JP5861873B2

JP5861873B2 - 分光器及び顕微分光システム

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Publication number: JP5861873B2
Application number: JP2012013720A
Authority: JP
Inventors: 良一左高
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2012-01-26
Filing date: 2012-01-26
Publication date: 2016-02-16
Anticipated expiration: 2032-01-26
Also published as: JP2013152179A

Description

本発明は、分光器及び顕微分光システムに関する。

従来の走査型蛍光顕微鏡では、点光源から射出された照明光（励起光）を走査ユニットにより標本上で走査し、この照明光により励起された標本から射出された信号光（蛍光）を走査ユニットでデスキャンした後、分光器の分光素子で分光することにより、分光された信号光をそれぞれの受光器で検出するように構成されている。このような分光器用の分光素子として、回折格子が広く用いられている。この回折格子は、偏光依存性があり、入射光の電場振動方向が回折格子の刻線に平行なＰ偏光成分の光に比べて、回折格子の刻線に垂直なＳ偏光成分の光の方が、一般的に回折効率が高いとされている。特に、入射光の波長が回折格子の周期（刻線のピッチ）と同程度以上の長波長帯域では、上記傾向が顕著に現われる。これは、言い換えると、回折格子の周期が短いものほど上記傾向が顕著に現われ、偏光依存性が高くなるということであり、分解能の高い回折格子を用いる場合には考慮すべき点である。そこで、偏光方向の相違による回折効率の差異を解消するために、信号光をＰ偏光成分の光とＳ偏光成分の光に分離するとともに、Ｐ偏光成分の光をＳ偏光成分の光に変換してこれらの光を回折格子で分光する構成が開示されている（例えば、特許文献１参照）。

米国特許第６４９８８７２号明細書

しかしながら、分離されたＰ偏光成分の光とＳ偏光成分の光とを回折格子の異なる位置に入射させると回折格子が大型化してしまい、また、これらの信号光の少なくとも一部が回折格子上で重なるように入射させると、回折格子の大型化は避けられるが、これらの光の回折格子に対する入射角度が異なるためこの回折格子で分光された分光光を受光器に集光するための集光光学系（例えば、結像レンズや凹面鏡）が２つ必要になり、結果として分光器が大型化してしまうという課題があった。

本発明はこのような課題に鑑みてなされたものであり、分光素子の偏光依存性を考慮しつつ、大型化及びコスト増加を抑えることができる分光器、及びこの分光器を備える顕微分光システムを提供することを目的とする。

前記課題を解決するために、本発明に係る分光器は、信号光を略平行光束とするコリメートレンズと、このコリメートレンズから射出した略平行光束を第１光路及び第２光路の２つの光路に分け、且つ、第１光路中の光をＰ偏光成分とし、第２光路中の光をＳ偏光成分とする偏光分離素子と、第１光路中に配置され、当該第１光路中のＰ偏光成分の光をＳ偏光成分の光とする偏光回転素子と、第１光路及び第２光路の各々の略平行光束の光束径を平行状態を維持しつつ縮小する光路結合部材と、光路結合部材から射出された略平行光束を分光する分光素子と、分光素子で分光された分光光を検出する受光器と、分光素子からの分光光を受光器に集光する集光光学系と、を有することを特徴とする。

また、このような分光器において、光路結合部材は、第１光路から射出する略平行光束を反射する軸外放物面形状の第１の反射面及び第２の反射面から構成される第１のビームエクスパンダと、第２光路から射出する略平行光束を反射する軸外放物面形状の第１の反射面及び第２の反射面から構成される第２のビームエクスパンダと、から構成されている。

また、このような分光器において、光路結合部材は、光束径が縮小された各々の略平行光束を互いに隣接させて射出するように構成されていることが好ましい。

また、このような分光器において、光路結合部材は、当該光路結合部材から射出する各々の略平行光束の全体の径を、コリメートレンズから射出して偏光分離素子に入射する略平行光束の径以下とすることが好ましい。

また、このような分光器において、偏光分離素子は、コリメートレンズから射出した略平行光束が入射する位置に配置され、この略平行光束のうちＰ偏光成分の光を透過して第１光路に導き、Ｓ偏光成分の光を反射する偏光ビームスプリッタと、偏光ビームスプリッタで反射されたＳ偏光成分の光を反射して第２光路に導く平面鏡と、から構成されていることが好ましい。

また、このような分光器において、偏光回転素子は、フレネルロム１／２波長板であることが好ましい。

また、本発明に係る顕微分光システムは、光源から放射された照明光を走査して対物レンズにより標本に照射するとともに、この標本から放射される信号光を対物レンズで集光する顕微鏡と、顕微鏡からの信号光を分光して検出する上述の分光器のいずれかと、を有することを特徴とする。

本発明によれば、分光素子の偏光依存性を考慮しつつ、大型化及びコスト増加を抑えた分光器、及びこの分光器を備える顕微分光システムを提供することができる。

顕微分光システムの構成を示す説明図である。分光器の構成を示す説明図である。上記分光器の要部を示す説明図である。

以下、本発明の好ましい実施形態について図面を参照して説明する。まず、図１を用いて顕微分光システムの構成について説明する。図１に示すように、この顕微分光システム１は、光源系１０、共焦点ユニット２０及び顕微鏡３０を有する共焦点顕微鏡と、分光器４０と、制御部５０と、を有して構成されている。この顕微分光システム１において、共焦点ユニット２０と分光器４０とは、ファイバカプラ２９ａ，２９ｂを介して光ファイバ２８により光学的に接続されている。

光源系１０は、レーザ装置１１と、光ファイバ１３と、ファイバカプラ１２，１４と、を有する。レーザ装置１１は、例えば、レーザーダイオードを備え、目的の波長特性を有するレーザ光（照明光）を射出する。このレーザ光は、光ファイバ１３を介して共焦点ユニット２０に導かれる。なお、図１の例では、照明光として、標本３３を励起して蛍光を発光させるための励起光を射出する。

共焦点ユニット２０は、光源系１０からの照明光を略平行光束とするコリメートレンズ２１と、ダイクロイックミラー２２と、走査ユニット２３と、スキャナレンズ２４と、集光レンズ２５と、ピンホール２６ａを有するピンホール板２６と、リレーレンズ２７と、を有する。また、顕微鏡３０は、第２対物レンズ３１及び対物レンズ３２と、標本３３が載置されるステージ３４と、を有する。これらの共焦点ユニット２０と顕微鏡３０とを組み合わせて走査型共焦点顕微鏡が構成される。なお、ダイクロイックミラー２２は、光源系１０から射出されたレーザ光を顕微鏡３０側に反射し、このレーザ光により励起した標本３３から放射される蛍光（信号光）を透過するように構成されている。また、集光レンズ２５の像側焦点は、ピンホール板２６のピンホール２６ａと略一致するように配置されている。

光源系１０のレーザ装置１１から射出されたレーザ光（照明光）はファイバカプラ１２を介して光ファイバ１３に導入される。さらにこの光ファイバ１３を通ったレーザ光はファイバカプラ１４から共焦点ユニット２０のコリメートレンズ２１に入射する。そして、このレーザ光はコリメートレンズ２１で略平行光に変換された後、ダイクロイックミラー２２で顕微鏡３０側の光路に反射され、直交配置された２つのガルバノミラーからなる走査ユニット２３及びスキャナレンズ２４に導入されて、二次元的に走査される。走査されたレーザ光は、第２対物レンズ３１で略平行光にされた後、対物レンズ３２で標本３３上の１点に集光される。なお、走査ユニット２３により二次元的に走査される標本３３上の位置は、制御部５０により走査ユニット２３を構成するガルバノミラーの動作を制御することにより制御される。そして、このレーザ光（照明光）により励起された標本３３から放射された蛍光（信号光）は、対物レンズ３２で略平行光に変換され、レーザ光（照明光）と逆の経路を辿り、走査ユニット２３でデスキャンされた後、ダイクロイックミラー２２に入射する。さらに、ダイクロイックミラー２２に入射した蛍光はこのダイクロイックミラー２２を透過し、集光レンズ２５によりピンホール板２６のピンホール２６ａ上に集光される。

ピンホール２６ａを通過した蛍光（信号光）は、リレーレンズ２７を経て、ファイバカプラ２９ａから光ファイバ２８に導かれる。リレーレンズ２７を介すると、図１に示すように、ピンホール２６ａを通過した光が、そのままであると発散光束となるところを、再び、集光され、光ファイバ２８の開口端において、見かけ上、小さな開口径でも、有効に（ロスが少なく）入射できるようになる。

ここで、ピンホール２６ａに形成される集光点は標本３３上での光スポットの像となっているため、標本３３上の他の点から発した光がたとえあったとしても、ピンホール２６ａでは像を結ばずピンホール板２６により遮られ、ファイバカプラ２９ａにほとんど到達できない。そのため、このピンホール２６ａを通過できた光のみ、すなわち、上述の光スポットの位置から出た光のみが、リレーレンズ２７を介してファイバカプラ２９ａに到達できる。この結果、走査型共焦点顕微鏡では高い横分解能だけでなく、高い縦分解能を持って標本を観察できる顕微鏡となっている。

ファイバカプラ２９ａに入射した蛍光（信号光）は、光ファイバ２８を通り、ファイバカプラ２９ｂを介して分光器４０に導入される。以下、本実施形態に係る分光器４０の構成について説明する。

図２及び図３に示すように、分光器４０は、ファイバカプラ２９ｂを介して光ファイバ２８から入射する信号光（図１の例では蛍光）を略平行光束とするコリメートレンズ４１と、このコリメートレンズ４１で略平行光束にされた信号光を、Ｐ偏光成分とＳ偏光成分の光に分離し、Ｐ偏光成分の光を第１光路Ｃ１に導き、Ｓ偏光成分の光を第２光路Ｃ２に導く偏光分離素子４２と、第１光路Ｃ１に設けられ、Ｐ偏光成分の光をＳ偏光成分の光に変換する偏光回転素子４３と、第１光路Ｃ１及び第２光路Ｃ２の光の光束径を変えるとともに、これらの光を互いに平行で且つ隣接させて射出する光路結合素子４４と、光路結合素子４４から射出した略平行光束を分光する分光素子である反射型の回折格子４５と、複数の受光素子がアレイ状に並べられてラインディテクタを構成する受光器４７と、回折格子４５から射出された回折光（分光光）を受光器４７の受光面に結像させる集光光学系４６と、を有する。ここで、受光器４７は、３２個のＰＭＴ（光電子倍増管：Photomultiplier Tube）を用いたものである。この複数のＰＭＴは、回折格子４５の複数の刻線が並んでいる方向、つまり回折格子４５の光分散方向（分光方向）に並んでいる。このように、本実施形態では、受光器４７として、複数の検出セル（ＰＭＴ）を持つ光検出アレイを用いているので、複数の波長域の光を同時に検出することができる。なお、図２においては集光光学系４６として凹面鏡（反射光学系）を用いた場合について示しているが、正の屈折力を有するレンズ（屈折光学系）で構成しても良い。

偏光分離素子４２は、コリメートレンズ４１から射出した略平行光束が入射する位置に、この略平行光束の入射角度が略４５°になるように配置された偏光ビームスプリッタ板４２ａと、偏光ビームスプリッタ板４２ａで反射された略平行光束の入射角度が略４５°になるように配置され、この略平行光束を反射する平面鏡４２ｂと、から構成されている。なお、入射角度とは、入射面の法線に対する入射光の角度である。ここで、偏光ビームスプリッタ板４２ａは、平行平板ガラスに誘電体反射コーティングを施したもので、入射する光のうち、Ｓ偏光成分の光を反射し、Ｐ偏光成分の光を透過する性質を有する。そのため、この偏光ビームスプリッタ板４２ａに入射した略平行光束（信号光）のうち、Ｐ偏光成分の光はこの偏光ビームスプリッタ板４２ａを透過して第１光路Ｃ１に導かれ、Ｓ偏光成分の光はこの偏光ビームスプリッタ板４２ａで反射し、さらに、平面鏡４２ｂで反射して第２光路Ｃ２に導かれる。なお、上述したように偏光ビームスプリッタ板４２ａ及び平面鏡４２ｂは、その入射光に対する角度が略４５°になるように配置されているため、第１光路Ｃ１及び第２光路Ｃ２は、略平行に延びて配置されている。なお、以下の説明の都合上、コリメートレンズ４１の光軸と平行な方向をＺ方向、コリメートレンズ４１からの光が偏光ビームスプリッタ板４２ａにより反射される方向とＺ方向とに平行な面内でＺ方向に垂直な方向をＹ方向、Ｙ方向及びＺ方向に垂直な方向をＸ方向とする。

偏光回転素子４３は、例えば、フレネルロム１／２波長板で構成される。このフレネルロム１／２は波長板は、全反射を利用した複屈折素子で、波長依存性が極めて小さく、各種波長の光に対して用いることができる。このフレネルロム１／２波長板では、入射面４３ａから入射した光は、一平面上で４回反射して（平面４３ｂ〜４３ｅで反射して）出射面４３ｆから出射される。このフレネルロム１／２波長板は、入射面４３ａ及び出射面４３ｆがＺ方向に対して垂直で且つ前述の一平面４３ｂ〜４３ｅが図３（ｂ）に示すように、ＺＸ平面に対して４５°を成すように配置されている。このように、偏光回転素子４３としてフレネルロム１／２波長板を設けることにより、偏光ビームスプリッタ板４２ａを通過してＰ偏光成分の光になった信号光（略平行光束）は、このフレネルロム１／２波長板内での全反射１回につき、偏光方向がλ／８分変化して、合計でλ／２分変化し、結果として、Ｓ偏光成分の光に変換される。このＳ偏光成分の光は、コリメートレンズ４１の光軸上、言い換えると、Ｚ方向に平行な方向に進む。

光路結合素子４４は、第１光路Ｃ１に配置された第１のビームエクスパンダ４４１と、第２光路Ｃ２に配置された第２のビームエクスパンダ４４２と、から構成されている。これらの第１及び第２のビームエクスパンダ４４１，４４２の各々は、第１及び第２光路Ｃ１，Ｃ２からの光が入射する位置に配置され、軸外放物面形状を有し、これらの光を反射する第１の反射面４４１ａ，４４２ａと、この第１の反射面４４１ａ，４４２ａに対向するように配置され第１の反射面４４１ａ，４４２ａで反射された光を反射する、軸外放物面形状を有する第２の反射面４４１ｂ，４４２ｂと、からなる２つの軸外放物面で構成されている。また、本実施形態においては、第１の反射面４４１ａ，４４２ａの焦点距離は、第２の反射面４４１ｂ，４４２ｂの焦点距離の略２倍になるように構成されている。そのため、この第２の反射面４４１ｂ，４４２ｂで反射された信号光の光束径は、第１及び第２光路Ｃ１，Ｃ２の光束径の略半分に縮小される。また、本実施形態において第１のビームエクスパンダ４４１に用いられている第２の反射面４４１ｂと第２のビームエクスパンダ４４２に用いられている第２の反射面４４２ｂとは接するようにかつＺ軸と略平行に光を射出するように配置してあるため、回折格子４５への入射時の最大光束径は、偏光分離素子４２に入射するときの光束径と同じである。そのため、コリメートレンズ４１から射出した信号光を偏光分離素子４２により２つの光路に分割して偏光回転素子４３で偏光を揃えても、結果的に光束径が２倍になってしまうことはなく、回折格子４５が大型化することはない。また、光路結合素子４４を射出した第１及び第２光路Ｃ１，Ｃ２の各々を通った信号光は略平行光束であり、回折格子４５に対する入射角が同じであるため、集光光学系４６を２つ用意する必要がなく、分光器４０の大型化を防ぐことができる。なお、本実施形態では第１及び第２のビームエクスパンダ４４１，４４２の光束径の変換倍率を揃えているが、第１のビームエクスパンダ４４１と第２のビームエクスパンダ４４２とで異なる変換倍率にしてもよい。なお、この場合も、回折格子４５への入射時の最大光束径が、偏光分離素子４２に入射するときの光束径以下となることが好ましい。

本実施形態に係る分光器４０を以上のように構成すると、信号光の偏光方向をＳ偏光に揃えることができるため、回折格子４５に入射する信号光の電場振動方向がこの回折格子４５の刻線に対して垂直にすることができるので、回折格子４５の回折効率を高くすることができ、明るい分光光を得ることができる。また、上述したように、光路結合素子４４により回折格子４５に入射する信号光の光束径（第１及び第２光路Ｃ１，Ｃ２を通過した信号光の全体の光束径）がコリメートレンズ４１を射出して偏光分離素子４２に入射する前の光束径より大きくならないようにすることができるため、偏光分離素子４２等を用いて偏光方向を揃えない従来の分光器と同じ大きさの回折格子４５を用いることができる。さらに、光路結合素子４４を射出した信号光は略平行光束であるため、集光光学系４６は１つで良い。そのため、この分光器４０の大型化を防ぐことができる。また、本実施形態に示す分光器４０は光ファイバ２８（ファイバカプラ２９ｂ）を入射端としているので、容易に共焦点顕微鏡に接続することが可能である。すなわち、上述したように一般的な共焦点顕微鏡では光検出をピンホール板２６に接続した光検出器で行っているが、ピンホール２６ａ透過後の光を光ファイバ２８に入射させることで分光器４０への光導入を容易に光ファイバ２８で行うことが可能である。

なお、以上の説明においては、１つの回折格子４５を用いた場合を示したが、波長分解能の異なる複数の回折格子を回転格子台上に配置し、この回転格子台を回転させて、光路結合素子４４から射出した信号光が入射する回折格子を切り替え可能に構成しても良い。回折格子を載せている回折格子台を回転させることで、回折格子の波長分解能を切り替えることができ、また、この回折格子に対する光の入射角度及び出射角度を変えることができるため、アレイ状の受光器４７で検出できる波長領域を変えることができる。

また、以上の説明では、第２光路Ｃ２中に平面鏡４２ｂを設けたが、第１光路Ｃ１中に平面鏡を設けても良いことは言うまでもない。また、以上の実施形態では、回折格子４５で分光された光を凹面鏡からなる集光光学系４６で集光した後、受光器４７で受光しているが、この受光器４７の代わりに、特定の波長域の光を出射する出射スリットを設けても良い。

また、以上の説明では、偏光分離素子４２にいわゆる平面型の偏光ビームスプリッタである偏光ビームスプリッタ板４２ａを設けた場合について説明したが、プリズム型やウェッジ基板型の偏光ビームスプリッタを用いることも可能である。

１顕微分光システム３０顕微鏡３２対物レンズ
４０分光器４１コリメートレンズ
４２偏光分離素子４２ａ偏光ビームスプリッタ板４２ｂ平面鏡
４３偏光回転素子４４光路結合部材
４４１第１のビームエクスパンダ
４４１ａ第１の反射面４４１ｂ第２の反射面
４４２第２のビームエクスパンダ
４４２ａ第２の反射面４４２ｂ第２の反射面
４５回折格子４６集光光学系４７受光器

Claims

信号光を略平行光束とするコリメートレンズと、
前記コリメートレンズから射出した前記略平行光束を第１光路及び第２光路の２つの光路に分け、且つ、前記第１光路中の光をＰ偏光成分とし、前記第２光路中の光をＳ偏光成分とする偏光分離素子と、
前記第１光路中に配置され、当該第１光路中の前記Ｐ偏光成分の光をＳ偏光成分の光とする偏光回転素子と、
前記第１光路及び前記第２光路の各々の前記略平行光束の光束径を平行状態を維持しつつ縮小する光路結合部材と、
前記光路結合部材から射出された前記略平行光束を分光する分光素子と、
前記分光素子で分光された分光光を検出する受光器と、
前記分光素子からの前記分光光を前記受光器に集光する集光光学系と、を有し、
前記光路結合部材は、
前記第１光路から射出する前記略平行光束を反射する軸外放物面形状の第１の反射面及び第２の反射面から構成される第１のビームエクスパンダと、
前記第２光路から射出する前記略平行光束を反射する軸外放物面形状の第１の反射面及び第２の反射面から構成される第２のビームエクスパンダと、から構成されていることを特徴とする分光器。
前記光路結合部材は、光束径が縮小された各々の前記略平行光束を互いに隣接させて射出するように構成されていることを特徴とする請求項１に記載の分光器。
前記光路結合部材は、当該光路結合部材から射出する各々の前記略平行光束の全体の径を、前記コリメートレンズから射出して前記偏光分離素子に入射する前記略平行光束の径以下とすることを特徴とする請求項１または２に記載の分光器。
前記偏光分離素子は、前記コリメートレンズから射出した前記略平行光束が入射する位置に配置され、前記略平行光束のうちＰ偏光成分の光を透過して前記第１光路に導き、Ｓ偏光成分の光を反射する偏光ビームスプリッタと、
前記偏光ビームスプリッタで反射された前記Ｓ偏光成分の光を反射して前記第２光路に導く平面鏡と、から構成されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の分光器。
前記偏光回転素子は、フレネルロム１／２波長板であることを特徴する請求項１〜４のいずれか一項に記載の分光器。
光源から放射された照明光を走査して対物レンズにより標本に照射するとともに、前記標本から放射される信号光を前記対物レンズで集光する顕微鏡と、
前記顕微鏡からの前記信号光を分光して検出する請求項１〜５のいずれか一項に記載の分光器と、を有することを特徴とする顕微分光システム。