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JP5651893B2 - 抗ｐｅｒｐ抗体 - Google Patents

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JP5651893B2
JP5651893B2 JP2006514511A JP2006514511A JP5651893B2 JP 5651893 B2 JP5651893 B2 JP 5651893B2 JP 2006514511 A JP2006514511 A JP 2006514511A JP 2006514511 A JP2006514511 A JP 2006514511A JP 5651893 B2 JP5651893 B2 JP 5651893B2
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Description

本発明は、ＰＥＲＰ（ｐ５３ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ＰＭＰ−２２）遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体または抗体断片、該抗体または該抗体断片を用いるＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの免疫学的検出方法および検出用試薬、該ポリペプチドを発現する細胞の免疫学的検出または測定方法および検出または測定用試薬、該抗体または該抗体断片を用いるＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の診断薬または治療薬および該抗体を産生するハイブリドーマに関する。更に、本発明はＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する、遺伝子組換え抗体または該抗体断片、該抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含んでなるベクター、該ベクターを形質転換して得られる形質転換体および該ハイブリドーマまたは該形質転換体を培養することを特徴とする抗体の製造方法に関する。
癌細胞は、正常細胞では少量あるいはほとんど産生しない物質を、多量に産生する。このような物質を検出または定量することにより、癌細胞を検出することができる。癌細胞が正常細胞よりも多量に産生する物質には、癌遺伝子産物および増殖因子などが含まれ、細胞の癌化・増殖・進展・転移・定着に寄与しているものもある。癌細胞に特徴的なこれらの物質、いわゆる腫瘍マーカーを検出または定量することにより、癌の診断ができる。
これまで腫瘍マーカーとしては、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＣＡ１２５などの胎児性癌抗原、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、酸性フォスファターゼ、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）などの酵素類、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、抗利尿ホルモン（ＡＤＨ）、カルシトニン（ＣＴ）などのホルモン関連物質などが用いられてきた。大腸癌ではＣＥＡ、ＣＡ１９−９、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、ＳＴＮなどが治療効果の判定や再発の指標として用いられてきた。しかしながら前述の腫瘍マーカーを用いた場合、癌などの悪性腫瘍でありながら陰性と判定される場合も多く、また、健常人や良性腫瘍の患者でも擬陽性と判定されてしまう場合があった。例えば、大腸癌において病期別に腫瘍マーカー陽性率を見た場合、治癒切除可能な段階ではＣＥＡは３６％、ＣＡ１９−９は３０％、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９は３５％、ＳＴＮは２１％の患者で検出されたに過ぎず、これらの腫瘍マーカーは早期の大腸癌発見に関して十分な腫瘍マーカーではない（非特許文献１）。
癌の診断における感度と特異性を向上させるためには、複数の腫瘍マーカーを組み合わせることが有効である。新たな腫瘍マーカーの発見により、新たな腫瘍マーカー単独、あるいは従来の腫瘍マーカーと組み合わせ用いることで、癌の診断の感度と精度を高めることができる。
膵臓癌では、一般的な臨床検査項目は正常値を示す上、病期の初期では特徴的な臨床所見もないことから、早期の膵臓癌患者を見出すことは困難である。膵臓癌において胆管閉塞や肝転移が起きている患者は、アルカリフォスファターゼ値とビリルビン値が上昇することがある。膵菅癌では、腫瘍による閉塞膵菅の末梢側に膵臓炎が生じることから、アミラーゼ、エラスターゼ、ＲＮａｓｅなどの膵外分泌酵素および該酵素の阻害物質が血中に逸脱して増加するため、これらの酵素および該酵素の阻害物質が腫瘍マーカーとして用いられており、例えば、ＰＳＴＩ（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）が知られている。ＰＳＴＩは、膵液中に分泌されるトリプシンの阻害物質であり、血中ＰＳＴＩは各種悪性腫瘍患者で高率に上昇しており、特に膵癌患者において高い頻度で認められる（非特許文献２）。
出現頻度が高い膵菅癌の診断と治療モニターの腫瘍マーカーとして、ＣＡ１９−９が広く用いられる。このほかの膵菅癌の腫瘍マーカーとしては、ＣＥＡ、ＳＬＸ、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、シアリルＴｎ、ＤｕＰａｎ−２、フェリチンなどが知られている。しかしながら、転移のない原発性膵臓癌においてはこれらの腫瘍マーカーの測定値は増加しない場合が多く、またこれらの腫瘍マーカーの測定値から擬陽性であると判定される場合も多く、十分な信頼性のある膵臓癌の診断法は知られていない。
膵臓癌の診断と病期分類において最も正確で費用対効果の高い方法は、最初の検査でＣＴ（Ｃｏｍｐｕｔｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）を行うことである。ＣＴにより切除不可能または転移していることが発見された場合、組織診断のための経皮的針吸引を行う。もしＣＴにより切除可能な腫瘍が発見されたり、全く腫瘍が発見されなかった場合には、超音波内視鏡が使われる。その他に超音波と内視鏡的逆行性膵管造影法が一般的な検査に用いられる。切除可能性を決定することを目的に動脈造影や膵機能検査が行われることはまれである。さらに、診断困難な場合には試験開腹が行われる場合もある。
しかしながら、膵臓は後腹膜臓器であるため、これらの診断法では膵臓癌を早期に正確に発見することは容易ではない。早期発見は治癒率の向上に貢献するため、膵臓癌の優れた早期診断法の開発が望まれている。
ＰＥＲＰ（あるいはＴＨＷまたはＰＩＧＰＣ１とも称される）の遺伝子配列は公知である（特許文献１〜１３）。
ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドは１９３アミノ酸からなる蛋白で、一次配列から４回膜貫通蛋白であると推定されている。ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドはｐ５３依存性アポトーシスに関わる蛋白であることが知られている（非特許文献３）。さらにＰＥＲＰ遺伝子ノックアウトマウスより調製した胸腺細胞と神経細胞では、ＤＮＡダメージの際のアポトーシス誘導が部分的に阻害されることが示された（非特許文献４）また、ＰＥＲＰは高転移性癌細胞においては発現が低下する遺伝子としても報告されている（非特許文献５）。
ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドに結合する抗体（以下、抗ＰＥＲＰ抗体と表記する）としては、これまでに、ＰＥＲＰ遺伝子産物のＣ末端細胞内の部分ペプチドまたは第一細胞外ループの部分ペプチドを免疫原として用いて作製されたポリクローナル抗体が知られている（非特許文献６、７）。これらのポリクローナル抗体はウェスタンブロッティングあるいは免疫組織染色に使用可能であることが示されている。これまでにＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体は知られていない。
一般にヒト以外の動物の抗体、例えばマウス抗体などをヒトに投与すると、異物として認識されることにより、ヒト体内にマウス抗体に対するヒト抗体（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＨＡＭＡ）が誘導されることが知られている。ＨＡＭＡは投与されたマウス抗体と反応し、副作用を引き起こしたり（非特許文献８〜１１）、マウス抗体の体内からの消失を速め（非特許文献９、１２、１３）、マウス抗体の治療効果を減じてしまうことが知られている（非特許文献１４、１５）。
これらの問題点を解決するため、遺伝子組換え技術を利用してヒト以外の動物の抗体からヒト型キメラ抗体やヒト型ＣＤＲ移植抗体といったヒト化抗体の作製が試みられている。
ヒト化抗体は、マウス抗体などのヒト以外の動物の抗体と比較してヒトへの臨床応用上、様々な利点を有している。例えば、サルを用いた実験でマウス抗体に比べ免疫原性が低下し、血中半減期が延長したことが報告されている（非特許文献１６、１７）。すなわち、ヒト化抗体は、ヒト以外の動物の抗体に比べ、ヒトにおいて副作用が少なく、その治療効果が長期間持続することが期待される。
また、ヒト化抗体は、遺伝子組換え技術を利用して作製するため、様々な形態の分子として作製することができる。例えば、ヒト抗体の重鎖（以下、Ｈ鎖と表記する）定常領域（以下、Ｃ領域と表記する）（Ｈ鎖Ｃ領域を、ＣＨと表記する）としてｇ１サブクラスを使用すれば、抗体依存性細胞傷害（以下、ＡＤＣＣと表記する）活性などのエフェクター機能の高いヒト化抗体を作製することができ（非特許文献１６）、かつ、マウス抗体に比べ血中半減期の延長が期待される（非特許文献１７）。特にＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの発現細胞数を減少させる治療においては、抗体のＦｃ領域（抗体重鎖のヒンジ領域以降の領域）を介した補体依存性細胞傷害活性（以下、ＣＤＣ活性と表記する）やＡＤＣＣ活性等の細胞傷害活性の高さがその治療効果に重要であるために、ヒト化抗体はマウス抗体等のヒト以外の動物の抗体と比較して望ましい（非特許文献１８、１９）。
さらに、ヒト化抗体は、最近の蛋白質工学、遺伝子工学の進歩により、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（以下、ｓｃＦｖと表記する）（非特許文献２０）、２量体化Ｖ領域断片（以下、Ｄｉａｂｏｄｙと表記する）（非特許文献２１）、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（以下、ｄｓＦｖと表記する）（非特許文献２２）、ＣＤＲを含むペプチド（非特許文献２３）などの、分子量の小さい抗体断片としても作製でき、これらの抗体断片は、完全な抗体分子に比べ、標的組織への移行性に優れている（非特許文献２４）。
以上の事実は、ヒトへの臨床応用に用いる抗体としては、マウス抗体などのヒト以外の動物の抗体よりもヒト化抗体または該抗体断片の方が望ましいことを示している。
ＷＯ９８／５５５０８ ＷＯ９９／５４４６１ ＷＯ００／５５３５０ ＷＯ０１／２２９２０ ＷＯ０１／６６７１９ ＷＯ００／６１６１２
ＷＯ０２／００１７４ ＷＯ０２／４７５３４ ＵＳ２００３−００６４９４７ ＵＳ２００３−００６５１５７ ＷＯ００／５５６２９ ＷＯ０２／６０３１７ ＵＳ２００２−０１１９４６３
大腸がんの腫瘍マーカー．ＣＲＣ１（４），４２（１９９２） 臨床病理，１１，１２２９（１９８６） Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１４，７０４（２０００） Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，１３，１９８５（２００３） Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０，２８０１（２０００）］ Ｐｒｏ Ｓｃｉ社ホームページ、［ｏｎ ｌｉｎｅ］、［平成１６年３月３１日検索］、インターネット＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｓｃｉ−ｉｎｃ．ｃｏｍ／Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ＴＤＳ／２４５１％２０ＰＥＲＰ．ｈｔｍｌ＞ 、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社ホームページ、［ｏｎ ｌｉｎｅ］、［平成１６年３月３１日検索］、インターネット＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｏｖｕｓ−ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ．ｃｏｍ／ｐｒｉｎｔ＿ｄａｔａ＿ｓｈｅｅｔ．ｐｈｐ／４４００＞］ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２，８８１（１９８４） Ｂｌｏｏｄ，６５，１３４９（１９８５） Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，８０，９３２（１９８８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，１２４２（１９８５）］ Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，２６，１０１１（１９８５） Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，８０，９３７（１９８８）］ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３５，１５３０（１９８５） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４６，６４８９（１９８６） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５６，１１１８（１９９６） Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８５，６６８（１９９５） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４，１３８２（１９９０） Ｎａｔｕｒｅ，３２２，３２３（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３（１９８８） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５，６２９（１９９７） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２，２４９（１９９５） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，２９６６（１９９６） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５２，３４０２（１９９２）
本発明の課題は、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体または抗体断片、該抗体または該抗体断片を用いるＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの免疫学的検出または測定方法および検出または測定用試薬、該ポリペプチドを発現する細胞の免疫学的検出または測定方法および検出または測定用試薬、該抗体または該抗体断片を用いるＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の診断薬または治療薬、該抗体を産生するハイブリドーマを提供することにある。また、本発明の課題は、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する遺伝子組換え抗体または該抗体断片、該抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含んでなるベクター、該ベクターを形質転換して得られる形質転換体および該ハイブリドーマまたは該形質転換体を培養することを含む抗体の製造方法を提供することにある。
本発明の抗体は、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する各種疾患の治療に有用である。また、該抗体は、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドまたは該ポリペプチドが発現した細胞を免疫学的手法により特異的に検出または測定することができ、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する各種疾患の診断に有用である。
本発明は、以下の（１）〜（４７）に関する。
（１） ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体または抗体断片。
（２） ポリペプチドの細胞外領域が、配列番号２で表されるアミノ酸配列の３５〜７５番目および１３０〜１５４番目に表されるアミノ酸配列で示される領域である、（１）に記載の抗体または抗体断片。
（３） 抗体が、モノクローナル抗体である、（１）または（２）に記載の抗体または抗体断片。
（４） モノクローナル抗体が、ハイブリドーマＫＭ３４１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−８６４３）から生産されるモノクローナル抗体である、（３）に記載の抗体または抗体断片。
（５） モノクローナル抗体が、ハイブリドーマＫＭ３４１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−８６４３）から生産されるモノクローナル抗体が結合するエピトープと結合するモノクローナル抗体である、（３）に記載の抗体または抗体断片。
（６）（３）〜（５）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ。
（７） ハイブリドーマが、ハイブリドーマＫＭ３４１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−８６４３）である、（６）に記載のハイブリドーマ。
（８） モノクローナル抗体が、遺伝子組換え抗体である、（３）に記載の抗体または抗体断片。
（９） 遺伝子組換え抗体が、ヒト化抗体およびヒト抗体から選ばれる遺伝子組換え抗体である、（８）に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
（１０） ヒト化抗体がヒト型キメラ抗体およびヒト型相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ；以下、ＣＤＲと表記する）移植抗体から選ばれるヒト化抗体である、（９）に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
（１１） （３）〜（５）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体の重鎖（以下、Ｈ鎖と表記する）可変領域（以下、Ｖ領域と表記する）および軽鎖（以下、Ｌ鎖と表記する）Ｖ領域を含む、（１０）に記載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
（１２） （３）〜（５）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域（以下、ＶＨと表記する）およびＬ鎖Ｖ領域（以下、ＶＬと表記する）を含み、かつ、ヒト抗体のＨ鎖定常領域（以下、Ｃ領域と表記する）およびＬ鎖Ｃ領域を含む、（１１）に記載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
（１３） 抗体のＶＨが配列番号１２で示されるアミノ酸配列の１９〜１３０番目のアミノ酸配列を含む、（１１）または（１２）に記載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
（１４） 抗体のＶＬが配列番号１４で示されるアミノ酸配列の２３〜１２８番目のアミノ酸配列を含む、（１１）または（１２）に記載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
（１５） 抗体のＶＨが配列番号１２で示されるアミノ酸配列の１９〜１３０番目のアミノ酸配列を含み、かつ、抗体ＶＬが配列番号１４で示されるアミノ酸配列の２３〜１２８番目のアミノ酸配列を含む、（１１）〜（１４）のいずれか１項に記載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
（１６）（３）〜（５）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを含む、（１０）に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体または抗体断片。
（１７）（３）〜（５）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲとヒト抗体のＶＨおよびＶＬのフレームワーク（以下、ＦＲと表記する）を含む、（１６）に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体または抗体断片。
（１８）（３）〜（５）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲとヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲを含み、かつ、ヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域およびＬ鎖Ｃ領域を含む、（１６）または（１７）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体または抗体断片。
（１９） 抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１５、１６および１７で示されるアミノ酸配列を含む、（１６）〜（１８）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体または抗体断片。
（２０） 抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１８、１９および２０で示されるアミノ酸配列を含む、（１６）〜（１８）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体または抗体断片。
（２１） 抗体ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１５、１６および１７を含み、かつ抗体ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１８、１９および２０で示されるアミノ酸配列を含む、（１６）〜（２０）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体または抗体断片。
（２２） 抗体のＶＨが、配列番号２５で示されるアミノ酸配列、または配列番号２５で示されるアミノ酸配列のうち、２７番目のＧｌｙ、３０番目のＳｅｒ、４１番目のＰｒｏ、４４番目のＬｙｓ、４５番目のＧｌｙ、７２番目のＶａｌ、および９７番目のＡｌａから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、（１６）〜（２１）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体または抗体断片。
（２３） 抗体のＶＬが、配列番号２６で示されるアミノ酸配列、または配列番号２６で示されるアミノ酸配列のうち、３番目のＧｌｎ、５番目のＴｈｒ、３５番目のＴｙｒ、４２番目のＡｌａ、４６番目のＬｅｕ、７０番目のＰｈｅ、および７７番目のＬｅｕから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、（１６）〜（２１）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体または抗体断片。
（２４） 抗体のＶＨが、配列番号２５で示されるアミノ酸配列、または配列番号２５で示されるアミノ酸配列のうち、３番目のＧｌｎ、５番目のＴｈｒ、３５番目のＴｙｒ、４２番目のＡｌａ、４６番目のＬｅｕ、７０番目のＰｈｅ、および７７番目のＬｅｕから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬが、配列番号２６で示されるアミノ酸配列、または配列番号２６で示されるアミノ酸配列のうち、３番目のＧｌｎ、５番目のＴｈｒ、３５番目のＴｙｒ、４２番目のＡｌａ、４６番目のＬｅｕ、７０番目のＰｈｅ、および７７番目のＬｅｕから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、（１６）〜（２３）のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体または抗体断片。
（２５） 抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片である（１）〜（２４）のいずれか１項に記載の抗体断片。
（２６）（１）〜（５）または（８）〜（２５）のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片をコードするＤＮＡ。
（２７）（２６）に記載のＤＮＡを含有する組換え体ベクター。
（２８）（２７）に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
（２９）（６）または（７）に記載のハイブリドーマまたは（２８）に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に（１）〜（５）または（８）〜（２５）のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を生成蓄積させ、培養物から抗体または抗体断片を採取することを特徴とする（１）〜（５）または（８）〜（２５）のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片の製造方法。
（３０）（１）〜（５）または（８）〜（２５）のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を用いるＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの免疫学的検出または測定方法。
（３１） 免疫学的検出または測定方法が免疫沈降法である（３０）に記載の方法。
（３２）（１）〜（５）または（８）〜（２５）のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を用いる、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが発現する細胞の免疫学的検出または測定方法。
（３３） 免疫学的検出または測定方法が蛍光細胞染色法である（３２）に記載の方法。
（３４）（１）〜（５）または（８）〜（２５）のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を用いる、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの検出または測定用試薬。
（３５）（１）〜（５）または（８）〜（２５）のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を用いる、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の診断薬。
（３６）ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患が癌である、（３５）に記載の診断薬。
（３７）（１）〜（５）または（８）〜（２５）のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を有効成分として含有する、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の治療薬。
（３８） ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患が癌である、（３７）に記載の治療薬。
（３９）（１）〜（５）または（８）〜（２５）のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を用いてＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが発現した細胞を検出または測定することを含む、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の診断方法。
（４０）（１）〜（５）または（８）〜（２５）のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を用いてＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドを検出または測定することを含む、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の診断方法。
（４１） ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患が癌である、（３９）または（４０）に記載の診断方法。
（４２）（１）〜（５）または（８）〜（２５）のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を患者に投与することを含む、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の治療方法。
（４３） ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患が癌である、（４２）に記載の治療方法。
（４４） ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の診断薬を製造するための、（１）〜（５）または（８）〜（２５）のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片の使用。
（４５） 癌の診断薬を製造するための、（１）〜（５）または（８）〜（２５）のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片の使用。
（４６） ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の治療薬を製造するための、（１）〜（５）または（８）〜（２５）のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片の使用。
（４７） 癌の治療薬を製造するための、（１）〜（５）または（８）〜（２５）のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片の使用。
本発明によると、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体または該抗体断片、該抗体または該抗体断片を用いるＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの免疫学的検出方法および検出用試薬、該ポリペプチドを発現する細胞の免疫学的検出または測定方法および検出または測定用試薬、該抗体または該抗体断片を用いる癌の診断薬または治療薬および該抗体を産生するハイブリドーマが提供される。更に、本発明はＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する、遺伝子組換え抗体または該抗体断片、該抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含んでなるベクター、該ベクターを形質転換して得られる形質転換体および該ハイブリドーマまたは該形質転換体を培養することを特徴とする抗体の製造方法が提供される。
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、２００４年６月７日に出願された日本国特許出願２００４−１６８１１６号の優先権を主張するものであり、当該特許出願の明細書及び図面に記載される内容を包含する。
第１図には、Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ａｒｒａｙを用いて各種臨床癌部組織および近傍の非癌部組織におけるＰＥＲＰの発現解析を行った結果を示す。癌種は図中に示す。Ｎは非癌部を、Ｔは癌部を示す。
第２図には、ＰＥＲＰ遺伝子導入細胞のクローン毎のＰＥＲＰ発現を、抗Ｍｙｃ抗体を用いたウェスタンブロッティングにより調べた結果を示す。図中のクローンナンバーは、４種のＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞の各クローンを示す。ＰＥＲＰ陰性細胞は、遺伝子を導入していないＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を示す。図中の矢印は、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチド鎖の分子量である約２５ｋＤａを示す。
第３図には、サンドイッチＥＬＩＳＡでのＫＭ３３１４の反応性を示す。左の黒塗りのバーは、ＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞の、右の白塗りのバーはＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の細胞可溶化物を用いたＥＬＩＳＡ法の結果をそれぞれ示す。 第４図には、ウェスタンブロッティングでのＫＭ３３１４の反応性を示す。レーンは左から分子量マーカー、ＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、Ｃｏｌｏ２０５細胞株、ＰＣ−１細胞株の細胞可溶化物をそれぞれ示す。左の写真は一次抗体に陰性対照であるＫＭ１７６４を、右の写真は一次抗体にＫＭ３４１１を用いた結果をそれぞれ示す。
第５図には、蛍光抗体染色法（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｍｉｃｒｏｖｏｌｕ ｍｅＡｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＦＭＡＴと記す）でのＫＭ３４１１の反応性を示す。グラフは縦軸に蛍光強度と細胞数の積算値を示す。 第６図には、フローサイトメトリーでのＫＭ３４１１の反応性を示す。各図の縦軸は細胞数を、横軸は蛍光強度をそれぞれ示す。 第７図には、免疫沈降でのＫＭ３４１１の反応性を示す。図中バーの下の抗体のＫＭ番号は、免疫沈降に使用した抗体をそれぞれ示し、各図の上のＫＭ番号は検出に用いた一次抗体をそれぞれ示す。各図のレーンは、それぞれマーカー、ＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞およびＣＨＯ／ＤＧ４４細胞をそれぞれ示す。
第８図には、フローサイトメトリーでのＫＭ３４１１の反応性を示す。縦軸は陰性対照であるＫＭ５１１の平均強度を１とした時のＫＭ３４１１の平均蛍光強度の比率を示す。グラフ上部の数値は平均蛍光強度比率１５以上であった場合の値を特に示す。図中の表は、使用した細胞株を示す。 第９図には、フローサイトメトリーでのＫＭ３４１１の反応性を示す。縦軸はＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ４５抗体の蛍光強度を、横軸はビオチン標識ＫＭ３４１１あるいは陰性対照であるＫＭ５１１の蛍光強度をそれぞれ示す。各ヒストグラムの上には、細胞の染色に用いた抗体を示す。
第１０図には、フローサイトメトリーでのＫＭ３４１１、市販の各抗ＰＥＲＰ抗体（ポリクローナル抗体）および陰性対照の抗体のＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞およびＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に対する反応性を示す。各図の縦軸は細胞数を、横軸は蛍光強度をそれぞれ示す。各ヒストグラムの上には、細胞の染色に用いた抗体を示す。 第１１図には、プラスミドｐＫＭ３４１１ＶＨ９とｐＫＭ３４１１ＶＬ１１の造成工程を示す。
第１２図には、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ３４１１の造成工程を示す。 第１３図には、精製した抗ＰＥＲＰキメラ抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５〜２０％グラジェントゲルを使用）の電気泳動パターンを示す。左側が非還元条件、右側が還元条件でそれぞれ電気泳動を行った結果である。レーン１と６が分子量マーカー、２と４が抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１、３と５が抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１の泳動パターンをそれぞれ示す。
第１４図には、フローサイトメトリーでの精製した抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１のＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞に対する反応性を示す。縦軸は平均蛍光強度、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。 第１５図には、フローサイトメトリーでの各癌細胞株に対する抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１の反応性を示す。縦軸に細胞数、横軸に蛍光強度をそれぞれ示す。
第１６図には、ＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞に対する抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１のＣＤＣ活性を示す。縦軸は細胞傷害活性％、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。 第１７図には、各細胞株に対する抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１のＡＤＣＣ活性を示す。縦軸は細胞傷害活性％、横軸は抗体濃度をそれぞれ示す。 第１８図には、肺癌細胞株ＰＣ−９が皮内移植されたマウスに、抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１を投与した時の投与群の腫瘍体積の平均値の経日的変化を示す。横軸は腫瘍移植後の日数、縦軸は腫瘍体積をそれぞれ表す。×は抗体非投与群、○は抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１ ０．１ｍｇ／ｋｇ投与群、●は抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１ １ｍｇ／ｋｇ投与群、▲は抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１ １０ｍｇ／ｋｇ投与群をそれぞれ示す。バーは標準偏差を示す。
第１９図には、膵癌細胞株ＢｘＰＣ−３が皮内移植されたマウスに、抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１を投与した時の投与群の腫瘍体積の平均値の経日的変化を示す。横軸は腫瘍移植後の日数、縦軸は腫瘍体積をそれぞれ表す。×は抗体非投与群、○は抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１ ０．１ｍｇ／ｋｇ投与群、●は抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１ １ｍｇ／ｋｇ投与群、▲は抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１ １０ｍｇ／ｋｇ投与群をそれぞれ示す。バーは標準偏差を示す。
本発明は、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体または抗体断片に関する。
ＰＥＲＰ遺伝子としては、配列番号１で示される塩基配列があげられる。
上記の塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を含む遺伝子、配列番号１で示される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有する塩基配列、好ましくは８０％以上の相同性を有する塩基配列、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列を含む遺伝子、ならびに配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを含む遺伝子なども本発明のＰＥＲＰ遺伝子に包含される。
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、サザンブロット・ハイブリダイゼーション法、ＤＮＡマイクロアレイ法などにより得られるハイブリダイズ可能なＤＮＡを意味し、具体的には、ハイブリダイズしたコロニーまたはプラーク由来のＤＮＡ、もしくは該配列を有するＰＣＲ産物もしくはオリゴＤＮＡを固定化したフィルターまたはスライドガラスを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターもしくはスライドグラスを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９８７−１９９７）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，１９９５）］などに記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号１で示される塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
真核生物の蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列には、しばしば遺伝子の多型が認められる。本発明において用いられる遺伝子に、このような多型によって塩基配列に小規模な変異を生じた遺伝子も、本発明のＰＥＲＰ遺伝子に包含される。
ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドとしては、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号２で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに配列番号２で示されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドなどがあげられる。
配列番号２で示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９８７−１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）］などに記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより得ることができる。欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、好ましくは１個〜数十個、例えば、１〜２０個、より好ましくは１個〜数個、例えば、１〜５個のアミノ酸である。
本発明に記載される相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、塩基配列については、ＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値など、アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴ２〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５，３３８９（１９９７）；Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，７，６４９（１９９７）；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ＢＬＡＳＴｉｎｆｏ／ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ３．ｈｔｍｌ〕においてデフォルトのパラメータを用いて算出される数値などがあげられる。
デフォルトのパラメータとしては、Ｇ（Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ｇａｐ）が塩基配列の場合は５、アミノ酸配列の場合は１１、−Ｅ（Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｇａｐ）が塩基配列の場合は２、アミノ酸配列の場合は１、−ｑ（Ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｉｓｍａｔｃｈ）が−３、−ｒ（ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍａｔｃｈ）が１、−ｅ（ｅｘｐｅｃｔ ｖａｌｕｅ）が１０、−Ｗ（ｗｏｒｄｓｉｚｅ）が塩基配列の場合は１１残基、アミノ酸配列の場合は３残基、−ｙ（Ｄｒｏｐｏｆｆ（Ｘ）ｆｏｒ ｂｌａｓｔ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ ｉｎ ｂｉｔｓ）がｂｌａｓｔｎの場合は２０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは７、−Ｘ（Ｘ ｄｒｏｐｏｆｆ ｖａｌｕｅ ｆｏｒ ｇａｐｐｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｉｎ ｂｉｔｓ）が１５および−Ｚ（ｆｉｎａｌ Ｘ ｄｒｏｐｏｆｆ ｖａｌｕｅ ｆｏｒ ｇａｐｐｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｉｎ ｂｉｔｓ）がｂｌａｓｔｎの場合は５０、ｂｌａｓｔｎ以外のプログラムでは２５である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｈｔｍｌ／ｂｌａｓｔｃｇｉｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ）。
配列番号２で示されるアミノ酸配列の部分配列を含むポリペプチドは、当業者に公知の方法によって作製することができ、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの一部を欠失させ、これを含む発現ベクターを導入した形質転換体を培養することにより作製することができる。また、こうして作製されるポリペプチドまたはＤＮＡに基づいて、上記と同様の方法により、配列番号２で示されるアミノ酸配列の部分配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを得ることができる。
ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域とは、例えば配列番号２で示される該ポリペプチドのアミノ酸配列を公知の膜貫通領域予測プログラムＳＯＳＵＩ（ｈｔｔｐ：／／ｓｏｓｕｉ．ｐｒｏｔｅｏｍｅ．ｂｉｏ．ｔｕａｔ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｓｕｉｆｒａｍｅ０．ｈｔｍｌ）または予測プログラムＴＭＨＭＭ ｖｅｒ．２（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ−２．０／）などを用いて予測された領域があげられる。
具体的には、ＳＯＳＵＩを用いた場合には配列番号２で示されるアミノ酸配列の３５〜７５番目および１３０〜１５４番目に相当する領域が、ＴＭＨＭＭ ｖｅｒ．２を用いた場合には配列番号２で示されるアミノ酸配列の３６〜７６番目および１２９〜１４７番目に相当する領域が細胞外領域としてあげられる。このとき、予測に用いられるパラメータはこれらの予測プログラムにデフォルトの値が用いられる。
また、本発明におけるＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域は、文献［Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１４，７０４（２０００）］で予測される細胞外ドメインの３３〜７５番目および１２９〜１５０番目に相当する領域であってもよい。
本発明のＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体または抗体断片は、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの天然型の立体構造を認識し、かつ該ポリペプチドの細胞外領域に結合できる。
ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの天然型の立体構造とは、配列番号１で示される塩基配列を有するＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが天然状態でとりうる立体構造と同等の立体構造を有していればいずれでもよい。このような立体構造を有しているＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドには、本発明のハイブリドーマＫＭ３４１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−８６４３）が生産するモノクローナル抗体が結合できる。従って、本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマＫＭ３４１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−８６４３）により生産されるモノクローナル抗体が結合するエピトープと同一のエピトープに結合するモノクローナル抗体なども包含される。
ハイブリドーマＫＭ３４１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−８６４３）が生産するモノクローナル抗体が結合することを確認する方法としては、例えば、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが発現した細胞に対する公知の免疫学的検出法が用いられ、蛍光細胞染色法などの特定の抗原が発現した細胞と特定抗原に対する抗体の結合性を確認する方法が好適に用いられる。具体的には、実施例４の（３）または実施例５の（２）に記載の蛍光抗体染色法または実施例５の（１）に記載の免疫沈降法などがあげられる。また、公知の免疫学的検出法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などを組み合わせて確認することもできる。
ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが発現した細胞としては、ヒト体内に天然に存在する細胞、ヒト体内に天然に存在する細胞から樹立された細胞株または遺伝子組換え技術により得られた細胞などがあげられる。
ヒト体内に天然に存在する細胞としては、癌患者体内において該ポリペプチドが発現している細胞があげられ、例えば、バイオプシーなどで得られた腫瘍細胞のうちで該ポリペプチドが発現している細胞があげられる。
ヒト体内に天然に存在する細胞から樹立された細胞株としては、上記の癌患者から得られた該ポリペプチドが発現している細胞を株化して得られた細胞株のうち、該ポリペプチドが発現している細胞株があげられ、例えば、ヒトから樹立された細胞株である膵癌細胞株Ｃａｐａｎ−２（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−８０）またはＢｘＰＣ−３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６８７）、大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２２）、ＨＴ２９（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３８）またはＷｉＤｒ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２１８）、肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ１２８（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１２０）またはＮＣＩ−Ｈ６９（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１１９）、乳癌細胞株ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−２２）または子宮癌細胞株ＭＣＡＳ（ＪＣＲＢ ０２４０）などがあげられる。
遺伝子組換え技術により得られた細胞としては、具体的には、該ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを昆虫細胞または動物細胞などに導入することにより得られる、該ポリペプチドが発現した細胞などがあげられ、具体的には、実施例４の（１）に記載のＰＥＲＰ遺伝子発現プラスミドｐｃＰＥＲＰｍＨを導入し、該ポリペプチドが発現した細胞などがあげられる。
本発明のＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体としては、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体があげられるが、好ましくはモノクローナル抗体が用いられる。
モノクローナル抗体としては、ハイブリドーマにより生産される抗体、および抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により生産される遺伝子組換え抗体をあげることができる。
ハイブリドーマは、例えば上記のＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが発現した細胞などを抗原として調製し、該抗原を免疫した動物より抗原特異性をもつ抗体生産細胞を誘導し、さらに、それと骨髄腫細胞とを融合させて調製することができる。該ハイブリドーマを培養するか、あるいは該ハイブリドーマ細胞を動物に投与して該動物を腹水癌化させ、該培養液または腹水を分離、精製することにより抗ＰＥＲＰ抗体を取得することができる。
抗原を免疫する動物としてはハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができるが、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなどが好適に用いられる。またこのような動物から抗体産生能を有する細胞を取得し、該細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫を施した後に、骨髄腫細胞と融合して作製したハイブリドーマが生産する抗体なども本発明の抗体に包含される。
本発明のモノクローナル抗体の具体例としては、ハイブリドーマＫＭ３４１１が生産するマウス抗体ＫＭ３４１１があげられる。ハイブリドーマＫＭ３４１１は平成１６年２月２４日付でブダペスト条約に基づき独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭ ＢＰ−８６４３として寄託されている。
遺伝子組換え抗体としては、ヒト化抗体、ヒト抗体または抗体断片など、遺伝子組換えにより製造される抗体を包含する。遺伝子組換え抗体において、モノクローナル抗体の特徴を有し、抗原性が低く、血中半減期が延長されたものは、治療薬として好ましい。
本発明におけるヒト化抗体は、ヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体を包含する。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体の重鎖可変領域（以下、ＶＨと表記する）および軽鎖可変領域（以下、ＶＬと表記する）とヒト抗体の重鎖定常領域（以下、ＣＨと表記する）および軽鎖定常領域（以下、ＣＬと表記する）とからなる抗体をいう。
本発明のヒト型キメラ抗体は、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
本発明のヒト型キメラ抗体としては、それぞれ配列番号１５、１６、１７で示されるアミノ酸配列からなる抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および／またはそれぞれ配列番号１８、１９、２０で示されるアミノ酸配列からなる抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む、ヒト型キメラ抗体があげられ、具体的には、抗体のＶＨが配列番号１２で示されるアミノ酸配列の１９〜１３０番目のアミノ酸配列および／または抗体のＶＬが配列番号１４で示されるアミノ酸配列の２３〜１２８番目のアミノ酸配列を含む、ヒト型キメラ抗体などがあげられる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨおよびＶＬの適切な位置に移植した抗体をいう。
本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するヒト以外の動物のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから産生されるヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を、任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列は、ヒト抗体由来のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列であれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列、またはＳｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）などに記載の、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列などが用いられる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにｈＩｇＧクラスに属するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３、ｈＩｇＧ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体としては、それぞれ配列番号１５、１６、１７で示されるアミノ酸配列からなる抗体ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３および／またはそれぞれ配列番号１８、１９、２０で示されるアミノ酸配列からなるＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体または該抗体断片などがあげられ、具体的には、抗体のＶＨが配列番号２５で示されるアミノ酸配列、または配列番号２５で示されるアミノ酸配列のうち、２７番目のＧｌｙ、３０番目のＳｅｒ、４１番目のＰｒｏ、４４番目のＬｙｓ、４５番目のＧｌｙ、７２番目のＶａｌ、および９７番目のＡｌａから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列および／または抗体のＶＬが配列番号２６で示されるアミノ酸配列、または配列番号２６で示されるアミノ酸配列のうち、３番目のＧｌｎ、５番目のＴｈｒ、３５番目のＴｙｒ、４２番目のＡｌａ、４６番目のＬｅｕ、７０番目のＰｈｅ、および７７番目のＬｅｕから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を含む、ヒト型ＣＤＲ移植抗体などがあげられる。
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体なども含まれる。
ヒト体内に天然に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルスなどを感染させ不死化し、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養上清中より該抗体を精製することができる。
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、ｓｃＦｖなどの抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を表面に発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、さらに、遺伝子工学的手法により２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物を意味する。具体的には、例えば、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞をマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニックマウスを作製することができる。ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体産生ハイブリドーマを取得し、培養することで培養上清中にヒト抗体を産生蓄積させることができる。
本発明の抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖおよびＣＤＲを含むペプチドなどがあげられる。
Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦａｂは、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧのヒンジ領域の２個のジスルフィド結合の下部を酵素ペプシンで分解して得られた、２つのＦａｂ領域がヒンジ部分で結合して構成された、分子量約１０万の抗原結合活性を有するフラグメントである。
本発明のＦ（ａｂ’）２は、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させ、作製することができる。
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦａｂ’は、本発明のＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するＦ（ａｂ’）２を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと表記する）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のｓｃＦｖは、本発明のＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。
本発明のｄｉａｂｏｄｙは、本発明のＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡをＰのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるように構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法〔Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４）］に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
本発明のｄｓＦｖは、本発明のＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
本発明のＣＤＲを含むペプチドは、本発明のＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合するモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。
また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法によって製造することもできる。
本発明は、本発明のＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体または抗体断片に放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質などを化学的あるいは遺伝子工学的に結合させた抗体の誘導体を包含する。
本発明の抗体の誘導体は、本発明のＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を認識する抗体または抗体断片のＨ鎖あるいはＬ鎖のＮ末端側あるいはＣ末端側、抗体またはその抗体断片中の適当な置換基あるいは側鎖、さらには抗体または抗体断片中の糖鎖などに放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質などを化学的手法［抗体工学入門、金光修著、地人書館（１９９４）］により結合させることにより製造することができる。
また、本発明のＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体または抗体断片をコードするＤＮＡと、結合させたい蛋白質をコードするＤＮＡを連結させて発現用ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入し、発現させることにより製造することができる。
放射性同位元素としては、１３１Ｉ、１２５Ｉなどがあげられ、例えば、クロラミンＴ法などにより抗体に結合させることができる。
低分子の薬剤としては、ナイトロジェン・マスタード、サイクロフォスファミドなどのアルキル化剤、５−フルオロウラシル、メソトレキセートなどの代謝拮抗剤、ダウノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、ダウノルビシン、ドキソルビシンなどの抗生物質、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンのような植物アルカロイド、タモキシフェン、デキサメタソンなどのホルモン剤などの抗癌剤［臨床腫瘍学、日本臨床腫瘍研究会編、癌と化学療法社（１９９６）］またはハイドロコーチゾン、プレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリン、インドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレート、ペニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスファミド、アザチオプリンなどの免疫抑制剤、マレイン酸クロルフェニラミン、クレマシチンのような抗ヒスタミン剤などの抗炎症剤［炎症と抗炎症療法、医歯薬出版株式会社（１９８２）］などがあげられる。例えば、ダウノマイシンと抗体を結合させる方法としては、グルタールアルデヒドを介してダウノマイシンと抗体のアミノ基間を結合させる方法、水溶性カルボジイミドを介してダウノマイシンのアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法などがあげられる。
高分子の薬剤としては、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと表記する）、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどがあげられる。これらの高分子化合物を抗体または抗体断片に結合させることにより、（１）化学的、物理的あるいは生物的な種々の因子に対する安定性の向上、（２）血中半減期の顕著な延長、（３）免疫原性の消失、抗体産生の抑制、などの効果が期待される［バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店（１９９３）］。例えば、ＰＥＧと抗体を結合させる方法としては、ＰＥＧ化修飾試薬と反応させる方法などがあげられる［バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店（１９９３）］。ＰＥＧ化修飾試薬としては、リジンのε−アミノ基の修飾剤（特開昭６１−１７８９２６）、アスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシル基の修飾剤（特開昭５６−２３５８７）、アルギニンのグアニジノ基の修飾剤（特開平２−１１７９２０）などがあげられる。
蛋白質としては、免疫担当細胞を活性化するサイトカイン、例えば、ヒトインターロイキン２、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ヒトマクロファージコロニー刺激因子、ヒトインター・ロイキン１２などがあげられる。また、癌細胞を直接傷害する活性を有するリシンやジフテリア毒素などの毒素を用いることができる。例えば、蛋白質との融合抗体ついては、抗体または抗体断片をコードするｃＤＮＡに蛋白質をコードするｃＤＮＡを連結させ、融合抗体をコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物あるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、融合抗体を製造することができる。
融合抗体を検出方法、定量方法、検出試薬、定量試薬または診断薬として使用する場合の薬剤としては、通常の免疫学的検出または測定法で用いられる標識体があげられる。標識体としては、アルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼなどの酵素、アクリジニウムエステル、ロフィンなどの発光物質、フルオレシン・イソチアネート（ＦＩＴＣ）、ＲＩＴＣなどの蛍光物質などがあげられる。
以下に、本発明の抗体の製造方法について、具体的に説明する。
１．ハイブリドーマが産生する抗ＰＥＲＰモノクローナル抗体の作製
（１）抗原の調製
本発明において用いられるポリペプチドは、［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９８７−１９９７）］などに記載された方法などを用い、例えば以下の方法により、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
まず、該ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含む完全長ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。この際もし必要であれば、完全長ｃＤＮＡをもとにしてポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製し、上記完全長ｃＤＮＡの代わりに該ＤＮＡ断片を使用してもよい。次いで、該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、ポリペプチドを生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、大腸菌、動物細胞など、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれをも用いることができる。
発現ベクターとしては、使用する宿主細胞において自律複製または染色体中への組込が可能で、ポリペプチドをコードするＤＮＡを転写できる位置に適当なプロモーターを含有しているものが用いられる。
大腸菌などの原核生物を宿主細胞として用いる場合には、該組換えベクターは、原核生物中で自律複製が可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明において用いられるＤＮＡおよび転写終結配列を含むベクターであることが好ましい。該組換えベクターは、さらに、プロモーターを制御する遺伝子を含んでいてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴｒｓ３０［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０７）より調製］、ｐＴｒｓ３２［大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４０８）より調製］、ｐＧＨＡ２［大腸菌ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４００）より調製、特開昭６０−２２１０９１］、ｐＧＫＡ２［大腸菌 ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ ＢＰ−６７９８）より調製、特開昭６０−２２１０９１］、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）］、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３などをあげることができる。
プロモーターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーターなどの、大腸菌やファージなどに由来するプロモーターなどをあげることができる。また、Ｐｔｒｐを２つ直列させたタンデムプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターも用いることができる。
また、上記組換えベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン・ダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。本発明において用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列においては、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することができ、これにより、目的とするポリペプチドの生産率を向上させることができる。さらに、上記組換えベクターにおける遺伝子の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
このような宿主細胞として用いられる原核生物としては、例えば、エシェリヒア属などに属する原核生物を用いることができ、具体的には大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、大腸菌ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、大腸菌ＤＨ１、大腸菌ＭＣ１０００、大腸菌ＫＹ３２７６、大腸菌Ｗ１４８５、大腸菌ＪＭ１０９、大腸菌ＨＢ１０１、大腸菌Ｎｏ．４９、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌ＮＹ４９などが用いることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）］に記載の方法などをあげることができる。
本発明において用いられるポリペプチドを大腸菌で生産した場合には、ベクターの種類により該ポリペプチドは、細胞質内に可溶型として、細胞質内に不溶性顆粒としてまたはペリプラズミックスペースに可溶型としてなどの発現様式で発現させることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９７９；Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３，（１９９０）］、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８［Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０，（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３などをあげることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーターなどをあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７細胞（特開昭６３−２９９）などをあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］などをあげることができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）］に記載されている方法などに準じて、分泌生産、融合蛋白質発現などを行うことができる。真核生物由来の細胞で発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加されたポリペプチドを得ることができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に該ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、本発明において用いられるポリペプチドを製造することができる。該形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドなどを、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸などを培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３，１（１９５０）］またはこれら培地に牛胎児血清などを添加した培地などを用いることができる。培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下などの条件下で１〜７日間行う。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、本発明において用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換えベクターを保有する微生物、動物細胞など由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養して該ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物より採取することにより、本発明において用いられるポリペプチドを製造することができる。
ポリペプチドの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、および宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞から、適切な方法を選択することができる。また、任意の蛋白質と蛋白質工学的に融合させて融合ポリペプチドとして発現させて生産させてもよい。
ポリペプチドが宿主細胞内または宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）、特開平０５−３３６９６３またはＷＯ９４／２３０２１］などに記載の方法を準用することにより、該遺伝子産物を宿主細胞外に積極的に分泌させることもできる。また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などを用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
ポリペプチドは、例えば、以下のようにして、上記の培養物などから単離・精製することができる。
ポリペプチドが細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミルなどにより細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安などによる塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ−７５（三菱化学社製）などのレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）などのレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロースなどのレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動などの電気泳動法などの手法を単独または組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
また、ポリペプチドが細胞質内に不溶性顆粒を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として該ポリペプチドの不溶性顆粒を回収する。回収した該蛋白質の不溶性顆粒を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析することにより、該蛋白質を正常な立体構造にまき戻した後、上記と同様の単離精製法によりポリペプチドの精製標品を得ることができる。
ポリペプチドまたはその糖修飾体などの誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ポリペプチドまたはその糖修飾体などの誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離などの手法により処理することにより、固形物を取り除いた培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
また、本発明において用いられるポリペプチドまたは該ポリペプチドの部分ペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法によっても製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ社、パーキン・エルマー社、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ社、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社、島津製作所などのペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
上記の方法により得られるポリペプチドまたは該ポリペプチドの部分配列を有するペプチドを抗原として用いることができる。
（２）動物の免疫と抗体産生細胞の調製
３〜２０週令のマウス、ラットまたはハムスターなどに上記のように調製した抗原を免疫して、その動物の脾臓、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。
免疫は、動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバント〔例えば、フロインドの完全アジュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ）や水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とともに抗原を投与することにより行う。抗原が部分ペプチドである場合には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）やＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）などのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。
抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに５〜１０回行う。各投与後３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清が抗原と反応することを酵素免疫測定法〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）〕などで調べる。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示したマウス、ラットまたはハムスターを抗体産生細胞の供給源として用いる。
ポリクローナル抗体は、該血清を分離、精製することにより調製することができる。該ポリクローナル抗体が、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する活性を有していることは、後述（６）に記載の方法で調べることができる。
抗体産生細胞と骨髄腫細胞の融合に供するにあたって、抗原の最終投与後３〜７日目に、免疫したマウス、ラットまたはハムスターより脾臓などの抗体産生細胞を含む組織を摘出し、抗体産生細胞を採取する。脾臓細胞を用いる場合には、脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し赤血球を除去し、ＭＥＭ培地で３回洗浄して融合用抗体産生細胞として提供する。
（３）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃマウス由来）骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）［Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１８，１（１９７８）］、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４１（ＮＳ−１）［Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６，５１１（１９７６）］、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）［Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９（１９７８）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２３，１５４８（１９７９）］、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）［Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５）］などが用いられる。これらの細胞株は、８−アザグアニン培地［ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、２−メルカプトエタノール（５×１０−５ｍｏｌ／Ｌ）、ジェンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）および牛胎児血清（ＦＣＳ）を加えた培地（以下、正常培地という。）に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍｌ）を加えた培地〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地に継代し、融合当日２×１０７個以上の細胞数を確保する。
（４）細胞融合
前述した抗体産生細胞と骨髄腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳ（リン酸二ナトリウム１．８３ｇ、リン酸−カリウム０．２１ｇ、食塩７．６５ｇ、蒸留水１リットル、ｐＨ７．２）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう混合し、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングライコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）２ｇ、ＭＥＭ ２ｍＬおよびジメチルスルホキシド０．７ｍＬの混液の０．２〜１ｍＬを、１×１０８個の抗体産生細胞に加え、１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍＬを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにする。遠心分離（９００ｒｐｍ、５分間）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかに細胞をＨＡＴ培地［正常培地にヒポキサンチン（１０−４ｍｏｌ／Ｌ）、チミジン（１．５×１０−５ｍｏｌ／Ｌ）およびアミノプテリン（４×１０−７ｍｏｌ／Ｌ）を加えた培地〕１００ｍＬ中に懸濁する。この懸濁液を９６ウェル培養用プレートに１００μＬ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で７〜１４日間培養する。
培養後、培養上清の一部をとり後述するハイブリドーマの選択方法により、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体を生産するハイブリドーマを含むウェルを選択する。ついで、限界希釈法によりクローニングを２回繰り返し〔１回目は、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）、２回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
（５）モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理〔２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育する〕した８〜１０週令のマウスまたはヌードマウスに、（４）で得られた抗ＰＥＲＰモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞２×１０６〜５×１０７細胞／匹を腹腔内注射する。１０〜２１日でハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分間）して固形分を除去後、４０〜５０％硫酸アンモニウムで塩析した後、カプリル酸沈殿法、ＤＥＡＥ−セファロースカラム、プロテインＡ−カラムあるいはゲル濾過カラムによる精製を行ない、ＩｇＧあるいは、ＩｇＭ画分を集め、精製モノクローナル抗体とする。
抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法により行う。蛋白量の定量は、ローリー法および２８０ｎｍでの吸光度より算出する。
（６）ハイブリドーマの選択方法
本発明のＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体を生産するハイブリドーマを選択する方法としては、以下の方法があげられる。
天然型の立体構造を保っているＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域に結合できる性質の抗体を選択するには、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドがヒト体内に天然に存在する細胞、ヒト体内から樹立された細胞株または遺伝子組換え技術により得られた細胞に対する結合性を調べることができる方法であればいずれでもよく、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社）を用いる蛍光抗体染色法やフローサイトメトリーを用いる蛍光細胞染色法などの方法があげられる。具体的な方法としては、実施例４の（３）または実施例５の（２）に記載の方法などがあげられる。
また、これらの反応性を確認するための方法は、公知の免疫学的測定法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）］、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などを組み合わせることもできる。
ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが発現している、ヒト体内に存在する細胞、ヒト体内から樹立した細胞株、およびＰＥＲＰ遺伝子が導入された遺伝子組換え細胞としては、前述した細胞があげられるが、遺伝子組換え技術により、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドを発現させた細胞を用いるのが好ましい。また、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドを発現させた細胞を陽性対照とし、宿主細胞を陰性対照として用いることができるので、モノクローナル抗体の選択に用いる細胞を容易に調製することができる。
前述の方法で選択される、本発明のＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を認識するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマの具体例としては、モノクローナル抗体ＫＭ３４１１を生産するハイブリドーマ細胞株ＫＭ３４１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−８６４３）などがあげられる。
２．遺伝子組換え抗体の作製
遺伝子組換え抗体の作製例として、以下にヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体などのヒト化抗体の作製方法を示す。
（１） ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡをそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体のＣ領域は任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬであることができ、例えば、ヒト抗体のγ１サブクラスのＣＨおよびκクラスのＣＬなどがあげられる。ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡとしてはエキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることも、ｃＤＮＡを用いることもできるが、ｃＤＮＡを用いるのが好ましい。動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３，１３３（１９９０）〕、ｐＡＧＥ１０３（〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）、ｐＨＳＧ２７４〔Ｇｅｎｅ，２７，２２３（１９８４）〕、ｐＫＣＲ〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８，１５２７（１９８１）〕、ｐｓＧ１ｂｄ２−４〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４，１７３（１９９０）〕、ｐＳＥ１ＵＫ１Ｓｅｄ１−３〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１３，７９（１９９３）〕などがあげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーター〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）〕、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４９，９６０（１９８７）〕、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター〔Ｃｅｌｌ，４１，４７９（１９８５）〕とエンハンサー〔Ｃｅｌｌ，３３，７１７（１９８３）〕などがあげられる。
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点からタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１（１９９４）〕。タンデム型のヒト化抗体発現用ベクターとしては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ９７／１０３５４）、ｐＥＥ１８〔Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１７，５５９（１９９８）〕などがあげられる。
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
（２）ヒト以外の動物由来の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得およびアミノ酸配列の解析
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡは以下の様にして取得することができる。
マウス抗体などを産生するハイブリドーマ細胞よりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージ或いはプラスミドなどのベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、マウス抗体のＣ領域部分或いはＶ領域部分をコードするＤＮＡをプローブとして用い、ＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のＶＨまたはＶＬの全塩基配列をそれぞれ決定し、塩基配列よりＶＨまたはＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定する。
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなどのハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３（１９８７）］、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）］等があげられる。また、ハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製するキットとしては、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ Ｐｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等があげられる。
ｃＤＮＡの合成及びｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｓｕｐ ｐｌｅｍｅｎｔ １−３４］、或いは市販のキット、例えば、Ｓｕｐｅｒ ＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）やＺＡＰ−ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いる方法等があげられる。
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ［Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８（１９９２）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４（１９８９）］、λＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１［ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉ，４９（１９８５）］、Ｌａｍｂｄａ ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３ １８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２［Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３，２８０（１９８３）］及びｐＵＣ１８［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］等が用いられる。
ファージ或いはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現及び維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’［Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，８１（１９９２）］、Ｃ６００［Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０（１９５４）］、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）］、ＮＭ５２２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，１（１９８３）］、Ｋ８０２［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，１１８（１９６６）］及びＪＭ１０５［Ｇｅｎｅ，３８，２７５（１９８５）］等が用いられる。
ｃＤＮＡライブラリーからのヒト以外の動物の抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法或いはプラーク・ハイブリダイゼーション法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）］により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ或いはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ［以下、ＰＣＲ法と表記する；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ１−３４］によりＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
上記方法により選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素等で切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ， Ｆ．）らのジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、Ａ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシークエンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等を用いて解析することで該ｃＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列からＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列をそれぞれ推定し、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかをそれぞれ確認することができる。分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することにより、分泌シグナル配列の長さ及びＮ末端アミノ酸配列を推定でき、更にはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、ＶＨ及びＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較することによって見出すことができる。
更にＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列を用いて任意のデータベース、例えば、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴやＰＩＲ−Ｐｒｏｔｅｉｎ等に対してＢＬＡＳＴ法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］等の配列の相同性検索を行い、配列の新規性を検討することができる。
（３）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
本項２の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、それぞれヒト以外の動物の抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の動物の抗体のＶＨまたはＶＬをコードするそれぞれのｃＤＮＡを、ヒト以外の動物の抗体のＶＨまたはＶＬの３’末端側の塩基配列とヒト抗体のＣＨまたはＣＬの５’末端側の塩基配列とから成り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡとそれぞれ連結し、それぞれを本項２の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現する様にそれぞれクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。また、ヒト以外の動物の抗体ＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡを、適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ法によりそれぞれ増幅し、それぞれを本項２の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターにクローニングすることもできる。
（４）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下の様にして構築することができる。まず、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨまたはＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のＶＨまたはＶＬのフレームワーク領域（以下、ＦＲと表記する）のアミノ酸配列をそれぞれ選択する。ヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ等のデータベースに登録されているヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］等があげられるが、その中でも、十分な活性を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体を作製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）をそれぞれ有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。次に、選択したヒト抗体のＶＨまたはＶＬのＦＲのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨまたはＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をそれぞれ移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をそれぞれ設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］を考慮してＤＮＡ配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をそれぞれ設計する。設計したＤＮＡ配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行う。この場合、ＰＣＲでの反応効率及び合成可能なＤＮＡの長さから、Ｈ鎖、Ｌ鎖とも６本の合成ＤＮＡを設計することが好ましい。
また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項２の（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングすることができる。ＰＣＲ反応後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにそれぞれクローニングし、本項２の（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドを取得する。
（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元のヒト以外の動物の抗体に比べて低下してしまうことが知られている［ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９，２６６（１９９１）］。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体のＶＨ及びＶＬでは、ＣＤＲのみならず、ＦＲのいくつかのアミノ酸残基が直接的或いは間接的に抗原結合活性に関与しており、それらアミノ酸残基がＣＤＲの移植に伴い、ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲの異なるアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられている。この問題を解決するため、ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基やＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用したり、抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらを元のヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている［ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９，２６６（１９９１）］。ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を如何に効率よく同定するかが、最も重要な点であり、そのためにＸ線結晶解析［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１２，５３５（１９７７）］或いはコンピューターモデリング［Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，１５０１（１９９４）］等による抗体の立体構造の構築及び解析が行われている。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来たが、その一方、あらゆる抗体に適応可能なヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製法は未だ確立されておらず、現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討する等の種々の試行錯誤が必要である。
ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸残基の改変は、改変用合成ＤＮＡを用いて本項２の（４）に記載のＰＣＲ法を行うことにより、達成できる。ＰＣＲ後の増幅産物について本項２の（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
本項２の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流に、構築したヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨまたはＶＬをコードするｃＤＮＡをそれぞれクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。
例えば、本項２の（４）及び（５）でヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨまたはＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項２の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨまたはＣＬをコードするそれぞれの遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにそれぞれクローニングすることができる。
（７）ヒト化抗体の一過性発現
作製した多種類のヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価するために、本項２の（３）及び（６）に記載のヒト化抗体発現ベクター、或いはそれらを改変した発現ベクターを用いてヒト化抗体の一過性発現を行うことができる。発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、その発現量の高さから、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）が一般に用いられる［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ，２８３（１９９１）］。ＣＯＳ−７細胞への発現ベクターの導入法としては、ＤＥＡＥ−デキストラン法［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ，２８３（１９９１）］、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］等があげられる。
発現ベクターの導入後、培養上清中のヒト化抗体の発現量及び抗原結合活性は酵素免疫抗体法［以下、ＥＬＩＳＡ法と表記する；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］等により測定できる。
（８）ヒト化抗体の安定発現
本項２の（３）及び（６）に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することによりヒト化抗体を安定に発現する形質転換株を得ることができる。
宿主細胞への発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法［特開平２−２５７８９１、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］等があげられる。
ヒト化抗体発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、ｄｈｆｒと表記する）が欠損したＣＨＯ細胞［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０）］、レクチン耐性を獲得したＬｅｃ１３［Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２，５５（１９８６）］、α１−６フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（ＷＯ０５／３５５８６）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２）などがあげられる。
上記宿主細胞の他、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素などの蛋白質、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素などの蛋白質または細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質などの活性が低下または欠失した宿主細胞、好ましくはＷＯ０５／３５５８６に記載のα１−６フコース転移酵素遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞などを用いることもできる。
発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に発現する形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８硫酸塩（以下、Ｇ４１８と表記する：ＳＩＧＭＡ社製）等の薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０１培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、またはこれら培地に牛胎児血清（以下、ＦＢＳと表記する）等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を発現蓄積させることができる。培養上清中のヒト化抗体の発現量及び抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法等により測定できる。また、形質転換株は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ｄｈｆｒ増幅系等を利用してヒト化抗体の発現量を上昇させることができる。
ヒト化抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖或いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動［以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと表記する：Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１９７０）］やウエスタンブロッティング法［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｌｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］等で測定することができる。
３．本発明の抗体または抗体断片の活性評価
精製した本発明の抗体または抗体断片の抗原との結合活性、ＰＥＲＰ発現細胞株に対する結合活性はＥＬＩＳＡ法および蛍光抗体法［Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３）］またはＢＩＡｃｏｒｅＴＭなどを用いた表面プラズモン共鳴等により測定できる。抗原陽性培養細胞株に対する細胞傷害活性は、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性等を測定し、評価することができる［Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３）］。
４．本発明の抗体を用いた疾患の診断方法
特定の細胞において、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの発現が認められているため、本発明の抗体または抗体断片を用いてＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドまたは該ポリペプチドが発現した細胞を検出または定量することにより、該ポリペプチドが関連する疾患を診断することができる。
ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患としては、該ポリペプチドが発現している細胞が関与する疾患であればいかなるものでもよく、例えば癌があげられる。癌としては、上皮由来の癌があげられ、具体的には、乳癌、子宮癌、大腸癌、胃癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、直腸癌、甲状腺癌、子宮頸癌、小腸癌、前立腺癌または膵臓癌などがあげられる。
本発明においてＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドを検出または測定する対象となる生体試料としては、組織細胞、血液、血漿、血清、膵液、尿、糞便、組織液、培養液など、該ポリペプチドを含む可能性のあるものであれば特に限定されない。
ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが関連する疾患としては、該疾患により発現が変動する疾患があげられ、具体的には、癌があげられる。
癌の診断は、例えば、以下のようにして行うことができる。
複数の健常者の生体から採取した生体試料について、本発明の抗体または該抗体断片、またはこれらの誘導体を用い、下記の免疫学的手法を用いて、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの検出または測定を行い、健常者の生体試料中の該ポリペプチドの存在量を調べておく。被験者の生体試料中についても同様に該ポリペプチドの存在量を調べ、その存在量を健常者の存在量と比較する。被験者の該ポリペプチドの存在量が健常者と比較して増加している場合には、癌が陽性であると診断できる。
本発明の抗体または抗体断片、またはこれらの誘導体を含有する診断薬は、目的の診断法に応じて、抗原抗体反応を行なうための試薬、該反応の検出用試薬を含んでもよい。抗原抗体反応を行なうための試薬としては、緩衝剤、塩などがあげられる。検出用試薬としては、抗体もしくは抗体断片、またはこれらの誘導体、または抗体もしくは抗体断片、またはこれらの誘導体を認識する標識された二次抗体、標識に対応した基質などの通常の免疫学的検出または測定法に用いられる試薬があげられる。
本発明においてＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの量を検出または測定する方法としては、任意の公知の方法があげられる。例えば、免疫学的検出または測定方法などがあげられる。
免疫学的検出または測定法とは、標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体量または抗原量を検出または測定する方法である。免疫学的検出または測定方法としては、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、発光免疫測定法（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ウエスタンブロット法および物理化学的手法（ＴＩＡ，ＬＡＰＩＡ，ＰＣＩＡ）などがあげられる。抗原の検出または測定を行う方法であればいかなる方法でもよいが好ましくは免疫沈降法または蛍光細胞染色法があげられる。
放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）としては、例えば、抗原または抗原を発現した細胞などに、本発明の抗体を反応させ、さらに放射線標識を施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、シンチレーションカウンターなどで測定する方法があげられる。
酵素免疫測定法（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）としては、例えば、抗原または抗原を発現した細胞などに、本発明の抗体を反応させ、さらに標識を施した抗イムノグロブリン抗体または結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する方法があげられ、例えばサンドイッチＥＬＩＳＡ法などが用いられる。酵素免疫測定法で用いる標識体としては、前述のとおり、任意の公知（石川榮次ら編、酵素免疫測定法、医学書院）の酵素標識を用いることができる。例えば、アルカリフォスファターゼ標識、ペルオキシダーゼ標識、ルシフェラーゼ標識、ビオチン標識などを用いることができる。
サンドイッチＥＬＩＳＡ法は、固相に抗体を結合させた後、検出または測定したい抗原をトラップさせ、トラップされた抗原に第２の抗体を反応させる方法である。該ＥＬＩＳＡ法では、検出または測定したい抗原を認識する抗体または抗体断片であって、抗原認識部位の異なる２種類の抗体を準備し、そのうち、一方の抗体または抗体断片を予めプレート（例えば、９６ウェルプレート）に吸着させ、第２の抗体または抗体断片をＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素、ビオチンなどで標識しておく。上記の抗体が吸着したプレートに、生体内から分離された、細胞またはその破砕液、組織またはその破砕液、細胞培養上清、血清、胸水、腹水、眼液などを反応させた後、標識したモノクローナル抗体または抗体断片を反応させ、標識物質に応じた検出反応を行う。免疫学的測定方法により、被験サンプル中の抗原濃度を測定する場合には、濃度既知の抗原を段階的に希釈して作製した検量線より、被験サンプル中の抗原濃度を算出することができる。サンドイッチＥＬＩＳＡ法に用いる抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれを用いてもよく、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２などの抗体フラグメントを用いてもよい。サンドイッチＥＬＩＳＡ法で用いる２種類の抗体の組み合わせとしては、異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体または抗体断片の組み合わせでもよいし、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体または抗体断片の組み合わせでもよい。
蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）としては、文献［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などに記載された方法があげられる。蛍光免疫測定法で用いる標識体としては、前述のとおり、任意の公知（川生明著、蛍光抗体法、ソフトサイエンス社）の蛍光標識を用いることができる。例えば、ＦＩＴＣ標識、ＲＩＴＣ標識などを用いることができる。
発光免疫測定法（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）で用いる標識体としては、前述のとおり、任意の公知［今井一洋編、生物発光と化学発光、廣川書店；臨床検査４２（１９９８）］の発光体標識があげられる。例えば、アクリジニウムエステル標識、ロフィン標識などを用いることができる。
ウエスタンブロット法は、抗原または抗原を発現した細胞などをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂａｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）］で分画した後、該ゲルをＰＶＤＦ膜またはニトロセルロース膜にブロッティングし、該膜に抗原を認識する抗体または抗体断片を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光物質、ペルオキシダーゼなどの酵素標識、ビオチン標識などを施した抗マウスＩｇＧ抗体または結合断片を反応させた後、該標識を可視化することによって確認する方法である。ウエスタンブロット法の一例を以下に示す。
配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現している細胞や組織を溶解し、還元条件下でレーンあたりのタンパク量として０．１〜３０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により泳動する。泳動されたタンパク質をＰＶＤＦ膜にトランスファーし１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳと表記する）に室温で３０分間反応させブロッキング操作を行う。ここで本発明のモノクローナル抗体を反応させ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと表記する）で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗マウスＩｇＧを室温で２時間反応させる。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄し、ＥＣＬＴＭＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）などを用いてモノクローナル抗体が結合したバンドを検出することにより、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを検出することができる。ウェスタンブロッティングでの検出に用いられる抗体としては、天然型の立体構造を保持していないポリペプチドに結合できる抗体が用いられる。具体的には、本発明の実施例４の（２）に記載のモノクローナル抗体ＫＭ３３１４あるいは市販抗ＰＥＲＰポリクローナル抗体（ＰｒｏＳｃｉ社製、製品番号２４５１、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製、製品番号ＮＢ５００−２３１）などが用いられる。
物理化学的手法とは、具体的には、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドと特異的に結合する本発明の抗体を用いて、抗原であるＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドと本発明の抗体とを結合させることにより凝集体を形成させて、この凝集体を検出することにより行う。この他に物理化学的手法としては、毛細管法、一次元免疫拡散法、免疫比濁法あるいはラテックス免疫比濁法等があげられる［臨床検査法提要、金原出版，４９９（１９９８）］。
例えば、ラテックス免疫比濁法では、抗体または抗原を感作させた粒径０．１〜１μｍ程度のポリスチレンラテックス等の担体を用い、対応する抗原あるいは抗体により抗原抗体反応を起こさせると、反応液中の散乱光は増加し、透過光は減少する。この変化を吸光度あるいは積分球濁度として検出することにより被験サンプル中の抗原濃度などを測定することができる。
本発明の抗体は、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合できるため、該ポリペプチドが発現している細胞の検出に好適に用いられる。
該ポリペプチドが発現している細胞の検出には、公知の免疫学的検出法を用いることができるが、免疫沈降法、蛍光細胞染色法、免疫組織染色法、および免疫組織染色法などが、好ましく用いられる。また、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社）を用いる蛍光抗体染色法なども用いることができる。
免疫沈降法とは、該ポリペプチドを発現した細胞などを本発明のモノクローナル抗体または抗体断片と反応させた後、プロテインＧ−セファロースなどのイムノグロブリンに特異的な結合能を有する担体を加えて抗原抗体複合体を沈降させる方法である。あるいは以下のような方法によっても行なうことができる。
ＥＬＩＳＡ用９６ウエルプレートに上述した本発明の抗体を固相化した後、ＢＳＡ−ＰＢＳによりブロッキングする。抗体が精製されていない状態の例えばハイブリドーマ株培養上清などの精製されていない状態である場合には、抗マウスイムノグロブリンあるいはラットイムノグロブリンまたはプロテインＡあるいはＧなどをあらかじめＥＬＩＳＡ用９６ウエルプレートに固相化しＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングした後、ハイブリドーマ株培養上清を分注して結合させる。ＢＳＡ−ＰＢＳを捨てＰＢＳでよく洗浄した後、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現している細胞や組織の溶解液を反応させる。よく洗浄した後のプレートより免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファーで抽出し、上記のウェスタンブロッティングにより検出を行う。
免疫細胞染色法および免疫組織染色法とは抗原を発現した細胞または組織などを、場合によっては抗体の通過性を良くするため界面活性剤やメタノールなどで処理した後、本発明の抗体を反応させ、さらにＦＩＴＣなどの蛍光標識、ペルオキシダーゼなどの酵素標識、ビオチン標識などを施した抗イムノグロブリン抗体または抗体断片を反応させた後、該標識を可視化し、顕微鏡にて顕鏡するか、あるいは蛍光標識の抗体と細胞を反応させ、フローサイトメーターにて解析する蛍光抗体染色法（フローサイトメトリー）である。例えば、文献［Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）、単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック（１９８７）］などに記載された方法を用いて行うことができる。特に、本発明の抗体は、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合できるため、フローサイトメトリーにより、天然の立体構造を保持しているＰＥＲＰタンパク質を、発現している細胞の検出に好ましくは用いられる。
また、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社）を用いる蛍光抗体染色法とは、形成された抗体−抗原複合体と、抗体−抗原複合体の形成に関与していない遊離の抗体または抗原とを分離することなく、抗原量または抗体量を測定することができる、ホモジニアスなアッセイ方法であり、具体的には、実施例４の（３）−３に記載の方法などがあげられる。
５．本発明の抗体を用いた疾患の治療方法
本発明のＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体または該抗体断片は、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の治療に用いることができる。
ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患としては、該ポリペプチドが発現している細胞が関与する疾患であればいかなるものでもよく、例えば癌があげられる。癌としては、上皮由来の癌があげられ、具体的には、乳癌、子宮癌、大腸癌、胃癌、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、直腸癌、甲状腺癌、子宮頸癌、小腸癌、前立腺癌または膵臓癌などがあげられる。
ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドに対する抗体を用いた癌の治療剤には、該抗体を用いてＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの活性を制御することを特徴とする癌の治療剤、およびＡＤＣＣ活性やＣＤＣ活性、あるいはアポトーシス誘導作用による癌の治療剤が含まれる。
抗体の有するＡＤＣＣ活性やＣＤＣ活性は、例えば、特開平６−２０５６９４に記載の方法で測定することができる。このような活性を有する抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、特定の抗原が発現した細胞を傷害することができるため、疾患の治療薬として用いることができる。ヒトＩｇＧクラスの抗体定常領域を有するヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体などのヒト化抗体およびヒト抗体は治療剤として、有効に用いられる［Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５６，１１１８（１９９６）］。
本発明の抗体は、変性を受けていない天然型のＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドを認識することができるので、生体内で存在するＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが発現している細胞を認識することができる。従って、該抗体の可変領域のＣＤＲを含むヒトＩｇＧクラスの抗体定常領域を有するヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体などのヒト化抗体およびヒト抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが発現している細胞を傷害することができる。ＰＥＲＰ遺伝子は癌において発現が亢進していることから、本発明の抗体または抗体断片は癌の治療剤として使用することができる。また、高いＡＤＣＣ活性が付与された本発明の抗体は、該抗体が発現している細胞を減ずる治療に用いられる治療剤として、特に有効に用いられる。
本発明の抗体または抗体断片、またはこれらの誘導体を含有する治療剤は、有効成分としての該抗体もしくは抗体断片、またはこれらの誘導体のみを含むものであってもよいが、通常は薬理学的に許容される１以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与をあげることができ、抗体またはペプチド製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤などがあげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などがあげられる。乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体などを用いて調製される。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該抗体または抗体断片自体、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該化合物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体などを用いて調製される。担体として具体的には乳糖、グリセリンなどが例示される。該抗体および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重などにより異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇである。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
各種細胞株、ゼノグラフト、正常組織におけるＰＥＲＰ遺伝子の発現解析
（１）各種ゼノグラフトの作製と腫瘍塊の調製
ヒト膵臓癌細胞株［ＡＳＰＣ−１株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１４６９）、Ｃａｐａｎ−１株（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−７９）、ＭｉａＰａｃａ株（国立癌センターより分与）］および３種のヒト膵臓癌患者の腫瘍組織由来の細胞［ＰＣ０１、ＰＣ０２、ＰＣ０３］を移植したゼノグラフトは以下のようにして作製した。
１０％の非働化ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）中で継代培養した各細胞株を用いて、それぞれ１×１０８個／ｍｌの細胞密度になるようにＰＢＳで細胞懸濁液を調製した。Ｆｏｘ ＣＨＡＳＥ Ｃ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄＪｃｌマウス（雄、５週齢、日本クレア社製）の腹側部皮下に、１尾あたり該懸濁液を１００μＬ移植した。移植した細胞株あるいは細胞の生着が認められたマウスの腫瘍径を、ノギスを用いて経日的に測定し、腫瘍の長径が１ｃｍ程度に到達した個体を麻酔下で脱血死せしめた後に各腫瘍塊を摘出した。各腫瘍塊は、それぞれを４つに切り分けた後、液体窒素を用いて急速凍結した。
ヒト膵臓癌細胞株のＰＡＮＣ−１株とＰＳＮ−１株を移植したゼノグラフトは以下のようにして作製した。
５％の非働化ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）中で継代培養した各細胞株を用いて、それぞれ８×１０７〜１×１０８個／ｍＬの細胞密度になるように血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地で細胞懸濁液を調製した。ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕマウス（雄、８週齢、日本クレア）の腹側部皮下に１尾あたり該懸濁液を１００μＬ移植した。移植した細胞株の生着が認められたマウスの腫瘍径を、ノギスを用いて経日的に測定し、腫瘍の長径が１ｃｍ程度に到達した個体を頚椎脱臼で屠殺した後に各腫瘍塊を摘出した。各腫瘍塊は、それぞれを４つに切り分けた後、液体窒素を用いて急速凍結した。
ヒト大腸癌細胞株のＨＴ−２９株（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３８）とＷｉＤｒ株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２１８）を移植したゼノグラフトは以下のようにして作製した。
１０％非働化ウシ血清を含むＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ培地（インビトロジェン社製）中で継代培養したＨＴ−２９細胞株、または１０％非働化ウシ血清を含むＭＥＭ培地（インビトロジェン社製）中で継代培養したＷｉＤｒ細胞株を用いて、それぞれ１×１０７個／ｍＬの細胞密度になるように血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地で細胞懸濁液を調製した。ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕマウス（雄、８週齢、日本クレア）の腹側部皮下に該懸濁液を１００μＬ移植した。移植した細胞株が生着したマウスの腫瘍径を、ノギスを用いて経日的に測定し、腫瘍の長径が１ｃｍ程度に到達した個体を頚椎脱臼で屠殺した後に各腫瘍塊を摘出した。各腫瘍塊は、それぞれを４つに切り分けた後、液体窒素を用いて急速凍結した。
ヒト大腸癌細胞株のＣｏｌｏ２０５株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２２）、ＬＳ１７４Ｔ株（ＡＴＣＣ ＣＬ−１８８）、ＬＳ１８０株（ＡＴＣＣ ＣＬ−１８７）、ＳＷ１１１６株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２３３）を移植したゼノグラフトは以下のようにして作製した。
各細胞株を１０％の非働化ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）で継代培養し、それぞれ１×１０８個／ｍＬの細胞密度になるようにＰＢＳで細胞懸濁液を調製した。Ｆｏｘ ＣＨＡＳＥ Ｃ．Ｂ−１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄＪｃｌマウス（雄、５週齢、日本クレア社製）の腹側部皮下に該懸濁液を１００μＬ移植した。このようにして作製されたゼノグラフトから摘出された腫瘍塊を同系のマウスの腹側部皮下に移植し、移植した腫瘍塊が生着したマウスの腫瘍径を、ノギスを用いて経日的に測定し、腫瘍の長径が１ｃｍ程度に到達した個体を麻酔下で脱血死せしめた後に各腫瘍塊を摘出した。各腫瘍塊は、それぞれを４つに切り分けた後、液体窒素を用いて急速凍結した。
（２）全ＲＮＡの抽出とポリＡ（＋）ＲＮＡの精製
細胞株、患者組織ならびに上記（１）で作製したゼノグラフトより、以下に示した方法により細胞懸濁液を調製した後、全ＲＮＡを抽出し、ポリＡ（＋）ＲＮＡを精製した。
５種類の膵臓癌由来細胞株［ＡＳＰＣ−１株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１４６９）、ＢｘＰＣ−３株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６８７）、Ｃａｐａｎ−１株（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−７９）、ＭｉａＰａｃａ株（国立癌センターより分与）、ＰＳＮ−１株］、８種類の大腸癌細胞株［Ｃｏｌｏ２０５株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２２）、ＨＴ−２９株（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３８）、ＬＳ１７４Ｔ株（ＡＴＣＣ ＣＬ−１８８）、ＬＳ１８０株（ＡＴＣＣ ＣＬ−１８７）、ＳＷ１１１６株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２３３）］、７種類の非小細胞肺癌細胞株｛ＰＣ−１株、ＰＣ−７株、ＰＣ−９株、ＰＣ−１２株［以上４株；Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ， ３９， １５（１９７６）］、ＰＣ−１４株（ＥＣＡＣＣ ９００７１８１０）、ＳＫ−ＬＵ１株（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−５７）、ＳＫ−ＬＣ−４株｝、４種類の小細胞肺癌細胞株［Ｌｕ−１３９株（ＲＣＢ ４６９）、ＮＣＩ−Ｈ６９株（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１１９）、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＡ株（ＪＣＲＢ０８１２）、ＳＢＣ−５株（ＪＣＲＢ０８１９）］、３種類の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞株［ＫＧ−１株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４６）、ＴＨＰ−１株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−８０３１）、ＨＬ−６０株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４０）］、３種類の急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）細胞株［ＣＣＲＦ−ＣＥＭ株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１２０）、Ｊｕｒｋａｔ株（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５２）、ＨＳＢ−２株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１２０．１）］、２種類の慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞株［Ｋ５６２株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４３）、ＫＵ８１２株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２０９９）］、８種類の多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株［ＫＭＳ−１１株［Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１２，５４５（１９９８）］、ＫＭＳ−１８株［Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１２，５４５（１９９８）］、ＡＲＨ−７７株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６２１）、ＩＭ−９株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１５９）、ＲＰＭＩ８２２６株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１５５）、ＨＳ−Ｓｕｌｔａｎ株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１４８４）、Ｕ２６６Ｂ１株（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１９６）、ＭＣ−ＣＡＲ株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−８０８３）］、２種類のバーキットリンパ腫細胞株［Ｄａｕｄｉ株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２１３）、Ｒａｊｉ株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８６）］、組織球性リンパ腫（ヒスチオサイティックリンフォーマ）細胞株［Ｕ９３７株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５９３）］、甲状腺濾胞癌（ＦＴＣ）細胞株［ＭＬ−１株（ＤＳＭＺ ＡＣＣ ４６４）］から以下のようにして、それぞれ細胞破砕液を調製してそれぞれＲＮＡを抽出した。
接着性の細胞株の場合には、培養後アスピレーターを用いて培地を除き、ＰＢＳで洗浄した後、シリコン製のヘラで細胞を回収した。培養面積１０ｃｍ２分の細胞あたり１ｍＬのＴＲＩｚｏＬ Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）を添加して懸濁した後、１８Ｇ注射針に１０回通し、ゲノムＤＮＡを寸断して細胞破砕液とした。
浮遊性細胞株の場合には、細胞培養液を冷却遠心機（日立Ｈｉｍａｃ ＣＦ１５Ｒ、ｗ／Ｔ１１Ａ２１ローター）を用いて１５００ｒｐｍで５分間遠心し、デカンテーションにより培地を除いた後、細胞をＰＢＳに懸濁した。該細胞懸濁液を冷却遠心機（日立Ｈｉｍａｃ ＣＦ１５Ｒ、ｗ／Ｔ１１Ａ２１ローター）を用いて１５００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を取り除いて細胞を回収した。回収した細胞１×１０７個あたり１ｍＬのＴＲＩｚｏＬ Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）を添加して懸濁した後、１８Ｇ注射針に１０回通し、ゲノムＤＮＡを寸断して細胞破砕液とした。
上記（１）で作製したゼノグラフトおよびヒト臨床組織から摘出した腫瘍塊の破砕は、以下のようにして行った。
凍結した腫瘍塊を１０ｍＬのＴＲＩｚｏＬ Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）に投入し、直ちにポリトロンＰＴ２１００（キネマティカ社製）を用いて３００００ｒｐｍで１５秒間、破砕し、細胞破砕液とした。
得られた各細胞破砕液を、それぞれ冷却遠心機（日立Ｈｉｍａｃ ＣＦ１５Ｒ、ｗ／Ｔ１１Ａ２１ローター）を用いて１１０００ｒｐｍで１０分間遠心し、沈殿を取らないように注意しながら、上清をそれぞれ新しいチューブに移した。上清に２ｍＬのクロロフォルムを加え、１５秒間激しく振とうし、室温で２〜３分間静置後、冷却遠心機（日立Ｈｉｍａｃ ＣＦ７Ｄ２、ｗ／ＲＴ３Ｓ３ローター）にて３０００ｒｐｍで９０分間、４℃にて遠心した。上清をそれぞれ新しいチューブに移し、５ｍＬのイソプロパノールを加え、緩やかに混和し、室温で１０分間静置後、冷却遠心機（日立Ｈｉｍａｃ ＣＦ１５Ｒ、ｗ／Ｔ１１Ａ２１ローター）にて１１０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を除いた後、１０ｍＬの７５％エタノール溶液を加えて混和し、さらに冷却遠心機（日立Ｈｉｍａｃ ＣＦ１５Ｒ、ｗ／Ｔ１１Ａ２１ローター）にて１１０００ｒｐｍで５分間遠心して沈殿を得た。該沈殿をそれぞれ適当量のＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒにて溶解し、全ＲＮＡサンプルとした。全ＲＮＡサンプルは吸光光度計にて濃度測定および純度検定を行い、Ａ２６０／Ａ２８０の比が１．７以上になっていることを確認した。Ａ２６０／Ａ２８０の比が１．７未満の場合には、さらにＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ（キアゲン社製）にて精製を行った。
上述のようにして得た全ＲＮＡを、Ｍｉｃｒｏ Ｐｏｌｙ（Ａ）Ｐｕｒｅ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社製）を用い、キット添付のプロトコールに従って、それぞれポリＡ（＋）ＲＮＡを精製した。
（３）ｃＤＮＡの合成
上記（２）で得られたポリＡ（＋）ＲＮＡまたは市販のｍＲＮＡより、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（インビトロジェン社製）を用い、キット添付のマニュアルに従ってｃＤＮＡを合成した。
ヒト正常組織由来のｍＲＮＡについては、血液、大腸、心臓、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、膵臓、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気道、子宮および胎盤由来のｍＲＮＡをＢＤクロンテック社より購入して使用した。また、ヒト臨床癌摘出組織として、腎明細胞癌（中分化癌、高分化癌）［３５〜７１才の男性患者９症例と４４〜６３才の女性患者６症例からの混合物］、肝細胞癌（低分化癌）［６９才男性患者１症例と６７才女性患者１症例からの混合物］、肺扁平上皮癌［４６〜７０才の男性患者５症例からの混合物］、胃腺癌（低分化癌、中分化癌、高分化癌）［４６〜８１才の男性患者７症例と４７〜５８才の女性患者２症例からの混合物］、子宮筋腫［２９〜５２才の女性患者５症例からの混合物］、浸潤性乳管癌（中分化癌）［４５〜６０才の女性患者６症例からの混合物］および食道扁平上皮癌（低分化癌、中分化癌、高分化癌）［５６〜７８才の男性患者４症例と７１才の女性患者１症例からの混合物］由来のｍＲＮＡをＢｉｏＣｈａｉｎ社より購入して実験に用いた。
ｍＲＮＡ１μｇに対して１０ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ混合溶液１μＬ、０．５μｇ／μＬＯｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８プライマー溶液１μＬを添加し、ＤＥＰＣ水で全量を７μＬにした反応液を６５℃で５分間加熱後、氷上で急冷し、１分間以上静置して変性させた。該ｍＲＮＡ溶液に１０×ＲＴｂｕｆｆｅｒ２μＬ、２５μｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム４μＬ、０．１ｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ２μＬ、ＲＮａｓｅＯＵＴ１μＬを添加して全量を１９μＬとし、４２℃で２分間保温した。さらにＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ ＲＴａｓｅ（５０Ｕ）１μＬを加えて４２℃で５０分間の逆転写反応を行い、７０℃で１５分間加熱して酵素を失活させた。この後、ＲＮａｓｅＨ１μＬ添加して３７℃で２０分間の反応後、ＤＥＰＣ水を加えて全量を１ｍＬとした。リアルタイムＰＣＲの反応には、該溶液を５倍希釈して用いた。
（４）リアルタイムＰＣＲ法（Ｑ−ＰＣＲ法）による細胞株、ゼノグラフト、正常組織におけるＰＥＲＰ遺伝子のｍＲＮＡ量の定量
上記（３）で調製したｃＤＮＡ １０μＬ（ポリＡ（＋）ＲＮＡ量として２ｎｇに相当）、配列番号５で示される配列からなるフォワードプライマーおよび配列番号６で示される配列からなるリバースプライマー（いずれもプロフリゴ社製）をそれぞれ終濃度が３００ｎｍｏｌ／Ｌになるように加え、さらに１０×Ｒ−ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ Ｍｇ２＋ｆｒｅｅ（タカラバイオ社製）２μＬ、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｍｇ２＋溶液０．２μＬ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ０．６μＬ、ＥｘＴａｑＲ−ＰＣＲ（タカラバイオ社製）０．２μＬ、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ（ＢＭＡ社製、製品原液を２５００倍希釈したもの）１μＬに、ＤＥＰＣ水を加えて全量を２０μＬとした溶液を、９４℃で５分間加熱後、９４℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間からなる反応を４５サイクルで反応させた。増幅産物にインターカレートしたＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩが発する蛍光強度をＰＲＩＳＭ７７００（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）を用いて測定し、同機器付属のソフトウエアＳｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｖｅｒ．１．７ａによりデータ解析を行った。
上記反応によって得られたシグナルが目的の増幅断片であるかどうかは、反応終了後の液をアガロースゲル電気泳動に供し、主な増幅断片のサイズによって判断した。尚、上記反応は、９６ウェルのＰＣＲプレートを用いて行った。ＰＣＲプレートの各ウェルには、検体として上記ｃＤＮＡの他、陰性コントロール（滅菌水）、Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐ Ｍｉｄｉ ｋｉｔ（キアゲン社製）で精製したＰＥＲＰ遺伝子のｃＤＮＡを含むプラスミドＰＬＡＣＥ１００１４０７（ＧｅｎＢａｎｋ アクセッション番号；ＡＫ０７５０８２）を用いて作製した検量線作製用標品（１０〜１０６コピー／ウェル）を配置し、上記と同様にしてＰＣＲ反応を行った。
このようにして得られた各試料におけるＰＥＲＰ遺伝子のｍＲＮＡ発現量の結果を第１表および第２表に示した。
Figure 0005651893
Figure 0005651893
第１表には、各種癌細胞株とゼノグラフトにおけるＰＥＲＰ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を、第２表には、臨床癌摘出組織と正常組織におけるＰＥＲＰ遺伝子のｍＲＮＡの発現量をそれぞれ示した。表中の分子数は、２ｎｇのポリＡ（＋）ＲＮＡあたりのＰＥＲＰ発現分子数の値である。表中の＊印は、ＰＥＲＰ発現分子数の測定値が検出限界以下だったことを示す。表中の最も右のカラムには、正常組織で最も発現が高いＴｒａｃｈｅａ（気道）でのＰＥＲＰ遺伝子発現量を１とした場合の、各組織におけるＰＥＲＰ遺伝子のｍＲＮＡの発現量をそれぞれ示した。
ＰＥＲＰ遺伝子は、ヒト正常組織では発現が低く、膵癌細胞株のＡＳＰＣ−１株およびＡＳＰＣ−１株を移植したゼノグラフト由来の腫瘍塊、２種の膵臓癌腫瘍組織由来細胞（ＰＣ０２およびＰＣ０３）を移植したゼノグラフト由来の腫瘍塊、大腸癌細胞株のｃｏｌｏ２０５株、腎明細胞癌ならびに食道扁平上皮癌において、ヒト正常組織の中では最も発現が高いＴｒａｃｈｅａ（気道）に比較して、発現が３倍以上亢進していることが明らかとなった。
癌手術摘出標本におけるＰＥＲＰ遺伝子の発現解析
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩキット（ロシュダイアグノスティック社製）を使用し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（ロシュダイアグノスティック社製）を用いて、癌手術摘出標本におけるＰＥＲＰ遺伝子のｍＲＮＡ量の定量を行った。
大腸癌患者６症例（原発巣５症例、転移巣３症例）ならびに膵臓癌患者１６症例から摘出された腫瘍組織の癌部ならびに隣接する非癌部から、実施例１の（２）に示した方法により抽出、精製したポリＡ（＋）ＲＮＡを鋳型として、実施例１の（３）で示した方法によりｃＤＮＡを作製した。このｃＤＮＡ溶液１μＬ（全ＲＮＡとして５０ｎｇに相当する量）、配列番号５で示される配列からなるフォワードプライマーおよび配列番号６で示される配列からなるリバースプライマー（いずれもプロリゴ社製、５μｍｏｌ／Ｌ）をそれぞれ０．５μＬ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム溶液１．２μＬ、０．９μＬまたは０．６７５μＬ、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ（耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよびＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ）１μＬを滅菌脱イオン水に加えて全量を１０μＬとした。ＰＣＲはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（ロシュダイアグノスティック社製）を用い、９５℃で１０分間加熱後、９４℃で１０秒間、６５℃または６０℃で３０秒間、７２℃で２０秒間からなる反応を４５サイクルでＰＣＲ反応を行った。更に、６５℃で１５秒保温後、毎秒０．１℃の割合で９５℃まで上昇させる反応を行うことにより産物の融解曲線解析を実施した。反応終了後、上記３点の塩化マグネシウム濃度および２点のアニーリング温度において、該機器付属のソフトウェアによりデータ解析を行った。
実施例１の（３）で作製したｃＤＮＡおよび検量線作製用標品としてＱｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐ Ｍｉｄｉ ｋｉｔ（キアゲン社製）で精製したＰＥＲＰ遺伝子のｃＤＮＡをコードするプラスミドＰＬＡＣＥ１００１４０７（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号；ＡＫ０７５０８２）を一反応あたりそれぞれ１０８、１０６、１０４、１０２コピーおよび陰性コントロールとして滅菌脱イオン水を配置し、上記の条件でＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（ロシュダイアグノスティック社製）を用いてＰＣＲを行った。
大腸癌臨床試料６症例８対（原発巣５対、転移巣３対）、膵臓癌臨床試料１６症例１６対の癌部および隣接非癌部におけるＰＥＲＰ遺伝子のｍＲＮＡの発現量を第３表に示した。
Figure 0005651893
 第３表には大腸癌患者および膵臓癌患者の手術摘出標本における、癌部と隣接する非癌部でのＰＥＲＰ遺伝子のｍＲＮＡの発現量をそれぞれ示した。表中の分子数のカラムは、それぞれの手術摘出標本における癌部由来の全ＲＮＡ５０ｎｇに占めるＰＥＲＰ発現分子数および同一患者、同一標本の隣接非癌部由来の全ＲＮＡ５０ｎｇに占めるＰＥＲＰ発現分子数をそれぞれ表す。表中の＊印は、ＰＥＲＰ発現分子数の測定値が検出限界以下であったことを示す。表中の癌部／非癌部のカラムは、隣接する非癌部に対する癌部でのＰＥＲＰ遺伝子発現量の比を示す。
大腸癌原発巣の８０％（５症例中４症例；Ｃ１虫垂、Ｃ２直腸、Ｃ４直腸、Ｃ５上行結腸）、大腸癌転移巣の３３％（３症例中１症例；Ｃ６肝転移）、膵臓癌臨床試料の１６症例中９症例（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ５、Ｐ８、Ｐ９、Ｐ１１、Ｐ１２、Ｐ１４）では、癌部において隣接する非癌部と比較して、ＰＥＲＰ遺伝子の発現が３倍以上亢進していることが明らかとなった。
Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ａｒｒａｙ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いたＰＥＲＰ遺伝子の発現解析
Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ａｒｒａｙ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製、Ｃａｔ．７８４１−１，Ｌｏｔ．２０７０６８６；各種癌組織と対照としてその近傍の正常組織から得られたｃＤＮＡがドットブロッティングされたナイロンメンブレン）を用いて各種癌組織と近傍の正常組織におけるＰＥＲＰ遺伝子の発現を、以下のようにして解析した。
ＰＥＲＰ遺伝子のプローブ作製はＤＩＧ Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ ＤＮＡラベリングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社）の使用説明書に従い、以下のように行った。実施例４の（１）に記載のＰＥＲＰ発現用プラスミドｐｃＰＥＲＰｍＨの１μｇをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断してアガロースゲル電気泳動で分離し、得られた０．６ｋｂｐの大きさの断片を切り出し、Ｇｅｎｅ Ｃｌｅａｎ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）で精製し、１５μＬのＤＮＡ溶液を得た。この１０μＬに６μＬの滅菌水を加え、９５℃で１０分間処理し、氷中にて急冷させ、ここに４μＬのＤＩＧ−Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅを加え、３７℃で２０時間反応させた。ここに２μＬの０．２ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを加え、さらに６５℃で１０分間加熱することにより、反応を停止させた。収量を定法に従って検定し、０．２４ｎｇ／μＬのプローブを２２μＬ得た。
ハイブリダイゼーションおよび検出は使用説明書に従い、以下のように行った。１．５ｍｇのｓｈｅａｒｅｄ ｓａｌｍｏｎ ｔｅｓｔｉｓ ＤＮＡ（以下、ｓｔＤＮＡと表記する）を９５℃で５分間処理し、氷中にて急冷したものを６８℃に予熱した１５ｍＬのＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）に加え、ハイブリダイゼーション溶液Ａを調製した。前述のＣａｎｃｅｒ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ａｒｒａｙを蒸留水に浸し、水気を完全に切った後、プラスチックバッグに入れ、１０ｍＬのハイブリダイゼーション溶液Ａを加え、６８℃で３０分間保温しプレハイブリダイゼーションを行った。５ｎｇのプローブに１５０μｇのｓｔＤＮＡを加え、９５℃で５分間処理し、氷中にて急冷したものを５ｍＬのハイブリダイゼーション溶液Ａに加えたものをプローブ液とした。プレハイブリダイゼーションが終了したＣａｎｃｅｒ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ａｒｒａｙを新しいプラスチックバッグに移し、プローブ液を加え、６８℃で１６時間反応させた。その後、Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ａｒｒａｙを２００ｍＬの洗浄溶液１（２×ＳＳＣ，０．５％ＳＤＳ）で６８℃にて３０分間洗浄を４回繰り返し、次に２００ｍＬの洗浄溶液２（０．２×ＳＳＣ，０．５％ＳＤＳ）で６８℃にて３０分間、１回のみ洗浄し、さらに２００ｍＬの２×ＳＳＣで室温にて５分間洗浄した。以下の検出反応は室温にて行った。洗浄したＣａｎｃｅｒ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ａｒｒａｙを１００ｍＬの洗浄溶液３（０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムおよび０．３％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．１ｍｏｌ／Ｌマレイン酸緩衝液ｐＨ７．５）で２分間洗浄した後、１０ｍＬのブロッキング溶液（０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムおよび１倍濃度のＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔを含む０．１ｍｏｌ／Ｌマレイン酸緩衝液ｐＨ ７．５）で３０分間ブロッキングを行った。その後、抗ＤＩＧアルカリフォスファターゼコンジュゲート抗体１μＬを５ｍＬのブロッキング溶液に加えた抗体溶液で３０分間反応させた。これを１００ｍＬの洗浄溶液３での１５分間の洗浄を２回繰り返し、２０ｍＬの検出溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む０．１ｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液ｐＨ９．５）で平衡化した後、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ ２５μＬを加えた検出溶液に５分間浸した。検出溶液を除去後、Ｘ線フィルムで検出した。
第１図には、乳癌、子宮癌、大腸癌、胃癌、卵巣癌、肺癌、直腸癌、甲状腺癌における各症例の癌組織（図中、Ｔで示す）および近傍の非癌部（図中、Ｎで示す）でのＰＥＲＰ遺伝子のｍＲＮＡの発現を示した。多くの症例において、近傍の正常組織と比較して、癌部においてＰＥＲＰの発現亢進が認められた。
抗ＰＥＲＰ遺伝子産物モノクローナル抗体の作製
（１）ＰＥＲＰ発現細胞の造成
ヒトＰＥＲＰ遺伝子を含むプラスミドＨＥＭＢＡ１００６３３５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号；ＡＫ０７４５８５、１ｎｇ／μＬ）を１μＬ、１０×ＥｘＴａｑ緩衝液２μＬ、２ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰを２μＬ、１０μｍｏｌ／Ｌの配列番号７および配列番号８に示される塩基配列からなるプライマーをそれぞれ２μＬ、ＥｘＴａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）０．５μＬ、滅菌水１０．５μＬからなる溶液を、９４℃で５分間加熱後、９４℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で１分間からなる反応を２５サイクル、７２℃で７分間反応させた。反応産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、約０．６ｋｂの増幅断片をＧＥＮＥＣＬＥＡＮ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１社製）を用いて抽出した。該断片と、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクターとをＴＯＰＯ ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて連結した後、コーエンらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｌｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］により大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。得られた形質転換体よりプラスミド抽出キット（キアゲン社製）を用いてプラスミドを抽出し、ヒトＰＥＲＰ遺伝子を含むプラスミドｐＣＲＩＩ−ＰＥＲＰを取得した。
ＰＥＲＰ断片の３’側にｍｙｃ−Ｈｉｓタグ配列を付加するためのクローニングベクターとしてｐＢＳｍＨを以下のようにして作製した。
ｐｃＤＮＡ３．１（−）／ｍｙｃ−ＨｉｓＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製］をＰｍｅＩで消化し、上記と同様にして約１７０ｂｐのｍｙｃ−Ｈｉｓタグをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得した。該断片と、ＸｂａＩおよびＫｐｎＩで消化後、Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）で末端の平滑化を行ったｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）とをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造社製）により、連結した後、大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。得られた形質転換体よりプラスミド抽出キット（キアゲン社製）を用いてプラスミドを抽出し、プラスミドｐＢＳｍＨを取得した。ｐＢＳｍＨは、制限酵素ＸｂａＩで該プラスミドを消化し、約２．９ｋｂｐおよび約１６０ｂｐの２本の断片を生じる。
上記のｐＣＲＩＩ−ＰＥＲＰをＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＰＥＲＰ遺伝子を含む断片を取得した。該断片と、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＢＳｍＨとをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造社製）により連結した後、大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。得られた形質転換体よりプラスミド抽出キット（キアゲン社製）を用いてプラスミドを抽出し、プラスミドｐＢＳ−ＰＥＲＰｍＨを取得した。
ｐＢＳ−ＰＥＲＰｍＨをＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、ＰＥＲＰ遺伝子およびｍｙｃ−Ｈｉｓタグをコードする遺伝子を含む断片を取得した。該断片と、ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化したｐｃＤＮＡ３．１＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）とをＤＮＡライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造社製）により連結した後、大腸菌ＤＨ５α株を形質転換した。得られた形質転換体よりプラスミド抽出キット（キアゲン社製）を用いてプラスミドを抽出し、ヒトＰＥＲＰの発現プラスミドｐｃＰＥＲＰｍＨを取得した。
ｐｃＰＥＲＰｍＨは、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］により以下のようにしてＣＨＯ／ＤＧ４４細胞［Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２（６），５５５（１９８６）］へ導入した。
細胞は、１０％ウシ胎児血清（ライフテクノロジー社製）、１×ＨＴ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ライフテクノロジー社製）、１％ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ライフテクノロジー社製）を添加したＩＭＤＭ培地（ライフテクノロジー社製）（以下、Ａ３培地と表記する）で培養したものを用いた。ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞をＫ−ＰＢＳ緩衝液［１３７ｎｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム、２．７ｎｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、８．１ｍｍｏｌ／Ｌリン酸一水素二ナトリウム、１．５ｎｍｏｌ／Ｌリン酸二水素一ナトリウム、４ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム緩衝液］に懸濁して８×１０６細胞／ｍＬの濃度に調製し、該細胞懸濁液２００μＬを上記発現プラスミドｐｃＰＥＲＰｍＨ ４μｇと混和した。該混和液をキュベット（電極間距離２ｍｍ）に移し、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＩＩ（バイオラッド社製）装置を用いてパルス電圧０．３５ｋＶ、電気容量２５０μＦの条件で遺伝子導入を行った。キュベットを氷上で静置後、キュベット中の細胞懸濁液をＡ３培地中に懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で培養した。１日間培養後、０．５ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８（カルビオケム社製）を添加したＡ３培地に培地交換し、培養を続けた。途中希釈しながら継代を続け、遺伝子導入より約２週間後に、Ｇ４１８に耐性を持つ形質転換細胞株を取得した。
得られた形質転換細胞を１．２５細胞／ｍＬとなるよう０．５ｍｇ／ｍＬ Ｇ４１８を添加したＡ３培地で希釈後、９６ウェルプレートに２００μＬずつ分注して、限界希釈法によるクローニングを行った。
上記で取得された形質転換細胞１〜５×１０５個を１５μＬの１×ＰＡＧＥ ｂｕｆｆｅｒに溶解して９５℃で５分間処理し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）〕にて分画後、ＰＶＤＦ膜にブロッティングした。ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキング後、抗ｍｙｃモノクローナル抗体９Ｅ１０（ＭＢＬ社製）を室温で１時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄した後、第二抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ダコ社製）を室温で１時間反応させた。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳでよく洗浄した後、検出はＥＣＬ−ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（アマシャム社製）を用いて行い、Ｘ線フィルム上に感光させた。
第２図に結果を示した。分子量２５ｋＤａ付近にシグナルが認められた株をＰＥＲＰ発現株（以下、ＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞と表記する）とした。
（２）抗ＰＥＲＰモノクローナル抗体の作製−１
（２）−１ 免疫原の調製
上記（１）で造成したＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞を１０％牛胎児血清入りＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ培地（インビトロジェン社製）で２〜３日培養後、１匹あたりの細胞数が６×１０６個から１×１０７個の細胞数となるようにＰＢＳに懸濁した。
（２）−２ 動物の免疫と抗体産生細胞の調製
上記（２）−１で調製した細胞を、百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）１×１０９細胞とともに６週令雌ＳＤラット３匹に投与した。投与１週間後より、毎週１回、計５回投与した。該ラットの眼底より部分採血し、以下に示すサンドイッチＥＬＩＳＡにより血中抗体価を測定し、十分な抗体価を示したマウスから最終免疫３日後に脾臓を摘出した。
脾臓をＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（２５０×ｇ、５分間）した。得られた沈殿画分にトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６）を添加し、１〜２分間処理することにより赤血球を除去した。得られた沈殿画分（細胞画分）をＭＥＭ培地で３回洗浄し、細胞融合に用いた。
（２）−３ 酵素免疫測定法（サンドイッチＥＬＩＳＡ）
９６ウェルのＥＩＡ用プレート（グライナー社製）に、ＭＹＣ １−９Ｅ１０．２細胞
株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７２９）が産生する抗ｃ−Ｍｙｃ抗体をダルベッコＰＢＳで１
０μｇ／ｍＬに調製し、該溶液を５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着さ
せた。該プレートをＰＢＳで洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μＬ／ウェルで添加し、室
温で１時間放置し、残存する活性基をブロックし、反応プレートとした。
ＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の各５×１０７細胞あたりに１ｍｌの細胞溶解用緩衝液（１％ＴｒｉｔｏｎＸ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、２ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カルシウム、０．１％アザイド、５０ｍｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミド、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎ−エチルマレイミド、１ｍｇ／ｍｌロイペプチン、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．２）を添加し、４℃で２時間放置後、遠心分離して得られた上清を、ＢＳＡ−ＰＢＳを除去した反応プレートに５０μＬ／ウェルで分注し、室温で２時間放置した。該プレートをＰＢＳで洗浄後、被免疫ラット抗血清またはハイブリドーマ細胞の培養上清を５０μＬ／ウェルで分注し、室温で２時間放置した。該プレートをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、２次抗体としてペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ラットイムノグロブリン（カルタグ社製）を５０μＬ／ウェルで加えて室温で１時間放置した。該プレートをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を１μＬ／ｍＬで添加した溶液］を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、４１５ｎｍの吸光度（以下、ＯＤ４１５などと表記する）をプレートリーダー（Ｅｍａｘ；モルキュラーデバイス社製）を用いて測定した。
（２）−４ マウス骨髄腫細胞の調製
８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１：Ｐ３−Ｕ１［ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５９７：Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６，５１１，（１９７６）］を正常培地（１０％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ培地）で培養し、細胞融合時に２×１０７個以上の細胞を確保し、細胞融合に供した。
（２）−５ ハイブリドーマの作製
上記（２）−２で得られたラット脾細胞と（２）−４で得られた骨髄腫細胞とを１０：１になるよう混合し、遠心分離（２５０×ｇ、５分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングライコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）２ｇ、ＭＥＭ培地２ｍＬおよびジメチルスルホキシド０．７ｍＬの混液０．２〜１ｍＬ／１０８マウス脾細胞を加え、１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍＬを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにした。遠心分離（９００ｒｐｍ、５分間）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吸出しでゆるやかに細胞をＨＡＴ培地１００ｍＬ中に懸濁した。
この懸濁液を９６ウェル培養用プレートに１００μＬ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１０〜１４日間培養した。培養後、培養上清を（２）−３に記載したサンドイッチＥＬＩＳＡ法で調べ、ＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞に反応してＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に反応しないウェルを選び、そこに含まれる細胞から限界希釈法によるクローニングを２回繰り返し、抗ＰＥＲＰ抗体産生ハイブリドーマ株ＫＭ３３１４を確立した。
第３図には、（２）−３記載のサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて、ＫＭ３３１４のＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞およびＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に対する反応性を示した。ＫＭ３３１４はＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞に特異的に反応した。
（２）−６ モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した８週令ヌード雌マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）に（２）−５で得られたハイブリドーマ株を５〜２０×１０６細胞／匹それぞれ腹腔内注射した。１０〜２１日後、ハイブリドーマが腹水癌化することにより腹水のたまったマウスから、腹水を採取（１〜８ｍＬ／匹）した。
該腹水を遠心分離（１２００×ｇ、５分間）し固形分を除去した。精製ＩｇＧモノクローナル抗体は、カプリル酸沈殿法〔Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）〕により精製することにより取得した。サブクラスタイピングキットを用いたＥＬＩＳＡ法により、精製した抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３３１４のサブクラスを決定したところ、抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３３１４のサブクラスはＩｇＧ２ａであった。
（２）−７ モノクローナル抗体の反応性の検討−ウェスタンブロッティング
ＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞およびＣＨＯ／ＤＧ４４細胞、大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２２）および肺癌細胞株ＰＣ１（免疫生物研究所）にＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー｛２％ＳＤＳおよび１０％グリセロールを含む６２ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ＰＨ６．８）｝を細胞１×１０７個あたり１００μＬ添加して、１００℃加熱および超音波破砕にて、可溶化画分を調製した。各１×１０５個細胞相当量をＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、泳動後のゲルをＰＶＤＦ膜にブロッティングした。該膜をＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキング後、ハイブリドーマＫＭ３３１４培養上清および陰性対照抗体ＫＭ１７６２（抗アベルメクチン抗体）を５μｇ／ｍＬで含むＢＳＡ−ＰＢＳを室温で２時間反応させた。
反応後、該膜をＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄した後、ペルオキシターゼ標識ウサギ抗ラットイムノグロブリン（ダコ社製）を室温で１時間反応させた。反応後、該膜をＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄し、ＥＣＬＴＭウェスタンブロッティングディテクションリーアジェンツ（アマシャムファルマシア社製）を用いて、抗ＰＥＲＰ抗体が結合したバンドを検出した。
結果を第４図に示した。ＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞および大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５で２５ｋＤａ付近にバンドが検出されたことから、抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３３１４はウエスタンブロットによるＰＥＲＰタンパク質の検出が可能な抗体であることが示された。ＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞で検出されるＰＥＲＰタンパク質の分子量が、大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５で検出されるＰＥＲＰタンパク質の分子量と比較して大きくなっているのは、ＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞では、ｍｙｃ−Ｈｉｓタグ配列が付加されたＰＥＲＰタンパク質が発現しているためであると考えられた。
（３） 抗ＰＥＲＰモノクローナル抗体の作製−２
（３）−１ 免疫原の調製
上記（１）で造成したＰＥＲＰ発現株を１０％牛胎児血清入りＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ培地（インビトロジェン社製）で２〜３日培養後、１匹あたりの細胞数が６×１０６個から１×１０７個の細胞数となるようにＰＢＳに懸濁した。
（３）−２ 動物の免疫と抗体産生細胞の調製
上記（３）−１で調製した細胞を、百日咳ワクチン（千葉県血清研究所製）１×１０９細胞とともに６週令雌Ｂａｌｂ／Ｃマウス３匹に投与した。投与１週間後より、毎週１回、計５回投与した。該マウスの眼底より部分採血し、その血中抗体価を、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）およびフローサイトメーター（ベックマンコールター社製）で測定し、十分な抗体価を示したマウスを選択し、最終免疫から３日後に脾臓を摘出した。
脾臓をＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（２５０×ｇ、５分間）した。得られた沈殿画分にトリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６）を添加し、１〜２分間処理することにより赤血球を除去した。得られた沈殿画分（細胞画分）をＭＥＭ培地で３回洗浄し、細胞融合に用いた。
（３）−３ 細胞を用いた蛍光抗体染色法（ＦＭＡＴ：Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｍｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
アッセイ用の細胞は（１）で造成したＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞とＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を用いた。１０％牛胎児血清入りＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ培地［インビトロジェン社］で２〜３日培養し、Ｔｒｉｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液（インビトロジェン社製）で剥離した細胞を同一の培地に懸濁し、ＦＭＡＴ用黒色９６ウエルプレートに７×１０３個／１００μＬ培地／ウェルで播種し、１晩培養した。該プレートに一次抗体として被免疫マウス抗血清あるいはハイブリドーマ培養上清を５μＬ／ウェルで分注し、二次抗体としてＡＬＥＸＡ６４７標識抗マウスイムノグロブリンＧ（Ｈ＋Ｌ）（モレキュラープローブ社製）を５０μＬ／ウェルで分注し、遮光下で４時間放置した。レーザー光６３３ｎｍＨｅ／Ｎｅで励起される６５０ｎｍ〜６８５ｎｍの波長をＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（アプライドバイオシステム社製）で測定した。
（３）−４ 細胞を用いた蛍光抗体染色法（フローサイトメトリー）
アッセイ用の細胞は（１）で造成したＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞とＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を用いた。１０％牛胎児血清入りＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ培地（インビトロジェン社製）で２〜３日培養し、０．０２％ＥＤＴＡ溶液（ナカライテスク社製）で剥離した細胞をＰＢＳで洗浄し、抗体の非特異的な吸着を避けるためにＢＳＡ−ＰＢＳを用いて、氷温中で２０分ブロッキングした。１×１０６個／１００μＬ ＢＳＡ−ＰＢＳとなるように９６ウェルＵ字プレートに分注し、遠心分離（１８００ｒｐｍ、２分間）した後、上清を除いて一次抗体として被免疫マウス抗血清、ハイブリドーマ培養上清を５０μＬ／ウェル分注し、氷温中で３０分間反応させた。ＰＢＳを用いて遠心分離法で３回洗浄し、二次抗体としてＡＬＥＸＡ４８８標識抗マウスイムノグロブリンＧ（Ｈ＋Ｌ）（モレキュラープローブ社製）を２０μＬ／ウェル加えて氷温で遮光下、３０分間反応させた。再びＰＢＳを用いて洗浄し、ＰＢＳに懸濁してレーザー光４８８ｎｍＡｒで励起される５１０〜５３０ｎｍの波長をフローサイトメーター（ベックマンコールター社製）で測定した。
（３）−５ マウス骨髄腫細胞の調製
８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１：Ｐ３−Ｕ１［ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５９７：Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６，５１１（１９７６）］を正常培地（１０％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ培地）で培養し、細胞融合時に２×１０７個以上の細胞を確保し、細胞融合に供した。
（３）−６ ハイブリドーマの作製
（３）−２で得られたマウス脾臓細胞と（３）−５で得られた骨髄腫細胞とを１０：１になるよう混合し、遠心分離（２５０×ｇ、５分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、３７℃で、ポリエチレングライコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）２ｇ、ＭＥＭ培地２ｍＬおよびジメチルスルホキシド０．７ｍＬの混液０．２〜１ｍＬを、１０ ８ 個のマウス脾臓細胞へ加え、１〜２分間毎にＭＥＭ培地１〜２ｍＬを数回加えた後、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにした。遠心分離（９００ｒｐｍ、５分間）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペットによる吸込み、吸出しでゆるやかに細胞をＨＡＴ培地１００ｍＬ中に懸濁した。
この懸濁液を９６ウェル培養用プレートに２００μＬ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１０〜１４日間培養した。培養後、培養上清を（３）−３および（３）−４に記載した蛍光抗体染色で調べ、ＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞に反応してＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に反応しないウェルを選び、選択した細胞から限界希釈法によるクローニングを２回繰り返し、抗ＰＥＲＰ抗体産生ハイブリドーマＫＭ３４１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−８６４３）を確立した。
第５図には、ハイブリドーマＫＭ３４１１の培養上清に含まれるモノクローナル抗体のＦＭＡＴ法におけるＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞およびＣＨＯ／ＤＧ４４細胞に対する反応性を示した。ハイブリドーマＫＭ３４１１が生産するモノクローナル抗体ＫＭ３４１１は、ＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞にのみ特異的に反応した。
（３）−７ モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した８週令ヌード雌マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）に（２）−５で得られたハイブリドーマ株を５〜２０×１０６細胞／匹それぞれ腹腔内注射した。１０〜２１日後、ハイブリドーマが腹水癌化することにより腹水のたまったマウスから、腹水を採取（１〜８ｍＬ／匹）した。
該腹水を遠心分離（１２００×ｇ、５分間）し固形分を除去した。精製ＩｇＧモノクローナル抗体は、カプリル酸沈殿法［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］により精製することにより取得した。サブクラスタイピングキットを用いたＥＬＩＳＡ法により、精製した抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１のサブクラスを決定したところ、抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１のサブクラスはＩｇＧ１であった。
（３）−８ モノクローナル抗体の反応性の検討−蛍光細胞染色（フローサイトメトリー）
上記（３）−４に示した方法に従って行なった。結果を図６に示す。ＫＭ３４１１はＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞および大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ２０５に反応して、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞およびＰＥＲＰｍＲＮＡが発現してないＰＣ１には反応しなかった。
抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１を用いた免疫学的手法によるＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの検出
（１） ＫＭ３４１１を用いた免疫沈降反応によるＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの検出
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに抗マウスイムノグロブリン（ダコ社製）をプレートコートし、抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１を含む、ハイブリドーマ細胞の培養上清、または陰性対照抗体ＫＭ５１１（抗顆粒球コロニー刺激因子誘導体抗体）を含む、ハイブリドーマ細胞の培養上清を４℃で１晩反応させた。反応後、ＰＢＳで洗浄し、非特異吸着を避けるためＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングした。ＰＥＲＰ発現細胞またはＣＨＯ／ＤＧ４４細胞の各５×１０７細胞あたりに１ｍＬの細胞溶解用緩衝液（１％ＴｒｉｔｏｎＸ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、２ｍｍｏＬ／Ｌ塩化カルシウム、０．１％アザイド、５０ｍｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミド、５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎ−エチルマレイミド、１ｍｇ／ｍＬロイペプチン、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液ｐＨ７．２）を添加し、４℃で２時間放置後、遠心分離して得られた上清を、ＢＳＡ−ＰＢＳを捨てた該プレートに１００μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置した。Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー｛２％ＳＤＳおよび１０％グリセロールを含む６２ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）｝にて溶解したものをサンプルとして、上記（２）−７と同様にウェスタンブロッティングを行った。このとき、一次抗体として上記（２）−５で作製した抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３３１４および陰性対照抗体ＫＭ１７６２（抗アベルメクチン抗体）を用いた。
結果を第７図に示した。抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１で免疫沈降を行い、抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３３１４で検出を行ったＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞にのみ、２５ｋＤａ付近にバンドが検出された。抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１は免疫沈降反応によるＰＥＲＰの検出が可能な抗体であることが示された。
（２） 抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１を用いた蛍光抗体染色法（フローサイトメトリー）によるＰＥＲＰの検出
（２）−１各種細胞株
図８中に示した各種癌細胞株を０．０２％ＥＤＴＡ溶辛夜（ナカライテスク社製）で剥離し、ＰＢＳで洗浄し、抗体の非特異的な吸着を避けるためにヒト免疫グロブリン（ウエルフアイド社製）を含む１％ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて、氷温中で２０分間ブロッキングした。１×１０６個／１００μＬ ＢＳＡ−ＰＢＳとなるように９６ウェルＵ字プレートに分注し、遠心分離（１８００ｒｐｍ、２分間）した後、上清を除いて、抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１培養上清および陰性対照抗体ＫＭ５１１（抗顆粒球コロニー刺激因子誘導体抗体）培養上清を５０μＬ／ウェル分注し、氷温中で３０分間反応させた。ＰＢＳを用いて遠心分離法で３回洗浄し、二次抗体としてＡＬＥＸＡ４８８標識抗マウスイムノグロブリンＧ（Ｈ＋Ｌ）（モレキュラープローブ社製）を２０μＬ／ウェル加えて氷温中、遮光下で３０分間反応させた。再びＰＢＳを用いて遠心分離法で３回洗浄し、ＰＢＳに懸濁してレーザー光 ４８８ｎｍＡｒで励起される５１０〜５３０ｎｍの波長をフローサイトメーター（ペックマンコールタ一社製）で測定した。
結果を図８に示した。ＫＭ３４１１は大腸癌５／５株、膵臓癌２／３株、肺癌４／５株、
乳癌２／２株、子宮癌１／１株の各種癌細胞株と反応した。
（２）−２ ヒト末梢血（単核球、顆粒球）
ヒト末梢血よりモノ・ポリ分離用溶液（大日本製薬社製）を用いた遠心分離法で、単核球であるリンパ球および単球画分または顆粒球画分を分離した。１０％牛胎児血清入りＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）で洗浄後、９６ウェルＵ字プレートに１×１０６個／１００μＬになるように分注し、遠心分離（１８００ｒｐｍ、２分間）後、上清を除いて一次抗体としてビオチン標識抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１および、陰性対照抗体ビオチン標識ＫＭ５１１（抗顆粒球コロニー刺激因子誘導体抗体）を、ヒト免疫グロブリン（ウェルファイド社製）／ＢＳＡ−ＰＢＳとともに氷温中で１時間反応させた。該プレートをＰＢＳで３回洗浄し、二次抗体としてレッド６７０標識抗ストレプトアビジン（コールター社製）を５０μＬ／ウェルを加え更に、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ４５抗体（ベックマンコールター社製）１０μＬ／ウェル加えて氷温中、遮光下で１時間させた。該プレートをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳに懸濁してレーザー光４８８ｎｍＡｒで励起される５０５〜５４５ｎｍまたは６６０〜７００ｎｍの波長をフローサイトメーター（ベックマンコールター社製）で測定した。
結果を第９図に示した。縦軸の蛍光強度はＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ４５抗体の、横軸の蛍光強度はビオチン標識抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１あるいは陰性対照抗体ビオチン標識ＫＭ５１１の反応性をそれぞれ示している。ビオチン標識抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１はヒト末梢血中の単核球、および顆粒球と反応しなかった。
抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１と市販の抗ＰＥＲＰ抗体（ポリクローナル抗体）との反応性比較
抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１と抗ＰＥＲＰポリクローナル抗体（ＰｒｏＳｃｉ社製、製品番号 ２４５１、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製、製品番号 ＮＢ５００−２３１）のＰＥＲＰ発現細胞に対する反応性をフローサイトメトリーで比較した。
細胞はＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞とＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を用いた。１０％牛胎児血清入りＩｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ 培地（インビトロジェン社製）で２〜３日培養し、０．０２％ＥＤＴＡ溶液（ナカライテスク社製）で剥離した細胞をＰＢＳで洗浄し、抗体の非特異的な吸着を避けるためにＢＳＡ−ＰＢＳを用いて、氷温中で２０分間ブロッキングした。１×１０６個／１００μＬ ＢＳＡ−ＰＢＳとなるように９６ウェルＵ字プレートに分注し、遠心分離（１８００ｒｐｍ、２分間）した後、上清を除いて一次抗体としてモノクローナル抗体の陰性対照抗体としてＫＭ５１１（抗ＧＣＳＦ誘導体抗体）、ポリクローナル抗体の陰性対照抗体として抗ラットアポＢポリクローナル抗体（ラットアポＢを免疫原として作製したウサギ抗血清由来ＩｇＧ画分ポリクローナル抗体）、抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１および２種類の市販抗ＰＥＲＰポリクローナル抗体（ＰｒｏＳｃｉ社製、製品番号２４５１、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製、製品番号ＮＢ５００−２３１）を各１０μｇ／ｍｌを５０μＬ／ウェル分注し、氷温中で６０分間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄し、二次抗体としてＦＩＴＣ標識抗マウスイムノグロブリンＧ（Ｈ＋Ｌ）（カルタグ社製）またはＦＩＴＣ標識抗ウサギイムノグロブリンＧ（Ｈ＋Ｌ）（カペル社製）を２０μＬ／ウェルで加えて氷温中、遮光下で３０分間反応させた。再びＰＢＳを用いて遠心分離法で３回洗浄し、ＰＢＳに懸濁してレーザー光４８８ｎｍＡｒで励起される５１０〜５３０ｎｍの波長をフローサイトメーター（ベックマンコールター社製）で測定した。
結果を第１０図に示した。横軸には、蛍光強度を示した。抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１のみＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞とＣＨＯ／ＤＧ４４細胞で蛍光強度が異なることから、抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１のみが、細胞に発現したＰＥＲＰに特異的に反応していることが示された。
抗ＰＥＲＰキメラ抗体の作製
（１）抗ＰＥＲＰマウス抗体の可変領域をコードするｃＤＮＡの単離、解析
（１）−１ 抗ＰＥＲＰマウス抗体産生ハイブリドーマ細胞からのｍＲＮＡの調製
実施例４に記載のハイブリドーマＫＭ３４１１より、ｍＲＮＡの調製キットであるＦａｓｔ Ｔｒａｃｋ ２．０ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、ハイブリドーマ細胞４×１０７細胞より約３９μｇのｍＲＮＡを調製した。
（１）−２ 抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１のＨ鎖およびＬ鎖可変領域の遺伝子クローニング
上記（１）−１で取得した抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１のｍＲＮＡの１μｇから、ＢＤ ＳＭＡＲＴＴＭ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、５’側にキット添付のＢＤ ＳＭＡＲＴ ＩＩＴＭ Ａ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ配列を有するｃＤＮＡを取得した。そのｃＤＮＡを鋳型として、キット添付のユニバーサルプライマーＡｍｉｘと、配列番号９で示したマウスＩｇ（γ）特異的プライマーを用いてＰＣＲ反応を行いＶＨのｃＤＮＡ断片を増幅した。またＩｇ（γ）特異的プライマーの代わりに配列番号１０で示したマウスＩｇ（κ）特異的プライマーを用いてＰＣＲを行いＶＬのｃＤＮＡ断片を増幅した。
ＰＣＲは、９４℃で５分間加熱後、９４℃で１５秒間、７２℃で３分間からなる反応サイクルを５回、９４℃で１５秒間、７０℃で３０秒間、７２℃で３分間からなる反応サイクルを５回、９４℃で１５秒間、６８℃で３０秒間、７２℃で３分間からなる反応サイクルを３０回それぞれ行った後、７２℃で１０分間反応させた。ＰＣＲはＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ９７００（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。得られたＰＣＲ産物はＨ鎖、Ｌ鎖共に約５００ｂｐのサイズであった。
得られたＰＣＲ産物の塩基配列を決定するため、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）をＳｍａＩで消化して得られたＤＮＡを約０．０５ｐｍｏｌと、上記で得られたそれぞれのＰＣＲ産物約０．５ｐｍｏｌをＴＡＫＡＲＡ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造社製）のＳｏｌｕｔｉｏｎＩを６μＬ、制限酵素ＳｍａＩを０．３μＬ入れ合計１２．３μＬとし、２２℃で一晩にわたって反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＰＥバイオシステムズ社製）を用い添付の説明書に従って反応後、同社のシーケンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３７００により塩基配列を解析した。その結果、ｃＤＮＡの５’末端に開始コドンと推定されるＡＴＧ配列が存在する、完全長のＨ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ３４１１Ｈ＃９およびＬ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ３４１１Ｌ＃４が取得された。
（１）−３ 抗ＰＥＲＰマウス抗体のＶ領域のアミノ酸配列の解析
プラスミドｐＫＭ３４１１Ｈ＃９に含まれていたＶＨの全塩基配列を配列番号１１に、該配列から推定された、シグナル配列を含んだ分泌型ＶＨの全アミノ酸配列を配列番号１２に、プラスミドｐＫＭ３４１１Ｌ＃４に含まれていたＶＬの全塩基配列を配列番号１３におよび該配列から推定された、シグナル配列を含んだ分泌型ＶＬの全アミノ酸配列を配列番号１４にそれぞれ示した。既知のマウス抗体の配列データ［ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］との比較、並びに精製した抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１のＨ鎖及びＬ鎖のＮ末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサー（島津製作所社製：ＰＰＳＱ−１０）を用いて解析した結果との比較から、単離した各々のｃＤＮＡは分泌シグナル配列を含む抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１をコードする完全長ｃＤＮＡであり、Ｈ鎖については配列番号１２に記載のアミノ酸配列の１から１８番目が、Ｌ鎖については配列番号１４に記載のアミノ酸配列の１から２２番目が分泌シグナル配列であることが明らかとなった。
次に、抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の新規性について検討した。配列解析システムとしてＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ ９．１、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ社製）を用い、既存の蛋白質のアミノ酸配列データベースをＢＬＡＳＴＰ法［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５，３３８９（１９９７）］により検索した。その結果、ＶＨ、ＶＬともに完全に一致するアミノ酸配列は認められず、抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１のＶＨおよびＶＬは新規なアミノ酸配列を有していることが確認された。
また、抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを、既知の抗体のアミノ酸配列と比較することにより同定した。抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号１５、１６および１７に、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列を配列番号１８、１９および２０にそれぞれ示した。
（２）抗ＰＥＲＰキメラ抗体の動物細胞を用いた安定発現
（２）−１ 抗ＰＥＲＰキメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ３４１１の構築
ＷＯ９７／１０３５４に記載のヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３と本実施例の（１）−２で得られたプラスミドｐＫＭ３４１１Ｈ＃９及びｐＫＭ３４１１Ｌ＃４を用いて抗ＰＥＲＰキメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ３４１１を以下のようにして構築した。
抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１のＶＨをコードするｃＤＮＡをＰＣＲ法によって得るために配列番号２１と２２の塩基配列を有する合成ＤＮＡを、ＶＬをコードするｃＤＮＡを得るために配列番号２３と２４の塩基配列を有する合成ＤＮＡをそれぞれ設計、合成した。それぞれの合成ＤＮＡ（ジェンセット社製）は５’末端にｐＫＡＮＴＥＸ９３へクローニングするための制限酵素認識配列を含んでいる。本実施例の（１）−２で得られたプラスミドｐＫＭ３４１１Ｈ＃９の２０ｎｇを５０μＬのＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ＃１（東洋紡績社製）、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、０．５μｍｏｌ／Ｌの配列番号２１と２２に示される塩基配列の合成ＤＮＡを含む緩衝液に添加し、サーマルサイクラーを用いて、９４℃で３分間加熱した後、２．５単位のＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を添加し、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、７４℃で１分間からなる反応サイクルを２５サイクル行った。同様に、本実施例の（１）−２で得られたプラスミドｐＫＭ３４１１Ｌ＃４の２０ｎｇを５０μＬのＫＯＤ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ＃１（東洋紡績社製）、０．２ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ、１ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、０．５μｍｏｌ／Ｌの配列番号２３と２４でそれぞれ示される塩基配列の合成ＤＮＡを含む緩衝液に添加し、上記の方法でＰＣＲを行なった。該反応液４０μＬをアガロースゲル電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．４７ｋｂのＶＨのＰＣＲ産物、約０．４５ｋｂのＶＬのＰＣＲ産物をそれぞれ回収した。
次に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＳｍａＩ（宝酒造社製）で消化したＤＮＡ０．０５ｐｍｏｌと、上記で得られたそれぞれのＰＣＲ産物約０．５ｐｍｏｌを滅菌水に加えて１０μＬとし、さらにＴＡＫＡＲＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２のｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（宝酒造社製）１０μＬ、制限酵素ＳｍａＩ（宝酒造社製）０．５μＬを加えて２２℃で一晩にわたって反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７００により塩基配列を解析し、目的の塩基配列を有する第１１図に示したプラスミドｐＫＭ３４１１ＶＨ９およびｐＫＭ３４１１ＶＬ１１が得られたことを確認した。
次にヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３と上記で得られたｐＫＭ３４１１ＶＬ１１をそれぞれ制限酵素ＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社製）で消化後、引き続き制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で消化した。消化後の反応液をアガロースゲル電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．４５ｋｂのＶＬのＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片と、約１２．７ｋｂのｐＫＡＮＴＥＸ９３のＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片をそれぞれ回収した。
得られた２種類の断片をＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて添付の説明書に従って連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製して制限酵素処理により確認し、目的の約０．４５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片が挿入された、第１２図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ３４１１ＶＬが得られたことを確認した。
次に、上記で得られたｐＫＡＮＴＥＸ３４１１ＶＬとｐＫＭ３４１１ＶＨ９をそれぞれ制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）で消化後、引き続き制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）で消化した。消化後の反応液をアガロースゲル電気泳動した後、約１３．２ｋｂのｐＫＡＮＴＥＸ３４１１ＶＬ由来のＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片、約０．４７ｋｂのｐＫＭ３４１１ＶＨ９由来のＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片をそれぞれ回収した。得られた２種類の断片をＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）を用いて添付の説明書に従って連結し、得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製して制限酵素処理により確認し、目的の約０．４７ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片が挿入された、第１２図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ３４１１が得られたことを確認した。該プラスミドに関して、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７００により塩基配列を解析した結果、目的のＫＭ３４１１のＶＨをコードするｃＤＮＡおよびＶＬをコードするｃＤＮＡがそれぞれクローニングされたプラスミドが得られたことを確認した。
（２）−２ 抗ＰＥＲＰキメラ抗体の動物細胞での発現
本実施例の（２）−１で得られた抗ＰＥＲＰキメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ３４１１を用いて抗ＰＥＲＰキメラ抗体の動物細胞での発現を、常法［Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９２）］により行い、ｐＫＡＮＴＥＸ３４１１が導入された形質転換株ＫＭ３４８１を取得した。
（３）精製抗体の取得
本実施例（２）−２で得られた形質転換株を、通常の培養法で培養した後、細胞懸濁液を回収し、３０００ｒｐｍ、４℃の条件で５分間の遠心分離を行って培養上清を回収した後、培養上清は０．２２μｍ孔径ＭｉｌｌｅｘＧＶフィルター（ミリポア社製）を用いて濾過滅菌した。得られた培養上清よりＭａｂ Ｓｅｌｅｃｔ（アマシャム・バイオサイエンス社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１を精製した。
得られた抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１の精製標品の精製度および発現分子サイズを、グラジュエントゲル（ＡＴＴＯ社製、カタログ番号：Ｅ−Ｔ５２０Ｌ）を用いて、添付の説明書に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１を対照として同時に泳動した。
結果を第１３図に示した。精製した抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１は、非還元条件下では分子量が約１５０ｋＤａの１本のバンドが、還元条件下では約５０ｋＤａと約２５ｋＤａの２本のバンドが認められた。これらの分子量は、ＩｇＧクラスの抗体は、非還元条件下では分子量は約１５０ｋＤａであり、還元条件下では分子内のＳ−Ｓ結合が切断され、約５０ｋＤａの分子量を持つＨ鎖と約２５ｋＤａの分子量を持つＬ鎖に分解されるという報告［Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４（１９８８）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９６）］と一致し、抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１が正しい構造の抗体分子として発現されていることが確認された。
抗ＰＥＲＰキメラ抗体の活性評価
（１）膜表面上のＰＥＲＰへの結合性（蛍光抗体法）
（１）−１ ＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞への結合性
実施例７の（３）で精製した抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１のＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞との結合反応性を、蛍光抗体法により以下のように検討した。
１ウェル当たり２×１０５個のＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞を９６ウェルＵ字プレートに分注し、抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１をＦＣＭ用緩衝液（１％ＢＳＡ−ＰＢＳ、０．０２％ＥＤＴＡ、０．０５％ＮａＮ３）にて２０μｇ／ｍＬから５倍希釈で７段階に希釈した抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１を５０μＬ／ウェル、さらに非特異的な染色を防ぐためにヒトイムノグロブリン（ＳＩＧＭＡ社製）を４００μｇ／ｍＬに希釈した抗体溶液を５０μＬ／ウェルでそれぞれ分注し、氷中で３０分間反応した。ＦＣＭ用緩衝液で２回洗浄後、ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ベックマン・コールター社製）をＦＣＭ用緩衝液にて５０倍に希釈した溶液を５０μＬ／ウェルで加えた。遮光し氷中で３０分間反応後、ＦＣＭ用緩衝液で３回洗浄し、フローサイトメーターで蛍光強度を測定した。
結果を第１４図に示した。縦軸には平均蛍光強度（ＭＦＩ）、横軸には、抗体濃度を示した。抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１は、ＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞に、抗体濃度依存的に結合することが明らかとなった。
（１）−２ ヒト癌細胞株に対する結合性
実施例５の（２）−１で検討したヒト癌細胞株の中から、ＰＣ９、ＮＣＩ−Ｈ６９、Ｃａｐａｎ−２、ＢｘＰＣ−３細胞を選択し、本実施例（１）−１に記載の方法を用いて抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１（１０μｇ／ｍＬ）の結合性を測定した。陰性対照としては抗ＣＣＲ４キメラ抗体（ＷＯ０１／６４７５４）を用いた。
結果を第１５図に示した。上記いずれの細胞株に対しても、抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１は結合性を示した。
（２）抗ＰＥＲＰキメラ抗体の補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）
実施例７で作製した抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１のＣＤＣ活性を以下に記載の方法で測定した。
（２）−１ 標的胞溶液の調製
ＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞を遠心分離操作および懸濁により５％のＦＣＳを含むＩＭＤＭ培地［ＩＭＤＭ−（５）培地］で洗浄した後、ＩＭＤＭ−（５）培地によって、細胞濃度を２×１０５細胞／ｍＬに調整し、標的細胞溶液とした。
（２）−２ ヒト補体溶液の調製
ヒト血清凍結乾燥品（Ｈｕｍａｎ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｓｅｒｕｍ；シグマ社製）を脱イオン水にて溶解し、等量のＩＭＤＭ−（５）培地を加えて２倍に希釈してヒト補体溶液とした。
（２）−３ ＣＤＣ活性の測定
９６ウェル平底プレート（住友ベークライト社製）に上記（２）−１で調製した標的細胞溶液の５０μＬ（１×１０４細胞／ウェル）を分注した。次いでＩＭＤＭ−（５）培地で希釈した各濃度の抗体溶液を加え、更に上記（２）−２で調製した補体溶液を５０μＬ添加して全量を１５０μＬとし、３７℃で２時間反応させた。各ウェルに細胞増殖試薬ＷＳＴ−１（ロシュ社製）を１５μＬずつ添加して更に３７℃で４時間反応させ、４５０ｎｍの吸光度（ＯＤ４５０：生細胞数に依存する）を測定した。標的細胞溶液、抗体溶液の代わりにＩＭＤＭ−（５）培地を用いてバックグラウンドの吸光度データを取得し、抗体溶液の代わりにＩＭＤＭ−（５）培地を用いて測定した吸光度データ（抗体濃度０μｇ／ｍＬ）を細胞傷害活性０％として取得した。ＣＤＣ活性は次式により求めた。
（式）
ＣＤＣ活性（％）＝（［抗体濃度０μｇ／ｍＬの際の吸光度データ］−［検体の吸光度データ］）／［抗体濃度０μｇ／ｍＬの際の吸光度データ］×１００
結果を第１６図に示した。抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１はＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞に対して濃度依存的にＣＤＣ活性を示し、その活性は抗体濃度依存的であった。
（３）抗ＰＥＲＰキメラ抗体のＡＤＣＣ活性
実施例７で取得した抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１のＡＤＣＣ活性を、以下のようにして測定した。標的細胞には、本実施例の（１）で用いた４種類のＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが発現していることが確認された細胞株、すなわちＰＣ９、ＮＣＩ−Ｈ６９、Ｃａｐａｎ−２、ＢｘＰＣ−３細胞株、並びに陽性対照としてＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞および陰性対照として該ポリペプチドが発現していないＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株を用い、エフェクター細胞溶液の調製にはｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＮＹＣＯＭＥＤ社製）を用いた。
（３）−１ 標的細胞溶液の調製
ＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞の場合にはＩＭＤＭ−（１０）培地、それ以外の癌細胞株ではＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地［ＦＣＳを１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）］を用いて培養した各細胞株を遠心分離操作及び懸濁によりＡＤＣＣ活性測定用培地であるＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（５）［５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）］で洗浄した後、ＡＤＣＣ活性測定用培地によって、細胞濃度を２×１０５細胞／ｍＬに調整し、標的細胞溶液とした。
（３）−２ エフェクター細胞溶液の調製
健常人静脈血５０ｍＬを採取し、ヘパリンナトリウム（清水製薬社製）０．５ｍＬを加え穏やかに混ぜた。これをｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＮＹＣＯＭＥＤ 社製）を用いて添付の使用説明書に従い、単核球（ＰＢＭＣ）画分を分離した。分離したＰＢＭＣ画分は、ＡＤＣＣ活性測定用培地で３回遠心分離して洗浄後、適宜懸濁し、エフェクター細胞溶液とした。
（３）−３ ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）に上記（３）−１で調製した標的細胞溶液の５０μＬ（１×１０４細胞／ウェル）を分注した。次いで（３）−２で調製したエフェクター細胞溶液を５０μＬ（ＰＥＲＰ／ＣＨＯ細胞をターゲットとした場合はエフェクター細胞と標的細胞の比が１５：１に、その他の場合は２０：１になるように希釈したもの）を添加した。更に、抗ＰＥＲＰキメラ抗体をＡＤＣＣ活性測定用培地で希釈し、各最終濃度０．００１〜１０μｇ／ｍＬとなるように加えて全量を１５０μＬとし、３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を、ＣｙｔｏＴｏｘ９６ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、添付の説明書にしたがって吸光度データを取得することで測定した。標的細胞自然遊離の吸光度データは、エフェクター細胞溶液および抗体溶液の代わりにＡＤＣＣ活性測定用培地を用いて、また、エフェクター細胞自然遊離の吸光度データは、標的細胞溶液および抗体溶液の代わりにＡＤＣＣ活性測定用培地を用いて、上記と同様の操作を行うことで取得した。標的細胞全遊離の吸光度データは、抗体溶液およびエフェクター細胞溶液の代わりにＡＤＣＣ活性測定用培地を用い、反応終了の４５分前に１５μＬの９％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶液を添加して反応させ、上記と同様の操作を行うことで取得した。ＡＤＣＣ活性は次式により求めた。
（式）
ＡＤＣＣ活性（％）＝｛（検体の吸光度−エフェクター細胞自然遊離の吸光度−標的細胞自然遊離の吸光度）／（標的細胞全遊離の吸光度−標的細胞自然遊離の吸光度｝×１００
結果を第１７図に示した。標的細胞として用いた全細胞株のうち、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが発現していることが確認されているＰＥＲＰ／ＣＨＯ、ＰＣ９、ＮＣＩ−Ｈ６９、Ｃａｐａｎ−２およびＢｘＰＣ−３細胞株に対して、抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１はＡＤＣＣ活性を有していた。一方、陰性対照として用いたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞株に対して、抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１はＡＤＣＣ活性を有していなかった。
抗ＰＥＲＰキメラ抗体のｉｎ ｖｉｖｏ薬効試験
肺癌および膵癌について、マウスゼノグラフト初期癌モデルの系で抗ＰＥＲＰキメラ抗体のｉｎ ｖｉｖｏ薬効試験を以下のようにして検討した。
癌細胞移植前日にＳＣＩＤマウス（日本クレア、雄、６週齢）の体重を測定し、抗体非投与群、抗体投与群０．１、１、１０ｍｇ／ｋｇの計４群（１群６匹）に群分けした。常法により培養したＰＥＲＰ陽性の肺癌細胞株ＰＣ−９またはＰＥＲＰ陽性の膵癌細胞株ＢｘＰＣ−３を５×１０７個／ｍＬでＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁し、マウスの右脇腹皮内にそれぞれ１００μＬ移植した。マウス１尾あたりの細胞数は５×１０６個となる。移植同日から、クエン酸緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、ｐＨ６）で希釈した抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１を１００μＬ、１週間に２回の頻度で計８回静脈内投与した。抗体非投与群はクエン酸緩衝液のみを投与した。
腫瘍を移植した日を０日目とし、経日的にノギスによる腫瘍径の測定を行い、次式により腫瘍体積を算出した。
（式）
腫瘍体積＝短径×短径×長径×０．５
肺癌および膵癌モデルにおける各群の腫瘍体積平均値の経日的推移をそれぞれ第１８図および第１９図に示す。
第１８図に示した肺癌モデルにおいては、２２日目以降に非投与群マウスの腫瘍死が始まったため、腫瘍体積の評価は２２日目で終了した。
肺癌モデルにおいて、抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１の１、１０ｍｇ／ｋｇ投与群で、非投与群と比較して顕著な腫瘍生着阻害および腫瘍増殖抑制効果が認められた。
第１９図に示した膵癌モデルにおいては、１、１０ｍｇ／ｋｇ投与群で顕著な腫瘍生着阻害および腫瘍増殖抑制効果が認められ、さらに０．１ｍｇ／ｋｇ投与群でも有意な阻害効果が認められた。
以上より、肺癌および膵癌をターゲットとした初期癌モデルにおいて、抗ＰＥＲＰキメラ抗体ＫＭ３４８１が抗腫瘍効果を有することが明らかとなった。
抗ＰＥＲＰヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製
（１）抗ＰＥＲＰヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の設計
まず、ＰＥＲＰに対するヒト型ＣＤＲ移植抗体（以下、抗ＰＥＲＰＣＤＲ移植抗体と表記する）のＶＨのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。
実施例７の（１）−３で同定した抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１のＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するためのヒト抗体のＶＨのＦＲのアミノ酸配列を選択した。カバットらは、既知の様々なヒト抗体のＶＨをそのアミノ酸配列の相同性から３種類のサブグループ（ＨＳＧ Ｉ〜ＩＩＩ）に分類し、更に、それらのサブグループ毎に共通配列を報告している［ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］。それら共通配列は、ヒトにおいてより免疫原性が低下する可能性が考えられることから、それら共通配列を基に抗ＰＥＲＰＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列を設計することとした。より結合活性の高い抗ＰＥＲＰＣＤＲ移植抗体を作製するために、設計にあたってはヒト抗体のＶＨの３種類のサブグループの共通配列のＦＲのアミノ酸配列のうち、ＫＭ３４１１のＶＨのＦＲのアミノ酸配列と最も高い相同性を有するＦＲのアミノ酸配列を選択した。第４表には、相同性の検索結果を示した。第４表に示したように、ＫＭ３４１１のＶＨ領域のＦＲのアミノ酸配列はサブグループＩＩと最も高い相同性を有していた。
Figure 0005651893
 以上の結果から、ヒト抗体のＶＨのサブグループＩＩの共通配列のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１のＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列を移植した。しかし、配列番号１２に記載のＫＭ３４１１のＶＨのアミノ酸配列中の４７番目のＩｌｅ、８６番目のＩｌｅ、１００番目のＧｌｎ、１０７番目のＧｌｕ、および１１１番目のＴｈｒは、カバットらがあげるヒト抗体ＦＲのアミノ酸配列の相当する部位において、最も使用される頻度が高いアミノ酸残基ではないが、比較的高い頻度で使用されるアミノ酸残基であるため、上記のＫＭ３４１１のアミノ酸配列で認められるアミノ酸残基を用いることとした。このようにして、配列番号２５で表される、抗ＰＥＲＰＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ０を設計した。
次に、抗ＰＥＲＰＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。
実施例７の（１）−３で同定した抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１のＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するためのヒト抗体のＶＬのＦＲのアミノ酸配列を選択した。カバットらは、既知の様々なヒト抗体のＶＬをそのアミノ酸配列の相同性から４種類のサブグループ（ＨＳＧ Ｉ〜ＩＶ）に分類し、更に、それらのサブグループ毎に共通配列を報告している［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］。そこでＶＨの場合と同様にして、ヒト抗体のＶＬの４種類のサブグループの共通配列のＦＲのアミノ酸配列のうち、ＫＭ３４１１のＶＬのＦＲのアミノ酸配列と最も高い相同性を有するＦＲのアミノ酸配列を選択した。第５表には、相同性の検索結果を示した。第５表に示したように、ＫＭ３４１１のＶＬのＦＲのアミノ酸配列はサブグループＩと最も高い相同性を有していた。
Figure 0005651893
 以上の結果から、ヒト抗体のＶＬのサブグループＩの共通配列のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１のＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、配列番号２６に記載の抗ＰＥＲＰＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０を設計した。
上記で設計した抗ＰＥＲＰＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ０およびＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０は、選択したヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列に抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１のＣＤＲのアミノ酸配列のみを移植した配列であるが、一般に、ヒト型ＣＤＲ移植抗体を作製する場合には、単なるヒト抗体のＦＲへのマウス抗体のＣＤＲのアミノ酸配列の移植のみでは結合活性が低下してしまうことが多い。結合活性の低下を回避するため、ヒト抗体とマウス抗体で異なっているＦＲのアミノ酸残基のうち、結合活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基を、ＣＤＲのアミノ酸配列の移植とともに、改変することが行われている。そこで、本実施例においても、結合活性に影響を与えると考えられるＦＲのアミノ酸残基を以下のようにして同定した。
まず、上記で設計した抗ＰＥＲＰＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ０およびＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０よりなる抗体Ｖ領域（ＨＶ０ＬＶ０）の三次元構造をコンピューターモデリングの手法を用いて構築した。三次元構造座標作製に関してはソフトウェアＡｂＭ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社製）を、三次元構造の表示についてはソフトウェアＰｒｏ−Ｅｘｐｌｏｒｅ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社製）あるいはＶｉｅｗｅｒＬｉｔｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ社製）を用いてそれぞれ添付の使用説明書に従い、行った。また、抗ＰＥＲＰマウスモノクローナル抗体ＫＭ３４１１のＶ領域の三次元構造のコンピューターモデルも同様にして構築した。更に、ＨＶ０ＬＶ０のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列において、抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１と異なっているアミノ酸残基について順次、抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１の相当する位置に見られるアミノ酸残基へ改変したアミノ酸配列からなる三次元構造モデルを同様にして構築し、抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１、ＨＶ０ＬＶ０および改変体のＶ領域の三次元構造を比較した。
その結果、ＨＶ０ＬＶ０のＦＲのアミノ酸残基の中で抗原結合部位の三次元構造を変化させ、抗体の結合活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基として、ＨＶ０では２７番目のＧｌｙ、３０番目のＳｅｒ、４１番目のＰｒｏ、４４番目のＬｙｓ、４５番目のＧｌｙ、７２番目のＶａｌ、および９７番目のＡｌａを、ＬＶ０では３番目のＧｌｎ、５番目のＴｈｒ、３５番目のＴｙｒ、４２番目のＡｌａ、４６番目のＬｅｕ、７０番目のＰｈｅ、および７７番目のＬｅｕをそれぞれ選択した。これらの選択したアミノ酸残基のうち、少なくとも１つ以上のアミノ酸配列をマウス抗体ＫＭ３４１１の同じ部位に存在するアミノ酸残基へ改変し、様々な改変を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬを設計した。
（２）抗ＰＥＲＰヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨをコードするｃＤＮＡの構築
本実施例（１）で設計した抗ＰＥＲＰヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ０をコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲを用いて以下のようにして構築した。
まず、設計したアミノ酸配列と、配列番号１２の１〜１８番目に示される抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１のＨ鎖の分泌シグナル配列とを繋げて完全な抗体アミノ酸配列とした。次に、該アミノ酸配列を遺伝子コドンに変換した。１つのアミノ酸残基に対して複数の遺伝子コドンが存在する場合は、抗体の遺伝子の塩基配列に見られる使用頻度［ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］を考慮し、対応する遺伝子コドンを決定した。決定した遺伝子コドンを繋げて、完全な抗体Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列を設計し、更に５’末端と３’末端にＰＣＲ反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列（ヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列も含む）を付加した。設計した塩基配列を５’末端側から約１００塩基ずつ計６本の塩基配列に分け（隣り合う塩基配列は、その末端に約２０塩基の重複配列を有するようにする）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順で、合成オリゴヌクレオチドを合成した。
各オリゴヌクレオチドを最終濃度が０．１μｍｏｌ／Ｌとなるように５０μＬの反応液に加えて、０．５μｍｏｌ／Ｌ Ｍ１３ ｐｒｉｍｅｒ ＲＶ（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ社製）、０．５μｍｏｌ／Ｌ Ｍ１３ ｐｒｉｍｅｒ Ｍ４（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ社製）および１単位のＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を用いて、ＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに添付の使用説明書に従い、ＰＣＲを行った。この際の反応条件は使用説明書に記された条件（９４℃ ３０秒間、５０℃ ３０秒間、７４℃ ６０秒間のサイクルを３０サイクル）に従った。該反応液をエタノール沈殿した後、滅菌水に溶解し、適当な制限酵素処理を行った後に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に連結した。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、形質転換株の株よりプラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列を解析した結果、目的の塩基配列を有するプラスミドを得た。
次に、本実施例（１）で設計したＦＲのアミノ酸残基の改変は、変異を有する合成オリゴヌクレオチドを作製し、上記のＰＣＲを行うか、上記で作製したＨＶ０をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡを鋳型として変異を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行い、増幅断片を単離することにより行った。改変後のアミノ酸残基の遺伝子コドンについては、抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１に見られる遺伝子コドンとなるように、ＤＮＡ配列の設計を行い、増幅断片遺伝子を取得した。
（３）抗ＰＥＲＰヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＬをコードするｃＤＮＡの構築
本実施例（１）で設計した抗ＰＥＲＰヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０をコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲを用いて以下のようにして構築した。
まず、設計したアミノ酸配列と、配列番号１４の１〜２２番目に示される抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１のＬ鎖の分泌シグナル配列とを繋げて完全な抗体アミノ酸配列とした。次に、該アミノ酸配列を遺伝子コドンに変換した。１つのアミノ酸残基に対して複数の遺伝子コドンが存在する場合は、抗体の遺伝子の塩基配列に見られる使用頻度［ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］を考慮し、対応する遺伝子コドンを決定した。決定した遺伝子コドンを繋げて、完全な抗体Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列を設計し、更に５’末端と３’末端にＰＣＲ反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列（ヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列も含む）を付加した。設計した塩基配列を５’末端側から約１００塩基ずつ計６本の塩基配列に分け（隣り合う塩基配列は、その末端に約２０塩基の重複配列を有するようにする）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順で、合成オリゴヌクレオチドを合成した。
各オリゴヌクレオチドを最終濃度が０．１μｍｏｌ／Ｌとなるように５０μＬの反応液に加えて、０．５μｍｏｌ／Ｌ Ｍ１３ ｐｒｉｍｅｒ ＲＶ（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ社製）、０．５μｍｏｌ／Ｌ Ｍ１３ ｐｒｉｍｅｒ Ｍ４（Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ社製）および１単位のＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を用いて、ＫＯＤ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅに添付の使用説明書に従い、上記（３）と同様にＰＣＲを行った。反応液をエタノール沈殿した後、滅菌水に溶解し、適当な制限酵素処理を行った後に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に連結した。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、形質転換株よりプラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列を解析した結果、目的の塩基配列を有するプラスミドを得た。
次に、本実施例（１）で設計したＦＲのアミノ酸残基の改変は、変異を有する合成オリゴヌクレオチドを作製し、上記のＰＣＲを行うか、上記で作製したＬＶ０をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡを鋳型として変異を有する合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行い、増幅断片を単離することにより行った。改変後のアミノ酸残基の遺伝子コドンについては、抗ＰＥＲＰマウス抗体ＫＭ３４１１で見られる遺伝子コドンとなるように行った。
（４）抗ＰＥＲＰヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
ＷＯ９７／１０３５４に記載のヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３の適当な位置に本実施例（２）および（３）で得られたＨＶ０およびＬＶ０をコードするそれぞれのｃＤＮＡ、あるいはそれらの改変体をコードするｃＤＮＡを挿入し、各種抗ＰＥＲＰヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築した。
（５）抗ＰＥＲＰヒト型ＣＤＲ移植抗体の動物細胞を用いた安定発現および精製抗体の取得
抗ＰＥＲＰヒト型ＣＤＲ移植抗体の動物細胞を用いた安定発現および培養上清からの抗体の精製は、上記実施例７（２）−２および（３）に記載の方法と同様にして行った。
本発明によれば、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつ該細胞外領域に結合する抗体または抗体断片が提供される。該抗体または該抗体断片は、ＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドの免疫学的検出方法および検出用試薬、該ポリペプチドを発現する細胞の免疫学的検出または測定方法および検出または測定用試薬、並びにＰＥＲＰ遺伝子によりコードされるポリペプチドが関与する疾患の診断薬または治療薬に利用できる。
配列番号３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２５−人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号２６−人工配列の説明：合成ペプチド

Claims (30)

  1. ヒトＰＥＲＰの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつハイブリドーマＫＭ３４１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−８６４３）から生産されるモノクローナル抗体が結合するエピトープと同一のエピトープと結合する遺伝子組換え抗体であって、かつ抗体依存性細胞傷害活性により抗腫瘍活性を示す遺伝子組換え抗体。
  2. 請求項１に記載の遺伝子組換え抗体の抗体断片であって、該抗体断片はヒトＰＥＲＰの細胞外領域の立体構造を特異的に認識し、かつハイブリドーマＫＭ３４１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−８６４３）から生産されるモノクローナル抗体が結合するエピトープと同一のエピトープと結合する、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ｄｉａｂｏｄｙ）およびジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）から選ばれる抗体断片。
  3. ハイブリドーマＫＭ３４１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−８６４３）から生産されるモノクローナル抗体。
  4. 請求項３に記載のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマＫＭ３４１１（ＦＥＲＭ ＢＰ−８６４３）。
  5. 遺伝子組換え抗体が、ヒト化抗体およびヒト抗体から選ばれる遺伝子組換え抗体である、請求項１または２に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
  6. ヒト化抗体がヒト型キメラ抗体およびヒト型相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ；以下、ＣＤＲと表記する）移植抗体から選ばれるヒト化抗体である、請求項５に記載の遺伝子組換え抗体または抗体断片。
  7. 請求項１または３に記載の抗体の重鎖（以下、Ｈ鎖と表記する）可変領域（以下、Ｖ領域と表記する）および軽鎖（以下、Ｌ鎖と表記する）Ｖ領域を含む、請求項６に記載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
  8. 請求項１または３に記載の抗体のＨ鎖Ｖ領域（以下、ＶＨと表記する）およびＬ鎖Ｖ領域（以下、ＶＬと表記する）を含み、かつ、ヒト抗体のＨ鎖定常領域（以下、Ｃ領域と表記する）およびＬ鎖Ｃ領域を含む、請求項７に記載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
  9. 抗体のＶＨが配列番号１２で示されるアミノ酸配列の１９〜１３０番目のアミノ酸配列を含む、請求項７または８に記載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
  10. 抗体のＶＬが配列番号１４で示されるアミノ酸配列の２３〜１２８番目のアミノ酸配列を含む、請求項７または８に記載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
  11. 抗体のＶＨが配列番号１２で示されるアミノ酸配列の１９〜１３０番目のアミノ酸配列を含み、かつ、抗体のＶＬが配列番号１４で示されるアミノ酸配列の２３〜１２８番目のアミノ酸配列を含む、請求項７〜１０のいずれか１項に記載のヒト型キメラ抗体または抗体断片。
  12. 請求項１または３に記載の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを含む、請求項６に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体または抗体断片。
  13. 請求項１または３に記載の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲとヒト抗体のＶＨおよびＶＬのフレームワーク（以下、ＦＲと表記する）を含む、請求項１２に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体または抗体断片。
  14. 請求項１または３に記載の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲとヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲを含み、かつ、ヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域およびＬ鎖Ｃ領域を含む、請求項１２または１３に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体または抗体断片。
  15. 抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１５、１６および１７で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体または抗体断片。
  16. 抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１８、１９および２０で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体または抗体断片。
  17. 抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１５、１６および１７を含み、かつ、抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１８、１９および２０で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載のヒト型ＣＤＲ移植抗体または抗体断片。
  18. 請求項１〜３および５〜１７のいずれか１項に記載の抗体または該抗体断片をコードするＤＮＡ。
  19. 請求項１８に記載のＤＮＡを含有する組換え体ベクター。
  20. 請求項１９に記載の組換え体ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換株。
  21. 請求項４に記載のハイブリドーマまたは請求項２０に記載の形質転換株を培地に培養し、培養物中に請求項１〜３および５〜１７のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を生成蓄積させ、培養物から抗体または抗体断片を採取することを特徴とする請求項１〜３および５〜１７のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片の製造方法。
  22. 請求項１〜３および５〜１７のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を用いる配列番号２で表されるヒトＰＥＲＰポリペプチドの免疫学的検出または測定方法。
  23. 免疫学的検出または測定方法が免疫沈降法である、請求項２２に記載の検出方法。
  24. 請求項１〜３および５〜１７のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を用いる配列番号２で表されるヒトＰＥＲＰポリペプチドが発現する細胞の免疫学的検出または測定方法。
  25. 免疫学的検出または測定方法が蛍光細胞染色法である請求項２４に記載の検出方法。
  26. 請求項１〜３および５〜１７のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を用いる、配列番号２で表されるヒトＰＥＲＰポリペプチドの検出または測定用試薬。
  27. 請求項１〜３および５〜１７のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片を用いる、配列番号２で表されるヒトＰＥＲＰポリペプチドが関与する癌の診断薬。
  28. 請求項１、３および５〜１７のいずれか１項に記載の抗体を有効成分として含有する配列番号２で表されるヒトＰＥＲＰポリペプチドが関与する癌の治療薬。
  29. 配列番号２で表されるヒトＰＥＲＰポリペプチドが関与する癌の診断薬を製造するための、請求項１〜３および５〜１７のいずれか１項に記載の抗体または抗体断片の使用。
  30. 配列番号２で表されるヒトＰＥＲＰポリペプチドが関与する癌の治療薬を製造するための、請求項１、３および５〜１７のいずれか１項に記載の抗体の使用。
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