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JP5663491B2 - 標的核酸の検出方法 - Google Patents

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Description

本願は、２００９年１０月２９日に出願した日本国特許出願である特願２００９−２４９１２２に基づく優先権を主張するものであり、引用により、その全ての内容が、本願に取り込まれるものとする。本発明は、標的核酸を検出する技術に関する。
従来、生物個体の遺伝子解析や、生体試料におけるウイルスや細菌等の感染を調べるための方法として、核酸配列を網羅的に検出または定量する方法が提案されている。例えば、試料中に含まれる検出対象の核酸配列（標的核酸）に関する発現量を検出する方法として、マイクロアレイ（以下、単にアレイと呼ぶ）が用いられている（例えば、非特許文献１〜４）。アレイとは、担体上にあらかじめ塩基配列の明らかな複数の核酸断片（検出用プローブ）をそれぞれ独立に固定化したものである。図８に示すように、従来のアレイ法は、検出対象の標的配列を識別する為に、標的配列を挟み込むように設計した正方向プライマー（Ｆプライマー）と逆方向プライマー（Ｒプライマー）を用いて、標的配列を含むＤＮＡ断片（標的核酸）を増幅する。次いで増幅した標的核酸を一本鎖に分離する。さらにアレイ上に固定されている検出用プローブの、標的核酸の特徴的な部分配列（標的配列）と相補的な配列を有する部分と、標的配列とがハイブリッドを形成（ハイブリダイズ）することによって、標的核酸を担体上に結合する。このハイブリッドを形成した標的核酸を何らかの手段で検出することにより、試料中の核酸の有無を調べることができる。また、一塩基多型（ＳＮＰ）の検出に特化したアレイが開発されている（例えば特許文献１、２）。この方法では、試料の標的核酸についてＤＮＡコンピュータ技術を用いて、ＳＮＰのタイプを検出することができる。
特開２００６−２１１９８２号公報 特開２００６−１０１８４４号公報
バイオ実験で失敗しない！検出と定量のコツ 実験医学別冊 羊土社 第３章−１０ マイクロアレイ解析のコツ Bioview, No.45,pp14-18,2004 タカラバイオ バイオテクノロジーシリーズ ＤＮＡチップ応用技術 シーエムシー社 第５章 ＤＮＡマイクロアレイの実際とその応用 厚生労働科学研究費補助金 食品の安心・安全確保推進事業 いわゆる健康食品の有効性の評価に関する研究（平成１８年度 総括・分担研究報告）
上記非特許文献１〜４に記載の方法は、アレイ上に固定されている検出用プローブと標的配列とをハイブリダイズするが、このハイブリダイズ反応に多くの時間を要する。さらに検出用プローブは、標的配列と類似性（ホモロジー）を有する他の核酸配列と非特異的に結合する可能性がある。すなわち、試料に含まれる複数の標的核酸を検出する場合に、正確に標的核酸の有無を検出することができない場合がある。
非特異的結合の問題について、非特許文献２には、検出用プローブを短くすることでホモロジーを最小化できると記載されているが、検出用プローブを短くすると検出時の標識シグナルが低下してしまう。また、非特許文献４には、ハイブリダイズ時の温度を高くすることで非特異的な結合を低減できると記載されているが、それでも解決できない場合には検出用プローブ配列の再設計とアレイの再作製が必要となる。従って、アレイの使用者は、ホモロジーの影響を検討する必要があった。適切な標的核酸のための適切な検出系を得るまでの作業工程は極めて多大なものであった。
一方、特許文献１，２に記載の方法は、ＳＮＰの検出に特化した方法であり、精度よくＳＮＰを検出できるものの、一つのＳＮＰの検出に７種ものプローブを要し、さらに操作が煩雑であるといった問題があった。さらに、アレイへのハイブリダイズの前に標的核酸の増幅副産物をライゲーションするための操作があるため、使用者にプローブ設計の煩わしさを生じさせていた。
以上のように、従来の手法では、意図した標的核酸の検出系を構築するための労力は多大なものであった。また、短時間で標的核酸を精度よく検出することもまた困難であった。そこで、本明細書の開示は、効率的に標的核酸の検出系を構築できる標的核酸の検出方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、検出系の構築の効率化のために、担体上に固定した検出用プローブと標的核酸とを、選択性を維持したまま効率的にハイブリダイズする方法を種々検討した。その結果、固相担体上におけるハイブリダイゼーション反応で標的核酸の配列特異性に基づく検出系では、検出系の効率的な構築は極めて困難であるという結論に達した。そして、あらかじめ特異的にハイブリダイズ可能に設計された複数組の検出用プローブとタグ配列とを用い、タグ配列を標的核酸に結合することでハイブリダイゼーション条件の検討等を省略してしかも非特異的な結合を排除して高い選択性を実現できることを見出した。さらに、このようなキメラ標的核酸を、標的配列に特異的なプローブを用いてライゲーションを行わずに、ホモロジーの低い部分配列、すなわち、標的核酸に特徴的な配列と、特異的にハイブリダイズ可能なプライマーを用いて、標識された標的核酸を増幅することによって、標識された標的核酸と検出用プローブとの非特異的な結合を低減することができることを見出した。こうした知見に基づき以下の手段が提供される。
本明細書の開示は、試料中の標的核酸を検出する方法に関する。本検出方法は、それぞれ異なる所定の塩基配列を有する検出用プローブを備える固相体を準備する工程と、前記試料に対してＰＣＲを実施して、前記標的核酸に予め関連付けられた前記検出用プローブに相補的なタグ配列と標識とを有するキメラＤＮＡを取得する工程と、前記キメラＤＮＡと前記検出用プローブとを前記タグ配列によりハイブリダイズ可能に接触させる工程と、前記固相体上の前記標識に基づくシグナル強度情報を取得する工程と、前記シグナル強度情報に基づいて前記標的核酸を検出する工程と、を備えることができる。
本検出前記ＰＣＲ工程は、前記標的核酸中の標的配列と相補的な識別用配列と前記タグ配列と相補的なタグ付加用配列とを有する第１のプライマーと、前記標的配列に隣接する部分配列に一致する部分配列と、標識とを有する第２のプライマーとを準備し、前記試料に対して前記第１のプライマーと前記第２のプライマーとを用いてＰＣＲを行い、前記標的配列と前記タグ配列と前記標識とを有するキメラＤＮＡを合成することを含むことができる。
また、前記ＰＣＲ工程は、２以上の前記標的核酸につき、２以上の前記第１のプライマーと２以上の前記標的核酸に共通する１つの前記第２のプライマーとすることができる。
さらに、前記ＰＣＲ工程は、非対称ＰＣＲによって、前記キメラＤＮＡを増幅する工程とすることができる。
前記標的核酸に予め関連付けられたタグ配列とハイブリダイズ可能な検出用プローブを備えるアレイを用いて、標的核酸を検出することができる。
本発明の検出方法の一例の概要を模式的に示す図である。 本発明における固相担体及び固相担体上の検出用プローブとキメラＤＮＡとの関係を示す図である。 本発明における標識済み標的核酸の増幅工程を示す図である。 アレイの作成とターゲットの調製のフローチャートを示す。 検出用プローブに用いる塩基配列を示す表である。 本発明の実施例で得られた検出結果を示す図である。 従来法の実施例で得られた検出結果を示す図である。 従来の標的核酸検出方法の一例を示す図である。
本発明は、検出対象たる標的核酸中の標的配列を検出するためのアレイに関する。本発明の標的核酸の検出方法によれば、それぞれ異なる固有の塩基配列を有する複数の検出用プローブを備える固相担体を準備するため、標的核酸毎に検出用プローブを設計し固定する検出系の構築のための操作が回避される。また、前記標的核酸に予め関連付けられた前記検出用プローブに相補的な検出用配列と標識とを有するキメラＤＮＡを取得するように前記試料に対してＰＣＲを実施することで、ハイブリダイズ用のＤＮＡを調製するＰＣＲにおいて、標的核酸を識別し、しかも既に検出用プローブに関連付けられた検出用配列を有して、標的核酸に特異的であってかつ標識されたキメラＤＮＡを得ることができる。さらに、キメラＤＮＡと検出用プローブとを検出用配列を用いてハイブリダイズさせることで、予め関連付けられた検出用プローブと検出用配列とに基づいてキメラＤＮＡが検出用プローブにハイブリダイズされるため、ハイブリダイズ時の非特異的結合が効果的に抑制又は回避される。
さらに、本明細書の開示によれば、ＰＣＲに際して、標的核酸中の標的配列と相補的な識別用配列とタグ付加用配列とを有する第１のプライマーと、標的配列に隣接する部分配列と標識とを有する第２のプライマーとを用いることで、プローブやプライマーの設計時の煩雑さが抑制又は回避される。また、こうしたプライマーセットを用いることで、標的配列を直接識別して標的核酸に特異的である、検出用プローブとのハイブリダイズのためのキメラＤＮＡを簡易に調製することができる。
この方法は、標的核酸が複数の場合でもそれぞれの標的核酸を確実に検出することができるほか、核酸中の一塩基多型（ＳＮＰ）や遺伝子改変した核酸における改変部位の検出、さらにはＲＮＡ等発現遺伝子の検出にも用いることができる。即ち、標的核酸中の多型や変異についても検出対象たる変異と同様のコンセプトでキメラＤＮＡを取得するようにすることで標的核酸中のＳＮＰ、改変部位、発現遺伝子、多型や変異等を検出することができる。
図４に、標的核酸を検出するためのアレイの作成とターゲットの調製の手順の概要を示す。図４の手順は、本明細書に開示される方法および従来の検出方法のフローチャートを併せて示している。なお、実線で示すステップは本明細書に開示される方法及び従来法に共通のステップであり、点線で表示されるステップは従来法にのみ必要なステップである。従来法では、標的核酸毎にアレイの作製のために複数工程を実施する。まず、検出対象の標的核酸の配列情報を取得し、この配列情報を参照して検出用プローブを設計する。検出用プローブを設計に基づいて合成し、アレイ用のスポット溶液に調製してアレイに固定する。一方で、検出対象の標的核酸（ＲＮＡやＤＮＡ等のターゲット）を試料から抽出し、精製する。次いで、標的核酸を増幅するためのプライマーを設計し、これにラベリングを付して合成する。その後、合成したプライマーを用いて標的核酸を増幅する。次いで、増幅した標的核酸と、調製したアレイ上の検出用プローブとをハイブリダイズを行う（ハイブリダイゼーション）。さらにアレイ上の標識シグナルの検出によって、ハイブリダイゼーションが行われたかを検討し、得られた標識シグナルから数値化を行う。ここで、得られた結果が、異常であったり、蛍光シグナルそのものが得られなかったりした場合など、意図する結果でなかったときには、図４の実線及び点線で示すように、再度アレイの設計もしくは試料の調製を見直す必要がある。
例えば、非特許文献１〜４に開示される従来の方法では、ハイブリダイゼーション条件、プライマー、さらにはアレイ上の検出用プローブ配列等、多くの再検討が必要であった。特に検出用プローブのオリゴＤＮＡやクエリプローブ配列の再設計と合成には多くの時間を費やすことになる。本発明の方法では、検出用プローブやクエリプローブは１００種の配列から選択するだけでよい（配列表参照）。また、特許文献５〜６に記載の方法では、一種類の標的配列の検出に対してプライマーおよびプローブを７種類要しているが、本発明では、一種類の標的配列の検出に対してプライマーは２種類あればよい。
これに対して、本明細書に開示される方法では、標的核酸にかかわらず予め決定されたそれぞれ固有の検出用配列を有する複数の検出用プローブを備えたアレイを準備すれば足りる。このアレイは、検出対象たる標的核酸にかかわらず適用できるものであるため、従来法のように標的核酸毎のプローブを設計、合成、固定化、ハイブリダイゼーション条件の検討がいずれも回避される。また、本明細書に開示される方法では、ターゲットの調製に際したプライマーの設計のみを中心に検討すれば、検出系を構築することができる。
さらに、本明細書の開示の方法によれば、ハイブリダイゼーション条件を最適化した検出用プローブを準備できるため、短時間で標的核酸を精度よく検出することができる。
なお、本明細書において「核酸」とは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡおよび合成ＲＮＡを含む全てのＤＮＡおよびＲＮＡ、並びにペプチド核酸、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸およびＳ−オリゴ核酸などの人工合成核酸を含む。また、１本鎖であっても２本鎖であってもよい。また、本明細書において「標的核酸」とは、任意の配列を有する任意の核酸である。典型的には、体質、遺伝病、癌などの特定疾患についての発症、疾患診断、治療予後、薬剤や治療の選択などのヒトや非ヒト動物における遺伝子上の指標となる塩基配列を有する可能性のある核酸が挙げられる。指標としては、ＳＮＰなどの多型や先天的又は後天的変異が挙げられる。また、病原菌やウイルスなどの微生物由来の核酸なども標的核酸に含まれる。
標的核酸は、後述する試料又はその核酸画分をそのまま用いることもできるが、好ましくは、ＰＣＲによる増幅反応、より好ましくはマルチプレックスＰＣＲによる増幅反応により、複数の標的核酸の全てが増幅された増幅産物を用いることが好ましい。
本明細書において「試料」とは、標的核酸を含む可能性のある試料をいう。試料としては、細胞、組織、血液、尿、唾液等が含まれ、核酸を含む任意の試料を用いることができる。こうした各種の試料からの核酸を含む画分は当業者であれば適宜従来技術を参照して取得することができる。
本明細書において「標的配列」とは、検出対象の標的核酸に特徴的な１又は２以上の塩基からなる配列をいう。例えば、標的核酸同士のホモロジーの低い部分配列であってもよいし、試料に含まれる可能性のある他の核酸に相補性もしくは相同性の低い配列であってもよい。標的配列は、標的核酸に特徴的な配列であってもよい。こうした標的配列は、人工的に配列を変更したものであってもよい。
以下では、本明細書の開示の代表的かつ非限定的な具体例について、図面を参照して詳細に説明する。この詳細な説明は、本明細書の開示の好ましい例を実施するための詳細を当業者に示すことを単純に意図しており、本明細書の開示の範囲を限定することを意図したものではない。また、以下に開示される追加的な特徴ならびに開示は、さらに改善された標的核酸の検出方法等を提供するために、他の特徴や発明とは別に、又は共に用いることができる。
また、以下の詳細な説明で開示される特徴や工程の組み合わせは、最も広い意味において本明細書の開示を実施する際に必須のものではなく、特に本明細書の開示の代表的な具体例を説明するためにのみ記載されるものである。さらに、上記及び下記の代表的な具体例の様々な特徴、ならびに、独立及び従属クレームに記載されるものの様々な特徴は、本明細書の開示の追加的かつ有用な実施形態を提供するにあたって、ここに記載される具体例のとおりに、あるいは列挙された順番のとおりに組合せなければならないものではない。
本明細書及び／又はクレームに記載された全ての特徴は、実施例及び／又はクレームに記載された特徴の構成とは別に、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、個別に、かつ互いに独立して開示されることを意図するものである。さらに、全ての数値範囲及びグループ又は集団に関する記載は、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、それらの中間の構成を開示する意図を持ってなされている。
図１は、本発明の検出方法の原理を模式的に表す図である。図２は、本発明で用いる固相体１００の一例を示し、図３は、図１の増幅工程の詳細を示す。なお、図１及び図３は、試料中に含まれる１種類の標的核酸を検出するための検出方法及びプライマーについての一例である。なお、以下の説明において、ある塩基配列について番号を付して説明するとき、その番号に対して（−）を付して記載しているものは、当該塩基配列に相補的な塩基配列を意味するものとする。
［標的核酸中の標的配列を検出する方法］
本明細書に開示される検出方法は、それぞれ異なる固有の塩基配列を有する複数の検出用プローブを備える固相体を準備する工程と、前記標的核酸に予め関連付けられた前記検出用プローブの検出用配列に相補的なタグ配列と標識とを有するキメラＤＮＡを取得するように前記試料に対してＰＣＲを実施する工程と、前記キメラＤＮＡと前記検出用プローブとを前記検出用配列と前記タグ配列とを用いてハイブリダイズさせる工程と、前記担体上の前記標識に基づくシグナル強度情報を取得する工程と、前記シグナル強度情報に基づいて前記標的核酸を検出する工程と、を備えている。本明細書に開示の検出方法は、１種又は２種以上の標的核酸を適用対象とし、より詳細には、これらの標的核酸中の特徴的な配列に関する標的配列を検出対象とする。以下、主として一種の標的核酸についての一連の工程を説明するが、以下の工程は、複数又は多数の標的核酸を同時に検出する場合にも適用される。
（固相担体の準備工程）
本明細書に開示される検出方法（以下、単に本検出方法という。）は、図１に示すように、固相体１００を準備する工程を備えることができる。こうした固相体１００は、検出方法の実施に先立って予め準備していてもよいし、商業的に入手してもよいし、検出方法の実施毎に調製してもよい。
図１に示すように、固相体１００は、それぞれ異なる固有の塩基配列である検出用配列１０６を備える複数の検出用プローブ１０４を担体１０２上に備えることができる。このような固相体１００を準備することで、プローブの設計、合成、アレイの作製、ハイブリダイゼーション条件についての検討を回避することができる。
図２に固相体１００の一例を示す。検出用プローブ１０４は、それぞれプロービングのための固有の塩基配列である検出用配列１０６を有している。このような検出用配列１０６は、標的核酸１０に特徴的な配列すなわち標的配列１２と、無関係に設定することができる。標的配列１２と無関係に設定することで、検出用プローブ１０４の検出用配列１０６を、複数の検出用プローブ１０４間での非特異的結合を抑制又は回避できるように、かつ、ハイブリダイゼーションに好適な温度及び時間等のハイブリダイゼーション条件を考慮して設定することができる。また、標的核酸１０の種類にかかわらず、いつも同じ検出用プローブ１０４を用いることができるようになる。
こうした検出用プローブ１０４の検出用配列１０６としては、例えば、配列番号１〜配列番号１００に記載の塩基配列又はこの塩基配列に相補的な塩基配列を用いることができる。これらの塩基配列は全て同一塩基長であり、融解温度（Ｔｍ）が４０℃以上８０℃以下、好ましくは５０℃以上７０℃以下であって、同一条件でのハイブリダイズにおいて均質なハイブリダイズ結果が得ることができる。
検出用プローブ１０４の検出用配列１０６は、このような候補となる塩基配列から適宜選択して用いることができる。使用する２種類以上の検出用プローブ１０４の融解温度は、できるだけ近いことが好ましい。同時に網羅的に複数の標的核酸１０を検出しようとする場合には、複数の標的核酸１０に対してそれぞれ使用する複数の検出用プローブ１０４の融解温度は互いに最も近似するように組み合わされていることが好ましい。例えば、検出用プローブ１０４を融解温度の順に配列したとき、例えば、区別しようとする２種類以上の標的核酸１０にそれぞれ対応する２種類以上の検出用プローブ１０４は、溶融温度の順列において隣り合う２種類の塩基配列から選択することができる。また、他の標的核酸１０に対応する検出用プローブ１０４のための検出用配列１０６を、既に選択した塩基配列にすぐ隣に連続する塩基配列から選択してもよいし、離れた一つづきの塩基配列から選択してもよい。同時に検出しようとする複数の標的核酸１０に対応する全ての検出用プローブの融解温度が融解温度の順列において一続きの塩基配列を用いることも好ましい。
なお、融解温度は、ＧＣ％法、Wallace法、Current Protocols in Molecular Biologyに準拠した方法（秀潤社刊バイオ実験イラストレイテッド３ 本当に増えるＰＣＲｐ．２５に記載）等により算出したものを採用できるが、本発明における融解温度の範囲および塩基配列濃度の影響を加味できるNearest-Neighbor法によって算出されることが好ましい。Nearest-Neighbor法による融解温度は、例えば、Visual OMP（トミーデジタルバイオロジー株式会社製）とのソフトウエアや日本遺伝子研究所（http://www.ngrl.co.jp/）が提供するソフトウエア（OligoCalculator;http://www.ngrl.co.jp/tool/ngrl_tool.html）により容易に取得できる。なお、配列番号１〜配列番号１００は、VisualOMPによって算出される融解温度（０．１Ｍプローブ濃度、５０ｍＭ Ｎａ＋イオン及び１．５ｍＭＭｇ＋イオン）の高い順に配列されている。
このような検出用プローブ１０４における検出用配列１０６は、正規直交化配列ともいい、たとえば乱数から得られた所定塩基長のＤＮＡ配列に対して連続一致長、Nearest-Neighbor法による融解温度予測、ハミング距離、二次構造予測の計算を行うことにより設計される。正規直交化配列は、核酸の塩基配列であって、その融解温度が均一であるもの、即ち融解温度が一定範囲内に揃うように設計された配列であって、核酸自身が分子内（intramolecular）で構造化して、相補的な配列とのハイブリッド形成を阻害することのない配列であり、尚且つこれに相補的な塩基配列以外とは安定したハイブリッドを形成しない塩基配列を意味する。１つの正規直交化配列群に含まれる配列は、所望の組み合わせ以外の配列間および自己配列内において反応が生じ難いか、または反応が生じない。また、正規直交化配列は、ＰＣＲにおいて増幅させると、たとえば上述のクロスハイブリダイズのような問題に影響されずに、当該正規直交化配列を有する核酸の初期量に応じた量の核酸が定量的に増幅される性質を有している。上記のような正規直交化配列は、H.Yshida and A.Suyama,“Solution to 3-SAT by breadth first search”,DIMACS Vl.54, 9-20(2000)および特願２００３−１０８１２６に詳細が記載されている。これらの文献に記載の方法を使用して正規直交化配列を設計することができる。
検出用プローブ１０４は、担体１０２に固定化されている。こうした担体１０２としては、固相担体を用いることができる。例えば、担体１０２はプラスチックであってもよいし、ガラスであってもよく、材質は特に限定されない。なお、担体１０２の形状は図１に示すように平板状であってもよいが、ビーズ状であってもよく、形状は特に限定されない。固相体１００は、好ましくは、担体１０２が固相平板状であり、複数の検出用プローブ１０４が一定の配列で固定されたアレイ（特にマイクロアレイ）である。アレイは、多数個の検出用プローブ１０４を固定でき、同時に網羅的に各種の標的核酸１０を検出するのに都合がよい。また、固相体１００は、担体１０２上に複数個の区画されたアレイ領域を備えていてもよい。これらの複数のアレイ領域は、それぞれ同一の組み合わせからなる検出用プローブ１０４のセットが固定化されていてもよいし、それぞれ別の組み合わせからなる検出用プローブ１０４のセットが固定化されていてもよい。複数のアレイ領域に異なる組み合わせの検出用プローブ１０４のセットが固定化されていれば、個々のアレイ領域を、異なる遺伝子における標的核酸１０の検出のために割り当てることができる。
また、好ましい固相体１００は、２種類以上の検出用プローブ１０４がその融解温度に基づく順序で配列された配列状態を備えることができる。例えば、このような固相体１００を用いて、検出用プローブ１０４の順序に沿って、ある遺伝子のある部位に関して存在しうる２種類以上の標的配列１２に対応する２種類以上の標的核酸１０に対応する２種類以上の検出用プローブ１０４を割り当てることで、検出用プローブ１０４の検出用配列１０６の融解温度の差や検出用プローブ１０４の固定化位置に由来するハイブリダイズのバラツキを抑制して、精度よく試料中の標的核酸１０を検出することができる。
検出用プローブ１０４の固定化形態は特に限定されない。共有結合性であってもよいし非共有結合性であってもよい。検出用プローブ１０４は、従来公知の各種の方法で担体１０２の表面に固定化することができる。また、担体１０２の表面に対しては適当なリンカー配列を備えていてもよい。リンカー配列は、好ましくは検出用プローブ１０４間において同一塩基長で同一配列とする。
（キメラＤＮＡ取得工程：ＰＣＲ工程）
図１に示すように、ＰＣＲ工程は、標識４２と、標的核酸１０に予め関連付けられた特定の検出用プローブ１０４の検出用配列１０６とハイブリダイズ可能なタグ配列６６とを有するキメラＤＮＡ６０を取得するように試料に対してＰＣＲを実施する工程とすることができる。このようなキメラＤＮＡ６０を取得することで、標的核酸１０の標的配列１２の塩基配列にかかわらず、予め標的配列１２に関係なく決定された固有の検出用配列１０６を有する検出用プローブ１０４を利用することができるようになる。タグ配列６６は、検出用プローブ１０４の固有の検出用配列１０６と特異的にハイブリダイズ可能な程度に相補的であることが好ましく、より好ましくは検出用配列１０６に完全に相補的である。標識については後述する。
ＰＣＲ工程は、こうしたキメラＤＮＡ６０を得ることができればよく、用いるプライマーの形態は特に限定しない。以下に、本検出方法において好適なＰＣＲ工程の一例を、図１を参照して説明する。図１の右側上段には、試料中の標的核酸１０及びその相補鎖２０に対して、第１のプライマー３０と第２のプライマー４０とを用いてＰＣＲを実施して、その増幅産物としてのキメラＤＮＡ６０を取得する工程を示している。
（第１のプライマー）
図１に示すように、第１のプライマー３０は、識別用配列３２とタグ付加用配列３６とを有している。第１のプライマー３０は、標的核酸１０の種類に基づき、その数だけ準備される。ある種の生物のゲノムＤＮＡの所定部分において二通りの変異が想定される場合、例えば、一塩基置換変異であって、天然型がＡであり変異型がＴの場合、当該部分について標的核酸１０は二種類存在することになる。したがって、当該部分について、一つの標的核酸１０が天然型塩基を含む標的配列１２を有し、他の一つの標的核酸１０が変異型塩基を含む標的配列１２を有することになる。したがって、遺伝子のある部位に関し２種類の標的核酸１０が存在するときには、それぞれの標的核酸１０が有する標的配列１２に相補的な識別用配列３２をそれぞれ備える２種類の第１のプライマー３０が準備される。
（識別用配列）
識別用配列３２は、標的核酸１０中の特徴的配列である標的配列１２と特異的にハイブリダイズして試料中の標的核酸１０を識別することができる。識別用配列３２は、標的核酸１０の標的配列１２と高い選択性でハイブリダイズ可能な程度に相補的に設定される。好ましくは完全に相補的（特異的）に設定される。なお、識別用配列３２として好ましい長さは変異の態様にもよるため、特に限定されないが、たとえば１５塩基以上であることが望ましい。識別用配列３２の長さ１５塩基以上であることによって、高い選択性で標的配列１２とハイブリダイズが可能である。また、識別用配列３２が６０塩基以下であれば、非特異なハイブリダイズが低減するため好ましい。
（タグ付加用配列）
第１のプライマー３０は、増幅産物であるキメラＤＮＡ６０を検出用プローブ１０４の検出用配列１０６とハイブリダイズ可能にするためのタグ配列６６をキメラＤＮＡ６０に付与するためのタグ付加用配列３６を備えることができる。キメラＤＮＡ６０におけるタグ配列６６は、標的核酸１０を検出するものであるため、標的核酸１０毎に検出用プローブ１０４の検出用配列１０６にハイブリダイズ可能に設定される。したがって、一つの標的核酸１０に対応する一つのキメラＤＮＡ６０は一つの検出用プローブ１０４に対応付けられることになる。また、タグ配列６６は、検出用プローブ１０４の固有の検出用配列１０６と完全に相補的であることが好ましい。したがって、タグ付加用配列３６は、検出用プローブ１０４における検出のための固有の検出用配列１０６と同一の塩基配列であることが好ましい。
以上説明したように、第１のプライマー３０を、標的核酸１０の標的配列１２に特異的に結合するようにし、これを標的核酸１０の種類だけ用意することによって、標的核酸１０を検出して特異的に増幅可能に形成されている。また、第１のプライマー３０は、標的核酸１０に対して予め関連付けられた特定の検出用プローブ１０４にＰＣＲ増幅産物であるキメラＤＮＡ６０が特異的に結合可能に形成されている。
（第２のプライマー）
図１に示すように、第２のプライマー４０は、標識４２と、標的核酸１０の標的配列１２に隣接する塩基配列と同一の部分配列４４とを有することができる。標識４２をその５’側に備えることができる。
（標識）
標識４２は、ＰＣＲ増幅産物であるキメラＤＮＡ６０を検出するためのものである。標識４２としては従来公知のものを適宜選択して用いることができる。それ自体励起されると蛍光シグナルを発する蛍光物質などの各種色素であってもよいし、さらに酵素反応や抗原抗体反応により第２成分と組み合わせて各種シグナルを発する物質であってもよい。典型的には、Ｃｙ３、Alexa555、Ｃｙ５、Alexa647等の蛍光標識物質を用いることができる。また、ビオチンとストレプトアビイジンＨＰＲとを組み合わせて基質による処理等による発色による検出を用いてもよい。
（部分配列）
部分配列４４は、標的核酸１０の標的配列１２に隣接する部分配列１４と同一の塩基配列をからなる。ここで、標的配列１２に隣接する部分配列１４は、標的配列１２に対して一個の塩基（ヌクレオチド）を置かずにすぐ５‘側にあることを意味するものでなく、適当な個数の塩基（ヌクレオチド）を置いて存在するものであってもよい。第２のプライマー４０における部分配列４４は、第２のプライマー４０を標的核酸１０の相補鎖２０にアニーリングさせるための配列である。
ＤＮＡ上のある変異を検出する場合、天然型と変異型との双方をそれぞれ標的核酸１０として第１のプライマー３０及び第２のプライマー４０を設計するが、こうした場合には、第２のプライマー４０の部分配列４４は、これらの標的核酸１０で共通化させることができる。すなわち、部分配列４４をこれらの標的核酸１０の標的配列１２に隣接する共通する部分配列とすることができる。共通する部分配列とは、変異に関わらず共通する塩基配列である。こうすることで、標的核酸１０の増幅効率を平均化することができるし、使用する第１のプライマー４０を減らすことができる。こうした部分配列４４は、ある変異を構成する複数の標的配列１２に対応する複数の標的核酸１０にホモロジーを有する配列といえる。
以上説明したように、第２のプライマー４０は、標識４２と部分配列４４とを有し、その部分配列４４に基づいて標的配列１２を含むキメラＤＮＡ６０を増幅産物として合成可能に形成されている。また、本方法が変異を構成する複数の標的配列１２を有する複数の標的核酸１０を対象とする場合には、第２のプライマー４０は、変異を構成する複数の標的配列１２を有する複数の標的核酸１０を同じ条件で増幅可能な共通の部分配列４４を有することができる。
次に、これらの第１のプライマー３０及び第２のプライマー４０を用いてキメラＤＮＡ６０を得る工程について図１及び図３を参照しながら説明する。なお、以下の説明においては、目的とするキメラＤＮＡ６０を得ることができるＰＣＲ反応についてのみ取り上げて説明するものとする。
図３に示すように、第１のプライマー３０は、その識別用配列３２を介して標的核酸１０の標的配列１２にアニールする。この結果、標的核酸１０を鋳型にして、第１のプライマー３０を基点として新生ＤＮＡ鎖が伸張され、新たに合成された部分配列１４（−）を含むＤＮＡ鎖５０が合成される。得られたＤＮＡ鎖５０は、タグ付加用配列３６、識別用配列３２及び部分配列１４（−）を有している。
次に、こうして得られるＤＮＡ鎖５０の部分配列１４（−）に第２のプライマー４０が、その部分配列４４を介してアニールする。この結果、ＤＮＡ鎖５０を鋳型とし、第２のプライマー４０を基点として新生ＤＮＡ鎖が伸張され、識別用配列３２に相補的な塩基配列とタグ付加用配列３６に相補的な塩基配列とを含むＤＮＡ鎖６０が合成される。識別用配列３２は標的配列１２（−）と同一の塩基配列であるため、識別用配列３２に相補的な塩基配列は、標的配列１２に一致する。タグ付加用配列３６に相補的は、検出用プローブ１０４の固有の検出用配列１０６と同一であるため、これに相補的な塩基配列は検出用プローブ１０４の固有の検出用配列１０６に相補的であるタグ配列６６である。したがって、こうして得られるＤＮＡ鎖６０は、標識４２と予め標的配列１２と検出用プローブ１０４に関連付けられたキメラＤＮＡ６０である。こうしたキメラＤＮＡ６０を鋳型にさらに増幅反応が実施される。
なお、このようなキメラＤＮＡ６０を得るＰＣＲ工程は非対称ＰＣＲ工程として実施することが好ましい。例えば、第１のプライマーと第２のプライマーの濃度を変えることによって非対称ＰＣＲを実行することができる。
キメラＤＮＡ６０は二本鎖ＤＮＡの状態で得られるため、これらを解離して一本鎖とすることで、ハイブリダイズ工程に供することができる。なお、ここでいう解離は、例えば、化学的変性及び熱的変性を含む変性処理によって達成することができる。たとえば、化学的変性によって連結されたオリゴヌクレオチドを解離させる場合には、アルカリ変性などの当業者に周知の処理を行えばよい。熱的変性により連結オリゴヌクレオチドを解離させる場合には、生理的条件下では、８５℃以上、好ましくは９０℃以上の温度にすればよいが、当業者であれば、適切な解離方法を選択することができる。
このようなＰＣＲ工程によると、標的核酸１０を含む可能性のある試料に対してＰＣＲ工程を実施することで、標的核酸１０を予め関連付けられた検出用プローブ１０４によって特異的に検出可能なキメラＤＮＡ６０を一挙に取得できる。
また、ＰＣＲ反応物からキメラＤＮＡ６０を回収することなく、次工程へと移行することができる。キメラＤＮＡ６０のみが検出用プローブ１０４に結合しかつ標識４２で検出されるからである。なお、公知の方法によってキメラＤＮＡ６０を回収してもよい。例えば、一本鎖化した後、例えば、適当な固相担体を用いること等の公知の方法でキメラＤＮＡ５０を分離・回収することができる。
（ハイブリダイズ工程）
ハイブリダイズ工程は、キメラＤＮＡ６０中のタグ配列６６に相補的な検出用配列１０６を有する検出用プローブ１０４を担体１０２に固定化した固相体１００上でこれらの検出用プローブ１０４とキメラＤＮＡ６０とをハイブリダイズ可能に接触させる工程である。図１及び図２（ｃ）に示すように、この工程によれば、キメラＤＮＡ６０が検出用プローブ１０４中の検出用配列１０６と一定条件下において特異的にハイブリダイズ部可能な程度に相補的であるとき、これらはハイブリダイズし担体１０２上の所定の検出用プローブ１０４において二重鎖を形成する。ハイブリダイズ工程後において、適宜洗浄工程をさらに含んでいてもよい。
ハイブリダイズ工程には、ＰＣＲ工程で試料中に標的核酸１０が存在する場合にのみ合成され、しかも予め関連付けられた検出用プローブ１０４にしかハイブリダイズしないキメラＤＮＡ６０が供給される。検出用プローブ１０４の検出用配列１０６とキメラＤＮＡ６０のタグ配列６６とは、高度に選択的に設計されておりミスハイブリダイズが高度に抑制されているため、ハイブリダイズ工程においては検出用プローブ１０４に対して非特異的にキメラＤＮＡ６０がハイブリダイズすることが高度に抑制される。
（シグナル強度情報取得工程）
シグナル強度情報取得工程は、ハイブリダイズ後の担体１０２上の標識４２に基づく標的核酸１０についてのシグナル強度情報を取得する工程である。本件シグナル強度情報取得工程によれば、キメラＤＮＡ６０が検出用プローブ１０４とハイブリダイズすることで、標識４２に基づきシグナル強度情報を得ることができる。
図１に示すように、シグナル強度情報取得工程では、固相体１００の検出用プローブ１０４に関連付けられて標識４２由来の標識シグナル４８を検出することができる。関連付けられた検出用プローブ１０４の固相体１００上における位置は予め取得されているため、後段の検出工程で標識シグナル４８の検出することで標的核酸１０の有無や比率を検知することができる。
シグナル強度情報取得工程は、用いた担体１０２の形態や標識４２の種類に応じて、従来公知の手法を適宜選択して採用すればよい。典型的には、担体１０２からハイブリダイズしなかったオリゴヌクレオチド等を洗浄操作等によって除去した後、付加した標識物質の蛍光シグナルをアレイスキャナ等により検出したり、標識物質に対して化学発光反応を実施したりすることができる。担体にビーズを用いた場合には、フローサイトメーターによる検出方法が挙げられる。
（検出工程）
検出工程は、検出用プローブ１０４について得られた標識４２のシグナル強度情報に基づいて、試料中の標的核酸１０の有無や比率等を検出する工程である。本方法によれば、複数の標的核酸１０を同時に検出する場合であっても、確実に検出対象たる標的配列を検出することができる。本方法では、ハイブリダイズ工程において検出用プローブ１０４に対する非特異的な結合が高度に抑制されているため、精度よくかつ高い検出感度で標的核酸１０を検出し、その有無や比率等を取得することができる。
（プライマーセット）
本発明のプライマーセットは、既に説明した第１のプライマーと第２のプライマーとを備えている。このプライマーセットは、検出用プローブ１０４が固定化された固相体と組み合わされて使用されるものであり、既に説明したキメラＤＮＡを取得するのに好適なプライマーセットである。第１のプライマーは、たとえば、同一の遺伝子等に関して個体内に存在する変異や種や属において存在する相違を検出特定の標的核酸に特異的である識別用配列３２と予め検出用配列１０６に関連付けられたタグ付加用配列３６とを有し、第２のプライマーは、標識を備えている。プライマーセットは、２種類以上の標的核酸を検出するためのものであってもよい。この場合、各標的核酸に対して特異的な第１のプライマーと２種類以上の標的核酸に共通化された単一の第２のプライマーとを含んでいてもよい。本発明のプライマーセットは、既に説明した検出用プローブが固定化されたアレイなどの担体とキット化されていてもよい。
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、以下の実施例は本発明を限定するものではない。
以下の実施例では、本発明の検出方法による標的核酸の検出を次の手順で行った。以下、これらの順序に従って説明する。
（１）ＤＮＡマイクロアレイの作製
（２）標的核酸とプライマーの調製と増幅
（３）ハイブリダイズ
（４）スキャナーを用いた検出
（５）データ解析
（１）ＤＮＡマイクロアレイの作製
プラスチック板に、３’末端をアミノ基で修飾した合成オリゴＤＮＡ（株式会社日本遺伝子研究所製）を溶かした水溶液を検出用プローブとして、日本ガイシ株式会社にてＧＥＮＥＳＨＯＴ（登録商標である）スポッターを用いてスポットした。表１に示すように、使用した合成オリゴＤＮＡ配列は、文献（Analytical Biochemistry 364(2007)78-85)のSupplementary Table1記載のＤ１＿００１からＤ１＿１００の１００種とした（図５参照）。スポットの後、８０℃、１時間のベークを行った。なお、これらのプローブは、そのＴｍが、ＶｉｓｕａｌＯＭＰによって算出される融解温度（０．１Ｍプローブ濃度、５０ｍＭＮａ＋イオン及び１．５ｍＭ Ｍｇ＋イオン）の高い順に配列されている。
さらに、以下に記載した手順で、合成オリゴＤＮＡの固定化を行った。すなわち、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳで１５分洗浄後、９５℃の２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳで５分洗浄し、その後、滅菌水で洗浄（１０回上下振とう）を３回繰り返した。その後、遠心（１０００ｒｐｍ×３分）により脱水した。
（２）標的核酸とプライマーの調製と増幅
検出対象とするサンプル遺伝子は、口腔内の微生物種のうち、Enterococcus faecalis（サンプル１）とPseudorambibacter alactolyticus（サンプル２）の２種を用いた。それぞれのサンプルの長さは、微生物に特徴的な配列の周辺配列である１５０ｂｐ程度とし、これらの塩基配列からなる人工遺伝子を標的核酸とした。この標的核酸を増幅するためのプライマーを以下のとおりに人工的に合成した。第２のプライマー、すなわち正方向プライマー（Ｆプライマー）は５´−AGGTTAAAACTCAAAGGAATTGACG−３´（配列番号１０１）とし、５´側をＣｙ３で標識した。第１のプライマー、すなわち逆方向プライマー（Ｒプライマー）はサンプルの標的配列に応じて作成した。サンプル１の逆方向プライマーは、５´−GCAGATTCATTGGTCAGAGAACATATCTCTAGAGTGGT−３´（配列番号１０２）とした。サンプル２の逆方向プライマーは、５´−CATCTAAAGCGTTCCCAGTTCCATATCTCTATTGCGCT−３´（配列番号１０３）とした。
次に、これらのサンプルを以下のように増幅した。なお、サンプル増幅用試薬として、ＱＩＡＧＥＮ社のmultiple PCR kitを使用した。サーマルサイクラーとして、Applied Biosystems社のGeneAmp PCR System9700を使用した。
まず、以下に示す試薬を個々のサンプルごとに調製した。なお、ＦプライマーとＲプライマーはそれぞれ１０ｐｍｏｌ／μｌに調製したものを用いた。
（試薬調製）
ｄＨ２Ｏ １５．０μｌ
multiple PCR kit ２５．０μｌ
Ｆプライマー ３．７５μｌ
Ｒプライマー ３．７５μｌ
試料 ２．５μｌ
合計 ５０．０μｌ
次に、試薬調製をサーマルサイクルプレートに移し、サーマルサイクル反応（９５℃で１５分後；９４℃で３０秒、６２℃で３０秒、７２℃で３０分を５０サイクル；７２℃で１０分、その後４℃に下げる）を行った。そして、増幅した標識サンプルはＱＩＡＧＥＮ社のMinElute PCR Purification Kitにて精製を行った後、狙いとする長さで増幅していることを確認した。
（３）ハイブリダイズ
（２）得た増幅サンプルをマイクロアレイ上に固定した検出用プローブとハイブリダイズするために、以下のHybri controlとHybri solutionを調製し、これからハイブリダイズ用の試薬を調製した。なお、Hybri controlに使用したAlexa555標識オリゴＤＮＡ配列は、図５に記載のプローブのうち、Ｄ１＿１００の配列に相補な配列の５´末端をAlexa555で標識したAlexa555−ｒＤ１＿１００を用いた。
（Hybri control）
Alexa555−ｒＤ１＿１００ １０μｌ
ＴＥ（ｐＨ８．０） ３９０μｌ
合計 ４００μｌ
（Hybri solution）
２０×ＳＳＣ ２．０ｍｌ
１０％ＳＤＳ ０．８ｍｌ
１００％ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ １２．０ｍｌ
１００ｍＭ ＥＤＴＡ ０．８ｍｌ
ｍｉｌｌｉＱ ２４．４ｍｌ
合計 ４０．０ｍｌ
（ハイブリダイズ用の試薬）
Hybri control １．５μｌ
Hybri solution ９．０μｌ
小計 １０．５μｌ
標識サンプル ７．５μｌ
合計 １８．０μｌ
調製した標識サンプル溶液を、Applied Biosystems社のGeneAmp PCR system 9700を使用し、９０℃で１分加熱した後、ヒートブロック（ＴＡＩＴＥＣ社ＤＴＵ−Ｎ）を使用し８０℃で１分加熱した。上記サンプル溶液を各９μｌずつ、マイクロアレイのスポットエリアにかけて、乾燥防止のためコンフォート／プラス用サーもブロックスライド（エッペンドルフ社）を使用し、３７℃で３０分間静置することによってハイブリダイズ反応を行った。
（洗浄）
ハイブリダイズ後、以下の組成の洗浄液を満たしたガラス染色バットに、ハイブリダイズ反応終了後のマイクロアレイ基板を浸漬し、５分間上下振とうし、滅菌水を入れたガラス染色バットにガラス基板を移し、１分間上下振とうし、２０００ｒｐｍで１分間遠心乾燥し、マイクロアレイ基板表面に残った水分を除去した。
（洗浄液の組成）
ｍｉｌｌｉＱ １８８．０ｍｌ
２０×ＳＳＣ １０．０ｍｌ
１０％ＳＤＳ ２．０ｍｌ
合計 ２００．０ｍｌ
（４）スキャナーを用いた検出
Appleied Precision社ArrayWoRxを使用して適宜、露光時間を調節し、蛍光画像を取得した。さらにGenePix Proを使用し、得られた画像の蛍光シグナルの数値化を行った。
（５）データ解析
画像の数値化ソフトウエアとしてGenePix Proを使用し、得られた画像の蛍光シグナルの数値化を行った。図６にサンプル１とサンプル２のそれぞれが、検出用プローブと非特異的結合を起こしているか検証を行った結果を示す。
図６（ａ）に示すように、サンプル１とサンプル２を混合して反応させた場合、両者とも反応による蛍光シグナルが得られており、サンプルを検出することができた。また、図６（ｂ）及び（ｃ）に示すように、サンプルを混合せずにサンプル１のみあるいはサンプル２のみで反応させた場合、狙いとしないプローブには非特異的結合反応を大幅に低減できることがわかった。また、それぞれのサンプルがそれぞれを識別可能に設計した検出用プローブに特異的に結合したことがわかった。
次いで、比較例として、従来の標的核酸の検出方法（非特許文献４の方法）を検証した。以下の比較例では、従来の検出方法による標的核酸の検出を次の手順で行った。以下、これらの順序に従って説明する。
プラスチック板に、３’末端をアミノ基で修飾した合成オリゴＤＮＡ（株式会社日本遺伝子研究所製）を溶かした水溶液を検出用プローブとして、日本ガイシ株式会社にてＧＥＮＥＳＨＯＴ（登録商標である）スポッターを用いてスポットした。使用した合成オリゴＤＮＡ配列は、サンプル１用を５´−ACCACTCTAGAGATA−３´（配列番号１０４）とし、サンプル２用を５´−AGCGCAATAGAGATA−３´（配列番号１０５）とした。プラスチック板にスポットの後、８０℃、１時間のベークを行い、Ｔｍの高い順に配列した。
検出対象とするサンプル遺伝子は、実施例と同じサンプル１サンプル２を用いた。この標的核酸を増幅するための共通のプライマーを以下のとおりに人工的に合成した。Ｆプライマーは５´−AGGTTAAAACTCAAAGGAATTGACG−３´（配列番号１０６）とし、５´側をＣｙ３で標識した。Ｒプライマーは、５´−ATGGTGTGACGGGCGGTGTGT−３´（配列番号１０７）とした。
次に、上記（３）〜（５）と同様にサーマルサイクル反応によってサンプル１とサンプル２を増幅し、実施例６で作成した検出用プローブとハイブリダイズ後、洗浄し、シグナルの検出を行った。図７にサンプル１とサンプル２のそれぞれが、検出用プローブと非特異的結合を起こしているか検証を行った結果を示す。
図７（ａ）〜（ｃ）に示すように、試料中にサンプル１が含まれない場合にも、サンプル１の検出用プローブに弱いながらもシグナルが検出され、一方、試料中にサンプル２が含まれない場合にも、サンプル２の検出用プローブに弱いながらもシグナルが検出された。すなわち、サンプルの非特異的結合が見られた。
また、従来法ではハイブリダイズに要する時間は２時間程度であった。また、検出用プローブへの非特異的反応（蛍光強度で１０％程度）が見られた。一方、本発明によりハイブリダイズに必要な時間は３０分程度と短縮でき、サンプルのＤＮＡマイクロアレイ上の狙いとしない検出用プローブへの非特異的反応を大幅に低減（蛍光強度で１％未満）することが可能となった。それゆえ、本発明によりハイブリダイズ温度は常に一定（３７℃程度）でかつ時間は３０分程度で行える（従来の１／４）ことができる。さらに従来よりも高シグナルの結果を得ることができ、特定の核酸中の塩基の検出及び配列の決定を従来よりも正確に行うことができる。また、従来の方法では、望ましい結果が得られるまで、ハイブリダイズ条件の至適化、プローブ配列の再設計、またはアレイ再作製が必要となることもあった。これに対し、本発明では、プローブ配列の再設計、アレイ再作製は必要とせず、常に同一仕様のアレイで評価することができる。
 配列用フリーテキスト
配列番号１〜１００：プローブ、配列番号１０１〜１０３：プライマー、配列番号１０４〜１０５：プローブ、配列番号１０６〜１０７：プライマー

Claims (3)

  1. 試料中の標的核酸を検出する方法であって、
    前記標的核酸は発症診断、疾患診断、予後診断、薬剤若しくは治療選択に関するヒト及び非ヒト動物におけるＳＮＰ以外の遺伝子上の指標となる標的配列又は微生物由来の当該微生物に特徴的な標的配列を含む核酸であり、
    それぞれ異なる所定の塩基配列を有する検出用プローブを備える固相体を準備する工程と、
    前記試料に対してＰＣＲを実施するＰＣＲ工程と、
    前記標的核酸に予め関連付けられた前記検出用プローブに相補的なタグ配列と標識とを有するキメラＤＮＡを取得する工程と、
    前記キメラＤＮＡと前記検出用プローブとを前記タグ配列によりハイブリダイズ可能に接触させる工程と、
    前記固相体上の前記標識に基づくシグナル強度情報を取得する工程と、
    前記シグナル強度情報に基づいて前記標的核酸を検出する工程と、
    を備え、
    前記ＰＣＲ工程は、前記標的核酸中の標的配列と相補的な識別用配列と前記タグ配列と相補的なタグ付加用配列とを有する第１のプライマーと、前記標的配列でない部分配列に一致する部分配列と標識とを有する第２のプライマーとを準備し、
    前記試料に対して前記第１のプライマーと前記第２のプライマーとを用いてＰＣＲを行い、前記標的配列と前記タグ配列と前記標識とを有する前記キメラＤＮＡを取得することを含み、
    前記検出用プローブは、配列番号１〜１００で表される塩基配列及びその相補配列から選択される塩基配列を有する、方法。
  2. 前記ＰＣＲ工程は、２以上の前記標的核酸につき、２以上の前記第１のプライマーと共有する前記第２のプライマーとを用いて、同時にＰＣＲを実施する工程である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＰＣＲ工程は、２以上の前記標的核酸につき、２以上の前記第１のプライマーと２以上の前記第２のプライマーとを用いて、同時にＰＣＲを実施する工程である、請求項１に記載の方法。
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