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JP5463492B2 - Plasmid DNA extraction from microbial cells - Google Patents

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JP5463492B2 JP2008261320A JP2008261320A JP5463492B2 JP 5463492 B2 JP5463492 B2 JP 5463492B2 JP 2008261320 A JP2008261320 A JP 2008261320A JP 2008261320 A JP2008261320 A JP 2008261320A JP 5463492 B2 JP5463492 B2 JP 5463492B2
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Description

本発明は、プラスミドDNAを保持する微生物細胞からの、プラスミドDNAの抽出方法に関するものである。   The present invention relates to a method for extracting plasmid DNA from a microbial cell carrying plasmid DNA.

プラスミドDNAは、遺伝子工学実験において、遺伝子のクローニング、遺伝子の増幅、遺伝子にコードされたタンパク質の発現、DNA塩基配列の読みとり、特定のDNA塩基配列に結合する因子の探索、遺伝子導入による細胞の薬剤耐性獲得等の形質転換、遺伝子のノックアウト等、様々な目的に用いられる。   Plasmid DNA is used in genetic engineering experiments to clone genes, amplify genes, express proteins encoded by genes, read DNA base sequences, search for factors that bind to specific DNA base sequences, and introduce cell drugs by gene transfer. It is used for various purposes such as transformation for acquiring resistance, knockout of genes, etc.

プラスミドDNAは、一般的には大腸菌、枯草菌等の微生物細胞内で複製される。従って、プラスミドDNAを遺伝子工学実験に用いるためには、目的とするプラスミドDNAを微生物に導入したのち培養し、増殖した微生物細胞を回収してプラスミドDNAを抽出する必要がある。そこで、そのための方法が数多く提案されている。   Plasmid DNA is generally replicated in microbial cells such as E. coli and Bacillus subtilis. Therefore, in order to use plasmid DNA for genetic engineering experiments, it is necessary to introduce the desired plasmid DNA into a microorganism, culture it, collect the grown microbial cells, and extract the plasmid DNA. Therefore, many methods have been proposed for this purpose.

プラスミドDNAの導入対象として大腸菌を用いる場合、代表的な大腸菌からのプラスミドDNA抽出法として、アルカリ−miniprep法が挙げられる。非特許文献1によれば、アルカリ−mini prep法の概略は、次の通りである。   When Escherichia coli is used as a plasmid DNA introduction target, a typical method for extracting plasmid DNA from Escherichia coli is an alkali-miniprep method. According to Non-Patent Document 1, the outline of the alkali-mini prep method is as follows.

(1)プラスミドDNAを保持する大腸菌培養液を1.5mLのチューブに移して遠心操作を行い、菌体をペレットとして回収する。(2)菌体ペレットに100μLのsolutionI[25mM Tris−HCl(pH8.0)、10mM EDTA、0.9%グルコース]を加えて懸濁する。(3)200μLのsolution II[0.2
M NaOH、1%SDS]を加えて菌体を溶解し、タンパク質、核酸を変性状態とする
。(4)150μLのsolution III[3M 酢酸カリウム、11.5%酢酸]を加えて溶液の中和とSDSの除去を行う。この操作により、染色体DNA、タンパク質は凝集沈殿物となるが、プラスミドDNAは溶液部分に留まる。(5)凝集沈殿物を遠心分離により溶液から除去し、プラスミドDNAを含む溶液を回収する。(6)得られたプラスミドDNAを含む溶液に対して、フェノール・クロロホルム抽出を行ってタンパク質を除去する。(7)プラスミド溶液の2倍量のエタノールを加えてドライアイス上に5分静置する。(8)遠心操作によってプラスミドDNAの沈殿を得る。(9)得られたプラスミドDNAの沈殿をTE[10mMTris−HCl pH8.0、1mM EDTA]に溶解して試料とする。
(1) The Escherichia coli culture solution holding the plasmid DNA is transferred to a 1.5 mL tube and centrifuged to collect the cells as pellets. (2) Add 100 μL of solution I [25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA, 0.9% glucose] to the cell pellet and suspend. (3) 200 μL of solution II [0.2
M NaOH, 1% SDS] is added to dissolve the cells, and the protein and nucleic acid are denatured. (4) Add 150 μL of solution III [3M potassium acetate, 11.5% acetic acid] to neutralize the solution and remove SDS. By this operation, chromosomal DNA and protein become aggregated precipitates, but plasmid DNA remains in the solution portion. (5) The aggregated precipitate is removed from the solution by centrifugation, and the solution containing the plasmid DNA is recovered. (6) The solution containing the obtained plasmid DNA is subjected to phenol / chloroform extraction to remove proteins. (7) Add twice as much ethanol as the plasmid solution and let stand on dry ice for 5 minutes. (8) A plasmid DNA precipitate is obtained by centrifugation. (9) The obtained plasmid DNA precipitate is dissolved in TE [10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA] to prepare a sample.

上記のように、アルカリ−mini prep法は操作段階が多く煩雑であり、また有
害物質であるフェノール、クロロホルムを使用する必要がある。そこで、操作の簡略化や有害物質の使用量削減を目的として、核酸結合担体を用いたプラスミドDNA抽出法が開示されている。以下に、核酸結合担体を用いたプラスミドDNA抽出法の例を示す。
As described above, the alkali-mini prep method has many operation steps and is complicated, and it is necessary to use phenol and chloroform which are harmful substances. Therefore, a plasmid DNA extraction method using a nucleic acid binding carrier has been disclosed for the purpose of simplifying the operation and reducing the amount of harmful substances used. The following is an example of a plasmid DNA extraction method using a nucleic acid binding carrier.

特許文献1には、「プラスミドDNAを保持する微生物あるいは細胞に、カオトロピック物質を含むpH3〜6の溶解液、有機溶媒からなる抽出液および核酸結合性固相担体を接触させることにより、プラスミドDNAを固相担体上に吸着させ、この固相担体を洗浄し、洗浄した固相担体から溶出液によりプラスミドDNAを溶出させる方法」が開示されている。この方法を前記アルカリ−miniprep法における操作(2)〜(9)に置き換えることにより、操作の簡略化を図るとしている。しかしこの方法で使用されるカオトロピック塩は、多くの場合強力な変性剤であり、人体に有害である。また、同じく有害性のある有機溶媒を使用しなければならない。   Patent Document 1 discloses that a plasmid DNA can be obtained by contacting a microorganism or cell holding plasmid DNA with a pH 3-6 lysate containing a chaotropic substance, an organic solvent extract and a nucleic acid-binding solid phase carrier. A method of adsorbing on a solid phase carrier, washing the solid phase carrier, and eluting plasmid DNA from the washed solid phase carrier with an eluent is disclosed. By replacing this method with the operations (2) to (9) in the alkali-miniprep method, the operation is simplified. However, the chaotropic salts used in this method are often strong denaturing agents and are harmful to the human body. In addition, organic solvents that are also harmful must be used.

特許文献2には、有害物質であるフェノール、クロロホルムを使用することなくプラスミドDNAを抽出する方法が開示されている。すなわち、前記アルカリ−miniprep法における操作(5)を、「A細胞破片および他の粒子を流れの方向に、または試料が流れる方向に見てポア径が小さくなるフィルター層によって除く」工程とし、(6)から(9)を「B該溶出液をその後、低イオン強度または高イオン強度のバッファー溶液中で陰イオン交換体により処理する」工程とすることで、有害物質の使用を避け、操作時間の短縮化を図るとしている。しかしこの方法は、工程中にフィルター層を有する器具を新たに導入する必要があり、コストの上昇を招く。また、アルカリ−miniprep法と比較した場合、操作段階は実質的に減少していない。   Patent Document 2 discloses a method for extracting plasmid DNA without using harmful substances such as phenol and chloroform. That is, the operation (5) in the alkali-miniprep method is a process of “removing A cell debris and other particles by a filter layer having a pore diameter that decreases in the direction of flow or in the direction of flow of the sample” 6) to (9) are steps in which “B the eluate is then treated with an anion exchanger in a buffer solution of low ionic strength or high ionic strength”, thereby avoiding the use of harmful substances and operating time. It is going to shorten. However, in this method, it is necessary to newly introduce an instrument having a filter layer in the process, resulting in an increase in cost. Also, when compared to the alkali-miniprep method, the operating stage is not substantially reduced.

上記2つの方法以外にも、核酸結合担体を使用するプラスミド抽出法は数多く開示されているが、核酸結合担体を使用するという原理上、(i)微生物細胞の溶解(ii)プラスミドDNAの担体への結合、(iii)担体の洗浄、(iiii)担体からのプラスミドDNAの溶出、の4操作は必須であり、この操作を省略することはできない。
山本雅編、「実験医学別冊バイオマニュアルシリーズ1 遺伝子工学の基礎実験」、羊土社、1993、p.19−76 特開平9−327290 特開2001−95572
In addition to the above two methods, many plasmid extraction methods using a nucleic acid binding carrier have been disclosed. However, on the principle of using a nucleic acid binding carrier, (i) lysis of microbial cells (ii) to a plasmid DNA carrier The following four operations are essential: (iii) washing of the carrier, (iii) elution of the plasmid DNA from the carrier, and this operation cannot be omitted.
Edited by Masaru Yamamoto, “Experimental Medicine Separate Bio Manual Series 1 Basic Experiments in Genetic Engineering”, Yodosha, 1993, p. 19-76 JP-A-9-327290 JP 2001-95572 A

本発明の目的は、従来の核酸結合担体を用いる方法とは異なるプラスミドDNA抽出法を開発することにより、抽出操作を簡略化し、試薬の使用量を削減し、操作時間を短縮することである。   The object of the present invention is to simplify the extraction operation, reduce the amount of reagent used, and shorten the operation time by developing a plasmid DNA extraction method different from the conventional method using a nucleic acid binding carrier.

本発明者は、従来のプラスミドDNA抽出工程を詳細に検討し、これにゼオライトによる陽イオン交換作用を応用することで、上記課題を解決するに至った。すなわち、本発明は、下記の構成からなるプラスミドDNAの抽出法である。 The present inventor has studied the conventional plasmid DNA extraction process in detail, and has applied the cation exchange action by zeolite to solve this problem. That is, the present invention is a method for extracting plasmid DNA having the following constitution.

第1に、微生物細胞からプラスミドDNAを抽出する方法であって、
工程(1):以下の細胞溶解液Aにより微生物細胞を溶解してライセートを調製する工程。
工程(2):工程(1)において調製したライセートに、以下のゼオライトBおよびゼオライトCを接触させる工程。
工程(3):不溶性画分と水層を分離する工程。
細胞溶解液A:アルカリ金属水酸化物塩と、アルキル硫酸塩を除く陰イオン界面活性剤とを含む液。
ゼオライトB:交換性陽イオンとしてアルカリ土類金属陽イオンを保持するゼオライトゼオライトC:交換性陽イオンとして水素イオンを保持するゼオライト
以上の工程(1)から工程(3)を含むことを特徴とする微生物細胞からのプラスミドDNA抽出法。
First, a method for extracting plasmid DNA from microbial cells, comprising:
Step (1): A step of preparing lysate by lysing microbial cells with the following cell lysate A.
Step (2): The step of bringing the following zeolite B and zeolite C into contact with the lysate prepared in step (1).
Step (3): A step of separating the insoluble fraction and the aqueous layer.
Cell lysate A: a solution containing an alkali metal hydroxide salt and an anionic surfactant excluding an alkyl sulfate.
Zeolite B: exchangeable zeolite that holds an alkaline earth metal cations as the cation. Zeolite C: exchangeable zeolite to hold the hydrogen ions as cations.
A method for extracting plasmid DNA from microbial cells, comprising the steps (1) to (3) above.

第2に、微生物細胞からプラスミドDNAを抽出する方法であって、
工程(1):以下の細胞溶解液Aにより微生物細胞を溶解してライセートを調製する工程。
工程(2):工程(1)において調製したライセートに、以下のゼオライトBおよびゼオライトCを接触させる工程。
工程(3):不溶性画分と水層を分離する工程。
細胞溶解液A:水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化セシウムからなる群より選択される、1つまたは複数のアルカリ金属水酸化物塩と、アルキル硫酸塩とを含む液。
ゼオライトB:カリウム、ルビジウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウムからなる群より選択される、1つまたは複数の陽イオンを交換性陽イオンとして保持するゼオライト
ゼオライトC:交換性陽イオンとして水素イオンを保持するゼオライト
以上の工程(1)から工程(3)を含むことを特徴とする微生物細胞からのプラスミドDNA抽出法。
Second, a method of extracting plasmid DNA from microbial cells,
Step (1): A step of preparing lysate by lysing microbial cells with the following cell lysate A.
Step (2): The step of bringing the following zeolite B and zeolite C into contact with the lysate prepared in step (1).
Step (3): A step of separating the insoluble fraction and the aqueous layer.
Cell lysate A: A solution containing one or more alkali metal hydroxide salts selected from the group consisting of lithium hydroxide, sodium hydroxide, and cesium hydroxide, and alkyl sulfates.
Zeolite B: potassium, rubidium, calcium, strontium, is selected from the group consisting of barium, one or more zeolites which holds a cation as exchangeable cations.
Zeolite C: exchangeable zeolite to hold the hydrogen ions as cations.
A method for extracting plasmid DNA from microbial cells, comprising the steps (1) to (3) above.

第3に、前記第1項または第2項に記載の工程(2)において、ライセートがゼオライトBへの接触の後にゼオライトCへ接触することを特徴とする前記第1項または第2項に記載の微生物細胞からのプラスミドDNA抽出法。 Thirdly, in the step (2) described in the above item 1 or 2, the lysate contacts the zeolite C after the contact with the zeolite B. Of extracting plasmid DNA from microbial cells.

第4に、前記第1項または第2項に記載の工程(2)において、ライセートがゼオライトBゼオライトCとに同時に接触することを特徴とする前記第1項または第2項に記載の微生物細胞からのプラスミドDNA抽出法。 Fourth, the microorganism according to item 1 or item 2, wherein the lysate is simultaneously contacted with zeolite B and zeolite C in step (2) according to item 1 or item 2. Plasmid DNA extraction from cells.

第5に、前記第1項または第2項に記載の工程(2)において、ライセートとゼオライトBまたはゼオライトCあるいはその両方との接触が、ゼオライトを充填したカラムにより行われることを特徴とする前記第1項乃至第4項のいずれかに記載の微生物細胞からのプラスミドDNA抽出法。 Fifth, in the step (2) described in the above item 1 or 2, the contact between the lysate and zeolite B and / or zeolite C is performed by a column packed with zeolite. 5. A method for extracting plasmid DNA from microbial cells according to any one of items 1 to 4.

本発明のプラスミドDNA抽出法は、上記のように(1)微生物細胞を溶解してライセートを調製する工程、(2)ライセートにゼオライトを接触させる工程、(3)不溶性画分と水層を分離する工程、からなる3操作によって微生物材料からプラスミドDNAを取得することができる。本発明によるプラスミドDNA抽出工程を、特許文献1および特許文献2に記載の方法に基づく核酸結合担体を用いたプラスミドDNA抽出法と比較し、図1に示した。本発明のプラスミドDNA抽出法は、プラスミドDNAを含む微生物細胞を溶解しライセートを調製する工程までは、従来法と類似である。しかし、次の工程であるライセートとゼオライトとの接触工程において、界面活性剤の除去、タンパク質と染色体DNAの凝集不溶化による除去、脱塩が同時に進行するため、この工程を経るのみでプラスミドDNAを取得することができる。また使用する試薬類は、微生物細胞溶解液および2種のゼオライトのみである。従って、従来の核酸結合担体を用いたプラスミドDNA抽出法と比較した場合、操作の簡略化、試薬使用量の削減が可能となる。また、本発明の方法をプラスミドDNA自動抽出装置に適用すれば、装置の簡略化、運転時間の短縮に貢献
することは明らかである。
As described above, the plasmid DNA extraction method of the present invention comprises (1) a step of lysing microbial cells to prepare a lysate, (2) a step of bringing a lysate into contact with zeolite , and (3) separation of an insoluble fraction and an aqueous layer. Plasmid DNA can be obtained from the microbial material by three operations comprising the steps of: The plasmid DNA extraction step according to the present invention is shown in FIG. 1 in comparison with a plasmid DNA extraction method using a nucleic acid binding carrier based on the methods described in Patent Document 1 and Patent Document 2. The plasmid DNA extraction method of the present invention is similar to the conventional method until the step of lysing microbial cells containing plasmid DNA to prepare lysate. However, in the next step, lysate- zeolite contact step, removal of surfactant, removal by aggregation and insolubilization of protein and chromosomal DNA, and desalting proceed simultaneously, so plasmid DNA can be obtained only through this step. can do. The only reagents used are microbial cell lysate and two types of zeolite . Accordingly, when compared with a plasmid DNA extraction method using a conventional nucleic acid binding carrier, the operation can be simplified and the amount of reagent used can be reduced. It is clear that the application of the method of the present invention to a plasmid DNA automatic extraction apparatus contributes to simplification of the apparatus and shortening of the operation time.

本発明のプラスミド抽出法は、(1)微生物細胞を溶解してライセートを調製する工程、(2)ライセートにゼオライトを接触させる工程、(3)不溶性画分と水層を分離する工程、を含む。以下に、本発明のプラスミドDNA抽出法を実施するための最良の形態について説明する。 The plasmid extraction method of the present invention comprises (1) a step of lysing microbial cells to prepare a lysate, (2) a step of bringing a lysate into contact with zeolite , and (3) a step of separating an insoluble fraction from an aqueous layer. . The best mode for carrying out the plasmid DNA extraction method of the present invention will be described below.

本発明の方法が対象とするプラスミドDNAは、遺伝子工学に用いるために改良されたプラスミドDNA、および天然に存在するプラスミドDNAを含む。特に遺伝子工学に用いられるプラスミドDNAは、その機能的性格からベクターと称することもある。またその由来からコスミド、バクミドと称することもある。   The plasmid DNA targeted by the method of the present invention includes plasmid DNA improved for use in genetic engineering and naturally occurring plasmid DNA. In particular, plasmid DNA used for genetic engineering is sometimes called a vector because of its functional character. Moreover, it may be called a cosmid and a bacmid from the origin.

本発明の方法において、プラスミドDNA抽出の出発材料となる微生物細胞としては、例えばプラスミドDNAを保持する大腸菌が挙げられる。特に、遺伝子工学実験において日常的に用いられる大腸菌K12株およびその誘導体を、プラスミドDNAの導入によって形質転換したものが代表的である。   In the method of the present invention, examples of the microbial cell used as a starting material for plasmid DNA extraction include Escherichia coli that holds plasmid DNA. In particular, E. coli K12 strain and its derivatives routinely used in genetic engineering experiments are typically transformed by introducing plasmid DNA.

本発明の方法では、プラスミドDNAを保持する微生物細胞を、既知の培地、例えばSOB、SOC、LB等で8−24時間培養したものを出発材料とする。培養した微生物細胞は、遠心操作等によりペレットとして回収してもよい。回収したペレットは、そのまま工程(1)のライセート調製に供してもよいが、前処理として、ペレットを純水あるいは緩衝液に分散する工程を設けてもよい。この工程は、微生物細胞の破壊反応が速やかかつ均等に進行することを助ける。緩衝液としては、例えば、TE[10mMTris−HCl pH8.0、1mM ETDA]、非特許文献1に記載のsolution I[25
mMTris−HCl(pH8.0)、10mM EDTA、0.9%グルコース]が挙
げられる。さらに、この工程においてRNase、プロテアーゼの添加を行ってもよい。
In the method of the present invention, microbial cells retaining plasmid DNA are cultured in a known medium such as SOB, SOC, LB, etc. for 8-24 hours, and used as a starting material. The cultured microbial cells may be collected as a pellet by centrifugation or the like. The recovered pellets may be directly used for lysate preparation in step (1), but as a pretreatment, a step of dispersing the pellets in pure water or a buffer solution may be provided. This step helps the microbial cell destruction reaction proceed rapidly and evenly. As the buffer solution, for example, TE [10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM ETDA], solution I [25 described in Non-Patent Document 1]
mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA, 0.9% glucose]. Furthermore, RNase and protease may be added in this step.

工程(1)微生物細胞を溶解し、ライセートを調製する工程
工程(1)では、ペレットまたは分散させた微生物細胞を、細胞溶解液Aを用いて溶解し、ライセートを調製する。この工程で用いる細胞溶解液Aは、アルカリ金属水酸化物塩と、陰イオン界面活性剤とを含む。アルカリ金属水酸化物塩は、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ルビジウム、水酸化セシウムから一つ、または複数選択して使用することができる。細胞溶解液は、DNAを1本鎖に変性させうるpH10〜14の範囲であることが好ましく、これはアルカリ金属水酸化物塩の濃度によって調整することができる。例えば濃度200mMの水酸化ナトリウムを用いる場合、pHは約12.5である。細胞溶解液に含まれる陰イオン界面活性剤は、アルキル硫酸塩を除いた陰イオン界面活性剤、例えばアルキルベンゼンスルホン酸塩、N−ラウロイルサルコシン塩、コール酸塩、デオキシコール酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸塩等から1つ、または複数選択して用いることができる。陰イオン界面活性剤は、アルカリ金属塩またはアンモニウム塩であることが好ましい。陰イオン界面活性剤の濃度は、0.1〜3%が好適である。
Step (1) Step of dissolving microbial cells and preparing lysate In step (1), lysate is prepared by lysing the pellet or dispersed microbial cells using cell lysate A. The cell lysate A used in this step contains an alkali metal hydroxide salt and an anionic surfactant. One or more alkali metal hydroxide salts can be selected from lithium hydroxide, sodium hydroxide, potassium hydroxide, rubidium hydroxide, and cesium hydroxide. The cell lysate is preferably in the range of pH 10-14 that can denature DNA into single strands, which can be adjusted by the concentration of alkali metal hydroxide salt. For example, when 200 mM sodium hydroxide is used, the pH is about 12.5. The anionic surfactant contained in the cell lysate is an anionic surfactant excluding alkyl sulfate such as alkylbenzene sulfonate, N-lauroyl sarcosine salt, cholate, deoxycholate, polyoxyethylene alkyl One or a plurality of ether sulfates, polyoxyethylene alkyl ether phosphates, and the like can be selected and used. The anionic surfactant is preferably an alkali metal salt or an ammonium salt. The concentration of the anionic surfactant is preferably 0.1 to 3%.

工程(1)の細胞溶解液に、陰イオン界面活性剤としてドデシル硫酸ナトリウムに代表されるアルキル硫酸塩が含まれる場合は、前記水酸化物塩は水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化セシウムから1つ、または複数選択することができる。水酸化カリウム、水酸化ルビジウムは、アルキル硫酸塩と反応して不溶性の沈殿を形成するため、好ましくない。アルキル硫酸塩の濃度は、0.1〜3%が好適である。   When the cell lysate in step (1) contains an alkyl sulfate represented by sodium dodecyl sulfate as an anionic surfactant, the hydroxide salt is selected from lithium hydroxide, sodium hydroxide, and cesium hydroxide. One or more can be selected. Potassium hydroxide and rubidium hydroxide are not preferred because they react with alkyl sulfate to form an insoluble precipitate. The concentration of the alkyl sulfate is preferably 0.1 to 3%.

工程(2)ライセートをゼオライトと接触させる工程
工程(2)では、工程(1)で調製したライセートを、ゼオライトBおよび、ゼオライトCと接触させる。ゼオライトBが保持する交換性陽イオンは、工程(1)の細胞溶解液Aに含まれる陰イオン界面活性剤の種類によって選択される。すなわち、陰イオン界面活性剤がアルキル硫酸塩を含まない場合は、アルカリ土類金属陽イオンから1つ、または複数選択することができる。陰イオン界面活性剤がアルキル硫酸塩を含む場合は、カリウム、ルビジウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウムからなる群より1つ、または複数選択することができる。この群から少なくとも1つが選択されている場合、二つめ以降の陽イオンとしてマグネシウムを選択していてもよい。ゼオライトCが保持する交換性陽イオンは水素イオンである。
Step (2) Step of contacting lysate with zeolite In step (2), the lysate prepared in step (1) is brought into contact with zeolite B and zeolite C. The exchangeable cation retained by zeolite B is selected depending on the type of anionic surfactant contained in cell lysate A in step (1). That is, when the anionic surfactant does not contain an alkyl sulfate, one or a plurality of alkaline earth metal cations can be selected. When the anionic surfactant contains an alkyl sulfate, one or more can be selected from the group consisting of potassium, rubidium, calcium, strontium and barium. When at least one is selected from this group, magnesium may be selected as the second and subsequent cations. The exchangeable cation retained by zeolite C is a hydrogen ion.

工程(2)−1 ライセートとゼオライトBとの接触工程
以下、ライセート中に含まれる陽イオンを陽イオンD、ゼオライトBが保持する交換性陽イオンを陽イオンEと称す。
Step (2) -1 Contacting Step of Lysate and Zeolite B Hereinafter, the cation contained in the lysate is referred to as cation D, and the exchangeable cation retained by zeolite B is referred to as cation E.

工程(2)−1では、ライセートとゼオライトBとの接触により、ライセート中に含まれる陽イオンDが、ゼオライトBが保持する陽イオンEと交換し、ライセートから除去される。同時に、ライセート中に遊離した陽イオンEは、ライセート中の陰イオン界面活性剤と反応し、沈殿を形成する。 In step (2) -1, the cation D contained in the lysate is exchanged with the cation E retained by the zeolite B by the contact between the lysate and the zeolite B, and is removed from the lysate. At the same time, the cation E liberated in the lysate reacts with the anionic surfactant in the lysate to form a precipitate.

この反応のために必要なゼオライトBの量は、少なくとも工程(1)で用いられる細胞溶解液Aの陰イオン界面活性剤の等量数と等しい量の陽イオンEを供給する必要がある。ゼオライトBが単位量当たり保持する陽イオンEの量、陰イオン界面活性剤の種類、細胞溶解液Aの使用量によってゼオライトBの必要量は異なるが、例えば陽イオンEを1meq/g保持するゼオライトBを使用する場合、工程(1)の細胞溶解液Aに含まれる陰イオン界面活性剤が1%デオキシコール酸ナトリウム(分子量414.55)であり、この液1mLを細胞の溶解に用いる場合、数1により、必要量は、少なくとも0.024gであると計算できる。 The amount of zeolite B required for this reaction needs to supply an amount of cation E equal to at least the equivalent number of anionic surfactant in cell lysate A used in step (1). The required amount of zeolite B varies depending on the amount of cation E retained per unit amount of zeolite B , the kind of anionic surfactant, and the amount of cell lysate A used. For example, zeolite that retains cation E at 1 meq / g When using B , the anionic surfactant contained in the cell lysate A in step (1) is 1% sodium deoxycholate (molecular weight 414.55), and when 1 mL of this solution is used for cell lysis, From Equation 1, the required amount can be calculated to be at least 0.024 g.

工程(2)−2 ライセートとゼオライトCとの接触工程
工程(2)−2では、ライセートとゼオライトCとの接触により、陽イオンEと交換しきれなかったライセート中に残存する陽イオンD、および陰イオン界面活性剤と反応しなかった陽イオンEが、ゼオライトCが保持する水素イオンと交換し、ライセート中から除去される。同時に、ライセート中に遊離した水素イオンは、ライセート中の水酸化物イオンと反応し、中和が起こる。
Step (2) -2 Contact Step of Lysate and Zeolite C In Step (2) -2, cation D remaining in the lysate that could not be exchanged for cation E by contact between lysate and zeolite C , and The cation E that has not reacted with the anionic surfactant is exchanged with the hydrogen ion retained in the zeolite C and removed from the lysate. At the same time, the hydrogen ions liberated in the lysate react with the hydroxide ions in the lysate to cause neutralization.

この反応のために必要なゼオライトCの量は、少なくとも工程(1)で用いられる細胞溶解液Aのアルカリ金属水酸化物塩のモル数と等しい量の水素イオンを供給する必要がある。ゼオライトCが単位量当たり保持する水素イオンの量、細胞溶解液Aの使用量、細胞溶解液Aに含まれるアルカリ金属水酸化物塩の濃度によってゼオライトCの必要量は異なるが、例えば水素イオンを1meq/g保持するゼオライトCを使用する場合、工程(1
)の細胞溶解液Aに含まれるアルカリ金属水酸化物塩が200mMの水酸化ナトリウムであり、この液1mLを細胞の溶解に用いる場合、数2により、必要量は、少なくとも0.2gであると計算できる。
The amount of zeolite C necessary for this reaction needs to supply at least hydrogen ions in an amount equal to the number of moles of the alkali metal hydroxide salt of the cell lysate A used in step (1). The required amount of zeolite C varies depending on the amount of hydrogen ions retained per unit amount by zeolite C, the amount of cell lysate A used, and the concentration of alkali metal hydroxide salt contained in cell lysate A. When using zeolite C holding 1 meq / g, step (1
When the alkali metal hydroxide salt contained in the cell lysate A) is 200 mM sodium hydroxide and 1 mL of this solution is used for lysis of the cells, the required amount is at least 0.2 g according to Equation 2. Can be calculated.

以上の工程により、ライセートからの陰イオン界面活性剤の除去と中和が完了し、変性状態にあった染色体DNAおよびタンパク質は不溶性の凝集物となる。またタンパク質は、ゼオライトへの吸着反応によっても除去される。この時、プラスミドDNAは溶液中に残存する。 The above steps complete the removal and neutralization of the anionic surfactant from the lysate, and the chromosomal DNA and protein in a denatured state become insoluble aggregates. Proteins are also removed by adsorption reaction to zeolite . At this time, the plasmid DNA remains in the solution.

工程(2)において、ライセートをゼオライトBおよびゼオライトCと接触させる操作は、同時に行われてもよい。これは、ゼオライトBゼオライトCを混合したものを調製し、ライセートに接触させることにより可能である。 In the step (2), the operation of bringing the lysate into contact with zeolite B and zeolite C may be performed simultaneously. This is possible by preparing a mixture of zeolite B and zeolite C and bringing it into contact with the lysate.

さらに、ライセートをゼオライトBおよびゼオライトCに同時に接触させる操作は、陽イオンEと水素イオンを同時に保持するゼオライト粒子あるいはゼオライト固体によっても可能である。このようなゼオライトは、陽イオンEでイオン交換したゼオライトの交換性陽イオンを、さらに水素イオンで一部のみをイオン交換することにより、またはその逆の順序によるイオン交換により調製することができる。 Furthermore, the operation of bringing the lysate into contact with zeolite B and zeolite C at the same time is also possible with zeolite particles or zeolite solids that simultaneously hold the cation E and hydrogen ions. Such a zeolite can be prepared by exchanging only a part of the exchangeable cation of the zeolite ion-exchanged with the cation E and further with a hydrogen ion, or by ion exchange in the reverse order.

工程(2)におけるライセートとゼオライトを接触状態におく方法の例として(a)直接添加法、(b)カラム充填法、を挙げることができる。以下、両方法について、工程(3)不溶性画分と水層を分離する工程を含めて説明する。 Examples of the method for bringing the lysate and zeolite into contact in the step (2) include (a) direct addition method and (b) column packing method. Hereinafter, both methods will be described including the step (3) the step of separating the insoluble fraction and the aqueous layer.

(a)直接添加法
ゼオライトBと、ゼオライトCとを、工程(1)のライセートが入った容器に添加する方法である。ゼオライトBと、ゼオライトCが別個のゼオライトである場合、前記ゼオライトを混合したものを添加してもよい。個別に添加する場合は、まずゼオライトBを添加し、続いてゼオライトCを添加することが好ましい。
(A) Direct addition method
In this method, zeolite B and zeolite C are added to the container containing the lysate of step (1). When zeolite B and zeolite C are separate zeolites , a mixture of the zeolites may be added. When added individually, it is preferable to add zeolite B first, and then add zeolite C.

直接添加法の場合、ライセートとゼオライトとの接触後は、工程(3)不溶性画分と水層の分離を、既知の方法、例えば遠心分離法、フィルターによるろ過法により行うことができる。フィルターによるろ過法を適用する場合、核酸を吸着しない、あるいは吸着性の低いものであれば使用可能である。フィルターの材質は、セルロース、コーティングを施したガラス、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエチレンテレフタレート、ポリテトラフルオロエチレン等から選択できる。 In the case of the direct addition method, after the contact between the lysate and the zeolite , the step (3) separation of the insoluble fraction and the aqueous layer can be performed by a known method such as a centrifugal separation method or a filtration method using a filter. When a filtration method using a filter is applied, any nucleic acid that does not adsorb nucleic acid or has low adsorbability can be used. The material of the filter can be selected from cellulose, coated glass, polyethylene, polypropylene, nylon, polyethylene terephthalate, polytetrafluoroethylene, and the like.

(b)カラム充填法
ゼオライトBと、ゼオライトCとを充填したカラムを用いる方法である。ゼオライトを充填したカラムは、ライセートを通液する前にあらかじめ超純水で洗浄して平衡化しておくことが好ましい。
(B) Column packing method
This is a method using a column packed with zeolite B and zeolite C. The column packed with zeolite is preferably washed and equilibrated in advance before passing the lysate.

ゼオライトBゼオライトCが別個のゼオライトである場合、前記ゼオライトを混合したものをカラムに充填してもよい。また、陽イオンEと水素イオンを同時に保持するゼオライト粒子あるいはゼオライト固体をカラムに充填してもよい。 When the zeolite B and the zeolite C are separate zeolites , a mixture of the zeolites may be packed in the column. Alternatively, the column may be filled with zeolite particles or zeolite solids that simultaneously hold cations E and hydrogen ions.

ゼオライトBゼオライトCが別個のゼオライトであり、これらを混合せずにカラムに充填する場合は、ゼオライトBが、ゼオライトCよりもカラムの通水方向に対して上流に配置されていることが好ましい。これらゼオライトの配置は、連続的であってもよいし、不連続的であってもよい。 When the zeolite B and the zeolite C are separate zeolites and are packed in the column without mixing them, it is preferable that the zeolite B is disposed upstream of the zeolite C with respect to the flow direction of the column. . The arrangement of these zeolites may be continuous or discontinuous.

ゼオライトBを充填したカラムと、ゼオライトCを充填したカラムを個別に調製し、これらを連結して使用することもできる。この場合、ゼオライトBを充填したカラムが、ゼオライトCを充填したカラムよりも通水方向に対して上流に配置されていることが好ましい。 A column packed with zeolite B and a column packed with zeolite C can be prepared separately, and these can be connected and used. In this case, the column filled with zeolite B is preferably arranged upstream of the column filled with zeolite C with respect to the water flow direction.

調製されたゼオライト充填カラムに対してライセートを通液すると、カラムを通過する過程でライセート中の陽イオンDとゼオライト中の陽イオンEが交換し、陰イオン界面活性剤の除去とライセートの中和が進行する。この反応に伴い凝集したタンパク質および染色体DNAはゼオライトに捕捉され、プラスミドDNAが非吸着画分として溶出される。通液は、自然落下式、加圧押し出し式、減圧吸引式、遠心機を用いたスピンカラム式等により実施できる。 When the lysate is passed through the prepared zeolite packed column, the cation D in the lysate and the cation E in the zeolite are exchanged in the process of passing through the column, thereby removing the anionic surfactant and neutralizing the lysate. Progresses. Proteins and chromosomal DNA aggregated by this reaction are captured by zeolite , and plasmid DNA is eluted as a non-adsorbed fraction. The liquid can be passed by a natural drop method, a pressure extrusion method, a vacuum suction method, a spin column method using a centrifuge, or the like.

カラム充填法の場合、工程(3)の不溶性画分と水層の分離は、カラム通過によって行われる。すなわち、不溶性画分はカラム中のゼオライトに捕捉され、またカラムの最終フィルターに捕捉されることにより除去される。 In the column packing method, the insoluble fraction and the aqueous layer in step (3) are separated by passing through the column. That is, the insoluble fraction is captured by the zeolite in the column and removed by being captured by the final filter of the column.

以上の工程(1)から工程(3)を含む方法で回収されたプラスミドDNAは、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿、ゲルろ過等の精製、濃縮、脱塩操作を追加することなしに、制限酵素処理、PCR等の各種酵素処理に使用可能である。   Plasmid DNA recovered by the method including the above steps (1) to (3) can be used for restriction enzymes without adding phenol / chloroform extraction, ethanol precipitation, gel filtration and other purification, concentration, and desalting operations. It can be used for various enzyme treatments such as treatment and PCR.

以下、調製例および実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。   EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated further more concretely according to a preparation example and an Example, this invention is not limited to these.

(定義1)
陽イオンの量を示す等量とは、陽イオンのモル数にその陽イオンの価数を乗じた値を指し、eqで表す。
(Definition 1)
The equivalent amount indicating the amount of a cation refers to a value obtained by multiplying the number of moles of a cation by the valence of the cation, and is represented by eq.

(定義2)
カリウム型ゼオライトとは、交換性陽イオンとしてカリウムイオンを保持しているゼオライトを指す。同様に、マグネシウム型ゼオライト、カルシウム型ゼオライト、ストロンチウム型ゼオライト、バリウム型ゼオライト、水素イオン型ゼオライトは、それぞれ、交換性陽イオンとしてマグネシウムイオンを保持しているゼオライト、交換性陽イオンとしてカルシウムイオンを保持しているゼオライト、交換性陽イオンとしてストロンチウムイオンを保持しているゼオライト、交換性陽イオンとしてバリウムイオンを保持しているゼオライト、交換性陽イオンとして水素イオンを保持しているゼオライト、を指す。
(Definition 2)
A potassium type zeolite refers to a zeolite holding potassium ions as exchangeable cations. Similarly, magnesium-type zeolite, calcium-type zeolite, strontium-type zeolite, barium-type zeolite, and hydrogen ion-type zeolite hold zeolite ions that hold magnesium ions as exchangeable cations and calcium ions as exchangeable cations, respectively. It refers to zeolite that holds strontium ions as exchangeable cations, zeolite that holds barium ions as exchangeable cations, and zeolite that holds hydrogen ions as exchangeable cations.

陰イオン界面活性剤を除去可能な陽イオンの検討
陰イオン界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム、ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム、N−ラウロイルサルコシンナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムについて、
陽イオンとの反応による沈殿除去が可能かを、次の方法により検討した。1%の上記陰イオン界面活性剤1mLに対して、濃度1Mのアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩の溶液0.1mLを添加混合し、沈殿生成を目視により確認した。表1に塩溶液の種類、および沈殿生成の有無を示す。なお、実験は室温(20℃)で行った。表1に示されるように、ドデシル硫酸ナトリウムと反応して沈殿を生じる陽イオンはカリウム、ルビジウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウムであった。また、ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム、N−ラウロイルサルコシンナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムと反応して沈殿を生じる陽イオンはマグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウムであった。
Study of cations capable of removing anionic surfactants Regarding anionic surfactants sodium dodecyl sulfate, sodium laurylbenzenesulfonate, sodium N-lauroyl sarcosine, sodium deoxycholate,
The following method was used to examine whether precipitation removal by reaction with cations was possible. 0.1 mL of a solution of an alkali metal salt and an alkaline earth metal salt having a concentration of 1 M was added to and mixed with 1 mL of 1% of the above anionic surfactant, and precipitation was confirmed visually. Table 1 shows the types of salt solution and the presence or absence of precipitation. The experiment was performed at room temperature (20 ° C.). As shown in Table 1, cations that react with sodium dodecyl sulfate to cause precipitation were potassium, rubidium, calcium, strontium, and barium. Moreover, the cation which reacts with sodium lauryl benzenesulfonate, sodium N-lauroyl sarcosine, and sodium deoxycholate and produces precipitation was magnesium, calcium, strontium, and barium.

(調製例1) 交換性陽イオンとしてカリウム、マグネシウム、カルシウム、ストロン
チウム、バリウムを保持するゼオライトの調製
交換性陽イオンとしてカリウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウムを保持するゼオライトを、次の方法により調製した。本調製例に用いたゼオライト試料を、表2に示す。天然ゼオライトは粒径が45μm以下となるよう原石を遊星ボールミルにて粉砕し、超純水で十分に洗浄した後乾燥させた。合成ゼオライトは、ナトリウム型のものを入手した。これらのゼオライト50gを、0.1Mの塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化ストロンチウム、塩化バリウム各水溶液1Lに浸漬し、80℃にて16時間放置した。その後、各水溶液を新しく調製したものと交換し、再度80℃にて16時間放置した。この操作を12〜15回繰り返すことにより、イオン交換を行った。イオン交換終了後、各ゼオライトを超純水で十分洗浄した後、乾燥させた。
(Preparation Example 1) Preparation of zeolite holding potassium, magnesium, calcium, strontium and barium as exchangeable cations. Zeolite holding potassium, magnesium, calcium, strontium and barium as exchangeable cations was prepared by the following method. did. Table 2 shows the zeolite samples used in this preparation example. The natural zeolite was crushed with a planetary ball mill so that the particle size would be 45 μm or less, thoroughly washed with ultrapure water, and then dried. Synthetic zeolite was obtained in the sodium form. 50 g of these zeolites were immersed in 1 L each of 0.1 M potassium chloride, magnesium chloride, calcium chloride, strontium chloride, and barium chloride aqueous solution and allowed to stand at 80 ° C. for 16 hours. Thereafter, each aqueous solution was replaced with a freshly prepared solution, and left again at 80 ° C. for 16 hours. Ion exchange was performed by repeating this operation 12 to 15 times. After completion of the ion exchange, each zeolite was sufficiently washed with ultrapure water and then dried.

以上の方法で調製したゼオライトについて、保持する交換性陽イオンの量を、以下の方法により測定した。各ゼオライト試料を約0.5g秤り取り、これを50mLの1M硝酸アンモニウム水溶液に浸漬して80℃にて約16時間保持したのち、遠心操作によってゼオライトと硝酸アンモニウム水溶液を分離した。この操作により、ゼオライト中に保持されていた各陽イオンを硝酸アンモニウムに溶出させた。その後、硝酸アンモニウム水溶液中に含まれる各陽イオンの濃度を、カリウム、マグネシウム、カルシウムは偏光ゼーマン原子吸光分光光度計(日立製作所製Z−6000)にて、ストロンチウム、バリウムは誘導結合プラズマ発光分光分析装置(島津製作所製ICP−7500)にて測定し、元々のゼオライト中の各陽イオンの保持量を算出した。結果を表2に示す。   With respect to the zeolite prepared by the above method, the amount of exchangeable cation retained was measured by the following method. About 0.5 g of each zeolite sample was weighed, immersed in 50 mL of 1M ammonium nitrate aqueous solution and kept at 80 ° C. for about 16 hours, and then the zeolite and ammonium nitrate aqueous solution were separated by centrifugation. By this operation, each cation retained in the zeolite was eluted in ammonium nitrate. Thereafter, the concentration of each cation contained in the aqueous ammonium nitrate solution was determined using a polarized Zeeman atomic absorption spectrophotometer (Z-6000, manufactured by Hitachi, Ltd.) for potassium, magnesium, and calcium, and an inductively coupled plasma emission spectrometer for strontium and barium. (ICP-7500 manufactured by Shimadzu Corporation) was measured, and the amount of each cation retained in the original zeolite was calculated. The results are shown in Table 2.

(調製例2) 水素イオンを保持するゼオライトの調製
水素イオンを保持するゼオライトは、次の方法により調製した。本調製例に用いたゼオライト試料を、表3に示す。天然ゼオライトは粒径が45μm以下となるよう原石を遊星ボールミルにて粉砕し、超純水で十分に洗浄した後乾燥させた。これらのゼオライト50gを、0.1MのHCl水溶液1Lに浸漬して80℃にて16時間放置した。その後、HCl水溶液を新しく調製したものと交換し、再度80℃にて16時間放置した。この操作を13回繰り返すことにより、イオン交換を行った。イオン交換終了後、各ゼオライトを超純水で十分洗浄した後、乾燥させた。
(Preparation Example 2) Preparation of zeolite holding hydrogen ions A zeolite holding hydrogen ions was prepared by the following method. Table 3 shows the zeolite samples used in this preparation example. The natural zeolite was crushed with a planetary ball mill so that the particle size would be 45 μm or less, thoroughly washed with ultrapure water, and then dried. 50 g of these zeolites were immersed in 1 L of 0.1 M HCl aqueous solution and left at 80 ° C. for 16 hours. Thereafter, the aqueous HCl solution was replaced with a freshly prepared one, and again left at 80 ° C. for 16 hours. Ion exchange was performed by repeating this operation 13 times. After completion of the ion exchange, each zeolite was sufficiently washed with ultrapure water and then dried.

以上の方法で調製したゼオライトが保持する水素イオンの量を、以下の方法により測定した。各ゼオライト試料を約0.5g秤り取り、これに100mLの1M塩化ナトリウム水溶液を加えてスターラーにて撹拌した。これにより、水素イオンを完全に塩化ナトリウム水溶液中に溶出した。この溶液をオートビュレット(メトラートレド製719STitrino)を用いて0.1mol/L水酸化ナトリウム水溶液でpH7を終点として滴定し、ゼオライト中の水素イオンの保持量を算出した。結果を表3に示す。   The amount of hydrogen ions retained by the zeolite prepared by the above method was measured by the following method. About 0.5 g of each zeolite sample was weighed, and 100 mL of 1M sodium chloride aqueous solution was added thereto, followed by stirring with a stirrer. As a result, hydrogen ions were completely eluted in the aqueous sodium chloride solution. The solution was titrated with an 0.1 mol / L sodium hydroxide aqueous solution using Autoburet (719 Stitino, manufactured by METTLER TOLEDO) with pH 7 as the end point, and the amount of hydrogen ions retained in the zeolite was calculated. The results are shown in Table 3.

(調製例3) 大腸菌DH5αのpBluescript II SK+による形質転換
大腸菌DH5αのコンピテントセル(TOYOBO製Competenthigh E
.coli DH5α)100μLに対してプラスミドDNApBluescript II SK+(STRATAGENE製)1pgを加え、添付の取り扱い説明書に従って形
質転換を行い、LB/Ampプレートにて培養した。37℃にて16時間の培養後、単一のコロニーをLB培地25mLに植菌し、37℃にて16時間震とう培養した。培養後、培養液を1.5mLポリプロピレン製チューブに1mLづつ分注し、マイクロ冷却遠心機(KUBOTA製3700)にて12000rpm、1分の遠心を行い、菌体ペレットと培地とに分離した。培地を除去し、得られたポリプロピレン製チューブ入り菌体ペレットを出発材料とし、プラスミドDNA抽出操作を行った。
(Preparation Example 3) Transformation of Escherichia coli DH5α with pBluescript II SK + Competent cells of E. coli DH5α (Competenthigh E manufactured by TOYOBO)
. 1 pg of plasmid DNA pBluescript II SK + (manufactured by STRATAGENE) was added to 100 μL of E. coli DH5α), and the cells were transformed according to the attached instruction manual and cultured on an LB / Amp plate. After culturing at 37 ° C. for 16 hours, a single colony was inoculated into 25 mL of LB medium, and cultured with shaking at 37 ° C. for 16 hours. After culturing, 1 mL of the culture solution was dispensed into a 1.5 mL polypropylene tube and centrifuged at 12000 rpm for 1 minute in a micro-cooled centrifuge (3700 manufactured by KUBOTA) to separate the cell pellet and medium. The medium was removed, and plasmid DNA extraction was performed using the obtained bacterial cell pellets in polypropylene tubes as starting materials.

プラスミドDNAの抽出(カリウム型、ストロンチウム型、バリウム型天然ゼオライト+ドデシル硫酸ナトリウム)
調製例3のポリプロピレン製チューブ入り菌体ペレットを6本用意した。それぞれのチューブに100μLの菌体縣濁液[25mMTris−HCl(pH7.5)、10mM
EDTA、0.9%グルコース]を加え、ボルテックスミキサーを用いて撹拌した。次
に、200μLの細胞溶解液[0.2MNaOH、1%ドデシル硫酸ナトリウム]をそれぞれのチューブに加え、転倒混和して菌体を溶解させ、ライセートを調製した。このライセート入りチューブに、表2に記載のカリウム型島根県産天然ゼオライトW、ストロンチウム型島根県産天然ゼオライトW、バリウム型島根県産天然ゼオライトW、カリウム型島根県産天然ゼオライトO、ストロンチウム型島根県産天然ゼオライトO、バリウム型島根県産天然ゼオライトOをそれぞれ0.2g加えて転倒混和した。次に、表3に記載の水素イオン型島根県産天然ゼオライトIを0.2g加えて転倒混和した。次に、上記混合物をマイクロ冷却遠心機(KUBOTA製3700)にて12000rpm、5分の遠心操作による固液分離を行い、上清を新しい1.5mLポリプロピレン製チューブに回収した。回収した上清10μLを1%アガロースによる電気泳動に供した。泳動終了後、臭化エチ
ジウムで染色し、紫外線照射下で写真撮影を行った。結果を図2に示す。図2から明らかなように、カリウム型、ストロンチウム型、バリウム型のいずれのゼオライトを用いても、プラスミドDNAが抽出された。
Extraction of plasmid DNA (potassium type, strontium type, barium type natural zeolite + sodium dodecyl sulfate)
Six cell pellets containing polypropylene tubes of Preparation Example 3 were prepared. In each tube, 100 μL of the cell suspension [25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM
EDTA, 0.9% glucose] was added and stirred using a vortex mixer. Next, 200 μL of cell lysate [0.2 M NaOH, 1% sodium dodecyl sulfate] was added to each tube and mixed by inversion to dissolve the cells, thereby preparing a lysate. In this lysate-containing tube, potassium type Shimane natural zeolite W, strontium type Shimane natural zeolite W, barium type Shimane natural zeolite W, potassium type Shimane natural zeolite O, strontium type Shimane listed in Table 2 0.2 g each of natural zeolite O produced in prefecture and natural zeolite O produced in barium type Shimane prefecture were added and mixed by inversion. Next, 0.2 g of hydrogen ion type natural zeolite I from Shimane Prefecture listed in Table 3 was added and mixed by inversion. Next, the mixture was subjected to solid-liquid separation by centrifugation at 12000 rpm for 5 minutes in a micro-cooled centrifuge (3700 manufactured by KUBOTA), and the supernatant was collected in a new 1.5 mL polypropylene tube. 10 μL of the collected supernatant was subjected to electrophoresis with 1% agarose. After completion of the electrophoresis, it was stained with ethidium bromide and photographed under ultraviolet irradiation. The results are shown in FIG. As is apparent from FIG. 2, plasmid DNA was extracted using any zeolite of potassium type, strontium type, or barium type.

プラスミドDNAの抽出(マグネシウム型、カルシウム型、ストロンチウム型、バリウム型天然ゼオライト+デオキシコール酸ナトリウム)
調製例3のポリプロピレン製チューブ入り菌体ペレットを4本用意した。それぞれのチューブに100μLの菌体縣濁液[25mMTris−HCl(pH7.5)、10mM
EDTA、0.9%グルコース]を加え、ボルテックスミキサーを用いて撹拌した。次
に、200μLの細胞溶解液[0.2MNaOH、1%デオキシコール酸ナトリウム]をそれぞれのチューブに加え、転倒混和して菌体を溶解させ、ライセートを調製した。このライセート入りチューブに、表2に記載のマグネシウム型島根県産天然ゼオライトW、カルシウム型島根県産天然ゼオライトW、ストロンチウム型島根県産天然ゼオライトW、バリウム型島根県産天然ゼオライトWを各0.2g加えて転倒混和した。次に、表3に記載の水素イオン型島根県産天然ゼオライトIを各0.2g加えて転倒混和した。次に、上記混合物をマイクロ冷却遠心機にて12000rpm、5分の遠心操作による固液分離を行い、上清部分を新しい1.5mLポリプロピレン製チューブに回収した。回収した上清10μLを1%アガロースによる電気泳動に供した。泳動終了後、臭化エチジウムで染色し、紫外線照射下で写真撮影を行った。結果を図3に示す。図3から明らかなように、マグネシウム型、カルシウム型、ストロンチウム型、バリウム型のいずれのゼオライトを用いても、プラスミドDNAが抽出された。
Extraction of plasmid DNA (magnesium type, calcium type, strontium type, barium type natural zeolite + sodium deoxycholate)
Four bacterial cell pellets in polypropylene tube of Preparation Example 3 were prepared. In each tube, 100 μL of the cell suspension [25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM
EDTA, 0.9% glucose] was added and stirred using a vortex mixer. Next, 200 μL of a cell lysate [0.2 M NaOH, 1% sodium deoxycholate] was added to each tube and mixed by inversion to dissolve the cells, thereby preparing a lysate. In this lysate-containing tube, each of the magnesium type natural zeolite W from Shimane Prefecture, the natural zeolite W from Shimane Prefecture, the natural zeolite W from Shimane Prefecture, the natural zeolite W from Shimane Prefecture, and the natural zeolite W from barium type Shimane Prefecture as shown in Table 2 were added. 2 g was added and mixed by inversion. Next, 0.2 g of each of hydrogen ion type natural zeolite I from Shimane Prefecture listed in Table 3 was added and mixed by inversion. Next, the mixture was subjected to solid-liquid separation by centrifugation at 12000 rpm for 5 minutes in a micro-cooled centrifuge, and the supernatant was collected in a new 1.5 mL polypropylene tube. 10 μL of the collected supernatant was subjected to electrophoresis with 1% agarose. After completion of the electrophoresis, it was stained with ethidium bromide and photographed under ultraviolet irradiation. The results are shown in FIG. As apparent from FIG. 3, plasmid DNA was extracted using any zeolite of magnesium type, calcium type, strontium type, and barium type.

水素イオン型天然ゼオライトの種類の影響
調製例2のポリプロピレン製チューブ入り菌体ペレットを3本用意した。それぞれのチューブに100μLの菌体縣濁液[25mMTris−HCl(pH7.5)、10mM
EDTA、0.9%グルコース]を加え、ボルテックスミキサーを用いて撹拌した。こ
の溶液に200μLの細胞溶解液[0.2MNaOH、1%ドデシル硫酸ナトリウム]を加え、転倒混和して菌体を溶解させ、ライセートを調製した。この細胞溶解液に、表2に記載のバリウム型島根県産天然ゼオライトW0.2gを加えて転倒混和した。次に、表3に記載の水素イオン型島根県産天然ゼオライトW、水素イオン型島根県産天然ゼオライトO、水素イオン型島根県産天然ゼオライトIを各0.2g加えて転倒混和した。次に、上記混合物をマイクロ冷却遠心機にて12000rpm、5分の遠心操作による固液分離を行い、上清部分を新しい1.5mLポリプロピレン製チューブに回収した。回収した上清10μLを1%アガロースによる電気泳動に供した。泳動終了後、臭化エチジウムで染色し、紫外線照射下で写真撮影を行った。結果を図4に示す。図4から明らかなように、水素イオン型島根県産天然ゼオライトW、水素イオン型島根県産天然ゼオライトO、水素イオン型島根県産天然ゼオライトIのいずれのゼオライトを用いても、プラスミドDNAが抽出された。
Influence of Kind of Hydrogen Ion Type Natural Zeolite Three cell pellets containing polypropylene tubes of Preparation Example 2 were prepared. In each tube, 100 μL of the cell suspension [25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM
EDTA, 0.9% glucose] was added and stirred using a vortex mixer. To this solution, 200 μL of cell lysate [0.2 M NaOH, 1% sodium dodecyl sulfate] was added and mixed by inversion to dissolve the cells, thereby preparing a lysate. To this cell lysate, barium type natural zeolite W0.2 g shown in Table 2 was added and mixed by inversion. Next, 0.2 g each of hydrogen ion type natural zeolite W from Shimane Prefecture, natural ion O from hydrogen ion type Shimane Prefecture and natural zeolite I from hydrogen ion type Shimane Prefecture listed in Table 3 were added and mixed by inversion. Next, the mixture was subjected to solid-liquid separation by centrifugation at 12000 rpm for 5 minutes in a micro-cooled centrifuge, and the supernatant was collected in a new 1.5 mL polypropylene tube. 10 μL of the collected supernatant was subjected to electrophoresis with 1% agarose. After completion of the electrophoresis, it was stained with ethidium bromide and photographed under ultraviolet irradiation. The results are shown in FIG. As is clear from FIG. 4, plasmid DNA can be extracted using any of the zeolites of hydrogen ion type natural zeolite W from Shimane, hydrogen ion type natural zeolite O from Shimane prefecture, and hydrogen ion type natural zeolite I from Shimane prefecture. It was done.

プラスミドDNAの抽出(カリウム型、ストロンチウム型、バリウム型合成ゼオライトA−4+ドデシル硫酸ナトリウム)
調製例3のポリプロピレン製チューブ入り菌体ペレットを3本用意した。それぞれのチューブに100μLの菌体縣濁液[25mMTris−HCl(pH7.5)、10mM
EDTA、0.9%グルコース]を加え、ボルテックスミキサーを用いて撹拌した。次
に、200μLの細胞溶解液[0.2MNaOH、1%ドデシル硫酸ナトリウム]をそれぞれのチューブに加え、転倒混和して菌体を溶解させ、ライセートを調製した。このライセート入りチューブに、表2に記載のカリウム型合成ゼオライトA−4、ストロンチウム
型合成ゼオライトA−4、バリウム型合成ゼオライトA−4をそれぞれ0.2g加えて転倒混和した。次に、表3に記載の水素イオン型島根県産天然ゼオライトIを0.2g加えて転倒混和した。次に、上記混合物をマイクロ冷却遠心機(KUBOTA製3700)にて12000rpm、5分の遠心操作による固液分離を行い、上清を新しい1.5mLポリプロピレン製チューブに回収した。回収した上清10μLを1%アガロースによる電気泳動に供した。泳動終了後、臭化エチジウムで染色し、紫外線照射下で写真撮影を行った。結果を図5に示す。図5から明らかなように、カリウム型、ストロンチウム型、バリウム型のいずれのゼオライトを用いても、プラスミドDNAが抽出された。
Extraction of plasmid DNA (potassium type, strontium type, barium type synthetic zeolite A-4 + sodium dodecyl sulfate)
Three bacterial cell pellets made in polypropylene tube of Preparation Example 3 were prepared. In each tube, 100 μL of the cell suspension [25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM
EDTA, 0.9% glucose] was added and stirred using a vortex mixer. Next, 200 μL of cell lysate [0.2 M NaOH, 1% sodium dodecyl sulfate] was added to each tube and mixed by inversion to dissolve the cells, thereby preparing a lysate. To this lysate-containing tube, 0.2 g of potassium type synthetic zeolite A-4, strontium type synthetic zeolite A-4 and barium type synthetic zeolite A-4 shown in Table 2 were added and mixed by inversion. Next, 0.2 g of hydrogen ion type natural zeolite I from Shimane Prefecture listed in Table 3 was added and mixed by inversion. Next, the mixture was subjected to solid-liquid separation by centrifugation at 12000 rpm for 5 minutes in a micro-cooled centrifuge (3700 manufactured by KUBOTA), and the supernatant was collected in a new 1.5 mL polypropylene tube. 10 μL of the collected supernatant was subjected to electrophoresis with 1% agarose. After completion of the electrophoresis, it was stained with ethidium bromide and photographed under ultraviolet irradiation. The results are shown in FIG. As is apparent from FIG. 5, plasmid DNA was extracted using any zeolite of potassium type, strontium type, or barium type.

プラスミドDNAの抽出(ライセートへのゼオライト添加法の比較)
(1)調製例3のポリプロピレン製チューブ入り菌体ペレットを4本用意し、1〜4の番号を付した。それぞれのチューブに100μLの菌体縣濁液[25mMTris−HCl(pH7.5)、10mM EDTA、0.9%グルコース]を加え、ボルテックスミ
キサーを用いて撹拌した。次に、200μLの細胞溶解液[0.2MNaOH、1%ドデシル硫酸ナトリウム]をそれぞれのチューブに加え、転倒混和して菌体を溶解させ、ライセートを調製した。このライセート入りチューブ1〜4に、表4に記載のゼオライト1およびゼオライト2をあらかじめ等量混合したものをそれぞれ0.4g加えて転倒混和した。次に、上記1〜4のチューブをマイクロ冷却遠心機にて12000rpm、5分の遠心操作による固液分離を行い、上清部分を新しい1.5mLポリプロピレン製チューブに回収した。
Extraction of plasmid DNA (comparison of zeolite addition method to lysate)
(1) Four polypropylene cell-containing pellets of Preparation Example 3 were prepared and numbered 1-4. 100 μL of the cell suspension [25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM EDTA, 0.9% glucose] was added to each tube, and the mixture was stirred using a vortex mixer. Next, 200 μL of cell lysate [0.2 M NaOH, 1% sodium dodecyl sulfate] was added to each tube and mixed by inversion to dissolve the cells, thereby preparing a lysate. 0.4 g each of the lysate-containing tubes 1 to 4 previously mixed with equal amounts of zeolite 1 and zeolite 2 listed in Table 4 was added and mixed by inversion. Next, the above-mentioned tubes 1 to 4 were subjected to solid-liquid separation by centrifugation at 12000 rpm for 5 minutes in a micro-cooled centrifuge, and the supernatant portion was collected in a new 1.5 mL polypropylene tube.

(2)調製例3のポリプロピレン製チューブ入り菌体ペレットを4本用意し、5〜8の番号を付した。それぞれのチューブに100μLの菌体縣濁液[25mMTris−HCl(pH7.5)、10mM EDTA、0.9%グルコース]を加え、ボルテックスミ
キサーを用いて撹拌した。次に、200μLの細胞溶解液[0.2MNaOH、1%ドデシル硫酸ナトリウム]をそれぞれのチューブに加え、転倒混和することにより菌体を溶解させ、ライセートを調製した。このライセート入りチューブ5〜8に、表4に記載のゼオライト1をそれぞれ0.2g加えて転倒混和した。次に、表4に記載のゼオライト2を各0.2g加えて転倒混和した。次に、上記5〜8のチューブをマイクロ冷却遠心機にて12000rpm、5分の遠心操作による固液分離を行い、上清部分を新しい1.5mLポリプロピレン製チューブに回収した。
(2) Four polypropylene cell-containing pellets of Preparation Example 3 were prepared and numbered 5-8. 100 μL of the cell suspension [25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM EDTA, 0.9% glucose] was added to each tube, and the mixture was stirred using a vortex mixer. Next, 200 μL of a cell lysate [0.2 M NaOH, 1% sodium dodecyl sulfate] was added to each tube, and the cells were dissolved by inverting to prepare a lysate. 0.2 g of zeolite 1 shown in Table 4 was added to each of the lysate-containing tubes 5 to 8 and mixed by inversion. Next, 0.2 g of zeolite 2 shown in Table 4 was added and mixed by inversion. Next, the above-mentioned tubes 5 to 8 were subjected to solid-liquid separation by centrifugation at 12000 rpm for 5 minutes using a micro-cooled centrifuge, and the supernatant was collected in a new 1.5 mL polypropylene tube.

(3)前記(1)(2)で回収した上清10μLを1%アガロースによる電気泳動に供した。泳動終了後、臭化エチジウムで染色し、紫外線照射下で写真撮影を行った。結果を図6に示す。図6から明らかなように、いずれのゼオライトの組み合わせにおいてもプラスミドDNAが抽出された。また、ゼオライト1とゼオライト2を混合したものを添加した場合と、ゼオライト1添加後にゼオライト2を添加した場合の双方においてプラスミドDNAが抽出された。   (3) 10 μL of the supernatant collected in (1) and (2) was subjected to electrophoresis with 1% agarose. After completion of the electrophoresis, it was stained with ethidium bromide and photographed under ultraviolet irradiation. The results are shown in FIG. As is clear from FIG. 6, plasmid DNA was extracted in any zeolite combination. Moreover, plasmid DNA was extracted both when the mixture of zeolite 1 and zeolite 2 was added and when zeolite 2 was added after addition of zeolite 1.

プラスミドDNAの制限酵素処理
本発明の方法で抽出したプラスミドDNAが制限酵素による消化処理に適用できるかを、次の方法により確認した。消化処理に使用した制限酵素および反応溶液組成を表5に示す。消化処理は、取り扱い説明書に記載の条件に従い行った。実施例4のバリウム型島根県産天然ゼオライトWと水素イオン型島根県産天然ゼオライトWの組み合わせによって抽出されたプラスミドDNA、およびバリウム型島根県産天然ゼオライトWと水素イオン型島根県産天然ゼオライトOの組み合わせによって抽出されたプラスミドDNAを基質とし、これらプラスミドDNA溶液15μLに制限酵素2〜10U、反応バッファー、超純水を添加して合計を20μLとした。この反応液を、37℃1時間で反応させた。反応終了後、全量を1%アガロースによる電気泳動に供した。泳動終了後、臭化エチジウムで染色し、紫外線照射下で写真撮影を行った。結果を図7に示す。図中のAがバリウム型島根県産天然ゼオライトWと水素イオン型島根県産天然ゼオライトWの組み合わせによって抽出されたプラスミドDNA、Bがバリウム型島根県産天然ゼオライトWと水素イオン型島根県産天然ゼオライトOの組み合わせによって抽出されたプラスミドDNAの処理結果である。レーン7に示す未処理プラスミドDNAは、スーパーコイル構造をとるために早く泳動される。一方、レーン1〜6の制限酵素によって消化されたプラスミドDNAはリニア型となるため、遅く泳動されていることが分かる。このように、全ての制限酵素において消化が確認され、本発明による方法で分離したプラスミドDNAは、直ちに制限酵素消化処理に適用可能であることが示された。
Restriction enzyme treatment of plasmid DNA It was confirmed by the following method whether the plasmid DNA extracted by the method of the present invention can be applied to a digestion treatment with a restriction enzyme. Table 5 shows the restriction enzymes and reaction solution compositions used for the digestion treatment. The digestion treatment was performed according to the conditions described in the instruction manual. Plasmid DNA extracted by combination of barium-type Shimane natural zeolite W and hydrogen ion-type Shimane natural zeolite W in Example 4, and barium-type Shimane natural zeolite W and hydrogen-ion Shimane natural zeolite O The plasmid DNA extracted by the above combination was used as a substrate, and restriction enzymes 2 to 10 U, reaction buffer, and ultrapure water were added to 15 μL of these plasmid DNA solutions to make a total of 20 μL. This reaction solution was reacted at 37 ° C. for 1 hour. After completion of the reaction, the entire amount was subjected to electrophoresis with 1% agarose. After completion of the electrophoresis, it was stained with ethidium bromide and photographed under ultraviolet irradiation. The results are shown in FIG. In the figure, A is a plasmid DNA extracted by a combination of barium-type Shimane natural zeolite W and hydrogen ion-type Shimane natural zeolite W, and B is barium-type Shimane natural zeolite W and hydrogen-ion type Shimane natural It is a processing result of plasmid DNA extracted by the combination of zeolite O. The untreated plasmid DNA shown in lane 7 is electrophoresed quickly to take a supercoiled structure. On the other hand, since the plasmid DNA digested with the restriction enzymes in lanes 1 to 6 is a linear type, it can be seen that it is electrophoresed slowly. Thus, digestion was confirmed in all restriction enzymes, and it was shown that the plasmid DNA isolated by the method according to the present invention can be immediately applied to the restriction enzyme digestion treatment.

プラスミドDNAを鋳型としたPCR反応
本発明の方法で抽出したプラスミドDNAがPCR反応に適用できるかを、次の方法により確認した。PCR反応液は、HybriPolDNAポリメラーゼ(BIOLINE製)1U、DNAポリメラーゼに添付の10×リアクションバッファー2μL、2.5mMMgCl2、10mM dNTP Mix、M13プライマー(tgtaaaacgacggccagt)10pmol、Reverseプライマー(ggaaacagctatgaccatg)10pmol、鋳型プラスミドDNA100pgとし、超純水で計20μLとした。鋳型プラスミドDNAは、実施例4においてバリウム型島根県産天然ゼオライトWと水素イオン型島根県産天然ゼオライトWの組み合わせによって抽出されたプラスミドDNA、バリウム型島根県産天然ゼオライトWと水素イオン型島根県産天然ゼオライトOの組み合わせによって抽出されたプラスミドDNA、バリウム型島根県産天然ゼオライトWと水素イオン型島根県産天然ゼオライトIの組み合わせによって抽出されたプラスミドDNAとした。この反応溶液をサーマルサイクラー(アステック製プログラムテンプコントロールシステムPC−812)にセットし、温度プログラム94℃15秒、55℃10秒、72℃60秒を1サイクルとして35サイクルの増幅を行った。増幅後、反応液10μLを1%アガロースによる電気泳動に供した。泳動終了後、臭化エチジウムで染色し、紫外線照射下で写真撮影を行った。結果を図8に示す。図8から明らかなように、本発明の方法で分離したプラスミドDNAを鋳型とした場合も従来法と同様にPCR産物の増幅が見られ、直ちにPCR反応に適用可能であることが示された。
PCR reaction using plasmid DNA as a template It was confirmed by the following method whether the plasmid DNA extracted by the method of the present invention can be applied to the PCR reaction. PCR reaction solution was HyPolPol DNA polymerase (manufactured by BIOLINE) 1U, 10 × reaction buffer attached to DNA polymerase, 2 μL, 2.5 mM MgCl2, 10 mM dNTP Mix, M13 primer (tgtaaaacgaggggccaggt), reverse primer (ggaaacaccagpatgagtpg DNA, 100 primers) The total volume was 20 μL with ultrapure water. The template plasmid DNA was extracted from the combination of barium-type Shimane natural zeolite W and hydrogen ion-type Shimane natural zeolite W in Example 4, barium-type Shimane natural zeolite W and hydrogen-ion Shimane prefecture. Plasmid DNA extracted by a combination of natural zeolite O produced in Japan, and plasmid DNA extracted by a combination of barium-type Shimane natural zeolite W and hydrogen ion-type Shimane natural zeolite I. This reaction solution was set in a thermal cycler (program temperature control system PC-812, manufactured by Astec), and 35 cycles of amplification were performed with a temperature program of 94 ° C. for 15 seconds, 55 ° C. for 10 seconds, and 72 ° C. for 60 seconds. After amplification, 10 μL of the reaction solution was subjected to electrophoresis with 1% agarose. After completion of the electrophoresis, it was stained with ethidium bromide and photographed under ultraviolet irradiation. The results are shown in FIG. As is apparent from FIG. 8, even when the plasmid DNA separated by the method of the present invention was used as a template, amplification of the PCR product was observed as in the conventional method, indicating that it was immediately applicable to the PCR reaction.

核酸結合担体を用いるプラスミドDNA抽出法(従来法)と本発明のプラスミドDNA抽出法の工程の比較。Comparison of steps of plasmid DNA extraction method (conventional method) using a nucleic acid binding carrier and plasmid DNA extraction method of the present invention. 実施例2において抽出されたプラスミドDNAのアガロース電気泳動結果。The agarose electrophoresis result of the plasmid DNA extracted in Example 2. 実施例3において抽出されたプラスミドDNAのアガロース電気泳動結果。The agarose electrophoresis result of the plasmid DNA extracted in Example 3. 実施例4において抽出されたプラスミドDNAのアガロース電気泳動結果。The agarose electrophoresis result of the plasmid DNA extracted in Example 4. 実施例5において抽出されたプラスミドDNAのアガロース電気泳動結果。The agarose electrophoresis result of the plasmid DNA extracted in Example 5. 実施例6において抽出されたプラスミドDNAのアガロース電気泳動結果。The agarose electrophoresis result of the plasmid DNA extracted in Example 6. 実施例7において得られた、プラスミドDNAの制限酵素処理結果。The restriction enzyme treatment result of plasmid DNA obtained in Example 7. 実施例8において得られた、プラスミドDNAのPCR反応結果。The PCR reaction result of plasmid DNA obtained in Example 8.

Claims (5)

微生物細胞からプラスミドDNAを抽出する方法であって、
工程(1):以下の細胞溶解液Aにより微生物細胞を溶解してライセートを調製する工程。
工程(2):工程(1)において調製したライセートに、以下のゼオライトBおよびゼオライトCを接触させる工程。
工程(3):不溶性画分と水層を分離する工程。
細胞溶解液A:アルカリ金属水酸化物塩と、アルキル硫酸塩を除く陰イオン界面活性剤とを含む液。
ゼオライトB:交換性陽イオンとしてアルカリ土類金属陽イオンを保持するゼオライトゼオライトC:交換性陽イオンとして水素イオンを保持するゼオライト
以上の工程(1)から工程(3)を含むことを特徴とする微生物細胞からのプラスミドDNA抽出法。
A method for extracting plasmid DNA from microbial cells, comprising:
Step (1): A step of preparing lysate by lysing microbial cells with the following cell lysate A.
Step (2): The step of bringing the following zeolite B and zeolite C into contact with the lysate prepared in step (1).
Step (3): A step of separating the insoluble fraction and the aqueous layer.
Cell lysate A: a solution containing an alkali metal hydroxide salt and an anionic surfactant excluding an alkyl sulfate.
Zeolite B: exchangeable zeolite that holds an alkaline earth metal cations as the cation. Zeolite C: exchangeable zeolite to hold the hydrogen ions as cations.
A method for extracting plasmid DNA from microbial cells, comprising the steps (1) to (3) above.
微生物細胞からプラスミドDNAを抽出する方法であって、
工程(1):以下の細胞溶解液Aにより微生物細胞を溶解してライセートを調製する工程。
工程(2):工程(1)において調製したライセートに、以下のゼオライトBおよびゼオライトCを接触させる工程。
工程(3):不溶性画分と水層を分離する工程。
細胞溶解液A:水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化セシウムからなる群より選択される、1つまたは複数のアルカリ金属水酸化物塩と、アルキル硫酸塩とを含む液。
ゼオライトB:カリウム、ルビジウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウムからなる群より選択される、1つまたは複数の陽イオンを交換性陽イオンとして保持するゼオライト
ゼオライトC:交換性陽イオンとして水素イオンを保持するゼオライト
以上の工程(1)から工程(3)を含むことを特徴とする微生物細胞からのプラスミドDNA抽出法。
A method for extracting plasmid DNA from microbial cells, comprising:
Step (1): A step of preparing lysate by lysing microbial cells with the following cell lysate A.
Step (2): The step of bringing the following zeolite B and zeolite C into contact with the lysate prepared in step (1).
Step (3): A step of separating the insoluble fraction and the aqueous layer.
Cell lysate A: A solution containing one or more alkali metal hydroxide salts selected from the group consisting of lithium hydroxide, sodium hydroxide, and cesium hydroxide, and alkyl sulfates.
Zeolite B: potassium, rubidium, calcium, strontium, is selected from the group consisting of barium, one or more zeolites which holds a cation as exchangeable cations.
Zeolite C: exchangeable zeolite to hold the hydrogen ions as cations.
A method for extracting plasmid DNA from microbial cells, comprising the steps (1) to (3) above.
請求項1または請求項2に記載の工程(2)において、ライセートがゼオライトBへの接触の後にゼオライトCへ接触することを特徴とする請求項1または請求項2に記載の微生物細胞からのプラスミドDNA抽出法。 The plasmid from microbial cells according to claim 1 or 2, wherein in step (2) according to claim 1 or 2, the lysate is contacted with zeolite C after contact with zeolite B. DNA extraction method. 請求項1または請求項2に記載の工程(2)において、ライセートがゼオライトBゼオライトCとに同時に接触することを特徴とする請求項1または請求項2に記載の微生物細胞からのプラスミドDNA抽出法。 3. Plasmid DNA extraction from microbial cells according to claim 1 or 2, characterized in that in step (2) according to claim 1 or 2, the lysate is simultaneously contacted with zeolite B and zeolite C. Law. 請求項1または請求項2に記載の工程(2)において、ライセートとゼオライトBまたはゼオライトCあるいはその両方との接触が、ゼオライトを充填したカラムにより行われることを特徴とする請求項1乃至請求項4のいずれかに記載の微生物細胞からのプラスミドDNA抽出法。 The step (2) according to claim 1 or 2, wherein the contact between the lysate and zeolite B and / or zeolite C is performed by a column packed with zeolite. 5. A method for extracting plasmid DNA from microbial cells according to any one of 4 above.
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