021_A3（NF）モノクローナル抗体を冷却1×PBS + 0.1% BSAで40μg/mlに希釈した。結合反応のために、50μlの希釈抗体溶液を4×105個の細胞を含む50μlの細胞懸濁液に加え、該混合物を30〜60分間、氷上でインキュベートした。細胞は、それから1×PBS + 0.1% BSAで3回洗浄した。1:50希釈したR-フィコエリトリンラベル化ヤギ抗ヒトIgG FγF(ab)2断片（Jackson ImmunoResearch Labs, カタログ番号109-116-098）を加え、該混合物を1時間氷上でインキュベートした後、冷却1×PBS + 0.1% BSAで2回洗浄した。最終的な洗浄の後、200μlの冷却1×PBS + 0.1% BSAを各溶液に加え、抗体結合の解析はFACSにより行った。
下記の図10及び表1は、フローサイトメトリー解析の結果及びNCI-H69細胞株に結合するためのEC50を示す。結果は、3つのモノクローナル抗体の全てが効果的に細胞表面ヒトCADM1に結合することを実証する。
Figure 0005816558
図11A及び11Bは、NCI-H69及びDMS79小細胞肺癌細胞株におけるフローサイトメトリー解析の結果を示す。
図12は、SKOV3卵巣癌細胞株における抗体PTA021_A3でのフローサイトメトリー解析の結果を示す。
図13は、A549非小細胞肺癌細胞株における抗体PTA021_A3でのフローサイトメトリー解析の結果を示す。
図14は、786-O腎細胞種及びSkMel28メラノーマ細胞株における抗体PTA021_A3でのフローサイトメトリー解析の結果を示す。
図11〜14の結果は、PTA021_A3が異なるCADM1発現細胞において細胞表面ヒトCADM1に効果的に結合することを実証する。
図15は、NCI-H69及びDMS79小細胞肺癌細胞株におけるPTA021_A3の非フコシル化バージョン（NF）でのフローサイトメトリー解析の結果を示す。これらの結果は、非フコシル化がPTA021_A3の細胞表面ヒトCADM1への結合に効果を及ぼさないことを実証する。
（実施例４）：抗CADM1 mAbによって媒介される抗体依存性細胞傷害
抗体依存性細胞傷害反応（ADCC）を介してエフェクター細胞の存在下でCADM1発現細胞を殺す抗CADM1 mAbの能力を測定するために、2つの細胞株（NCI-H69及びDMS79）が標的細胞として使用された。
ヒトエフェクター細胞は、以下の通りに全血から調製した。ヒト末梢血液単核細胞は、標準的なフィコール-paque分離によってヘパリン化された全血から精製された。細胞は、10% FBS（熱不活化）及び200U/mlのヒトIL-2を含むRPMI1640培地で再懸濁し、37℃で終夜インキュベートした。翌日、細胞を回収し、培地で4回洗浄し、1×107細胞/mlで再懸濁した。標的細胞は、37℃で20分間、1×106の標的細胞/mL当たり2.5μlのBATDAでBATDA試薬（Perkin Elmer, Wellesley, MA）とインキュベートすることにより調製した。標的細胞は、4回洗浄し、スピンダウンし、1×105細胞/mlの最終量にした。
標的細胞は、以下の通りにDelfia蛍光発光解析を使用して、ヒト抗CADM1モノクローナル抗体に対する抗体特異的ADCCについて試験した。NCI-H69又はDMS79細胞（100μlのラベル化標的細胞、104細胞/ウェル）を、50μlのエフェクター細胞（106細胞/ウェル）及び50μlの抗体（10ug/ml終濃度）とインキュベートした。実験の全体にわたって1:25の標的対エフェクタ比を使用した。全ての研究において、ヒトIgG1アイソタイプコントロールをネガティブコントロールとして使用した。細胞を2000rpmでスピンダウンし、37℃で1時間インキュベートした。その後、上清を回収して遠心分離に供し、20μlの上清を平底プレートに移し、これに180μlのEu溶液（Perkin Elmer, Wellesley, MA）を加え、RubyStarリーダー（BMG Labtech）で読み取った。溶解（％）は、以下の通りに算出した：（サンプル放出−自発的放出×100）/（最大放出−自発的放出）；式中、自発的放出は標的細胞及びエフェクター細胞を含むウェル由来の蛍光であり、最大放出は標的細胞を含み2% トリトン-Xで処理したウェル由来の蛍光である。
結果は以下の表2並びに図16A及び16Bにおいて要約され、これらはPTA021_A1、PTA021_A2及びPTA021_A3がCADM1発現癌細胞株においてADCCを特異的に誘発できることを実証する。
Figure 0005816558
（実施例５）：CADM1抗体内在化
モノクローナル抗体PTA021_A1、PTA021_A2及びPTA021_A3は、Hum-Zapアッセイを使用して、細胞に結合すると即座にNCI-H69及びDMS79細胞によって内在化されることが示された。Hum-ZAPアッセイは、毒素サポリンに抱合化される抗ヒトIgG二次抗体の結合を介する抗CADM1モノクローナル抗体の内在化を示した。(Advanced Targeting System, San Diego, CA, IT-22-100)。はじめに、PTA021_A1、PTA021_A2及びPTA021_A3は、NCI-H69又はDMS79細胞の表面に結合した。それから、Hum-ZAP抗体は、一次抗体に結合した。次に、一次抗体/Hum-ZAP複合体は、細胞により内在化された。細胞へのサポリンの侵入は、タンパク質合成阻害及び最終的な細胞死を結果的に生じた。
Hum-ZAPアッセイは、以下の通りに実施された。細胞の各々は、ウェルあたり3×103細胞の密度で播種した。抗CADM1モノクローナル抗体又はアイソタイプコントロールヒトIgGを連続希釈した後、細胞に添加した。その後、Hum-ZAPを2μg/ml の濃度で添加し、該プレートを96時間インキュベートした。プレートの細胞生存度は、CellTiter-Glo（登録商標）発光細胞生存度アッセイキット（Promega, G7571）により検出し、プレートは、Luminomitor（Tuner BioSystems, Sunnyvale, CA）によって490nMで読んだ。データは、Prism（Graphpad）により解析した。細胞死は、PTA021_A1、PTA021_A2及びPTA021_A3モノクローナル抗体の濃度と比例していた。図17A及び17Bは、抗CADM1モノクローナル抗体が、hIgG1アイソタイプコントロール抗体に比較して、それぞれDMS79及びNCI-H69細胞によって効率的に内在化されたされたことを示す。
（実施例６）：CADM1はLAMP1と共局在する
モノクローナル抗体PTA021_A3は、LAMP1と共局在し、そのようにして内在化されることが示された。PTA021_A3は、NCI-H69細胞に結合し、洗浄し、45分間37℃でインキュベートした。PTA021_A3抗体は、FITCラベル化抗ヒト抗体を介して追跡した。
いくつかの細胞は、浸透し、抗ヒトLAMP1と共に染色され、TRITCラベル二次抗体で検出された。
結果は、PTA021_A3及びLAMP1がエンドソームにおいて共局在化されることを示した。
（実施例７）：抗CADM1抗体は癌組織に結合する
抗CADM1モノクローナル抗体PTA021_A1、PTA021_A2及びPTA021_A3は、小細胞肺癌、神経内分泌性膵臓癌、肝癌、肺カルチノイド及び胃腸カルチノイドを表す組織を含むヒト癌組織に結合することが示された。癌患者から生検が得られ、抗体は免疫組織化学染色（Cytomyx、MA）に使用した。5μm組織核が使用された。スライド上で30分間乾燥させた後、組織切片を5分間室温でアセトンで固定した。スライドをPBSですすぎ、無血清タンパク質及びペルオキシダーゼ遮断剤（Dako S2001, CO）で遮断した後、5μg/mlの一次抗体複合体で45分間室温でインキュベートした。次に、スライドを洗浄し、FITC抱合化二次抗体（Jackson Immunoresearch Lab, 109-097-003）と30分間インキュベートし、PBSで再び洗浄し、ポリマーHRP抱合体（Dako, CO, K4063）と20分間インキュベートした。色原体（Dako K3464）を基質として使用し、茶色の染色を結果的に生じた。スライドは、Faramount Aqueous Mounting Media（Dako, S3025）に包埋した。PTA021_A1、PTA021_A2及びPTA021_A3は、上記の型の腫瘍細胞に特異的に結合することが示された。これらモノクローナル抗体で染色される場合、他の器官は、負の又は非特異的染色を呈し、該器官には、子宮、肺、肝臓、腎臓、大腸、頸部、胸部、骨髄、小脳、大脳、食道、心臓、前立腺、胎盤、下垂体、卵巣、中皮、扁桃、皮膚、小腸、骨格筋、胃、脾臓、胸腺及び甲状腺を含む。データは、抗CADM1 HuMab PTA021_A1、PTA021_A2及びPTA021_A3が、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（扁平上皮癌及び腺癌を含む）、神経内分泌癌（膵臓、肺及び胃腸管のものを含む）、肝癌、肺カルチノイド、乳癌、大腸癌、前立腺癌、卵巣癌、腎臓癌及び胃腸カルチノイドのこれらの腫瘍を含む腫瘍に発現されるCADM1を認識することを実証する。
小細胞肺癌組織サンプルにおける抗体PTA021_A3での免疫組織化学は、全ての腫瘍細胞のうち75%に高レベルの（+++）膜染色を示した。肝癌組織サンプルにおける抗体PTA021_A3での免疫組織化学は、サンプルの75%〜95%において陽性染色を示し、全ての腫瘍細胞のうち45%の腫瘍に高レベルの（+++）膜染色を示した。PTA021_A3の更なる研究は、非小細胞肺癌、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、卵巣癌及び腎細胞種のより小さいサンプルセットで実行した。非小細胞肺癌、乳癌及び腎臓明細胞癌における陽性染色の有病率は〜66%であり；前立腺癌及び卵巣癌における有病率は100%であり、結腸直腸腺癌はサンプルの17% において陽性染色を示した。肺、膵臓及び胃腸管の神経内分泌腫瘍を試験し、肺カルチノイド及び神経内分泌の膵臓サンプルでは75%の有病率を示し、胃腸管神経内分泌腫瘍はサンプルの65%において陽性染色を示した。
（実施例８）：マウス異種移植モデルでの肝癌腫瘍増殖におけるフコシル化及び非フコシル化抗CADM1抗体の効果
マウス異種移植モデルでのHepG2細胞由来肝癌の増殖におけるPTA021_A3及び非フコシル化バージョンのPTA021_A3（NF）の効果を検討した。この異種移植モデルにおいて、SCIDマウス（CB17, Charles River Laboratories提供, Hollister, CA）は2.5×106HepG2細胞/マウスで移植され、HepG2細胞は約30日間増殖させた。それからマウスをランダム化し、以下の表3のとおりに腹膜内治療した（i.p.）。
Figure 0005816558
 ネクサバルソラフェニブ（腎細胞腫及び肝癌を治療するために使用される化学系の複数のキナーゼ阻害剤）を標的治療についてのコントロールとして使用した。
図18に示されるように、PTA021_A3及びPTA021_A3 NF抗体を用いる治療は、著しく腫瘍増殖率を低下させ、非フコシル化PTA021_A3 NF抗体がより強力であった。
（実施例９）：抗CADM1抗体-薬剤抱合体はマウス異種移植モデルにおいてHepG2細胞増殖を阻害する
マウス異種移植モデルにおいて肝細胞癌由来のHepG2細胞の増殖における式M（以下「PTA021_A3-式A抱合体」又は「PTA021_A3-式M」という）によるPTA021_A3抱合体の効果を検討した。この異種移植モデルにおいて、SCIDマウス（CB17, Charles River Laboratories提供, Hollister, CA）は2.5×106HepG2細胞/マウスを移植され、HepG2細胞は約30日間増殖させた。それからマウスをランダム化し、PTA021_A3-式M抱合体（0.1umole/kg又は0.03umol/kg）で腹膜内治療した（i.p.）。DT及び抗ジフテリア毒素抗体を非結合アイソタイプコントロールとして使用した。ネクサバルソラフェニブ（腎細胞腫及び肝癌を治療するために使用される化学系の複数のキナーゼ阻害剤）を標的治療についてのコントロールとして使用した。
図19に示されるように、PTA021_A3-式M抱合体を用いる治療は、用量依存的様式で腫瘍増殖速度を著しく阻害した。
（実施例１０）：抗CADM1抗体-薬剤抱合体はマウス異種移植モデルにおけるDMS79細胞増殖を阻害する
マウス異種移植モデルにおいて小細胞肺癌由来のDMS79細胞の増殖におけるPTA021_A3-式M 効果を検討した。この異種移植モデルにおいて、SCIDマウス（CB17, Charles River Laboratories提供, Hollister, CA）は5×106DMS79細胞/マウスを移植され、DMS79細胞は該平均腫瘍容積が約200mm3になるまで増殖させた。それからマウスをランダム化し、2つの研究でPTA021_A3-式M抱合体で腹膜内治療した（i.p.）。
図20Aに示されるように、0.3μmole/kgのPTA021_A3-式M抱合体を用いる治療は、研究の全体にわたって（88日）、全てのマウスにおいて完全な腫瘍後退を引き起こした。図20Bに示されるように、PTA021_A3-式M抱合体を用いる治療は、研究によって0.1umol/kg用量で腫瘍後退を引き起こし、これは60日目に完了した。低用量の0.03umol/kgは、腫瘍増殖に顕著な遅れを引き起こした。
（実施例１１）：PTA021_A3及び非フコシル化PTA021_A3により媒介される抗体依存性細胞傷害反応
蛍光細胞毒性アッセイは、抗体依存性細胞傷害反応を介してエフェクター細胞の存在下で（HepG2、786-O及びDMS79細胞でのADCC）、CADM1発現細胞を殺す非フコシル化PTA021_A3抗CADM1 mAbの能力を測定するために使用された。
ヒトエフェクター細胞は、以下の通りに全血から調製した。ヒト末梢血液単核細胞は、標準的なフィコール-paque単離によってヘパリン化された全血から精製した。細胞は、10% FBS（熱不活化）及び200U/mlのヒトIL-2を含むRPMI1640培地に再懸濁し、37℃で終夜インキュベートした。翌日、細胞を回収し、培地で4回洗浄し、2×107細胞/mlで再懸濁した。標的CHO-メソテリン細胞は、BATDA試薬（Perkin Elmer, Wellesley, MA）と1×106標的細胞/mL当たり2.5μlのBATDAで20分間37℃でインキュベートすることにより調製した。標的細胞は、4回洗浄し、スピンダウンして、1×105 細胞/mlの 最終量にした。
HepG2、786-O及びDMS79細胞は、以下の通りにDelfia蛍光発光解析を使用して、ヒト抗CADM1 PTA021_A3モノクローナル抗体及びPTA021_A3の非フコシル化調製物に対する抗体特異的ADCCについて試験した。HepG2、786-O又はDMS79（100μlのラベル化標的細胞、104細胞/ウェル）は、50μlのエフェクター細胞（106細胞/ウェル）及び50μlの抗体（10ug/ml終濃度）とインキュベートした。1:100の標的対エフェクタ比が、実験全体にわたって使用された。全ての研究において、ヒトIgG1アイソタイプコントロールがネガティブコントロールとして使用された。細胞は、2000rpmでスピンダウンし、37℃で1時間インキュベートした。それから上清を回収して遠心分離に供し、20μlの上清を平底プレートに移し、これに180μlのEu溶液(Perkin Elmer, Wellesley, MA) を加え、RubyStarリーダー（BMG Labtech）で読み取った。溶解（％）は、以下の通りに算出した：（サンプル放出−自発的放出×100）/（最大放出−自発的放出）；式中、自発的放出は標的細胞及びエフェクター細胞を含むウェルからの蛍光であり、最大放出は標的細胞を含み、2% トリトン-Xで処理されたウェルからの蛍光である。
図21、22及び23は、PTA021_A3及び非フコシル化PTA021_A3の両方がHepG2、786-O及びDMS79細胞でADCCを誘発でき、非フコシル化PTA021_A3がより有力な抗体であることを示す。同効果は、SCLC株NCI-H69などのCADM1を発現する他の細胞株で観察できる。
（実施例１２）：抗CADM1抗体/シスプラチンはマウス異種移植モデルにおけるDMS79細胞増殖を阻害する
マウス異種移植モデルSCLC由来のDMS79細胞の増殖におけるPTA021_A3単独、及びシスプラチンとの併用の効果を検討した。この異種移植モデルにおいて、SCIDマウス（CB17, Charles River Laboratories提供, Hollister, CA）は5×106DMS79細胞/マウスを移植され、DMS79細胞は該腫瘍が平均200mm3に達するまで増殖させた。それからマウスをランダム化し、腫瘍容積プロットに示されるように、腹膜内治療された（i.p.）。
図24に示されるように、PTA021_A3単独を用いる治療は腫瘍増殖を遅延させ、シスプラチンとの併用は顕著かつ相乗的な抗腫瘍活性を示す。
（実施例１３）：PTA021_A3NF、PTA021_A3及びPTA021_A3-式Mの毒性の評価
非フコシル化抗体及び抗体-薬剤抱合体を含む抗CADM1抗体の毒性プロファイルは、例えばPTA021_A3及びその誘導体を使用して、カニクイザル（cynomolgus macaques）において評価される。IHCアッセイの結果は、カニクイザル及びヒトが、PTA021_A3を使用するIHCに供される場合、類似のパターンのCADM1発現を示すことを示した。さらに、CADM1タンパク質は、カニクイザル及びヒトにおいて高い同一性を示す。例えば、0.1mg/kg〜100mg/kgの複数回IV用量は、ヒトにおける臨床試験に適切な用量を同定するために使用の最大耐量を測定するために使用される。
探索毒物学研究は、カニクイザルマカクにおいてPTA021_A3及びPTA021_A3の非フコシル化バージョン（NF）で実施した。8匹の4年齢の非被験（生物製剤に対し非被験であるが、小分子薬剤動態学的研究で予め処理された）カニクイザルは、各グループにおいて2匹のオス及び2匹のメスを含む2つのグループで評価される研究に使用した。グループ1の動物は、1mg/kgの単回静脈(IV)用量の非フコシル化PTA021_A3（NF）抗体で処理された。グループ2の動物は、1mg/kgの単回IV投与においてPTA021_A3抗体で処理された。
臨床観察及び死亡率/罹患率は、1日2回、午前と午後に評価した。体重、血液学及び血液化学は、-11、0、1、3、8、15及び22日目に解析した。血液学評価には、RBC、HGB、HCT、PLT、MCH、MCV、網状赤血球、WBC及びディファレンシャルカウントを含んだ。血液化学評価には、AST、ALT、ALP、CRE、BUN、GLU、CHO、TP、ALB、TBIL、LDH、TG、Ca、P、A/G、K、Na及びClを含んだ。
研究の間、有意な顕在的な観察（例えば食行動）はなかった。神経内分泌組織における観察可能な効果（例えば、行動変化及び苦痛の徴候をもたらすホルモン変化）はなかった。注記すべき苦痛又は振戦の証拠もなかった。図25〜32は、実施された解析の全てが通常の期待値の範囲内であったことを示す。
図25A及び25Bは、それぞれ雄サル及び雌サルについての体重データを示す。
図26A及び26Bは、それぞれ雄サル及び雌サルについてのグルコースデータを示す。
図27A及び27Bは、それぞれ雄サル及び雌サルについてのアラニントランスアミナーゼデータを示す。
図28A及び28Bは、それぞれ雄サル及び雌サルについてのアスパラギン酸トランスアミナーゼデータを示す。
図29A及び29Bは、それぞれ雄サル及び雌サルについてのアルカリホスファターゼデータを示す。
図30A及び30Bは、それぞれ雄サル及び雌サルについての乳酸デヒドロゲナーゼデータを示す。
図31A及び31Bは、それぞれ雄サル及び雌サルについてのRBCデータを示す。
図32A及び32Bは、それぞれ雄サル及び雌サルについてのWBCデータを示す。
（実施例１４）：PTA021_A3NF、PTA021_A3及びPTA021_A3-式Mの有効性の評価
CADM1は、PTA021_A3 HuMAbを使用して、IHCによって多くの癌型において発現されることが示された。癌腫瘍モデルを表す細胞株を使用して、様々な癌を治療するための裸の及び毒素抱合化抗CADM1抗体の有効性を実証する。例えば、PTA021_A3及びその誘導体は、CADM1が発現される腎臓癌（786-O細胞）、メラノーマ（SkMel28細胞）及び小細胞肺癌（DMS79細胞）の有効性モデルにおいて、それ自身で、又は標準的配慮と組み合わせて使用される。PTA021_A3及び他の抗CADM1抗体は、癌（例えば、神経内分泌癌、大腸癌、乳癌、卵巣癌及び前立腺癌）を表すCADM1発現細胞株を使用して、異種移植動物モデルで使用できる。
本願明細書において引用した全ての書類、刊行物、特許、特許出願、提示、テキスト、報告、原稿、パンフレット、書籍、インターネットポスティング、論文記事、定期刊行物、製品データ表などを含むがこれらに限定されない全ての文献は、引用によりその全てが本明細書に組み込まれる。引用文献に係る議論は、本明細書においてこれらの著者によってなされる主張を単に要約するのみを意図し、任意の引用文献が先行技術を構成するという承認はなく、出願人は引用文献の精度及び妥当性に挑戦する権利を保有する。
前記の本発明は理解の明快さのために図及び例をあげて若干詳細に記載されるが、本発明の教示に照らし、係属する特許請求の範囲の精神又は範囲から逸脱せずに特定の変更及び修飾がなされ得ることは、当業者に容易に認識されるであろう。
Figure 0005816558
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Claims (12)

  1. (a)配列番号21に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号24に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
    (b)配列番号19に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号22に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；又は
    (c)配列番号20に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号23に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
    を含む、CADM1に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分、又は、ユニボディ、ドメイン抗体、及びナノボディからなる群から選択される抗体断片。
  2. (a) 配列番号3を含む重鎖可変領域CDR1、配列番号6を含む重鎖可変領域CDR2、及び配列番号9を含む重鎖可変領域CDR3を含む、配列番号21に記載されるアミノ酸配列、又は、該配列に少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
    配列番号12を含む軽鎖可変領域CDR1、配列番号15を含む軽鎖可変領域CDR2、及び配列番号18を含む軽鎖可変領域CDR3を含む、配列番号24に記載されるアミノ酸配列、又は、該配列に少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    (b) 配列番号1を含む重鎖可変領域CDR1、配列番号4を含む重鎖可変領域CDR2、及び配列番号7を含む重鎖可変領域CDR3を含む、配列番号19に記載されるアミノ酸配列、又は、該配列に少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
    配列番号10を含む軽鎖可変領域CDR1、配列番号13を含む軽鎖可変領域CDR2、及び配列番号16を含む軽鎖可変領域CDR3を含む、配列番号22に記載されるアミノ酸配列、又は、該配列に少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は
    (c) 配列番号2を含む重鎖可変領域CDR1、配列番号5を含む重鎖可変領域CDR2、及び配列番号8を含む重鎖可変領域CDR3を含む、配列番号20に記載されるアミノ酸配列、又は、該配列に少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び
    配列番号11を含む軽鎖可変領域CDR1、配列番号14を含む軽鎖可変領域CDR2、及び配列番号17を含む軽鎖可変領域CDR3を含む、配列番号23に記載されるアミノ酸配列、又は、該配列に少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
    を含む、CADM1に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分、又は、ユニボディ、ドメイン抗体、及びナノボディからなる群から選択されるその抗体断片。
  3. (a) 配列番号1を含む重鎖可変領域CDR1、
    配列番号4を含む重鎖可変領域CDR2、
    配列番号7を含む重鎖可変領域CDR3、
    配列番号10を含む軽鎖可変領域CDR1、
    配列番号13を含む軽鎖可変領域CDR2、及び
    配列番号16を含む軽鎖可変領域CDR3、又は
    (b) 配列番号2を含む重鎖可変領域CDR1、
    配列番号5を含む重鎖可変領域CDR2、
    配列番号8を含む重鎖可変領域CDR3、
    配列番号11を含む軽鎖可変領域CDR1、
    配列番号14を含む軽鎖可変領域CDR2、及び
    配列番号17を含む軽鎖可変領域CDR3、又は
    (c) 配列番号3を含む重鎖可変領域CDR1、
    配列番号6を含む重鎖可変領域CDR2、
    配列番号9を含む重鎖可変領域CDR3、
    配列番号12を含む軽鎖可変領域CDR1、
    配列番号15を含む軽鎖可変領域CDR2、及び
    配列番号18を含む軽鎖可変領域CDR3、
    を含む、CADM1に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分、又は、ユニボディ、ドメイン抗体、及びナノボディからなる群から選択されるその抗体断片。
  4. (A) 前記抗体が、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4アイソタイプの全長抗体であるか、
    (B) 前記抗体が、
    全抗体、
    ユニボディ、ドメイン抗体、及びナノボディからなる群から選択される抗体断片、
    ヒト化抗体、
    ヒト抗体、
    単鎖抗体、
    Fc受容体に対する結合増加及び／又はADCCに対する効力増加を生じさせる改変抗体、並びに
    二重特異性抗体
    からなる群から選択されるか、
    (C) 治療剤に抱合化されているか、
    (D) 治療剤に抱合化されているか（ここで該治療剤は、細胞毒又は放射性同位元素である。）、又は
    (E) 前記抗体が、50nM未満の範囲のEC50でヒトCADM1に結合する、
    請求項1〜3のいずれか1項記載の抗体。
  5. 請求項1〜4のいずれか1項記載の単離された抗体、又はその抗原結合部分、又はその抗体断片を含む、組成物。
  6. 請求項1〜3のいずれか1項記載の抗体、又はその抗原結合部分、又はその抗体断片の、重鎖又は軽鎖をコードする、単離された核酸分子。
  7. 請求項6記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
  8. 請求項7記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  9. 請求項1〜4のいずれか1項記載の抗CADM1抗体又はその抗原結合部分、又はその抗体断片を含む、CADM1を発現する標的細胞に関連する疾患を治療又は予防するための医薬組成物。
  10. 前記疾患が、ヒト癌である、請求項9記載の医薬組成物。
  11. 前記ヒト癌が以下からなる群から選択される、請求項10記載の医薬組成物：小細胞肺癌、成人T細胞白血病、非小細胞肺癌（扁平上皮癌及び腺癌を含む）、メラノーマ、乳癌、結腸直腸癌、卵巣癌、前立腺癌、神経内分泌癌（肺、副腎、下垂体、胃腸管、腎臓、肝臓（肝細胞癌を含む）、膵臓（インスリノーマ及びグルカゴノーマを含む）のものを含む）、グリア芽細胞腫、及びカルチノイド腫瘍（膵臓、肺、胃腸管、肝臓及び腎臓のものを含む）。
  12. 請求項1〜3のいずれか1項記載の抗体、又はその抗原結合部分、又はその抗体断片を発現する、ハイブリドーマ。
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