JP5596894B2

JP5596894B2 - プローブセット、プローブ固定担体及び遺伝子検査方法

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Publication number: JP5596894B2
Application number: JP2006306009A
Authority: JP
Inventors: 英人栗林; 裕人吉井; 寿文福井
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 2006-11-10
Filing date: 2006-11-10
Publication date: 2014-09-24
Anticipated expiration: 2026-11-10
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Description

本発明は、感染による疾患の原因菌の検出および同定に有用な感染症起炎菌であるバクテロイデス属菌の遺伝子を検出するプローブセット、これらを担体に固定したプローブ固定担体及びこれらを用いた遺伝子検査方法、ならびに遺伝子検査のためのキットに関する。

検体中の、感染症の原因菌をより迅速かつ確実に検出するための試薬並びに方法が従来より提案されてきている。例えば特許文献１には、カンジダ症及びアスペルギルス症の起炎菌を検出するためのプローブ及びプライマーとして用い得る特定の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及びそれを用いた対象菌の検出方法が開示されている。また、同特許文献には、複数の対象菌を共通にＰＣＲで増幅するためのプライマーセットが開示されている。これらのプライマーは検体中の複数の対象となる真菌由来の核酸断片をＰＣＲで増幅するために用いられるものである。これらのプライマーにより増幅された核酸断片中における各菌に特異的な配列部分の有無を、各菌に固有のプローブを用いるハイブリダイゼーションアッセイで検出することで、検体中の真菌の菌種を同定することができる。

一方、複数の異なる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを同時的に検出可能な方法として、当該塩基配列の各々に相補的な配列を有するプローブを固相上に隔離して配置したプローブアレイを用いる方法が知られている（特許文献２）。
特開平８−８９２５４号公報特開２００４−３１３１８１号公報

しかし、試料中に含まれる感染症起炎菌の遺伝子を特異的に検出するプローブを設定することは決して容易なことではない。即ち、試料中には、検出対象たる感染症起炎菌の遺伝子だけではなく、他の感染症起炎菌の遺伝子も存在している可能性がある。このような状況においても検出対象外の感染症起炎菌遺伝子の存在による影響（クロスコンタミネーション）を極力抑えつつ検出対象たる感染症起炎菌遺伝子を特異的に検出可能なプローブを設定することは、決して容易なことではないのである。このような状況の下、本願発明者らは、下記の感染症起炎菌について、複数の菌の遺伝子が存在する試料からもクロスコンタミネーションをより低いレベルに抑えつつ当該感染症起炎菌遺伝子を精度良く検出することができるプローブを得ることを目的として検討を行った。その結果として当該感染症起炎菌遺伝子を精度良く検出可能なプローブの複数を得るに至った。
［菌名］
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（バクテロイデス）
本発明の第１の目的は、様々な菌が同時に存在しうる試料の中から、対象となる菌を正確に同定することのできるプローブセットを提供することを目的とする。

また本発明の他の目的は、様々な菌が同時に存在しうる検体の中から、対象となる菌を正確に同定することのできるプローブ固定担体を提供することを目的とする。

更にまた本発明の他の目的は、検体中に様々な菌が含まれている場合に、それらから対象となる菌をより迅速に、且つより正確に検出することのできる感染症起炎菌の遺伝子検査方法およびそのためのキットを提供することを目的とする。

本発明にかかる感染症起炎菌であるバクテロイデス属菌の遺伝子を特異的に検出するためのプローブセットは、下記の（１）から選択される少なくとも１つのプローブと、下記の（２）から選択される少なくとも１つのプローブと、下記の（３）から選択される少なくとも１つのプローブとを含み、該少なくとも３つのプローブのそれぞれとの反応を示すシグナルを検出するために用いられることを特徴とするプローブセットである。
（１）ＣＧＡＴＧＧＡＴＡＧＧＧＧＴＴＣＴＧＡＧＡＧＧＡＡ（配列番号３５）で表される塩基配列からなるプローブ及びその相補配列からなるプローブ、
（２）ＴＧＣＧＧＣＴＣＡＡＣＣＧＴＡＡＡＡＴＴＧＣＡＧＴ（配列番号３６）で表される塩基配列からなるプローブ及びその相補配列からなるプローブ、
（３）ＴＧＴＧＧＣＴＣＡＡＣＣＡＴＡＧＡＡＴＴＧＣＣＧＴ（配列番号３７）で表される塩基配列からなるプローブ及びその相補配列からなるプローブ。

本発明のプローブ固定担体は、上記のプローブセットの各プローブが固相担体上に固定され、各プローブが互いに隔離して配置されていることを特徴とするプローブ固定担体である。

本発明のプローブ固定担体を用いた検体中でのバクテロイデス属菌の遺伝子の検出方法は、
（i）本発明のプローブ固定担体と検体とを反応させる工程と、
（ii）前記プローブ固定担体上にプローブと前記検体中の核酸との反応の有無を検出する工程と、
を有することを特徴とするバクテロイデス属菌の遺伝子の検出方法である。

本発明のバクテロイデス属菌遺伝子の検出用のキットは、上記のプローブセットと、プローブと標的核酸との反応を検出するための試薬と、を有することを特徴とするバクテロイデス属菌遺伝子菌検出用のキットである。

本発明によれば、検体が、上記に示した原因菌に感染している場合に、上記に示した菌以外の菌と同時に複合的に感染している場合であっても、該検体から上記に示した菌をより迅速かつ正確に同定することができる。特に、クロスコンタミネーションの可能性の高いＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉと精度良く区別してバクテロイデス属菌の検出を行なうことが可能となる。

以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。

以下の実施形態では、感染症の起炎菌同定の為のオリゴヌクレオチドプローブ（以下単にプローブという）及びその２以上の組み合わせからなるプローブセットが提供される。このプローブまたはプローブセットを用いることで、感染により炎症を引き起こす以下の菌の検出が可能である。
［菌名］
Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属
上記菌の遺伝子のうち１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を検出し得るプローブには、以下の各塩基配列からなるものが含まれる。
（Ａ）ＣＧＡＴＧＧＡＴＡＧＧＧＧＴＴＣＴＧＡＧＡＧＧＡＡ（配列番号３５）で表される塩基配列からなるプローブ、
（Ｂ）ＴＧＣＧＧＣＴＣＡＡＣＣＧＴＡＡＡＡＴＴＧＣＡＧＴ（配列番号３６）で表される塩基配列からなるプローブ、
（Ｃ）ＴＧＴＧＧＣＴＣＡＡＣＣＡＴＡＧＡＡＴＴＧＣＣＧＴ（配列番号３７）で表される塩基配列からなるプローブ、
（Ｄ）配列番号３５の塩基配列の相補配列からなるプローブ、
（Ｅ）配列番号３６の塩基配列の相補配列からなるプローブ、
（Ｆ）配列番号３７の塩基配列の相補配列からなるプローブ、
（Ｇ）配列番号３５の塩基配列に、前記プローブとしての機能を保持できる範囲内で、塩基の欠失、置換もしくは付加がなされた変異配列からなるプローブ、
（Ｈ）配列番号３６の塩基配列に、前記プローブとしての機能を保持できる範囲内で、塩基の欠失、置換もしくは付加がなされた変異配列からなるプローブ、
（Ｉ）配列番号３７の塩基配列に、前記プローブとしての機能を保持できる範囲内で、塩基の欠失、置換もしくは付加がなされた変異配列からなるプローブ、
（Ｊ）配列番号３５の塩基配列の相補配列に、前記プローブとしての機能を保持できる範囲内で、塩基の欠失、置換もしくは付加がなされた変異配列からなるプローブ、
（Ｋ）配列番号３６の塩基配列の相補配列に、前記プローブとしての機能を保持できる範囲内で、塩基の欠失、置換もしくは付加がなされた変異配列からなるプローブ、
（Ｌ）配列番号３７の塩基配列の相補配列に、前記プローブとしての機能を保持できる範囲内で、塩基の欠失、置換もしくは付加がなされた変異配列からなるプローブ。

これらのプローブの２つ以上を用いてプローブセットを構成することができる。

上記の変異配列は、プローブとしての機能を損なわない範囲内、すなわち、検出対象としての標的核酸配列にハイブリダイズしてこれを検出可能な範囲内での変異を有するものである。なかでも、ストリンジェントな条件で検出対象としての標的核酸配列にハイブリダイズし得る範囲での変異を有することが好ましい。変異の範囲を規定するハイブリダイゼーションの好ましい条件としては、後述する実施例における条件を挙げることができる。なお、ここでいう検出対象は、ハイブリダイゼーションを行う試料中に含まれるもので、感染症起炎菌に特有な塩基配列そのものであってもよいし、この特有な塩基配列の相補配列であってもよい。更に、かかる変異としては、１から数個の塩基の欠失、置換または付加がプローブ機能を保持する範囲内で行われた変異配列を挙げることができる。

これらのプローブによれば、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をコーディングしているゲノム部分より、当該菌に対し非常に特異性が高く、また、それぞれのプローブ配列でばらつきがなく、十分なハイブリダイゼーション感度が期待できるようになった。これらのプローブは、その１種以上を担体に固定した状態での検体とのハイブリダイゼーション反応において、安定なハイブリッド体を形成し、良好な結果を与えるように設計されている。

さらに本発明にかかる感染症起炎菌検出用プローブが固定されたプローブ固定担体（例えばＤＮＡチップ）は、担体の所定位置にプローブを供給し、固定することにより得ることができる。担体へのプローブの供給には、種々の方法が利用できる。例えば、プローブが化学結合（共有結合など）により担体に固定可能な状態としておき、これを含む液体をインクジェット法により担体の所定位置に付与する方法が好適に利用できる。これにより、プローブが担体から剥がれにくくなるうえ、感度が向上するという付帯的な効果も得られる。つまり、従来より一般的に用いられるスタンフォード法と呼ばれるスタンピング法によりＤＮＡチップを作成した場合、塗布したＤＮＡが剥がれやすい場合があるという欠点があった。また、ＤＮＡチップの作成方法としては、担体表面上でのＤＮＡ合成によりプローブを配置する方法がある（例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＤＮＡチップ等）。この担体上でのプローブを合成する方法においては、プローブ配列ごとの合成量を均一に制御することが難しい為に、各プローブの固定領域（スポット）ごとにプローブの固定量が大幅に異なる場合が生じ易い。そのような各プローブの固定量にばらつきがあると、それを用いた検出結果に対する正確な評価ができない場合が生じる。このような観点から、本発明にかかるプローブ担体は、上述したインクジェット法を利用して作成されることが好ましい。上述したインクジェット法によれば、プローブが担体に安定に固定され剥がれにくく、高感度と高精度の検出ができるプローブ担体を効率良く提供できるという利点がある。

また、前記配列番号３５乃至３７及びそれらの相補配列からなる群から選ばれる少なくとも２つのプローブを用いてプローブセットを構成してもよい。この場合、バクテロイデス属菌の遺伝子の検出精度のより一層の向上を図ることができる。

本発明においては、先に挙げた（Ａ）〜（Ｆ）から選択される２種以上を少なくとも用いてプローブセットが構成される。以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。

本発明のプローブを担体に固定したプローブ担体（例えば、ＤＮＡチップ）を用いた検査対象としての試料には、ヒト、家畜等の動物由来のものがある。例えば、血液、髄液、喀痰、胃液、膣分泌物、口腔内粘液等の体液、尿及び糞便のような排出物等細菌が存在すると思われるあらゆるものが検査対象となる。また、食中毒、汚染の対象となる食品、飲料水及び温泉水のような環境中の水等、または空気清浄機等のフィルタなど、細菌による汚染が引き起こされる可能性のある媒体全てが検査対象として挙げられる。さらに、輸出入時における検疫等の動植物も検体の対象となる。

上記のような試料がＤＮＡチップとの反応にそのまま利用できる場合には、それを検体としてＤＮＡチップと反応させて、その結果を分析する。また、試料をそのままＤＮＡチップと反応させることができない場合には、標的物質の抽出、精製などの必要に応じた処理を試料に行なって得たサンプルを検体としてＤＮＡチップと反応させる。例えば、標的核酸が含まれている場合にこれを含むと想定される抽出物を試料から調整し、更に必要に応じて洗浄や希釈などの処理を行なって検体溶液とし、これをＤＮＡチップと反応させてもよい。更に、ＰＣＲ増幅処理などを含む各種の増幅処理を行って標的核酸が検体に含まれている場合にこれを増幅してＤＮＡチップと反応させる検体としてもよい。このような増幅核酸検体には、以下のものがある。
（ａ）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子検出用に設計されたＰＣＲ反応用プライマーを用いて調整された増幅検体。
（ｂ）ＰＣＲ増幅物を元にさらにＰＣＲ反応等を行なって調整された検体。
（ｃ）ＰＣＲ以外の増幅方法により調整された検体。
（ｄ）可視化のために各種標識方法により標識された検体。

また、ＤＮＡチップなどのプローブ固定担体の調製に用いられる担体としては、目的とする固相−液相反応を行なうことができる特性を満たすものであればよい。例えば、ガラス基板、プラスチック基板、シリコンウェハー等の平面基板、凹凸のある三次元構造体、ビーズのような球状のもの、棒状、紐状、糸状のもの等を担体として用いることができる。さらに、その担体の表面はプローブの固定化が可能なように処理されたものであってもよい。特に、表面に化学反応が可能となるように官能基を導入したものは、ハイブリダイゼーション反応の過程でプローブが安定に結合している為に、再現性の点で好ましい形態である。

プローブの固定化には種々の方法が利用できる。一例として、マレイミド基とチオール（−ＳＨ）基との組み合わせを用いる方法が挙げられる。この方法では、プローブの末端にチオール（−ＳＨ）基を結合させておき、担体（固相）表面がマレイミド基を有するように処理しておく。これにより、担体表面に供給されたプローブのチオール基と担体表面のマレイミド基とが反応して共有結合が形成されプローブが固定化される。

マレイミド基の導入には、まず、ガラス基板にアミノシランカップリング剤を反応させ、次にそのアミノ基とＥＭＣＳ試薬（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ：Ｄｏｊｉｎ社製）との反応によりマレイミド基を導入する方法が利用できる。ＤＮＡへのチオール基の導入は、ＤＮＡ自動合成機上５’−Ｔｈｉｏｌ−ＭｏｄｉｆｉｅｒＣ６（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いることにより行なうことができる。固定化に利用する官能基の組み合わせとしては、上記したチオール基とマレイミド基の組み合わせ以外にも、例えばエポキシ基（固相上）とアミノ基（核酸プローブ末端）の組み合わせ等が挙げられる。また、各種シランカップリング剤による表面処理も有効であり、該シランカップリング剤により導入された官能基と反応可能な官能基を導入したプローブが用いられる。さらに、官能基を有する樹脂をコーティングする方法も利用可能である。

本発明にかかるプローブ固定担体を用いた感染症起炎菌遺伝子の検出は以下の工程を有する遺伝子検出方法により行なうことができる。
（i）本発明のかかるプローブを固定したプローブ固定担体と検体とを反応させる工程。
（ii）プローブ固定担体上のプローブと検体中の核酸との反応の有無を検出する工程。
（iii）プローブと検体中の核酸の反応が検出される場合に、検体中の核酸と反応したプローブを特定し、プローブの塩基配列に基づいて検体中に含まれる感染症起炎菌遺伝子を特定する工程。

プローブ固定担体に固定するプローブは、先に挙げた（Ａ）乃至（Ｌ）の少なくとも１種であり、担体には検査目的に応じてその他のプローブ（バクテロイデス属以外の菌種を検出するためのプローブ）が固定されていてもよい。この場合、その他のプローブとしてバクテロイデス属以外の菌種をクロスコンタミネーションを起こすことなく検出可能なプローブを用いることで複数菌種の精度良い同時検出が可能となる。

更に、先に述べたとおり、検体中に含まれる感染症起炎菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列をＰＣＲで増幅させてこれをプローブ担体と反応させるサンプルとする場合には、感染症起炎菌の検出用プライマーセットを用いることができる。このプライマーセットとしては、以下の（１）乃至（２１）に挙げるオリゴヌクレオチドから選択される１種以上及び（２２）乃至（２８）に挙げるオリゴヌクレオチドから選択される１種以上を含むものが好適であり、更に好ましくは（１）乃至（２８）に挙げる全種のオリゴヌクレオチドを含むものが好適である。
（１）５’ ｇｃｇｇｃｇｔｇｃｃｔａａｔａｃａｔｇｃａａｇ３’（配列番号１）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（２）５’ ｇｃｇｇｃａｇｇｃｃｔａａｃａｃａｔｇｃａａｇ３’（配列番号２）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（３）５’ ｇｃｇｇｃａｇｇｃｔｔａａｃａｃａｔｇｃａａｇ３’（配列番号３）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（４）５’ ｇｃｇｇｔａｇｇｃｃｔａａｃａｃａｔｇｃａａｇ３’（配列番号４）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（５）５’ ｇｃｇｇｃｇｔｇｃｔｔａａｃａｃａｔｇｃａａｇ３’（配列番号５）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（６）５’ ｇｃｇｇｇａｔｇｃｃｔｔａｃａｃａｔｇｃａａｇ３’（配列番号６）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（７）５’ ｇｃｇｇｃａｔｇｃｃｔｔａｃａｃａｔｇｃａａｇ３’（配列番号７）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（８）５’ ｇｃｇｇｃａｔｇｃｔｔａａｃａｃａｔｇｃａａｇ３’（配列番号８）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（９）５’ ｇｃｇｇｃｇｔｇｃｔｔａａｔａｃａｔｇｃａａｇ３’（配列番号９）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（１０）５’ ｇｃｇｇｃａｇｇｃｃｔａａｔａｃａｔｇｃａａｇ３’（配列番号１０）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（１１）５’ ｇｃｇｇｇａｔｇｃｔｔｔａｃａｃａｔｇｃａａｇ３’（配列番号１１）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（１２）５’ ｇｃｇｇｃｇｔｇｃｃｔａａｃａｃａｔｇｃａａｇ３’（配列番号１２）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（１３）５’ ｇｃｇｇｃｇｔｇｃａｔａａｃａｃａｔｇｃａａｇ３’（配列番号１３）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（１４）５’ ｇｃｇｇｃａｔｇｃｃｔａａｃａｃａｔｇｃａａｇ３’（配列番号１４）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（１５）５’ ｇｃｇｇｃｇｃｇｃｃｔａａｃａｃａｔｇｃａａｇ３’（配列番号１５）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（１６）５’ ｇｃｇｇｃｇｃｇｃｔｔａａｃａｃａｔｇｃａａｇ３’（配列番号１６）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（１７）５’ ｇｃｇｔｃａｔｇｃｃｔａａｃａｃａｔｇｃａａｇ３’（配列番号１７）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（１８）５’ ｇｃｇａｔａｇｇｃｔｔａａｃａｃａｔｇｃａａｇ３’（配列番号１８）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（１９）５’ ｇｃｇａｃａｇｇｃｔｔａａｃａｃａｔｇｃａａｇ３’（配列番号１９）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（２０）５’ ｇｃｔａｃａｇｇｃｔｔａａｃａｃａｔｇｃａａｇ３’（配列番号２０）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（２１）５’ ａｃａｇａａｔｇｃｔｔａａｃａｃａｔｇｃａａｇ３’（配列番号２１）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（２２）５’ ａｔｃｃａｇｃｃｇｃａｃｃｔｔｃｃｇａｔａｃ３’（配列番号２２）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（２３）５’ ａｔｃｃａａｃｃｇｃａｇｇｔｔｃｃｃｃｔａｃ３’（配列番号２３）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（２４）５’ ａｔｃｃａｇｃｃｇｃａｇｇｔｔｃｃｃｃｔａｃ３’（配列番号２４）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（２５）５’ ａｔｃｃａｇｃｃｇｃａｃｃｔｔｃｃｇｇｔａｃ３’（配列番号２５）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（２６）５’ ａｔｃｃａｇｃｇｃｃａｇｇｔｔｃｃｃｃｔａｇ３’（配列番号２６）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（２７）５’ ａｔｃｃａｇｃｃｇｃａｇｇｔｔｃｔｃｃｔａｃ３’（配列番号２７）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（２８）５’ ａｔｃｃａｇｃｃｇｃａｃｇｔｔｃｃｃｇｔａｃ３’（配列番号２８）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。

以上説明したプローブと、検体中の核酸とプローブとの反応を検出するための試薬とを少なくとも用いて感染症起炎菌検出用のキットを構成することができる。このキットにおけるプローブは上述したプローブ固体担体として提供されていることが好ましい。また、検出用試薬には、反応を検出するための標識や、前処理としての増幅を行う場合のプライマーが含まれる。

以下、バクテロイデス属菌を検出するための感染症起炎菌検出用プローブを用いた実施例により、本発明を更に詳細に説明する。
（実施例１）
以下の実施例では、２ＳｔｅｐＰＣＲ法を用いた微生物の検出について説明する。
［１．プローブＤＮＡの準備］
バクテロイデス属菌検出用プローブの塩基配列として、表１に示す核酸配列を設計した。具体的には、バクテロイデス属菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をコーディングしているゲノム部分より、これらの塩基配列を選択した。これらのプローブ塩基配列群は、当該菌に対して非常に特異性が高く、十分かつそれぞれのプローブ塩基配列でばらつきのないハイブリダイゼーション感度が期待できるように設計されている。なお、プローブとしては、表１に示す塩基配列からなるプローブの他に、各塩基配列を含む２０から３０程度の塩基長を有するプローブも利用可能である。この場合、表１で規定される塩基配列以外の部分については検出精度に影響のない塩基配列を有していることが必要である。

表１中に示した塩基配列を有するプローブには、ＤＮＡチップに固定するための官能基として、合成後、定法に従って核酸の５’末端にチオール基を導入した。官能基の導入後、精製し、凍結乾燥した。凍結乾燥した内部標準用プローブは、−３０℃の冷蔵庫に保存した。

［２．ＰＣＲプライマーの準備］
［２−１．検体増幅用ＰＣＲプライマーの準備］
起炎菌検出用の為の１６ｓｒＲＮＡ遺伝子（標的遺伝子）増幅用ＰＣＲプライマーとして以下の表２に示す核酸配列を設計した。具体的には、１６ｓｒＲＮＡをコーディングしているゲノム部分を特異的に増幅するプローブセット、つまり約１４００〜１７００塩基長の１６ｓｒＲＮＡコーディング領域の両端部分で、特異的な融解温度をできるだけ揃えるよう設計されたプライマーを使用した。なお、変異株や、ゲノム上に複数存在する１６ｓｒＲＮＡ遺伝子も同時に増幅できるように複数種類のプライマーが設計されている。なお、起炎菌の１６ｓｒＲＮＡ遺伝子に対して共通にほぼ全長を増幅できるプライマーセットであれば、下記の表２に挙げたプライマーセットに限定する必要はないのは言うまでもない。

上記表２中に示したプライマーは、合成後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製し、Ｆｏｒｗａｒｄプライマーを２１種、Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーを７種それぞれ混合し、それぞれのプライマー濃度が、最終濃度１０ｐｍｏｌ／μｌとなるようにＴＥ緩衝液に溶解した。

［２−２．標識用ＰＣＲプライマーの準備］
上述の検体増幅用のプライマーと同様に、以下の表３に示す配列を持つオリゴヌクレオチドを標識用のプライマーとして使用した。

表３中に示したプライマーには、蛍光色素としてＣｙ３を用いて標識を行なった。
合成後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製し、６種類の標識プライマーを混合し、それぞれの標識プライマー濃度が、最終濃度１０ｐｍｏｌ／μｌとなるようにＴＥ緩衝液に溶解した。

［３．Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ菌ＧｅｎｏｍｅＤＮＡ（モデル検体）の抽出］
［３−１．微生物の培養＆ＧｅｎｏｍｅＤＮＡの抽出］
まず、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属菌である、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ１１０１９）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ（ＪＣＭ５８２７）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ（ＡＴＣＣ８５０３）の３種を、定法に従って培養した。この微生物培養液から、核酸精製キット（ＦａｓｔＰｒｅｐＦＰ１００Ａ・ＦａｓｔＤＮＡＫｉｔ：フナコシ株式会社製）を用いて、各ＧｅｎｏｍｅＤＮＡの抽出と精製を行なった。なお、菌名の後に寄託番号を付している菌は、理化学研究所微生物系統保存施設（ＪＣＭ）またはＡｍｅｒｉｃａｎＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より入手可能である。

［３−２．回収したＧｅｎｏｍｅＤＮＡの検査］
回収された微生物（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属菌）のＧｅｎｏｍｅＤＮＡは、定法に従って、アガロース電気泳動と２６０／２８０ｎｍの吸光度測定を行い、その品質（低分子核酸の混入量、分解の程度）と回収量を検定した。本実施例では、約１０μｇのＧｅｎｏｍｅＤＮＡが回収され、ＧｅｎｏｍｅＤＮＡのデグラデーションやｒＲＮＡの混入は認められなかった。回収したＧｅｎｏｍｅＤＮＡは、最終濃度５０ｎｇ／μｌとなるようにＴＥ緩衝液に溶解し、以下の実施例に使用した。

［４．ＤＮＡチップの作成］
［４−１．ガラス基板の洗浄］
合成石英のガラス基板（サイズ：２５ｍｍ×７５ｍｍ×１ｍｍ、飯山特殊ガラス社製）を耐熱、耐アルカリのラックに入れ、所定の濃度に調製した超音波洗浄用の洗浄液に浸した。一晩洗浄液中で浸した後、２０分間超音波洗浄を行った。続いて基板を取り出し、軽く純水ですすいだ後、超純水中で２０分超音波洗浄をおこなった。次に８０℃に加熱した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中に１０分間基板を浸した。再び純水洗浄と超純水洗浄を行い、ＤＮＡチップ用の石英ガラス基板を用意した。

［４−２．表面処理］
シランカップリング剤ＫＢＭ−６０３（信越シリコーン社製）を、１重量（ｗｔ）％の濃度となるように純水中に溶解させ、２時間室温で攪拌した。続いて、先に洗浄したガラス基板をシランカップリング剤水溶液に浸し、２０分間室温で放置した。ガラス基板を引き上げ、軽く純水で表面を洗浄した後、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥させた。次に乾燥した基板を１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークし、カップリング剤処理を完結させ、基板表面にアミノ基を導入した。次いで、Ｎ−マレイミドカプロイロキシスクシイミド（以下ＥＭＣＳと略す）を、ジメチルスルホキシドとエタノールの１：１混合（容量比）溶媒中に最終濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなるように溶解したＥＭＣＳ溶液を用意した。ＥＭＣＳは、同仁化学研究所社製のＮ−マレイミドカプロイロキシスクシイミド（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏ）である。

ベークの終了したガラス基板を放冷し、調製したＥＭＣＳ溶液中に室温で２時間浸した。この処理により、シランカップリング剤によって表面に導入されたアミノ基とＥＭＣＳのスクシイミド基が反応し、ガラス基板表面にマレイミド基が導入された。ＥＭＣＳ溶液から引き上げたガラス基板を、先述のＥＭＣＳを溶解した混合溶媒を用いて洗浄し、さらにエタノールにより洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で乾燥させた。

［４−３．プローブＤＮＡ］
実施例１の［１．プローブＤＮＡの準備］で作製した微生物検出用プローブを純水に溶解し、それぞれ、最終濃度（インク溶解時）１０μＭとなるように分注した後、凍結乾燥を行い、水分を除いた。

［４−４．ＢＪプリンタによるＤＮＡ吐出、および基板への結合］
グリセリン７．５ｗｔ％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％、アセチレノールＥＨ（川研ファインケミカル社製）１．０ｗｔ％を含む水溶液を用意した。続いて、先に用意した２種類のプローブ（表１）の夫々を上記の混合溶媒に規定濃度なるように溶解した。得られたＤＮＡ溶液をインクジェットプリンタ（商品名：ＢＪＦ−８５０キヤノン社製）用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。

なおここで用いたインクジェットプリンタは平板への印刷が可能なように改造を施したものである。またこのインクジェットプリンタは、所定のファイル作成方法に従って印字パターンを入力することにより、約５ピコリットルのＤＮＡ溶液を約１２０μｍピッチでスポッティングすることが可能となっている。

続いて、この改造インクジェットプリンタを用いて、１枚のガラス基板に対して、印字操作を行い、アレイを作製した。印字が確実に行われていることを確認した後、３０分間加湿チャンバー内に静置し、ガラス基板表面のマレイミド基と核酸プローブ末端のチオール基とを反応させた。

［４−５．洗浄］
３０分間のプローブ結合反応後、１００ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）により表面に残ったＤＮＡ溶液を洗い流し、ガラス基板表面に一本鎖ＤＮＡが固定したＤＮＡチップを得た。

［５．検体の増幅と標識化］
［５−１．検体の増幅：１ｓｔＰＣＲ］
検体となる微生物遺伝子の増幅（１ｓｔＰＣＲ）、および、標識化（２ｎｄＰＣＲ）反応を以下の表４に示す。

上記組成の反応液を図１に示すプロトコルに従って、市販のサーマルサイクラーで増幅反応を行なった。

反応終了後、精製用カラム（ＱＩＡＧＥＮＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ）を用いて精製した後、増幅産物の定量を行なった。
［５−２．標識化反応：２ｎｄＰＣＲ］
表５の組成の反応液を図２に示すプロトコルに従って、市販のサーマルサイクラーで増幅反応を行なった。

反応終了後、精製用カラム（ＱＩＡＧＥＮＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ）を用いて精製し、標識化検体とした。

［６．ハイブリダイゼーション］
上述の［４．ＤＮＡチップの作成］で作成したＤＮＡチップと［５．検体の増幅と標識化］で作成した標識化検体を用いて、検出反応を行なった。

［６−１．ＤＮＡチップのブロッキング］
ＢＳＡ（牛血清アルブミンＦｒａｃｔｉｏｎＶ：Ｓｉｇｍａ社製）を１ｗｔ％となるように１００ｍＭＮａＣｌ／１０ｍＭＰｈｏｓｐｈａｔｅＢｕｆｆｅｒに溶解した。次に、この溶液に［４．ＤＮＡチップの作製］で作製したＤＮＡチップを室温で２時間浸し、ブロッキングを行った。ブロッキング終了後、以下の洗浄液で洗浄を行った後、純水でリンスしてからスピンドライ装置で水切りを行った。
洗浄液：
０．１ｗｔ％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む２×ＳＳＣ溶液（ＮａＣｌ３００ｍＭ、ＳｏｄｉｕｍＣｉｔｒａｔｅ（ｔｒｉｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅｄｉｈｙｄｒａｔｅ，Ｃ₆Ｈ₅Ｎａ₃・２Ｈ₂Ｏ）３０ｍＭ、ｐ．Ｈ．７．０）
［６−２．ハイブリダイゼーション］
水切りしたＤＮＡチップをハイブリダイゼーション装置（ＧｅｎｏｍｉｃＳｏｌｕｔｉｏｎｓＩｎｃ．ＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＳｔａｔｉｏｎ）にセットし、以下に示すハイブリダイゼーション溶液、条件でハイブリダイゼーション反応を行った。

［６−３．ハイブリダイゼーション溶液］
６ｘＳＳＰＥ／１０％Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ／Ｔａｒｇｅｔ（２ｎｄＰＣＲＰｒｏｄｕｃｔｓ全量）／０．０５ｗｔ％ＳＤＳ
（６ｘＳＳＰＥ：ＮａＣｌ９００ｍＭ、ＮａＨ₂ＰＯ₄・Ｈ₂Ｏ５０ｍＭ、ＥＤＴＡ６ｍＭ、ｐ．Ｈ．７．４）
［６−４．ハイブリダイゼーション条件］
６５℃ ３ｍｉｎ → ５５℃ ４ｈｒ → Ｗａｓｈ２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳａｔ５０℃ → Ｗａｓｈ２ｘＳＳＣａｔ２０℃ → （ＲｉｎｓｅｗｉｔｈＨ２Ｏ：Ｍａｎｕａｌ） → Ｓｐｉｎｄｒｙ
［７．微生物Ｇｅｎｏｍｅの検出（蛍光測定）］
上記ハイブリダイゼーション反応終了後のＤＮＡチップをＤＮＡチップ用蛍光検出装置（Ａｘｏｎ社製、ＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂ）を用いで蛍光測定を行った。その結果、再現性良く、十分なシグナルでＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属菌を検出することができた。
以下の表６に、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属菌の蛍光測定結果を示す。

［８．他の菌種とのハイブリダイゼーション］
表１に示すプローブセットが、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属菌のみに特異的にハイブリッド体を形成することを証明するため、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（ＪＣＭ１６４９）とのハイブリダイゼーション反応を行なった結果を、次の表７に示す。

［９．結果］
以上に説明したように、上記実施例によれば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属菌のみを特異的に検出可能なプローブセットを固定したＤＮＡチップを作成することができた。更に、このＤＮＡチップを用いて、感染症起炎菌を同定することが可能になり、微生物由来のＤＮＡプローブの問題を解決した。すなわち、オリゴヌクレオチドプローブは化学的に大量合成が可能であり、精製や濃度のコントロールが可能である。また、微生物の種による分類を目的に、同じ種の菌種は一括検出が可能で、しかも、他の種の菌は区別して検出できるようなプローブセットが提供できた。

また、上記実施例によれば、感染症起炎菌遺伝子の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を過不足なく検出することにより、該感染症起炎菌の存在を効率良く、また高い精度で判定することができる。

１ｓｔＰＣＲプロトコルを説明する図である。２ｎｄＰＣＲプロトコルを説明する図である。

Claims

感染症起炎菌であるバクテロイデス属菌の遺伝子を特異的に検出するためのプローブセットであって、
下記の（１）から選択される少なくとも１つのプローブと、下記の（２）から選択される少なくとも１つのプローブと、下記の（３）から選択される少なくとも１つのプローブとを含み、該少なくとも３つのプローブのそれぞれとの反応を示すシグナルを検出するために用いられることを特徴とするプローブセット。
（１）ＣＧＡＴＧＧＡＴＡＧＧＧＧＴＴＣＴＧＡＧＡＧＧＡＡ（配列番号３５）で表される塩基配列からなるプローブ及びその相補配列からなるプローブ、
（２）ＴＧＣＧＧＣＴＣＡＡＣＣＧＴＡＡＡＡＴＴＧＣＡＧＴ（配列番号３６）で表される塩基配列からなるプローブ及びその相補配列からなるプローブ、
（３）ＴＧＴＧＧＣＴＣＡＡＣＣＡＴＡＧＡＡＴＴＧＣＣＧＴ（配列番号３７）で表される塩基配列からなるプローブ及びその相補配列からなるプローブ。
請求項１に記載のプローブセットを構成する複数のプローブの各々が、固相担体上に、互いに隔離して配置されていることを特徴とするプローブ固定担体。
プローブ固定担体を用いた検体中でのバクテロイデス属菌の遺伝子の検出方法において、
（ｉ）請求項２に記載のプローブ固定担体と検体とを反応させる工程と、
（ｉｉ）前記プローブ固定担体上にプローブと前記検体中の核酸との反応の有無を検出する工程と、
を有することを特徴とするバクテロイデス属菌遺伝子の検出方法。
請求項１に記載のプローブセットを構成する複数のプローブと、プローブと標的核酸との反応を検出するための試薬と、を有することを特徴とするバクテロイデス属菌遺伝子検出用のキット。
前記プローブが担体に固定された状態で提供されている請求項４に記載のキット。
該試薬として、バクテロイデス属菌の遺伝子を増幅するプライマーとして、以下の（１）乃至（２１）から選ばれる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと、以下の（２２）乃至（２８）から選ばれる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと、を含む請求項４に記載のキット。
（１）５' ｇｃｇｇｃｇｔｇｃｃｔａａｔａｃａｔｇｃａａｇ３'（配列番号１）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（２）５' ｇｃｇｇｃａｇｇｃｃｔａａｃａｃａｔｇｃａａｇ３'（配列番号２）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（３）５' ｇｃｇｇｃａｇｇｃｔｔａａｃａｃａｔｇｃａａｇ３'（配列番号３）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（４）５' ｇｃｇｇｔａｇｇｃｃｔａａｃａｃａｔｇｃａａｇ３'（配列番号４）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（５）５' ｇｃｇｇｃｇｔｇｃｔｔａａｃａｃａｔｇｃａａｇ３'（配列番号５）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（６）５' ｇｃｇｇｇａｔｇｃｃｔｔａｃａｃａｔｇｃａａｇ３'（配列番号６）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（７）５' ｇｃｇｇｃａｔｇｃｃｔｔａｃａｃａｔｇｃａａｇ３'（配列番号７）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（８）５' ｇｃｇｇｃａｔｇｃｔｔａａｃａｃａｔｇｃａａｇ３'（配列番号８）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（９）５' ｇｃｇｇｃｇｔｇｃｔｔａａｔａｃａｔｇｃａａｇ３'（配列番号９）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（１０）５' ｇｃｇｇｃａｇｇｃｃｔａａｔａｃａｔｇｃａａｇ３'（配列番号１０）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（１１）５' ｇｃｇｇｇａｔｇｃｔｔｔａｃａｃａｔｇｃａａｇ３'（配列番号１１）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（１２）５' ｇｃｇｇｃｇｔｇｃｃｔａａｃａｃａｔｇｃａａｇ３'（配列番号１２）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（１３）５' ｇｃｇｇｃｇｔｇｃａｔａａｃａｃａｔｇｃａａｇ３'（配列番号１３）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（１４）５' ｇｃｇｇｃａｔｇｃｃｔａａｃａｃａｔｇｃａａｇ３'（配列番号１４）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（１５）５' ｇｃｇｇｃｇｃｇｃｃｔａａｃａｃａｔｇｃａａｇ３'（配列番号１５）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（１６）５' ｇｃｇｇｃｇｃｇｃｔｔａａｃａｃａｔｇｃａａｇ３'（配列番号１６）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（１７）５' ｇｃｇｔｃａｔｇｃｃｔａａｃａｃａｔｇｃａａｇ３'（配列番号１７）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（１８）５' ｇｃｇａｔａｇｇｃｔｔａａｃａｃａｔｇｃａａｇ３'（配列番号１８）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（１９）５' ｇｃｇａｃａｇｇｃｔｔａａｃａｃａｔｇｃａａｇ３'（配列番号１９）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（２０）５' ｇｃｔａｃａｇｇｃｔｔａａｃａｃａｔｇｃａａｇ３'（配列番号２０）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（２１）５' ａｃａｇａａｔｇｃｔｔａａｃａｃａｔｇｃａａｇ３'（配列番号２１）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（２２）５' ａｔｃｃａｇｃｃｇｃａｃｃｔｔｃｃｇａｔａｃ３'（配列番号２２）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（２３）５' ａｔｃｃａａｃｃｇｃａｇｇｔｔｃｃｃｃｔａｃ３'（配列番号２３）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（２４）５' ａｔｃｃａｇｃｃｇｃａｇｇｔｔｃｃｃｃｔａｃ３'（配列番号２４）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（２５）５' ａｔｃｃａｇｃｃｇｃａｃｃｔｔｃｃｇｇｔａｃ３'（配列番号２５）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（２６）５' ａｔｃｃａｇｃｇｃｃａｇｇｔｔｃｃｃｃｔａｇ３'（配列番号２６）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（２７）５' ａｔｃｃａｇｃｃｇｃａｇｇｔｔｃｔｃｃｔａｃ３'（配列番号２７）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
（２８）５' ａｔｃｃａｇｃｃｇｃａｃｇｔｔｃｃｃｇｔａｃ３'（配列番号２８）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
前記バクテロイデス属菌の遺伝子を増幅するプライマーが、前記（１）乃至（２８）の全てのオリゴヌクレオチドの混合物である請求項６に記載のキット。
該試薬として、増幅されたバクテロイデス属菌の遺伝子の標識化のためのプライマーである以下の（２９）〜（３４）の標識化されたオリゴヌクレオチドを更に含む請求項４乃至７のいずれか１項に記載のキット。
（２９）5' TACCTTGTTACGACTTCACCCCA 3'（配列番号２９）
（３０）5' TACCTTGTTACGACTTCGTCCCA 3'（配列番号３０）
（３１）5' TACCTTGTTACGACTTAGTCCCA 3'（配列番号３１）
（３２）5' TACCTTGTTACGACTTAGCCCCA 3'（配列番号３２）
（３３）5' TACCTTGTTACGACTTAGTCCTA 3'（配列番号３３）
（３４）5' TACCTTGTTACGACTTAGCCCTA 3'（配列番号３４）