JP5463492B2 - 微生物細胞からのプラスミドｄｎａ抽出法 - Google Patents

Description

本発明は、プラスミドＤＮＡを保持する微生物細胞からの、プラスミドＤＮＡの抽出方法に関するものである。

プラスミドＤＮＡは、遺伝子工学実験において、遺伝子のクローニング、遺伝子の増幅、遺伝子にコードされたタンパク質の発現、ＤＮＡ塩基配列の読みとり、特定のＤＮＡ塩基配列に結合する因子の探索、遺伝子導入による細胞の薬剤耐性獲得等の形質転換、遺伝子のノックアウト等、様々な目的に用いられる。

プラスミドＤＮＡは、一般的には大腸菌、枯草菌等の微生物細胞内で複製される。従って、プラスミドＤＮＡを遺伝子工学実験に用いるためには、目的とするプラスミドＤＮＡを微生物に導入したのち培養し、増殖した微生物細胞を回収してプラスミドＤＮＡを抽出する必要がある。そこで、そのための方法が数多く提案されている。

プラスミドＤＮＡの導入対象として大腸菌を用いる場合、代表的な大腸菌からのプラスミドＤＮＡ抽出法として、アルカリ−ｍｉｎｉｐｒｅｐ法が挙げられる。非特許文献１によれば、アルカリ−ｍｉｎｉ ｐｒｅｐ法の概略は、次の通りである。

（１）プラスミドＤＮＡを保持する大腸菌培養液を１．５ｍＬのチューブに移して遠心操作を行い、菌体をペレットとして回収する。（２）菌体ペレットに１００μＬのｓｏｌｕｔｉｏｎＩ［２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．９％グルコース］を加えて懸濁する。（３）２００μＬのｓｏｌｕｔｉｏｎ ＩＩ［０．２
Ｍ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ］を加えて菌体を溶解し、タンパク質、核酸を変性状態とする
。（４）１５０μＬのｓｏｌｕｔｉｏｎ ＩＩＩ［３Ｍ 酢酸カリウム、１１．５％酢酸］を加えて溶液の中和とＳＤＳの除去を行う。この操作により、染色体ＤＮＡ、タンパク質は凝集沈殿物となるが、プラスミドＤＮＡは溶液部分に留まる。（５）凝集沈殿物を遠心分離により溶液から除去し、プラスミドＤＮＡを含む溶液を回収する。（６）得られたプラスミドＤＮＡを含む溶液に対して、フェノール・クロロホルム抽出を行ってタンパク質を除去する。（７）プラスミド溶液の２倍量のエタノールを加えてドライアイス上に５分静置する。（８）遠心操作によってプラスミドＤＮＡの沈殿を得る。（９）得られたプラスミドＤＮＡの沈殿をＴＥ［１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ］に溶解して試料とする。

上記のように、アルカリ−ｍｉｎｉ ｐｒｅｐ法は操作段階が多く煩雑であり、また有
害物質であるフェノール、クロロホルムを使用する必要がある。そこで、操作の簡略化や有害物質の使用量削減を目的として、核酸結合担体を用いたプラスミドＤＮＡ抽出法が開示されている。以下に、核酸結合担体を用いたプラスミドＤＮＡ抽出法の例を示す。

特許文献１には、「プラスミドＤＮＡを保持する微生物あるいは細胞に、カオトロピック物質を含むｐＨ３〜６の溶解液、有機溶媒からなる抽出液および核酸結合性固相担体を接触させることにより、プラスミドＤＮＡを固相担体上に吸着させ、この固相担体を洗浄し、洗浄した固相担体から溶出液によりプラスミドＤＮＡを溶出させる方法」が開示されている。この方法を前記アルカリ−ｍｉｎｉｐｒｅｐ法における操作（２）〜（９）に置き換えることにより、操作の簡略化を図るとしている。しかしこの方法で使用されるカオトロピック塩は、多くの場合強力な変性剤であり、人体に有害である。また、同じく有害性のある有機溶媒を使用しなければならない。

特許文献２には、有害物質であるフェノール、クロロホルムを使用することなくプラスミドＤＮＡを抽出する方法が開示されている。すなわち、前記アルカリ−ｍｉｎｉｐｒｅｐ法における操作（５）を、「Ａ細胞破片および他の粒子を流れの方向に、または試料が流れる方向に見てポア径が小さくなるフィルター層によって除く」工程とし、（６）から（９）を「Ｂ該溶出液をその後、低イオン強度または高イオン強度のバッファー溶液中で陰イオン交換体により処理する」工程とすることで、有害物質の使用を避け、操作時間の短縮化を図るとしている。しかしこの方法は、工程中にフィルター層を有する器具を新たに導入する必要があり、コストの上昇を招く。また、アルカリ−ｍｉｎｉｐｒｅｐ法と比較した場合、操作段階は実質的に減少していない。

上記２つの方法以外にも、核酸結合担体を使用するプラスミド抽出法は数多く開示されているが、核酸結合担体を使用するという原理上、（ｉ）微生物細胞の溶解（ｉｉ）プラスミドＤＮＡの担体への結合、（ｉｉｉ）担体の洗浄、（ｉｉｉｉ）担体からのプラスミドＤＮＡの溶出、の４操作は必須であり、この操作を省略することはできない。
山本雅編、「実験医学別冊バイオマニュアルシリーズ１ 遺伝子工学の基礎実験」、羊土社、１９９３、ｐ．１９−７６ 特開平９−３２７２９０ 特開２００１−９５５７２

本発明の目的は、従来の核酸結合担体を用いる方法とは異なるプラスミドＤＮＡ抽出法を開発することにより、抽出操作を簡略化し、試薬の使用量を削減し、操作時間を短縮することである。

本発明者は、従来のプラスミドＤＮＡ抽出工程を詳細に検討し、これにゼオライトによる陽イオン交換作用を応用することで、上記課題を解決するに至った。すなわち、本発明は、下記の構成からなるプラスミドＤＮＡの抽出法である。

第１に、微生物細胞からプラスミドＤＮＡを抽出する方法であって、
工程（１）：以下の細胞溶解液Ａにより微生物細胞を溶解してライセートを調製する工程。
工程（２）：工程（１）において調製したライセートに、以下のゼオライトＢおよびゼオライトＣを接触させる工程。
工程（３）：不溶性画分と水層を分離する工程。
細胞溶解液Ａ：アルカリ金属水酸化物塩と、アルキル硫酸塩を除く陰イオン界面活性剤とを含む液。
ゼオライトＢ：交換性陽イオンとしてアルカリ土類金属陽イオンを保持するゼオライト。ゼオライトＣ：交換性陽イオンとして水素イオンを保持するゼオライト。
以上の工程（１）から工程（３）を含むことを特徴とする微生物細胞からのプラスミドＤＮＡ抽出法。

第２に、微生物細胞からプラスミドＤＮＡを抽出する方法であって、
工程（１）：以下の細胞溶解液Ａにより微生物細胞を溶解してライセートを調製する工程。
工程（２）：工程（１）において調製したライセートに、以下のゼオライトＢおよびゼオライトＣを接触させる工程。
工程（３）：不溶性画分と水層を分離する工程。
細胞溶解液Ａ：水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化セシウムからなる群より選択される、１つまたは複数のアルカリ金属水酸化物塩と、アルキル硫酸塩とを含む液。
ゼオライトＢ：カリウム、ルビジウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウムからなる群より選択される、１つまたは複数の陽イオンを交換性陽イオンとして保持するゼオライト。
ゼオライトＣ：交換性陽イオンとして水素イオンを保持するゼオライト。
以上の工程（１）から工程（３）を含むことを特徴とする微生物細胞からのプラスミドＤＮＡ抽出法。

第３に、前記第１項または第２項に記載の工程（２）において、ライセートがゼオライトＢへの接触の後にゼオライトＣへ接触することを特徴とする前記第１項または第２項に記載の微生物細胞からのプラスミドＤＮＡ抽出法。

第４に、前記第１項または第２項に記載の工程（２）において、ライセートがゼオライトＢとゼオライトＣとに同時に接触することを特徴とする前記第１項または第２項に記載の微生物細胞からのプラスミドＤＮＡ抽出法。

第５に、前記第１項または第２項に記載の工程（２）において、ライセートとゼオライトＢまたはゼオライトＣあるいはその両方との接触が、ゼオライトを充填したカラムにより行われることを特徴とする前記第１項乃至第４項のいずれかに記載の微生物細胞からのプラスミドＤＮＡ抽出法。

本発明のプラスミドＤＮＡ抽出法は、上記のように（１）微生物細胞を溶解してライセートを調製する工程、（２）ライセートにゼオライトを接触させる工程、（３）不溶性画分と水層を分離する工程、からなる３操作によって微生物材料からプラスミドＤＮＡを取得することができる。本発明によるプラスミドＤＮＡ抽出工程を、特許文献１および特許文献２に記載の方法に基づく核酸結合担体を用いたプラスミドＤＮＡ抽出法と比較し、図１に示した。本発明のプラスミドＤＮＡ抽出法は、プラスミドＤＮＡを含む微生物細胞を溶解しライセートを調製する工程までは、従来法と類似である。しかし、次の工程であるライセートとゼオライトとの接触工程において、界面活性剤の除去、タンパク質と染色体ＤＮＡの凝集不溶化による除去、脱塩が同時に進行するため、この工程を経るのみでプラスミドＤＮＡを取得することができる。また使用する試薬類は、微生物細胞溶解液および２種のゼオライトのみである。従って、従来の核酸結合担体を用いたプラスミドＤＮＡ抽出法と比較した場合、操作の簡略化、試薬使用量の削減が可能となる。また、本発明の方法をプラスミドＤＮＡ自動抽出装置に適用すれば、装置の簡略化、運転時間の短縮に貢献
することは明らかである。

本発明のプラスミド抽出法は、（１）微生物細胞を溶解してライセートを調製する工程、（２）ライセートにゼオライトを接触させる工程、（３）不溶性画分と水層を分離する工程、を含む。以下に、本発明のプラスミドＤＮＡ抽出法を実施するための最良の形態について説明する。

本発明の方法が対象とするプラスミドＤＮＡは、遺伝子工学に用いるために改良されたプラスミドＤＮＡ、および天然に存在するプラスミドＤＮＡを含む。特に遺伝子工学に用いられるプラスミドＤＮＡは、その機能的性格からベクターと称することもある。またその由来からコスミド、バクミドと称することもある。

本発明の方法において、プラスミドＤＮＡ抽出の出発材料となる微生物細胞としては、例えばプラスミドＤＮＡを保持する大腸菌が挙げられる。特に、遺伝子工学実験において日常的に用いられる大腸菌Ｋ１２株およびその誘導体を、プラスミドＤＮＡの導入によって形質転換したものが代表的である。

本発明の方法では、プラスミドＤＮＡを保持する微生物細胞を、既知の培地、例えばＳＯＢ、ＳＯＣ、ＬＢ等で８−２４時間培養したものを出発材料とする。培養した微生物細胞は、遠心操作等によりペレットとして回収してもよい。回収したペレットは、そのまま工程（１）のライセート調製に供してもよいが、前処理として、ペレットを純水あるいは緩衝液に分散する工程を設けてもよい。この工程は、微生物細胞の破壊反応が速やかかつ均等に進行することを助ける。緩衝液としては、例えば、ＴＥ［１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＴＤＡ］、非特許文献１に記載のｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ［２５
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．９％グルコース］が挙
げられる。さらに、この工程においてＲＮａｓｅ、プロテアーゼの添加を行ってもよい。

工程（１）微生物細胞を溶解し、ライセートを調製する工程
工程（１）では、ペレットまたは分散させた微生物細胞を、細胞溶解液Ａを用いて溶解し、ライセートを調製する。この工程で用いる細胞溶解液Ａは、アルカリ金属水酸化物塩と、陰イオン界面活性剤とを含む。アルカリ金属水酸化物塩は、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ルビジウム、水酸化セシウムから一つ、または複数選択して使用することができる。細胞溶解液は、ＤＮＡを１本鎖に変性させうるｐＨ１０〜１４の範囲であることが好ましく、これはアルカリ金属水酸化物塩の濃度によって調整することができる。例えば濃度２００ｍＭの水酸化ナトリウムを用いる場合、ｐＨは約１２．５である。細胞溶解液に含まれる陰イオン界面活性剤は、アルキル硫酸塩を除いた陰イオン界面活性剤、例えばアルキルベンゼンスルホン酸塩、Ｎ−ラウロイルサルコシン塩、コール酸塩、デオキシコール酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸塩等から１つ、または複数選択して用いることができる。陰イオン界面活性剤は、アルカリ金属塩またはアンモニウム塩であることが好ましい。陰イオン界面活性剤の濃度は、０．１〜３％が好適である。

工程（１）の細胞溶解液に、陰イオン界面活性剤としてドデシル硫酸ナトリウムに代表されるアルキル硫酸塩が含まれる場合は、前記水酸化物塩は水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化セシウムから１つ、または複数選択することができる。水酸化カリウム、水酸化ルビジウムは、アルキル硫酸塩と反応して不溶性の沈殿を形成するため、好ましくない。アルキル硫酸塩の濃度は、０．１〜３％が好適である。

工程（２）ライセートをゼオライトと接触させる工程
工程（２）では、工程（１）で調製したライセートを、ゼオライトＢおよび、ゼオライトＣと接触させる。ゼオライトＢが保持する交換性陽イオンは、工程（１）の細胞溶解液Ａに含まれる陰イオン界面活性剤の種類によって選択される。すなわち、陰イオン界面活性剤がアルキル硫酸塩を含まない場合は、アルカリ土類金属陽イオンから１つ、または複数選択することができる。陰イオン界面活性剤がアルキル硫酸塩を含む場合は、カリウム、ルビジウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウムからなる群より１つ、または複数選択することができる。この群から少なくとも１つが選択されている場合、二つめ以降の陽イオンとしてマグネシウムを選択していてもよい。ゼオライトＣが保持する交換性陽イオンは水素イオンである。

工程（２）−１ ライセートとゼオライトＢとの接触工程
以下、ライセート中に含まれる陽イオンを陽イオンＤ、ゼオライトＢが保持する交換性陽イオンを陽イオンＥと称す。

工程（２）−１では、ライセートとゼオライトＢとの接触により、ライセート中に含まれる陽イオンＤが、ゼオライトＢが保持する陽イオンＥと交換し、ライセートから除去される。同時に、ライセート中に遊離した陽イオンＥは、ライセート中の陰イオン界面活性剤と反応し、沈殿を形成する。

この反応のために必要なゼオライトＢの量は、少なくとも工程（１）で用いられる細胞溶解液Ａの陰イオン界面活性剤の等量数と等しい量の陽イオンＥを供給する必要がある。ゼオライトＢが単位量当たり保持する陽イオンＥの量、陰イオン界面活性剤の種類、細胞溶解液Ａの使用量によってゼオライトＢの必要量は異なるが、例えば陽イオンＥを１ｍｅｑ／ｇ保持するゼオライトＢを使用する場合、工程（１）の細胞溶解液Ａに含まれる陰イオン界面活性剤が１％デオキシコール酸ナトリウム（分子量４１４．５５）であり、この液１ｍＬを細胞の溶解に用いる場合、数１により、必要量は、少なくとも０．０２４ｇであると計算できる。

工程（２）−２ ライセートとゼオライトＣとの接触工程
工程（２）−２では、ライセートとゼオライトＣとの接触により、陽イオンＥと交換しきれなかったライセート中に残存する陽イオンＤ、および陰イオン界面活性剤と反応しなかった陽イオンＥが、ゼオライトＣが保持する水素イオンと交換し、ライセート中から除去される。同時に、ライセート中に遊離した水素イオンは、ライセート中の水酸化物イオンと反応し、中和が起こる。

この反応のために必要なゼオライトＣの量は、少なくとも工程（１）で用いられる細胞溶解液Ａのアルカリ金属水酸化物塩のモル数と等しい量の水素イオンを供給する必要がある。ゼオライトＣが単位量当たり保持する水素イオンの量、細胞溶解液Ａの使用量、細胞溶解液Ａに含まれるアルカリ金属水酸化物塩の濃度によってゼオライトＣの必要量は異なるが、例えば水素イオンを１ｍｅｑ／ｇ保持するゼオライトＣを使用する場合、工程（１
）の細胞溶解液Ａに含まれるアルカリ金属水酸化物塩が２００ｍＭの水酸化ナトリウムであり、この液１ｍＬを細胞の溶解に用いる場合、数２により、必要量は、少なくとも０．２ｇであると計算できる。

以上の工程により、ライセートからの陰イオン界面活性剤の除去と中和が完了し、変性状態にあった染色体ＤＮＡおよびタンパク質は不溶性の凝集物となる。またタンパク質は、ゼオライトへの吸着反応によっても除去される。この時、プラスミドＤＮＡは溶液中に残存する。

工程（２）において、ライセートをゼオライトＢおよびゼオライトＣと接触させる操作は、同時に行われてもよい。これは、ゼオライトＢとゼオライトＣを混合したものを調製し、ライセートに接触させることにより可能である。

さらに、ライセートをゼオライトＢおよびゼオライトＣに同時に接触させる操作は、陽イオンＥと水素イオンを同時に保持するゼオライト粒子あるいはゼオライト固体によっても可能である。このようなゼオライトは、陽イオンＥでイオン交換したゼオライトの交換性陽イオンを、さらに水素イオンで一部のみをイオン交換することにより、またはその逆の順序によるイオン交換により調製することができる。

工程（２）におけるライセートとゼオライトを接触状態におく方法の例として（ａ）直接添加法、（ｂ）カラム充填法、を挙げることができる。以下、両方法について、工程（３）不溶性画分と水層を分離する工程を含めて説明する。

（ａ）直接添加法
ゼオライトＢと、ゼオライトＣとを、工程（１）のライセートが入った容器に添加する方法である。ゼオライトＢと、ゼオライトＣが別個のゼオライトである場合、前記ゼオライトを混合したものを添加してもよい。個別に添加する場合は、まずゼオライトＢを添加し、続いてゼオライトＣを添加することが好ましい。

直接添加法の場合、ライセートとゼオライトとの接触後は、工程（３）不溶性画分と水層の分離を、既知の方法、例えば遠心分離法、フィルターによるろ過法により行うことができる。フィルターによるろ過法を適用する場合、核酸を吸着しない、あるいは吸着性の低いものであれば使用可能である。フィルターの材質は、セルロース、コーティングを施したガラス、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエチレンテレフタレート、ポリテトラフルオロエチレン等から選択できる。

（ｂ）カラム充填法
ゼオライトＢと、ゼオライトＣとを充填したカラムを用いる方法である。ゼオライトを充填したカラムは、ライセートを通液する前にあらかじめ超純水で洗浄して平衡化しておくことが好ましい。

ゼオライトＢとゼオライトＣが別個のゼオライトである場合、前記ゼオライトを混合したものをカラムに充填してもよい。また、陽イオンＥと水素イオンを同時に保持するゼオライト粒子あるいはゼオライト固体をカラムに充填してもよい。

ゼオライトＢとゼオライトＣが別個のゼオライトであり、これらを混合せずにカラムに充填する場合は、ゼオライトＢが、ゼオライトＣよりもカラムの通水方向に対して上流に配置されていることが好ましい。これらゼオライトの配置は、連続的であってもよいし、不連続的であってもよい。

ゼオライトＢを充填したカラムと、ゼオライトＣを充填したカラムを個別に調製し、これらを連結して使用することもできる。この場合、ゼオライトＢを充填したカラムが、ゼオライトＣを充填したカラムよりも通水方向に対して上流に配置されていることが好ましい。

調製されたゼオライト充填カラムに対してライセートを通液すると、カラムを通過する過程でライセート中の陽イオンＤとゼオライト中の陽イオンＥが交換し、陰イオン界面活性剤の除去とライセートの中和が進行する。この反応に伴い凝集したタンパク質および染色体ＤＮＡはゼオライトに捕捉され、プラスミドＤＮＡが非吸着画分として溶出される。通液は、自然落下式、加圧押し出し式、減圧吸引式、遠心機を用いたスピンカラム式等により実施できる。

カラム充填法の場合、工程（３）の不溶性画分と水層の分離は、カラム通過によって行われる。すなわち、不溶性画分はカラム中のゼオライトに捕捉され、またカラムの最終フィルターに捕捉されることにより除去される。

以上の工程（１）から工程（３）を含む方法で回収されたプラスミドＤＮＡは、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿、ゲルろ過等の精製、濃縮、脱塩操作を追加することなしに、制限酵素処理、ＰＣＲ等の各種酵素処理に使用可能である。

以下、調製例および実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

（定義１）
陽イオンの量を示す等量とは、陽イオンのモル数にその陽イオンの価数を乗じた値を指し、ｅｑで表す。

（定義２）
カリウム型ゼオライトとは、交換性陽イオンとしてカリウムイオンを保持しているゼオライトを指す。同様に、マグネシウム型ゼオライト、カルシウム型ゼオライト、ストロンチウム型ゼオライト、バリウム型ゼオライト、水素イオン型ゼオライトは、それぞれ、交換性陽イオンとしてマグネシウムイオンを保持しているゼオライト、交換性陽イオンとしてカルシウムイオンを保持しているゼオライト、交換性陽イオンとしてストロンチウムイオンを保持しているゼオライト、交換性陽イオンとしてバリウムイオンを保持しているゼオライト、交換性陽イオンとして水素イオンを保持しているゼオライト、を指す。

陰イオン界面活性剤を除去可能な陽イオンの検討
陰イオン界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム、ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムについて、
陽イオンとの反応による沈殿除去が可能かを、次の方法により検討した。１％の上記陰イオン界面活性剤１ｍＬに対して、濃度１Ｍのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩の溶液０．１ｍＬを添加混合し、沈殿生成を目視により確認した。表１に塩溶液の種類、および沈殿生成の有無を示す。なお、実験は室温（２０℃）で行った。表１に示されるように、ドデシル硫酸ナトリウムと反応して沈殿を生じる陽イオンはカリウム、ルビジウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウムであった。また、ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムと反応して沈殿を生じる陽イオンはマグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウムであった。

（調製例１） 交換性陽イオンとしてカリウム、マグネシウム、カルシウム、ストロン
チウム、バリウムを保持するゼオライトの調製
交換性陽イオンとしてカリウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウムを保持するゼオライトを、次の方法により調製した。本調製例に用いたゼオライト試料を、表２に示す。天然ゼオライトは粒径が４５μｍ以下となるよう原石を遊星ボールミルにて粉砕し、超純水で十分に洗浄した後乾燥させた。合成ゼオライトは、ナトリウム型のものを入手した。これらのゼオライト５０ｇを、０．１Ｍの塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化ストロンチウム、塩化バリウム各水溶液１Ｌに浸漬し、８０℃にて１６時間放置した。その後、各水溶液を新しく調製したものと交換し、再度８０℃にて１６時間放置した。この操作を１２〜１５回繰り返すことにより、イオン交換を行った。イオン交換終了後、各ゼオライトを超純水で十分洗浄した後、乾燥させた。

以上の方法で調製したゼオライトについて、保持する交換性陽イオンの量を、以下の方法により測定した。各ゼオライト試料を約０．５ｇ秤り取り、これを５０ｍＬの１Ｍ硝酸アンモニウム水溶液に浸漬して８０℃にて約１６時間保持したのち、遠心操作によってゼオライトと硝酸アンモニウム水溶液を分離した。この操作により、ゼオライト中に保持されていた各陽イオンを硝酸アンモニウムに溶出させた。その後、硝酸アンモニウム水溶液中に含まれる各陽イオンの濃度を、カリウム、マグネシウム、カルシウムは偏光ゼーマン原子吸光分光光度計（日立製作所製Ｚ−６０００）にて、ストロンチウム、バリウムは誘導結合プラズマ発光分光分析装置（島津製作所製ＩＣＰ−７５００）にて測定し、元々のゼオライト中の各陽イオンの保持量を算出した。結果を表２に示す。

（調製例２） 水素イオンを保持するゼオライトの調製
水素イオンを保持するゼオライトは、次の方法により調製した。本調製例に用いたゼオライト試料を、表３に示す。天然ゼオライトは粒径が４５μｍ以下となるよう原石を遊星ボールミルにて粉砕し、超純水で十分に洗浄した後乾燥させた。これらのゼオライト５０ｇを、０．１ＭのＨＣｌ水溶液１Ｌに浸漬して８０℃にて１６時間放置した。その後、ＨＣｌ水溶液を新しく調製したものと交換し、再度８０℃にて１６時間放置した。この操作を１３回繰り返すことにより、イオン交換を行った。イオン交換終了後、各ゼオライトを超純水で十分洗浄した後、乾燥させた。

以上の方法で調製したゼオライトが保持する水素イオンの量を、以下の方法により測定した。各ゼオライト試料を約０．５ｇ秤り取り、これに１００ｍＬの１Ｍ塩化ナトリウム水溶液を加えてスターラーにて撹拌した。これにより、水素イオンを完全に塩化ナトリウム水溶液中に溶出した。この溶液をオートビュレット（メトラートレド製７１９ＳＴｉｔｒｉｎｏ）を用いて０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７を終点として滴定し、ゼオライト中の水素イオンの保持量を算出した。結果を表３に示す。

（調製例３） 大腸菌ＤＨ５αのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋による形質転換
大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセル（ＴＯＹＯＢＯ製Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔｈｉｇｈ Ｅ
．ｃｏｌｉ ＤＨ５α）１００μＬに対してプラスミドＤＮＡｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）１ｐｇを加え、添付の取り扱い説明書に従って形
質転換を行い、ＬＢ／Ａｍｐプレートにて培養した。３７℃にて１６時間の培養後、単一のコロニーをＬＢ培地２５ｍＬに植菌し、３７℃にて１６時間震とう培養した。培養後、培養液を１．５ｍＬポリプロピレン製チューブに１ｍＬづつ分注し、マイクロ冷却遠心機（ＫＵＢＯＴＡ製３７００）にて１２０００ｒｐｍ、１分の遠心を行い、菌体ペレットと培地とに分離した。培地を除去し、得られたポリプロピレン製チューブ入り菌体ペレットを出発材料とし、プラスミドＤＮＡ抽出操作を行った。

プラスミドＤＮＡの抽出（カリウム型、ストロンチウム型、バリウム型天然ゼオライト＋ドデシル硫酸ナトリウム）
調製例３のポリプロピレン製チューブ入り菌体ペレットを６本用意した。それぞれのチューブに１００μＬの菌体縣濁液［２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．９％グルコース］を加え、ボルテックスミキサーを用いて撹拌した。次
に、２００μＬの細胞溶解液［０．２ＭＮａＯＨ、１％ドデシル硫酸ナトリウム］をそれぞれのチューブに加え、転倒混和して菌体を溶解させ、ライセートを調製した。このライセート入りチューブに、表２に記載のカリウム型島根県産天然ゼオライトＷ、ストロンチウム型島根県産天然ゼオライトＷ、バリウム型島根県産天然ゼオライトＷ、カリウム型島根県産天然ゼオライトＯ、ストロンチウム型島根県産天然ゼオライトＯ、バリウム型島根県産天然ゼオライトＯをそれぞれ０．２ｇ加えて転倒混和した。次に、表３に記載の水素イオン型島根県産天然ゼオライトＩを０．２ｇ加えて転倒混和した。次に、上記混合物をマイクロ冷却遠心機（ＫＵＢＯＴＡ製３７００）にて１２０００ｒｐｍ、５分の遠心操作による固液分離を行い、上清を新しい１．５ｍＬポリプロピレン製チューブに回収した。回収した上清１０μＬを１％アガロースによる電気泳動に供した。泳動終了後、臭化エチ
ジウムで染色し、紫外線照射下で写真撮影を行った。結果を図２に示す。図２から明らかなように、カリウム型、ストロンチウム型、バリウム型のいずれのゼオライトを用いても、プラスミドＤＮＡが抽出された。

プラスミドＤＮＡの抽出（マグネシウム型、カルシウム型、ストロンチウム型、バリウム型天然ゼオライト＋デオキシコール酸ナトリウム）
調製例３のポリプロピレン製チューブ入り菌体ペレットを４本用意した。それぞれのチューブに１００μＬの菌体縣濁液［２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．９％グルコース］を加え、ボルテックスミキサーを用いて撹拌した。次
に、２００μＬの細胞溶解液［０．２ＭＮａＯＨ、１％デオキシコール酸ナトリウム］をそれぞれのチューブに加え、転倒混和して菌体を溶解させ、ライセートを調製した。このライセート入りチューブに、表２に記載のマグネシウム型島根県産天然ゼオライトＷ、カルシウム型島根県産天然ゼオライトＷ、ストロンチウム型島根県産天然ゼオライトＷ、バリウム型島根県産天然ゼオライトＷを各０．２ｇ加えて転倒混和した。次に、表３に記載の水素イオン型島根県産天然ゼオライトＩを各０．２ｇ加えて転倒混和した。次に、上記混合物をマイクロ冷却遠心機にて１２０００ｒｐｍ、５分の遠心操作による固液分離を行い、上清部分を新しい１．５ｍＬポリプロピレン製チューブに回収した。回収した上清１０μＬを１％アガロースによる電気泳動に供した。泳動終了後、臭化エチジウムで染色し、紫外線照射下で写真撮影を行った。結果を図３に示す。図３から明らかなように、マグネシウム型、カルシウム型、ストロンチウム型、バリウム型のいずれのゼオライトを用いても、プラスミドＤＮＡが抽出された。

水素イオン型天然ゼオライトの種類の影響
調製例２のポリプロピレン製チューブ入り菌体ペレットを３本用意した。それぞれのチューブに１００μＬの菌体縣濁液［２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．９％グルコース］を加え、ボルテックスミキサーを用いて撹拌した。こ
の溶液に２００μＬの細胞溶解液［０．２ＭＮａＯＨ、１％ドデシル硫酸ナトリウム］を加え、転倒混和して菌体を溶解させ、ライセートを調製した。この細胞溶解液に、表２に記載のバリウム型島根県産天然ゼオライトＷ０．２ｇを加えて転倒混和した。次に、表３に記載の水素イオン型島根県産天然ゼオライトＷ、水素イオン型島根県産天然ゼオライトＯ、水素イオン型島根県産天然ゼオライトＩを各０．２ｇ加えて転倒混和した。次に、上記混合物をマイクロ冷却遠心機にて１２０００ｒｐｍ、５分の遠心操作による固液分離を行い、上清部分を新しい１．５ｍＬポリプロピレン製チューブに回収した。回収した上清１０μＬを１％アガロースによる電気泳動に供した。泳動終了後、臭化エチジウムで染色し、紫外線照射下で写真撮影を行った。結果を図４に示す。図４から明らかなように、水素イオン型島根県産天然ゼオライトＷ、水素イオン型島根県産天然ゼオライトＯ、水素イオン型島根県産天然ゼオライトＩのいずれのゼオライトを用いても、プラスミドＤＮＡが抽出された。

プラスミドＤＮＡの抽出（カリウム型、ストロンチウム型、バリウム型合成ゼオライトＡ−４＋ドデシル硫酸ナトリウム）
調製例３のポリプロピレン製チューブ入り菌体ペレットを３本用意した。それぞれのチューブに１００μＬの菌体縣濁液［２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．９％グルコース］を加え、ボルテックスミキサーを用いて撹拌した。次
に、２００μＬの細胞溶解液［０．２ＭＮａＯＨ、１％ドデシル硫酸ナトリウム］をそれぞれのチューブに加え、転倒混和して菌体を溶解させ、ライセートを調製した。このライセート入りチューブに、表２に記載のカリウム型合成ゼオライトＡ−４、ストロンチウム
型合成ゼオライトＡ−４、バリウム型合成ゼオライトＡ−４をそれぞれ０．２ｇ加えて転倒混和した。次に、表３に記載の水素イオン型島根県産天然ゼオライトＩを０．２ｇ加えて転倒混和した。次に、上記混合物をマイクロ冷却遠心機（ＫＵＢＯＴＡ製３７００）にて１２０００ｒｐｍ、５分の遠心操作による固液分離を行い、上清を新しい１．５ｍＬポリプロピレン製チューブに回収した。回収した上清１０μＬを１％アガロースによる電気泳動に供した。泳動終了後、臭化エチジウムで染色し、紫外線照射下で写真撮影を行った。結果を図５に示す。図５から明らかなように、カリウム型、ストロンチウム型、バリウム型のいずれのゼオライトを用いても、プラスミドＤＮＡが抽出された。

プラスミドＤＮＡの抽出（ライセートへのゼオライト添加法の比較）
（１）調製例３のポリプロピレン製チューブ入り菌体ペレットを４本用意し、１〜４の番号を付した。それぞれのチューブに１００μＬの菌体縣濁液［２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．９％グルコース］を加え、ボルテックスミ
キサーを用いて撹拌した。次に、２００μＬの細胞溶解液［０．２ＭＮａＯＨ、１％ドデシル硫酸ナトリウム］をそれぞれのチューブに加え、転倒混和して菌体を溶解させ、ライセートを調製した。このライセート入りチューブ１〜４に、表４に記載のゼオライト１およびゼオライト２をあらかじめ等量混合したものをそれぞれ０．４ｇ加えて転倒混和した。次に、上記１〜４のチューブをマイクロ冷却遠心機にて１２０００ｒｐｍ、５分の遠心操作による固液分離を行い、上清部分を新しい１．５ｍＬポリプロピレン製チューブに回収した。

（２）調製例３のポリプロピレン製チューブ入り菌体ペレットを４本用意し、５〜８の番号を付した。それぞれのチューブに１００μＬの菌体縣濁液［２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．９％グルコース］を加え、ボルテックスミ
キサーを用いて撹拌した。次に、２００μＬの細胞溶解液［０．２ＭＮａＯＨ、１％ドデシル硫酸ナトリウム］をそれぞれのチューブに加え、転倒混和することにより菌体を溶解させ、ライセートを調製した。このライセート入りチューブ５〜８に、表４に記載のゼオライト１をそれぞれ０．２ｇ加えて転倒混和した。次に、表４に記載のゼオライト２を各０．２ｇ加えて転倒混和した。次に、上記５〜８のチューブをマイクロ冷却遠心機にて１２０００ｒｐｍ、５分の遠心操作による固液分離を行い、上清部分を新しい１．５ｍＬポリプロピレン製チューブに回収した。

（３）前記（１）（２）で回収した上清１０μＬを１％アガロースによる電気泳動に供した。泳動終了後、臭化エチジウムで染色し、紫外線照射下で写真撮影を行った。結果を図６に示す。図６から明らかなように、いずれのゼオライトの組み合わせにおいてもプラスミドＤＮＡが抽出された。また、ゼオライト１とゼオライト２を混合したものを添加した場合と、ゼオライト１添加後にゼオライト２を添加した場合の双方においてプラスミドＤＮＡが抽出された。

プラスミドＤＮＡの制限酵素処理
本発明の方法で抽出したプラスミドＤＮＡが制限酵素による消化処理に適用できるかを、次の方法により確認した。消化処理に使用した制限酵素および反応溶液組成を表５に示す。消化処理は、取り扱い説明書に記載の条件に従い行った。実施例４のバリウム型島根県産天然ゼオライトＷと水素イオン型島根県産天然ゼオライトＷの組み合わせによって抽出されたプラスミドＤＮＡ、およびバリウム型島根県産天然ゼオライトＷと水素イオン型島根県産天然ゼオライトＯの組み合わせによって抽出されたプラスミドＤＮＡを基質とし、これらプラスミドＤＮＡ溶液１５μＬに制限酵素２〜１０Ｕ、反応バッファー、超純水を添加して合計を２０μＬとした。この反応液を、３７℃１時間で反応させた。反応終了後、全量を１％アガロースによる電気泳動に供した。泳動終了後、臭化エチジウムで染色し、紫外線照射下で写真撮影を行った。結果を図７に示す。図中のＡがバリウム型島根県産天然ゼオライトＷと水素イオン型島根県産天然ゼオライトＷの組み合わせによって抽出されたプラスミドＤＮＡ、Ｂがバリウム型島根県産天然ゼオライトＷと水素イオン型島根県産天然ゼオライトＯの組み合わせによって抽出されたプラスミドＤＮＡの処理結果である。レーン７に示す未処理プラスミドＤＮＡは、スーパーコイル構造をとるために早く泳動される。一方、レーン１〜６の制限酵素によって消化されたプラスミドＤＮＡはリニア型となるため、遅く泳動されていることが分かる。このように、全ての制限酵素において消化が確認され、本発明による方法で分離したプラスミドＤＮＡは、直ちに制限酵素消化処理に適用可能であることが示された。

プラスミドＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応
本発明の方法で抽出したプラスミドＤＮＡがＰＣＲ反応に適用できるかを、次の方法により確認した。ＰＣＲ反応液は、ＨｙｂｒｉＰｏｌＤＮＡポリメラーゼ（ＢＩＯＬＩＮＥ製）１Ｕ、ＤＮＡポリメラーゼに添付の１０×リアクションバッファー２μＬ、２．５ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ、Ｍ１３プライマー（ｔｇｔａａａａｃｇａｃｇｇｃｃａｇｔ）１０ｐｍｏｌ、Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー（ｇｇａａａｃａｇｃｔａｔｇａｃｃａｔｇ）１０ｐｍｏｌ、鋳型プラスミドＤＮＡ１００ｐｇとし、超純水で計２０μＬとした。鋳型プラスミドＤＮＡは、実施例４においてバリウム型島根県産天然ゼオライトＷと水素イオン型島根県産天然ゼオライトＷの組み合わせによって抽出されたプラスミドＤＮＡ、バリウム型島根県産天然ゼオライトＷと水素イオン型島根県産天然ゼオライトＯの組み合わせによって抽出されたプラスミドＤＮＡ、バリウム型島根県産天然ゼオライトＷと水素イオン型島根県産天然ゼオライトＩの組み合わせによって抽出されたプラスミドＤＮＡとした。この反応溶液をサーマルサイクラー（アステック製プログラムテンプコントロールシステムＰＣ−８１２）にセットし、温度プログラム９４℃１５秒、５５℃１０秒、７２℃６０秒を１サイクルとして３５サイクルの増幅を行った。増幅後、反応液１０μＬを１％アガロースによる電気泳動に供した。泳動終了後、臭化エチジウムで染色し、紫外線照射下で写真撮影を行った。結果を図８に示す。図８から明らかなように、本発明の方法で分離したプラスミドＤＮＡを鋳型とした場合も従来法と同様にＰＣＲ産物の増幅が見られ、直ちにＰＣＲ反応に適用可能であることが示された。

核酸結合担体を用いるプラスミドＤＮＡ抽出法（従来法）と本発明のプラスミドＤＮＡ抽出法の工程の比較。 実施例２において抽出されたプラスミドＤＮＡのアガロース電気泳動結果。 実施例３において抽出されたプラスミドＤＮＡのアガロース電気泳動結果。 実施例４において抽出されたプラスミドＤＮＡのアガロース電気泳動結果。 実施例５において抽出されたプラスミドＤＮＡのアガロース電気泳動結果。 実施例６において抽出されたプラスミドＤＮＡのアガロース電気泳動結果。 実施例７において得られた、プラスミドＤＮＡの制限酵素処理結果。 実施例８において得られた、プラスミドＤＮＡのＰＣＲ反応結果。

Claims (5)

1. 微生物細胞からプラスミドＤＮＡを抽出する方法であって、
   工程（１）：以下の細胞溶解液Ａにより微生物細胞を溶解してライセートを調製する工程。
   工程（２）：工程（１）において調製したライセートに、以下のゼオライトＢおよびゼオライトＣを接触させる工程。
   工程（３）：不溶性画分と水層を分離する工程。
   細胞溶解液Ａ：アルカリ金属水酸化物塩と、アルキル硫酸塩を除く陰イオン界面活性剤とを含む液。
   ゼオライトＢ：交換性陽イオンとしてアルカリ土類金属陽イオンを保持するゼオライト。ゼオライトＣ：交換性陽イオンとして水素イオンを保持するゼオライト。
   以上の工程（１）から工程（３）を含むことを特徴とする微生物細胞からのプラスミドＤＮＡ抽出法。
2. 微生物細胞からプラスミドＤＮＡを抽出する方法であって、
   工程（１）：以下の細胞溶解液Ａにより微生物細胞を溶解してライセートを調製する工程。
   工程（２）：工程（１）において調製したライセートに、以下のゼオライトＢおよびゼオライトＣを接触させる工程。
   工程（３）：不溶性画分と水層を分離する工程。
   細胞溶解液Ａ：水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化セシウムからなる群より選択される、１つまたは複数のアルカリ金属水酸化物塩と、アルキル硫酸塩とを含む液。
   ゼオライトＢ：カリウム、ルビジウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウムからなる群より選択される、１つまたは複数の陽イオンを交換性陽イオンとして保持するゼオライト。
   ゼオライトＣ：交換性陽イオンとして水素イオンを保持するゼオライト。
   以上の工程（１）から工程（３）を含むことを特徴とする微生物細胞からのプラスミドＤＮＡ抽出法。
3. 請求項１または請求項２に記載の工程（２）において、ライセートがゼオライトＢへの接触の後にゼオライトＣへ接触することを特徴とする請求項１または請求項２に記載の微生物細胞からのプラスミドＤＮＡ抽出法。
4. 請求項１または請求項２に記載の工程（２）において、ライセートがゼオライトＢとゼオライトＣとに同時に接触することを特徴とする請求項１または請求項２に記載の微生物細胞からのプラスミドＤＮＡ抽出法。
5. 請求項１または請求項２に記載の工程（２）において、ライセートとゼオライトＢまたはゼオライトＣあるいはその両方との接触が、ゼオライトを充填したカラムにより行われることを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれかに記載の微生物細胞からのプラスミドＤＮＡ抽出法。