JP5686817B2

JP5686817B2 - 配列依存性の凝集

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Publication number: JP5686817B2
Application number: JP2012545256A
Authority: JP
Inventors: ヒューバートケッテンベルガー; ステファンクロステルマン; ウルリッヒコーナート; セバスティアンノイマン
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2009-12-22
Filing date: 2010-12-17
Publication date: 2015-03-18
Anticipated expiration: 2030-12-17
Also published as: ES2535393T3; BR112012012873A2; NZ599840A; SG181893A1; HK1174340A1; WO2011076684A1; KR101593262B1; MY160124A; HUE025190T2; EP2516460B1; MX2012006626A; IL219629A0; IL219629A; US20160068602A1; ZA201203783B; RU2567804C2; KR20120096040A; JP2013514794A; US10047162B2; SI2516460T1

Description

本明細書において、免疫グロブリン重鎖の第4のフレームワーク領域、すなわちJエレメントにおける1個または2個の変異を、親水性または中性の生殖系列アミノ酸残基に復帰させることにより、濃縮された溶液における免疫グロブリンの凝集を減少させるための方法を報告する。

発明の背景
免疫グロブリンの下流処理は、分子量、および二次的改変を含むドメイン構築などの、化学的および物理的特性のために、非常に複雑である。経済的な取扱いおよび保存用途のために低体積を達成するように、製剤化された薬物についてだけでなく、下流処理（DSP）における中間体についても、濃縮された免疫グロブリン溶液が必要とされる。

免疫グロブリンの最終製剤もまた、高度に濃縮された溶液を必要とする。例えば、皮下適用のために、100 mg/mlより高い、すなわち約150 mg/mlの免疫グロブリン濃度が必要とされる。しかし、少なくともいくつかの免疫グロブリンは、100 mg/mlまたはそれより高い、非生理学的に高い濃度で凝集する傾向がある。

国際公開公報第2009/000098号（特許文献1）において、一本鎖抗体の配列ベースの工学および最適化が報告されている。

国際公開公報第2009/000098号

本明細書において、濃縮された溶液における免疫グロブリンの凝集を減少させるための方法を報告する。免疫グロブリン重鎖の第4のフレームワーク領域における2個の復帰変異、または単一の復帰変異でさえ、凝集物の形成を減少させ、減少した凝集物含量を伴う復帰させた免疫グロブリン変異体の高度に濃縮された溶液の提供を可能にし得ることが見出された。従って、本明細書において、個々の局面として、溶液における免疫グロブリンの凝集を減少させるための方法、免疫グロブリンを改変するための方法、免疫グロブリンを生産するための方法、および免疫グロブリンをヒト化するための方法が報告される。
[1] a）最大レベルのアミノ酸配列同一性を達成するように、免疫グロブリンの第4の重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列を、参照配列であるxxxxTTxTxSS（SEQ ID NO: 01）またはxxxxTxxTxxx（SEQ ID NO: 11）と整列させる段階、
b）第4の重鎖フレームワーク領域および参照配列において、異なるアミノ酸残基と整列されたアミノ酸の位置を同定する段階、
c）参照配列においてスレオニンまたはセリンであり、かつ第4の重鎖フレームワーク領域においてスレオニンでなくセリンでもない、b）において同定された位置の第4の重鎖フレームワーク領域におけるアミノ酸残基を、参照配列におけるようにそれぞれのスレオニンまたはセリン残基と置換することにより、免疫グロブリンを改変する段階、
d）免疫グロブリンをコードする核酸配列を提供する段階
を含む、免疫グロブリンをコードする核酸配列を提供するための方法。
[2] a）最大レベルのアミノ酸配列同一性を達成するように、免疫グロブリンの第4の重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列を、参照配列であるxxxxTTxTxSS（SEQ ID NO: 01）またはxxxxTxxTxxx（SEQ ID NO: 11）と整列させる段階、
b）第4の重鎖フレームワーク領域および参照配列において、異なるアミノ酸残基と整列されたアミノ酸の位置を同定する段階、
c）参照配列においてスレオニンまたはセリンであり、かつ第4の重鎖フレームワーク領域においてスレオニンでなくセリンでもない、b）において同定された位置の第4の重鎖フレームワーク領域におけるアミノ酸残基を、参照配列におけるようにそれぞれのスレオニンまたはセリン残基と置換することにより、免疫グロブリンをヒト化する段階、
d）任意で、ヒト化免疫グロブリンをコードする核酸配列を提供する段階
を含む、免疫グロブリンをヒト化するための方法。
[3] a）最大レベルのアミノ酸配列同一性を達成するように、免疫グロブリンの第4の重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列を、参照配列であるxxxxTTxTxSS（SEQ ID NO: 01）またはxxxxTxxTxxx（SEQ ID NO: 11）と整列させる段階、
b）第4の重鎖フレームワーク領域および参照配列において、異なるアミノ酸残基と整列されたアミノ酸の位置を同定する段階、
c）参照配列においてスレオニンまたはセリンであり、かつ第4の重鎖フレームワーク領域においてスレオニンでなくセリンでもない、b）において同定された位置の第4の重鎖フレームワーク領域におけるアミノ酸残基を、参照配列におけるようにそれぞれのスレオニンまたはセリン残基と置換することにより、免疫グロブリンを改変する段階、
d）改変された免疫グロブリン重鎖アミノ酸配列をコードする核酸および対応する軽鎖アミノ酸配列をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の発現のために培養する段階、
e）哺乳動物細胞または培養培地から免疫グロブリンを回収し、かつそれにより免疫グロブリンを生産する段階
を含む、免疫グロブリンを生産するための方法。
[4] 参照アミノ酸配列がxxxxTxxTxxx（SEQ ID NO: 11）であることを特徴とする、前記のいずれか一項記載の方法。
[5] 同定する段階および改変する段階が参照アミノ酸配列の5および／または8位のスレオニンアミノ酸残基のものであることを特徴とする、前記のいずれか一項記載の方法。
[6] 参照配列が、配列WGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 02）、または配列WGRGTLVTVSS（SEQ ID NO: 03）、または配列WGQGTMVTVSS（SEQ ID NO: 04）、または配列WGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 05）、または配列WGKGTTVTVSS（SEQ ID NO: 06）であることを特徴とする、前記のいずれか一項記載の方法。
[7] 改変する段階が、
参照配列においてスレオニンであり、かつ第4の重鎖フレームワーク領域においてスレオニンでない、先の段階において同定された位置の第4の重鎖フレームワーク領域におけるアミノ酸残基を、参照配列におけるようにそれぞれのスレオニン残基と置換することにより、免疫グロブリンを改変する段階
であることを特徴とする、前記のいずれか一項記載の方法。
[8] 第1の段階として、
免疫グロブリン重鎖の第4のフレームワーク領域のアミノ酸配列を提供するかまたは決定する段階
を含むことを特徴とする、前記のいずれか一項記載の方法。
[9] 免疫グロブリンがヒトまたはヒト化免疫グロブリンであることを特徴とする、前記のいずれか一項記載の方法。
[10] 免疫グロブリンが、キメラ免疫グロブリン、またはCDR移植免疫グロブリン、またはT細胞エピトープが除去された免疫グロブリン、またはそれらの変異体であることを特徴とする、前記のいずれか一項記載の方法。
[11] 哺乳動物細胞がCHO細胞またはHEK細胞であることを特徴とする、[3]〜[10]のいずれか一項記載の方法。

本明細書において報告されるすべての方法は、以下の段階を含む：
a）最大レベルのアミノ酸配列同一性を達成するように、免疫グロブリンの第4の重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列を、参照アミノ酸配列と整列させる段階、
b）免疫グロブリンの第4の重鎖フレームワーク領域アミノ酸配列および参照アミノ酸配列において、異なるアミノ酸残基と整列されたアミノ酸配列の位置を同定する段階、
c）b）において同定された位置の、免疫グロブリンの第4の重鎖フレームワーク領域アミノ酸配列における1個のまたは少なくとも1個のアミノ酸残基を、参照アミノ酸配列において存在するようにそれぞれのスレオニンまたはセリン残基と置換することにより、免疫グロブリンアミノ酸配列を改変する段階であって、置換された位置で、アミノ酸残基が参照アミノ酸配列においてスレオニンまたはセリンであり、かつアミノ酸残基が免疫グロブリンの第4の重鎖フレームワーク領域アミノ酸配列においてスレオニンでなくセリンでもない、段階、
d）任意で、改変された免疫グロブリンアミノ酸配列をコードする核酸配列を提供する段階。

一つの態様において、スレオニン残基の差のみが判定され、かつ変更される。別の態様において、免疫グロブリンの第4のフレームワーク領域に対する参照アミノ酸配列は、xがスレオニンおよびセリン以外の任意のアミノ酸残基を意味するアミノ酸配列xxxxTTxTxSS（SEQ ID NO: 01）である。さらなる態様において、参照アミノ酸配列は、1、2、3、4、7、および9位のxがスレオニンおよびセリン以外の任意のアミノ酸残基を意味し、かつ6位のxがスレオニンを意味し、かつ10および11位のxがセリンを意味するアミノ酸配列xxxxTxxTxxx（SEQ ID NO: 11）であり、それにより、免疫グロブリン重鎖の第4のフレームワーク領域のアミノ酸配列に対する参照アミノ酸配列における5および／または8位でのスレオニン残基の差が、段階b）において同定され、かつ段階c）において改変される。一つの態様において、参照アミノ酸配列はヒト生殖系列アミノ酸配列である。本明細書において報告されるすべての局面の一つの態様において、方法は以下の段階を含む：
a）最大レベルのアミノ酸配列同一性を達成するように、免疫グロブリンの第4の重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列を、アミノ酸配列WGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 02）、またはアミノ酸配列WGRGTLVTVSS（SEQ ID NO: 03）、またはアミノ酸配列WGQGTMVTVSS（SEQ ID NO: 04）、またはアミノ酸配列WGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 05）、またはアミノ酸配列WGKGTTVTVSS（SEQ ID NO: 06）と整列させる段階、
b）免疫グロブリンの第4の重鎖フレームワーク領域アミノ酸配列および参照アミノ酸配列において、異なるアミノ酸残基と整列されたアミノ酸の位置を同定する段階、
c）b）において同定された位置の第4の重鎖フレームワーク領域アミノ酸配列におけるアミノ酸残基を、参照アミノ酸配列において存在するそれぞれのスレオニンまたはセリン残基と置換することにより、免疫グロブリンを改変する段階であって、該位置のアミノ酸残基が参照アミノ酸配列においてスレオニンまたはセリンであり、かつ該位置のアミノ酸残基が免疫グロブリンの第4の重鎖フレームワーク領域アミノ酸配列においてスレオニンでなくセリンでもない、段階、
d）任意で、改変された免疫グロブリンアミノ酸配列をコードする核酸配列を提供する段階。

本明細書において報告される局面の一つの態様において、方法は、第1の段階として、免疫グロブリン重鎖の第4のフレームワーク領域のアミノ酸配列を提供するかまたは決定する段階を含む。一つの態様において、参照配列はアミノ酸配列WGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 02）である。別の態様において、参照アミノ酸配列はxxxxTxxTxxx（SEQ ID NO: 11）である。一つの態様において、参照アミノ酸配列の5または／および8位でのスレオニン残基の差が判定される。一つの態様において、スレオニン残基の差のみが判定され、かつ変更される。

本明細書において報告される一つの局面において、方法は、以下の段階を含む、免疫グロブリンを生産するための方法である：
a）最大レベルのアミノ酸配列同一性を達成するように、免疫グロブリンの第4の重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列を、参照アミノ酸配列であるxxxxTTxTxSS（SEQ ID NO: 01）またはxxxxTxxTxxx（SEQ ID NO: 11）と整列させる段階、
b）免疫グロブリンの第4の重鎖フレームワーク領域アミノ酸配列および参照アミノ酸配列において、5および／または6および／または8および／または10および／または11位の、異なるアミノ酸残基と整列されたアミノ酸配列の位置を同定する段階、
c）b）において同定された位置の第4の重鎖フレームワーク領域アミノ酸配列におけるアミノ酸残基を、参照アミノ酸配列におけるようにそれぞれのスレオニンまたはセリン残基と置換することにより、免疫グロブリンの第4の重鎖フレームワーク領域アミノ酸配列を改変する段階であって、該位置のアミノ酸残基が参照アミノ酸配列においてスレオニンまたはセリンであり、かつ該位置のアミノ酸残基が免疫グロブリンの第4の重鎖フレームワーク領域アミノ酸配列においてスレオニンでなくセリンでもない、段階、
d）免疫グロブリン重鎖および軽鎖の発現のために、改変された免疫グロブリン重鎖アミノ酸配列をコードする核酸、および対応する軽鎖アミノ酸配列をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する段階、
e）哺乳動物細胞または培養培地から免疫グロブリンを回収し、かつそれにより免疫グロブリンを生産する段階。

一つの態様において、参照アミノ酸配列は、アミノ酸配列WGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 02）、またはアミノ酸配列WGRGTLVTVSS（SEQ ID NO: 03）、またはアミノ酸配列WGQGTMVTVSS（SEQ ID NO: 04）、またはアミノ酸配列WGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 05）、またはアミノ酸配列WGKGTTVTVSS（SEQ ID NO: 06）である。一つの態様において、免疫グロブリンの第4の重鎖フレームワーク領域アミノ酸配列を改変する段階は、参照アミノ酸配列においてスレオニンであり、かつ第4の重鎖フレームワーク領域アミノ酸配列においてスレオニンでない、b）において同定された位置の第4の重鎖フレームワーク領域アミノ酸配列におけるアミノ酸残基を、参照アミノ酸配列において存在するようにそれぞれのスレオニン残基と置換する段階である。別の態様において、改変する段階は、同定された少なくとも一つの位置のものである。一つの態様において、参照アミノ酸配列は、アミノ酸配列WGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 02）である。一つの態様において、免疫グロブリンはヒトまたはヒト化免疫グロブリンである。別の態様において、哺乳動物細胞はCHO細胞またはHEK細胞である。別の態様において、参照アミノ酸配列の5および／または8位のスレオニン残基の差が判定される。

本明細書において報告される別の局面は、以下の段階を含む、免疫グロブリンをヒト化するための方法である：
a）最大レベルのアミノ酸配列同一性を達成するように、免疫グロブリンの第4の重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列を、参照アミノ酸配列であるxxxxTTxTxSS（SEQ ID NO: 01）またはxxxxTxxTxxx（SEQ ID NO: 11）と整列させる段階、
b）免疫グロブリンの第4の重鎖フレームワーク領域アミノ酸配列および参照アミノ酸配列において、異なるアミノ酸残基と整列されたアミノ酸配列の位置を同定する段階、
c）b）において同定された位置の第4の重鎖フレームワーク領域アミノ酸配列におけるアミノ酸残基を、参照配列におけるようにそれぞれのスレオニンまたはセリン残基と置換することにより、免疫グロブリンをヒト化する段階であって、該位置のアミノ酸残基が参照アミノ酸配列においてスレオニンまたはセリンであり、かつ該位置のアミノ酸残基が免疫グロブリンの第4の重鎖フレームワーク領域アミノ酸配列においてスレオニンでなくセリンでもない、段階、
d）任意で、ヒト化免疫グロブリンをコードする核酸配列を提供する段階。

動的光散乱により測定した、0、140、および500 mM NaClを含む20 mMヒスチジン緩衝液、pH 6中、50℃での、30 mg/mlの抗IL13Rα1抗体（a）および復帰させた変異体抗体（b）両方の溶液における、時間単位あたりの粒子サイズ増加の速度。 500 mM NaClの存在下における30 mg/mlの抗IL13Rα1抗体および復帰させた形態の2種類の溶液両方の、15時間、10℃での分析用サイズ排除クロマトグラム。親の抗IL13Rα1抗体の9残基の分析窓での、重鎖1〜130残基のKyte-Doolittleプロット。変異体の抗IL13Rα1抗体の9残基の分析窓での、重鎖1〜130残基のKyte-Doolittleプロット。親の抗OX40L抗体の9残基の分析窓での、重鎖1〜130残基のKyte-Doolittleプロット。変異体の抗OX40L抗体の9残基の分析窓での、重鎖1〜130残基のKyte-Doolittleプロット。

発明の詳細な説明
第4の免疫グロブリン重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列における、イソロイシンまたはアラニンなどの小さな疎水性または非極性アミノ酸残基への2個のスレオニンおよび／またはセリンアミノ酸残基の交換、または単一のスレオニンおよび／またはセリンアミノ酸残基の交換でさえ、溶液、特に高い塩濃度および／または高い免疫グロブリン濃度を伴う溶液において凝集物を形成する免疫グロブリンの傾向を増加させることが見出されている。交換されているアミノ酸残基を天然に存在するスレオニンおよび／またはセリン残基に戻して復帰させることにより、溶液、特に濃縮された溶液において凝集物を形成する傾向が明確に減少する。

一つの局面において、本明細書において報告される方法は、以下の段階を含む、溶液における免疫グロブリンの凝集を減少させるための方法である：
−アミノ酸配列を第4のフレームワーク領域アミノ酸配列についての参照アミノ酸配列と比較することにより、免疫グロブリンの重鎖の第4のフレームワーク領域アミノ酸配列における一つまたは複数のスレオニンおよび／またはセリン残基が変更されているか否かを判定する段階、
−交換されているスレオニンおよび／またはセリン残基の少なくとも一つを参照スレオニンおよび／またはセリン残基に戻して改変することにより、免疫グロブリンのアミノ酸配列を復帰させ、かつそれにより溶液における免疫グロブリンの凝集を減少させる段階。

「整列させる」という用語は、最大レベルのアミノ酸配列同一性および保存を達成するように、二つまたはそれ以上のアミノ酸配列を並べる工程を意味する。それは、相同の分子におけるアミノ酸またはヌクレオチドの並置を伴い、分子配列についての位置的相同性の判定を含む。結果として、比較された配列は、最も大きい統計学的類似性の領域が示される形態において呈示される。

参照アミノ酸配列に対する「最大レベルのアミノ酸配列同一性」は、必要な場合、最大パーセントの配列同一性を達成するように、かついかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮せずに、配列を整列させ、かつギャップを導入した後に、参照アミノ酸配列におけるアミノ酸残基と同一である候補アミノ酸配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性を判定する目的の整列は、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、またはMegalign（DNASTAR）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用し、種々の方法において達成され得る。当業者は、比較されるアミノ酸配列の全長に渡って最大の整列を達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含み、アミノ酸配列を整列させるための適切なパラメータを判定し得る。しかしながら、本明細書における目的のために、「％アミノ酸配列同一性」の値は、配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を使用して生成される。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはGenentech, Inc.が著作者であり、かつソースコードは、U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559に使用者用説明書とともに提出されており、U.S. Copyright Registration No. TXU510087の下に登録されている。ALIGN-2プログラムは、Genentech, Inc., South San Francisco, Californiaより公的に利用可能であり、または、ソースコードからコンパイルされてもよい。ALIGN-2プログラムは、デジタルUNIX V4.0Dを含むUNIXオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされるべきである。すべての配列比較パラメータはALIGN-2プログラムにより設定されており、かつ変動しない。

アミノ酸配列比較のためにALIGN-2が利用される状況において、所定のアミノ酸配列Aの、所定のアミノ酸配列Bへの、それとの、またはそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、所定のアミノ酸配列Bへの、それとの、またはそれに対するある特定の％アミノ酸配列同一性を有するか、または含む所定のアミノ酸配列Aとして言葉で表現され得る）は、以下のように計算される：
分数X／Y×100
式中、Xは、配列整列プログラムALIGN-2により、AおよびBのそのプログラムの整列において同一のマッチと記録されたアミノ酸残基の数であり、ならびにYは、Bにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと同等でない場合、BへのAの％アミノ酸配列同一性は、AへのBの％アミノ酸配列同一性と同等でないことが認識されるであろう。

さらなる局面において、本明細書において報告される方法は、以下の段階を含む、免疫グロブリンを改変するための方法である：
−アミノ酸配列を第4のフレームワーク領域アミノ酸配列についての参照アミノ酸配列と比較することにより、免疫グロブリンの重鎖の第4のフレームワーク領域アミノ酸配列における一つまたは複数のスレオニンおよび／またはセリン残基が変更されているか否かを判定する段階、
−交換されているスレオニンおよび／またはセリン残基の少なくとも一つを参照スレオニンおよび／またはセリン残基に戻して改変することにより、免疫グロブリンのアミノ酸配列を復帰させ、かつそれにより免疫グロブリンを改変する段階。

一つの局面において、本明細書において報告される方法は、以下の段階を含む、免疫グロブリンをヒト化するための方法である：
−キメラ免疫グロブリン、CDR移植免疫グロブリン、T細胞エピトープが削減されたかもしくは除去された免疫グロブリン、またはそれらの変異体の重鎖の第4のフレームワーク領域のアミノ酸配列を、第4のフレームワーク領域についての参照アミノ酸配列と比較することにより、一つまたは複数のスレオニンおよび／またはセリン残基が異なるアミノ酸残基により置換されているか否かを判定する段階、
−交換されているスレオニンおよび／またはセリン残基の少なくとも一つを参照アミノ酸配列におけるようなスレオニンおよび／またはセリン残基に戻して改変することにより、免疫グロブリンのアミノ酸配列を復帰させ、かつそれにより免疫グロブリンをヒト化する段階。

「第4のフレームワーク領域アミノ酸配列」という用語は、免疫グロブリンの重鎖の第4のフレームワーク領域のアミノ酸配列を表す。このアミノ酸配列は、免疫グロブリン重鎖の相補性決定領域3（CDR 3）のまさにC末端のアミノ酸残基から開始し、かつ重鎖可変ドメインの最後のアミノ酸残基で終了する。一つの態様において、免疫グロブリン重鎖のCDR 3のアミノ酸残基は、Kabatに従って決定される。

「キメラ免疫グロブリン」という用語は、第1の種の免疫グロブリン由来のアミノ酸残基、および第1の種とは同一でない第2の種由来のアミノ酸残基を含む免疫グロブリンを表す。アクセプター種がヒトである場合、その時キメラ免疫グロブリンは「ヒト化免疫グロブリン」である。大部分について、ヒト化免疫グロブリンはヒト免疫グロブリン（レシピエントまたはアクセプター免疫グロブリン）由来であり、Kabatおよび／またはChothiaおよび／または他のナンバリングシステムに従って決定された一つまたは複数の超可変領域のアミノ酸配列が、非ヒト種（ドナー免疫グロブリン）の超可変領域のアミノ酸配列に変更されている。ヒトアクセプター免疫グロブリンのKabatおよび／またはChothiaおよび／または他のナンバリングシステムに従う超可変領域全体が、非ヒトドナー免疫グロブリンの対応するアミノ酸残基により置換されているヒト化免疫グロブリンは、「CDR移植免疫グロブリン」として表される。例示的な非ヒトドナー免疫グロブリンは、関心対象の抗原に対して望ましい特異性および親和性を有する、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ハムスター、ヒツジ、または非ヒト霊長類免疫グロブリンである（例えば、Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855；米国特許第5,202,238号；米国特許第5,204,244号を参照されたい）。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（FR）残基は、対応する非ヒト残基により置換されている。さらに、ヒト化免疫グロブリンは、さらなる改変、例えば、アクセプター免疫グロブリンまたはドナー免疫グロブリンにおいて見出されないアミノ酸残基を含んでもよい。そのような改変は、対応する親配列に相同であるが同一でない、そのようなレシピエントまたはドナー免疫グロブリンの変異体を結果としてもたらす。ヒト化免疫グロブリンは、任意で、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものもまた含むと考えられる。

一つの態様において、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン、またはCDR移植免疫グロブリン、またはT細胞エピトープが削減されたかもしくは除去された免疫グロブリン、またはそれらの変異体である。一つの態様において、免疫グロブリンは、ヒト重鎖定常領域またはその変異体を含む。さらなる態様において、ヒト定常領域は、IgG1サブクラスのもの、またはIgG4サブクラスのもの、またはIgG2サブクラスのもの、またはIgG3サブクラスのもの、またはSEQ ID NO: 07もしくはSEQ ID NO: 08のものであり、またはそれらの変異体である。

一つの態様において、定常領域は、下記で定義されるようなFcγ受容体（例えば、FcγRIIIa）結合および／またはC1q結合が検出され得ない方法で改変される。一つの態様において、定常領域は、ヒト定常領域であり、かつヒトIgG4サブクラスのもの、またはヒトIgG1サブクラス由来の変異Fc部分のいずれかである。別の態様において、定常領域は、変異L234AおよびL235A（完全長、すなわち可変ドメインを含む、ヒトIgG1重鎖アミノ酸配列に従って決定された位置）を含むヒトIgG1サブクラスのものである。IgG4は減少したFcγ受容体（FcγRIIIa）結合を示すが、他のIgGサブクラスの免疫グロブリンは強い結合を示す。しかしながら、Pro238、Asp265、Asp270、Asn297（Fc糖質の欠如）、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434、または／およびHis435は、変更された場合、同様に減少したFcγ受容体結合を提供する残基である（Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604；Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119；Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324；EP 0 307 434）。一つの態様において、定常領域は、Fcγ受容体結合に関して、IgG4サブクラスのもの、または、L234、L235、および／もしくはD265における変異を伴うIgG1もしくはIgG2サブクラスのものであるか、ならびに／または、PVA236変異を含有する。一つの態様において、変異は、S228P、L234A、L235A、L235E、および／またはPVA236（PVA236は、IgG1のアミノ酸233〜236位由来のアミノ酸配列ELLG（一文字アミノ酸表記において示される）またはIgG4のEFLGがPVAにより置換されていることを意味する）である。さらなる態様において、変異は、IgG4のS228P、ならびにIgG1のL234AおよびL235Aである。免疫グロブリンの定常領域は、ADCC（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）およびCDC（補体依存性細胞傷害）に直接関与している。Fcγ受容体および／または補体因子C1qに結合しない免疫グロブリンは、抗体依存性細胞性細胞傷害（ADCC）および／または補体依存性細胞傷害（CDC）を誘発しない。

「T細胞エピトープが除去された免疫グロブリン」という用語は、ヒトT細胞エピトープ（MHCクラスII分子に結合する能力を有するタンパク質内のペプチド配列）を除去することにより、免疫原性を除去するかまたは削減するように改変された免疫グロブリンを表す。この方法により、ペプチドのアミノ酸側鎖とMHCクラスII結合溝を伴う特異的結合ポケットとの間の相互作用が同定される。同定された免疫原性領域は、免疫原性を排除するように変更される。そのような方法は、一般に、例えば、国際公開公報第98/52976号または国際公開公報第98/08097号に記載されている。

「その変異体」という用語は、保存的配列改変または変更されたグリコシル化パターンを含む免疫グロブリンを表す。「保存的配列改変」という用語は、アミノ酸残基が類似した側鎖を有するアミノ酸残基と置換されているものを含むアミノ酸置換を表す。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。免疫グロブリンの変異体の別のタイプは、免疫グロブリンの本来のグリコシル化パターンを変更する。変更することにより、免疫グロブリンにおいて見出される一つもしくは複数のグリコシル化部位を欠失させること、および／または免疫グロブリンに存在しない一つもしくは複数のグリコシル化部位を導入することが意味される。免疫グロブリンのグリコシル化は、典型的にN-結合型である。N-結合型とは、アスパラギン残基の側鎖への炭化水素部分の付加を指す。Xが任意のアミノ酸であり得るトリペプチド配列、アスパラギン-X-セリンおよびアスパラギン-X-スレオニンおよびアスパラギン-X-システインは、アスパラギン側鎖への炭化水素部分の酵素的付加のための認識配列である。

一つの態様において、参照配列は、SEQ ID NO: 02〜06の配列、またはSEQ ID NO: 01の配列、またはSEQ ID NO: 11の配列である。別の態様において、判定する段階および復帰させる段階は、置換されているスレオニン残基のものである。

本発明は、以下において抗IL13Rα1抗体および抗OX40L抗体と共に例示される。対応するアミノ酸配列および生産方法は、国際公開公報第2006/072564号および国際公開公報第2006/029879号（参照により本明細書に組み入れられる）において報告されている。これらの抗体は、本明細書において報告される局面を例証するために使用されるだけであり、かつ任意の限定を呈示するためには使用されない。本発明の範囲は、添付の一連の特許請求の範囲において示される。

抗IL13Rα1抗体は、以下において親抗体として表され、かつWGQGTLVIVSS（SEQ ID NO: 09）の第4の重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列を有する。SEQ ID NO: 01およびSEQ ID NO: 11のアミノ酸配列との比較を下記に示す。

アミノ酸配列間の一つの差は、SEQ ID NO: 01またはSEQ ID NO: 11におけるスレオニン残基の代わりの、SEQ ID NO: 09の第8位のイソロイシン残基であることが見られ得る。従って、イソロイシン残基をスレオニン残基に戻して復帰させた変異体抗体が生産された。

親抗体が高いレベルの凝集物形成を示すのに対して、復帰させた変異体抗体は、明らかに減少した凝集物を形成する傾向を有する。図1に、30 mg/mlの抗体濃度で、50℃および変動するイオン強度での、親の抗IL13Rα1抗体の凝集物のサイズ増加の速度（nm/h）を示す。重鎖アミノ酸配列の第4のフレームワーク領域におけるアミノ酸155位のイソロイシン残基（SEQ ID NO: 01、11、および09における第8位に対応する）を、親の抗IL13Rα1抗体に対する単一かつ唯一の差としてスレオニンに復帰させた変異体の抗IL13Rα1抗体で得られた速度もまた、図1に示す。単一の復帰変異が、すべての検討したイオン強度で凝集物サイズ増加の速度を減少させる。

図2に、同一の製剤において9週間40℃で保存した2種類の試料の分析用サイズ排除クロマトグラムを示す。それぞれのデータを以下の表1に列挙する。

（表１）9週間40℃で保存した試料の分析データ

復帰させた変異体抗体の凝集物を形成する傾向は、親抗体と比較して50％より多く減少することが見られ得る。

図3に、親の抗IL13Rα1抗体の9残基の分析または平均化窓での重鎖1〜130残基のKyte-Doolittleプロットを示す。プロットは、第4のフレームワーク領域において、重鎖全体にとって最も高い疎水性値を示す。図4に、変異体の抗IL13Rα1抗体の重鎖のKyte-Doolittleプロットを示す。第4のフレームワーク領域の疎水性値が、復帰させた変異体抗体において明確に減少することが見られ得る。

図5に、抗OX40L抗体の9残基の分析／平均化窓での重鎖1〜130残基のKyte-Doolittleプロットを示す。この場合においてまた、最も高い疎水性値は、第4の重鎖フレームワーク領域中にあることが見られ得る。第4の重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列を分析することにより、アミノ酸交換が下記に示すように決定され得る。

この単一のアミノ酸変更を天然に存在する生殖系列のスレオニン残基に戻して復帰させる段階は、図6におけるKyte-Doolittleプロットに示すように抗体の疎水性を減少させた。

以下の実施例、配列一覧表、および図面は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は添付の特許請求の範囲に示される。本発明の精神から逸脱することなく、示される手順において改変が作成され得ることが理解される。

配列表の説明
SEQ ID NO: 01 xxxxTTxTxSS−参照アミノ酸配列
SEQ ID NO: 02 WGQGTLVTVSS−部分的な生殖系列FR4/Jエレメントアミノ酸配列。
SEQ ID NO: 03 WGRGTLVTVSS−部分的な生殖系列FR4/Jエレメントアミノ酸配列。
SEQ ID NO: 04 WGQGTMVTVSS−部分的な生殖系列FR4/Jエレメントアミノ酸配列。
SEQ ID NO: 05 WGQGTTVTVSS−部分的な生殖系列FR4/Jエレメントアミノ酸配列。
SEQ ID NO: 06 WGKGTTVTVSS−部分的な生殖系列FR4/Jエレメントアミノ酸配列。
SEQ ID NO: 07 ヒトIgG1重鎖定常領域アミノ酸配列。
SEQ ID NO: 08 ヒトIgG4重鎖定常領域アミノ酸配列。
SEQ ID NO: 09 WGQGTLVIVSS−抗IL13Rα1抗体のアミノ酸配列。
SEQ ID NO: 10 WGQGALVTVSS−抗OX40L抗体のアミノ酸配列。
SEQ ID NO: 11 xxxxTxxTxxx−参照アミノ酸配列。

材料および方法
分析用サイズ排除クロマトグラフィー
高分子量種（HMW）、抗体単量体、および低分子量種（LMW）の含量を、TSK 3000S WXL 7.8×300 mmカラム（Tosoh, Stuttgart, Germany）を使用した分析用サイズ排除クロマトグラフィーにより測定した。溶出液として、200 mM KH₂PO₄および250 mM KClを含有するpH 7.0の緩衝溶液を0.5 ml/分の流速で使用した。ランあたり150μgの量のタンパク質をロードした。280 nmでのUV吸収により検出を成し遂げた。

動的光散乱（DLS）
DLSは、典型的にサブミクロンサイズの範囲において粒子サイズを測定するための非侵襲性技術である。本発明において、1 nm〜6μmのサイズ範囲をモニターするために、温度制御された石英キュベット（25℃）を伴うZetasizer Nano S装置（Malvern Instruments, Worcestershire, UK）を使用した。後方散乱レーザー光の強度を、173°の角度で検出した。強度は、粒子拡散スピードに依存する速度、ひいては粒子サイズにより支配される速度で変動する。従って、粒子サイズのデータは、散乱光強度における変動の分析から生成され得る（Dahneke, B.E. (ed), Measurement of Suspended Particles by Quasielectric Light Scattering, Wiley Inc. (1983)；Pecora, R., Dynamic Light Scattering: Application of Photon Correlation Spectroscopy, Plenum Press (1985)）。DTSソフトウェア（Malvern）の多重ナローモードを使用して、強度によるサイズ分布を計算した。

実施例1
変異体の抗IL13Rα1抗体の生産
抗IL13Rα1抗体の軽鎖および重鎖をコードする遺伝子を、哺乳動物細胞発現ベクターにおいて別々に構築した。それにより、抗IL13Rα1抗体軽鎖可変領域（V_L）およびヒトκ軽鎖定常領域（C_L）をコードする遺伝子セグメントを、抗IL13Rα1抗体重鎖可変領域（V_H）およびヒトγ1重鎖定常領域（C_H1-ヒンジ-C_H2-C_H3）についての遺伝子セグメントのように連結した。コドン使用頻度が示されるヒト軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、以下に示される：Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesman, K. S., and Foeller, C. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No. 91-3242 (1991)。抗IL13Rα1抗体κ軽鎖の転写単位は、以下のエレメントから構成される：
・ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
・Kozak配列を含む合成5'-UT、
・シグナル配列イントロンを含むマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
・5'端に唯一のBsmI制限酵素部位、ならびに3'端にスプライスドナー部位および唯一のNotI制限酵素部位を伴って配置された、クローン化された抗IL13Rα1抗体の可変軽鎖cDNA、
・イントロン2マウスIg-κエンハンサーを含むゲノムヒトκ遺伝子定常領域（Picard, D., and Schaffner, W., Nature 307 (1984) 80-82）、ならびに
・ヒト免疫グロブリンκポリアデニル化（「ポリA」）シグナル配列。

抗IL13Rα1抗体γ1重鎖の転写単位は、以下のエレメントから構成される：
・ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
・Kozak配列を含む合成5'-UT、
・シグナル配列イントロンを含む改変されたマウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
・5'に唯一のBsmI制限酵素部位、ならびに3'端にスプライスドナー部位および唯一のNotI制限酵素部位を伴って配置された、クローン化された抗IL13Rα1抗体の可変重鎖cDNA、
・マウスIgμエンハンサーを含むゲノムヒトγ1重鎖遺伝子定常領域（Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378）、
・ヒトγ1免疫グロブリンポリアデニル化（「ポリA」）シグナル配列。

抗IL13Rα1抗体κ軽鎖またはγ1重鎖発現カセットに加えて、これらのプラスミドは、以下を含有する：
・ハイグロマイシン耐性遺伝子、
・エプスタイン-バーウイルス（EBV）の複製開始点、oriP、
・このプラスミドの大腸菌（E. coli）における複製を可能にするベクターpUC18由来の複製開始点、および
・大腸菌におけるアンピシリン耐性を与えるβラクタマーゼ遺伝子。

変異体の抗IL13Rα1抗体γ1重鎖をコードする発現プラスミドは、QuickChange（商標）Site-Directed mutagenesis Kit（Stratagene）を使用して親抗体発現プラスミドの部位特異的変異誘発により作製した。アミノ酸は、EUナンバリングに従って番号をつける（Edelman, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85；Kabat, E. A., Wu, T. T., Perry, H. M., Gottesman, K. S., and Foeller, C., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No. 91-3242）。

安定にトランスフェクションしたCHOクローンは、130 mg/リットルで変異体の抗IL13Rα1抗体を生産する。下流処理は、3つの連続したクロマトグラフィー段階：プロテインAクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、および陰イオン交換クロマトグラフィーを利用することにより実施した。

実施例2
動的光散乱による凝集物サイズ増加の速度の測定
経時的に凝集を追跡するために、規則的な時間間隔で動的光散乱（DLS）測定を実施した。高い塩濃度は疎水性相互作用を安定化し；従って、疎水性に関連した凝集は、高い塩濃度でより顕著であると期待される。平均粒子サイズ（Z-平均半径）の変化を、タンパク質凝集の測定基準としてモニターした（図1）。種々の量のNaClを含有する緩衝液（pH 6.0の20 mM His/His-HCl＋0/140/500 mM NaCl）において、30 mg/mlのタンパク質濃度で試料を透析した。DLS測定を、Wyatt DynaProプレートリーダー上で394ウェルマイクロタイタープレートにおいて50℃の温度で実施した。

実施例3
変異体の抗IL13Rα1抗体の安定性試験
高分子量化合物（HMW）の誘導を、0または500 mM NaClを含有するpH6.0の20 mM His/His-HCl中で試料を透析し、その後、10℃で15時間インキュベーションすることにより行った。未処理の試料と比較したHMWの形成を、SEC HPLCによりモニターした（図2）。

Claims

a）最大レベルのアミノ酸配列同一性を達成するように、免疫グロブリンの第4の重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列を、参照配列であるxxxxTxxTxxx（SEQ ID NO: 11）と整列させる段階、
b）第4の重鎖フレームワーク領域およびxxxxTxxTxxx（SEQ ID NO: 11）の参照配列において、5および／または8位でのスレオニン残基の差を同定する段階、
c）b）において同定された5および／または8位の位置の第4の重鎖フレームワーク領域におけるアミノ酸残基を、参照配列におけるようにそれぞれのスレオニン残基と置換することにより、免疫グロブリンを改変する段階、
d）免疫グロブリンをコードする核酸配列を提供する段階
を含む、免疫グロブリンをコードする核酸配列を提供するための方法。
a）最大レベルのアミノ酸配列同一性を達成するように、免疫グロブリンの第4の重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列を、参照配列であるxxxxTxxTxxx（SEQ ID NO: 11）と整列させる段階、
b）第4の重鎖フレームワーク領域およびxxxxTxxTxxx（SEQ ID NO: 11）の参照配列において、5および／または8位でのスレオニン残基の差を同定する段階、
c）b）において同定された5および／または8位の位置の第4の重鎖フレームワーク領域におけるアミノ酸残基を、参照配列におけるようにそれぞれのスレオニン残基と置換することにより、免疫グロブリンをヒト化する段階、
d）任意で、ヒト化免疫グロブリンをコードする核酸配列を提供する段階
を含む、免疫グロブリンをヒト化するための方法。
a）最大レベルのアミノ酸配列同一性を達成するように、免疫グロブリンの第4の重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列を、参照配列であるxxxxTxxTxxx（SEQ ID NO: 11）と整列させる段階、
b）第4の重鎖フレームワーク領域およびxxxxTxxTxxx（SEQ ID NO: 11）の参照配列において、5および／または8位でのスレオニン残基の差を同定する段階、
c）b）において同定された5および／または8位の位置の第4の重鎖フレームワーク領域におけるアミノ酸残基を、参照配列におけるようにそれぞれのスレオニン残基と置換することにより、免疫グロブリンを改変する段階、
d）改変された免疫グロブリン重鎖アミノ酸配列をコードする核酸および対応する軽鎖アミノ酸配列をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の発現のために培養する段階、
e）哺乳動物細胞または培養培地から免疫グロブリンを回収し、かつそれにより免疫グロブリンを生産する段階
を含む、免疫グロブリンを生産するための方法。
参照配列が、配列WGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 02）、または配列WGRGTLVTVSS（SEQ ID NO: 03）、または配列WGQGTMVTVSS（SEQ ID NO: 04）、または配列WGQGTTVTVSS（SEQ ID NO: 05）、または配列WGKGTTVTVSS（SEQ ID NO: 06）であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
第1の段階として、
免疫グロブリン重鎖の第4のフレームワーク領域のアミノ酸配列を提供するかまたは決定する段階
を含むことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
免疫グロブリンがヒトまたはヒト化免疫グロブリンであることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
免疫グロブリンが、キメラ免疫グロブリン、またはCDR移植免疫グロブリン、またはT細胞エピトープが除去された免疫グロブリン、またはそれらの変異体であることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
哺乳動物細胞がCHO細胞またはHEK細胞であることを特徴とする、請求項3〜7のいずれか一項記載の方法。