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JP5848028B2 - ２’−デオキシヌクレオシドの製造方法 - Google Patents

２’−デオキシヌクレオシドの製造方法 Download PDF

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Description

本発明は、２'−デオキシヌクレオシドの製造方法に関する。
近年、抗生物質、抗ウイルス薬、アンチセンス医薬の原料等として、２'−デオキシヌクレオシド類が利用されている。２'−デオキシヌクレオシド類の一つであるチミジンは、２−デヒドロ―３−デオキシグルコン酸を基質として２−デオキシリボースを合成し、２−デオキシリボースのリン酸化反応により合成した２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステルからのリン酸転移反応及びグリコシル化反応により得られることが知られている。
２−デオキシリボースの酵素反応による製造方法は知られている。例えば、特許文献１には、２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸、２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸ナトリウム又は２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸カリウムを出発物質として、酵素的脱カルボキシル化反応により２−デオキシ−Ｄ−リボースが得られることが記載されている。
２−デオキシリボースの酵素反応に用いられる酵素の一つとして、ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．７）が挙げられる。特許文献１には、２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸又はその塩を出発原料として、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼを用いた脱カルボキシル化反応により２−デオキシリボースが得られることが記載されている。
また、従来、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来のベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼを変異させる技術も知られている。非特許文献１には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼの４６０番目のアラニン、又は／及び、４６４番目のフェニルアラニンを置換したい変異体を用いて、分岐状の側鎖を持つケト酸などを反応させた結果が記載されている。
非特許文献２には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼの４７６番目のロイシン、又は、３６５番目のメチオニンをロイシンに置換した変異体をベンゾホルメートやベンズアルデヒド誘導体とアセトアルデヒドとのカルボライゲーション反応に用いることが記載されている。
非特許文献３には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼの２４番目のプロリン、４６０番目のアラニン、又は、４６１番目のロイシンを置換した変異体を、それぞれ、ベンズアルデヒド誘導体と脂肪族アルデヒドとのカルボライゲーション反応に用いることが記載されている。
非特許文献４には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来のベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼでは、２８１番目のヒスチジンをアラニンに置換すると（Ｒ）−マンデル酸に対するｋｃａｔ値が減少したことが記載されている。
非特許文献５には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来のベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼの２８１番目のヒスチジンをフェニルアラニンに置換した場合、ベンゾイルホルメートに対するｋｃａｔ値が１／５に低下したこと、及び、チロシンに置換した場合、１／４６にまで低下したことがそれぞれ記載されている。
また、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステルの酵素反応による製造方法も知られている。この酵素反応に用いられる酵素の一つとして、酸性ホスファタ−ゼ（ＥＣ３．１．３．２）が挙げられる。特許文献２には、ペント−スを出発原料として、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来の酸性ホスファタ−ゼを用いたリン酸化反応によりペント−ス−５−リン酸エステルが得られることが記載されている。
また、従来、酸性ホスファタ−ゼを変異させる技術も知られている。特許文献３には、各種微生物由来の酸性ホスファタ−ゼの７２番目のグリシンをアスパラギン酸へ、又は／及び、１５１番目のイソロイシンをスレオニンへ置換した変異体を用いて、ヌクレオシド類をリン酸化反応させた結果が記載されている。
特許文献４には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｂｌａｔｔａｅ由来の酸性ホスファタ−ゼ、又は／及び、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ由来の酸性ホスファタ−ゼの様々なアミノ酸を置換した変異体をヌクレオシド類のリン酸化反応に用いることが記載されている。
特許文献５には、各種微生物由来の酸性ホスファタ−ゼの様々なアミノ酸を置換した変異体をヌクレオシド類のリン酸化反応に用いることが記載されている。
特許文献６には、ヌクレオシドホスホリラーゼ存在下に、ペントース−１−リン酸からヌクレオシドを製造する方法が記載されている。特許文献６では、リン酸イオンと難水溶性の塩を形成しうる金属カチオンを反応液に存在させることで、反応の副生成物であるリン酸イオンが難水溶性の塩として沈殿し反応系外に除外し、反応の平衡をヌクレオシド化合物合成方向へ移動させて、反応転化率を向上させることが記載されている。
特許文献７には、デオキシリボース１−リン酸と核酸塩基とを反応させて、デオキシリボヌクレオシドと無機リン酸とを生成するデオキシリボヌクレオシドの酵素的合成法において、生成する無機リン酸を酢酸バリウムによって沈澱させながら、大腸菌由来ホスホペントムタ−ゼおよびプリンヌクレオシドホスホリラ−ゼを用いて、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸とアデニンから２'−デオキシアデノシンを合成したことが記載されている。
特許文献８には、バチルス属細菌由来ホスホペントムタ−ゼおよびヌクレオシドホスホリラ−ゼを用いて、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸とヒポキサンチンから２'−デオキシイノシンを合成したことが記載されている。
特表２００７−５２７８５５号公報 国際公開第２００５／０４５０５２号パンフレット 特開２００１−２４５６７６号公報 特開２００１−１３６９８４号公報 特開平１０−２０１４８１号公報 特開２００２−３４５４９７号公報 特表２００３−５０７０７１号公報 特開２００２−９５４９４号公報
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ｖｏｌ．１８，ｎｏ．７，ｐｐ．３４５−３５７，２００５ ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，２００３，４，７２１−７２６ ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，２００８，９，４０６−４１２ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，４２，１８２０−１８３０ ＰＮＡＳ，２００８，ｖｏｌ．１０５，ｎｏ．１５，５７３３−５７３８
しかしながら、上記文献記載の技術は、以下の点で改善の余地を有していた。
上記特許文献１記載の反応では、副生する二酸化炭素の影響で反応液のｐＨが変動する。この変動を抑制するため、ｐＨ調整が必要であり、その方法として酸を添加する方法や緩衝液を反応溶媒として用いる方法がある。これらの反応方法は、低収率であり、また反応基質である２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸濃度が低く工業的製造に適しているとは言い難い。
また、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸塩由来のナトリウムカチオン又はカリウムカチオンと、副生する二酸化炭素との反応により生成する炭酸ナトリウム又は炭酸カリウム、及び、ｐＨ調整として用いる酸との反応により生成するナトリウム塩又はカリウム塩は、水に対する溶解度が高い。このため、これらの塩の除去には、イオン交換樹脂の使用などが必要であり、工業的に効率よく２−デオキシリボースを精製することは困難である。
また、特許文献１の技術では、生成した２−デオキシリボースは定量されておらず、推測されている生成物濃度では工業的に用いるには十分といえる反応収率ではない。
非特許文献１〜５には、２−デオキシリボースのように側鎖に水酸基を有する化合物に対する基質特異性の改変による活性向上を示した例は記載されておらず、複数の水酸基を有する化合物に対して活性中心のどのアミノ酸が活性向上に有効であるかは明らかにされていない。
以上のように、効率の良い２−デオキシリボースの工業的製造方法は確立されていない。
また、特許文献２の技術では、２−デオキシリボ−スからの２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステルの生成収率が低く、工業的に用いるには十分ではない。
特許文献３〜５には、２−デオキシリボ−スに対する基質特異性の改変による活性向上を示した例は記載されておらず、２−デオキシリボ−スに対してどのアミノ酸が活性向上に有効であるかは明らかにされていない。
またこれらの技術においては、大量にリン酸が排出されるため、その処理に膨大なコストがかかる。特許文献２には、リン酸共与体がペント−スに対して多く存在しすぎると、リン酸の産業廃棄物が多く発生してしまいプロセス上好ましくないことから、リン酸共与体がペント−スに対して３倍モル以上７倍モル以下存在する条件下で行われることが記載されている。しかしながら、工業的には、さらにリン酸共与体の使用量を低減して、リン酸の産業廃棄物をより低減できる技術が求められる。
特許文献６〜８の技術においても、２'−デオキシヌクレオシドの工業生産の効率化という観点から、さらなる改善の余地がある。
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、高収率で生産性がよく工業化に適した２'−デオキシヌクレオシドの製造方法を提供することである。
本発明によれば、
少なくとも下記（i）を実行することにより、２−デオキシリボースを経由して２'−デオキシヌクレオシドを製造する２'−デオキシヌクレオシドの製造方法であって、
（i）２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩を、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩に対する脱カルボキシル化能を有する脱カルボキシル化酵素による脱カルボキシル化反応に付して２−デオキシリボースを合成する、
前記脱カルボキシル化酵素は、ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼであり、
前記二価金属塩は、カルシウム、ストロンチウム及びバリウムからなる群から選択される少なくとも１種の二価金属の塩であり、
前記脱カルボキシル化酵素が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来のベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼまたはＣｈｒｏｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ属由来のベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼである、２'−デオキシヌクレオシドの製造方法が提供される。
本発明によれば、少なくとも上記（i）を実行するため、２−デオキシリボースを経由して２'−デオキシヌクレオシドを効率よく合成することができ、工業生産に適した２'−デオキシヌクレオシドの製造方法が実現可能となる。
ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼのアミノ酸配列を比較した結果を示す図である。 ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼの活性部位を示す図である。 酸性ホスファタ−ゼのアミノ酸配列を比較した結果を示す図である。網掛けの箇所は共通配列の箇所を示す。 実験例を示す図である。 実施例を示す図である。 （ａ）及び（ｂ）は、実施例を示す図である。 （ａ）及び（ｂ）は、実施例を示す図である。 （ａ）及び（ｂ）は、実施例を示す図である。 （ａ）及び（ｂ）は、実施例を示す図である。 実施例を示す図である。 実施例を示す図である。 実施例を示す図である。 実施例を示す図である。 実施例を示す図である。 実施例を示す図である。 実施例を示す図である。 実施例を示す図である。 実施例を示す図である。
以下、本発明の実施の形態について、説明する。本発明は、２−デオキシリボースを経由して２'−デオキシヌクレオシドを製造する方法である。本発明の方法では、少なくとも下記（i）、（ii）及び（iii）のいずれかを実行する。
（i）２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩を酵素による脱カルボキシル化反応に付して２−デオキシリボ−スを合成する；
（ii）基質ポケットを形成するアミノ酸残基が野生型と比して少なくとも一つ以上変異している２−デオキシリボ−ス合成能を有する変異型酵素を使用して、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸又はその塩から２−デオキシリボ−スを合成する；
（iii）２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成能を有する野生型酵素に対して少なくとも配列表の配列番号１で示す配列の５７番目、６８番目、８９番目、１２２番目、１２６番目、１３０番目、１３１番目、１３６番目、１７１番目及び１９７番目のいずれかに相当するアミノ酸の１つ以上の変異を含み、かつ、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成能を有する変異型酵素を使用して２−デオキシリボ−スから２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル又はその塩を合成し、得られる２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル又はその塩から２'−デオキシヌクレオシドを合成し、
前記野生型酵素は、下記のアミノ酸配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）を有し、前記野生型酵素において、前記アミノ酸配列（ｂ）は、少なくとも１以上のアミノ酸を介して、アミノ酸配列（ａ）とアミノ酸配列（ｃ）とを連結し、前記アミノ酸配列（ｃ）は、少なくとも１以上のアミノ酸を介して、アミノ酸配列（ｂ）とアミノ酸配列（ｄ）とを連結している。
（ａ）ＧＳＩＸＦＬＮＤＱＡＭＹＥＸＧＲ
（ｂ）ＤＡＯＬ（Ａ／Ｓ）ＸＧＧＶＡＸＸＦＳＸＡＦＧＪＰＩ
（ｃ）ＫＬＬＴＮＭＩＥＤＡＧＤＬＡＴＲ（Ｓ／Ｇ）ＡＫＢＸＹＭＲＩＲＰＦＡＦＹＧ
（ｄ）ＮＧＳＹＰＳＧＨＴＸＩＧＷＡＪＡＬＶＬＸＥＵＮＰＸＸＱＯＸＩＬＫＲＧＹＺＬＧＸＳＲＶＩＣＧＹＨＷＱＳＤＶＤＡＡＲ
［アミノ酸配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）中、Ｂは、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり、Ｊは、セリン、トレオニン又はチロシンであり、Ｕは、バリン、ロイシン又はイソロイシンであり、Ｏは、アスパラギン酸又はアスパラギンであり、Ｚは、グルタミン酸又はグルタミンであり、Ｘは任意のアミノ酸である。アミノ酸配列（ｂ）中、Ａ／Ｓは、アラニン又はセリンであることを示し、（ｃ）中、Ｓ／Ｇは、セリン又はグリシンであることを示す。］
＜第１の実施形態＞
本実施形態は、上記（i）を実行して２'−デオキシヌクレオシドを製造するものである。具体的には、本実施形態は、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩を用いた酵素による脱カルボキシル化反応を行い、得られた２−デオキシリボ−スを中間体として、２'−デオキシヌクレオシドを製造する方法である。
（２―デヒドロ―３―デオキシグルコン酸から２―デオキシリボースの合成）
本実施形態では、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩を用いて、２−デオキシリボースを合成する。
二価金属には、遷移金属と周期表第２族に属する金属とがあり、遷移金属にはマンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛があり、周期表第２族に属する金属には、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウムがある。２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩に好適な二価金属は、周期表第２族に属する金属であり、より好ましくはカルシウム、ストロンチウム、バリウムである。二価金属は、一種又は二種以上併用してもよい。
本実施形態で実行する脱カルボキシル化反応は、酵素反応により脱カルボキシル化反応を実行する。本実施の形態の脱カルボキシル化反応において用いられる酵素は、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩に対する脱カルボキシル化能を有する脱カルボキシル化酵素であれば特に制限はなく使用することができ、例えば、ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するものを使用することができる。具体的には、種々の微生物由来のケト酸デカルボキシラーゼを使用することができる。中でも、ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼ（ＥＣ４・１・１・７）を用いることが好ましく、例えば、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００３１８６９１４）、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００２４２７１４７）、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００２７５４４１１）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００２５４６７１３）、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＮＰ＿７７４２４３）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｎｅｎｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＺＰ＿０５９１５３５２）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｒｉａ ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００１５７８９０６）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｘｅｎｏｖｏｒａｎｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿５５５１５１）、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＮＰ＿９０２７７１）、Ｃｈｒｏｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿５７２３７０）、Ｄｅｌｆｔｉａ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００１５６２５７４）、Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｓ ｎｅｐｔｕｎｉｕｍ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＡＢＩ７５６７５）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００２３６３２１９）、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ａｕｒａｎｔｉａｃａ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＥＦＡ３４３４８）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿８８５９８５）、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿４９６９５３）、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿９８１２６１）、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＺＰ＿０３３１９４７９）、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｔｕａｒｔｉｉ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＺＰ＿０２９６１３１３）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＮＰ＿２５３５８８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿２６０５８１）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＡＢＮ８０４２３）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＡＡＣ１５５０２）、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿７２５６２２）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊｏｓｔｉｉ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿７０２９４６）、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＮＰ＿９４６９５５）、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００１１０５３４５）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＮＰ＿６３１４８６）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＺＰ＿０５５２１７０１）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＣＡＱ５２６１７）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＮＰ＿３４３０７０）、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＮＰ＿３９３９７６）、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ｖｏｌｃａｎｉｕｍ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＮＰ＿１１１７１６）に由来するベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼを用いることができる。また、ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子において、１若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入または転移を含んでいたとしても、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩に対する脱カルボキシル化能を有していれば使用することができる。
酵素的脱カルボキシル化反応において使用されるケト酸デカルボキシラーゼは、ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有する菌体の培養液そのものや、該培養液より遠心分離によって分離、回収して得られる形質転換細胞、該形質転換細胞の菌体処理物の形で利用することもできる。ここでいう菌体処理物とは、該形質転換細胞の抽出物や破砕物、該抽出物や破砕物のケト酸デカルボキシラーゼ活性画分を分離・精製して得られる分離物、該形質転換細胞や該形質転換細胞の抽出物、破砕物、分離物を適当な担体を用いて固定化した固定化物が含まれる。
酵素的脱カルボキシル化反応のｐＨ値は、脱カルボキシル化酵素がその活性を維持できればよく、特に制限はないが、ｐＨ５以上８以下の範囲で行うことが好ましく、ｐＨ６以上７．５以下の範囲で行うことがより好ましい。
酵素的脱カルボキシル化反応の反応温度は、脱カルボキシル化酵素がその活性を維持できればよく、特に制限はないが、３０℃以上６０℃以下の範囲で行うことが好ましく、４０℃以上５０℃以下の範囲で行うことがより好ましい。
酵素的脱カルボキシル化反応の反応基質である２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の濃度は、脱カルボキシル化酵素が阻害を受けない濃度であればよく、特に制限はないが、反応液全量に対して９重量％以上２５重量％以下の範囲で行うことができる。本実施形態における酵素的脱カルボキシル化反応は、基本的に水を溶媒とするが、必要に応じ反応系にアルコールやジメチルスルホキシドなど通常の酵素反応に用いられる有機溶媒を適量添加しても良い。
２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩は、例えば、市販されたグルコン酸の二価金属塩を、脱水酵素による酵素的脱水反応に付することにより得ることができる。
前述のとおり、二価金属には、遷移金属と周期表第２族に属する金属とがあり、遷移金属にはマンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛があり、周期表第２族に属する金属には、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウムがある。グルコン酸の二価金属塩に好適な二価金属は、周期表第２族に属する金属であり、より好ましくはカルシウム、ストロンチウム、バリウムである。二価金属は、一種又は二種以上併用してもよい。
グルコン酸の二価金属塩から２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩を合成する反応に用いられる脱水酵素は、具体的には、グルコン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素を用いることができる。中でも好適な酵素は、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓに由来する酵素である（特開２００５−４０１３０号公報）。
グルコン酸の二価金属塩からの２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩の合成反応のｐＨ値は、脱水酵素がその活性を維持できればよく、特に制限はないが、ｐＨ５以上９以下の範囲で行うことが好ましく、ｐＨ７以上９以下の範囲で行うことがより好ましい。
グルコン酸の二価金属塩からの２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩の合成反応の反応温度は、脱水酵素がその活性を維持できればよく、特に制限はないが、３０℃以上６０℃以下の範囲で行うことが好ましく、３０℃以上５０℃以下の範囲で行うことがより好ましい。
グルコン酸の二価金属塩から２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩を合成する反応を行うときのグルコン酸の二価金属塩の濃度は、脱水酵素が阻害を受けない濃度であればよく、特に制限はないが、反応液全量に対して１０重量％以上２７重量％以下の範囲が好ましい。
また、酵素的脱水反応によりグルコン酸の二価金属塩から２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩を合成する反応と、酵素的脱カルボキシル化反応により２−デヒドロ−３−デオキシ−グルコン酸の二価金属塩から２−デオキシリボースの合成する反応とは、ワンポット反応により行ってもよい。ワンポット反応とは、一つの反応容器を用いて多段階反応を行うことを意味し、一つの反応容器で多段反応を一度に行うこと、一つの反応中に次の反応を行うこと及び一つの反応が終わった後にこれを原料として同じ反応容器内で次の反応を行うことを含む。
ワンポット反応における脱水酵素は、グルコン酸を脱水して２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸を合成することができれば特に制限はなく、例えばグルコン酸デヒドラターゼであり、好ましくはＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ由来グルコン酸デヒドラターゼである。
ワンポット反応における変異型２−デオキシリボース合成酵素は、前記の脱カルボキシル化酵素を用いることができる。
グルコン酸の二価金属塩の脱水反応と、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩の脱カルボキシル化反応とのワンポット反応は、脱水酵素と脱カルボキシル化酵素との共存下に実行することができる。両酵素の反応液への添加方法は、反応初期に両酵素を全量添加する方法、反応中に両酵素を分割して添加する方法、又は反応初期に脱水酵素を全量添加し、反応中に脱カルボキシル化酵素を分割して添加する方法等のいずれの方法を用いることができる。また、脱水酵素及び脱カルボキシル化酵素をそれぞれ発現する複数の微生物を用いてもよいし、両酵素を発現する単一の微生物を用いてもよい。
グルコン酸二価金属塩の酵素的脱水反応と、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩の酵素的脱カルボキシル化反応とをワンポット反応で行う場合、ｐＨ値は、脱水酵素及び脱カルボキシル化酵素がその活性を維持できればよく、特に制限はないが、ｐＨ５以上８以下の範囲で行うことが好ましく、ｐＨ６．５以上７．５以下の範囲で行うことがより好ましい。
グルコン酸の二価金属塩の酵素的脱水反応と、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩の酵素的脱カルボキシル化反応とをワンポット反応で行う場合、反応温度は、脱水酵素及び脱カルボキシル化酵素がその活性を維持できればよく、特に制限はないが、３０℃以上６０℃以下の範囲が好ましく、４０℃以上５０℃以下の範囲がより好ましい。
グルコン酸の二価金属塩の酵素的脱水反応と２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩の酵素的脱カルボキシル化反応とをワンポットで行う場合、反応基質であるグルコン酸の濃度は、脱水酵素及び脱カルボキシル化酵素が阻害を受けない濃度であればよく、特に制限はないが、反応液全量に対して１０重量％以上２７重量％以下の範囲が好ましい。なお、このワンポット反応は、基本的に水を溶媒とするが、必要に応じ反応系にアルコールやジメチルスルホキシドなど通常の酵素反応に用いられる有機溶媒を適量添加しても良い。
なお、本実施形態で用いるグルコン酸の二価金属塩は、市販されているグルコン酸と水酸化カルシウム等の二価金属塩とを混合することによって得ることもできるし、市販されているものを使用することもできる。
本実施形態では、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩を用いた脱カルボキシル化反応により２−デオキシリボースを合成するため、その副生成物は、水に難溶性の二価金属炭酸塩となる。したがって、反応液中からの２−デオキシリボースの分離・回収には、２−デオキシリボースと二価金属炭酸塩との水への溶解度差を利用した精製が可能である。また、必要に応じ、通常行われるろ過などの手段を採用してもよい。
（２−デオキシリボースから２'−デオキシヌクレオシドの合成）
続いて、上記得られた２−デオキシリボースから２'−デオキシヌクレオシドを合成する方法について説明する。本実施形態においては、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩を用いた脱カルボキシル化反応により得られた２−デオキシリボースを用いた任意の一又は複数の反応を経て、２'−デオキシヌクレオシドを合成するものであれば特に限定されない。以下、一例として、２−デオキシリボースにリン酸供与体を作用させて、２−デオキシリボース−５−リン酸エステル又はその塩を合成し、得られる２−デオキシリボース−５−リン酸エステルから２−デオキシリボースを合成する合成経路を挙げて、具体的に説明する。
まず、２−デオキシリボースから２−デオキシリボース−５−リン酸エステルを合成する方法について説明する。
リン酸供与体は、２−デオキシリボースにリン酸基を与えて２−デオキシリボース−５−リン酸エステルを合成するものであれば制限はなく、アデノシントリリン酸（ＡＴＰ）、ポリリン酸又はこれらの塩が挙げられる。ポリリン酸又はその塩としては、ピロリン酸、トリポリリン酸、テトラポリリン酸、及び、これらのナトリウム塩若しくはカリウム塩等のアルカリ金属塩が挙げられる。中でも、ピロリン酸又はその塩が好ましく、酸性ピロリン酸ナトリウムがより好ましい。これらのリン酸供与体は単独で使用してもよく、２種類以上を併用することもできる。
本実施形態において、２−デオキシリボースとリン酸供与体とを反応させて２−デオキシリボース−５−リン酸エステルを合成する反応は、化学的に行うものであってもよいし、酵素的に行うものであってもよいが、工業的に効率よく２−デオキシリボース−５−リン酸エステルを合成できるという観点から、酵素反応により実行することが好ましい。使用する酵素としては、ホスファターゼが挙げられ、ホスファターゼは、酸性ホスファターゼ及びアルカリホスファターゼに分類されるが、酸性ホスファターゼがより好ましい。
酸性ホスファターゼとしては、２−デオキシリボースの５位の炭素原子にリン酸基を導入する反応を触媒するものであれば特に制限はなく、種々の微生物由来の酸性ホスファターゼが使用できる。例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖｕｌｇａｔｕｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＡＢＲ３８２４３）、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＢＡＣ５０００５）、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｏｃｈｒａｃｅａ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＡＣＵ９２２４８）、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ａｒｅｓｃｅｎｔｕｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００２５１５７３８）、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｅｇｎｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＥＥＺ３８４１９）、Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａ ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿０６６１０１）、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｍａｇｎｅｔｉｃｕｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００２９５３０６６）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＡＢＷ３７１７４）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｂｌａｔｔａｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＢＡＡ８４９４２）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＣＡＡ６０５３４）、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００３２５０１５２）、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊｏｈｎｓｏｎｉａｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００１１９３９８２）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＡＢＺ８７６７０）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿１６９２２２）、Ｇｒａｎｕｌｉｂａｃｔｅｒ ｂｅｔｈｅｓｄｅｎｓｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿７４５６４２）、Ｈｅｌｏｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＣＡＤ２１７４５）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＢＡＨ６２９２８）、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＮＰ＿１０３９８３）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｉｃｕｍ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＡＣＫ８２７１２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００１６３９０４０）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｐｕｌｉ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＡＣＢ７９８３２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＡＣＢ２６０７０）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿１１４６４１）、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＢＡＡ９６７４４）、Ｐｈｅｎｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００２１２９１６９）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＢＡＡ３３１４８）、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００１０１６３６３）、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｔｕａｒｔｉｉ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＣＡＡ４６０３２）、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿８４０７５８）、Ｒａｏｕｌｔｅｌｌａ ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＢＡＢ１８９１８）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＡＡＫ５０８６１）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＡＡＭ８１２０８）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｂｏｙｄｉｉ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＡＢＢ６８８７９）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＢＡＡ１１６５５）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＡＢＢ６４５８０）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＡＡＺ９１０２５）、Ｓｅｂａｌｄｅｌｌａ ｔｅｒｍｉｔｉｄｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＡＣＺ１００２３）、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＡＢＶ４３５９０）、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００２０２６４２６）、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＡＡＭ４３３５６）、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＡＡＡ２７７００）由来の酸性ホスファタ−ゼである。
近年の分子生物学および遺伝子工学の進歩により、目的遺伝子を公知の遺伝子工学的手法により製造および取得することが容易になった。そのため、前記の微生物が産生する酸性ホスファターゼの分子生物学的な性質やアミノ酸配列等を解析することにより、該酸性ホスファターゼをコードする遺伝子を該微生物株より取得し、該遺伝子および発現に必要な制御領域が挿入された遺伝子組換えプラスミドを構築し、これを任意の宿主に導入し、酸性ホスファターゼを産生する遺伝子組換え体を作出することができる。
ここでいう発現に必要な制御領域とは、プロモーター配列（転写を制御するオペレーター配列を含む）・リボソーム結合配列（ＳＤ配列）・転写終結配列等を示している。バクテリアを宿主とした場合、プロモーター配列の具体例としては、大腸菌由来のトリプトファンオペロンのｔｒｐオペレーター、ラクトースオペロンのｌａｃオペレーター、ラムダファージ由来のＰＬプロモーターおよびＰＲプロモーター、枯草菌由来のグルコン酸合成酵素プロモーター、アルカリプロテアーゼプロモーター、中性プロテアーゼプロモーター、α−アミラーゼプロモーター等が挙げられる。また、ｔａｃプロモーターのように独自に改変・設計された配列も利用できる。リボソーム結合配列としては、大腸菌由来または枯草菌由来の配列が挙げられるが、大腸菌や枯草菌等の所望の宿主内で機能する配列であれば特に限定されるものではない。例えば、１６ＳリボソームＲＮＡの３'末端領域に相補的な配列が４塩基以上連続したコンセンサス配列をＤＮＡ合成により作成してこれを利用してもよい。また、酸性ホスファターゼの上流に位置しているＳＤ配列が利用できるのであれば、そのＳＤ配列を利用するのが好ましい。転写終結配列は必ずしも必要ではないが、ρ因子非依存性のもの、例えばリポプロテインターミテーター、ｔｒｐオペロンターミネーター等が利用できる。これら制御領域の組換えプラスミド上での配列順序は、５'末端側上流からプロモーター配列、リボソーム結合配列、酸性ホスファターゼをコードする遺伝子、転写終結配列の順に並ぶことが望ましい。ここでいうプラスミドの具体例としては、大腸菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＳＣ１０１や、枯草菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１、φ１０５等をベクターとして利用することができる。また、２種類以上の宿主内で自律複製が可能なプラスミドの例として、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７およびｐＢＳ７等をベクターとして利用することができる。
ここでいう任意の宿主には、後述の実施例に記載したような大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が代表例として挙げられるが、大腸菌に限定されるものではなく、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の微生物菌株も含まれる。
本実施形態では、酸性ホスファターゼ産生能を有する微生物および高等生物由来の細胞、酸性ホスファターゼをコードする遺伝子で形質転換された細胞そのもの及びこれら細胞の破砕物を使用することもできるが、該細胞、該細胞の破砕物および該細胞の破砕物を硫安沈殿やカラムクロマトグラフィー等の処理を行って精製した酸性ホスファターゼ活性を含む画分を担体に担持させた固定化物を使用することもできる。
酸性ホスファターゼをコードする遺伝子において、１若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入又は転移を含んでいたとしても、２−デオキシリボースをリン酸化して２−デオキシリボース−５−リン酸エステルを合成することができれば使用することができる。また、ＬａｃＺとの融合蛋白質として発現させたり、ヒスチジンタグを付加して発現させたりする場合のように、酸性ホスファターゼのＮ末端やＣ末端に数残基のアミノ酸が結合していたとしても、２−デオキシリボースをリン酸化して２−デオキシリボース−５−リン酸エステルを合成することができれば使用することができる。
２−デオキシリボースとリン酸供与体とのモル比は特に制限されないが、どちらか一方が他方に対して１倍モル以上存在する条件下で反応を行うことが好ましく、リン酸供与体が２−デオキシリボースに対して１倍モル以上２０倍モル以下存在する条件下で行うことがより好ましく、リン酸供与体が２−デオキシリボースに対して１．１倍モル以上２．９倍モル以下存在する条件下で行うことがより好ましい。
反応液中の２−デオキシリボースの濃度は特に制限されないが、０．０５ｍｏｌ／Ｌ以上２ｍｏｌ／Ｌ以下の範囲で行うことが好ましく、０．１ｍｏｌ／Ｌ以上１．０ｍｏｌ／Ｌ以下の範囲で行うことがより好ましい。このリン酸エステル化反応は基本的に水を溶媒とするが、必要に応じ反応系にアルコールやジメチルスルホキシドなど通常の酵素反応に用いられる有機溶媒を適量添加しても良い。
反応液中のリン酸供与体の濃度は、酸性ホスファターゼの酵素活性が阻害されない範囲であれば特に制限されないが、０．０５ｍｏｌ／Ｌ以上２ｍｏｌ／Ｌ以下の範囲が好ましく、０．１ｍｏｌ／Ｌ以上１．０ｍｏｌ／Ｌ以下の範囲がより好ましい。
反応液中の酸性ホスファターゼの活性値は、２−デオキシリボース−５−リン酸エステルが生成する量が存在すれば特に制限されないが、１Ｕ／ｍＬ以上１０００Ｕ／ｍＬ以下の範囲で行うことが好ましい。
反応温度は、２−デオキシリボース−５−リン酸エステルが生成する温度範囲であれば特に制限されないが、０℃以上４０℃以下の範囲で行うことが好ましく、０℃以上２０℃以下の範囲で行うことがより好ましく、５℃以上１５℃以下で行うことが最も好ましい。
反応液のｐＨは、２−デオキシリボース−５−リン酸エステルが生成する範囲であれば特に制限されないが、ｐＨは２．５以上６．０以下の範囲で行うことが好ましく、３．０以上４．５以下の範囲で行うことがより好ましい。
酸性ホスファターゼの中にはマグネシウムイオン等の二価の金属イオンでホスファターゼ活性の向上が見られるものもあるため、必要に応じて二価の金属イオンのような多価金属化合物等を反応液中に存在させることができる。
これにより、反応に使用する２−デオキシリボースに対応する２−デオキシリボース−５−リン酸エステルが得られる。本実施形態では、上記（i）を実行して得られた２−デオキシリボースを用いるため、２−デオキシリボース−５−リン酸エステルが得られる。
本実施形態において、２−デオキシリボースから２−デオキシリボース−５−リン酸エステルを合成する一実施態様としては、例えば、所望のｐＨに調整したバッファー中に２−デオキシリボースとリン酸供与体を存在させ、そこに酸性ホスファターゼを加えて反応させる方法が挙げられる。得られる２−デオキシリボース−５−リン酸エステルは、反応液から金属塩として沈殿させる方法やカラムクロマトグラフィー等の公知の分離方法を用いて分離することができる。２−デオキシシリボース−５−リン酸エステルの塩としては、例えば、リン酸供与体の塩由来の塩を形成しているものがあり、具体的には、ナトリウム塩やカリウム塩が挙げられる。
２−デオキシリボ−スに対して過剰量のピロリン酸又はその塩存在下に２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル又はその塩を合成した場合、ピロリン酸に由来するリン酸が副生する。副生したリン酸を除去しておくと、次に実行する２−デオキシリボース−５−リン酸エステルから２'−デオキシリボヌクレオシドを得る反応を効率よく実行することができるため好ましい。
リン酸を除去する方法としては、例えば金属水酸化物を添加して沈澱除去する方法や陰イオン交換樹脂などによって除去する方法などがある。金属水酸化物としては、水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウム、水酸化鉄、水酸化銅、水酸化マンガン、水酸化コバルト、水酸化亜鉛、水酸化ニッケルなどが挙げられる。好ましくは水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウム、水酸化鉄であり、より好ましくは水酸化マグネシウム、水酸化カルシウムである。リン酸を難水溶性塩にして沈澱させ、濾過により除去する際に、ナトリウムイオンを含まないと濾過速度が速くなる効果もある。
つづいて、得られた２−デオキシリボース−５−リン酸エステル又はその塩から２'−デオキシヌクレオシドを合成する方法について説明する。この方法では、リン酸化転移反応によりこれを２−デオキシリボース−１−リン酸エステルとし、核酸塩基を作用させてグルコシル化反応を行い、２'−デオキシヌクレオシドを合成するものであれば、特に制限されない。
リン酸転移反応及びグリコシル化反応は、化学的に実行してもよいし、酵素反応により行ってもよいが、工業的に効率よく合成できるという観点から、いずれも酵素反応により行うことが好ましい。酵素的リン酸転移反応とグリコシル化反応とは、順に行ってよいし、ワンポット反応で行うこともできるが、ワンポット反応で行うことが好ましい。
酵素的リン酸転移反応は、例えば、ホスホペントムタ−ゼやホスホグルコノムタ−ゼ、ホスホマンノムターゼ、ホスホデオキシリボムタ−ゼ、ホスホリボムタ−ゼ等のリン酸転移酵素を使用して実行することができる。中でもホスホペントムタ−ゼを用いることが好ましく、ホスホペントムターゼの例としては、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００３８２８２８）、Ａｃｅｔｉｖｉｂｒｉｏ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＺＰ＿０７３２８０７２）、Ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｒｅｄｉｇｅｎｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００１３２０３３６）、Ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ ｏｒｅｍｌａｎｄｉｉ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００１５１３１３１）、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００３２３９２７６）、Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｐｒｅｖｏｔｉｉ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＥＧＣ８１９４９）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００３５９９５６２）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００１４８７３１１）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＡＡＡ７４４３３）、Ｂｌａｕｔｉａ ｈａｎｓｅｎｉｉ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＺＰ＿０５８５３０５３）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００２７７１８６３）、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００３９９２０７１）、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎｉｉ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００４０２６０３５）、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｋｒｏｎｏｔｓｋｙｅｎｓｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００４０２３６３１）、Ｃａｒｂｏｘｙｄｉｂｒａｃｈｉｕｍ ｐａｃｉｆｉｃｕｍ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＺＰ＿０５０９２５６２）、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｑｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿３６０７８２）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００２５０７４７５）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００１３９４６３２）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｅｎｔｏｃｅｌｌｕｍ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００４３０９１８４）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００１０３７１０５）、Ｄｅｉｏｃｏｃｃｕｓ ｄｅｓｅｒｔｉ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００２７８４９５２）、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｅｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿６０４０５７）、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｒｉｃｏｐｅｒｎｓｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００４１７０７９０）、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００４２５６５２４）、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＮＰ＿２９５８５８）、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００２２５１１８１）、Ｄｕｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｆｎｉｅｎｓｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿５１８５４５）、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｎｉｇｒｉｆｉｃａｎｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＺＰ＿０８１１４１９８）、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｒｅｄｕｃｅｎｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００１１１２４６０）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＮＰ＿４１８８００）、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００２９３０５６０）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＢＡＡ２２９１７）、Ｈａｌａｎａｅｒｏｂｉｕｍ ｐｒａｅｖａｌｅｎｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＡＤＯ７７９３３）、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｏｄｅｓｔｉｃａｌｄｕｍ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００１６７８９４５）、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＺＰ＿０６９６７９３８）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＺＰ＿０８１４９２７３）、Ｌｅａｄｂｅｔｔｅｒｅｌｌａ ｂｙｓｓｏｐｈｉｌａ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００３９９６３６７）、Ｍａｈｅｌｌａ ａｕｕｓｔｒａｌｉｅｎｓｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００４４６３４６６）、Ｍａｒｉｎｉｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００４３６８７０３）、Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｕｂｅｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００３５０８６１３）、Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ ｓｉｌｖａｎｕｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００３６８３６０３）、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿４３０３５２）、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００１９１７８２９）、Ｏｃｅａｎｉｔｈｅｒｍｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００４０５８８０１）、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＮＰ＿６９２７６７）、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００１２１１７６１）、Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｎｑｈａｅｎｓｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＺＰ＿０８０９４８７６）、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿３４１５７７）、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＣＢＬ１１８５３）、Ｓｏｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＢＡＫ１７２１１）、Ｓｙｍｂｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿０７５６４９）、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｔｈｅｒｍｕｓ ｌｉｐｏｃａｌｉｄｕｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００３７０１８４３）、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＺＰ＿０８２１１１３４）、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｐｓｅｕｄｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００１６６５７９９）、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｗｉｅｇｅｌｉｉ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＺＰ＿０７５４７０７５）、Ｔｈｅｒｍｏｓｅｄｉｍｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｏｃｅａｎｉ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００３８２４９９０）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＮＰ＿２２７９８２）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００１２４４３５３）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＺＰ＿０３４９６６４２）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００４２０３５８２）、Ｔｒｕｅｐｅｒａ ｒａｄｉｏｖｉｃｔｒｉｘ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００３７０４７３９）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００５６２８）などが挙げられる。
リン酸転移酵素を用いて、２−デオキシリボース−５−リン酸エステル又はその塩から得られた２−デオキシリボース−１−リン酸エステル又はその塩は、リン酸転移反応したものをそのまま使用するか、あるいは、カラムクロマトグラフィー、再結晶などにより精製した後、核酸塩基と作用させて、グルコシル化反応を行う。
２−デオキシリボース−１−リン酸エステルに作用させる塩基は、ピリミジン、プリン、アザプリンおよびデアザプリンからなる群から選択された天然または非天然型の塩基を示し、それらはハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、ハロアルケニル基、アルキニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、水酸基、ヒドロキシアミノ基、アミノキシ基、アルコキシ基、メルカプト基、アルキルメルカプト基、アリール基、アリールオキシ基またはシアノ基によって置換されていてもよい。
置換基としてのハロゲン原子としては、塩素、フッ素、ヨウ素、臭素が例示される。アルキル基としては、メチル、エチル、プロピルなどの炭素数１〜７の低級アルキル基が例示される。ハロアルキル基としては、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、ブロモメチル、ブロモエチルなどの炭素数１〜７のアルキルを有するハロアルキル基が例示される。アルケニル基としては、ビニル、アリールなどの炭素数２〜７のアルケニル基が例示される。ハロアルケニル基としては、ブロモビニル、クロロビニルなどの炭素数２〜７のアルケニルを有するハロアルケニル基が例示される。アルキニル基としては、エチニル、プロピニルなどの炭素数２〜７のアルキニル基が例示される。アルキルアミノ基としては、メチルアミノ、エチルアミノなどの炭素数１〜７のアルキルを有するアルキルアミノ基が例示される。アルコキシ基としては、メトキシ、エトキシなどの炭素数１〜７のアルコキシ基が例示される。アルキルメルカプト基としては、メチルメルカプト、エチルメルカプトなどの炭素数１〜７のアルキルを有するアルキルメルカプト基が例示される。アリール基としては、フェニル基；メチルフェニル、エチルフェニルなどの炭素数１〜５のアルキルを有するアルキルフェニル基；メトキシフェニル、エトキシフェニルなどの炭素数１〜５のアルコキシを有するアルコキシフェニル基；ジメチルアミノフェニル、ジエチルアミノフェニルなどの炭素数１〜５のアルキルアミノを有するアルキルアミノフェニル基；クロロフェニル、ブロモフェニルなどのハロゲノフェニル基などが例示される。
ピリミジン塩基を具体的に例示すれば、シトシン、ウラシル、５−フルオロシトシン、５−フルオロウラシル、５−クロロシトシン、５−クロロウラシル、５−ブロモシトシン、５−ブロモウラシル、５−ヨ−ドシトシン、５−ヨ−ドウラシル、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル（チミン）、５−エチルシトシン、５−エチルウラシル、５−フルオロメチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−トリフルオロシトシン、５−トリフルオロウラシル、５−ビニルウラシル、５−ブロモビニルウラシル、５−クロロビニルウラシル、５−エチニルシトシン、５−エチニルウラシル、５−プロピニルウラシル、ピリミジン−２−オン、４−ヒドロキシアミノピリミジン−２−オン、４−アミノオキシピリミジン−２−オン、４−メトキシピリミジン−２−オン、４−アセトキシピリミジン−２−オン、４−フルオロピリミジン−２−オン、５−フルオロピリミジン−２−オンなどが挙げられる。
プリン塩基を具体的に例示すれば、プリン、６−アミノプリン（アデニン）、６−ヒドロキシプリン、６−フルオロプリン、６−クロロプリン、６−メチルアミノプリン、６−ジメチルアミノプリン、６−トリフルオロメチルアミノプリン、６−ベンゾイルアミノプリン、６−アセチルアミノプリン、６−ヒドロキシアミノプリン、６−アミノオキシプリン、６−メトキシプリン、６−アセトキシプリン、６−ベンゾイルオキシプリン、６−メチルプリン、６−エチルプリン、６−トリフルオロメチルプリン、６−フェニルプリン、６−メルカプトプリン、６−メチルメルカプトプリン、６−アミノプリン−１−オキシド、６−ヒドロキシプリン−１−オキシド、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン（グアニン）、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２−アミノ−６−ヨ−ドプリン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−メルカプトプリン、２−アミノ−６−メチルメルカプトプリン、２−アミノ−６−ヒドロキシアミノプリン、２−アミノ−６−メトキシプリン、２−アミノ−６−ベンゾイルオキシプリン、２−アミノ−６−アセトキシプリン、２−アミノ−６−メチルプリン、２−アミノ−６−サイクロプロピルアミノメチルプリン、２−アミノ−６−フェニルプリン、２−アミノ−８−ブロモプリン、６−シアノプリン、６−アミノ−２−クロロプリン（２−クロロアデニン）、６−アミノ−２−フルオロプリン（２−フルオロアデニン）などが挙げられる。
アザプリン塩基およびデアザプリン塩基を具体的に例示すれば、６−アミノ−３−デアザプリン、６−アミノ−８−アザプリン、２−アミノ−６−ヒドロキシ−８−アザプリン、６−アミノ−７−デアザプリン、６−アミノ−１−デアザプリン、６−アミノ−２−アザプリンなどが挙げられる。
酵素的グリコシル化反応は、ヌクレオシド合成酵素存在下に実行することができる。ヌクレオシド合成酵素には、例えば、ヌクレオシドホスホリラーゼ活性を有する酵素が挙げられる。ヌクレオシドホスホリラーゼとは、リン酸存在下でヌクレオシドのＮ−グリコシド結合を分解する酵素の総称であり、本実施形態においては逆反応を利用することができる。反応に使用するヌクレオシドホスホリラーゼは、２−デオキシリボース−１−リン酸エステルと塩基とから目的とする２'−デオキシヌクレオシドを生成しうる活性を有していればいかなる種類及び起源のものでもかまわない。該酵素はプリン型とピリミジン型に大別され、例えば、プリン型としてプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１）、グアノシンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１５）、ピリミジン型としてピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２）、ウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．３）、チミジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．４）、デオキシウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２３）などが挙げられる。
本発明におけるヌクレオシドホスホリラーゼを発現している微生物とは、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１）、グアノシンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１５）、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２）、ウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．３）、チミジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．４）、デオキシウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．２３）からなる群から選択される一種類以上のヌクレオシドホスホリラーゼを発現している微生物であれば特に限定はされない。
このような微生物の具体例としては、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、フラボバクテリウム（Ｆｌａｂｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、クルイヘラ（Ｋｌｕｙｖｅｒｅ）属、ミコバクテリウム（Ｍｉｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ヘモフィラス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）属、ミコプラナ（Ｍｉｃｏｐｌａｎａ）属、プロタミノバクター（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、好熱性のバチルス属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ザルチナ（Ｓａｒｔｉｎａ）属、プラノコッカス（Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、エシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、クルチア（Ｋｕｒｔｈｉａ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、キサントバクター（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、エアロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アクロモバクター（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アースロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属またはシュードノカルディア（Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａ）属に含まれる微生物株を好適な例として挙げることができる。
近年の分子生物学および遺伝子工学の進歩により、上述の微生物株のヌクレオシドホスホリラーゼの分子生物学的な性質やアミノ酸配列等を解析することにより、該蛋白質の遺伝子を該微生物株より取得し、該遺伝子および発現に必要な制御領域が挿入された組換えプラスミドを構築し、これを任意の宿主に導入し、該蛋白質を発現させた遺伝子組換え菌を作出することが可能となり、かつ、比較的容易にもなった。かかる技術水準に鑑み、このようなヌクレオシドホスホリラーゼの遺伝子を任意の宿主に導入した遺伝子組換え菌も本実施形態で使用し得るヌクレオシドホスホリラーゼを発現している微生物に包含されるものとする。
ここでいう発現に必要な制御領域とは、プロモーター配列（転写を制御するオペレーター配列を含む）・リボゾーム結合配列（ＳＤ配列）・転写終結配列等を示している。プロモーター配列の具体例としては、大腸菌由来のトリプトファンオペロンのｔｒｐプロモーター・ラクトースオペロンのｌａｃプロモーター・ラムダファージ由来のＰＬプロモーター及びＰＲプロモーターや、枯草菌由来のグルコン酸合成酵素プロモーター（ｇｎｔ）・アルカリプロテアーゼプロモーター（ａｐｒ）・中性プロテアーゼプロモーター（ｎｐｒ）・α−アミラーゼプロモーター（ａｍｙ）等が挙げられる。また、ｔａｃプロモーターのように独自に改変・設計された配列も利用できる。リボゾーム結合配列としては、大腸菌由来または枯草菌由来の配列が挙げられるが、大腸菌や枯草菌等の所望の宿主内で機能する配列であれば特に限定されるものではない。たとえば、１６ＳリボゾームＲＮＡの３'末端領域に相補的な配列が４塩基以上連続したコンセンサス配列をＤＮＡ合成により作成してこれを利用してもよい。転写終結配列は必ずしも必要ではないが、ρ因子非依存性のもの、例えばリポプロテインターミネーター・ｔｒｐオペロンターミネーター等が利用できる。これら制御領域の組換えプラスミド上での配列順序は、５'末端側上流からプロモーター配列、リボゾーム結合配列、ヌクレオシドホスホリラーゼをコードする遺伝子、転写終結配列の順に並ぶことが望ましい。
ここでいうプラスミドの具体例としては、大腸菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＳＣ１０１や、枯草菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１、φ１０５等をベクターとして利用することができる。また、２種類以上の宿主内での自律複製が可能なプラスミドの例として、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７をベクターとして利用することができる。
ここでいう任意の宿主には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が代表例として挙げられるが、とくに大腸菌に限定されるものではなく枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の微生物菌株も含まれる。
また、ここでいうヌクレオシドホスホリラーゼ活性とは、上述の該酵素活性を有する微生物菌体のみならず、該酵素活性を有する微生物菌体の菌体処理物またはそれらの固定化物なども使用できる。菌体処理物とは、例えばアセトン乾燥菌体や機械的破壊、超音波破砕、凍結融解処理、加圧減圧処理、浸透圧処理、自己消化、細胞壁分解処理、界面活性剤処理などにより調製した菌体破砕物などであり、また、必要に応じて硫安沈殿やアセトン沈殿、カラムクロマトグラフィーにより精製を重ねたものを用いても良い。
本実施形態のグリコシル化反応では、２−デオキシリボース−１−リン酸エステルと核酸塩基との反応から、２'−デオキシヌクレオシドとリン酸イオンが生成する。そこで、２'−デオキシヌクレオシドを含む反応終了物を含む水溶液中にリン酸イオンと難水溶性の塩を形成しうる金属カチオンを加えてもよい。リン酸イオンと難水溶性の塩を形成しうる金属カチオンとは、反応において副生したリン酸イオンと難水溶性の塩を形成し、水溶液中に沈殿しうるものであれば限定されない。そのようなものとして、カルシウム、マグネシウム、バリウム、鉄、コバルト、ニッケル、銅、銀、モリブデン、鉛、亜鉛、リチウムなどの金属カチオンが挙げられる。それらのうち工業的に汎用性や安全性が高く、反応に影響を与えない金属塩が特に好ましく、そのようなものの例としてカルシウムイオン、バリウムイオン、アルミニウムイオン及びマグネシウムイオンが挙げられる。
本発明におけるリン酸イオンと難水溶性の塩を形成しうる金属カチオンとは、リン酸と難水溶性の塩を形成しうる金属カチオンを、塩素イオン、硝酸イオン、炭酸イオン、硫酸イオン、酢酸イオンまたは水酸イオンの中から選ばれる１種類以上のアニオンとの金属塩として水溶液中に添加すればよい。具体的には、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、酢酸カルシウム、塩化バリウム、硝酸バリウム、炭酸バリウム、硫酸バリウム、酢酸バリウム、塩化アルミニウム、硝酸アルミニウム、炭酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、酢酸アルミニウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウム、水酸化アルミニウム、水酸化マグネシウム、塩化マグネシウム、硝酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウムなどが例示される。
また、該金属カチオンは、２−デオキシリボース−１−リン酸の塩として反応液中に存在させてもよい。一例を挙げると、２−デオキシリボース−１−リン酸・カルシウム塩、２−デオキシリボース−１−リン酸・バリウム塩、２−デオキシリボース−１−リン酸・アルミニウム塩、などが挙げられる。
リン酸転移反応及びグリコシル化反応による２'−デオキシヌクレオシドの合成反応は、目的とする２'−デオキシヌクレオシド、基質である２−デオキシリボース−５−リン酸エステルと核酸塩基、反応触媒であるリン酸転移酵素及びヌクレオシドホスホリラーゼ、又は該酵素活性を有する微生物、そしてリン酸を反応系より除外させるために添加する金属塩の種類とその特性により、適切なｐＨや温度などの反応条件並びに管理幅を選べばよいが、ｐＨ５以上１０以下が好ましく、温度１０℃以上６０℃以下の範囲で行うことができる。反応に使用する２−デオキシリボース−５−リン酸エステル及び核酸塩基の濃度は０．１ｍＭ以上１０００ｍＭ以下程度が適当であり、両者のモル比は添加する核酸塩基の比率を２−デオキシリボース−５−リン酸エステル又はその塩に対して０．１倍モル量以上１０倍モル量以下で行える。反応転化率を考えれば０．９５倍モル量以下が好ましい。
また、リン酸と難水溶性の塩を形成しうる金属塩を添加する場合、反応に使用する２−デオキシリボース−１−リン酸に対して０．１倍モル量以上１０倍モル量以下、より好ましくは０．５倍モル以上５倍モル量以下添加するのが良い。その添加方法について制限は無く、一括添加や反応中に逐次添加しても良い。また、本反応は基本的に水を溶媒としているが、必要に応じ反応系にアルコールやジメチルスルホキシドなど通常の酵素反応に用いられる有機溶媒を適量添加しても良い。なお、高濃度の反応においては、基質の核酸塩基や生成物の２'−デオキシヌクレオシド化合物が溶解しきれずに反応液中に存在する場合もあるが、このような場合にも本発明を適用することができる。
このようにして製造した２'−デオキシヌクレオシド化合物は、濃縮、晶析、溶解、電気透析処理、イオン交換樹脂や活性炭による吸脱着処理などの常法を適用することにより単離することができる。
本実施形態で合成できる２'−デオキシヌクレオシドは、天然に存在する２'−デオキシヌクレオシドでも天然に存在しない２'−デオキシヌクレオシドでも、核酸塩基が供与できるのであれば特に制限されない。具体的な例としては、核酸塩基としてアデニンを用いた場合に合成できる２'−デオキシヌクレオシドは２'−デオキシアデノシン、核酸塩基としてグアニンを用いた場合に合成できる２'−デオキシヌクレオシドは２'−デオキシグアノシン、核酸塩基としてチミンを用いた場合に合成できる２'−デオキシヌクレオシドはチミジン、核酸塩基としてシトシンを用いた場合に合成できる２'−デオキシヌクレオシドは２'−デオキシシチジン、核酸塩基としてヒポキサンチンを用いた場合に合成できる２'−デオキシヌクレオシドは２'−デオキシイノシンを合成することができる。
つづいて本実施形態の効果について説明する。本実施形態によれば、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩を出発原料として利用する酵素的脱カルボキシル化反応を行うことで、効率的に２−デオキシリボースを高収率で得ることができる。
２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸ナトリウム、及び、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸カリウムを用いた脱カルボキシル化反応では、ｐＨ調整として酸の添加もしくは緩衝液中での反応が必要と報告されている。一方、本実施形態によれば、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩を用いた脱カルボキシル化反応を行うことで、ｐＨ調整を行わずに高収率で２−デオキシリボースを得ることができる。
また、本実施形態によれば、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩を用いた酵素的脱カルボキシル化反応を行うことで、２−デヒドロ −３−デオキシグルコン酸濃度が反応液全量に対して２５重量％の高濃度条件においても高収率で２−デオキシリボースを得ることができる。
また、本実施形態によれば、脱水反応によりグルコン酸の二価金属塩から２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩を生成する工程と、生成した２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩を脱カルボキシル化反応に付して２−デオキシリボースを生成する工程とを実行することにより、ｐＨ調整を必要とせず、効率的にグルコン酸の二価金属塩から２−デオキシリボースを高収率で製造することができる。
また、グルコン酸の二価金属塩の脱水反応と、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸二価金属塩の脱カルボキシル化反応とをワンポット反応で行うことにより、よりいっそう効率的にグルコン酸二価金属塩から２−デオキシリボースを製造することができる。
本実施形態において、脱カルボキシル化反応及びワンポット反応の副生成物は、二価金属炭酸塩であり、水に対して難溶性である。したがって、ろ過処理のみで副生成物を除去することができ、２−デオキシリボース水溶液を簡便に得ることができる。
このように、本実施形態によれば、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩若しくはグルコン酸の二価金属塩を出発物質として用いることにより、従来の製造方法では低収率であった２−デオキシリボースを高収率で得ることができるため、これを用いて２'−デオキシヌクレオシドの工業的製造を生産性よく実行することが可能となる。
＜第２の実施形態＞
本実施形態は、上記（ii）を実行して２'−デオキシヌクレオシドを製造するものである。具体的には、本実施形態は、２−デオキシリボ−ス合成能を有する変異型酵素を使用して、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸又はその塩から２−デオキシリボースを合成し、得られた２−デオキシリボ−スを中間体として、２'−デオキシヌクレオシドを製造する方法である。
（２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸から２−デオキシリボースの合成）
本実施形態は、まず、２−デオキシリボ−ス合成能を有する変異型酵素（以下、「変異型２−デオキシリボース合成酵素」ともいう。）を使用して、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸又はその塩から２−デオキシリボースを合成する。
本実施形態において変異型２−デオキシリボース合成酵素は、基質ポケットを形成するアミノ酸残基が野生型と比して少なくとも一つ以上変異したものである。
ここでいう、基質ポケットとは、基質である２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸を認識し、脱カルボキシル化反応を触媒する部位のことをいう。
また、本発明において、２−デオキシリボース合成能とは、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸またはその塩を２−デオキシリボースに変換する反応を触媒する能力をいう。本明細書では、２−デオキシリボース合成能を有する酵素を「２−デオキシリボース合成酵素」ともいう。
本実施形態で使用される変異型２−デオキシリボース合成酵素は、具体的には、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸を基質とした２−デオキシリボースの合成反応において、２−デオキシリボース合成酵素の基質ポケットを構成する少なくとも一つのアミノ酸と２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸との結合距離が、ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼ（ＥＣ ４．１．１．７）の２８１番目のヒスチジンに相当するアミノ酸と２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸との結合距離よりも大きくなるように構成されている。本実施形態において、例えば、２８１番目のヒスチジンに相当するアミノ酸とは、他のタンパク質において、本実施形態で用いる変異型２−デオキシリボース合成酵素と他のタンパク質間での一次配列の相同性から類推される場合や、タンパク質の立体構造から三次元でアミノ酸が事実上重なると想定される場合も含む。これは、立体構造で同様の配置に来るアミノ酸は、仮に一次配列での相同性が低い場合でも、触媒作用や、基質認識においては、同様の作用を持つことが予想されるからである。
本実施形態で使用される変異型２−デオキシリボース合成酵素は、ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼのベンゾイルホルメートに対する活性部位（基質ポケット）の少なくとも１つのアミノ酸を変異させたものとすることが好ましい。また、本実施形態で使用される変異型２−デオキシリボース合成酵素は、ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼの２６番目のセリン、７０番目のヒスチジン、及び２８１番目のヒスチジンにそれぞれ相当するアミノ酸から選択される少なくとも一以上のアミノ酸が置換されたものとするとより好ましく、２８１番目のヒスチジンに相当するアミノ酸を置換したものがより好ましい。具体的には、ヒスチジンよりも疎水性の高いアミノ酸に置換することが好ましく、中でも２８１番目のヒスチジンに相当するアミノ酸を芳香族アミノ酸に置換させたものが特に好ましい。芳香族アミノ酸としては、フェニルアラニン又はチロシンを例示することができる。
ここで、２−デオキシリボース合成酵素とは、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸を脱カルボキシル化して２−デオキシリボースを合成することができれば特に制限はなく、例えば、種々の微生物由来のベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼを用いることができる。具体的には、第１の実施形態の脱カルボキシル化反応で用いられる、種々の微生物由来のベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼが挙げられる。
その他の２−デオキシリボース合成酵素としては、例えば、種々の微生物由来のピルビン酸デカルボキシラーゼを用いることができる。具体的には、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００３１８８８４１）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＮＰ＿１４９１８９）、Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿００１６００４６２）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＣＡＤ９３７３８）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＣＡＣ３１１２２）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＮＰ＿２１５３６８）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＮＰ＿７５８０７７）、Ｓａｒｃｉｎａ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌｉ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＡＡＬ１８５５７）、Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ ｐａｌｍａｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＡＡＭ４９５６６），Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＡＡＡ２７６８５）が挙げられる。
２−デオキシリボース合成酵素は公知の遺伝子工学的手法により製造及び取得することができる。そのため、前記の微生物が産生する２−デオキシリボース合成酵素の分子生物学的な性質やアミノ酸配列等を解析することにより、該酵素をコードする遺伝子を該微生物株より取得し、該遺伝子および発現に必要な制御領域が挿入された遺伝子組換えプラスミドを構築し、これを任意の宿主に導入し、２−デオキシリボース合成酵素を産生する遺伝子組換え体を作出することができる。
ここでいう発現に必要な制御領域とは、プロモーター配列（転写を制御するオペレーター配列を含む）、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）、及び転写終結配列等を示している。バクテリアを宿主とした場合、プロモーター配列の具体例としては、大腸菌由来のトリプトファンオペロンのｔｒｐオペレーター、ラクトースオペロンのｌａｃオペレーター、ラムダファージ由来のＰＬプロモーターおよびＰＲプロモーター、枯草菌由来のグルコン酸合成酵素プロモーター、アルカリプロテアーゼプロモーター、中性プロテアーゼプロモーター、α−アミラーゼプロモーター等が挙げられる。また、ｔａｃプロモーターのように独自に改変・設計された配列も利用できる。リボソーム結合配列としては、大腸菌由来または枯草菌由来の配列が挙げられるが、大腸菌や枯草菌等の所望の宿主内で機能する配列であれば特に限定されるものではない。例えば、１６ＳリボソームＲＮＡの３'末端領域に相補的な配列が４塩基以上連続したコンセンサス配列をＤＮＡ合成により作成してこれを利用してもよい。また、２−デオキシリボース合成酵素の上流に位置しているＳＤ配列が利用できるのであれば、そのＳＤ配列を利用するのが好ましい。転写終結配列は必ずしも必要ではないが、ρ因子非依存性のもの、例えばリポプロテインターミネーター、ｔｒｐオペロンターミネーター等が利用できる。これら制御領域の組換えプラスミド上での配列順序は、５'末端側上流からプロモーター配列、リボソーム結合配列、２−デオキシリボース合成酵素をコードする遺伝子、転写終結配列の順に並ぶことが望ましい。ここでいうプラスミドの具体例としては、大腸菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＳＣ１０１や、枯草菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１、φ１０５等をベクターとして利用することができる。また、２種類以上の宿主内で自律複製が可能なプラスミドの例として、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７およびｐＢＳ７等をベクターとして利用することができる。
ここでいう任意の宿主には、後述の実施例に記載したような大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が代表例として挙げられるが、大腸菌に限定されるものではなく、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の微生物菌株も含まれる。
本実施形態で用いられる変異型２−デオキシリボース合成酵素としては、２−デオキシリボース合成酵素そのものだけでなく、２−デオキシリボース合成酵素産生能を有する微生物及び高等生物由来の細胞、２−デオキシリボース合成酵素をコードする遺伝子で形質転換された細胞そのもの及びこれら細胞の破砕物を使用することもできるが、該細胞、該細胞の破砕物および該細胞の破砕物を硫安沈殿やカラムクロマトグラフィー等の処理を行って精製した２−デオキシリボース合成酵素活性を含む画分を担体に担持させた固定化物を使用することもできる。
２−デオキシリボース合成酵素をコードする遺伝子において、１若しくは複数の塩基の置換、欠失、挿入又は転移を含んでいたとしても、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸又はその塩を脱カルボキシル化して２−デオキシリボースを合成することができれば使用することができる。また、ＬａｃＺとの融合蛋白質として発現させたり、ヒスチジンタグを付加して発現させたりする場合のように、２−デオキシリボース合成酵素のＮ末端やＣ末端に数残基のアミノ酸が結合していたとしても、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸を脱炭酸して２−デオキシリボースを合成することができれば使用することができる。
２−デオキシリボース合成酵素をコードする遺伝子の目的とする部位に変異を入れる方法としては、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いる方法やファージを用いる方法などがある。
２−デオキシリボースの合成活性が向上した２−デオキシリボース合成酵素の例としては、配列表の配列番号２、３又は４で示す配列と実質的に相同であるアミノ酸残基を含み、かつ、野生型のベンゾイルデカルボキシラーゼに対して２−デオキシリボースの合成活性を向上させることができる変異を有する２−デオキシリボース合成酵素が挙げられる。例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｃｈｒｏｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ由来ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼにおいて、２８１番目のヒスチジンに相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものが挙げられる。好ましくは２８１番目のヒスチジンに相当するアミノ酸がヒスチジンよりも疎水性のアミノ酸に置換されたものであり、より好ましくは２８１番目のヒスチジンに相当するアミノ酸が芳香族アミノ酸に置換されたものである。
ここで、ヒスチジンよりも疎水性のアミノ酸とは、ヒスチジンのｌｏｇＰ値よりも低いアミノ酸であればよく、具体的には、セリン、トレオニン、グリシン、リシン、チロシン、トリプトファン、システイン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンが挙げられる。
また、芳香族アミノ酸とは、チロシン、フェニルアラニンが挙げられる。
上記（ii）で使用する変異型２−デオキシリボース合成酵素を得るためには、このように、ベンゾイルデカルボキシラーゼの特定部位においてアミノ酸残基の置換を行えばよい。あるベンゾイルデカルボキシラーゼの特定部位が別のベンゾイルデカルボキシラーゼにおいてどのアミノ酸残基に相当するのかは配列を比較して判断することができる。いくつかのベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼのアミノ酸配列を比較した結果を図１に示した。図１中、ＩがＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼであり、ＩＩがＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼであり、ＩＩＩがＣｈｒｏｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ由来ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼである。
本実施形態で使用し得る２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸塩は、フリー体の２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸に金属水酸化物を添加することで調製してもよく、また、市販の２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸塩を用いてもよい。例えば、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸ナトリウム、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸カリウムなどの一価金属塩、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸カルシウム、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸バリウム、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸マグネシウム、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸ストロンチウムなどの二価金属塩が挙げられ、好ましくは２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩であり、より好ましくは周期表第２族に属する二価金属からなる２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩を用いることができる。
２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸は公知の製造方法によって得ることができる（特開２００５−４０１３０号公報）。また、製造工程を通して得られた２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸水溶液を単離・生成することなく、反応に用いることも可能である。
２−デオキシリボース合成反応の反応ｐＨ値は、２−デオキシリボース合成酵素がその活性を維持できればよく、特に制限されないが、ｐＨ５以上８以下の範囲で行うことが好ましく、ｐＨ６以上７．５以下の範囲で行うことがより好ましい。
２−デオキシリボース合成反応の反応温度は、２−デオキシリボース合成酵素がその活性を維持できればよく、特に制限されないが、３０℃以上６０℃以下の範囲が好ましく、４０℃以上５０℃以下の範囲がより好ましい。
２−デオキシリボース合成反応に添加する２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸濃度は、２−デオキシリボース合成酵素が阻害を受けない濃度であればよく、特に制限されないが、反応液全量に対して９重量％以上２５重量％以下の範囲とすることができる。また、本反応は基本的に水を溶媒とするが、必要に応じ反応系にアルコールやジメチルスルホキシドなど通常の酵素反応に用いられる有機溶媒を適量添加しても良い。
本実施形態で使用し得る２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸又はその塩は、グルコン酸又はその塩を脱水反応に付して得ることができ、例えば、脱水酵素により脱水して得ることができる。ここでいう脱水酵素とは、グルコン酸を脱水して２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸を合成することができれば特に制限はなく、例えばグルコン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素であり、好ましくはＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ由来グルコン酸デヒドラターゼである。
水溶液中でグルコン酸は塩の状態で存在するが、フリー体のグルコン酸に金属水酸化物を添加することで調製してもよく、また、市販のグルコン酸塩を用いてもよい。例えば、グルコン酸ナトリウム、グルコン酸カリウムなどの一価金属塩、グルコン酸カルシウム、グルコン酸バリウム、グルコン酸マグネシウムなどの二価金属塩が挙げられ、好ましくはグルコン酸二価金属塩であり、より好ましくは周期表第２族に属する二価金属からなるグルコン酸二価金属塩を用いることができる。
脱水反応の反応ｐＨ値は、脱水酵素がその活性を維持できればよく、特に制限されないが、ｐＨ５以上９以下の範囲で行うことが好ましく、ｐＨ７以上９以下の範囲で行うことがより好ましい。反応中にｐＨが変動する場合は、適宜調整すれば良い。
脱水反応の反応温度は、脱水酵素がその活性を維持できればよく、特に制限されないが、３０℃以上６０℃以下の範囲が好ましく、３０℃以上５０℃以下の範囲がより好ましい。
脱水反応に添加するグルコン酸濃度は、脱水酵素が阻害を受けない濃度であればよく、特に制限されないが、反応液全量に対して９重量％以上２７重量％以下の範囲が好ましい。また、本反応は基本的に水を溶媒としているが、必要に応じ反応系にアルコールやジメチルスルホキシドなど通常の酵素反応に用いられる有機溶媒を適量添加しても良い。
本実施形態では、グルコン酸を出発物質とし、グルコン酸から２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸を生成する酵素的脱水反応と、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸から２−デオキシリボースを生成する酵素的脱カルボキシル化反応とをワンポット反応で行ってもよい。
ワンポット反応とは、１つの反応容器を用いて多段階反応を行うことを意味し、１つの反応容器で多段階反応を一度に行うことおよび１つの反応が終わった後にこれを原料として同じ反応容器内で次の反応を行うことを含む。
ワンポット反応における脱水酵素は、グルコン酸を脱水して２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸を合成することができれば特に制限はなく、例えばグルコン酸デヒドラターゼであり、好ましくはＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ由来グルコン酸デヒドラターゼである。
ワンポット反応における変異型２−デオキシリボース合成酵素には、前記の変異型２−デオキシリボース合成酵素を用いることができる。
ワンポット反応には脱水酵素と変異型２−デオキシリボース合成酵素を用いるが、両酵素の反応液への添加方法は、反応初期に両酵素を全量添加する方法、反応中に両酵素を分割して添加する方法、又は反応初期に脱水酵素を全量添加し、反応中に脱カルボキシル化酵素を分割して添加する方法等のいずれの方法を用いることができる。また、脱水酵素及び変異型２−デオキシリボース合成酵素をそれぞれ発現する複数の微生物を用いてもよいし、両酵素を発現する単一の微生物を用いてもよい。
本実施形態においてワンポット反応に用いられるグルコン酸もまた、Ｄ−グルコン酸である。
ワンポット反応の反応ｐＨ値は、脱水酵素がその活性を維持できればよく、特に制限されないが、ｐＨ５以上８以下の範囲が好ましく、ｐＨ６．５以上７．５以下の範囲がより好ましい。反応中にｐＨが変動する場合は、適宜調整すれば良い。
ワンポット反応の反応温度は、脱水酵素がその活性を維持できればよく、特に制限されないが、３０℃以上６０℃以下の範囲が好ましく、４０℃以上５０℃以下の範囲で行うことがより好ましい。
ワンポット反応に添加するグルコン酸濃度は、脱水酵素が阻害を受けない濃度であればよく、特に制限されないが、反応液全量に対して１０重量％以上２７重量％以下の範囲で行われる。また、このワンポット反応は基本的に水を溶媒とするが、必要に応じ反応系にアルコールやジメチルスルホキシドなど通常の酵素反応に用いられる有機溶媒を適量添加しても良い。
なお、本実施形態で用いるグルコン酸の二価金属塩は、市販されているグルコン酸と水酸化カルシウム等の二価金属塩とを混合することによって得ることもできるし、市販されているものを使用することもできる。
こうして得られた２−デオキシリボースは、そのまま次の反応に用いてもよいし、カラムクロマトグラフィーや再結晶などを行い精製してもよい。
（２−デオキシリボースから２'−デオキシヌクレオシドの合成）
本実施形態においては、２−デオキシリボ−ス合成能を有する変異型酵素を使用して、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸又はその塩から得られた２−デオキシリボースを用いた任意の一又は複数の反応を経て、２'−デオキシヌクレオシドを製造するものであれば特に限定されない。例えば、第１の実施形態で例示した方法により、２−デオキシリボースから２'−デオキシヌクレオシドを製造することができる。
つづいて、本実施形態の効果について説明する。本実施形態によれば、基質ポケットを形成するアミノ酸残基が野生型と比して少なくとも一つ以上変異している変異型酵素を使用して２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸またはその塩から２−デオキシリボースを製造する。したがって、より工業生産に適した、酵素反応による２−デオキシリボースの製造方法が実現可能になる。
図２は、野生型のベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼの活性部位における２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸とベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼの２８１番目のヒスチジンに相当するアミノ酸（図中、Ｈ２８１）との結合を計算化学により予測した結果を示している。２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸は、３つのヒドロキシ基を有する一方、ヒスチジンは、親水性の高いアミノ酸である。そのため、２―デヒドロ―３―デオキシグルコン酸は、ベンゾイルホルメートのような疎水性の高い基質と比べて、ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼに接近しすぎてしまい、補酵素（この図では、チアミン二リン酸 （ＴＰＰ））との間の距離が離れてしまう。したがって、脱炭酸反応が起こりにくくなってしまうものと推察される。
一方、本実施形態では、例えば、２８１番目のヒスチジンに相当するアミノ酸をより疎水性の高いアミノ酸に置換することで、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸をベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼの活性部位に接近しすぎるのを防いで、補酵素との距離を小さくすることができる。したがって、脱炭酸反応を効率よく進行させることができ、より効率よく２−デオキシリボースを製造することができる。
このように、本実施形態によれば、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸又はその塩若しくはグルコン酸又はその塩を出発物質として用いることにより、従来の製造方法では低収率であった２−デオキシリボースを高収率で得ることができるため、これを用いて２'−デオキシヌクレオシドの工業的製造を生産性よく実行することが可能となる。
＜第３の実施形態＞
本実施形態は、上記（iii）を実行して２'−デオキシヌクレオシドを製造するものである。具体的には、本実施形態は、２−デオキシリボースから２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成能を有する変異型酵素を用いて２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル又はその塩を合成し、得られる２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステルを用いて２'−デオキシヌクレオシドを製造する方法である。
（２−デオキシリボースから２−デオキシリボース−５−リン酸エステル又はその塩の合成）
本実施形態では、まず、２−デオキシリボースにリン酸供与体を酵素反応により作用させて、２−デオキシリボース−５−リン酸エステル又はその塩を合成する。この方法では、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成能を有する野生型酵素に対して少なくとも配列表の配列番号１の配列で示す５７番目、６８番目、８９番目、１２２番目、１２６番目、１３０番目、１３１番目、１３６番目、１７１番目及び１９７番目のいずれかに相当するアミノ酸の１つ以上の変異を含み、かつ、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成能を有する変異型酵素を用いて酵素反応を実行し２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル又はその塩を製造する。
ここでいう２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成能とは、２−デオキシリボ−スを２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル又はその塩に変換する反応を触媒する能力をいう。
本実施形態で用いる変異型酵素（以下「変異型２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成酵素」ともいう。）は、下記のアミノ酸配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）を有する野生型酵素を変異させたものである。アミノ酸配列（ｂ）は、少なくとも１以上のアミノ酸を介して、アミノ酸配列（ａ）とアミノ酸配列（ｃ）とを連結しており、アミノ酸配列（ｃ）は、少なくとも１以上のアミノ酸を介して、アミノ酸配列（ｂ）とアミノ酸配列（ｄ）とを連結している。変異型酵素における変異は、野生型酵素を構成するアミノ酸配列（ａ）の「ＧＳＩ」のセリン（Ｓ）及び「ＹＥＸ」のグルタミン酸（Ｅ）、アミノ酸配列（ｂ）の「Ｌ（Ａ／Ｓ）Ｘ」のアラニン（Ａ）またはセリン（Ｓ）、アミノ酸配列（ｃ）の「ＩＥＤ」のグルタミン酸（Ｅ）、「ＧＤＬ」のアスパラギン酸（Ｄ）、「ＴＲ（Ｓ／Ｇ）」のアルギニン（Ｒ）、Ｒ（Ｓ／Ｇ）Ａのセリン（Ｓ）またはグリシン（Ｇ）、及び「ＸＹＭ」のチロシン（Ｙ）、アミノ酸配列（ｄ）の「ＸＩＧ」のイソロイシン（Ｉ）及び「ＺＬＧ」のロイシン（Ｌ）の少なくとも１つが他のアミノ酸に置換したものである。
（ａ）ＧＳＩＸＦＬＮＤＱＡＭＹＥＸＧＲ
（ｂ）ＤＡＯＬ（Ａ／Ｓ）ＸＧＧＶＡＸＸＦＳＸＡＦＧＪＰＩ
（ｃ）ＫＬＬＴＮＭＩＥＤＡＧＤＬＡＴＲ（Ｓ／Ｇ）ＡＫＢＸＹＭＲＩＲＰＦＡＦＹＧ
（ｄ）ＮＧＳＹＰＳＧＨＴＸＩＧＷＡＪＡＬＶＬＸＥＵＮＰＸＸＱＯＸＩＬＫＲＧＹＺＬＧＸＳＲＶＩＣＧＹＨＷＱＳＤＶＤＡＡＲ
［アミノ酸配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）中、Ｂは、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり、Ｊは、セリン、トレオニン又はチロシンであり、Ｕは、バリン、ロイシン又はイソロイシンであり、Ｏは、アスパラギン酸又はアスパラギンであり、Ｚは、グルタミン酸又はグルタミンであり、Ｘは任意のアミノ酸である。アミノ酸配列（ｂ）中、Ａ／Ｓは、アラニン又はセリンであることを示し、（ｃ）中、Ｓ／Ｇは、セリン又はグリシンであることを示す。］。
具体的には、本実施形態で用いる変異型２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成酵素とは、配列表の配列番号１に示す配列の５７番目のセリン、６８番目のグルタミン酸、８９番目のアラニンまたはセリン、１２２番目のグルタミン酸、１２６番目のアスパラギン酸、１３０番目のアルギニン、１３１番目のセリンまたはグリシン、１３６番目のチロシン、１７１番目のイソロイシン及び１９７番目のロイシンにそれぞれ相当するアミノ酸から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸が置換されたものである。本実施形態において、例えば、配列表の配列番号１の５７番目のセリンに相当するアミノ酸とは、他のタンパク質において、本実施形態の変異型２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成酵素と他のタンパク質間での一次配列の相同性から類推される場合や、タンパク質の立体構造から三次元でアミノ酸が事実上重なると想定される場合も含む。これは、立体構造で同様の位置に配置されるアミノ酸は、仮に一次配列での相同性が低い場合でも、触媒作用や、基質認識においては、同様の作用を持つことが予想されるからである。
上記アミノ酸配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）を有する野生型酵素としては、酸性ホスファタ−ゼ（ＥＣ ３．１．３．２）が好ましく、本実施形態の変異型２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成酵素は、酸性ホスファタ−ゼ（ＥＣ ３．１．３．２）の少なくとも１つ以上のアミノ酸を変異させたものとすることが好ましい。
より具体的には、変異型２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成酵素は、配列表の配列番号１に示す配列の５７番目に相当するアミノ酸をトレオニンに置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１に示す配列の６８番目に相当するアミノ酸をアスパラギン酸に置換したもの、配列表の配列番号１に示す配列の８９番目に相当するアミノ酸をグリシンに置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１に示す配列の１２２番目に相当するアミノ酸をグリシンに置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１に示す配列の１２６番目に相当するアミノ酸を脂肪族アミノ酸又は分岐鎖アミノ酸に置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１に示す配列の１３０番目に相当するアミノ酸をヒスチジンに置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１に示す配列の１３１番目に相当するアミノ酸をアスパラギン、フェニルアラニン又はイソロイシンに置換したもの、配列表の配列番号１に示す配列の１３６番目に相当するアミノ酸をフェニルアラニンに置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１に示す配列の１７１番目に相当するアミノ酸を酸性アミノ酸に置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１に示す配列の１９７番目に相当するアミノ酸を芳香族アミノ酸に置換したものであることが好ましい。
本実施形態において、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成能を有する野生型酵素とは、２−デオキシリボ−スをリン酸化して２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル又はその塩を合成する反応を触媒することができ、かつ、天然に存在する酵素であれば特に制限はなく、例えば、種々の微生物由来の酸性ホスファタ−ゼを用いることができる。具体的には、第１の実施形態で例示した微生物由来の酸性ホスファタ−ゼを用いることができる。
変異型２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成酵素は、上記の２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成能を有する野生型酵素から公知の遺伝子工学的手法により製造及び取得することができる。例えば、前記の微生物が産生する酸性ホスファタ−ゼの分子生物学的な性質やアミノ酸配列等を解析することにより、該酵素をコ−ドする遺伝子を該微生物株より取得し、該遺伝子及び発現に必要な制御領域が挿入された遺伝子組換えプラスミドを構築し、これを任意の宿主に導入し、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成酵素を産生する遺伝子組換え体を作出することができる。
ここでいう発現に必要な制御領域とは、プロモ−タ−配列（転写を制御するオペレ−タ−配列を含む）、リボソ−ム結合配列（ＳＤ配列）、及び転写終結配列等を示している。バクテリアを宿主とした場合、プロモ−タ−配列の具体例としては、大腸菌由来のトリプトファンオペロンのｔｒｐオペレ−タ−、ラクト−スオペロンのｌａｃオペレ−タ−、ラムダファ−ジ由来のＰＬプロモ−タ−及びＰＲプロモ−タ−、枯草菌由来のグルコン酸合成酵素プロモ−タ−、アルカリプロテア−ゼプロモ−タ−、中性プロテア−ゼプロモ−タ−、α−アミラ−ゼプロモ−タ−等が挙げられる。また、ｔａｃプロモ−タ−のように独
自に改変・設計された配列も利用できる。リボソ−ム結合配列としては、大腸菌由来又は枯草菌由来の配列が挙げられるが、大腸菌や枯草菌等の所望の宿主内で機能する配列であれば特に限定されるものではない。例えば、１６Ｓリボソ−ムＲＮＡの３'末端領域に相補的な配列が４塩基以上連続したコンセンサス配列をＤＮＡ合成により作成してこれを利用してもよい。また、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成酵素の上流に位置しているＳＤ配列が利用できるのであれば、そのＳＤ配列を利用するのが好ましい。転写終結配列は必ずしも必要ではないが、ρ因子非依存性のもの、例えばリポプロテインタ−
ミネ−タ−、ｔｒｐオペロンタ−ミネ−タ−等が利用できる。これら制御領域の組換えプラスミド上での配列順序は、５'末端側上流からプロモ−タ−配列、リボソ−ム結合配列、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成酵素をコ−ドする遺伝子、転写終結配列の順に並ぶことが望ましい。ここでいうプラスミドの具体例としては、大腸菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＳＣ１０１や、枯草菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１、φ１０５等をベクタ
−として利用することができる。また、２種類以上の宿主内で自律複製が可能なプラスミドの例として、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７等をベクタ−として利用することができる。
ここでいう任意の宿主には、後述の実施例に記載したような大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が代表例として挙げられるが、大腸菌に限定されるものではなく、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の微生物菌株も含まれる。
本実施形態では、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成酵素そのものだけでなく、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成酵素産生能を有する微生物及び高等生物由来の細胞、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成酵素をコ−ドする遺伝子で形質転換された細胞そのもの及びこれら細胞の破砕物を使用することもできるが、該細胞、該細胞の破砕物及び該細胞の破砕物を硫安沈殿やカラムクロマトグラフィー等の処理を行って精製した２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成酵素活性を含む画分、さらにその画分を担体に担持させた固定化物などを使用することもできる。
２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成酵素をコ−ドする遺伝子において、１つもしくは複数の塩基の置換、欠失、挿入又は転移を含んでいたとしても、２−デオキシリボ−スをリン酸化して２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル又はその塩を合成することができれば使用することができる。また、ＬａｃＺとの融合蛋白質として発現させたり、ヒスチジンタグを付加して発現させたりする場合のように、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成酵素のＮ末端やＣ末端に数残基のアミノ酸が結合していたとしても、２−デオキシリボ−スをリン酸化して２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル
又はその塩を合成することができれば使用することができる。
２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成酵素をコ−ドする遺伝子の目的とする部位に変異を入れる方法としては、ＰＣＲ（ポリメラ−ゼ連鎖反応）を用いる方法やファ−ジを用いる方法などがある。
２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル又はその塩の合成活性が向上した２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成酵素の例としては、配列表の配列番号１に示す配列と実質的に相同であるアミノ酸残基を含み、かつ、野生型の酸性ホスファタ−ゼに対して２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル又はその塩の合成活性を向上させることができる変異を有する２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成酵素が挙げられる。例えば、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来の酸性ホスファタ−ゼにおいて、図３に示す共通配列の中の少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたものが挙げられる。好ましくは、配列表の配列番号１に示す配列の５７番目のセリン、６８番目のグルタミン酸、８９番目のアラニンまたはセリン、１２２番目のグルタミン酸、１２６番目のアスパラギン酸、１３０番目のアルギニン、１３１番目のセリンまたはグリシン、１３６番目のチロシン、１７１番目のイソロイシン及び１９７番目のロイシンにそれぞれ相当するアミノ酸の中の少なくとも１つが置換されたものである。より好ましくは、５７番目のセリンがトレオニンに、６８番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に、８９番目のアラニンまたはセリンがグリシンに、１２２番目のグルタミン酸がグリシンに、１２６番目のアスパラギン酸が脂肪族アミノ酸又は分岐鎖アミノ酸に、１３０番目のアルギニンがヒスチジンに、１３１番目のセリンまたはグリシンがアスパラギン、フェニルアラニン又はイソロイシンに、１３６番目のチロシンがフェニルアラニンに、１７１番目のイソロイシンが酸性アミノ酸に、１９７番目のロイシンが芳香族アミノ酸に置換されたものである。
ここで、脂肪族アミノ酸としてはグリシン又はアラニンが挙げられる。また、分岐鎖アミノ酸としてはバリン、ロイシン又はイソロイシンが挙げられる。芳香族アミノ酸としてはフェニルアラニン又はチロシンが挙げられる。酸性アミノ酸としてはアスパラギン酸又はグルタミン酸が挙げられる。
変異型２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成酵素を得るためには、このようにして、酸性ホスファタ−ゼの特定部位においてアミノ酸残基の置換を行えばよい。ある酸性ホスファタ−ゼの特定部位が別の酸性ホスファタ−ゼにおいてどのアミノ酸残基に相当するのかは配列を比較して判断することができる。いくつかの酸性ホスファタ−ゼのアミノ酸配列を比較した結果を図３に示した。図３中、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ由来の酸性ホスファタ−ゼとしてＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ ＩＦＯ１２０１０が示されており、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｂｌａｔｔａｅ由来の酸性ホスファタ−ゼとしてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｂｌａｔｔａｅ ＪＣＭ１６５０が示されており、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ由来の酸性ホスファタ−ゼとしてＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｌａｎｔｉｃｏｌａ ＩＦＯ１４９３９が示されており、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ由来の酸性ホスファタ−ゼとしてＭｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ ＮＣＩＭＢ１０４６６が示されており、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｔｕａｒｔｉｉ由来の酸性ホスファタ−ゼとしてＰｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｔｕａｒｔｉｉが示されており、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来の酸性ホスファタ−ゼとしてＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ ２ａが示されている。
本実施形態において用いる２−デオキシリボースは、市販されたものを用いてもよいし、第１の実施形態又は第２の実施形態で合成した２−デオキシリボースを用いてもよい。
その他、公知の製造方法によって２−デオキシリボ−スを得てもよい（国際公開第２００４／１１３３５８号パンフレット）。また、製造工程を通して得られた２−デオキシリボ−ス水溶液を単離・精製することなく、次の２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステルの合成反応に用いることも可能である。
２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成反応の反応ｐＨ値は、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成酵素がその活性を維持できればよく、特に制限されないが、ｐＨ２．５以上６．０以下の範囲が好ましく、ｐＨ３．０以上４．５以下の範囲がより好ましい。
２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成反応の反応温度は、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成酵素がその活性を維持できればよく、特に制限されないが、０℃以上４０℃以下の範囲が好ましく、０℃以上２０℃以下の範囲がより好ましく、５℃以上１５℃以下が最も好ましい。
２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成反応に添加する２−デオキシリボ−ス濃度は、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成酵素が阻害を受けない濃度であればよく、特に制限されないが、反応液全量に対して５重量％以上２０重量％以下の範囲で行うことが好ましい。また、本反応は基本的に水を溶媒としているが、必要に応じ反応系にアルコールやジメチルスルホキシドなど通常の酵素反応に用いられる有機溶媒を適量添加しても良い。
２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステルに作用させるリン酸供与体は、２−デオキシリボースにリン酸基を与えて２−デオキシリボース−５−リン酸エステルを合成するものであれば制限はなく、ポリリン酸又はこれらの塩が挙げられる。ポリリン酸又はその塩としては、ピロリン酸、トリポリリン酸、テトラポリリン酸、及び、これらのナトリウム塩若しくはカリウム塩等のアルカリ金属塩が挙げられる。中でも、ピロリン酸又その塩が好ましく、酸性ピロリン酸ナトリウムがより好ましい。これらのリン酸供与体は単独で使用してもよく、２種類以上を併用することもできる。
２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成反応に添加するリン酸供与体の濃度は、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成酵素が阻害を受けない濃度であればよく、特に制限されないが、ピロリン酸又はその塩を用いる場合、添加した２−デオキシリボ−スに対して１．１倍モル以上２．９倍モル以下の範囲で行うことが好ましい。反応に添加したリン酸分子のうち、２−デオキシリボ−スと結合して２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステルとなったリン酸分子以外は排出されるリン酸分子となる。すなわち、（排出されるリン酸分子数）＝｛（反応に添加したピロリン酸分子数×２）−（回収した２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル分子数）｝と計算される。従って、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル反応収率が高いほど、また反応系に加える基質のピロリン酸が少ないほど、排出されるリン酸量は削減される。
リン酸供与体として、酸性ピロリン酸ナトリウムを用いた場合は、反応生成物からナトリウムイオンを除去する方法としては陽イオン交換樹脂による除去方法がある。例えば、アンバーライトＩＲ１２０Ｂ、アンバーライト２００ＣＴ、アンバーライト２５２、アンバーライトＦＰＣ３５００、アンバーライトＩＲＣ７６（オルガノ製）、ダイヤイオンＳＫ１０４、ダイヤイオンＳＫ１Ｂ、ダイヤイオンＳＫ１１０、ダイヤイオンＳＫ１１２、ダイヤイオンＵＢＫ０８、ダイヤイオンＵＢＫ１０、ダイヤイオンＵＢＫ１２、ダイヤイオンＵＢＫ１２０、ダイヤイオンＵＢＫ５１０Ｌ、ダイヤイオンＵＢＫ５３０、ダイヤイオンＵＢＫ５５０、ダイヤイオンＵＢＫ５３５、ダイヤイオンＵＢＫ５５５、ダイヤイオンＰＫ２０８、ダイヤイオンＰＫ２１２、ダイヤイオンＰＫ２１６、ダイヤイオンＰＫ２１８、ダイヤイオンＰＫ２２０、ダイヤイオンＰＫ２２８、ダイヤイオンＷＫ１０、ダイヤイオンＷＫ１１、ダイヤイオンＷＫ１００、ダイヤイオンＷＫ４０Ｌ（三菱化学製）、ＭｕｒｏｍａｃＸＳＣ―１２４４、ＭｕｒｏｍａｃＶＳＣ―１６１４、ＭｕｒｏｍａｃＸＳＣ―１６１４ＭＢ、ＭｕｒｏｍａｃＸＭＣ―３６１４、ＭｕｒｏｍａｃＣ１０１、ＭｕｒｏｍａｃＣ５０１、ＭｕｒｏｍａｃＣ５０２、ＭｕｒｏｍａｃＣ１００１、ＭｕｒｏｍａｃＣ６０２、ＭｕｒｏｍａｃＷＰＣ―６６１２、ダウエックスマラソン、ダウエックスマラソンＭＳＣ、ダウエックスモノスフィアー６５０Ｃ、ダウエックスＨＣＲ―Ｓ、ダウエックス８８、ダウエックスＭＡＣ―３、ダウエックスＣ６０１（ムロマチテクノス製）、レバチットＭＤＳ１３６８、レバチットモノプラスＳＰ１１２、レバチットモノプラスＳＰ１００、レバチットモノプラスＳ１０８、レバチットモノプラスＳ１０８Ｈ（ＬＡＮＸＥＳＳ製）などが挙げられる。好ましくはレバチットＭＤＳ１３６８、である。陽イオン交換樹脂によって分画されたサンプルはｐＨが非常に低くなり、サンプル溶液中に存在する酵素が失活する。例えば分画したサンプル溶液中に２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステルを分解するような酵素が含まれていたとしても、陽イオン交換樹脂による処理を行うことによってそれらを失活させることができる。このようにして得られた２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステルは長期間保存しても安定であり、これは製造現場において非常に重要なことである。
このようにナトリウムイオンを２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステルの反応生成物から除去することで、ｐＨ調整を不要として２'−デオキシヌクレオシドを合成することができる。
（２−デオキシリボース−５−リン酸エステル又はその塩から２'−デオキシヌクレオシドの合成）
本実施形態においては、変異型２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成酵素を用いて２−デオキシリボースから得られた２−デオキシリボース−５−リン酸エステル又はその塩に核酸塩基を作用させて２'−デオキシヌクレオシドを合成するものであれば制限されない。例えば、第１の実施形態で説明したリン酸転移反応及びグリコシル化反応により２'−デオキシヌクレオシドを合成することができる。
ここで、リン酸供与体として酸性ピロリン酸ナトリウムを用いて２−デオキシリボース−５−リン酸エステルを合成した後、上述のナトリウムイオンの除去を行わない場合は、リン酸転移反応及び／又はグリコシル化反応を行う反応液中にナトリウムイオンが混入することで、ｐＨが変化し、目的物や基質の安定性、酵素活性の低下、リン酸との難水溶性塩の未形成などが原因で反応転化率の低下を招くことがある。そこで、反応途中、ｐＨ調整剤によってｐＨを調整しながら合成することで反応転化率の低下を安定して防ぐことができる。
ｐＨ調整剤としては、一般的な酸やアルカリが挙げられる。酵素反応が進行するｐＨ範囲となるように酸やアルカリを添加しながら反応することができる。その他のｐＨ調整剤としては、緩衝液のように反応仕込み時に添加しておくものが挙げられる。緩衝液は反応に伴うｐＨの変化を抑え、酵素反応が進行するｐＨ範囲を維持する働きがある。このような働きをするものとしては二価金属塩も挙げられる。二価金属塩の添加によって反応開始時にあるｐＨに調整しておけば、反応が進んでも反応終了時までに酵素反応が進行する範囲にｐＨを維持することができるのである。二価金属塩の具体的な例としては、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化バリウム、硫酸マグネシウム、硫酸カルシウム、硫酸バリウムなどである。好ましくは、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸カルシウムであり、より好ましくは、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムである。これら二価金属は、一種又は二種以上使用することができる。
また、前述のとおり、２−デオキシリボース−５−リン酸エステルを合成した後の反応生成物からナトリウムイオンを除去している場合は、こうしたｐＨ調整を行わずに、反応転化率の低下を安定して防ぐことができる。
つづいて、本実施形態の効果について説明する。この発明によれば、酸性ホスファタ−ゼのアミノ酸残基が野生型と比して少なくとも１つ以上変異している変異型酵素を使用して２−デオキシリボ−スから２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル又はその塩を製造する。したがって、より工業生産に適した、酵素反応による２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステルが合成可能になり、２'−デオキシヌクレオシドの工業的製造を生産性よく実行することが可能となる。
なお、図３の共通配列において、１つもしくは複数のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は転移を含んでいたとしても、アミノ酸配列の相同性を解析した際に共通配列に相当する箇所であれば、本発明でいうところの共通配列に含まれる。
＜第４の実施形態＞
本実施形態は、下記（i）及び（ii）を実行して、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩から２−デオキシリボ−スを合成する第１工程と、下記（iii）を実行して、２−デオキシリボ−スから２−デオキシ−５−リン酸エステル又はその塩を合成する第２工程と、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル又はその塩から２'−デオキシヌクレオシドを合成する第３工程と、を含む、２'−デオキシヌクレオシドを製造する方法である。
（i）２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩を酵素反応による脱カルボキシル化反応に付して２−デオキシリボ−スを合成する；
（ii）基質ポケットを形成するアミノ酸残基が野生型と比して少なくとも一つ以上変異している２−デオキシリボ−ス合成能を有する変異型酵素を使用して、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸又はその塩から２−デオキシリボ−スを合成する；
（iii）２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成能を有する野生型酵素に対して少なくとも配列表の配列番号１で示す配列の５７番目、６８番目、８９番目、１２２番目、１２６番目、１３０番目、１３１番目、１３６番目、１７１番目及び１９７番目のいずれかに相当するアミノ酸の１つ以上の変異を含み、かつ、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成能を有する変異型酵素を使用して２−デオキシリボ−スから２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル又はその塩を合成し、得られる２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル又はその塩から２'−デオキシヌクレオシドを合成し、
前記野生型酵素は、下記のアミノ酸配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）を有し、前記野生型酵素において、前記アミノ酸配列（ｂ）は、少なくとも１以上のアミノ酸を介して、アミノ酸配列（ａ）とアミノ酸配列（ｃ）とを連結し、前記アミノ酸配列（ｃ）は、少なくとも１以上のアミノ酸を介して、アミノ酸配列（ｂ）とアミノ酸配列（ｄ）とを連結している。
（ａ）ＧＳＩＸＦＬＮＤＱＡＭＹＥＸＧＲ
（ｂ）ＤＡＯＬ（Ａ／Ｓ）ＸＧＧＶＡＸＸＦＳＸＡＦＧＪＰＩ
（ｃ）ＫＬＬＴＮＭＩＥＤＡＧＤＬＡＴＲ（Ｓ／Ｇ）ＡＫＢＸＹＭＲＩＲＰＦＡＦＹＧ
（ｄ）ＮＧＳＹＰＳＧＨＴＸＩＧＷＡＪＡＬＶＬＸＥＵＮＰＸＸＱＯＸＩＬＫＲＧＹＺＬＧＸＳＲＶＩＣＧＹＨＷＱＳＤＶＤＡＡＲ
［アミノ酸配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）中、Ｂは、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり、Ｊは、セリン、トレオニン又はチロシンであり、Ｕは、バリン、ロイシン又はイソロイシンであり、Ｏは、アスパラギン酸又はアスパラギンであり、Ｚは、グルタミン酸又はグルタミンであり、Ｘは任意のアミノ酸である。アミノ酸配列（ｂ）中、Ａ／Ｓは、アラニン又はセリンであることを示し、（ｃ）中、Ｓ／Ｇは、セリン又はグリシンであることを示す。］
本実施形態では、第１工程、第２工程及び第３工程を酵素反応で行う。以下、各工程について説明する。
（第１工程）
第１工程は、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩を酵素的脱カルボキシル化反応に付して２−デオキシリボ−スを合成する。このとき使用する脱カルボキシル化酵素は、基質ポケットを形成するアミノ酸残基が野生型と比して少なくとも一つ以上変異している２−デオキシリボ−ス合成能を有する変異型酵素（「変異型２−デオキシリボ−ス合成酵素」）である。
２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩は、第１の実施形態で使用し得るものを用いることができる。
変異型２−デオキシリボース合成酵素は、第２の実施形態で使用し得るものを用いることができる。
脱カルボキシル化反応の反応条件は、第２の実施形態で採用し得る条件とすることができる。第２の実施形態で説明した条件により、グルコン酸の二価金属の酵素的脱水反応と、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の酵素的脱カルボキシル化反応とをワンポット反応で実行してもよい。
（第２工程）
第２工程は、変異型２−デオキシリボース−５−リン酸エステル合成酵素を使用して、第１工程で得られた２−デオキシリボースにリン酸供与体としてピロリン酸又はその塩を作用させ２−デオキシリボース−５−リン酸エステル又はその塩を合成するものである。第２工程においては、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成能を有する野生型酵素に対して少なくとも配列表の配列番号１で示す配列の５７番目、６８番目、８９番目、１２２番目、１２６番目、１３０番目、１３１番目、１３６番目、１７１番目及び１９７番目のいずれかに相当するアミノ酸の１つ以上の変異を含み、かつ、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成能を有する変異型酵素を使用する。野生型酵素は、下記のアミノ酸配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）を有し、前記野生型酵素において、前記アミノ酸配列（ｂ）は、少なくとも１以上のアミノ酸を介して、アミノ酸配列（ａ）とアミノ酸配列（ｃ）とを連結しているものであり、前記アミノ酸配列（ｃ）は、少なくとも１以上のアミノ酸を介して、アミノ酸配列（ｂ）とアミノ酸配列（ｄ）とを連結している。
（ａ）ＧＳＩＸＦＬＮＤＱＡＭＹＥＸＧＲ
（ｂ）ＤＡＯＬ（Ａ／Ｓ）ＸＧＧＶＡＸＸＦＳＸＡＦＧＪＰＩ
（ｃ）ＫＬＬＴＮＭＩＥＤＡＧＤＬＡＴＲ（Ｓ／Ｇ）ＡＫＢＸＹＭＲＩＲＰＦＡＦＹＧ
（ｄ）ＮＧＳＹＰＳＧＨＴＸＩＧＷＡＪＡＬＶＬＸＥＵＮＰＸＸＱＯＸＩＬＫＲＧＹＺＬＧＸＳＲＶＩＣＧＹＨＷＱＳＤＶＤＡＡＲ
［アミノ酸配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）中、Ｂは、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり、Ｊは、セリン、トレオニン又はチロシンであり、Ｕは、バリン、ロイシン又はイソロイシンであり、Ｏは、アスパラギン酸又はアスパラギンであり、Ｚは、グルタミン酸又はグルタミンであり、Ｘは任意のアミノ酸である。アミノ酸配列（ｂ）中、Ａ／Ｓは、アラニン又はセリンであることを示し、（ｃ）中、Ｓ／Ｇは、セリン又はグリシンであることを示す。］
変異型２−デオキシリボース合成酵素は、第３の実施形態で使用し得るものを用いることができる。また、２−デオキシリボース−５−リン酸エステルの合成条件は、第３の実施形態で説明した条件と同じ条件を用いることができる。
本実施形態において、リン酸供与体として酸性ピロリン酸ナトリウムを用いた場合、２−デオキシリボース−５−リン酸エステルの合成後、反応生成物に含まれる酸性ピロリン酸ナトリウムに由来するナトリウムイオンを除去することが好ましい。ナトリウムイオンを除去する手法は、第３の実施形態で説明したように、陽イオン交換樹脂を用いる方法が挙げられる。ナトリウムイオンを除去しない場合は、塩化マグネシウムや硫酸マグネシウムのような二価金属塩をリン酸転移反応及びグリコシル化反応に添加することによりｐＨを調整しながら反応させることが出来る。
（第３工程）
第３工程は、第２工程で得られた２−デオキシリボース−５−リン酸エステル又はその塩をリン酸転移反応により２−デオキシリボース−１−リン酸エステル又はその塩とし、これに核酸塩基を作用させて、グリコシル化反応により２'−デオキシヌクレオシドを合成するものである。
リン酸化転移反応及びグリコシル化反応は、第１の実施形態で説明した方法を用いることができる。
つづいて、本実施形態の効果について説明する。本実施形態では、第１〜第３の実施形態で説明した（i）、（ii）及び（iii）の全てを実行する。したがって、よりいっそう高収率で生産性がよく工業化に適した２'−デオキシヌクレオシドの製造方法が実現可能となる。
以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
以下に実施例により本発明を詳細に示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜分析条件＞
（１）生成した２−Ｄ−デオキシリボース及び２−デオキシリボースは高速液体クロマトグラフィーにより定量した。分析条件は以下による。
カラム；Ｓｈｏｄｅｘ ＳＵＧＡＲ ＳＣ１０１１ ３００×８．０ｍｍＩ．Ｄ．（昭和電工株式会社製）
カラム温度；８０℃
ポンプ流速；１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出；ＲＩ（示差屈折率計）
溶離液；純水
（２）生成した２−デオキシリボース−５−リン酸エステルはＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）により定量した。分析条件は以下による。
カラム： Ｓｈｏｄｅｘ Ａｓａｈｉｐａｋ ＮＨ２Ｐ−５０ ４Ｅ（昭和電工株式会社）
カラム温度： ４０℃
流速： １．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出： ＲＩ（示差屈折率計）
キャリア： １５０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸二水素ナトリウム（ｐＨ３．０）
（３）生成した２'−デオキシヌクレオシドはＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）により定量した。分析条件は以下による。
カラム： Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＯＤＳ−ＭＧ−５（野村化学株式会社）
カラム温度： ４０℃
流速： １．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出： ＵＶ２８０ｎｍ
キャリア： １０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸／１０ｗｔ％メタノール
なお、実施例では、２−デオキシ−Ｄ−リボースを「ｄＲ」とし、２−デオキシリボース−５−リン酸エステルを「ｄＲ５Ｐ」と表記することもある。
（参考例Ａ１）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａに由来するベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼ遺伝子を発現する大腸菌の調製方法
Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ製）にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＡＴＣＣ １２６３３を植菌して３０℃で２０時間通気攪拌培養を行い、遠心分離によって菌体を回収した。得られた菌体よりＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼ配列の公知情報（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＡＡＣ１５５０２）をもとに、配列表の配列番号５と配列番号６に示す２種のプライマーを作製し、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を以下の条件で行った。１０ｍｍｏｌ／ＬのＫＯＤ−ｐｌｕｓバッファー、１．５μＭのフォワード及びリバースプライマー、１ｍｍｏｌ／Ｌの硫酸マグネシウム、０．２ｍｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰｓ、２ＵのＫＯＤ−ｐｌｕｓポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ製）、５０ｎｇ／μｌのゲノムＤＮＡからなる反応溶液を作成した。９４℃で２分間保持した後、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、６８℃で９０秒間のサーマルサイクルを３０サイクル行った後、最後に６８℃で１０分間保持した。その結果、約１．５ｋｂの増幅断片が得られた。得られた断片をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ処理してｐＵＣ１９に連結し、ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼをコードするＤＮＡを含むプラスミドを作製した。このプラスミドを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換して、ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼ活性の発現株を作製した。作成した発現株よりプラスミドを抽出して、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ１．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いてサンプルを調製し、３１３０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＨＩＴＡＣＨＩ製）により塩基配列を解析した結果、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＡＴＣＣ １２６３３由来ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼ配列の公知情報（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＡＡＣ１５５０２）と同一であることを確認した。７０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ製）に作製した発現株を植菌して３７℃で１５時間通気攪拌培養を行い、遠心分離によって菌体を回収して反応に供した。
（参考例Ａ２）
Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓに由来するグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子を発現する大腸菌の調製方法
７０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ製）に特開２００５−４０１３０号公報に準拠し作成したグルコン酸脱水活性発現株を植菌して３７℃で１５時間通気攪拌培養を行い、遠心分離によって菌体を回収した。
（実施例Ａ１）
Ｄ−グルコン酸カルシウムからの２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸カルシウムの合成
Ｄ−グルコン酸カルシウム一水和物（和光純薬製）８．５ｇを水２５ｇに加え、参考例Ａ２で調製した菌体を０．４４ｇ添加した。４０℃で撹拌を行ったところ、反応時間２４時間で６．４ｇの２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸カルシウムが生成し、反応収率９８モル％であった。また、反応初期のｐＨは８．４、反応終了時のｐＨは７．１であった。
（実施例Ａ２）
２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸カルシウムからの２−デオキシ−Ｄ−リボースの酵素的合成
実施例Ａ１に従い合成した２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸カルシウム１３ｇを含む水溶液６０ｇに、チアミンピロリン酸と硫酸マグネシウムを其々１．０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように加え、参考例Ａ１で調製した菌体を４．４ｇ添加した。４５℃で撹拌を行ったところ、反応時間６時間で３．９ｇの２−デオキシ−Ｄ−リボースを生成し、反応収率４６モル％であり、反応時間２４時間で７．６ｇの２−デオキシ−Ｄ−リボースを生成し、反応収率８８モル％であった。また、反応初期のｐＨは６．２、反応終了時のｐＨは６．９であった。
（実施例Ａ３）
２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸ストロンチウムからの２−デオキシ−Ｄ−リボースの酵素的合成
実施例Ａ１と同様の方法で合成した２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸ストロンチウム５．８ｇを含む水溶液６３ｇに、チアミンピロリン酸と硫酸マグネシウムを其々１．０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように加え、参考例Ａ１で調製した菌体を１．７ｇ添加した。４５℃で撹拌を行ったところ、反応時間６時間で２．３ｇの２−デオキシ−Ｄ−リボースを生成し、反応収率４９モル％であり、反応時間２５時間で４．４ｇの２−デオキシ−Ｄ−リボースを生成し、反応収率９４モル％であった。また、反応初期のｐＨは５．７、反応終了時のｐＨは７．２であった。
（実施例Ａ４）
２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸バリウムからの２−デオキシ−Ｄ−リボースの酵素的合成
実施例Ａ１と同様の方法で合成した２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸バリウム６．４ｇを含む水溶液６３ｇに、チアミンピロリン酸と硫酸マグネシウムを其々１．０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように加え、参考例Ａ１で調製した菌体を１．７ｇ添加した。４５℃で撹拌を行ったところ、反応時間６時間で２．７ｇの２−デオキシ−Ｄ−リボースを生成し、反応収率５８モル％であり、反応時間２５時間で４．３ｇの２−デオキシ−Ｄ−リボースを生成し、反応収率９４モル％であった。また、反応初期のｐＨは６．３、反応終了時のｐＨは６．８であった。
（実施例Ａ５）
２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸カルシウムからの２−デオキシ−Ｄ−リボースの酵素的合成［反応温度］
実施例Ａ１に従い合成した２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸カルシウムを２．９ｇ含有する水溶液１３ｇに、チアミンピロリン酸と硫酸マグネシウムを其々１．０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように加え、参考例Ａ１で調製した菌体を１．０４ｇ添加した。混合液を３０℃から６０℃で２３時間撹拌を行い、２−デオキシ−Ｄ−リボースの生成量を定量した。結果を表１に示した。表１中、ｄＲは、２−デオキシ−Ｄ−リボースである。
（実施例Ａ６）
２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸カルシウムからの２−デオキシ−Ｄ−リボースの酵素的合成［基質濃度］
実施例Ａ１に従い合成した２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸カルシウムを１．６ｇから４．９ｇ含有する水溶液１５ｇに、チアミンピロリン酸と硫酸マグネシウムを其々１．０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように加え、参考例１で調製した菌体を０．６４ｇから１．８８ｇ添加した。混合液を４５℃で２２時間撹拌を行い、２−デオキシ−Ｄ−リボースの生成量を定量した。結果を表２に示した。
（実施例Ａ７）
Ｄ−グルコン酸カルシウムからの２−デオキシ−Ｄ−リボースの酵素的合成
Ｄ−グルコン酸カルシウム・一水和物（和光純薬製）１８ｇを含有する水溶液７３ｇに、チアミンピロリン酸と硫酸マグネシウムを其々１．０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように加え、参考例Ａ１で調製した菌体を２１．３ｇ及び参考例Ａ２で調製した菌体を３．５８ｇ添加した。４５℃で撹拌を行ったところ、反応時間２４時間で１０ｇの２−デオキシ−Ｄ−リボースが生成し、反応収率９３モル％であった。また、反応初期のｐＨは６．０、反応終了時のｐＨは７．２であった。
（実施例Ａ８）
Ｄ−グルコン酸カルシウムからの２−デオキシ−Ｄ−リボースの酵素的合成
Ｄ−グルコン酸カルシウム・一水和物（和光純薬製）１８ｇを含有する水溶液７３ｇに、参考例Ａ２で調製した菌体を３．５８ｇ添加し、４５℃で撹拌を行った。１２時間後チアミンピロリン酸と硫酸マグネシウムを其々１．０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように加え、参考例Ａ１で調製した菌体を２１．３ｇ添加した。４５℃で撹拌を行ったところ、反応時間３６時間で１０ｇの２−デオキシ−Ｄ−リボースが生成し、反応収率９３モル％であった。また、反応初期のｐＨは８．４、１２時間後にチアミンピロリン酸等を添加した後のｐＨは６．１、反応終了時のｐＨは７．２であった。
（実施例Ａ９）
２−デオキシ−Ｄ−リボース水溶液の精製
実施例Ａ１に従い合成した２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸カルシウム１２０ｇを含む水溶液５００ｇに、チアミンピロリン酸と硫酸マグネシウムを其々１．０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように加え、参考例Ａ１で調製した菌体を４３．６ｇ添加した。４５℃で撹拌を行ったところ、反応時間２７時間で７３．１ｇの２−デオキシ−Ｄ−リボースが生成し、反応収率８９モル％であった。また、反応初期のｐＨは６．２、反応終了時のｐＨは６．８であった。この２−デオキシ−Ｄ−リボース溶液にラヂオライト（登録商標）を２７．５ｇ添加し、撹拌した後、５Ａのろ紙を用いて吸引ろ過により炭酸カルシウムを除去し、２−デオキシ−Ｄ−リボース６８．７ｇを含む水溶液５０３ｇを得た。
（比較例Ａ１）
２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸ナトリウムからの２−デオキシ−Ｄ−リボースの酵素的合成反応
２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸ナトリウム１３ｇを含む水溶液６０ｇに、チアミンピロリン酸と硫酸マグネシウムを其々１．０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように加え、参考例Ａ１で調製した菌体を５．２ｇ添加した。４５℃で撹拌を行い、反応時間６時間で２．９ｇの２−デオキシ−Ｄ−リボースが生成し、反応収率２９モル％であり、反応時間２４時間で３．８ｇの２−デオキシ−Ｄ−リボースが生成し、反応収率３８モル％であった。また、反応初期のｐＨは６．４、反応終了時のｐＨは８．９であった。
（比較例Ａ２）
Ｄ−グルコン酸ナトリウムからの２−デオキシ−Ｄ−リボースの酵素的合成反応
Ｄ−グルコン酸ナトリウム１８ｇを含む水溶液７４ｇに、チアミンピロリン酸と硫酸マグネシウムを其々１．０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように加え、参考例Ａ１で調製した菌体を２２．０ｇ及び参考例Ａ２で調製したグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子を発現する菌体を３．６８ｇ添加した。４５℃で撹拌を行ったところ、反応時間２４時間で６．４ｇの２−デオキシ−Ｄ−リボースが生成し、反応収率５８モル％であった。また、反応初期のｐＨは６．０、反応終了時のｐＨは８．７であった。
（参考例Ａ３）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａに由来する変異型ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼ遺伝子を発現する大腸菌の調製方法
配列表の配列番号７と配列番号８に示した２種のプライマーを作製し、参考例Ａ１で調整したプラスミドを鋳型として以下の条件でＰＣＲを行った。１０ｍｍｏｌ／ＬのＫＯＤ−ｐｌｕｓバッファー、１．５μＭのフォワードおよびリバースプライマー、１ｍｍｏｌ／Ｌの硫酸マグネシウム、０．２ｍｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰｓ、２ＵのＫＯＤ−ｐｌｕｓポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ製）、１０ｎｇ／μｌのｐＰＰＢＦＤからなる反応溶液を作成した。９７℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で５分間のサーマルサイクルを１１サイクル行った。その結果、約４．５ｋｂの増幅断片が得られた。得られた増幅断片をＤｐｎＩ処理し、その溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。作製した株よりプラスミドを調製して塩基配列を決定したところ、配列表の配列番号９に示す塩基配列において、目的の塩基が置換されていることを確認した。このように、配列表の配列番号１０に示すアミノ酸配列の２８１番目のヒスチジン残基をコードしている遺伝子コドンｃａｃをｔｔｔに置換して、配列表の配列番号１０に示すアミノ酸配列の２８１番目のヒスチジン残基がフェニルアラニン残基に置換された変異型ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼをコードする変異型遺伝子を含むプラスミドを作製した。同様にして、配列表の配列番号１１及び配列番号１２に示したプライマーを用いて、配列表の配列番号１０に示すアミノ酸配列の２８１番目のヒスチジン残基をコードしている遺伝子コドンｃａｃをｔａｔに置換して、配列表の配列番号１０に示すアミノ酸配列の２８１番目のヒスチジン残基がチロシン残基に置換された変異型ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼをコードする変異型遺伝子を含むプラスミドを作製した。これら作成したプラスミドを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換して、変異型ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼ遺伝子を発現する大腸菌を作製した。７０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ製）に作製した発現株を植菌して３７℃で１５時間通気攪拌培養を行い、遠心分離によって菌体を回収して反応に供した。
（実施例Ａ１０）
変異型ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼを用いた２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸カルシウムからの２−デオキシ−Ｄ−リボースの酵素的合成
実施例Ａ１に従い合成した２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸カルシウム１３ｇを含む水溶液６０ｇに、チアミンピロリン酸と硫酸マグネシウムを其々１．０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように加え、参考例Ａ３で調製した菌体を１．３ｇ添加した。４５℃で撹拌を行ったところ、反応時間２４時間で、２８１番目のヒスチジン残基をフェニルアラニン残基に置換した変異体では７．４ｇ、２８１番目のヒスチジン残基をチロシン残基に置換した変異体では７．１ｇの２−デオキシ−Ｄ−リボースを生成し、反応収率はそれぞれ９８モル％、９５モル％であった。また、反応初期のｐＨは、２８１番目のヒスチジン残基をフェニルアラニン残基に置換した変異体では６．３、２８１番目のヒスチジン残基をチロシン残基に置換した変異体では６．２、反応終了時のｐＨはそれぞれ７．５、７．３であった。
Ｄ−グルコン酸又は２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸の二価金属塩を用いた実施例Ａ１〜Ａ１０では、反応中にｐＨが大きく変化せず、高い反応収率を得ることができた。一方、Ｄ−グルコン酸又は２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸の一価金属塩を用いた比較例Ａ１、２では、反応中にｐＨが大きく変化し、低い反応収率となっている。このような場合は酸でｐＨ調整すれば、高い反応収率を得ることができる。また、Ｄ−グルコン酸又は２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸の二価金属塩を用いた実施例Ａ１〜Ａ１０では、副生する炭酸イオンと二価金属塩が不溶性の塩を形成し、沈澱するため、濾過により簡単に精製して、金属イオンをほとんど含まない純度の高い２−デオキシ−Ｄ−リボース水溶液を得ることができる。
一方、Ｄ−グルコン酸又は２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸の一価金属塩を用いた場合は、不溶性の塩を形成しないため、大量の金属イオンを含んだ純度の低い２−デオキシ−Ｄ−リボース水溶液となる。
実施例Ａ１〜Ａ１０で得られる純度の高い２−デオキシ−Ｄ−リボースを用いて次の２−デオキシ−Ｄ−リボースをリン酸化して２−デオキシ−Ｄ−リボース‐５‐リン酸エステルを合成する反応を行った場合、高い反応収率で２−デオキシ−Ｄ−リボース‐５‐リン酸エステルを得ることができる。
比較例Ａ１、２で得られる純度の低い２−デオキシ−Ｄ−リボース水溶液では、水溶液中に含まれる大量の金属イオンは次工程の反応に持ち込むこととなる。例えば、Ｄ−グルコン酸ナトリウムや２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸ナトリウムを用いて２−デオキシ−Ｄ−リボースを合成した場合、２−デオキシ−Ｄ−リボース水溶液中に多くのナトリウムイオンが含まれるため、次の２−デオキシ−Ｄ−リボースをリン酸化して２−デオキシ−Ｄ−リボース‐５‐リン酸エステルを合成する反応において反応阻害を起こし、得られる２−デオキシ−Ｄ−リボース−５−リン酸エステルの反応収率は低くなる。
このようにして得られる２−Ｄ−デオキシリボース水溶液を用いて公知の反応を経てチミジン、２'−デオキシアデノシン、２'−デオキシグアノシン等の ２'−デオキシヌクレオシドを合成することができる。例えば、特許文献２又はArchives of biochemistry and biophysiscs, 164, 567-570 (1974）に記載された方法により２−Ｄ−デオキシリボースを２−デオキシ−Ｄ−リボース−５−リン酸エステルとし、特許文献８の方法により、２'−デオキシヌクレオシドとする方法が挙げられる。
（参考例Ｂ１）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼ遺伝子の単離
Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ製）にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＡＴＣＣ １２６３３を植菌して３０℃で２０時間通気攪拌培養を行い、遠心分離によって菌体を回収した。得られた菌体よりＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼ配列の公知情報（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＡＡＣ１５５０２）をもとに、配列表の配列番号１９及び配列番号２０に示した２種のプライマーを作製し、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として以下の条件でＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行った。１０ｍｍｏｌ／ＬのＫＯＤ−ｐｌｕｓバッファー、１．５μＭのフォワードおよびリバースプライマー、１ｍｍｏｌ／Ｌの硫酸マグネシウム、０．２ｍｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰｓ、２ＵのＫＯＤ−ｐｌｕｓポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ製）、５０ｎｇ／μｌのゲノムＤＮＡからなる反応溶液を作製した。９４℃で２分間保持した後、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、６８℃で９０秒間のサーマルサイクルを３０サイクル行った後、最後に６８℃で１０分間保持した。その結果、約１．５ｋｂの増幅断片が得られた。得られた断片をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ処理してｐＵＣ１９に連結し、ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドを作製した。このプラスミドをｐＰＰＢＦＤと命名した。ｐＰＰＢＦＤを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換して、ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼ遺伝子を発現する大腸菌ＤＨ５α／ｐＰＰＢＦＤを作製した。作製した発現株よりプラスミドを抽出して、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ１．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いてサンプルを調製し、３１３０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＨＩＴＡＣＨＩ製）により塩基配列を解析した結果、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＡＴＣＣ １２６３３由来ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼ配列の公知情報（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＡＡＣ１５５０２）と同一であることを確認した。７０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ製）に作製した発現株を植菌して３７℃で１５時間通気攪拌培養を行い、遠心分離によって菌体を回収して反応に供した。
（実施例Ｂ１）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来変異型ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼ遺伝子を発現する大腸菌の作製
配列表の配列番号２１及び配列番号２２に示した２種のプライマーを作製し、参考例Ｂ１で調製したｐＰＰＢＦＤを鋳型として以下の条件でＰＣＲを行った。１０ｍｍｏｌ／ＬのＫＯＤ−ｐｌｕｓバッファー、１．５μＭのフォワードおよびリバースプライマー、１ｍｍｏｌ／Ｌの硫酸マグネシウム、０．２ｍｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰｓ、２ＵのＫＯＤ−ｐｌｕｓポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ製）、１０ｎｇ／μｌのｐＰＰＢＦＤからなる反応溶液を作製した。９７℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で５分間のサーマルサイクルを１１サイクル行った。その結果、約４．５ｋｂの増幅断片が得られた。得られた増幅断片をＤｐｎＩ処理し、その溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。作製した株よりプラスミドを調製して塩基配列を決定したところ、配列表の配列番号２３に示す塩基配列において、目的の塩基が置換されていることを確認した。このように、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列の２８１番目のヒスチジン残基をコードしている遺伝子コドンｃａｃをｔｔｔに置換して、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列の２８１番目のヒスチジン残基がフェニルアラニン残基に置換された変異型ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼをコードする変異型遺伝子を含むプラスミドを作製した。このプラスミドをｐＰＰＢＦＤｍ１と命名した。同様にして、配列表の配列番号２４及び配列番号２５に示したプライマーを用いて、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列の２８１番目のヒスチジン残基をコードしている遺伝子コドンｃａｃをｔａｔに置換して、配列表の配列番号２に示すアミノ酸配列の２８１番目のヒスチジン残基がチロシン残基に置換された変異型ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼをコードする変異型遺伝子を含むプラスミドを作製した。このプラスミドをｐＰＰＢＦＤｍ２と命名した。これら作成したプラスミドを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換して、変異型ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼ遺伝子を発現する大腸菌ＤＨ５α／ｐＰＰＢＦＤｍ１、大腸菌ＤＨ５α／ｐＰＰＢＦＤｍ２をそれぞれ作製した。７０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ製）に作製した発現株を植菌して３７℃で１５時間通気攪拌培養を行い、遠心分離によって菌体を回収して反応に供した。
（参考例Ｂ２）
Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ由来グルコン酸デヒドラターゼ遺伝子を発現する大腸菌の調製方法
７０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ製）に特開２００５−４０１３０号公報の実施例７に準拠して、同公報の図１で示されるプラスミドで形質転換した大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０を植菌して３７℃で１５時間通気攪拌培養を行い、遠心分離によって菌体を回収した。
（参考例Ｂ３）
２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸カルシウムの合成
グルコン酸カルシウム・一水和物（キシダ化学製）８．５ｇを水２５ｇに加え、参考例Ｂ２で調製した菌体０．４４ｇを添加した。４０℃で２４時間反応した結果、７．４ｇの２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸カルシウムが生成した。
（実施例Ｂ２）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来変異型ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼを用いた２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸カルシウムからの２−デオキシリボースの合成
参考例Ｂ３に従い合成した２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸カルシウム１．９ｇを含む水溶液９ｇに、１ｍｍｏｌ／Ｌチアミンピロリン酸、１ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸マグネシウムとなるように混合し、参考例Ｂ１及び実施例Ｂ１で得られた菌体０．３ｇをそれぞれ添加して、４５℃で反応させた。反応液をＨＰＬＣで分析した結果を表３に示した。
（参考例Ｂ４）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来およびＣｈｒｏｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ由来ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼ遺伝子の単離
参考例Ｂ１を参考にして、配列表の配列番号２６及び配列番号２７に示したプライマーを用いてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｐｆ−５よりベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子を単離し、この遺伝子を含むプラスミドを作製してｐＰＦＢＦＤと命名した。また、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ製）に１０重量％の塩化ナトリウムを添加して培養した以外は同様にして、配列表の配列番号２８及び配列番号２９に示したプライマーを用いてＣｈｒｏｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ ｓａｌｅｘｉｇｅｎｅｓ ＤＳＭ３０４３よりベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼをコードする遺伝子を単離し、この遺伝子を含むプラスミドを作製してｐＣＳＢＦＤと命名した。作製したｐＰＦＢＦＤおよびｐＣＳＢＦＤの塩基配列を解析した結果、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ Ｐｆ−５およびＣｈｒｏｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ ｓａｌｅｘｉｇｅｎｅｓ ＤＳＭ３０４３由来ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼ配列の公知情報（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＹＰ＿２６０５８１およびＹＰ＿５７２３７０）と同一であることを確認した。
（実施例Ｂ３）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来およびＣｈｒｏｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ由来変異型ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼ遺伝子を発現する大腸菌の作製
実施例Ｂ１を参考にして、参考例Ｂ４で作成したｐＰＦＢＦＤを鋳型として、配列表の配列番号３０及び配列番号３１に示したプライマーを用いてＰＣＲを行い、配列表の配列番号３２に示す塩基配列において、配列表の配列番号３２に示す２８１番目のヒスチジン残基をコードしている遺伝子コドンｃａｃをｔｔｃに置換して、配列表の配列番号３に示すアミノ酸配列の２８１番目のヒスチジン残基がフェニルアラニン残基に置換された変異型ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼをコードするＤＮＡを含むプラスミドを作製した。作製したプラスミドをｐＰＦＢＦＤｍ１と命名した。また、同様に、実施例Ｂ１を参考にして、参考例Ｂ４で作成したｐＣＳＢＦＤを鋳型として、配列表の配列番号３３及び配列番号３４に示したプライマーを用いてＰＣＲを行い、配列表の配列番号３５に示す塩基配列において、配列表の配列番号４に示す２８１番目のヒスチジン残基をコードしている遺伝子コドンｃａｃをｔｔｃに置換して、配列表の配列番号４に示すアミノ酸配列の２８１番目のヒスチジン残基がフェニルアラニン残基に置換された変異型ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼをコードするＤＮＡを含むプラスミドを作製した。作製したプラスミドをｐＣＳＢＦＤｍ１と命名した。これら作製したプラスミドを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換して、変異型ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼ遺伝子を発現する大腸菌ＤＨ５α／ｐＰＦＢＦＤｍ１および大腸菌ＤＨ５α／ｐＣＳＢＦＤｍ１をそれぞれ作製した。作製した株よりプラスミドを調製して塩基配列を決定したところ、目的の塩基が置換されていることを確認した。７０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ製）に作製した発現株を植菌して３７℃で１５時間通気攪拌培養を行い、遠心分離によって菌体を回収して反応に供した。
（実施例Ｂ４）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来およびＣｈｒｏｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ由来変異型ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼを用いた２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸カルシウムからの２−デオキシリボースの合成
実施例Ｂ２と同様にして、参考例Ｂ２及び実施例Ｂ３で得られた菌体をそれぞれ用いて４５℃で２４時間反応させた。反応液をＨＰＬＣで分析した結果を表４に示した。
（参考例Ｂ５）
２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸マグネシウムの合成
グルコン酸マグネシウム・ｘ水和物（キシダ化学製）８０ｇを水３００ｇに加え、参考例Ｂ２で調製した菌体４．２ｇを添加した。４０℃で１８時間反応した結果、５８ｇの２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸マグネシウムが生成した。
（参考例Ｂ６）
２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸ストロンチウムの合成
４５〜５０重量％グルコン酸水溶液（キシダ化学製）１００ｇに水１５０ｇを添加し、ｐＨ７．４となるように水酸化ストロンチウム（和光純薬製）を添加したのち、参考例Ｂ２で調製した菌体３．５ｇを添加した。４０℃で２４時間反応した結果、６２ｇの２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸ストロンチウムが生成した。
（参考例Ｂ７）
２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸バリウムの合成
参考例Ｂ５と同様にして、水酸化バリウム（キシダ化学製）を用いて４０℃で２４時間反応した結果、７４ｇの２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸バリウムが生成した。
（実施例Ｂ５）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来変異型ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼを用いた２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸マグネシウム、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸ストロンチウムおよび２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸バリウムからの２−デオキシリボースの合成
参考例Ｂ５に従い合成した２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸マグネシウム５．２２ｇ、参考例Ｂ６に従い合成した２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸ストロンチウム７．００ｇおよび参考例Ｂ７に従い合成した２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸バリウム８．１３ｇを含む各水溶液２９ｇに、１ｍｍｏｌ／Ｌチアミンピロリン酸、１ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸マグネシウムとなるように混合し、参考例Ｂ１及び実施例Ｂ１で得られた菌体０．７ｇをそれぞれ添加して、４５℃で反応させた。反応液をＨＰＬＣで分析した結果を表５に示した。
（実施例Ｂ６）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来変異型ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼを用いたグルコン酸カルシウムからの２−デオキシリボースの合成
グルコン酸カルシウム・一水和物（キシダ化学製）１８ｇに、１ｍｍｏｌ／Ｌチアミンピロリン酸、１ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸マグネシウムとなるように混合し、参考例Ｂ２で得られた菌体３．６ｇ、参考例Ｂ１及び実施例Ｂ１で得られた菌体２．３ｇを添加して、４５℃で２４時間反応させた。反応液をＨＰＬＣで分析した結果を表６に示した。
実施例Ｂ２、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６で得られた２−デオキシリボース水溶液を公知の反応を経てチミジン、２'−デオキシアデノシン、２'−デオキシグアノシンをそれぞれ合成できる。例えば、特許文献２又はArchives of biochemistry and biophysiscs, 164, 567-570 (1974）に記載された方法により２−デオキシリボースを２−デオキシリボース−５−リン酸エステルとし、特許文献８の方法により、２'−デオキシヌクレオシドとする方法が挙げられる。
（実験例Ｃ１）
Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼ遺伝子を発現する大腸菌の作製
国際公開第２００５／０４５０５２号パンフレットの参考例１に準拠してＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来酸性ホスファターゼをコードする遺伝子を含むプラスミドを作製し、このプラスミドをｐＳＦＡＰと命名した。ｐＳＦＡＰを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換してＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来酸性ホスファターゼ遺伝子を発現する大腸菌を作製した。
目的のアミノ酸残基に変異が入るようにデザインしたフォワード及びリバースプライマーを用いて、ｐＳＦＡＰを鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、約４．０ｋｂの増幅断片が得られた。得られた増幅断片をＤｐｎＩ処理し、その溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。作製した株よりプラスミドを調製して塩基配列を決定したところ、配列表の配列番号３６に示す塩基配列において、目的の塩基が置換されていることを確認した。
このように、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列の様々なアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型酸性ホスファターゼをコードする変異型遺伝子を含むプラスミドを作製した。作製したプラスミドと導入した変異点、及び、その作製の際に用いたプライマーを表７に示した。
これら作製したプラスミドを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換して、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼ遺伝子を発現する大腸菌を作製した。７０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ製）に作製した大腸菌を植菌して３７℃で１５時間通気攪拌培養を行い、遠心分離によって菌体を回収して反応に供した。
（実験例Ｃ２）
Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼを用いた２−デオキシリボースからの２−デオキシリボース−５−リン酸エステルの合成
酸性ピロリン酸ナトリウム２．５ｇ、２−デオキシリボース（東京化成製）１．０ｇを含む水溶液１０ｇに、実験例Ｃ１で調製した菌体０．５ｇをそれぞれ添加して１０℃で反応させた。生成した２−デオキシリボース−５−リン酸エステルをＨＰＬＣで定量した結果を表８及び図４に示した。
（実験例Ｃ３）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｂｌａｔｔａｅ由来野生型酸性ホスファターゼ遺伝子を発現する大腸菌の作製
Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ製）にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｂｌａｔｔａｅ ＪＣＭ１６５０を植菌して３０℃で２０時間通気攪拌培養を行い、遠心分離によって菌体を回収した。得られた菌体よりＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｂｌａｔｔａｅ由来酸性ホスファターゼ配列の公知情報（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＢＡＡ８４９４２）をもとに配列表の配列番号４７と配列表の配列番号４８に示した２種のプライマーを用いて、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、約０．８ｋｂの増幅断片が得られた。得られた断片をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ処理してｐＵＣ１９に連結し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｂｌａｔｔａｅ由来酸性ホスファターゼをコードする遺伝子を含むプラスミドを作製した。このプラスミドをｐＥＢＡＰと命名した。ｐＥＢＡＰを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換して、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｂｌａｔｔａｅ由来酸性ホスファターゼ遺伝子を発現する大腸菌を作製した。作製した発現株よりプラスミドを調製して塩基配列を解析した結果、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｂｌａｔｔａｅ由来酸性ホスファターゼ配列の公知情報（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＢＡＡ８４９４２）と同一であることを確認した。
作製した発現株を実験例Ｃ１と同様にして菌体を調製し、反応に供した。
（実験例Ｃ４）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｂｌａｔｔａｅ由来変異型酸性ホスファターゼ遺伝子を発現する大腸菌の作製
目的のアミノ酸残基に変異が入るようにデザインしたフォワード及びリバースプライマーを用いて、ｐＥＢＡＰを鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、約４．０ｋｂの増幅断片が得られた。得られた増幅断片をＤｐｎＩ処理し、その溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。作製した株よりプラスミドを調製して塩基配列を決定したところ、配列表の配列番号４９に示す塩基配列において、目的の塩基が置換されていることを確認した。このように、配列表の配列番号５０に示すアミノ酸配列の様々なアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型酸性ホスファターゼをコードする変異型遺伝子を含むプラスミドを作製した。作製したプラスミドと導入した変異点、及び、その作製の際に用いたプライマーを表９に示した。これら作製したプラスミドを用いて実験例Ｃ１と同様にして菌体を調製し、反応に供した。
（実験例Ｃ５）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｂｌａｔｔａｅ由来変異型酸性ホスファターゼを用いた２−デオキシリボースからの２−デオキシリボース−５−リン酸エステルの合成
酸性ピロリン酸ナトリウム２．５ｇ、２−デオキシリボース（東京化成製）１．０ｇを含む水溶液１０ｇに、実験例Ｃ３及び実験例Ｃ４で調製した菌体０．２５ｇをそれぞれ添加して１０℃で反応させた。生成した２−デオキシリボース−５−リン酸エステルをＨＰＬＣで定量した結果を表１０及び図５に示した。
（実験例Ｃ６）
二重変異を導入したＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼ遺伝子を発現する大腸菌の作製
目的のアミノ酸残基に変異が入るようにデザインしたフォワード及びリバースプライマーを用いて、実験例Ｃ１で作製したプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、二重変異が導入されたＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼ遺伝子を発現する大腸菌を作製した。作製したプラスミドと導入した変異点、その作製の際に用いたプライマー、及び、鋳型として用いたプラスミドを表１１に示した。これら作製したプラスミドを用いて実験例Ｃ１と同様にして菌体を調製し、反応に供した。
（実験例Ｃ７）
二重変異を導入したＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼを用いた２−デオキシリボースからの２−デオキシリボース−５−リン酸エステルの合成
酸性ピロリン酸ナトリウム２．５ｇ、２−デオキシリボース（東京化成製）１．０ｇを含む水溶液１０ｇに、実験例Ｃ１で調製した菌体のうちｐＳＦＡＰを用いて調製した菌体、及び、実験例Ｃ６で調製した菌体０．５ｇをそれぞれ添加して１０℃で反応させた。生成した２−デオキシリボース−５−リン酸エステルをＨＰＬＣで定量した結果を表１２及び図６（ａ）、図６（ｂ）に示した。
（実験例Ｃ８）
三重変異を導入したＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼ遺伝子を発現する大腸菌の作製
配列表の配列番号６３及び配列番号６４に示した２種のプライマーを用いてｐＳＦＡＰｍ１を鋳型としてＰＣＲを行い、１７１番目のイソロイシンをトレオニンに置換したＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼ遺伝子をコードするプラスミドｐＳＦＡＰｍ１５、及び作製したｐＳＦＡＰｍ１５で形質転換した大腸菌を作製した。さらにこのｐＳＦＡＰｍ１５を鋳型として、目的のアミノ酸残基に変異が入るようにデザインしたフォワード及びリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、三重変異が導入されたＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼ遺伝子を発現
する大腸菌を作製した。作製したプラスミドと導入した変異点、及び、その作製の際に用いたプライマーを表１３に示した。
これら作製したプラスミドを用いて実験例Ｃ１と同様にして菌体を調製し、得られた菌体を２０ｍｍｏｌ／Ｌトリスバッファー（ｐＨ７．５）に懸濁して１０重量％となるように調製したものを反応に供した。
（実験例Ｃ９）
三重変異を導入したＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼを用いた２−デオキシリボースからの２−デオキシリボース−５−リン酸エステルの合成
１．５ｍｏｌ／ｌのピロリン酸水溶液と１．５ｍｏｌ／ｌのピロリン酸カリウム水溶液でｐＨ３．５となるように調製したピロリン酸水溶液３．５ｇに、０．５ｍｏｌ／ｌに調製した２−デオキシリボース（東京化成製）の水溶液５．５ｇを混合し、実験例Ｃ８で調製した菌体のうちｐＳＦＡＰｍ１５及びｐＳＦＡＰｍ２８を用いて調製した菌体１．０ｇをそれぞれ添加して１０℃で反応させた。生成した２−デオキシリボース−５−リン酸エステルをＨＰＬＣで定量した結果を表１４及び図７（ｂ）に示した。
（実験例Ｃ１０）
三重変異を導入したＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼを用いた２−デオキシリボースからの２−デオキシリボース−５−リン酸エステルの合成
１．５ｍｏｌ／ｌのピロリン酸水溶液と１．５ｍｏｌ／ｌのピロリン酸カリウム水溶液でｐＨ３．５となるように調製したピロリン酸水溶液３．５ｇに、０．６ｍｏｌ／ｌに調製した２−デオキシリボース（東京化成製）の水溶液４．５ｇを混合し、実験例Ｃ８で調製した菌体のうちｐＳＦＡＰｍ１５及びｐＳＦＡＰｍ３１を用いて調製した菌体２．０ｇをそれぞれ添加して１０℃で反応させた。生成した２−デオキシリボース−５−リン酸エステルをＨＰＬＣで定量した結果を表１５及び図８（ａ）に示した。
（実験例Ｃ１１）
三重変異を導入したＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼ遺伝子を発現する大腸菌の作製
実験例Ｃ８で作製したｐＳＦＡＰｍ１５を鋳型として、目的のアミノ酸残基に変異が入るようにデザインしたフォワード及びリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、三重変異が導入されたＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼ遺伝子を発現する大腸菌を作製した。作製したプラスミドと導入した変異点、及び、その作製の際に用いたプライマーを表１６に示した。
これら作製したプラスミドを用いて実験例Ｃ１と同様にして菌体を調製し、得られた菌体を２０ｍｍｏｌ／Ｌトリスバッファー（ｐＨ７．５）に懸濁して１０重量％となるように調製したものを反応に供した。
（実験例Ｃ１２）
三重変異を導入したＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼを用いた２−デオキシリボースからの２−デオキシリボース−５−リン酸エステルの合成
１．５ｍｏｌ／ｌのピロリン酸水溶液と１．５ｍｏｌ／ｌのピロリン酸カリウム水溶液でｐＨ３．５となるように調製したピロリン酸水溶液３．５ｇに、０．５ｍｏｌ／ｌに調製した２−デオキシリボース（東京化成製）の水溶液５．５ｇを混合し、実験例Ｃ８で調製した菌体のうちｐＳＦＡＰｍ１５を用いて調製した菌体、並びに、実験例Ｃ１１で調製した菌体のうちｐＳＦＡＰｍ１６、ｐＳＦＡＰｍ１７、ｐＳＦＡＰｍ１８、ｐＳＦＡＰｍ１９、ｐＳＦＡＰｍ２０、ｐＳＦＡＰｍ２１、ｐＳＦＡＰｍ２２、ｐＳＦＡＰｍ２３、ｐＳＦＡＰｍ２４、ｐＳＦＡＰｍ２５、ｐＳＦＡＰｍ２６、ｐＳＦＡＰｍ２７及びｐＳＦＡＰｍ２９を用いて調製した菌体１．０ｇをそれぞれ添加して１０℃で反応させた。生成した２−デオキシリボース−５−リン酸エステルをＨＰＬＣで定量した結果を表１７及び図７（ａ）、図７（ｂ）に示した。
（実験例Ｃ１３）
三重変異を導入したＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼを用いた２−デオキシリボースからの２−デオキシリボース−５−リン酸エステルの合成
１．５ｍｏｌ／ｌのピロリン酸水溶液と１．５ｍｏｌ／ｌのピロリン酸カリウム水溶液でｐＨ３．５となるように調製したピロリン酸水溶液３．５ｇに、０．６ｍｏｌ／ｌに調製した２−デオキシリボース（東京化成製）の水溶液４．５ｇを混合し、実験例Ｃ８で調製した菌体のうちｐＳＦＡＰｍ１５を用いて調製した菌体、並びに、実験例Ｃ１１で調製した菌体のうちｐＳＦＡＰｍ３０、ｐＳＦＡＰｍ３２、ｐＳＦＡＰｍ３３、ｐＳＦＡＰｍ３４、ｐＳＦＡＰｍ３５、ｐＳＦＡＰｍ３６、ｐＳＦＡＰｍ３７、ｐＳＦＡＰｍ３８及びｐＳＦＡＰｍ３９を用いて調製した菌体２．０ｇをそれぞれ添加して１０℃で反応させた。生成した２−デオキシリボース−５−リン酸エステルをＨＰＬＣで定量した結果を表１８及び図８（ａ）、図８（ｂ）に示した。
（実験例Ｃ１４）
四重変異を導入したＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼ遺伝子を発現する大腸菌の作製
目的のアミノ酸残基に変異が入るようにデザインしたフォワード及びリバースプライマーを用いて、ｐＳＦＡＰｍ２８を鋳型としてＰＣＲを行い、四重変異が導入されたＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼ遺伝子を発現する大腸菌を作製した。作製したプラスミドと導入した変異点、及び、その作製の際に用いたプライマーを表１９に示した。
これら作製したプラスミドを用いて実験例Ｃ８と同様にして菌体を調製し、反応に供した。
（実験例Ｃ１５）
四重変異を導入したＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼを用いた２−デオキシリボースからの２−デオキシリボース−５−リン酸エステルの合成
１．５ｍｏｌ／ｌのピロリン酸水溶液と１．５ｍｏｌ／ｌのピロリン酸カリウム水溶液でｐＨ３．５となるように調製したピロリン酸水溶液３．５ｇに、０．６ｍｏｌ／ｌに調製した２−デオキシリボース（東京化成製）の水溶液４．５ｇを混合し、実験例Ｃ８で調製した菌体のうちｐＳＦＡＰｍ２８を用いて調製した菌体、及び、実験例Ｃ１４で調製した菌体２．０ｇをそれぞれ添加して１０℃で反応させた生成した２−デオキシリボース−５−リン酸エステルをＨＰＬＣで定量した結果を表２０、図９（ａ）、図９（ｂ）及び図１０に示した。
（実験例Ｃ１６）
１２６番目に変異を導入したＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼ遺伝子を発現する大腸菌の作製
配列表の配列番号４６と配列番号４７に示した２種のプライマーを用いてｐＳＦＡＰｍ８を鋳型としてＰＣＲを行い、１９７番目のロイシンをチロシンに置換したＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼ遺伝子をコードするプラスミドｐＳＦＡＰｍ６０、及び、作製したｐＳＦＡＰｍ６０で形質転換した大腸菌を作製した。さらにこのｐＳＦＡＰｍ６０を鋳型として、１２６番目が目的のアミノ酸残基に置換されるようにデザインしたフォワード及びリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、１２６番目が様々なアミノ酸に置換されたＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼ遺伝子を発現する大腸菌を作製した。作製したプラスミドと導入したアミノ酸、及び、その作製の際に用いたプライマーを表２１に示した。これら作製したプラスミドを用いて実験例Ｃ１と同様にして菌体を調製し、反応に供した。
（実験例Ｃ１７）
１２６番目に変異を導入したＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼを用いた２−デオキシリボースからの２−デオキシリボース−５−リン酸エステルの合成
酸性ピロリン酸ナトリウム２．５ｇ、２−デオキシリボース（東京化成製）１．０ｇを含む水溶液１０ｇに、実験例Ｃ１６で調製した菌体０．５ｇをそれぞれ添加して１０℃で反応させた。生成した２−デオキシリボース−５−リン酸エステルをＨＰＬＣで定量した結果を表２２及び図１１に示した。
（実験例Ｃ１８）
１２６番目に変異を導入したＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼ遺伝子を発現する大腸菌の作製
配列表の配列番号１４３と配列番号１４４に示した２種のプライマーを用いて実験例Ｃ１６で作製したｐＳＦＡＰｍ６０を鋳型としてＰＣＲを行い、１２６番目のアミノ酸がフェニルアラニンに置換されたＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼ遺伝子をコードするプラスミドｐＳＦＡＰｍ６４を作製した。作製したプラスミドｐＳＦＡＰｍ６４を用いて実験例Ｃ１と同様にして菌体を調製し、反応に供した。
（実験例Ｃ１９）
１２６番目に変異を導入したＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼを用いた２−デオキシリボースからの２−デオキシリボース−５−リン酸エステルの合成
酸性ピロリン酸ナトリウム２．５ｇ、２−デオキシリボース（東京化成製）１．０ｇを含む水溶液１０ｇに、実験例Ｃ１６で調製した菌体のうちｐＳＦＡＰｍ６０を用いて調製した菌体、及び、実験例Ｃ１８で調製した菌体０．５ｇをそれぞれ添加して１０℃で反応させた。生成した２−デオキシリボース−５−リン酸エステルをＨＰＬＣで定量した結果を表２３及び図１１に示した。
（実験例Ｃ２０）
１７１番目に変異を導入したＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼ遺伝子を発現する大腸菌の作製
配列表の配列番号１４５と配列番号１４６に示した２種のプライマーを用いてｐＳＦＡＰｍ２８を鋳型としてＰＣＲを行い、１７１番目のトレオニンをアスパラギン酸に置換したＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼ遺伝子をコードするプラスミドｐＳＦＡＰｍ６８を作製した。ｐＳＦＡＰｍ６８を用いて実験例Ｃ８と同様にして菌体を調製し、反応に供した。
（実験例Ｃ２１）
１７１番目に変異を導入したＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼを用いた２−デオキシリボースからの２−デオキシリボース−５−リン酸エステルの合成
１．５ｍｏｌ／ｌのピロリン酸水溶液と１．５ｍｏｌ／ｌのピロリン酸カリウム水溶液でｐＨ３．５となるように調製したピロリン酸水溶液３．５ｇに、０．６ｍｏｌ／ｌに調製した２−デオキシリボース（東京化成製）の水溶液４．５ｇを混合し、実験例８で調製した菌体のうちｐＳＦＡＰｍ２８を用いて調製した菌体、及び、実験例２０で調製した菌体２．０ｇをそれぞれ添加して１０℃で反応させた。生成した２−デオキシリボース−５−リン酸エステルをＨＰＬＣで定量した結果を表２４及び図１２に示した。
（実験例Ｃ２２）
１７１番目に変異を導入したＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼ遺伝子を発現する大腸菌の作製
１７１番目が目的のアミノ酸残基に置換されるようにデザインしたフォワード及びリバースプライマーを用いて、ｐＳＦＡＰｍ２８を鋳型としてＰＣＲを行い、１７１番目が様々なアミノ酸置換されたＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼ遺伝子を発現する大腸菌を作製した。作製したプラスミドと導入したアミノ酸、及び、その作製の際に用いたプライマーを表２５に示した。これら作成したプラスミドを用いて実験例Ｃ８と同様にして菌体を調製し、反応に供した。
（実験例Ｃ２３）
１７１番目に変異を導入したＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼを用いた２−デオキシリボースからの２−デオキシリボース−５−リン酸エステルの合成
１．５ｍｏｌ／ｌのピロリン酸水溶液と１．５ｍｏｌ／ｌのピロリン酸カリウム水溶液でｐＨ３．５となるように調製したピロリン酸水溶液３．５ｇに、０．６ｍｏｌ／ｌに調製した２−デオキシリボース（東京化成製）の水溶液４．５ｇを混合し、実験例Ｃ８で調製した菌体のうちｐＳＦＡＰｍ２８を用いて調製した菌体、及び、実験例Ｃ２２で調製した菌体２．０ｇをそれぞれ添加して１０℃で反応させた。生成した２−デオキシリボース−５−リン酸エステルをＨＰＬＣで定量した結果を表２６及び図１２に示した。
（実験例Ｃ２４）
１９７番目に変異を導入したＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼ遺伝子を発現する大腸菌の作製
配列表の配列番号６５と配列番号６６に示した２種のプライマーを用いてｐＳＦＡＰｍ６１を鋳型としてＰＣＲを行い、１９７番目のロイシンをフェニルアラニンに置換したＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼ遺伝子をコードするプラスミドｐＳＦＡＰｍ７４を作製した。これら作製したプラスミドを用いて実験例Ｃ１と同様にして菌体を調製し、反応に供した。
（実験例Ｃ２５）
１９７番目に変異を導入したＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼを用いた２−デオキシリボースからの２−デオキシリボース−５−リン酸エステルの合成
酸性ピロリン酸ナトリウム２．５ｇ、２−デオキシリボース１．０ｇ（東京化成製）を含む水溶液１０ｇに、実験例Ｃ１６で調製した菌体のうちｐＳＦＡＰｍ６１を用いて調製した菌体、及び、実験例Ｃ２４で調製した菌体０．５ｇをそれぞれ添加して１０℃で反応させた。生成した２−デオキシリボース−５−リン酸エステルをＨＰＬＣで定量した結果を表２７及び図１３に示した。
（実験例Ｃ２６）
１９７番目に変異を導入したＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼ遺伝子を発現する大腸菌の作製
１９７番目が目的のアミノ酸残基に置換されるようにデザインしたフォワード及びリバースプライマーを用いて、ｐＳＦＡＰｍ６１を鋳型としてＰＣＲを行い、１９７番目が様々なアミノ酸置換されたＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼ遺伝子を発現する大腸菌を作製した。作製したプラスミドと導入したアミノ酸、及び、その作製の際に用いたプライマーを表２８に示した。これら作成したプラスミドを用いて実験例Ｃ１と同様にして菌体を調製し、反応に供した。
（実験例Ｃ２７）
１９７番目に変異を導入したＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼを用いた２−デオキシリボースからの２−デオキシリボース−５−リン酸エステルの合成
酸性ピロリン酸ナトリウム２．５ｇ、２−デオキシリボース（東京化成製）１．０ｇを含む水溶液１０ｇに、実験例Ｃ１６で調製した菌体のうちｐＳＦＡＰｍ６１を用いて調製した菌体、及び、実験例Ｃ２６で調製した菌体０．５ｇをそれぞれ添加して１０℃で反応させた。生成した２−デオキシリボース−５−リン酸エステルをＨＰＬＣで定量した結果を表２９及び図１３に示した。
（実験例Ｃ２８）
五重変異を導入したＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼ遺伝子を発現する大腸菌の作製
目的のアミノ酸残基に変異が入るようにデザインしたフォワード及びリバースプライマーを用いて、ｐＳＦＡＰｍ６１を鋳型としてＰＣＲを行い、五重変異が導入されたＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼ遺伝子を発現する大腸菌を作製した。作製したプラスミドと導入した変異点、及び、その作製の際に用いたプライマーを表３０に示した。これら作製したプラスミドを用いて実験例Ｃ１と同様にして菌体を調製し、反応に供した。
（実験例Ｃ２９）
五重変異を導入したＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼを用いた２−デオキシリボースからの２−デオキシリボース−５−リン酸エステルの合成
酸性ピロリン酸ナトリウム２．５ｇ、２−デオキシリボース（東京化成製）１．０ｇを含む水溶液１０ｇに、実験例Ｃ１６で調製した菌体のうちｐＳＦＡＰｍ６１を用いて調製した菌体、及び、実験例Ｃ２８で調製した菌体０．５ｇをそれぞれ添加して１０℃で反応させた。生成した２−デオキシリボース−５−リン酸エステルをＨＰＬＣで定量した結果を表３１及び図１４に示した。
（実験例Ｃ３０）
五重変異を導入したＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼ遺伝子を発現する大腸菌の作製
目的のアミノ酸残基に変異が入るようにデザインしたフォワード及びリバースプライマーを用いて、ｐＳＦＡＰｍ６１を鋳型としてＰＣＲを行い、五重変異が導入されたＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼ遺伝子を発現する大腸菌を作製した。作製したプラスミドと導入した変異点、及び、その作製の際に用いたプライマーを表３２に示した。これら作製したプラスミドを用いて実験例Ｃ１と同様にして菌体を調製し、反応に供した。
（実験例Ｃ３１）
五重変異を導入したＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼを用いた２−デオキシリボースからの２−デオキシリボース−５−リン酸エステルの合成酸性
酸性ピロリン酸ナトリウム２．５ｇ、２−デオキシリボース（東京化成製）１．０ｇを含む水溶液１０ｇに、実験例Ｃ１６で調製した菌体のうちｐＳＦＡＰｍ６１を用いて調製した菌体、及び、実験例Ｃ３０で調製した菌体０．５ｇをそれぞれ添加して１０℃で反応させた。生成した２−デオキシリボース−５−リン酸エステルをＨＰＬＣで定量した結果を表３３及び図１４に示した。
（実験例Ｃ３２）
グルコン酸より合成した２−デオキシリボースを用いた２−デオキシリボース−５−リン酸エステルの合成
実施例Ａ２に従い合成し、ろ紙を用いて吸引濾過した２−デオキシリボース２．６ｇを含む水溶液に酸性ピロリン酸６．５ｇを添加後、水で３０ｇに調製し、実験例Ｃ１６で調製した菌体のうちｐＳＦＡＰｍ６１を用いて調製した菌体、及び、実験例Ｃ２８で調製した菌体０．６ｇを添加して１０℃で反応させた。生成した２−デオキシリボース−５−リン酸エステルをＨＰＬＣで定量した結果を表３４及び図１８に示した。
（実験例Ｃ３３）
六重変異を導入したＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼ遺伝子を発現する大腸菌の作製
配列表の配列番号１７５と配列番号１７６に示した２種のプライマーを用いてｐＳＦＡＰｍ７８を鋳型としてＰＣＲを行い、８９番目のセリンをグリシンに置換したＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼ遺伝子をコードするプラスミドｐＳＦＡＰｍ８１、及び、作製したｐＳＦＡＰｍ８１で形質転換した大腸菌を作製した。作製したプラスミドを用いて実験例Ｃ８と同様にして菌体を調製し、反応に供した。
（実験例Ｃ３４）
六重変異を導入したＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼを用いた２−デオキシリボースからの２−デオキシリボース−５−リン酸エステルの合成
酸性ピロリン酸ナトリウム１．２５ｇ、２−デオキシリボース０．７５ｇを含む水溶液５ｇに、実験例Ｃ３０で調製した菌体のうちｐＳＦＡＰｍ７８を用いて調製した菌体、及び、実験例Ｃ３３で調製した菌体０．２ｇをそれぞれ添加して１０℃で反応させた。生成した２−デオキシリボース−５−リン酸エステルをＨＰＬＣで定量した結果を表３５及び図１５に示した。
（実験例Ｃ３５）
１３１番目に変異を導入した七重変異を導入したＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼ遺伝子を発現する大腸菌の作製
１３１番目が目的のアミノ酸残基に置換されるようにデザインしたフォワード及びリバースプライマーを用いて、ｐＳＦＡＰｍ８１を鋳型としてＰＣＲを行い、七重変異が導入されたＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼ遺伝子を発現する大腸菌を作製した。作製したプラスミドと導入した変異点、及び、その作製の際に用いたプライマーを表３６に示した。これら作製したプラスミドを用いて実験例Ｃ８と同様にして菌体を調製し、反応に供した。
（実験例Ｃ３６）
七重変異を導入したＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼを用いた２−デオキシリボースからの２−デオキシリボース−５−リン酸エステルの合成
酸性ピロリン酸ナトリウム１．２５ｇ、２−デオキシリボース０．７５ｇ（東京化成製）を含む水溶液５ｇに、実験例Ｃ３３で調製した菌体、及び、実験例Ｃ３５で調製した菌体０．２ｇをそれぞれ添加して１０℃で反応させた。生成した２−デオキシリボース−５−リン酸エステルをＨＰＬＣで定量した結果を表３７及び図１６に示した。
（実験例Ｃ３７）
Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼ遺伝子を発現する大腸菌の作製
実験例Ｃ１で作製したｐＳＦＡＰを鋳型として、目的のアミノ酸残基に変異が入るようにデザインしたフォワード及びリバースプライマーを用いてＰＣＲを行い、変異が導入されたＳｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼ遺伝子を発現する大腸菌を作製した。作製したプラスミドと導入した変異点、及び、その作製の際に用いたプライマーを表３８に示した。
これら作製したプラスミドを用いて実験例Ｃ１と同様にして菌体を調製し、反応に供した。
（実験例Ｃ３８）
Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ由来変異型酸性ホスファターゼを用いた２−デオキシリボースからの２−デオキシリボース−５−リン酸エステルの合成
酸性ピロリン酸ナトリウム２．５ｇ、２−デオキシリボース１．０ｇ（東京化成製）を含む水溶液１０ｇに、実験例Ｃ３７で調製した菌体０．５ｇをそれぞれ添加して１０℃で反応させた。生成した２−デオキシリボース−５−リン酸エステルをＨＰＬＣで定量した結果を表３９及び図１７に示した。
（実験例Ｃ３９）
２−デオキシリボース−５−リン酸エステル水溶液中のリン酸除去
実験例Ｃ３２に従い合成した２−デオキシリボース−５−リン酸エステル水溶液１００ｇに、冷却した状態で攪拌しながら水酸化マグネシウムを少しずつ添加してｐＨを９．０にした。ろ過後、水溶液中の２−デオキシリボース−５−リン酸エステル量をＨＰＬＣで分析した結果、７．８ｇの２−デオキシリボース−５−リン酸エステルが含まれていた。
（実験例Ｃ４０）
２−デオキシリボース−５−リン酸エステルの精製
陽イオン交換樹脂ＭＤＳ１３６８（ＬＡＮＸＥＳＳ製）３Ｌを充填したカラムに、実験例Ｃ３２に従い合成した２−デオキシリボース−５−リン酸エステル水溶液２４７０ｇを通液させて分画した。ｐＨ１以下の分画サンプルを集めたところ、２−デオキシリボース−５−リン酸エステルは２６０ｇ含まれていた。溶液中のナトリウムイオン濃度は、陽イオン交換樹脂通液前が３．７８ｗｔ％、通液後が０．０６ｗｔ％だった。
（実験例Ｃ４１）
２−デオキシリボース−５−リン酸エステル水溶液中のリン酸除去
実験例Ｃ４０に従い合成した２−デオキシリボース−５−リン酸エステル水溶液１５００ｇを冷却しながら攪拌し、そこへ水酸化マグネシウム１１０ｇを少しずつ添加した。添加後、２５℃に上げて４時間攪拌した。その液を濾過した後、水溶液中の２−デオキシリボース−５−リン酸エステル量をＨＰＬＣで分析した結果、１００ｇの２−デオキシリボース−５−リン酸エステルが含まれていた。溶液中のリン酸濃度は、水酸化マグネシウム処理前が５．９ｗｔ％、処理後が０．２ｗｔ％だった。
（実験例Ｃ４２）
ｄＲ５Ｐ水溶液の安定性
実験例Ｃ４１に従い調製した２−デオキシリボース−５−リン酸エステル水溶液を２０〜６０℃に保持し、４８時間後に水溶液中に存在する２−デオキシリボース−５−リン酸エステルをＨＰＬＣで定量して求めた残存率を表４０に示した。
（参考例Ｃ１）
ホスホペントムターゼ遺伝子を高発現する大腸菌の調製
ＬＢ ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ製）に大腸菌ＭＧ１６５５を植菌して３０℃で２０時間通気攪拌培養を行い、遠心分離によって菌体を回収した。得られた菌体よりＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。大腸菌ＭＧ１６５５由来ホスホペントムターゼ配列の公知情報（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 Ｕ０００９６）をもとに、配列表の配列番号１３及び配列番号１４に示した２種のプライマーを作製し、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行った。その結果、約１．２ｋｂの増幅断片が得られた。得られた断片をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ処理してｐＵＣ１９に連結し、ホスホペントムターゼをコードする遺伝子を含むプラスミドを作製した。このプラスミドを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換して、ホスホペントムターゼ遺伝子を高発現する大腸菌を作製した。作製した高発現株よりプラスミドを調製して塩基配列を解析した結果、大腸菌ＭＧ１６５５由来ホスホペントムターゼ配列の公知情報（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 Ｕ０００９６）と同一であることを確認した。７０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）に作製した高発現株を植菌して３７℃で１５時間通気攪拌培養を行い、遠心分離によって菌体を回収して反応に供した。
（参考例Ｃ２）
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ由来ホスホペントムターゼ遺伝子を高発現する大腸菌の調製
ＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ製）にＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＬＴ２を植菌して３０℃で２０時間培養を行い、遠心分離によって菌体を回収した。得られた菌体よりＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＬＴ２由来ホスホペントムターゼ配列の公知情報（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＡＥ００８９１５）をもとに配列表の配列番号１８９及び配列番号１９０に示した２種のプライマーを作製し、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行った。その結果、約１．２ｋｂの増幅断片が得られた。得られた断片をＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ処理してｐＵＣ１９に連結し、ホスホペントムターゼをコードする遺伝子を含むプラスミドを作製した。このプラスミドを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換して、ホスホペントムターゼ遺伝子を高発現する大腸菌を作製した。作製した高発現株よりプラスミドを調製して塩基配列を解析した結果、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ＬＴ２由来ホスホペントムターゼ配列の公知情報（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＡＥ００８９１５）と同一であることを確認した。７０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）に作製した高発現株を植菌して３７℃で１５時間通気攪拌培養を行い、遠心分離によって菌体を回収した。回収した菌体に硫酸マンガンを添加し、室温で３０分攪拌したものを反応に供した。
（参考例Ｃ３）
Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来ホスホペントムターゼ遺伝子を高発現する大腸菌の調製
Ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚ ＴＹＥ培地（Ｄｉｆｃｏ製）にＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−１６３を植菌して７０℃で２０時間培養を行い、遠心分離によって菌体を回収した。得られた菌体よりＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−１６３由来ホスホペントムターゼ配列の公知情報（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号ＮＣ＿００５８３５）をもとに配列表の配列番号１９１及び配列番号１９２に示した２種のプライマーを作製し、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行った。その結果、約１．２ｋｂの増幅断片が得られた。得られた断片をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII処理してｐＵＣ１９に連結し、ホスホペントムターゼをコードする遺伝子を含むプラスミドを作製した。このプラスミドを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換して、ホスホペントムターゼ遺伝子を高発現する大腸菌を作製した。作製した高発現株よりプラスミドを調製して塩基配列を解析した結果、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＡＴＣＣ ＢＡＡ−１６３由来ホスホペントムターゼ配列の公知情報（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＮＣ＿００５８３５）と同一であることを確認した。７０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ製）に作製した高発現株を植菌して３７℃で１５時間通気攪拌培養を行い、遠心分離によって菌体を回収して反応に供した。
（参考例Ｃ４）
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来ホスホペントムターゼ遺伝子を高発現する大腸菌の調製
ＶＹ培地にＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ ３３６７７を植菌して３０℃で２０時間通気攪拌培養を行い、遠心分離によって菌体を回収した。得られた菌体よりＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ ３３６７７由来ホスホペントムターゼ配列の公知情報（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 Ｕ３２６８５）をもとに配列番号１９３及び配列番号１９４に示した２種のプライマーを作製し、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行った。その結果、約１．２ｋｂの増幅断片が得られた。得られた断片をＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ処理してｐＵＣ１９に連結し、ホスホペントムターゼをコードする遺伝子を含むプラスミドを作製した。このプラスミドを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換して、ホスホペントムターゼ遺伝子を高発現する大腸菌を作製した。作製した高発現株よりプラスミドを調製して塩基配列を解析した結果、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ ３３６７７由来ホスホペントムターゼ配列の公知情報（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 Ｕ３２６８５）と同一であることを確認した。７０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ製）に作製した高発現株を植菌して３７℃で１５時間通気攪拌培養を行い、遠心分離によって菌体を回収して反応に供した。
（参考例Ｃ５）
チミジンホスホリラーゼ遺伝子を高発現する大腸菌の調製
配列表の配列番号１５及び配列番号１６に示した２種のプライマーを用いてＰＣＲを行った以外は参考例Ｃ１と同様に操作を行い、チミジンホスホリラーゼ遺伝子を高発現する大腸菌を作製した。塩基配列を解析した結果、大腸菌ＭＧ１６５５由来チミジンホスホリラーゼ配列の公知情報（Ｇｅｎｂａｎｋ受け入れ番号 ＮＰ＿４１８７９９）と同一であることを確認した。７０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ製）に作製した高発現株を植菌して３７℃で１５時間通気攪拌培養を行い、遠心分離によって回収した菌体を反応に供した。
（参考例Ｃ６）
プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子を高発現する大腸菌の調製
配列番号１７及び配列番号１８に示した２種のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIIIで処理を行った以外は参考例Ｃ１と同様に操作を行い、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子を高発現する大腸菌を作製した。７０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ製）に作製した高発現株を植菌して３７℃で１５時間通気攪拌培養を行い、遠心分離によって回収した菌体を反応に供した。
（実験例Ｃ４３）
チミジン合成
実験例Ｃ３９で得られた２−デオキシリボース−５−リン酸エステル２．３ｇを含む水溶液にチミン１．１ｇ、硫酸マンガン・一水和物０．０２ｇ、水酸化マグネシウム０．５０ｇ、塩化マグネシウム・６水和物１．７ｇを添加して４０ｇに調製し、参考例Ｃ１、参考例Ｃ２、参考例Ｃ３又は参考例Ｃ４で調製した菌体０．４０ｇ及び、参考例Ｃ５で調製した菌体０．２０ｇをそれぞれ添加して４０℃で２０時間反応させた。生成したチミジンをＨＰＬＣで分析した結果を表４１に示した。
（実験例Ｃ４４）
２−デオキシリボース−５−リン酸エステルからのチミジン合成
実験例Ｃ３９で得られた２−デオキシリボース−５−リン酸エステル２．３ｇを含む水溶液にチミン１．１ｇ、硫酸マンガン・一水和物０．０２ｇ、水酸化マグネシウム１．０ｇを添加して４０ｇに調製し、参考例Ｃ１、参考例Ｃ２、参考例Ｃ３又は参考例Ｃ４で調製した菌体０．４０ｇ及び参考例５で調製した菌体０．２０ｇをそれぞれ添加して４０℃で２０時間反応させた。生成したチミジンをＨＰＬＣで分析した結果、０．２３ｇのチミジンが生成した。
（実験例Ｃ４５）
２−デオキシリボース−５−リン酸エステルからの２'−デオキシヌクレオシド合成
実験例Ｃ３９で得られた２−デオキシリボース−５−リン酸エステル２．９ｇを含む水溶液に硫酸マンガン・一水和物０．０２ｇ、水酸化マグネシウム０．６３ｇ、塩化マグネシウム・６水和物２．２ｇを添加後、アデニンもしくはグアニン１．５ｇを添加して４０ｇに調製し、参考例Ｃ１で調製した菌体０．７７ｇ及び参考例Ｃ６で調製した菌体０．２０ｇをそれぞれ添加して５０℃で２２時間反応させた。生成した２'−デオキシヌクレオシドをＨＰＬＣで分析した結果を表４２に示した。
（実験例Ｃ４６）
２−デオキシリボース−５−リン酸エステルからのチミジン合成
実験例Ｃ４１に従い合成した２−デオキシリボース−５−リン酸エステル２．３４ｇを含む水溶液にチミン１．１ｇ、硫酸マンガン・一水和物０．０２ｇ、水酸化マグネシウム１．２ｇを添加して４２ｇに調製し、参考例Ｃ１で調製した菌体０．４ｇ及び参考例Ｃ５で調製した菌体０．３ｇをそれぞれ添加して、４０℃で８時間反応させた。生成したチミジンをＨＰＬＣで分析した結果、１．９ｇのチミジンが生成した。
（実験例Ｃ４７）
２−デオキシリボース−５−リン酸エステルからのチミジン合成
実験例Ｃ４１に従い合成した２−デオキシリボース−５−リン酸エステル１２．５ｇを含む水溶液にチミン６．４ｇ、硫酸マンガン・一水和物０．１４ｇを添加して１５０ｇに調製し、参考例Ｃ２で調製した菌体４．２ｇ及び参考例Ｃ５で調製した菌体１．２ｇをそれぞれ添加した。反応液のｐＨが７．５〜９．０の範囲になるように水酸化カルシウム適宜添加しながら２７℃で６時間反応させた。生成したチミジンをＨＰＬＣで分析した結果、１２．７ｇのチミジンが生成した。
（実験例Ｃ４８）
２−デオキシリボース−５−リン酸エステルからのチミジン合成反応
実験例Ｃ３９に従い合成した２−デオキシリボース−５−リン酸エステル１４．１ｇを含む水溶液にチミン６．６ｇ、硫酸マンガン・一水和物０．１２ｇ、水酸化マグネシウム２．８８ｇ、硫酸マグネシウム・一水和物７．５２ｇを添加して１５０ｇに調製し、参考例Ｃ１で調製した菌体２．４ｇ及び参考例Ｃ５で調製した菌体１．２ｇをそれぞれ添加した。それぞれ添加して４０℃で２０時間反応させた。生成したチミジンをＨＰＬＣで分析した結果、１１．５ｇのチミジンが生成した。
（実験例Ｃ４９）
２―デオキシリボース―５―リン酸エステル水溶液中のリン酸除去
実験例Ｃ４０に従い合成した２―デオキシリボース―５―リン酸エステル水溶液４００ｇを冷却しながら攪拌し、そこへ水酸化マグネシウム２５ｇおよび水酸化カルシウム２ｇを少しずつ添加した。添加後、１５℃で４時間攪拌した。その液を濾過した後、水溶液中の２―デオキシリボース―５―リン酸エステル量をＨＰＬＣで分析した結果、２３．９ｇの２―デオキシリボース―５―リン酸エステルが含まれていた。溶液中のリン酸濃度は、水酸化カルシウム／水酸化マグネシウム処理前が３．４ｗｔ％、処理後が０．２ｗｔ％だった。
実験例Ｃ３９、Ｃ４１およびＣ４９で調製した２―デオキシリボース―５―リン酸エステル水溶液をろ紙を引いて吸引濾過したところ、実験例４１およびＣ４９で調製した２―デオキシリボース―５―リン酸エステル水溶液は、実験例Ｃ３９で調製した２―デオキシリボース―５―リン酸エステル水溶液よりも濾過速度が速く、処理時間を短縮できた。
（実験例Ｃ５０）
チミジン合成
実験例Ｃ３５で作製したｐＳＦＡＰｍ８２、ｐＳＦＡＰｍ８３、ｐＳＦＡＰｍ８４を用いて形質転換した大腸菌をそれぞれ用いて、実験例Ｃ３２、実験例Ｃ４０、実験例Ｃ４１、実験例Ｃ４２、実験例Ｃ４６、実験例Ｃ４７、実験例Ｃ４９と同様の操作を実施したところ、それぞれほぼ同等の結果が得られた。
本発明の他の態様を以下に例示する。
第１の例
［１］２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩を脱カルボキシル化反応に付する工程を含む、２−デオキシリボ−スの製造方法。
［２］二価金属が周期表第２族に属する金属から選択された少なくとも１種である、［１］に記載の２−デオキシリボ−スの製造方法。
［３］周期表第２族に属する金属がカルシウム、ストロンチウム、バリウムから選択された少なくとも１種である、［２］に記載の２−デオキシリボ−スの製造方法。
［４］脱カルボキシル化反応に付する前記工程において、酵素反応により２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の脱カルボキシル化反応を行う、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の２−デオキシリボ−スの製造方法。
［５］脱カルボキシル化反応に付する前記工程における酵素反応が、ケト酸デカルボキシラ−ゼ活性を有する酵素により触媒される、［４］に記載の２−デオキシリボ−スの製造方法。
［６］ケト酸デカルボキシラ−ゼ活性を有する前記酵素が、ベンゾイルホルメ−トデカルボキシラ−ゼである、［５］に記載の２−デオキシリボ−スの製造方法。
［７］グルコン酸の二価金属塩を脱水反応に付する工程をさらに含み、
脱水反応に付する前記工程において、グルコン酸の二価金属塩から得られる２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩を用いて、脱カルボキシル化反応に付する前記工程を実行する、［１］乃至［６］いずれか１項に記載の２−デオキシリボ−スの製造方法。
［８］脱水反応に付する前記工程と、脱カルボキシル化反応に付する前記工程とをワンポットで行う、［７］に記載の２−デオキシリボ−スの製造方法。
［９］脱水反応に付する前記工程において、酵素反応によりグルコン酸の二価金属塩の脱水反応を行う、［７］又は［８］に記載の２−デオキシリボ−スの製造方法。
［１０］脱水反応に付する前記工程における前記酵素反応が、グルコン酸デヒドラタ−ゼ活性を有する酵素により触媒される、［９］に記載の２−デオキシリボ−スの製造方法。
［１１］グルコン酸デヒドラタ−ゼ活性を有する前記酵素が、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓに由来する酵素である、［１０］に記載の２−デオキシリボ−スの製造方法。
［１２］グルコン酸の二価金属塩が、Ｄ−グルコン酸の二価金属塩である、［７］〜［１１］いずれか１項に記載の２−デオキシリボ−スの製造方法。
［１３］２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩が、２−デヒドロ−３−Ｄ−デオキシグルコン酸の二価金属塩である、［１］〜［１２］いずれか１項に記載の２−デオキシリボ−スの製造方法。
第２の例
［１４］酵素反応により、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸またはその塩から２−デオキシリボ−スを製造する２−デオキシリボ−スの製造方法であって、
基質ポケットを形成するアミノ酸残基が野生型と比して少なくとも一つ以上変異している２−デオキシリボ−ス合成能を有する変異型酵素を使用することを特徴とする２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸またはその塩からの２−デオキシリボ−スの製造方法。
［１５］前記変異型酵素が野生型のベンゾイルホルメ−トデカルボキシラ−ゼ（ＥＣ４．１．１．７）を変異させたものである、［１４］に記載の２−デオキシリボ−スの製造方法。
［１６］前記変異型酵素が配列表の配列番号２で示す配列の２８１番目に相当するアミノ酸を芳香族アミノ酸に置換したものである、［１４］又は［１５］に記載の２−デオキシリボ−スの製造方法。
［１７］前記芳香族アミノ酸がフェニルアラニン又はチロシンである、［１６］に記載の２−デオキシリボ−スの製造方法。
［１８］前記変異型酵素を用いて２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩から２−デオキシリボ−スに変換する、［１４］〜［１７］いずれか１項に記載の２−デオキシリボ−スの製造方法。
［１９］二価金属が周期表第２族に属する二価金属から選択された少なくとも１つである、［１８］に記載の２−デオキシリボ−スの製造方法。
［２０］グルコン酸デヒドラタ−ゼによりグルコン酸またはその塩を脱水して２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸またはその塩を生成し、
得られる２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸またはその塩から、前記酵素反応により、２−デオキシリボ−スを製造する、［１４］〜［１９］いずれか１項に記載の２−デオキシリボ−スの製造方法。
［２１］グルコン酸デヒドラタ−ゼがＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓに由来する酵素である［２０］に記載の２−デオキシリボ−スの製造方法。
［２２］グルコン酸を出発物質とし、グルコン酸から２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸を生成する脱水反応、および２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸から２−デオキシリボ−スを生成する脱カルボキシル化反応をワンポット反応で行う［２０］又は［２１］に記載の２−デオキシリボ−スの製造方法。
［２３］［１４］〜［２２］いずれか１項に記載の２−デオキシリボ−スの製造方法に用いる変異型２−デオキシリボ−ス合成酵素。
［２４］２−デオキシリボ−ス合成能を有し、配列番号１〜３いずれかに記載のアミノ酸配列において、少なくとも１以上のアミノ酸から他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を持つことを特徴とする［２３］記載の変異型２−デオキシリボ−ス合成酵素。
第３の例
［２５］酵素反応により、２−デオキシリボ−スから２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル又はその塩を製造する２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステルの製造方法であって、
２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成能を有する野生型酵素に対して少なくとも配列表の配列番号１で示す配列の５７番目、６８番目、８９番目、１２２番目、１２６番目、１３０番目、１３１番目、１３６番目、１７１番目及び１９７番目のいずれかに相当するアミノ酸の１つ以上の変異を含み、かつ、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成能を有する変異型酵素を用いて前記酵素反応を実行し、
前記野生型酵素は、下記のアミノ酸配列（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を有し、
前記野生型酵素において、前記アミノ酸配列（ｂ）は、少なくとも１以上のアミノ酸を介して、アミノ酸配列（ａ）とアミノ酸配列（ｃ）とを連結しているものであることを特徴とする２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステルの製造方法。
（ａ）ＧＳＩＸＦＬＮＤＱＡＭＹＥＸＧＲ
（ｂ）ＤＡＯＬ（Ａ／Ｓ）ＸＧＧＶＡＸＸＦＳＸＡＦＧＪＰＩ
（ｃ）ＫＬＬＴＮＭＩＥＤＡＧＤＬＡＴＲ（Ｓ／Ｇ）ＡＫＢＸＹＭＲＩＲＰＦＡＦＹＧ
（ｄ）ＮＧＳＹＰＳＧＨＴＸＩＧＷＡＪＡＬＶＬＸＥＵＮＰＸＸＱＯＸＩＬＫＲＧＹＺＬＧＸＳＲＶＩＣＧＹＨＷＱＳＤＶＤＡＡＲ
［アミノ酸配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）中、Ｂは、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり、Ｊは、セリン、トレオニン又はチロシンであり、Ｕは、バリン、ロイシン又はイソロイシンであり、Ｏは、アスパラギン酸又はアスパラギンであり、Ｚは、グルタミン酸又はグルタミンであり、Ｘは任意のアミノ酸である。アミノ酸配列（ｂ）中、Ａ／Ｓは、アラニン又はセリンであることを示し、（ｃ）中、Ｓ／Ｇは、セリン又はグリシンであることを示す。］
［２６］前記野生型酵素が野生型の酸性ホスファタ−ゼ（ＥＣ３．１．３．２）である、［２５］に記載の２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステルの製造方法。
［２７］前記変異型酵素が、配列表の配列番号１の５７番目に相当するアミノ酸をトレオニンに置換したもの、かつ／又は、配列表の配列番号１の６８番目に相当するアミノ酸をアスパラギン酸に置換したもの、かつ／又は、配列表の配列番号１の８９番目に相当するアミノ酸をグリシンに置換したもの、かつ／又は、配列表の配列番号１の１２２番目に相当するアミノ酸をグリシンに置換したもの、かつ／又は、配列表の配列番号１の１２６番目に相当するアミノ酸を脂肪族アミノ酸又は分岐鎖アミノ酸に置換したもの、かつ／又は、配列表の配列番号１の１３０番目に相当するアミノ酸をヒスチジンに置換したもの、かつ／又は、配列表の配列番号１の１３１番目に相当するアミノ酸をアスパラギン、フェニルアラニン又はイソロイシンに置換したもの、かつ／又は、配列表の配列番号１の１３６番目に相当するアミノ酸をフェニルアラニンに置換したもの、かつ／又は、配列表の配列番号１の１７１番目に相当するアミノ酸を酸性アミノ酸に置換したもの、かつ／又は、配列表の配列番号１の１９７番目に相当するアミノ酸を芳香族アミノ酸に置換したものである、［２５］又は［２６］に記載の２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステルの製造方法。
［２８］前記脂肪族アミノ酸がグリシンであり、分岐鎖アミノ酸がバリン又はロイシンである、［２７］に記載の２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステルの製造方法。
［２９］前記酸性アミノ酸がアスパラギン酸又はグルタミン酸である、［２７］又は［２８］に記載の２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステルの製造方法。
［３０］前記芳香族アミノ酸がフェニルアラニン又はチロシンである、［２７］〜［２９］いずれか１項に記載の２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステルの製造方法。
［３１］前記変異型酵素を用いて２−デオキシリボ−スから２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステルに変換する、［２５］〜［３０］いずれか１項に記載の２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステルの製造方法。
［３２］グルコン酸デヒドラタ−ゼによりグルコン酸又はその塩を脱水して２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸又はその塩を生成し、
２−デオキシリボ−ス合成酵素によって得られる２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸又はその塩を脱炭酸して２−デオキシリボ−スを生成し、
得られる２−デオキシリボ−スに対して、前記酵素反応を実行して、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル又はその塩を製造する、［２５］〜［３１］いずれか１項に記載の２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステルの製造方法。
［３３］グルコン酸デヒドラタ−ゼがＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓに由来する酵素である［３２］に記載の２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステルの製造方法。
［３４］２−デオキシリボ−ス合成酵素がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａに由来する酵素である［３２］又は［３３］に記載の２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステルの製造方法。
［３５］［２５］〜［３４］いずれか１項に記載の製造方法に用いる変異型２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成酵素。
［３６］２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成能を有する野生型酵素に対して少なくとも配列表の配列番号１の配列で示す５７番目、６８番目、８９番目、１２２番目、１２６番目、１３０番目、１３１番目、１３６番目、１７１番目及び１９７番目のいずれかに相当するアミノ酸の１つ以上の変異を含み、かつ、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成能を有し、
前記野生型酵素は、下記のアミノ酸配列（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を有し、
前記野生型酵素において、前記アミノ酸配列（ｂ）は、少なくとも１以上のアミノ酸を介して、アミノ酸配列（ａ）とアミノ酸配列（ｃ）とを連結しており、
前記変異は、前記アミノ酸配列（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を構成するアミノ酸の少なくとも１つが他のアミノ酸に置換されたものである変異型２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成酵素。
（ａ）ＧＳＩＸＦＬＮＤＱＡＭＹＥＸＧＲ
（ｂ）ＤＡＯＬ（Ａ／Ｓ）ＸＧＧＶＡＸＸＦＳＸＡＦＧＪＰＩ
（ｃ）ＫＬＬＴＮＭＩＥＤＡＧＤＬＡＴＲ（Ｓ／Ｇ）ＡＫＢＸＹＭＲＩＲＰＦＡＦＹＧ
（ｄ）ＮＧＳＹＰＳＧＨＴＸＩＧＷＡＪＡＬＶＬＸＥＵＮＰＸＸＱＯＸＩＬＫＲＧＹＺＬＧＸＳＲＶＩＣＧＹＨＷＱＳＤＶＤＡＡＲ
［アミノ酸配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）中、Ｂは、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり、Ｊは、セリン、トレオニン又はチロシンであり、Ｕは、バリン、ロイシン又はイソロイシンであり、Ｏは、アスパラギン酸又はアスパラギンであり、Ｚは、グルタミン酸又はグルタミンであり、Ｘは任意のアミノ酸である。アミノ酸配列（ｂ）中、Ａ／Ｓは、アラニン又はセリンであることを示し、（ｃ）中、Ｓ／Ｇは、セリン又はグリシンであることを示す。］
なお、実施例Ａ１〜Ａ１０では、グルコン酸としてＤ−グルコン酸、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸として２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコン酸、２−デオキシリボ−スとして２−デオキシ−Ｄ−リボースを用いる例を挙げて説明した。しかしながら、本発明の方法は、グルコン酸としてＬ−グルコン酸、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸として２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｌ−グルコン酸、２−デオキシリボースとして２−デオキシ−Ｌ−リボースを使用する場合や、Ｄ体とＬ体とが混合したグルコン酸、Ｄ体とＬ体とが混合した２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸、Ｄ体とＬ体とが混合した２−デオキシリボースにも用いることができる。
以下、参考形態の例を付記する。
１．少なくとも下記（i）、（ii）及び（iii）のいずれか１つを実行することにより、２−デオキシリボースを経由して２'−デオキシヌクレオシドを製造する２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
（i）２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩を酵素による脱カルボキシル化反応に付して２−デオキシリボースを合成する；
（ii）基質ポケットを形成するアミノ酸残基が野生型と比して少なくとも一つ以上変異している２−デオキシリボース合成能を有する変異型酵素を使用して、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸又はその塩から２−デオキシリボースを合成する；
（iii）２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成能を有する野生型酵素に対して少なくとも配列表の配列番号１で示す配列の５７番目、６８番目、８９番目、１２２番目、１２６番目、１３０番目、１３１番目、１３６番目、１７１番目及び１９７番目のいずれかに相当するアミノ酸の１つ以上の変異を含み、かつ、２−デオキシリボース−５−リン酸エステル合成能を有する変異型酵素を使用して２−デオキシリボースから２−デオキシリボース−５−リン酸エステル又はその塩を合成し、得られる２−デオキシリボース−５−リン酸エステル又はその塩から２'−デオキシヌクレオシドを合成し、
前記野生型酵素は、下記のアミノ酸配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）を有し、前記野生型酵素において、前記アミノ酸配列（ｂ）は、少なくとも１以上のアミノ酸を介して、アミノ酸配列（ａ）とアミノ酸配列（ｃ）とを連結し、前記アミノ酸配列（ｃ）は、少なくとも１以上のアミノ酸を介して、アミノ酸配列（ｂ）とアミノ酸配列（ｄ）とを連結している。
（ａ）ＧＳＩＸＦＬＮＤＱＡＭＹＥＸＧＲ
（ｂ）ＤＡＯＬ（Ａ／Ｓ）ＸＧＧＶＡＸＸＦＳＸＡＦＧＪＰＩ
（ｃ）ＫＬＬＴＮＭＩＥＤＡＧＤＬＡＴＲ（Ｓ／Ｇ）ＡＫＢＸＹＭＲＩＲＰＦＡＦＹＧ
（ｄ）ＮＧＳＹＰＳＧＨＴＸＩＧＷＡＪＡＬＶＬＸＥＵＮＰＸＸＱＯＸＩＬＫＲＧＹＺＬＧＸＳＲＶＩＣＧＹＨＷＱＳＤＶＤＡＡＲ
［アミノ酸配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）中、Ｂは、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり、Ｊは、セリン、トレオニン又はチロシンであり、Ｕは、バリン、ロイシン又はイソロイシンであり、Ｏは、アスパラギン酸又はアスパラギンであり、Ｚは、グルタミン酸又はグルタミンであり、Ｘは任意のアミノ酸である。アミノ酸配列（ｂ）中、Ａ／Ｓは、アラニン又はセリンであることを示し、（ｃ）中、Ｓ／Ｇは、セリン又はグリシンであることを示す。］
２．２−デオキシリボースを出発物質又は中間体とし、複数の酵素反応を実行して２'−デオキシヌクレオシドを製造する、１．に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
３．前記２'−デオキシヌクレオシドがチミジンである、１．又は２．に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
４．少なくとも前記（i）を実行する、１．乃至３．いずれか１つに記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
５．前記（i）を実行するとき使用する２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩が、周期表第２族に属する金属から選択された少なくとも１種の二価金属の塩である、４．に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
６．前記周期表第２族に属する金属が、カルシウム、ストロンチウム及びバリウムからなる群から選択される少なくとも１種である、５．に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
７．前記（i）で示す脱カルボキシル化反応が、ケト酸デカルボキシラ−ゼ活性を有する酵素により触媒される、１．乃至６．いずれか１つに記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
８．ケト酸デカルボキシラ−ゼ活性を有する前記酵素が、ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼである、７．に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
９．グルコン酸の二価金属塩を脱水反応に付する工程をさらに含み、
脱水反応に付する前記工程において、グルコン酸の二価金属塩から得られる２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩を用いて、脱カルボキシル化反応に付する前記（i）を実行する、１．乃至８．いずれか１つに記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
１０．少なくとも前記（ii）を実行する、１．乃至９．いずれか１つに記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
１１．前記（ii）で使用する前記変異型酵素が野生型のベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．７）を変異させたものである、１．乃至１０．いずれか１つに記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
１２．前記（ii）で使用する前記変異型酵素が、配列表の配列番号２で示す配列の２８１番目に相当するアミノ酸を芳香族アミノ酸に置換したものである、１．乃至１１．いずれか１つに記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
１３．前記芳香族アミノ酸がフェニルアラニン又はチロシンである、１２．に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
１４．少なくとも前記（iii）を実行する、１．乃至１３．いずれか１つに記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
１５．前記（iii）で示す前記野生型酵素が野生型の酸性ホスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．２）である、１．乃至１４．いずれか１つに記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
１６．前記（iii）で使用する前記変異型酵素が、配列表の配列番号１で示す配列の５７番目に相当するアミノ酸をトレオニンに置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１で示す配列の６８番目に相当するアミノ酸をアスパラギン酸に置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１で示す配列の８９番目に相当するアミノ酸をグリシンに置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１で示す配列の１２２番目に相当するアミノ酸をグリシンに置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１で示す配列の１２６番目に相当するアミノ酸を脂肪族アミノ酸又は分岐鎖アミノ酸に置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１で示す配列の１３０番目に相当するアミノ酸をヒスチジンに置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１で示す配列の１３１番目に相当するアミノ酸をアスパラギン、フェニルアラニン又はイソロイシンに置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１で示す配列の１３６番目に相当するアミノ酸をフェニルアラニンに置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１で示す配列の１７１番目に相当するアミノ酸を酸性アミノ酸に置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１で示す配列の１９７番目に相当するアミノ酸を芳香族アミノ酸に置換したものである、１．乃至１５．いずれか１つに記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
１７．前記脂肪族アミノ酸がグリシンであり、分岐鎖アミノ酸がバリン又はロイシンである、１６．に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
１８．前記酸性アミノ酸がアスパラギン酸又はグルタミン酸である、１６．又は１７．に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
１９．前記芳香族アミノ酸がフェニルアラニン又はチロシンである、１６．乃至１８．いずれか１つに記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
２０．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に由来する２−デオキシリボース合成酵素を用いて、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸又はその塩から２−デオキシリボースを合成する、１．乃至１９．いずれか１つに記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
２１．グルコン酸又はその塩を脱水反応に付して２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸又はその塩を得る工程をさらに含み、得られた２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸又はその塩を用いて２−デオキシリボースを合成する、１．乃至２０．いずれか１つに記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
２２．グルコン酸又はその塩を脱水反応に付して２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸又はその塩を得る前記工程において、前記脱水反応を酵素反応により実行する、２１．に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
２３．脱水反応に付する前記工程における前記酵素反応が、グルコン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素により触媒される、２２．に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
２４．グルコン酸デヒドラターゼ活性を有する前記酵素が、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓに由来する酵素である、２３．に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
２５．前記脱水反応と、前記脱水反応により得られる２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸又はその塩を用いて２−デオキシリボースを合成する反応とをワンポットで行う、２２．乃至２４．いずれか１つに記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
２６．２−デオキシリボースから２−デオキシリボース−５−リン酸エステル又はその塩を合成し、リン酸転移酵素及びヌクレオシド合成酵素を用いて、２−デオキシリボース−５−リン酸エステル又はその塩から２'−デオキシヌクレオシドを合成する、１．乃至２５．いずれか１つに記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
２７．前記ヌクレオシド合成酵素がヌクレオシドホスホリラーゼである、２６．に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
２８．前記ヌクレオシド合成酵素が、チミジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．４）、ウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．３）及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１）からなる群から選択される少なくとも１種である、２６．又は２７．に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
２９．前記リン酸転移酵素がホスホペントムターゼである、２６．乃至２８．いずれか１つに記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
３０．２−デオキシリボースと、ピロリン酸又はその塩とを反応させることにより、２−デオキシリボース−５−リン酸エステル又はその塩を合成し、得られる２−デオキシリボース−５−リン酸エステル又はその塩から２'−デオキシヌクレオシドを合成する、１．乃至２９．いずれか１つに記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
３１．２−デオキシリボ−スに酸性ピロリン酸ナトリウムを作用させて、２−デオキシリボースから２−デオキシリボース−５−リン酸エステルナトリウムを合成し、得られた２−デオキシリボース−５−リン酸エステルを含む反応終了物から、前記酸性ピロリン酸ナトリウムに由来するナトリウムイオンが除去されていないとき、２−デオキシリボース−５−リン酸エステルナトリウムとナトリウムイオンとを含む粗精製物を用いてｐＨ調整剤によってｐＨを調整しながら２'−デオキシヌクレオシドを製造する、３０．に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
３２．前記ｐＨ調整剤が二価金属塩である、３１．に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
３３．前記二価金属塩が硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム又はこれらの混合物である、３２．に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
３４．２−デオキシリボースから２−デオキシリボース−５−リン酸エステルナトリウムを合成する反応の反応生成物から、前記ピロリン酸ナトリウムに由来するナトリウムイオンを除去されたとき、得られる２−デオキシリボース−５−リン酸ナトリウムを用いた２'−デオキシヌクレオシドを合成する反応において、前記ｐＨ調整剤によるｐＨの調整を実行しない、３１．乃至３３．いずれか１つに記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
３５．２−デオキシリボース−５−リン酸エステルナトリウムから２'−デオキシヌクレオシドを合成する前記反応を行う前に、陽イオン交換樹脂を用いて前記反応生成物からナトリウムイオンを除去する、３４．に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
３６．２−デオキシリボースに対して過剰のピロリン酸又はその塩を用いて２−デオキシリボース−５−リン酸エステル又はその塩を合成したとき、二価金属の水酸化物を用いて、２−デオキシリボース−５−リン酸エステルを含む水溶液から、前記ピロリン酸又はその塩に由来するリン酸を沈殿により除去し、得られる２−デオキシリボース−５−リン酸エステル又はその塩を用いて２'−デオキシヌクレオシドを合成する、３０．乃至３５．いずれか１つに記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
３７．前記二価金属の水酸化物が水酸化マグネシウム又は水酸化カルシウムである、３６．に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
３８．１．乃至３７．いずれか１つに記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法に用いる、変異型２−デオキシリボース合成酵素。
３９．２−デオキシリボース合成能を有し、配列表の配列番号２乃至４いずれかに示す配列において、少なくとも１以上のアミノ酸から他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を持つことを特徴とする３８．記載の変異型２−デオキシリボース合成酵素。
４０．１．乃至３７．いずれか１つに記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法に用いる、変異型２−デオキシリボース−５−リン酸エステル合成酵素。
４１．２−デオキシリボース−５−リン酸エステル合成能を有する野生型酵素に対して少なくとも配列表の配列番号１で示す配列の５７番目、６８番目、８９番目、１２２番目、１２６番目、１３０番目、１３１番目、１３６番目、１７１番目及び１９７番目のいずれかに相当するアミノ酸の１つ以上の変異を含み、かつ、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成能を有し、
前記野生型酵素は、下記のアミノ酸配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）を有し、前記野生型酵素において、前記アミノ酸配列（ｂ）は、少なくとも１以上のアミノ酸を介して、アミノ酸配列（ａ）とアミノ酸配列（ｃ）とを連結し、前記アミノ酸配列（ｃ）は、少なくとも１以上のアミノ酸を介して、アミノ酸配列（ｂ）とアミノ酸配列（ｄ）とを連結している変異型２−デオキシリボース−５−リン酸エステル合成酵素。
（ａ）ＧＳＩＸＦＬＮＤＱＡＭＹＥＸＧＲ
（ｂ）ＤＡＯＬ（Ａ／Ｓ）ＸＧＧＶＡＸＸＦＳＸＡＦＧＪＰＩ
（ｃ）ＫＬＬＴＮＭＩＥＤＡＧＤＬＡＴＲ（Ｓ／Ｇ）ＡＫＢＸＹＭＲＩＲＰＦＡＦＹＧ
（ｄ）ＮＧＳＹＰＳＧＨＴＸＩＧＷＡＪＡＬＶＬＸＥＵＮＰＸＸＱＯＸＩＬＫＲＧＹＺＬＧＸＳＲＶＩＣＧＹＨＷＱＳＤＶＤＡＡＲ
［アミノ酸配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）中、Ｂは、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり、Ｊは、セリン、トレオニン又はチロシンであり、Ｕは、バリン、ロイシン又はイソロイシンであり、Ｏは、アスパラギン酸又はアスパラギンであり、Ｚは、グルタミン酸又はグルタミンであり、Ｘは任意のアミノ酸である。アミノ酸配列（ｂ）中、Ａ／Ｓは、アラニン又はセリンであることを示し、（ｃ）中、Ｓ／Ｇは、セリン又はグリシンであることを示す。］

Claims (32)

  1. 少なくとも下記（i）を実行することにより、２−デオキシリボースを経由して２'−デオキシヌクレオシドを製造する２'−デオキシヌクレオシドの製造方法であって、
    （i）２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩を、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩に対する脱カルボキシル化能を有する脱カルボキシル化酵素による脱カルボキシル化反応に付して２−デオキシリボースを合成する、
    前記脱カルボキシル化酵素は、ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼであり、
    前記二価金属塩は、カルシウム、ストロンチウム及びバリウムからなる群から選択される少なくとも１種の二価金属の塩であり、
    前記脱カルボキシル化酵素が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属由来のベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼまたはＣｈｒｏｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ属由来のベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼである、２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
  2. ２−デオキシリボースを出発物質又は中間体とし、複数の酵素反応を実行して２'−デオキシヌクレオシドを製造する、請求項１に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
  3. 前記２'−デオキシヌクレオシドがチミジンである、請求項１又は２に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
  4. グルコン酸の二価金属塩を脱水反応に付する工程をさらに含み、
    脱水反応に付する前記工程において、グルコン酸の二価金属塩から前記２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩を合成する、請求項１乃至３いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
  5. 脱水反応に付する前記工程において、前記脱水反応を酵素反応により実行する、請求項４に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
  6. 脱水反応に付する前記工程における前記酵素反応が、グルコン酸デヒドラターゼ活性を有する酵素により触媒される、請求項５に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
  7. グルコン酸デヒドラターゼ活性を有する前記酵素が、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓに由来する酵素である、請求項６に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
  8. 前記脱水反応と、前記脱水反応により得られる前記２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩を用いて前記２−デオキシリボースを合成する反応とをワンポットで行う、請求項４乃至７いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
  9. 前記脱カルボキシル化酵素が、基質ポケットを形成するアミノ酸残基が野生型と比して少なくとも一つ以上変異している２−デオキシリボース合成能を有する変異型酵素である、請求項１乃至８いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
  10. 前記変異型酵素が野生型のベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．７）を変異させたものである、請求項９に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
  11. 前記変異型酵素が、配列表の配列番号２で示す配列の２８１番目に相当するアミノ酸を芳香族アミノ酸に置換したものである、請求項９又は１０に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
  12. 前記芳香族アミノ酸がフェニルアラニン又はチロシンである、請求項１１に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
  13. 前記２−デオキシリボースから２−デオキシリボース−５−リン酸エステル又はその塩を合成し、得られる２−デオキシリボース−５−リン酸エステル又はその塩から２'−デオキシヌクレオシドを合成する工程をさらに含み、
    前記２'−デオキシヌクレオシドを合成する工程において、前記２−デオキシリボースから前記２−デオキシリボース−５−リン酸エステル又はその塩を合成する際に、２−デオキシリボース−５−リン酸エステル合成能を有する野生型酵素に対して少なくとも配列表の配列番号１で示す配列の５７番目、６８番目、８９番目、１２２番目、１２６番目、１３０番目、１３１番目、１３６番目、１７１番目及び１９７番目のいずれかに相当するアミノ酸の１つ以上の変異を含み、かつ、２−デオキシリボース−５−リン酸エステル合成能を有する変異型酵素を使用し、かつ
    前記野生型酵素が、下記のアミノ酸配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）を有し、前記野生型酵素において、前記アミノ酸配列（ｂ）は、少なくとも１以上のアミノ酸を介して、アミノ酸配列（ａ）とアミノ酸配列（ｃ）とを連結し、前記アミノ酸配列（ｃ）は、少なくとも１以上のアミノ酸を介して、アミノ酸配列（ｂ）とアミノ酸配列（ｄ）とを連結している、請求項１乃至１２いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
    （ａ）ＧＳＩＸＦＬＮＤＱＡＭＹＥＸＧＲ
    （ｂ）ＤＡＯＬ（Ａ／Ｓ）ＸＧＧＶＡＸＸＦＳＸＡＦＧＪＰＩ
    （ｃ）ＫＬＬＴＮＭＩＥＤＡＧＤＬＡＴＲ（Ｓ／Ｇ）ＡＫＢＸＹＭＲＩＲＰＦＡＦＹＧ
    （ｄ）ＮＧＳＹＰＳＧＨＴＸＩＧＷＡＪＡＬＶＬＸＥＵＮＰＸＸＱＯＸＩＬＫＲＧＹＺＬＧＸＳＲＶＩＣＧＹＨＷＱＳＤＶＤＡＡＲ
    ［アミノ酸配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）中、Ｂは、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり、Ｊは、セリン、トレオニン又はチロシンであり、Ｕは、バリン、ロイシン又はイソロイシンであり、Ｏは、アスパラギン酸又はアスパラギンであり、Ｚは、グルタミン酸又はグルタミンであり、Ｘは任意のアミノ酸である。アミノ酸配列（ｂ）中、Ａ／Ｓは、アラニン又はセリンであることを示し、（ｃ）中、Ｓ／Ｇは、セリン又はグリシンであることを示す。］
  14. 前記野生型酵素が野生型の酸性ホスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．２）である、請求項１３に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
  15. 前記変異型酵素が、配列表の配列番号１で示す配列の５７番目に相当するアミノ酸をトレオニンに置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１で示す配列の６８番目に相当するアミノ酸をアスパラギン酸に置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１で示す配列の８９番目に相当するアミノ酸をグリシンに置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１で示す配列の１２２番目に相当するアミノ酸をグリシンに置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１で示す配列の１２６番目に相当するアミノ酸を脂肪族アミノ酸又は分岐鎖アミノ酸に置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１で示す配列の１３０番目に相当するアミノ酸をヒスチジンに置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１で示す配列の１３１番目に相当するアミノ酸をアスパラギン、フェニルアラニン又はイソロイシンに置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１で示す配列の１３６番目に相当するアミノ酸をフェニルアラニンに置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１で示す配列の１７１番目に相当するアミノ酸を酸性アミノ酸に置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１で示す配列の１９７番目に相当するアミノ酸を芳香族アミノ酸に置換したものである、請求項１３又は１４に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
  16. 前記脂肪族アミノ酸がグリシンであり、前記分岐鎖アミノ酸がバリン又はロイシンである、請求項１５に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
  17. 前記酸性アミノ酸がアスパラギン酸又はグルタミン酸である、請求項１５又は１６に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
  18. 前記芳香族アミノ酸がフェニルアラニン又はチロシンである、請求項１５乃至１７いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
  19. 前記２−デオキシリボースから２−デオキシリボース−５−リン酸エステル又はその塩を合成し、得られる２−デオキシリボース−５−リン酸エステル又はその塩から２'−デオキシヌクレオシドを合成する工程をさらに含み、
    前記２−デオキシリボース−５−リン酸エステル又はその塩から前記２'−デオキシヌクレオシドを合成する前記工程において、リン酸転移酵素及びヌクレオシド合成酵素を用いて、前記２−デオキシリボース−５−リン酸エステル又はその塩から２'−デオキシヌクレオシドを合成する、請求項１乃至１８いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
  20. 前記２−デオキシリボース−５−リン酸エステル又はその塩から、前記リン酸転移酵素により、２−デオキシリボース−１−リン酸エステル又はその塩を合成し、得られた前記２−デオキシリボース−１−リン酸エステル又はその塩に対して、前記ヌクレオシド合成酵素を用いて、ピリミジン、プリン、アザプリンおよびデアザプリンからなる群から選択された天然または非天然型の塩基を作用させる工程をさらに含み、
    前記塩基は、ハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、ハロアルケニル基、アルキニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、水酸基、ヒドロキシアミノ基、アミノキシ基、アルコキシ基、メルカプト基、アルキルメルカプト基、アリール基、アリールオキシ基またはシアノ基によって置換されていてもよい、請求項１９に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
  21. 前記ヌクレオシド合成酵素がヌクレオシドホスホリラーゼである、請求項１９又は２０に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
  22. 前記ヌクレオシド合成酵素が、チミジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．４）、ウリジンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．３）及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．２．１）からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１９乃至２１いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
  23. 前記リン酸転移酵素がホスホペントムターゼである、請求項１９乃至２２いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
  24. 前記２−デオキシリボースから前記２−デオキシリボース−５−リン酸エステル又はその塩を合成し、得られる前記２−デオキシリボース−５−リン酸エステル又はその塩から前記２'−デオキシヌクレオシドを合成する前記工程において、
    前記２−デオキシリボ−スと、ピロリン酸又はその塩とを反応させることにより、前記２−デオキシリボース−５−リン酸エステル又はその塩を合成し、得られる前記２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル又はその塩から前記２'−デオキシヌクレオシドを合成する、請求項１３乃至２３いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
  25. 前記２−デオキシリボースに酸性ピロリン酸ナトリウムを作用させて、２−デオキシリボースから２−デオキシリボース−５−リン酸エステルナトリウムを合成し、得られた２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステルを含む反応終了物から、前記酸性ピロリン酸ナトリウムに由来するナトリウムイオンが除去されていないとき、２−デオキシリボース−５−リン酸エステルナトリウムとナトリウムイオンとを含む粗精製物を用いてｐＨ調整剤によってｐＨを調整しながら２'−デオキシヌクレオシドを製造する、請求項２４に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
  26. 前記ｐＨ調整剤が二価金属塩である、請求項２５に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
  27. 前記二価金属塩が硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム又はこれらの混合物である、請求項２６に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
  28. ２−デオキシリボースから２−デオキシリボース−５−リン酸エステルナトリウムを合成する反応の反応生成物から、前記ピロリン酸ナトリウムに由来するナトリウムイオンを除去されたとき、得られる２−デオキシリボース−５−リン酸ナトリウムを用いた２'−デオキシヌクレオシドを合成する反応において、前記ｐＨ調整剤によるｐＨの調整を実行しない、請求項２４に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
  29. ２−デオキシリボース−５−リン酸エステルナトリウムから２'−デオキシヌクレオシドを合成する前記反応を行う前に、陽イオン交換樹脂を用いて前記反応生成物からナトリウムイオンを除去する、請求項２８に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
  30. ２−デオキシリボースに対して過剰のピロリン酸又はその塩を用いて２−デオキシリボース−５−リン酸エステル又はその塩を合成したとき、二価金属の水酸化物を用いて、２−デオキシリボース−５−リン酸エステルを含む水溶液から、前記ピロリン酸又はその塩に由来するリン酸を沈殿により除去し、得られる２−デオキシリボース−５−リン酸エステル又はその塩を用いて２'−デオキシヌクレオシドを合成する、請求項２４乃至２９いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
  31. 前記二価金属の水酸化物が水酸化マグネシウム又は水酸化カルシウムである、請求項３０に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
  32. 前記脱カルボキシル化反応は、前記ベンゾイルホルメートデカルボキシラーゼを発現する大腸菌または前記大腸菌の菌体処理物を用いて実行する、請求項１乃至３１いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
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