JP2005345561A

JP2005345561A - 走査型レーザ顕微鏡装置

Info

Publication number: JP2005345561A
Application number: JP2004162288A
Authority: JP
Inventors: Nobuhiro Kita; 信浩北
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2004-05-31
Filing date: 2004-05-31
Publication date: 2005-12-15

Abstract

【課題】簡易な構成でコンントラストの良い蛍光画像が取得できる走査型レーザ顕微鏡装置を提供すること。
【解決手段】レーザ光源１０からレーザ光を出射し、レーザ光を試料６３に照射しつつ走査し、試料６３から発する蛍光を検出して蛍光画像を取得する走査型レーザ顕微鏡装置１００において、レーザ光源１９と試料６３との間の光路上に配置され、試料６３から反射されたレーザ光と試料６３から発した蛍光とを偏光状態の違いによって分離する偏光ビームスプリッタ４，１／４波長板６１を備える。
【選択図】図１

Description

本発明は、試料にレーザ光を照射しつつ走査し、試料から発する蛍光を検出して蛍光画像を取得する走査型レーザ顕微鏡装置に関するものである。

従来、励起光であるレーザ光を試料に照射しつつ走査し、試料から発する蛍光画像を取得する走査型レーザ顕微鏡が多用されている。ところで、近年、蛍光試薬の種類の増加とともに様々な検出ファクターの測定が望まれている。この検出ファクターとして、蛍光色素毎の蛍光画像の取得、蛍光スペクトルの定量化等がある。このような種々の検出ファクターを測定するには、試料から発する蛍光のみを抽出し、試料で反射される励起光を排除する必要がある。そのため、光の回折効果を利用して励起光と蛍光とを分離する音響光学素子（ＡＯＴＦ：Acousto-Optic Tunable Filter）を用いる方法が提示されている（特許文献１参照）。

特開２００３−１７７３２号公報

しかしながら、ＡＯＴＦは、波長の差によって回折分光し、励起光と蛍光とを分離するが、励起光の光強度が蛍光の光強度に比して非常に強いため、回折分光した蛍光成分に励起光成分が漏れ入る。蛍光の光強度は、励起光の光強度に比して微弱であるため、蛍光成分に励起光成分が漏れ入ると、コントラストが悪い蛍光画像しか取得できないという問題点があった。

本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、簡易な構成によって試料で反射される励起光を排除し、コントラストの良い蛍光画像が取得できる走査型レーザ顕微鏡装置を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、請求項１にかかる走査型レーザ顕微鏡装置は、レーザ光源からレーザ光を出射し、前記レーザ光を試料に照射しつつ走査し、前記試料から発する蛍光を検出して蛍光画像を取得する走査型レーザ顕微鏡装置において、前記レーザ光源と前記試料との間の光路上に配置され、前記試料から反射された前記レーザ光と前記試料から発した蛍光とを偏光状態の違いによって分離する分離手段を備えたことを特徴とする。

また、請求項２にかかる走査型レーザ顕微鏡装置は、上記の発明において、前記分離手段は、偏光ビームスプリッタと１／４波長板との組合わせであることを特徴とする。

また、請求項３にかかる走査型レーザ顕微鏡装置は、上記の発明において、前記光路上に配置され、光の波長によって回折分光を行う回折手段をさらに備えたことを特徴とする。

また、請求項４にかかる走査型レーザ顕微鏡装置は、上記の発明において、前記回折手段は、音響光学素子であることを特徴とする。

本発明にかかる走査型レーザ顕微鏡装置は、偏光ビームスプリッタと１／４波長板とを組合わせて光路上に配置することによって、簡易な構成でコントラストの良い蛍光画像が取得できるという効果を奏する。

以下に添付図面を参照して、この発明にかかる走査型レーザ顕微鏡装置の好適な実施の形態を詳細に説明する。

（実施の形態）
図１は、この発明の実施の形態である走査型レーザ顕微鏡装置１００の概要構成を示すブロック図である。図１において、この走査型レーザ顕微鏡装置１００は、光源部１と、音響光学素子（ＡＯＴＦ）２と、共焦点光学部３と、偏光ビームスプリッタ４と、走査光学部５と、顕微鏡部６と、検出器７Ａ，７Ｂと、信号処理部８と、制御部９とを有している。さらに、光源部１は、レーザ光源１０と、コリメータレンズ１１とを有し、共焦点光学部３は、共焦点レンズ３０と、共焦点ピンホール３１と、共焦点レンズ３２とを有し、走査光学部５は、ガルバノミラー５０を有し、顕微鏡部６は、結像レンズ６０と、１／４波長板６１と、対物レンズ６２とを有している。

まず、レーザ光源１０から励起光である波長５８０ｎｍのレーザ光が出射され、出射されたレーザ光は、ＡＯＴＦ２、共焦点光学部３、偏光ビームスプリッタ４、走査光学部５を順次介して顕微鏡部６に入射する。顕微鏡部６に入射したレーザ光は、結像レンズ６０、１／４波長板６１、対物レンズ６２を順次介して試料６３に入射する。試料６３に入射したレーザ光は、試料６２を励起し、試料６２から波長６００ｎｍの蛍光が発光する。蛍光は、対物レンズ６２、１／４波長板６１、結像レンズ６０を順次介して顕微鏡部６から出射し、走査光学部５、偏光ビームスプリッタ４、共焦点光学部３を順次介してＡＯＴＦ２に入射する。ＡＯＴＦ２に入射した蛍光は、±１次に回折分光され、＋１次に回折分光された蛍光は、検出器７Ａに入射し、−１次に回折分光された蛍光は、検出器７Ｂに入射する。検出器７Ａ，７Ｂは、入射した蛍光を電気信号に変換して信号処理部８に出力する。信号処理部８は、入力した電気信号を加算し、加算した加算信号を制御部９に出力する。制御部９は、入力した加算信号を画像信号に変換し、表示部１２に出力し、表示部１２は、入力した画像信号を蛍光画像として出力表示する。

ところで、試料６３を照射したレーザ光の大部分は、試料６３を透過するが、一部は、試料６３で反射され、試料６３から発した蛍光とともにＡＯＴＦ２まで逆行する。ＡＯＴＦ２は、入射した光を回折現象によって回折分光し、回折分光する光の波長を可変できる機能を有している。したがって、複数の蛍光色素で染色した試料６３から複数の異なる波長の蛍光を同時に選別し、蛍光色素毎に蛍光画像を取得する場合に多用される。図２は、ＡＯＴＦ２の回折効率ηを示す特性図である。図２に示すように、例えば蛍光波長λ０が６００ｎｍであり、蛍光波長λ０の回折効率η_EMを１とした場合、励起光波長５８０ｎｍの回折効率η_EXは、１／１００となる。したがって、ＡＯＴＦ２は、蛍光を抽出するものの、蛍光に対して１／１００の比で励起光も抽出することになる。励起光の光強度は、蛍光の光強度に対して非常に強いため、励起光の回折効率η_EXが蛍光の回折効率η_EMの１／１００になったとしても、蛍光画像のコントラストを悪化させる要因になる。

図３は、偏光ビームスプリッタ４と１／４波長板６１とを組合わせて配置することによって、ＡＯＴＦ２に入射する前の段階で励起光と蛍光とを分離する過程を示す模式図である。図３において、試料６３に入射する励起光を入射励起光Ａ１とし、試料６３で反射された励起光を反射励起光Ａ２とし、試料６３から発した蛍光を蛍光Ｂとした場合、まず、レーザ光源１０から出射されたレーザ光は、入射励起光Ａ１として偏光ビームスプリッタ４に入射する。入射励起光Ａ１は、直線偏光であり、入射励起光Ａ１の偏光方向は、偏光ビームスプリッタ４を透過するように整合されている。このため、入射励起光Ａ１は、偏光ビームスプリッタ４を透過し、１／４波長板６１に入射する。また、１／４波長板６１の向きは、入射励起光Ａ１を右回転の円偏光に変換するように整合されている。このため、入射励起光Ａ１は、１／４波長板６１によって、右回転の円偏光に変換され、試料６３に入射する。試料６３に入射した入射励起光Ａ１の大部分は、試料６３に吸収されるが、一部は、試料６３で反射され、反射励起光Ａ２となる。

反射励起光Ａ２は、試料６３で反射されると、円偏光の回転方向が反転し、左回転の円偏光となる。左回転の円偏光となった反射励起光Ａ２は、１／４波長板６１に入射する。１／４波長板６１は、入射した反射励起光Ａ２を直線偏光に変換する。したがって、１／４波長板６１に入射した入射励起光Ａ１と１／４波長板６１から出射する反射励起光Ａ２との位相差は、π／２になり、入射励起光Ａ１と反射励起光Ａ２との偏光角は、９０°異なる。したがって、反射励起光Ａ２は、入射励起光Ａ１と９０°異なった直線偏光光となって偏光ビームスプリッタ４に入射する。偏光ビームスプリッタ４は、入射励起光Ａ１が透過するように整合されているため、偏光角が入射励起光Ａ１と９０°異なる反射励起光Ａ２を反射する。この結果、偏光ビームスプリッタ４まで入射励起光Ａ１と同じ光路を逆行した反射励起光Ａ２は、偏光ビームスプリッタ４によって分離される。しかし、上述の原理にも係わらず、偏光ビームスプリッタ４を透過する反射励起光Ａ２が存在し、反射励起光Ａ２の反射と透過との比率は、一般的に１：１／１００〜１／５００程度である。

また、図３において、入射励起光Ａ１の照射によって試料６３は励起され、試料６３から蛍光が発せられる。試料６３から発した蛍光を蛍光Ｂとした場合、蛍光Ｂは、ランダム偏光であり、１／４波長板６１を通過しても、ランダム偏光に変化なく、偏光ビームスプリッタ４に入射する。偏光ビームスプリッタ４は、入射した蛍光Ｂを直交するＰ偏光成分の光とＳ偏光成分の光とに分離し、Ｓ偏光成分の光を反射し、Ｐ偏光成分の光を透過する。蛍光Ｂは、ランダム偏光であるため、偏光ビームスプリッタ４によって、蛍光Ｂの１／２は、透過蛍光Ｂ１となり、蛍光Ｂの１／２は、反射蛍光Ｂ２となる。したがって、偏光ビームスプリッタ４を透過し、ＡＯＴＦ２に入射する蛍光Ｂの入射比率は、１／２となる。

つまり、試料６３で反射された励起光は、偏光ビームスプリッタ４によって、１／１００〜１／５００に減衰され、ＡＯＴＦ２によって、さらに１／１００に減衰される。したがって、試料６３で反射された励起光は、１／１０，０００〜１／５０，０００に減衰されて検出器７Ａ，７Ｂに入射し、蛍光は、偏光ビームスプリッタ４によって１／２に減衰されて検出器７Ａ，７Ｂに入射する。

この結果、検出器７Ａ，７Ｂに入射する蛍光と励起光との入射比率は、１／２：１／１０，０００〜１／２：５０，０００＝１：１／５，０００〜１：１／２５，０００となる。従来、検出器７Ａ，７Ｂに入射する蛍光と励起光との入射比率は、１：１／１００であることから、この発明によれば、蛍光が相対的に５０〜２５０倍明るくなり、コントラストの良い蛍光画像が取得できる。

この実施の形態では、偏光ビームスプリッタ４と１／４波長板６１とを組み合わせてレーザ光上に配置することによって、検出器７Ａ，７Ｂに入射する励起光を減衰させ、コントラストのよい蛍光画像が取得できるようにしている。

なお、この実施の形態では、偏光ビームスプリッタ４を透過した蛍光を検出器７Ａ，７Ｂに入射するようにして、偏光ビームスプリッタ４を透過する反射励起光Ａ２を減衰するようにしていたが、偏光ビームスプリッタ４で反射された蛍光を検出器７Ａ，７Ｂに入射し、偏光ビームスプリッタ４で反射される反射励起光Ａ２を減衰するようにしてもよい。また、１／４波長板６１は、入射した入射励起光Ａ１を右回転の円偏光に変換していたが、左回転の円偏光に変換するようにしてもよい。

この発明の実施の形態にかかる走査型レーザ顕微鏡装置を示す機能ブロック図である。この発明の実施の形態にかかるＡＯＴＦの特性を示すグラフである。この発明の実施の形態にかかる偏光ビームスプリッタと１／４波長板との働きを示す模式図である。

符号の説明

１光源部
２ＡＯＴＦ
３共焦点光学部
４偏光ビームスプリッタ
５走査光学部
６顕微鏡部
７Ａ，７Ｂ検出器
８信号処理部
９制御部
１０レーザ光源
１１コリメータレンズ
１２表示部
３０レンズ
３１共焦点ピンホール
３２共焦点レンズ
５１ガルバノミラー
６０結像レンズ
６１１／４波長板
６２対物レンズ
６３試料
１００走査型レーザ顕微鏡装置

Claims

レーザ光源からレーザ光を出射し、前記レーザ光を試料に照射しつつ走査し、前記試料から発する蛍光を検出して蛍光画像を取得する走査型レーザ顕微鏡装置において、
前記レーザ光源と前記試料との間の光路上に配置され、前記試料から反射された前記レーザ光と前記試料から発した蛍光とを偏光状態の違いによって分離する分離手段を備えたことを特徴とする走査型レーザ顕微鏡装置。
前記分離手段は、偏光ビームスプリッタと１／４波長板との組合わせであることを特徴とする請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡装置。
前記光路上に配置され、光の波長によって回折分光を行う回折手段をさらに備えたことを特徴とする請求項１または２に記載の走査型レーザ顕微鏡装置。
前記回折手段は、音響光学素子であることを特徴とする請求項３に記載の走査型レーザ顕微鏡装置。