JP5251505B2 - プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 - Google Patents
プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5251505B2 JP5251505B2 JP2008513147A JP2008513147A JP5251505B2 JP 5251505 B2 JP5251505 B2 JP 5251505B2 JP 2008513147 A JP2008513147 A JP 2008513147A JP 2008513147 A JP2008513147 A JP 2008513147A JP 5251505 B2 JP5251505 B2 JP 5251505B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- purine
- gene
- producing
- bacillus
- activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 230
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims description 58
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims description 37
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 31
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 170
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 83
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 64
- 101150106935 purR gene Proteins 0.000 claims description 58
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 48
- 239000002212 purine nucleoside Substances 0.000 claims description 40
- 108020004530 Transaldolase Proteins 0.000 claims description 37
- 241001037822 Bacillus bacterium Species 0.000 claims description 36
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 36
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 35
- 102100028601 Transaldolase Human genes 0.000 claims description 34
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 claims description 33
- 239000002213 purine nucleotide Substances 0.000 claims description 30
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 27
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 25
- MRWXACSTFXYYMV-FDDDBJFASA-N nebularine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC=C2N=C1 MRWXACSTFXYYMV-FDDDBJFASA-N 0.000 claims description 24
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 22
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 claims description 22
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 claims description 22
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 22
- 101710101148 Probable 6-oxopurine nucleoside phosphorylase Proteins 0.000 claims description 21
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 21
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 claims description 20
- 108020000772 Ribose-Phosphate Pyrophosphokinase Proteins 0.000 claims description 19
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 19
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 15
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 14
- 102000030764 Purine-nucleoside phosphorylase Human genes 0.000 claims description 13
- 102000000439 Ribose-phosphate pyrophosphokinase Human genes 0.000 claims description 13
- RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N guanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N 0.000 claims description 13
- 235000013902 inosinic acid Nutrition 0.000 claims description 13
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 11
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 claims description 10
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 108010087227 IMP Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 10
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 10
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 10
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 claims description 10
- 235000013928 guanylic acid Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 10
- DCTLYFZHFGENCW-UUOKFMHZSA-N 5'-xanthylic acid Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2N=C1 DCTLYFZHFGENCW-UUOKFMHZSA-N 0.000 claims description 9
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 9
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 claims description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 8
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 claims description 7
- 108010017464 Fructose-Bisphosphatase Proteins 0.000 claims description 7
- 102000006674 IMP dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 7
- GRSZFWQUAKGDAV-UHFFFAOYSA-N Inosinic acid Natural products OC1C(O)C(COP(O)(O)=O)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 GRSZFWQUAKGDAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 7
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 7
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 6
- 229950006790 adenosine phosphate Drugs 0.000 claims description 6
- AUHDWARTFSKSAC-HEIFUQTGSA-N (2S,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)-2-(6-oxo-1H-purin-9-yl)oxolane-2-carboxylic acid Chemical compound [C@]1([C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)(N1C=NC=2C(O)=NC=NC12)C(=O)O AUHDWARTFSKSAC-HEIFUQTGSA-N 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 5
- UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q(11) Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 102000027487 Fructose-Bisphosphatase Human genes 0.000 claims description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 5
- 239000004245 inosinic acid Substances 0.000 claims description 5
- 229940028843 inosinic acid Drugs 0.000 claims description 5
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 claims description 4
- UBORTCNDUKBEOP-UHFFFAOYSA-N L-xanthosine Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2N=C1 UBORTCNDUKBEOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- UBORTCNDUKBEOP-HAVMAKPUSA-N Xanthosine Natural products O[C@@H]1[C@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2N=C1 UBORTCNDUKBEOP-HAVMAKPUSA-N 0.000 claims description 4
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 claims description 4
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000004226 guanylic acid Substances 0.000 claims description 4
- UBORTCNDUKBEOP-UUOKFMHZSA-N xanthosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2N=C1 UBORTCNDUKBEOP-UUOKFMHZSA-N 0.000 claims description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- CMPQUABWPXYYSH-UHFFFAOYSA-N phenyl phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=CC=C1 CMPQUABWPXYYSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229920000137 polyphosphoric acid Polymers 0.000 claims description 3
- 101100259759 Bacillus subtilis (strain 168) tal gene Proteins 0.000 description 50
- 239000002585 base Substances 0.000 description 47
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 30
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 29
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 27
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 27
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 25
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 101150072043 deoD gene Proteins 0.000 description 22
- 101150057497 fbp gene Proteins 0.000 description 18
- 101150002764 purA gene Proteins 0.000 description 17
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 16
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 15
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 101150042478 punA gene Proteins 0.000 description 14
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- 101150035744 guaB gene Proteins 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 12
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 11
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 11
- 101150118377 tet gene Proteins 0.000 description 11
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 10
- OFBHPPMPBOJXRT-VWJPMABRSA-N adenylosuccinic acid Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)=C2N=C1 OFBHPPMPBOJXRT-VWJPMABRSA-N 0.000 description 10
- -1 aliphatic amino acid Chemical class 0.000 description 10
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 241000276408 Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 Species 0.000 description 9
- GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-N IMP Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 101150108007 prs gene Proteins 0.000 description 8
- RQFCJASXJCIDSX-UHFFFAOYSA-N 14C-Guanosin-5'-monophosphat Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O RQFCJASXJCIDSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 101100126053 Dictyostelium discoideum impdh gene Proteins 0.000 description 7
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 7
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 7
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 7
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 7
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 7
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 6
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 6
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 6
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 6
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 6
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 6
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 6
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 5
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 5
- VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O VZUNGTLZRAYYDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 5
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 5
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 5
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 4
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NGHMDNPXVRFFGS-IUYQGCFVSA-N D-erythrose 4-phosphate Chemical compound O=C[C@H](O)[C@H](O)COP(O)(O)=O NGHMDNPXVRFFGS-IUYQGCFVSA-N 0.000 description 4
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 230000004108 pentose phosphate pathway Effects 0.000 description 4
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 4
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L (R)-2-Hydroxy-3-(phosphonooxy)-propanal Natural products O=C[C@H](O)COP([O-])([O-])=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 3
- 241000194103 Bacillus pumilus Species 0.000 description 3
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde 3-phosphate Chemical compound O=C[C@H](O)COP(O)(O)=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- PPQRONHOSHZGFQ-LMVFSUKVSA-N aldehydo-D-ribose 5-phosphate Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PPQRONHOSHZGFQ-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 3
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 3
- PQGCEDQWHSBAJP-TXICZTDVSA-N 5-O-phosphono-alpha-D-ribofuranosyl diphosphate Chemical compound O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@@H]1COP(O)(O)=O PQGCEDQWHSBAJP-TXICZTDVSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 2
- GSXOAOHZAIYLCY-UHFFFAOYSA-N D-F6P Natural products OCC(=O)C(O)C(O)C(O)COP(O)(O)=O GSXOAOHZAIYLCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N D-Glucose 6-phosphate Chemical compound OC1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O NBSCHQHZLSJFNQ-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 2
- VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N Glc6P Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O VFRROHXSMXFLSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 2
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- GSXOAOHZAIYLCY-HSUXUTPPSA-N keto-D-fructose 6-phosphate Chemical compound OCC(=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)COP(O)(O)=O GSXOAOHZAIYLCY-HSUXUTPPSA-N 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 2
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 2
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 2
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 108010028584 nucleotidase Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WKZGKZQVLRQTCT-ABLWVSNPSA-N (2S)-2-[[4-[(2-amino-4-oxo-5,6,7,8-tetrahydro-3H-pteridin-6-yl)methylamino]benzoyl]amino]-5-formyloxy-5-oxopentanoic acid Chemical compound N1C=2C(=O)NC(N)=NC=2NCC1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(=O)OC=O)C(O)=O)C=C1 WKZGKZQVLRQTCT-ABLWVSNPSA-N 0.000 description 1
- IJROUPFSQHMOBK-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-3-nitro-1-nitrosoguanidine 2-nitrosoguanidine Chemical compound NC(=N)NN=O.O=NN(C)C(=N)N[N+]([O-])=O IJROUPFSQHMOBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OMGHIGVFLOPEHJ-UHFFFAOYSA-N 2,5-dihydro-1h-pyrrol-1-ium-2-carboxylate Chemical compound OC(=O)C1NCC=C1 OMGHIGVFLOPEHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 241000730261 Bacillus subtilis PY79 Species 0.000 description 1
- 101900331086 Bacillus subtilis Transaldolase Proteins 0.000 description 1
- 241000046135 Cedecea Species 0.000 description 1
- 241000043249 Cedecea lapagei Species 0.000 description 1
- 241000043250 Cedecea neteri Species 0.000 description 1
- 241000588879 Chromobacterium violaceum Species 0.000 description 1
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 241000186145 Corynebacterium ammoniagenes Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- FNZLKVNUWIIPSJ-UHNVWZDZSA-N D-ribulose 5-phosphate Chemical compound OCC(=O)[C@H](O)[C@H](O)COP(O)(O)=O FNZLKVNUWIIPSJ-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- 239000004470 DL Methionine Substances 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000004278 EU approved seasoning Substances 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 description 1
- 102000000587 Glycerolphosphate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010041921 Glycerolphosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 108010001139 Inosine kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000588880 Iodobacter fluviatilis Species 0.000 description 1
- 241000588915 Klebsiella aerogenes Species 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N L-methionine (R)-S-oxide Chemical compound C[S@@](=O)CC[C@H]([NH3+])C([O-])=O QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N L-methionine sulphoxide Natural products CS(=O)CCC(N)C(O)=O QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000588772 Morganella morganii Species 0.000 description 1
- 102000010722 N-Glycosyl Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010063372 N-Glycosyl Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N Nitrous acid Chemical compound ON=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100035703 Prostatic acid phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 241000588746 Raoultella planticola Species 0.000 description 1
- 241000588756 Raoultella terrigena Species 0.000 description 1
- FNZLKVNUWIIPSJ-UHFFFAOYSA-N Rbl5P Natural products OCC(=O)C(O)C(O)COP(O)(O)=O FNZLKVNUWIIPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000881765 Serratia ficaria Species 0.000 description 1
- 241001087783 Shimwellia blattae DSM 4481 = NBRC 105725 Species 0.000 description 1
- 101150094640 Siae gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 102000014701 Transketolase Human genes 0.000 description 1
- 108010043652 Transketolase Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 230000037006 agalactosis Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940092559 enterobacter aerogenes Drugs 0.000 description 1
- 229940032049 enterococcus faecalis Drugs 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010931 ester hydrolysis Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000011194 food seasoning agent Nutrition 0.000 description 1
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000012208 gluconic acid Nutrition 0.000 description 1
- 101150097303 glyA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 150000002386 heptoses Chemical class 0.000 description 1
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 1
- YUDNQQJOVFPCTF-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetone phosphate Chemical compound CC(=O)COP(O)(O)=O YUDNQQJOVFPCTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 159000000014 iron salts Chemical class 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 150000002696 manganese Chemical class 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N methionine Chemical compound CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000006109 methionine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 description 1
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 229940076266 morganella morganii Drugs 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 101150048626 pbuG gene Proteins 0.000 description 1
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000003014 phosphoric acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 108010091901 purine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 125000000561 purinyl group Chemical group N1=C(N=C2N=CNC2=C1)* 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 101150117659 rhtA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000010845 search algorithm Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L sodium thiosulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=S AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019345 sodium thiosulphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 150000003641 trioses Chemical class 0.000 description 1
- 101150079396 trpC2 gene Proteins 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1022—Transferases (2.) transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/32—Nucleotides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two N-atoms in the same ring, e.g. purine nucleotides, nicotineamide-adenine dinucleotide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/38—Nucleosides
- C12P19/40—Nucleosides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two nitrogen atoms in the same ring, e.g. purine nucleosides
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は５’−イノシン酸および５’−グアニル酸を代表とするプリンヌクレオチド、並びにこれらの合成原料として重要な物質であるイノシンおよびグアノシン等のプリンヌクレオシド、などのプリン系物質の製造法、及びそれに用いられるバチルス属細菌に関する。プリン系物質は、調味料、医薬並びにそれらの原料等として有用である。
発酵法によるイノシンおよびグアノシンの生産に関しては、アデニン要求株、またはそれにプリンアナログをはじめとする各種の薬剤に対する耐性を付与したバチルス属の微生物（特許文献１〜８参照）、およびブレビバクテリウム属の微生物（特許文献９、１０又は非特許文献１参照）等を用いる方法が知られている。
このような変異株を取得するには、従来、微生物に紫外線照射やニトロソグアニジン（N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine）処理などの変異誘起処理を行い、適当な選択培地を用いて、目的とする変異株を取得するという方法が行われてきた。
一方で、遺伝子工学技術を用いたプリン系物質生産株の育種もバチルス属の微生物（特許文献１１〜２０参照）、ブレビバクテリウム属の微生物（特許文献２１参照）、およびエシェリヒア属の微生物（特許文献２２参照）で行われている。具体的には、例えば、プリンオペロンのリプレッサータンパク質遺伝子（purR）が破壊されたバチルス属細菌を用いて、ヒポキサンチン、ウラシル、グアニン及びアデニン等の核酸系物質を効率よく製造する方法（特許文献２３参照）が開示されている。
バチルス・ズブチリスでは、前記リプレッサータンパク質は、プリンオペロンの遺伝子群の他に、ＡＭＰ生合成に関与するｐｕｒＡ遺伝子（非特許文献２参照）、ホルミルテトラヒドロ葉酸生合成に関与するｇｌｙＡ遺伝子（非特許文献３参照）およびヒポキサンチン／グアニンのトランスポーターをコードするｐｂｕＧ遺伝子（非特許文献４参照）などの発現を調節することが知られている。
さらに、ｐｕｒＲ遺伝子破壊に加えて、サクシニル−ＡＭＰシンターゼ遺伝子（purA）を破壊してアデニン要求性を付与すること、およびプリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（deoD）を破壊して、イノシンのヒポキサンチンへの分解を抑制することによって、イノシンを効率的に製造する微生物、及びそれを用いたイノシンの製造法が開示されている（特許文献８参照）。
トランスアルドラーゼは、ペントースリン酸経路の一つであり、セドヘプツロース７−リン酸とＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸からＤ−エリトロース４−リン酸とＤ−フルクトース６−リン酸を生成する可逆反応を触媒する酵素である。この酵素とプリン系物質の生合成経路との関係はあまり知られておらず、同酵素活性を低下させてプリン系物質生産菌を育種するという試みはなされていなかった。
特公昭３８−２３０９９号公報
特公昭５４−１７０３３号公報
特公昭５５−２９５６号公報
特公昭５５−４５１９９号公報
特公昭５７−１４１６０号公報
特公昭５７−４１９１５号公報
特開昭５９−４２８９５号公報
特開２００４−２４２６１０号公報
特公昭５１−５０７５号公報
特公昭５８−１７５９２号公報
特開昭５８−１５８１９７号公報
特開昭５８−１７５４９３号公報
特開昭５９−２８４７０号公報
特開昭６０−１５６３８８号公報
特開平１−２７４７７号公報
特開平１−１７４３８５号公報
特開平３−５８７８７号公報
特開平３−１６４１８５号公報
特開平５−８４０６７号公報
特開平５−１９２１６４号公報
特開昭６３−２４８３９４号公報
国際公開第９９／０３９８８号パンフレット
米国特許第６，２８４，４９５号
Agric.Biol.Chem., 1978, 42, 399-405
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 7455-7459
J. Bacteriol., 2001, 183, 6175-6183
J. Bacteriol., 2003, 185, 5200-5209
本発明は、発酵法によってプリンヌクレオシド及び／又はプリンヌクレオチドなどのプリン系物質を製造するために好適なバチルス属細菌を創製すること、及び同細菌を用いたプリン系物質の製造法を提供することを課題とする。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。その結果、バチルス属細菌において、ペントースリン酸経路のトランスアルドラーゼの酵素活性を低下させることによって、プリンヌクレオシドやプリンヌクレオチドの生産能が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は以下のとおりである。
すなわち本発明は以下のとおりである。
（１）プリン系物質生産能を有し、トランスアルドラーゼの酵素活性が低下するように改変されたバチルス属細菌。
（２）前記プリン系物質がイノシン、キサントシン、グアノシン、及びアデノシンからなる群より選択されるプリンヌクレオシドである前記バチルス属細菌。
（３）前記プリン系物質がイノシン酸、キサンチル酸、グアニル酸、アデニル酸からなる群より選択されるプリンヌクレオチドである前記バチルス属細菌。
（４）前記トランスアルドラーゼをコードする遺伝子を破壊することまたは、トランスアルドラーゼをコードする遺伝子の発現量を低下させることにより、トランスアルドラーゼ活性が低下した前記バチルス属細菌。
（５）前記トランスアルドラーゼをコードする遺伝子が下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードする遺伝子である前記バチルス属細菌。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、トランスアルドラーゼ酵素活性を有するタンパク質。
（６）さらにホスホリボシルピロリン酸シンセターゼ活性が上昇するように改変されたことを特徴とする前記バチルス属細菌。
（７）さらに、プリンオペロンの発現量が上昇するように改変されたことを特徴とする前記バチルス属細菌。
（８）プリンオペロンのリプレッサーをコードする遺伝子であるｐｕｒＲ遺伝子が破壊されたこと、または、プリンオペロンのアテニュエーター領域の一部が除去されたことにより、プリンオペロンの発現量が上昇したことを特徴とする前記バチルス属細菌。
（９）さらに、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性が低下するように改変されたことを特徴とする前記バチルス属細菌
（１０）さらにフルクトース−ビスフォスファターゼ活性が低下するように改変されたことを特徴とする前記バチルス属細菌。
（１１）さらに、ＩＭＰ脱水素酵素活性が低下するように改変されたことを特徴とする前記バチルス属細菌。
（１２）バチルス属細菌がバチルス・ズブチリスである前記バチルス属細菌。
（１３）前記バチルス属細菌を培地に培養して、同細菌の細胞内又は培地中にプリン系物質を蓄積せしめ、同細胞又は培地からプリン系物質を回収することを特徴とするプリン系物質の製造法。
（１４）プリン系物質がプリンヌクレオシド又はプリンヌクレオチドである、前記方法。
（１５）前記プリン系物質がイノシン、キサントシン、グアノシン、及びアデノシンからなる群より選択されるプリンヌクレオシドである前記方法。
（１６）前記プリン系物質がイノシン酸、キサンチル酸、グアニル酸、及びアデニル酸からなる群より選択されるプリンヌクレオチドである前記方法。
（１７）前記方法によりプリンヌクレオシドを製造し、該プリンヌクレオシドに、ポリ燐酸、フェニル燐酸、及びカルバミル燐酸からなる群より選択される燐酸供与体と、ヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成する能力を有する微生物又は酸性フォスファターゼを作用させて、プリンヌクレオチドを生成せしめ、該プリンヌクレオチドを採取することを特徴とするプリンヌクレオチドの製造法。
（２）前記プリン系物質がイノシン、キサントシン、グアノシン、及びアデノシンからなる群より選択されるプリンヌクレオシドである前記バチルス属細菌。
（３）前記プリン系物質がイノシン酸、キサンチル酸、グアニル酸、アデニル酸からなる群より選択されるプリンヌクレオチドである前記バチルス属細菌。
（４）前記トランスアルドラーゼをコードする遺伝子を破壊することまたは、トランスアルドラーゼをコードする遺伝子の発現量を低下させることにより、トランスアルドラーゼ活性が低下した前記バチルス属細菌。
（５）前記トランスアルドラーゼをコードする遺伝子が下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードする遺伝子である前記バチルス属細菌。
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、トランスアルドラーゼ酵素活性を有するタンパク質。
（６）さらにホスホリボシルピロリン酸シンセターゼ活性が上昇するように改変されたことを特徴とする前記バチルス属細菌。
（７）さらに、プリンオペロンの発現量が上昇するように改変されたことを特徴とする前記バチルス属細菌。
（８）プリンオペロンのリプレッサーをコードする遺伝子であるｐｕｒＲ遺伝子が破壊されたこと、または、プリンオペロンのアテニュエーター領域の一部が除去されたことにより、プリンオペロンの発現量が上昇したことを特徴とする前記バチルス属細菌。
（９）さらに、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性が低下するように改変されたことを特徴とする前記バチルス属細菌
（１０）さらにフルクトース−ビスフォスファターゼ活性が低下するように改変されたことを特徴とする前記バチルス属細菌。
（１１）さらに、ＩＭＰ脱水素酵素活性が低下するように改変されたことを特徴とする前記バチルス属細菌。
（１２）バチルス属細菌がバチルス・ズブチリスである前記バチルス属細菌。
（１３）前記バチルス属細菌を培地に培養して、同細菌の細胞内又は培地中にプリン系物質を蓄積せしめ、同細胞又は培地からプリン系物質を回収することを特徴とするプリン系物質の製造法。
（１４）プリン系物質がプリンヌクレオシド又はプリンヌクレオチドである、前記方法。
（１５）前記プリン系物質がイノシン、キサントシン、グアノシン、及びアデノシンからなる群より選択されるプリンヌクレオシドである前記方法。
（１６）前記プリン系物質がイノシン酸、キサンチル酸、グアニル酸、及びアデニル酸からなる群より選択されるプリンヌクレオチドである前記方法。
（１７）前記方法によりプリンヌクレオシドを製造し、該プリンヌクレオシドに、ポリ燐酸、フェニル燐酸、及びカルバミル燐酸からなる群より選択される燐酸供与体と、ヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成する能力を有する微生物又は酸性フォスファターゼを作用させて、プリンヌクレオチドを生成せしめ、該プリンヌクレオチドを採取することを特徴とするプリンヌクレオチドの製造法。
＜１＞本発明のバチルス属細菌
（Ｉ）プリン系物質生産能の付与
本発明のバチルス属細菌は、プリン系物質生産能を有し、トランスアルドラーゼの酵素活性が低下するように改変されたバチルス属細菌である。
（Ｉ）プリン系物質生産能の付与
本発明のバチルス属細菌は、プリン系物質生産能を有し、トランスアルドラーゼの酵素活性が低下するように改変されたバチルス属細菌である。
「プリン系物質」とはプリン骨格を含む物質をいうが、プリンヌクレオシド、プリンヌクレオチドなどが挙げられる。プリンヌクレオシドには、イノシン、キサントシン、グアノシン、アデノシンなどが含まれ、プリンヌクレオチドには、プリンヌクレオシドの５’−燐酸エステル、例えばイノシン酸（イノシン−５’−リン酸 以下「IMP」ともいう）、キサンチル酸（キサントシンー５’−リン酸 以下「XMP」ともいう）、グアニル酸（グアノシン−５’−モノリン酸、以下「GMP」ともいう）、アデニル酸（アデノシン−５’−モノリン酸以下「AMP」ともいう）などが含まれる。
「プリン系物質生産能」とは、本発明のバチルス属細菌を培地中で培養したときに、プリン系物質を細胞又はまたは培地から回収できる程度に細胞内または培地中に生成、分泌、蓄積できる能力をいう。なお、本発明のバチルス属細菌は、上記プリン系物質のうちの２種類以上の生産能を有するものであってもよい。
プリン系物質生産能を有するバチルス属細菌としては、本来的にプリン系物質生産能を有するものであってもよいが、以下に示すようなバチルス属細菌を、変異法や組換えＤＮＡ法を利用して、プリン系物質生産能を有するように改変することによって得られるものでもよい。また、後述するようにしてトランスアルドラーゼの酵素活性が低下するように改変することによってプリン系物質生産能が付与又は増強されたバチルス属細菌であってもよい。
尚、本発明において、「酵素活性が低下する」とは、前記トランスアルドラーゼ、又は後述するプリン系物質を分解する酵素、イノシンモノリン酸（IMP）脱水素酵素等の酵素活性が、非改変株、例えば野生型のバチルス属細菌における活性よりも低いこと、及び、活性が実質的に消失していることを含む。また、後述するプリンオペロンリプレッサーの活性についても同様である。
本発明のバチルス属細菌を得るために用いられるバチルス属細菌としては、バチルス・ズブチリス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・プミルス等が挙げられる。
バチルス・ズブチリスとしては、バチルス・ズブチリス１６８ Ｍａｒｂｕｒｇ（ATCC6051）、バチルス・ズブチリスＰＹ７９（Plasmid, 1984, 12, 1-9）等が、バチルス・アミロリケファシエンスとしては、バチルス・アミロリケファシエンスＴ（ATCC23842）、及びバチルス・アミロリケファシエンスＮ（ATCC23845）等が挙げられる。また、バチルス・プミルスとしては、バチルス・プミルス Gottheil No.3218（ATCC No.21005）（米国特許第3,616,206号）等が挙げられる。これらの菌株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)、住所 P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108, United States of America）から入手することができる。
バチルス・ズブチリスとしては、バチルス・ズブチリス１６８ Ｍａｒｂｕｒｇ（ATCC6051）、バチルス・ズブチリスＰＹ７９（Plasmid, 1984, 12, 1-9）等が、バチルス・アミロリケファシエンスとしては、バチルス・アミロリケファシエンスＴ（ATCC23842）、及びバチルス・アミロリケファシエンスＮ（ATCC23845）等が挙げられる。また、バチルス・プミルスとしては、バチルス・プミルス Gottheil No.3218（ATCC No.21005）（米国特許第3,616,206号）等が挙げられる。これらの菌株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)、住所 P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108, United States of America）から入手することができる。
プリン系物質生産能を有するバチルス属細菌は、上記のようなバチルス属細菌に、例えば、プリンヌクレオシド要求性、又はさらにプリンアナログ等の薬剤に対する耐性を付与することにより、取得することが出来る（特公昭３８−２３０９９、特公昭５４−１７０３３、特公昭５５−４５１９９、特公昭５７−１４１６０、特公昭５７−４１９１５、特公昭５９−４２８９５参照）。栄養要求性及び薬剤耐性を持つバチルス属細菌は、Ｎ-メチル-Ｎ’-ニトロ-Ｎ-ニトロソグアニジン（NTG）、またはＥＭＳ(エチルメタンスルフォネート)等の通常の変異処理に用いられている変異剤による処理によって取得することが出来る。
プリンヌクレオシドを生産するバチルス属細菌としては、以下のものが挙げられる。
バチルス属に属するイノシン生産株の具体例として、バチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１６株を使用することができる。同菌株は、プリンオペロンリプレッサーをコードするｐｕｒＲ遺伝子の欠損（purR::spc）、スクシニル−ＡＭＰシンターゼをコードするｐｕｒＡ遺伝子の欠損（purA::erm）、およびプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするｄｅｏＤ遺伝子の欠損（deoD::kan）が導入された、既知のバチルス・ズブチリスｔｒｐＣ２株（168 Marburg）の誘導体である（特開２００４−２４２６１０、ＵＳ２００４１６６５７５Ａ１）。また、バチルス・ズブチリス菌株ＡＪ３７７２（ＦＥＲＭ Ｐ−２５５５）（特開昭６２−０１４７９４）等を使用することもできる。
バチルス属に属するイノシン生産株の具体例として、バチルス・ズブチリスＫＭＢＳ１６株を使用することができる。同菌株は、プリンオペロンリプレッサーをコードするｐｕｒＲ遺伝子の欠損（purR::spc）、スクシニル−ＡＭＰシンターゼをコードするｐｕｒＡ遺伝子の欠損（purA::erm）、およびプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするｄｅｏＤ遺伝子の欠損（deoD::kan）が導入された、既知のバチルス・ズブチリスｔｒｐＣ２株（168 Marburg）の誘導体である（特開２００４−２４２６１０、ＵＳ２００４１６６５７５Ａ１）。また、バチルス・ズブチリス菌株ＡＪ３７７２（ＦＥＲＭ Ｐ−２５５５）（特開昭６２−０１４７９４）等を使用することもできる。
グアノシン生産能を有するバチルス属細菌としては、ＩＭＰ脱水素酵素の活性が上昇したバチルス属細菌（特開平３−５８７８７）、プリンアナログ耐性又はデコイニン耐性遺伝子が組み込まれているベクターをアデニン要求性変異株に導入したバチルス属細菌（特公平４−２８３５７）等が挙げられる。
またプリンヌクレオチドを生産するバチルス属細菌としては、以下のものが挙げられる。
イノシン酸生産菌としては、バチルス・ズブチリスのフォスファターゼ活性が弱化したイノシン生産株が報告されている（Uchida, K. et al., Agr. Biol. Chem., 1961, 25, 804-805、Fujimoto, M. Uchida, K., Agr. Biol. Chem., 1965, 29, 249-259）。グアニル酸生産菌としては、アデニン要求性を有しさらにデコイニンまたはメチオニンスルフォキシドに耐性を有し、かつ５’−グアニル酸（グアノシン−５’−モノリン酸、以下「GMP」ともいう）生産能を有するバチルス属の変異株が挙げられる（特公昭５６−１２４３８号公報）。
イノシン酸生産菌としては、バチルス・ズブチリスのフォスファターゼ活性が弱化したイノシン生産株が報告されている（Uchida, K. et al., Agr. Biol. Chem., 1961, 25, 804-805、Fujimoto, M. Uchida, K., Agr. Biol. Chem., 1965, 29, 249-259）。グアニル酸生産菌としては、アデニン要求性を有しさらにデコイニンまたはメチオニンスルフォキシドに耐性を有し、かつ５’−グアニル酸（グアノシン−５’−モノリン酸、以下「GMP」ともいう）生産能を有するバチルス属の変異株が挙げられる（特公昭５６−１２４３８号公報）。
また、キサンチル酸生産菌は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammmoniagenes）を中心とするコリネ型細菌の育種に用いた方法を使用して構築することができる。例えば、PRPP amidotransferaseを強化株（特開平8-168383）、脂肪族アミノ酸耐性株（特開平4-262790）、デヒドロプロリン耐性株（韓国特許公開公報2003-56490）を取得することによって、キサンチル酸生産菌を構築することができる。
また、プリン系物質生産能を有するバチルス属細菌を育種する方法として、以下の方法が挙げられる。プリンヌクレオシド及びプリンヌクレオチドに共通のプリン生合成に関与する酵素、すなわちプリン生合成酵素の細胞内での活性を上昇させる方法が挙げられる。該酵素の細胞内での活性は、バチルス属細菌の非改変株、例えば野生型のバチルス属細菌よりも上昇させることが好ましい。「活性が上昇する」とは、例えば、細胞当たりの酵素分子の数が増加した場合や、酵素分子当たりの比活性が上昇した場合などが該当する。例えば、前記酵素の遺伝子の発現量を上昇させることにより活性を上昇させることができる。 前記プリン生合成に関与する酵素としては、たとえばホスホリボシルピロリン酸アミドトランスフェラーゼ、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼ（PRPP synthetase [EC:2.7.6.1]）などが挙げられる
ペントースリン酸系に取り込まれたグルコースなどの糖源が代謝により生成したカタボライトの一部は、リブロース−５−リン酸を経由して、リボース−５−リン酸となる。生合成されたリボース−５−リン酸より、プリンヌクレオシド、ヒスチジン、およびトリプトファン生合成の不可欠な前駆物質であるホスホリボシルピロリン酸（ＰＲＰＰ）が生成される。具体的には、リボース−５−リン酸は、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼによりＰＲＰＰに転換される。したがって、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性が上昇するように改変することにより、バチルス属細菌にプリン系物質生産能を付与又は増強することができる。
「ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性が上昇する」とは、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性が野生株又は親株等の非改変株に対して増加していることをいう。ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性は例えば、Ｓｗｉｔｚｅｒ等の方法（Methods Enzymol., 1978, 51, 3-11）、Ｒｏｔｈ等の方法（Methods Enzymol., 1978, 51, 12-17）により、測定することができる。ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性が上昇したバチルス属細菌は、例えば、特開２００４−２４２６１０号公報に記載の方法と同様にして、プラスミドを用いる方法や染色体上に組込む方法などにより、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼをコードする遺伝子をバチルス属細菌で高発現させることにより作製することができる。本発明に利用出来るホスホリボシルピロリン酸シンセターゼをコードする遺伝子は、配列番号３に記載のバチルス属細菌由来のｐｒｓ遺伝子（Genbank Accession No. X16518）が挙げられるが、他の細菌由来の遺伝子、動植物由来の遺伝子でもバチルス属でホスホリボシルピロリン酸シンセターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であれば、何れも用いることが出来る。
一方、プリンヌクレオシド、ヒスチジン、およびトリプトファン生合成に不可欠な前駆物質であるＰＲＰＰが生成されると、その一部は、プリン生合成に関与する酵素群によりプリンヌクレオチド、プリンヌクレオシドへと変換される。そのような酵素群をコードする遺伝子としては、バチルス・ズブチリスのプリンオペロン、具体的にはｐｕｒＥＫＢ−ｐｕｒＣ（ｏｒｆ）ＱＬＦ−ｐｕｒＭＮＨ（Ｊ）−ｐｕｒＤオペロンの遺伝子（Ebbole DJ and Zalkin H, J. Biol. Chem., 1987, 262, 17, 8274-87）（現在では、purEKBCSQLFMNHDとも呼ばれる：Bacillus subtilis and Its Closest Relatives, Editor in Chief: A.L. Sonenshein, ASM Press, Washington D.C., 2002。Genbank Accession No.NC_000964）、およびエシェリヒア・コリのｐｕｒレギュロンの遺伝子（Escherichia and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996）が例示される。
したがって、これらの遺伝子の発現を増強することにより、プリン系物質生産能を付与又は増強することもできる。なお、本発明に用いることが出来るプリンオペロン遺伝子はこれらのものには限定されず、他の微生物や動植物由来の遺伝子も利用することも出来る。
プリンオペロンの発現量を増大させる方法としては、プラスミドを用いる方法や染色体上に組込む方法などにより、プリンオペロン遺伝子をバチルス属細菌で高発現させる方法が挙げられる。
プリンオペロンの発現量を増大させる第２の方法として、プリンオペロン固有のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することや、固有のプロモーターの−３５、−１０領域をコンセンサス配列に置換することが挙げられる。
例えば、バチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）では、プリンオペロンの−３５配列はコンセンサス配列（TTGACA）であるが、−１０配列はＴＡＡＧＡＴであり、コンセンサス配列ＴＡＴＡＡＴとは異なっている（Ebbole, D. J. and H. Zalikn, J. Biol. Chem., 1987, 262, 8274−8287）。したがって、−１０配列（ＴＡＡＧＡＴ）をコンセンサス配列あるいはコンセンサス配列に近づけることにより、ＴＡＴＡＡＴ、またはＴＡＴＧＡＴ、もしくはＴＡＡＡＡＴとなるように改変することで、プリンオペロンの転写活性を上昇させることができる。なお、プロモーター配列の置換は、下記の遺伝子置換と同様の方法で行うことが出来る。
プリンオペロンの発現量を増大させる第３の方法として、プリンオペロンのリプレッサーの発現量を低下させる方法も挙げられる（ＵＳＰ６，２８４，４９５号）。「プリンオペロンのリプレッサーの発現」とは、プリンオペロン遺伝子の転写、及び転写産物の翻訳の両方を含む。また、「発現量を低下させる」とは、発現量が、非改変株、例えば野生型のバチルス属細菌における発現量よりも低いこと、及び、発現が実質的に消失していることを含む。
プリンペオペロンのリプレッサー（プリンリプレッサー）の発現量を低下させるためには、例えば、バチルス属細菌を紫外線照射またはＮＴＧもしくはＥＭＳ等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、プリンリプレッサーの発現量が低下した変異株を選択する方法を採用することができる。
また、プリンリプレッサーの発現量が低下したバチルス属細菌は、変異処理の他に、例えば、遺伝子組換え法を用いた相同組換え法（Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press (1972); Matsuyama, S. and Mizushima, S., J. Bacteriol., 1985, 162, 1196-1202）により、染色体上のプリンリプレッサーをコードする遺伝子（purR；GenBank Accession NC_000964（コード領域は塩基番号54439〜55293；配列番号５）を、正常に機能しない遺伝子（以下、「破壊型遺伝子」ということがある）で置換することによって得ることができる。
破壊型遺伝子で、宿主染色体上の正常遺伝子を置換するには、例えば以下のようにすればよい。なお、以下の例では、ｐｕｒＲ遺伝子を例として説明するが、他の遺伝子、例えば後述のｐｕｒＡ、ｄｅｏＤ、ｇｕａＢ、ｆｂｐ又はｙｗｊＨ遺伝子についても、同様にして遺伝子破壊を行うことができる。
染色体上の配列と相同性を有する配列を持ち、バチルス属細菌内で複製できないプラスミド等が菌体内に導入されると、ある頻度で染色体上の相同性を有する配列の箇所で組換えを起こし、導入されたプラスミド全体が染色体上に組み込まれる。この後さらに染色体上の相同性を有する配列の箇所で組換えを起こすと、再びプラスミドが染色体上から抜け落ちるが、この時組換えを起こす位置により破壊された遺伝子の方が染色体上に固定され、元の正常な遺伝子がプラスミドと一緒に染色体上から抜け落ちることがある。このような菌株を選択することにより、染色体上の正常なｐｕｒＲ遺伝子が破壊型ｐｕｒＲ遺伝子に置換された菌株を取得することができる。
このような相同組換えによる遺伝子破壊技術は既に確立しており、直鎖ＤＮＡを用いる方法、温度感受性プラスミドを用いる方法等が利用できる。また、薬剤耐性等のマーカー遺伝子が内部に挿入されたｐｕｒＲ遺伝子を含み、かつ、目的とする微生物細胞内で複製できないプラスミドを用いることによっても、ｐｕｒＲ遺伝子の破壊を行うことができる。すなわち、前記プラスミドで形質転換され、薬剤耐性を獲得した形質転換体は、染色体ＤＮＡ中にマーカー遺伝子が組み込まれている。このマーカー遺伝子は、その両端のｐｕｒＲ遺伝子配列と染色体上のｐｕｒＲ遺伝子との相同組換えによって組み込まれる可能性が高いため、効率よく遺伝子破壊株を選択することができる。
遺伝子破壊に用いる破壊型ｐｕｒＲ遺伝子は、具体的には、制限酵素消化及び再結合によりｐｕｒＲ遺伝子の一定領域を欠失させたり、ｐｕｒＲ遺伝子へ他のＤＮＡ断片（マーカー遺伝子等）を挿入したり、部位特異的変異法（Kramer, W. and Fritz, H. J., Methods Enzymol., 1987, 154, 350-367）またはリコンビナントＰＣＲ法（PCR Technology, Stockton Press (1989)）や次亜硫酸ナトリウム、ヒドロキシルアミン等の化学薬剤による処理（Shortle, D. and Nathans, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, 75, 2170-2174）によって、ｐｕｒＲ遺伝子のコーディング領域またはプロモーター領域等の塩基配列の中に１つまたは複数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を起こさたりして、コードされるリプレッサーの活性が低下したか、又はｐｕｒＲ遺伝子の転写が低下したものを選択することにより、取得することができる。これらの態様の中では、制限酵素消化及び再結合によりｐｕｒＲ遺伝子の一定領域を欠失させる方法、又はｐｕｒＲ遺伝子へ他のＤＮＡ断片を挿入する方法が、確実性及び安定性の点から好ましい。欠失させるｐｕｒＲ遺伝子の一定領域は、ｐｕｒＲ遺伝子の５’末端側、内部、３’末端側のいずれであってもよいが、ｐｕｒＲ遺伝子の全長の９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上であると、リプレッサーの活性が低下する確実性が高くなる。また、ｐｕｒＲ遺伝子のコード領域中に塩基を欠失又は挿入させ、フレームシフト変異を起こさせる場合は、複数箇所で塩基の欠失又は挿入を起こさせること、及び、３’末端側で塩基の欠失又は挿入を起こさせることが、リプレッサーの活性を確実に低下させ得る点で好ましい。
また、プリンリプレッサーの活性の低下は、上記の遺伝子破壊による以外に、通常の変異処理法によって、染色体上のpurR遺伝子に、細胞中のプリンリプレッサーの活性が低下するような変異を導入すればよい。例えば、染色体上の酵素をコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入すること、遺伝子の一部分あるいは全領域を欠失させることによっても達成出来る。また、染色体上のpurR遺伝子にトランスポゾンを挿入することによっても、リプレッサーの活性を低下させることができる。
また、プリンリプレッサーの活性の低下は、染色体ＤＮＡ上のｐｕｒＲ遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を微弱なものに置換することによっても達成される。プロモーターの強度は、ＲＮＡ合成開始の頻度により定義される。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128）等に記載されている。また、国際公開Ｗ０００／１８９３５に開示されているように、目的遺伝子のプロモーター領域に数塩基の塩基置換を導入し、より微弱なものに改変することも可能である。さらに、リボソーム結合部位（RBS）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がｍＲＮＡの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られている。このRBSの改変は、目的遺伝子の転写を減少させることと組み合わせてもよい。
更に、purR遺伝子より転写されたメッセンジャーＲＮＡを不安定化するような変異を導入した組換えＤＮＡを作製し、これをバチルス属細菌宿主に導入して形質転換してもよい。
後述のｐｕｒＡ、ｄｅｏＤ、ｇｕａＢ、ｆｂｐ又はｙｗｊＨ遺伝子についても、上記と同様にしてコードされる酵素の活性を低下させることができる。
後述のｐｕｒＡ、ｄｅｏＤ、ｇｕａＢ、ｆｂｐ又はｙｗｊＨ遺伝子についても、上記と同様にしてコードされる酵素の活性を低下させることができる。
なお、ｐｕｒＲ遺伝子は、プリンオペロンを持つ微生物の染色体ＤＮＡから、公知のｐｕｒＲ遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法によって取得することができる。また、プリンオペロンを持つ微生物の染色体ＤＮＡライブラリーから、公知のｐｕｒＲ遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーション法によって、ｐｕｒＲ遺伝子を取得することができる。バチルス・ズブチリス１６８ Ｍａｒｂｕｒｇ株では、ｐｕｒＲ遺伝子の塩基配列が報告されている（GenBank accession No.D26185（コード領域は塩基番号118041〜118898）、NC_000964(コード領域は塩基番号54439〜55296)）。ｐｕｒＲ遺伝子の塩基配列及び同遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を、配列表の配列番号５及び６に示す（特開２００４−２４２６１０号参照）。
ｐｕｒＲ遺伝子を得るためのＰＣＲに用いるプライマーとしては、ｐｕｒＲ遺伝子の一部あるいは全長を増幅することができるものであればよく、具体的には配列番号１７（GAAGTTGATGATCAAAA）及び配列番号１８（ACATATTGTTGACGATAAT）に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。
破壊型遺伝子の作製に用いるｐｕｒＲ遺伝子は、必ずしも全長を含む必要はなく、遺伝子破壊を起こすのに必要な長さを有していればよい。また、各遺伝子の取得に用いる微生物は、同遺伝子が、遺伝子破壊株の創製に用いるバチルス属細菌のｐｕｒＲ遺伝子と相同組換えを起こす程度の相同性を有していれば特に制限されない。しかし、通常は、目的とするバチルス属細菌と同じ細菌に由来する遺伝子を用いることが好ましい。
前記マーカー遺伝子としては、スペクチノマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）由来のスペクチノマイシン耐性遺伝子は、バチルス ジェネチック ストック センター（BGSC）より市販されているエシェリヒア・コリ ＥＣＥ１０１株から、プラスミドｐＤＧ１７２６を調製し、該プラスミドからカセットとして取り出すことにより、取得することができる。スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）のエリスロマイシン耐性遺伝子は、バチルス ジェネチック ストック センター（BGSC）より市販されているエシェリヒア・コリＥＣＥ９１株から、プラスミドｐＤＧ６４６を調製し、該プラスミドからカセットとして取り出すことにより、取得することができる。カナマイシン耐性遺伝子は、ストレプトコッカス・フェカリス（Streptococcus faecalis）由来カナマイシン耐性遺伝子は、バチルス ジェネチック ストック センター（BGSC）より市販されているエシェリヒア・コリ ＥＣＥ９４株から、プラスミドｐＤＧ７８３を調製し、該プラスミドからカセットとして取り出すことにより、取得することができる。さらに、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）のクロラムフェニコール耐性遺伝子は、バチルス ジェネチック ストック センター（BGSC）より市販されているバチルス・ズブチリス１Ｅ１７株から、プラスミドｐＣ１９４を調製し、該プラスミドを鋳型としてＰＣＲにより増幅することで、取得することができる。ストレプトコッカス・アガラクティア由来のテトラサイクリン耐性遺伝子は、エシェリヒア・コリECE99株からプラスミドpDG1513を調製し、該プラスミドからカセットとして取り出すことにより、取得することができる(Gene 1995 167:335-336)。
マーカー遺伝子として薬剤耐性遺伝子を用いる場合は、該遺伝子をプラスミド中のｐｕｒＲ遺伝子の適当な部位に挿入し、得られるプラスミドで微生物を形質転換し、薬剤耐性となった形質転換体を選択すれば、ｐｕｒＲ遺伝子破壊株が得られる。染色体上のｐｕｒＲ遺伝子が破壊されたことは、サザンブロッティングやＰＣＲ法により、染色体上のｐｕｒＲ遺伝子又はマーカー遺伝子を解析することによって、確認することができる。前記スペクチノマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子又はカナマイシン耐性遺伝子が染色体ＤＮＡに組み込まれたことの確認は、これらの遺伝子を増幅することができるプライマーを用いたＰＣＲにより、行うことができる。
また、プリンオペロンの発現は、プロモーター下流に位置するｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ−ａｎｔｉｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ配列（以下、アテニュエーター配列と称する）により制御されていることが知られている（Ebbole, D. J. and Zalkin, H., J. Biol. Chem., 1987, 262, 8274−8287、Ebbole, D. J. and Zalkin, H., J. Biol. Chem., 1988, 263, 10894−10902、Ebbole, D. J. and Zalkin, H., J. Bacteriol., 1989, 171, 2136−2141）。したがって、アテニュエーター配列を欠損させることで、プリンオペロンの発現量を上昇させることができる。アテニュエーター配列の欠損はｐｕｒＲ破壊と同様の方法で行うことが出来る。
なお、プリンオペロン転写をさらに増大させるためには、上記方法を組み合わせてもよく、例えば、ｐｕｒＲ遺伝子を破壊し、さらに、アテニュエーター配列を欠損させたプリンオペロンをプラスミドで増幅するか、あるいは、このようなプリンオペロンを染色体上で多コピー化させてもよい。
また、プリン生合成に関与する酵素の活性増強は、プリン生合成に関与する酵素の調節を解除すること、例えば、前記酵素のフィードバック阻害を解除する方法によっても行うことができる（ＷＯ９９／０３９８８）。
さらに、プリン系物質の細胞内への取り込みを弱化することによっても、プリン系物質生産能を強化することができる。例えば、プリンヌクレオシドの細胞内へ取り込みは、プリンヌクレオシドの細胞内への取り込みに関与する反応を遮断することによって弱化することができる。上記プリンヌクレオシドの細胞内への取り込みに関与する反応は、たとえばヌクレオシドパーミアーゼに触媒される反応である。
さらに、プリンヌクレオシドを製造する場合には、プリンヌクレオシド生産能を増強させるためにプリン系物質を分解する酵素の活性を低下させてもよい。このような酵素として、例えば、プリンヌクレオシドホスホリラーゼが挙げられる。
ＰＲＰＰから、プリン生合成に関与する酵素群により生合成されたプリンヌクレオチドは、脱リン酸化されて、プリンヌクレオシドに変換される。プリンヌクレオシドを効率的に蓄積せしめるためには、プリンヌクレオシドを更に分解してヒポキサンチン等とするプリンヌクレオシドホスホリラーゼの活性を低下させることが好ましい。すなわち、イノシンをはじめとするプリンヌクレオシドを基質とするプリンヌクレオシドホスホリラーゼを弱化、あるいは欠損させるように改変することが望ましい。
プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性の低下は、具体的には、バチルス属細菌でプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするｄｅｏＤ遺伝子とｐｕｐＧ遺伝子を破壊することによって達成することができる。本発明のバチルス属細菌は、上記のようなｄｅｏＤ遺伝子とｐｕｐＧ遺伝子を単独、または同時に破壊するように改変されたものであってもよい。ｄｅｏＤ遺伝子、ｐｕｐＧ遺伝子は、例えばバチルス属由来の遺伝子（deoD;Genbank Accession No. NC_000964（配列番号７）, pupG;Genbank Accession No. NC_000964（配列番号９））が利用でき、上記ｐｕｒＲ遺伝子破壊と同様の方法で遺伝子破壊株を取得出来る。
また、プリン系物質生産能を増強させるために、サクシニル−AMPシンターゼの活性を低下させてもよい。サクシニル−AMPシンターゼをコードする遺伝子としては、purA遺伝子が挙げられる。purA遺伝子としては、例えば、GenBank Accession No. NC_000964（コード領域は相補鎖の塩基番号4153460-4155749）（配列番号１１）で登録されている塩基配列を有するものが挙げられる。
さらに、プリン系物質生産能を増強させるために、イノシンモノリン酸（IMP）脱水素酵素の活性を低下させてもよい。ＩＭＰ脱水素酵素をコードする遺伝子としては、guaB遺伝子が挙げられる。guaB遺伝子としては、例えば、GenBank Accession No.NC_000964(コード領域は15913-17376)（配列番号１３）で登録されている塩基配列を有するものが挙げられる。
また、プリン系物質生産能を増強させるために、フルクトース−ビスフォスファターゼの活性を低下させてもよい。フルクトース−ビスフォスファターゼをコードする遺伝子としては、fbp遺伝子が挙げられる。fbp遺伝子としては、例えば、GenBank Accession No.NC_000964(コード領域は4127053-4129065)（配列番号１５）で登録されている塩基配列を有するものが挙げられる。
また、プリン系物質生産能を増強させる方法として、プリン系物質を排出する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を増幅することが考えられる。このような遺伝子が増幅された細菌としては、例えば、rhtA遺伝子を増幅したバチルス属細菌が挙げられる（特開２００３−２１９８７６）。
上記のようにして破壊されるpurR、deoD、pupG、purA、guaB、もしくはfbp遺伝子、又は発現が増強されるprs遺伝子は、各々保存的バリアントであってよく、例えば各々配列番号６、８、１０、１２、１４、１６又は４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含み、かつ、それぞれプリンリプレッサー、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、サクシニル−AMPシンターゼ、IMP脱水素酵素、又はフルクトース−ビスフォスファターゼ、ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。前記「数個」は、例えば２〜５０個、好ましくは、２〜３０個、より好ましくは２〜１０個である。
上記のようなアミノ酸配列に対する変更は、通常、タンパク質の活性を維持するような保存的変更である。保存的なアミノ酸置換としては、ｓｅｒまたはｔｈｒによるＡｌａの置換；ｇｌｎ、ｈｉｓまたはｌｙｓによるａｒｇの置換；ｇｌｕ、ｇｌｎ、ｌｙｓ、ｈｉｓ、ａｓｐによるａｓｎの置換；ａｓｎ、ｇｌｕまたはｇｌｎによるａｓｐの置換；ｓｅｒまたはａｌａによるｃｙｓの置換；ａｓｎ、ｇｌｕ、ｌｙｓ、ｈｉｓ、ａｓｐまたはａｒｇによるｇｌｎの置換；ａｓｎ、ｇｌｎ、ｌｙｓまたはａｓｐによるｇｌｕの置換；ｐｒｏによるｇｌｙの置換；ａｓｎ、ｌｙｓ、ｇｌｎ、ａｒｇ、ｔｙｒによるｈｉｓの置換；ｌｅｕ、ｍｅｔ、ｖａｌ、ｐｈｅによるｉｌｅの置換；ｉｌｅ、ｍｅｔ、ｖａｌ、ｐｈｅによるｌｅｕの置換；ａｓｎ、ｇｌｕ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ａｒｇによるｌｙｓの置換；ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｖａｌ、ｐｈｅによるｍｅｔの置換；ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｍｅｔ、ｉｌｅまたはｌｅｕによるｐｈｅの置換；ｔｈｒ、ａｌａによるｓｅｒの置換；ｓｅｒまたはａｌａによるｔｈｒの置換；ｐｈｅ、ｔｙｒによるｔｒｐの置換；ｈｉｓ、ｐｈｅまたはｔｒｐによるｔｙｒの置換；およびｍｅｔ、ｉｌｅ、ｌｅｕによるｖａｌが挙げられる。
上記purR、deoD、pupG、purA、guaB、fbp遺伝子、又はprs遺伝子の保存的バリアントとしては具体的には、各々配列番号５、７、９、１１、１３、１５又は３に示す塩基配列を有するＤＮＡと、例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡが挙げられる。より具体的には、配列番号５、７、９、１１、１３、１５又は３に示す塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが挙げられる。ストリンジェントな条件としては、６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で洗浄が行われる条件が挙げられる。洗浄の回数は、１回又はそれ以上、好ましくは２回又は３回である。
ＤＮＡの相同性の評価は、ＢＬＡＳＴ検索、ＦＡＳＴＡ検索およびＣｒｕｓｔａｌＷ等の計算方法によって行うことができる。
ＢＬＡＳＴ（ベーシックローカルアラインメント検索ツール）は、プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｍｅｇａｂｌａｓｔ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘにより使用されるヒューリスティック検索アルゴリズムであり、これらのプログラムは、Karlin、SamuelおよびStephen F. Altschulの統計学的方法（「一般的なスコアリングスキームを使用することにより、分子配列の特徴の統計学的有意性を評価する方法（Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes）」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-68、「分子配列における多重ハイスコアリングセグメントに関する用途および統計学（Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences）」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-7）を用いて、得られた結果が有意であると見なす。ＦＡＳＴＡ検索方法は、W.R. Pearsonにより記載されている（「ＦＡＳＴＰおよびＦＡＳＴＡによる迅速かつ高感度な配列比較（Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA）」、Methods in Enzymology, 1990 183:63-98）。ＣｌｕｓｔａｌＷ方法は、Thompson J.D.、Higgins D.G.およびGibson T.J.により記載されている（「ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ：配列重み付け、位置特異的ギャップペナルティおよび重み行列法選択による漸進的多重配列アラインメントの感度の改善（CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice）」、Nucleic Acids Res. 1994, 22:4673-4680）。
ＢＬＡＳＴ（ベーシックローカルアラインメント検索ツール）は、プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｍｅｇａｂｌａｓｔ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘにより使用されるヒューリスティック検索アルゴリズムであり、これらのプログラムは、Karlin、SamuelおよびStephen F. Altschulの統計学的方法（「一般的なスコアリングスキームを使用することにより、分子配列の特徴の統計学的有意性を評価する方法（Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes）」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-68、「分子配列における多重ハイスコアリングセグメントに関する用途および統計学（Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences）」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-7）を用いて、得られた結果が有意であると見なす。ＦＡＳＴＡ検索方法は、W.R. Pearsonにより記載されている（「ＦＡＳＴＰおよびＦＡＳＴＡによる迅速かつ高感度な配列比較（Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA）」、Methods in Enzymology, 1990 183:63-98）。ＣｌｕｓｔａｌＷ方法は、Thompson J.D.、Higgins D.G.およびGibson T.J.により記載されている（「ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ：配列重み付け、位置特異的ギャップペナルティおよび重み行列法選択による漸進的多重配列アラインメントの感度の改善（CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice）」、Nucleic Acids Res. 1994, 22:4673-4680）。
また、破壊型遺伝子の作製に用いられるＤＮＡも、purR、deoD、pupG、purA又はguaB遺伝子の保存的バリアントであってもよい。
バチルス属細菌の染色体ＤＮＡに目的遺伝子を組み込むには、後述するトランスアルドラーゼをコードする遺伝子と同様にして行えばよい。
＜２＞トランスアルドラーゼの酵素活性を低下させるための改変
本発明のバチルス属細菌は、上述のようなプリン系物質生産能を有する菌株をトランスアルドラーゼの酵素活性が低下するように改変することによって取得することが出来る。ただし、改変の順は問わず、トランスアルドラーゼの酵素活性が低下するように改変したのちにプリンヌクレオチド生産能を付与してもよい。
本発明のバチルス属細菌は、上述のようなプリン系物質生産能を有する菌株をトランスアルドラーゼの酵素活性が低下するように改変することによって取得することが出来る。ただし、改変の順は問わず、トランスアルドラーゼの酵素活性が低下するように改変したのちにプリンヌクレオチド生産能を付与してもよい。
ここでトランスアルドラーゼとは、セドヘプツロース7-リン酸とD-グリセロアルデヒド3-リン酸からD-エリスロース４−リン酸とD−フルクトース6-リン酸を可逆的に生成する反応を触媒する酵素であり、この反応はペントースリン酸経路の反応の一部である。「ペントースリン酸経路」とは、細胞内にとりこまれたグルコースが、グルコースキナーゼによりリン酸化され、グルコース−６−リン酸が生合成され、グルコース−６−リン酸は、酸化的にリボース−５−リン酸へ転換される経路とエピメラーゼ、トランスケトラーゼ（EC：2.2.1.1）、トランスアルドラーゼ（EC：2.2.1.2）の作用により、トリオース、テトロロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトースのリン酸エステルが相互変換する可逆過程からなる経路を意味する。
トランスアルドラーゼの酵素活性は、以下のような方法で測定出来る。例えば、生成したＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸をトリオースリン酸イソメラーゼによりヒドロキシアセトンリン酸とし、これをグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼとＮＡＤＨを用いて測定する方法（Ochoa, T., and Horecker, B. L., 1966, Methods Enzymol., 9, 499-505）で測定出来る。
トランスアルドラーゼの酵素活性が低下するように改変するには、例えば、上記のｐｕｒＲ遺伝子の破壊で示したように、相同組換え法により、染色体上のトランスアルドラーゼをコードする遺伝子を、正常に機能しない遺伝子（例えば薬剤耐性等のマーカー遺伝子をトランスアルドラーゼをコードする遺伝子内部に挿入した破壊型遺伝子）で置換することにより、達成できる。また、purR遺伝子について述べたように、通常の変異処理法によって、染色体上のトランスアルドラーゼ遺伝子に、細胞中のトランスアルドラーゼの酵素活性が低下するような変異を導入してもよい。
バチルス・ズブチリスのトランスアルドラーゼは、配列番号２に示す２１２個のアミノ酸から構成されるタンパク質が挙げられ、該タンパク質をコードする遺伝子、好ましくは配列番号１（ywjH遺伝子；Genbank Accession No. NC_000964）の塩基配列を有する遺伝子を改変に用いることができる。なお、ｙｗｊＨ遺伝子は、バチルス・ズブチリス染色体上３２５度近傍に存在する。
トランスアルドラーゼをコードする遺伝子も、前述の各遺伝子と同様に、ywjH遺伝子の保存的バリアントであってもよい。具体的には、配列番号１に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加又は逆位を含み、かつ、トランスアルドラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。あるいは、配列番号２に示すアミノ酸配列と、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有し、かつトランスアルドラーゼの酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。より具体的には、配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが挙げられる。ストリンジェントな条件としては、６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で洗浄が行われる条件が挙げられる。洗浄の回数は、１回又はそれ以上、好ましくは２回又は３回である。
上記のようなトランスアルドラーゼと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むように、これら酵素をコードする塩基配列を改変することによって得られる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、変異処理前のＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及び変異処理前のＤＮＡを保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線照射またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
目的とする遺伝子は、例えば、バチルス属細菌の染色体ＤＮＡを鋳型とし、目的とする遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet., 1989, 5, 185-189参照）によって、取得することができる。染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miura, Biochem.B iophys. Acta, 1963, 72, 619-629、生物工学実験書、日本生物工学会編、97〜98頁、培風館、1992年参照）等により調製することができる。ＰＣＲ用プライマーは、バチルス属細菌の公知の遺伝子配列に基づいて、又は他の細菌等で配列が公知の遺伝子間で保存されている領域の情報に基づいて、調製することができる。
バチルス属細菌の染色体ＤＮＡに目的遺伝子を組み込むためのベクターとしては、ｐＨＶ１２４８（Prtit, M.-A., et. al., J. Bacteriol., 1990, 172, 6736-6740）等の温度感受性複製起点をもつベクターやｐＨＳＧ３９８（宝酒造（株））、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−（Stratagene）等のＥ．ｃｏｌｉ用ベクター等が挙げられる。
目的遺伝子とバチルス属細菌で機能するマーカーを搭載したベクターを連結して組換えＤＮＡを調製するには、目的遺伝子の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結はＴ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。
上記のように調製した組換えＤＮＡをバチルス属細菌に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Dubnau, D., and Davidoff-Abelson, R., J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）、又は、宿主細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Chang, S. and Cohen, S.N., Molec. Gen. Genet., 1979, 168, 111-115）が挙げられる。
＜２＞プリン系物質の製造法
本発明のバチルス属細菌はプリン系物質を効率よく生産する。したがって、本発明のバチルス属細菌を好適な培地で培養することによって、細菌の細胞内又は培地中にプリンヌクレオシド及びプリンヌクレオチドなどのプリン系物質を生成蓄積せしめることができる。
本発明のバチルス属細菌はプリン系物質を効率よく生産する。したがって、本発明のバチルス属細菌を好適な培地で培養することによって、細菌の細胞内又は培地中にプリンヌクレオシド及びプリンヌクレオチドなどのプリン系物質を生成蓄積せしめることができる。
本発明に用いる培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地を用いて常法により行うことができる。合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源は培養する菌株の利用可能なものならばよい。
炭素源としてはグルコース、フラクトース、シュークロース、マルトース、マンノース、ガラクトース、アラビノース、キシロース、トレハロース、リボース、でんぷん加水分解物、糖蜜等の糖類、グリセロールやマンニトールなどのアルコール類が使用され、その他、グルコン酸、酢酸、クエン酸、マレイン酸、フマール酸、コハク酸等の有機酸等も単独あるいは他の炭素源と併用して用いられる。
窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸塩または大豆加水分解物などの有機窒素等が使用される。
有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、さらにこれらのものを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が使用され、生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添する事が必要である。
無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。
培養条件は、用いるバチルス属細菌の種類によるが、例えばバチルス・ズブチリスでは、発酵温度２０〜５０℃、ｐＨを４〜９に制御しつつ通気培養を行う。培養中にｐＨが低下する場合にはアンモニアガス等のアルカリで中和する。かくして４０時間〜３日間程度培養することにより、培養液中にプリンヌクレオシドが蓄積される。
培養終了後、培養液中に蓄積されたイノシンを採取する方法としては公知の方法に従って行えばよい。例えば、沈殿法、またはイオン交換クロマトグラフィー等によって単離することができる。
また、本発明に用いる微生物は、さらにヌクレオシダーゼやヌクレオチダーゼをコードする遺伝子を欠損させれば、各々に対応するヌクレオシド又はヌクレオチドを蓄積させることができ、又イノシンの要求性を付与すれば、これらの生合成系経路上の前駆体及びその関連物質を蓄積させることができる。
さらに、本発明の方法により製造されたイノシン又はグアノシンに、プリンヌクレオシドホスホリラーゼおよびホスホリボシルトランスフェラーゼを作用させることにより、５’−イノシン酸あるいは５’−グアニル酸が得られる。
また、本発明の微生物を用いて生産されたプリンヌクレオシドに、ホスホトランスフェラーゼを作用させることによってリン酸化し、プリンヌクレオチド（ヌクレオシド−５’−燐酸エステル）を生産することも可能である（特開2000-295996）。例えば、エシェリヒア・コリのイノシングアノシンキナーゼをコードする遺伝子を導入したエシェリヒア属細菌を用いるプリンヌクレオチドの製造法（WO91/08286号パンフレット）、エキシグオバクテリウム・アセチリカムのイノシングアノシンキナーゼをコードする遺伝子を導入したコリネバクテリウム・アンモニアゲネスを用いたプリンヌクレオチドの製造法（WO96/30501号パンフレット）を採用することができる。
また、本発明の微生物を用いて生産されたプリンヌクレオシドに、ポリ燐酸、フェニル燐酸、カルバミル燐酸からなる群より選択された燐酸供与体と、ヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成する能力を有する微生物や、酸性フォスファターゼ（EC 3.1.3.2）を作用させることによって、プリンヌクレオチド（ヌクレオシド−５’−燐酸エステル）を生産することも可能である。ヌクレオシド−５’−燐酸エステルを生成する能力を有する微生物は、プリンヌクレオシドをプリンヌクレオチドに変換する能力を有するものであれば特に制限されないが、例えば、国際公開パンフレットＷＯ９６３７６０３号に記載されたような微生物が挙げられる。
また、特開平０７−２３１７９３に開示されているようなエシェリヒア・ブラッタエ（Escherichia blattae）JCM 1650、セラチア・フィカリア（Serratia ficaria）ATCC 33105、クレブシエラ・プランティコラ（Klebsiella planticola）IFO 14939 (ATCC 33531)、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）IFO 3318 (ATCC 8724)、クレブシエラ・テリゲナ（Klebsiella terrigena）IFO 14941 (ATCC 33257)、モルガネラ・モルガニ（Morganella morganii）IFO 3168、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）IFO 12010、エンテロバクター・アエロゲネス IFO 13534 (ATCC 13048)、クロモバクテリウム・フルヴィアティレ（Chromobacterium fluviatile）IAM 13652、クロモバクテリウム・ヴィオラセウム（Chromobacterium violaceum）IFO 12614、セデセア・ラパゲイ（Cedecea lapagei）JCM 1684、セデセア・ダヴィシエ（Cedecea davisiae）JCM 1685、セデセア・ネテリ（Cedecea neteri）JCM 5909などを用いることもできる。
酸性フォスファターゼとしては、例えば、特開２００２−０００２８９に開示されているようなものを用いることができ、より好ましくはヌクレオシドに対する親和性が上昇した酸性フォスファターゼ（特開平１０−２０１４８１参照）やヌクレオチダーゼ活性が低下した変異型酸性フォスファターゼ（ＷＯ９６３７６０３参照）、燐酸エステル加水分解活性が低下した変異型酸性フォスファターゼ（特開２００１−２４５６７６）などを用いることができる。
本発明の微生物を用いて生産されたプリンヌクレオシドを化学的にリン酸化することにより、プリンヌクレオチドを得ることも可能である（Bulletin of the Chemical Society of Japan 42,3505）。また、微生物が有しているATP再生系を利用して、本発明のXMP生産能を有する微生物とXMPアミナーゼ活性を共役させることによってGMPを得る方法、イノシンキナーゼを共役させることによってIMPを得る方法も採用できる（Biosci.Biotech.Biochem.,51,840(1997) 特開昭63-230094）。
上記プリンヌクレオチドの製造に用いる、本発明の方法により製造されたイノシン又はグアノシン、又はプリンヌクレオシドは、精製されたものであってもよいが、プリンヌクレオシドの発酵液又はプリンヌクレオシドを含む粗精製物であってもよい。
［実施例］
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
＜プリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするpupG遺伝子およびdeoD遺伝子を欠損した菌株の作製＞
バチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）由来で、プリンオペロンリプレッサー遺伝子（purR）、サクシニル−AMPシンターゼ遺伝子（purA）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（pupG）を欠損し、かつIMP脱水素酵素遺伝子（guaB）が弱化され、かつプリンオペロンプロモーター領域、PRPPシンセターゼ遺伝子（prs）のSD配列を改変した組換え体KMBS310（特願２００５−２８０１８６号）を用いて、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（deoD）を欠損した菌株の作製を、以下のようにして行った。尚、前記プリンオペロン及びPRPPシンセターゼ遺伝子は、各々プロモーター領域及びSD配列の改変により発現が強化されている。
バチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）由来で、プリンオペロンリプレッサー遺伝子（purR）、サクシニル−AMPシンターゼ遺伝子（purA）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（pupG）を欠損し、かつIMP脱水素酵素遺伝子（guaB）が弱化され、かつプリンオペロンプロモーター領域、PRPPシンセターゼ遺伝子（prs）のSD配列を改変した組換え体KMBS310（特願２００５−２８０１８６号）を用いて、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（deoD）を欠損した菌株の作製を、以下のようにして行った。尚、前記プリンオペロン及びPRPPシンセターゼ遺伝子は、各々プロモーター領域及びSD配列の改変により発現が強化されている。
KMBS16（purR::spc purA::erm deoD::kan；特開２００４−２４２６１０号公報）より、FouetとSonensheinの方法（J. Bacteriol., 1990, 172, 835-844）により調製したゲノムDNAを用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製したB. subtilis 168 Marburg株のコンピテントセルを形質転換し、5μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。このようにして得られたいくつかのコロニーの中でスペクチノマイシン耐性又はエリスロマイシン耐性となっていないコロニーを選択し、それらの内の一株を、KMBS5（deoD::kan）と名づけた。
KMBS5より、FouetとSonensheinの方法（J. Bacteriol., 1990, 172, 835-844）により調製したゲノムDNAを用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製したKMBS310株のコンピテントセルを形質転換し、5μg/mlのカナマイシンと20μg/mlのグアニンを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。このようにして得られたいくつかのコロニーを選択し、野生型deoD遺伝子がdeoD::kanで置換されており、かつKMBS310由来のすべての変異が野生型配列と置換されていないことが確認できた形質転換体の内の一株を、KMBS321と名づけた。
＜フルクトース−ビスフォスファターゼをコードするfbp遺伝子、トランスアルドラーゼをコードするywjH遺伝子、又は両遺伝子を欠損した菌株の作製と培養評価＞
（１）fbp遺伝子欠損株の作製
上述のバチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）由来で、プリンオペロンリプレッサー遺伝子（purR）、サクシニル−AMPシンターゼ遺伝子（purA）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（pupG）を欠損し、かつIMP脱水素酵素遺伝子（guaB）が弱化され、かつプリンオペロンプロモーター領域、PRPP synthetase遺伝子（prs）のSD配列が改変され、かつプリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（deoD）を欠損した組換え体KMBS321を用いて、フルクトース−ビスフォスファターゼ遺伝子（fbp）を欠損させた菌株の作製を、以下のようにして行った。
（１）fbp遺伝子欠損株の作製
上述のバチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）由来で、プリンオペロンリプレッサー遺伝子（purR）、サクシニル−AMPシンターゼ遺伝子（purA）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（pupG）を欠損し、かつIMP脱水素酵素遺伝子（guaB）が弱化され、かつプリンオペロンプロモーター領域、PRPP synthetase遺伝子（prs）のSD配列が改変され、かつプリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（deoD）を欠損した組換え体KMBS321を用いて、フルクトース−ビスフォスファターゼ遺伝子（fbp）を欠損させた菌株の作製を、以下のようにして行った。
（ｉ）fbp上流域のPCR法による増幅
遺伝子データバンク（GenBank Accession NC_000964およびV01277）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ28 mer、50 merのPCR用プライマーを作製した。
遺伝子データバンク（GenBank Accession NC_000964およびV01277）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ28 mer、50 merのPCR用プライマーを作製した。
TTCCCTTAGGGTTATTTTCGTTTCAAAA（配列番号１９）
cgtttgttgaactaatgggtgctTTTATGAGCATGTGCATGATAAGGTGA（配列番号２０；小文字の塩基はpC194上にクローニングされているクロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）のプロモーター上流域の配列）
cgtttgttgaactaatgggtgctTTTATGAGCATGTGCATGATAAGGTGA（配列番号２０；小文字の塩基はpC194上にクローニングされているクロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）のプロモーター上流域の配列）
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 1.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、fbp遺伝子5’末端領域と上流の約1350 bpを含む増幅断片を得た。
（ii）fbp下流域のPCR法による増幅
遺伝子データバンク（GenBank Accession NC_000964およびV01277）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ50 mer、27 merのPCR用プライマーを作製した。
遺伝子データバンク（GenBank Accession NC_000964およびV01277）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ50 mer、27 merのPCR用プライマーを作製した。
acagctccagatccatatccttcttTTTTAGAGAGTTTGCGGGAGTATCG（配列番号２１；小文字の塩基はpC194上にクローニングされているクロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）の構造遺伝子下流域の配列）
TAAAGGTTTTTCGGGATAAGATTGAAA（配列番号２２）
TAAAGGTTTTTCGGGATAAGATTGAAA（配列番号２２）
バチルス・ズブチリス 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 1.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、fbp遺伝子3’末端領域と下流の約1770 bp含む増幅断片を得た。
（iii）cat遺伝子のPCR法による増幅
遺伝子データバンク（GenBank Accession No.V01277およびNC_000964）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ50 merのPCR用プライマーを作製した。
遺伝子データバンク（GenBank Accession No.V01277およびNC_000964）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ50 merのPCR用プライマーを作製した。
tcaccttatcatgcacatgctcataaaAGCACCCATTAGTTCAACAAACG（配列番号２３；小文字の塩基はfbp遺伝子5’末端領域の配列で配列番号２０の3’末端領域と相補するようにデザインされている）
cgatactcccgcaaactctctaaaaAAGAAGGATATGGATCTGGAGCTGT（配列番号２４；小文字の塩基はfbp遺伝子3’末端領域の配列で配列番号２１の3’末端領域と相補するようにデザインされている）
cgatactcccgcaaactctctaaaaAAGAAGGATATGGATCTGGAGCTGT（配列番号２４；小文字の塩基はfbp遺伝子3’末端領域の配列で配列番号２１の3’末端領域と相補するようにデザインされている）
クロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）が搭載されているプラスミドpC194を鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 1.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、cat遺伝子を含む約980 bpの増幅断片を得た。
（iv）cat遺伝子がfbp領域に挿入された断片のリコンビナントPCR法による増幅
（ｉ）から（iii）で増幅したDNA断片をMicroSpin Column S-400（Amersham Pharmacia Biotech）で精製後、適量を混合したものをテンプレートとし、配列番号１９および２２を用いて、PCR（98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 4.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、cat遺伝子がfbp領域に挿入された増幅断片を得た。
（ｉ）から（iii）で増幅したDNA断片をMicroSpin Column S-400（Amersham Pharmacia Biotech）で精製後、適量を混合したものをテンプレートとし、配列番号１９および２２を用いて、PCR（98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 4.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、cat遺伝子がfbp領域に挿入された増幅断片を得た。
（ｖ）fbpを破壊したイノシン生産菌株の作製
（iv）で取得したcat遺伝子を挿入したfbp領域(fbp::cat)のDNA断片をアガロースゲル電気泳動後、目的とする断片をゲルより抽出した。このようにして精製したDNA断片を用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製したB. subtilis KMBS321株のコンピテントセルを形質転換し、2.5 μg/mlのクロラムフェニコールと20 μg/mlのグアニンを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。これらのコロニーから染色体DNAを調製し、（ｉｖ）に示したPCR法により、染色体上のfbp領域が、内部がクロラムフェニコール耐性遺伝子で置換されたfbp領域（fbp::cat）と２回組換えにより置換した菌株を同定し、これらの内の一株をTABS133と名づけた。
（iv）で取得したcat遺伝子を挿入したfbp領域(fbp::cat)のDNA断片をアガロースゲル電気泳動後、目的とする断片をゲルより抽出した。このようにして精製したDNA断片を用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製したB. subtilis KMBS321株のコンピテントセルを形質転換し、2.5 μg/mlのクロラムフェニコールと20 μg/mlのグアニンを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。これらのコロニーから染色体DNAを調製し、（ｉｖ）に示したPCR法により、染色体上のfbp領域が、内部がクロラムフェニコール耐性遺伝子で置換されたfbp領域（fbp::cat）と２回組換えにより置換した菌株を同定し、これらの内の一株をTABS133と名づけた。
（２）ywjH遺伝子欠損株の作製
上述のバチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）由来で、プリンオペロンリプレッサー遺伝子（purR）、サクシニル−AMPシンターゼ遺伝子（purA）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（pupG）を欠損し、かつIMP脱水素酵素遺伝子（guaB）が弱化され、かつプリンオペロンプロモーター領域、PRPP synthetase遺伝子（prs）のSD配列が改変され、かつプリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（deoD）を欠損した組換え体KMBS321を用いて、トランスアルドラーゼ遺伝子（ywjH）を欠損させた菌株の作製を、以下のようにして行った。
上述のバチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）由来で、プリンオペロンリプレッサー遺伝子（purR）、サクシニル−AMPシンターゼ遺伝子（purA）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（pupG）を欠損し、かつIMP脱水素酵素遺伝子（guaB）が弱化され、かつプリンオペロンプロモーター領域、PRPP synthetase遺伝子（prs）のSD配列が改変され、かつプリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（deoD）を欠損した組換え体KMBS321を用いて、トランスアルドラーゼ遺伝子（ywjH）を欠損させた菌株の作製を、以下のようにして行った。
（ｉ）ywjH上流域のPCR法による増幅
遺伝子データバンク（GenBank Accession NC_000964およびV01277）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ28 mer、50 merのPCR用プライマーを作製した。
遺伝子データバンク（GenBank Accession NC_000964およびV01277）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ28 mer、50 merのPCR用プライマーを作製した。
ATGGACGGAATCGAAATCTTAAAACGGA（配列番号２５）
cgtttgttgaactaatgggtgctttAGAATTCCTAATTCATTCGCTTCTC（配列番号２６；小文字の塩基はpC194上にクローニングされているクロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）のプロモーター上流域の配列）
cgtttgttgaactaatgggtgctttAGAATTCCTAATTCATTCGCTTCTC（配列番号２６；小文字の塩基はpC194上にクローニングされているクロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）のプロモーター上流域の配列）
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 1.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、ywjH遺伝子5’末端領域と上流の約1420 bpを含む増幅断片を得た。
（ii）ywjH下流域のPCR法による増幅
遺伝子データバンク（GenBank Accession NC_000964およびV01277）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ50 mer、28 merのPCR用プライマーを作製した。
遺伝子データバンク（GenBank Accession NC_000964およびV01277）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ50 mer、28 merのPCR用プライマーを作製した。
acagctccagatccatatccttctTTGACCTGATTTCAGAAGTTAAACAG（配列番号２７；小文字の塩基はpC194上にクローニングされているクロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）の構造遺伝子下流域の配列）
GGATGACGTTATCGATAATGACTTCCTT（配列番号２８）
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 1.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、ywjH遺伝子3’末端領域と下流の約1370 bp含む増幅断片を得た。
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 1.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、ywjH遺伝子3’末端領域と下流の約1370 bp含む増幅断片を得た。
（iii）cat遺伝子のPCR法による増幅
遺伝子データバンク（GenBank Accession No.V01277およびNC_000964）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ50 merのPCR用プライマーを作製した。
遺伝子データバンク（GenBank Accession No.V01277およびNC_000964）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ50 merのPCR用プライマーを作製した。
gagaagcgaatgaattaggaattctAAAGCACCCATTAGTTCAACAAACG（配列番号２９；小文字の塩基はywjH遺伝子5’末端領域の配列で配列番号２６の3’末端領域と相補するようにデザインされている）
ctgtttaacttctgaaatcaggtcaaAGAAGGATATGGATCTGGAGCTGT（配列番号３０；小文字の塩基はywjH遺伝子3’末端領域の配列で配列番号２７の3’末端領域と相補するようにデザインされている）
クロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）が搭載されているプラスミドpC194を鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 1.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、cat遺伝子を含む約980 bpの増幅断片を得た。
クロラムフェニコール耐性遺伝子（cat）が搭載されているプラスミドpC194を鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 1.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、cat遺伝子を含む約980 bpの増幅断片を得た。
（iv）cat遺伝子がywjH領域に挿入された断片のリコンビナントPCR法による増幅
（ｉ）から（iii）で増幅したDNA断片をMicroSpin Column S-400（Amersham Pharmacia Biotech）で精製後、適量を混合したものをテンプレートとし、配列番号２５および２８を用いて、PCR（98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 4分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、cat遺伝子がywjH領域に挿入された増幅断片を得た。
（ｉ）から（iii）で増幅したDNA断片をMicroSpin Column S-400（Amersham Pharmacia Biotech）で精製後、適量を混合したものをテンプレートとし、配列番号２５および２８を用いて、PCR（98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 4分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、cat遺伝子がywjH領域に挿入された増幅断片を得た。
（ｖ）ywjHを破壊したイノシン生産菌株の作製
（iv）で取得したcat遺伝子を挿入したywjH領域(ywjH::cat)のDNA断片をアガロースゲル電気泳動後、目的とする断片をゲルより抽出した。このようにして精製したDNA断片を用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製したB. subtilis KMBS321株のコンピテントセルを形質転換し、2.5 μg/mlのクロラムフェニコールと20 μg/mlのグアニンを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。これらのコロニーから染色体DNAを調製し、（ｉｖ）に示したPCR法により、染色体上のywjH領域が、内部がクロラムフェニコール耐性遺伝子で置換されたywjH領域（ywjH::cat）と２回組換えにより置換した菌株を同定し、これらの内の一株をTABS135と名づけた。
（iv）で取得したcat遺伝子を挿入したywjH領域(ywjH::cat)のDNA断片をアガロースゲル電気泳動後、目的とする断片をゲルより抽出した。このようにして精製したDNA断片を用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製したB. subtilis KMBS321株のコンピテントセルを形質転換し、2.5 μg/mlのクロラムフェニコールと20 μg/mlのグアニンを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。これらのコロニーから染色体DNAを調製し、（ｉｖ）に示したPCR法により、染色体上のywjH領域が、内部がクロラムフェニコール耐性遺伝子で置換されたywjH領域（ywjH::cat）と２回組換えにより置換した菌株を同定し、これらの内の一株をTABS135と名づけた。
（３）fbp ywjH二重欠損株の作製
バチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）由来で、プリンオペロンリプレッサー遺伝子（purR）、サクシニル−AMPシンターゼ遺伝子（purA）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（pupG）、フルクトース−ビスフォスファターゼ遺伝子（fbp）を欠損し、かつIMP脱水素酵素遺伝子（guaB）が弱化され、かつプリンオペロンプロモーター領域、PRPP synthetase遺伝子（prs）のSD配列を改変した組換え体TABS133を用いて、トランスアルドラーゼ遺伝子（ywjH）を欠損した菌株の作製を、以下のようにして行った。
バチルス・ズブチリス（B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051）由来で、プリンオペロンリプレッサー遺伝子（purR）、サクシニル−AMPシンターゼ遺伝子（purA）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（pupG）、フルクトース−ビスフォスファターゼ遺伝子（fbp）を欠損し、かつIMP脱水素酵素遺伝子（guaB）が弱化され、かつプリンオペロンプロモーター領域、PRPP synthetase遺伝子（prs）のSD配列を改変した組換え体TABS133を用いて、トランスアルドラーゼ遺伝子（ywjH）を欠損した菌株の作製を、以下のようにして行った。
（ｉ）ywjH上流域のPCR法による増幅
遺伝子データバンク（GenBank Accession NC_000964およびM29725）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ26 mer、50 merのPCR用プライマーを作製した。
遺伝子データバンク（GenBank Accession NC_000964およびM29725）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ26 mer、50 merのPCR用プライマーを作製した。
TAAAGCGTGATAGACATACAGTGCTG（配列番号３１）
cattgcaagacttttttcaccaagcAGAATTCCTAATTCATTCGCTTCTC（配列番号３２；小文字の塩基はpDG1513上にクローニングされているテトラサイクリン耐性遺伝子（tet）のプロモーター上流域の配列）
cattgcaagacttttttcaccaagcAGAATTCCTAATTCATTCGCTTCTC（配列番号３２；小文字の塩基はpDG1513上にクローニングされているテトラサイクリン耐性遺伝子（tet）のプロモーター上流域の配列）
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 2.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、ywjH遺伝子5’末端領域と上流の約2250 bpを含む増幅断片を得た。
（ii）ywjH下流域のPCR法による増幅
遺伝子データバンク（GenBank Accession NC_000964およびM29725）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ50 mer、26 merのPCR用プライマーを作製した。
遺伝子データバンク（GenBank Accession NC_000964およびM29725）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ50 mer、26 merのPCR用プライマーを作製した。
gagagagttcaaaattgatcctttTTGACCTGATTTCAGAAGTTAAACAG（配列番号３３；小文字の塩基はpDG1513上にクローニングされているテトラサイクリン耐性遺伝子（tet）の構造遺伝子下流域の配列）
TTGCATATACATGTCAGGAGCATTCA（配列番号３４）
TTGCATATACATGTCAGGAGCATTCA（配列番号３４）
B． subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 2.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、ywjH遺伝子3’末端領域と下流の約2280 bp含む増幅断片を得た。
（iii）tet遺伝子のPCR法による増幅
遺伝子データバンク（GenBank Accession No.M29725およびNC_000964）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ50 merのPCR用プライマーを作製した。
遺伝子データバンク（GenBank Accession No.M29725およびNC_000964）の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ50 merのPCR用プライマーを作製した。
gagaagcgaatgaattaggaattctGCTTGGTGAAAAAAGTCTTGCAATG（配列番号３５；小文字の塩基はywjH遺伝子5’末端領域の配列で配列番号３２の3’末端領域と相補するようにデザインされている）
ctgtttaacttctgaaatcaggtcaaAAAGGATCAATTTTGAACTCTCTC（配列番号３６；小文字の塩基はywjH遺伝子3’末端領域の配列で配列番号３３の3’末端領域と相補するようにデザインされている）
ctgtttaacttctgaaatcaggtcaaAAAGGATCAATTTTGAACTCTCTC（配列番号３６；小文字の塩基はywjH遺伝子3’末端領域の配列で配列番号３３の3’末端領域と相補するようにデザインされている）
テトラサイクリン耐性遺伝子（tet）が搭載されているpDG1513を鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR（98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 2.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、cat遺伝子を含む約2070 bpの増幅断片を得た。
（iv）tet遺伝子がywjH領域に挿入された断片のリコンビナントPCR法による増幅
（ｉ）から（iii）で増幅したDNA断片をMicroSpin Column S-400（Amersham Pharmacia Biotech）で精製後、適量を混合したものをテンプレートとし、配列番号３１および３４を用いて、PCR（98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 7分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、tet遺伝子がywjH領域に挿入された増幅断片を得た。
（ｉ）から（iii）で増幅したDNA断片をMicroSpin Column S-400（Amersham Pharmacia Biotech）で精製後、適量を混合したものをテンプレートとし、配列番号３１および３４を用いて、PCR（98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 7分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600（パーキンエルマー社製））を行い、tet遺伝子がywjH領域に挿入された増幅断片を得た。
（ｖ）fbpおよびywjHを破壊したイノシン生産菌株の作製
（iv）で取得したtet遺伝子を挿入したywjH領域(ywjH::tet)のDNA断片をアガロースゲル電気泳動後、目的とする断片をゲルより抽出した。このようにして精製したDNA断片を用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製したB. subtilis TABS133株のコンピテントセルを形質転換し、12.5 μg/mlのテトラサイクリンと20 μg/mlのグアニンを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。これらのコロニーから染色体DNAを調製し、（ｉｖ）に示したPCR法により、染色体上のywjH領域が、内部がテトラサイクリン耐性遺伝子で置換されたywjH領域（ywjH::tet）と２回組換えにより置換した菌株を同定し、これらの内の一株をTABS174と名づけた。
（iv）で取得したtet遺伝子を挿入したywjH領域(ywjH::tet)のDNA断片をアガロースゲル電気泳動後、目的とする断片をゲルより抽出した。このようにして精製したDNA断片を用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法（J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221）により調製したB. subtilis TABS133株のコンピテントセルを形質転換し、12.5 μg/mlのテトラサイクリンと20 μg/mlのグアニンを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。これらのコロニーから染色体DNAを調製し、（ｉｖ）に示したPCR法により、染色体上のywjH領域が、内部がテトラサイクリン耐性遺伝子で置換されたywjH領域（ywjH::tet）と２回組換えにより置換した菌株を同定し、これらの内の一株をTABS174と名づけた。
（４）fbp遺伝子、ywjH遺伝子、あるいは両遺伝子を欠損したイノシン生産菌株のプリンヌクレオシド生産
fbp遺伝子欠損株TABS133、ywjH遺伝子欠損株TABS135、両遺伝子を欠損した株TABS174およびコントロール株であるKMBS321を、グアニン20 mg/Lを含むLB培地プレート上にまんべんなく塗布し、34℃で一晩培養した。1/8プレート分の菌体を、500 ml容の坂口フラスコ中の発酵培地20 mlに接種し、その後、炭酸カルシウムを50 g/Lとなるように加えて、34℃で振とう培養した。培養開始後72時間目にサンプリングし、培養液中に含まれるイノシンおよびヒポキサンチン量を公知の方法で測定した。fbp遺伝子欠損株TABS133、ywjH遺伝子欠損株TABS135のイノシンの蓄積は、コントロール株であるKMBS321株のそれよりも高かった。また、両遺伝子を欠損させた株のイノシン蓄積は、TABS133株あるいはTABS135株のそれよりも高かった。
fbp遺伝子欠損株TABS133、ywjH遺伝子欠損株TABS135、両遺伝子を欠損した株TABS174およびコントロール株であるKMBS321を、グアニン20 mg/Lを含むLB培地プレート上にまんべんなく塗布し、34℃で一晩培養した。1/8プレート分の菌体を、500 ml容の坂口フラスコ中の発酵培地20 mlに接種し、その後、炭酸カルシウムを50 g/Lとなるように加えて、34℃で振とう培養した。培養開始後72時間目にサンプリングし、培養液中に含まれるイノシンおよびヒポキサンチン量を公知の方法で測定した。fbp遺伝子欠損株TABS133、ywjH遺伝子欠損株TABS135のイノシンの蓄積は、コントロール株であるKMBS321株のそれよりも高かった。また、両遺伝子を欠損させた株のイノシン蓄積は、TABS133株あるいはTABS135株のそれよりも高かった。
[発酵培地組成]
グルコース 30 g/L
KH2PO4 1 g/L
NH4Cl 32 g/L
豆濃（T-N）* 1.35 g/L
DL-メチオニン 0.4 g/L
L-トリプトファン 0.02 g/L
アデニン 0.1 g/L
グアノシン 0.075 g/L
MgSO4 0.4 g/L
FeSO4 0.01 g/L
MnSO4 0.01 g/L
アデカノール（消泡剤) 0.5 ml/L
（KOHでpH 7.0に調整）
炭酸カルシウム 50 g/L
*：大豆蛋白加水分解物
グルコース 30 g/L
KH2PO4 1 g/L
NH4Cl 32 g/L
豆濃（T-N）* 1.35 g/L
DL-メチオニン 0.4 g/L
L-トリプトファン 0.02 g/L
アデニン 0.1 g/L
グアノシン 0.075 g/L
MgSO4 0.4 g/L
FeSO4 0.01 g/L
MnSO4 0.01 g/L
アデカノール（消泡剤) 0.5 ml/L
（KOHでpH 7.0に調整）
炭酸カルシウム 50 g/L
*：大豆蛋白加水分解物
〔配列表の説明〕
配列番号１：ywjH遺伝子の塩基配列
配列番号２：トランスアルドラーゼのアミノ酸配列
配列番号３：prs遺伝子の塩基配列
配列番号４：ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼのアミノ酸配列
配列番号５：purR遺伝子の塩基配列
配列番号６：プリンリプレッサーのアミノ酸配列
配列番号７：deoD遺伝子の塩基配列
配列番号８：deoD遺伝子産物（プリンヌクレオシドホスホリラーゼ）のアミノ酸配列
配列番号９：pupG遺伝子の塩基配列
配列番号10：pupG遺伝子産物（プリンヌクレオシドホスホリラーゼ）のアミノ酸配列
配列番号11：purA遺伝子の塩基配列
配列番号12：サクシニル−AMPシンターゼのアミノ酸配列
配列番号13：guaB遺伝子の塩基配列
配列番号14：IMP脱水素酵素のアミノ酸配列
配列番号15：fbp遺伝子の塩基配列
配列番号16：フルクトース−ビスフォスファターゼのアミノ酸配列
配列番号17：purR遺伝子増幅用プライマー
配列番号18：purR遺伝子増幅用プライマー
配列番号19：fbp遺伝子上流域増幅用プライマー
配列番号20：fbp遺伝子上流域増幅用プライマー
配列番号21：fbp遺伝子下流域増幅用プライマー
配列番号22：fbp遺伝子下流域増幅用プライマー
配列番号23：cat遺伝子増幅用プライマー
配列番号24：cat遺伝子増幅用プライマー
配列番号25：ywjH遺伝子上流域増幅用プライマー
配列番号26：ywjH遺伝子上流域増幅用プライマー
配列番号27：ywjH遺伝子下流域増幅用プライマー
配列番号28：ywjH遺伝子下流域増幅用プライマー
配列番号29：cat遺伝子増幅用プライマー
配列番号30：cat遺伝子増幅用プライマー
配列番号31：ywjH遺伝子上流域増幅用プライマー
配列番号32：ywjH遺伝子上流域増幅用プライマー
配列番号33：ywjH遺伝子下流域増幅用プライマー
配列番号34：ywjH遺伝子下流域増幅用プライマー
配列番号35：tet遺伝子増幅用プライマー
配列番号36：tet遺伝子増幅用プライマー
配列番号１：ywjH遺伝子の塩基配列
配列番号２：トランスアルドラーゼのアミノ酸配列
配列番号３：prs遺伝子の塩基配列
配列番号４：ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼのアミノ酸配列
配列番号５：purR遺伝子の塩基配列
配列番号６：プリンリプレッサーのアミノ酸配列
配列番号７：deoD遺伝子の塩基配列
配列番号８：deoD遺伝子産物（プリンヌクレオシドホスホリラーゼ）のアミノ酸配列
配列番号９：pupG遺伝子の塩基配列
配列番号10：pupG遺伝子産物（プリンヌクレオシドホスホリラーゼ）のアミノ酸配列
配列番号11：purA遺伝子の塩基配列
配列番号12：サクシニル−AMPシンターゼのアミノ酸配列
配列番号13：guaB遺伝子の塩基配列
配列番号14：IMP脱水素酵素のアミノ酸配列
配列番号15：fbp遺伝子の塩基配列
配列番号16：フルクトース−ビスフォスファターゼのアミノ酸配列
配列番号17：purR遺伝子増幅用プライマー
配列番号18：purR遺伝子増幅用プライマー
配列番号19：fbp遺伝子上流域増幅用プライマー
配列番号20：fbp遺伝子上流域増幅用プライマー
配列番号21：fbp遺伝子下流域増幅用プライマー
配列番号22：fbp遺伝子下流域増幅用プライマー
配列番号23：cat遺伝子増幅用プライマー
配列番号24：cat遺伝子増幅用プライマー
配列番号25：ywjH遺伝子上流域増幅用プライマー
配列番号26：ywjH遺伝子上流域増幅用プライマー
配列番号27：ywjH遺伝子下流域増幅用プライマー
配列番号28：ywjH遺伝子下流域増幅用プライマー
配列番号29：cat遺伝子増幅用プライマー
配列番号30：cat遺伝子増幅用プライマー
配列番号31：ywjH遺伝子上流域増幅用プライマー
配列番号32：ywjH遺伝子上流域増幅用プライマー
配列番号33：ywjH遺伝子下流域増幅用プライマー
配列番号34：ywjH遺伝子下流域増幅用プライマー
配列番号35：tet遺伝子増幅用プライマー
配列番号36：tet遺伝子増幅用プライマー
本発明のバチルス属細菌を用いることにより、プリンヌクレオシド及び/又はプリンヌクレオチドの生産効率を向上させることが出来る。
Claims (12)
- プリン系物質生産能を有し、トランスアルドラーゼの酵素活性が低下するように改変され、さらにフルクトース−ビスフォスファターゼ活性が低下するように改変されたバチルス属細菌を培地に培養して、同細菌の細胞内又は培地中にプリン系物質を蓄積せしめ、同細胞又は培地からプリン系物質を回収することを特徴とするプリン系物質の製造法。
- 前記バチルス属細菌は、トランスアルドラーゼをコードする遺伝子を破壊すること、または、トランスアルドラーゼをコードする遺伝子の発現量を低下させることにより、トランスアルドラーゼ活性が低下したバチルス属細菌である請求項１に記載のプリン系物質の製造法。
- 前記トランスアルドラーゼをコードする遺伝子が下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコードする遺伝子である請求項２に記載のプリン系物質の製造法。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、トランスアルドラーゼ活性を有するタンパク質。 - 前記バチルス属細菌は、さらにホスホリボシルピロリン酸シンセターゼ活性が上昇するように改変されたことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のプリン系物質の製造法。
- 前記バチルス属細菌は、さらに、プリンオペロンの発現量が上昇するように改変されたことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載のプリン系物質の製造法。
- 前記バチルス属細菌は、プリンオペロンのリプレッサーをコードする遺伝子であるｐｕｒＲ遺伝子が破壊されたことにより、プリンオペロンの発現量が上昇したことを特徴とする請求項５に記載のプリン系物質の製造法。
- 前記バチルス属細菌は、さらに、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性が低下するように改変されたことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のプリン系物質の製造法。
- 前記バチルス属細菌は、さらに、ＩＭＰ脱水素酵素活性が低下するように改変されたことを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載のプリン系物質の製造法。
- バチルス属細菌がバチルス・ズブチリスである請求項１〜８のいずれか
一項に記載のプリン系物質の製造法。 - 前記プリン系物質がイノシン、キサントシン、グアノシン、及びアデノシンからなる群より選択されるプリンヌクレオシドである請求項１〜９のいずれか一項に記載のプリン系物質の製造法。
- 前記プリン系物質がイノシン酸、キサンチル酸、グアニル酸、及びアデニル酸からなる群より選択されるプリンヌクレオチドである請求項１〜９のいずれか一項に記載のプリン系物質の製造法。
- 請求項１０に記載の方法によりプリンヌクレオシドを製造し、該プリンヌクレオシドに、ポリ燐酸、フェニル燐酸、及びカルバミル燐酸からなる群より選択される燐酸供与体と、ヌクレオシド−５'−燐酸エステルを生成する能力を有する微生物又は酸性フォスファターゼを作用させて、プリンヌクレオチドを生成せしめ、該プリンヌクレオチドを採取することを特徴とするプリンヌクレオチドの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2008513147A JP5251505B2 (ja) | 2006-04-24 | 2007-04-17 | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006119324 | 2006-04-24 | ||
| JP2006119324 | 2006-04-24 | ||
| JP2008513147A JP5251505B2 (ja) | 2006-04-24 | 2007-04-17 | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 |
| PCT/JP2007/058357 WO2007125783A1 (ja) | 2006-04-24 | 2007-04-17 | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2007125783A1 JPWO2007125783A1 (ja) | 2009-09-10 |
| JP5251505B2 true JP5251505B2 (ja) | 2013-07-31 |
Family
ID=38655313
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2008513147A Active JP5251505B2 (ja) | 2006-04-24 | 2007-04-17 | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8236531B2 (ja) |
| EP (1) | EP2011861A1 (ja) |
| JP (1) | JP5251505B2 (ja) |
| KR (1) | KR101173533B1 (ja) |
| CN (1) | CN101432418B (ja) |
| BR (1) | BRPI0709635A2 (ja) |
| WO (1) | WO2007125783A1 (ja) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5104754B2 (ja) | 2006-04-24 | 2012-12-19 | 味の素株式会社 | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 |
| CN101960005B (zh) * | 2008-02-25 | 2016-02-24 | 味之素株式会社 | 5’-鸟苷酸的生产方法 |
| US8647642B2 (en) | 2008-09-18 | 2014-02-11 | Aviex Technologies, Llc | Live bacterial vaccines resistant to carbon dioxide (CO2), acidic PH and/or osmolarity for viral infection prophylaxis or treatment |
| JP5636648B2 (ja) | 2009-08-10 | 2014-12-10 | 味の素株式会社 | ５’−グアニル酸の製造法 |
| CN102329836A (zh) * | 2011-09-19 | 2012-01-25 | 南通香地生物有限公司 | 采用芽孢杆菌生产5’-腺苷酸的方法 |
| JP6618792B2 (ja) * | 2015-12-15 | 2019-12-11 | 株式会社Ｍｉｚｋａｎ Ｈｏｌｄｉｎｇｓ | 加熱殺菌が可能な納豆 |
| US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
| US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
| JP7203744B2 (ja) | 2017-09-29 | 2023-01-13 | 三菱ケミカル株式会社 | ニコチンアミドモノヌクレオチドの製造方法およびその方法に用いる形質転換体 |
| CN111411134B (zh) * | 2019-09-18 | 2023-05-12 | 大连民族大学 | 一种海洋芽孢杆菌Bacillus sp.JIN118发酵生产嘌呤的制备方法 |
| CN110863022A (zh) * | 2019-09-30 | 2020-03-06 | 大连民族大学 | 嘌呤的发酵生产工艺 |
| KR102185850B1 (ko) * | 2020-02-21 | 2020-12-02 | 씨제이제일제당 주식회사 | 퓨린 뉴클레오티드를 생산하는 미생물 및 이를 이용한 퓨린 뉴클레오티드의 생산방법 |
| CN113583929B (zh) * | 2021-07-26 | 2024-04-05 | 中国科学院微生物研究所 | 发酵生产嘌呤核苷的重组菌及其构建方法与应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999003988A1 (fr) * | 1997-07-18 | 1999-01-28 | Ajinomoto Co., Inc. | Procede de production de nucleosides de purine par fermentation |
| WO2001021774A1 (fr) * | 1999-09-21 | 2001-03-29 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Nouveau gene transaldolase |
Family Cites Families (52)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1161988A (en) | 1965-09-04 | 1969-08-20 | Takeda Chemical Industries Ltd | A Process for the Production of Inosine |
| JPS515075B1 (ja) * | 1970-02-05 | 1976-02-17 | ||
| JPS5417033B2 (ja) * | 1973-06-14 | 1979-06-27 | ||
| JPS5545199B2 (ja) * | 1974-03-30 | 1980-11-17 | ||
| JPS552956B2 (ja) * | 1974-03-30 | 1980-01-23 | ||
| JPS533271B2 (ja) | 1975-03-06 | 1978-02-04 | ||
| JPS5417033A (en) | 1977-07-07 | 1979-02-08 | Canon Inc | Fixing roller for zerography |
| JPS552956A (en) | 1978-06-22 | 1980-01-10 | Nec Corp | Automatic wiring tester |
| US4198692A (en) | 1978-09-22 | 1980-04-15 | Rockwell International Corporation | Self-biased structure for magnetic bubble domain devices |
| JPS5612438A (en) | 1979-07-13 | 1981-02-06 | Mitsubishi Heavy Ind Ltd | Drag suction-head for sludge dredging |
| JPS5714160A (en) | 1980-06-27 | 1982-01-25 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | Airconditioner |
| JPS5741915A (en) | 1980-08-27 | 1982-03-09 | Makoto Mori | Manufacture of knife handle having sealed object inside thereof |
| JPS5817592A (ja) | 1981-07-24 | 1983-02-01 | Hitachi Ltd | 磁気バブル拡大器 |
| JPS58158197A (ja) | 1982-03-16 | 1983-09-20 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるイノシンの製造法 |
| JPS58175493A (ja) | 1982-04-08 | 1983-10-14 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるグアノシンの製造法 |
| JPS5942895A (ja) | 1982-07-27 | 1984-03-09 | Takeda Chem Ind Ltd | イノシンおよびグアノシンの製造法 |
| JPS5928470A (ja) | 1982-08-11 | 1984-02-15 | Ajinomoto Co Inc | バチルス・ズブチリス |
| JPH0630583B2 (ja) | 1984-01-27 | 1994-04-27 | 武田薬品工業株式会社 | Ｄνａおよびその用途 |
| JPS6214794A (ja) | 1985-07-09 | 1987-01-23 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるグアノシン及び／またはイノシンの製造法 |
| ATE92101T1 (de) | 1986-12-26 | 1993-08-15 | Takeda Chemical Industries Ltd | Fuer inaktivierte imp-dehydrogenase kodierende dns. |
| JPH0669386B2 (ja) | 1987-03-18 | 1994-09-07 | 協和醗酵工業株式会社 | ５′−イノシン酸の製造法 |
| JPS6427477A (en) | 1987-04-01 | 1989-01-30 | Takeda Chemical Industries Ltd | Dna and use thereof |
| JP2545078B2 (ja) | 1987-04-06 | 1996-10-16 | 協和醗酵工業株式会社 | 核酸関連物質の製造法 |
| EP0393969A3 (en) | 1989-04-19 | 1991-03-13 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Dna containing imp dehydrogenase gene and its use |
| TW201793B (ja) | 1989-08-04 | 1993-03-11 | Takeda Pharm Industry Co Ltd | |
| ATE132528T1 (de) | 1989-12-05 | 1996-01-15 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Inosin-guanosin-kinase |
| JP2921702B2 (ja) | 1990-05-24 | 1999-07-19 | 株式会社トプコン | レーザ装置 |
| JPH05192164A (ja) | 1990-07-03 | 1993-08-03 | Takeda Chem Ind Ltd | 組換えｄｎａおよびその用途 |
| KR920002774A (ko) | 1990-07-03 | 1992-02-28 | 우메모또 요시마사 | Dna 및 그의 용도 |
| JP3016883B2 (ja) | 1991-02-19 | 2000-03-06 | 協和醗酵工業株式会社 | 発酵法による５’−キサンチル酸の製造法 |
| JPH0584067A (ja) | 1991-09-27 | 1993-04-06 | Takeda Chem Ind Ltd | 発酵法によるイノシンの製造法 |
| JP3651036B2 (ja) | 1993-12-27 | 2005-05-25 | 味の素株式会社 | ヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法 |
| ES2311289T3 (es) | 1995-03-24 | 2009-02-01 | Ajinomoto Co., Inc. | Procedimiento para producir acidos nucleicos. |
| JPH0937785A (ja) * | 1995-05-25 | 1997-02-10 | Ajinomoto Co Inc | ヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法 |
| JP3941390B2 (ja) | 1995-05-25 | 2007-07-04 | 味の素株式会社 | 変異型酸性フォスファターゼ |
| JPH08168383A (ja) | 1995-09-11 | 1996-07-02 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 核酸関連物質の製造法 |
| JP4304727B2 (ja) | 1996-11-21 | 2009-07-29 | 味の素株式会社 | ヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法 |
| JP4913929B2 (ja) | 1998-06-12 | 2012-04-11 | 味の素株式会社 | 核酸系物質の製造法 |
| WO2000018935A1 (fr) | 1998-09-25 | 2000-04-06 | Ajinomoto Co.,Inc. | Procede de construction d'une bacterie produisant des acides amines, et procede de production d'acides amines par une technique de fermentation utilisant ladite bacterie |
| RU2144564C1 (ru) * | 1998-10-13 | 2000-01-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | ФРАГМЕНТ ДНК rhtB, КОДИРУЮЩИЙ СИНТЕЗ БЕЛКА RhtB, ПРИДАЮЩЕГО УСТОЙЧИВОСТЬ К L-ГОМОСЕРИНУ БАКТЕРИЯМ ESCHERICHIA COLI, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ |
| JP2000295996A (ja) | 1999-02-08 | 2000-10-24 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | プリンヌクレオチドの製造法 |
| US20060014259A9 (en) | 1999-07-09 | 2006-01-19 | Kevin Burke | Process for the preparation of L-amino acids with amplification of the zwf gene |
| JP4192408B2 (ja) | 2000-06-23 | 2008-12-10 | 味の素株式会社 | ヌクレオシド−５’−燐酸エステルの製造法 |
| KR100429925B1 (ko) | 2001-12-28 | 2004-05-03 | 씨제이 주식회사 | 5'-크산틸산을 생산하는 미생물 |
| RU2239656C2 (ru) | 2002-01-24 | 2004-11-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" | Способ получения пуриновых нуклеозидов и нуклеотидов, штамм-продуцент пуриновых нуклеозидов (варианты) |
| DE102004001674B4 (de) * | 2003-01-29 | 2019-01-24 | Ajinomoto Co., Inc. | Verfahren zur Herstellung von L-Lysin unter Einsatz von Methanol verwertenden Bakterien |
| JP4352716B2 (ja) | 2003-02-17 | 2009-10-28 | 味の素株式会社 | バチルス属に属するイノシン生産菌及びイノシンの製造法 |
| DE602004000428T2 (de) * | 2003-05-26 | 2006-10-19 | Ajinomoto Co., Inc. | Verfahren zur Herstellung von Cadaverindicarboxylat und dessen Verwendung zur Herstellung von Nylon |
| JP3823099B2 (ja) | 2003-06-26 | 2006-09-20 | 中日産業株式会社 | キャリーカート |
| JP2005280186A (ja) | 2004-03-30 | 2005-10-13 | Canon Chemicals Inc | 発泡ゴムローラの製造方法 |
| US7326546B2 (en) * | 2005-03-10 | 2008-02-05 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing purine-derived substance |
| JP5104754B2 (ja) * | 2006-04-24 | 2012-12-19 | 味の素株式会社 | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 |
-
2007
- 2007-04-17 KR KR1020087028621A patent/KR101173533B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2007-04-17 CN CN200780014925XA patent/CN101432418B/zh active Active
- 2007-04-17 EP EP07741793A patent/EP2011861A1/en not_active Ceased
- 2007-04-17 JP JP2008513147A patent/JP5251505B2/ja active Active
- 2007-04-17 WO PCT/JP2007/058357 patent/WO2007125783A1/ja active Application Filing
- 2007-04-17 BR BRPI0709635-6A patent/BRPI0709635A2/pt not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-10-21 US US12/255,031 patent/US8236531B2/en active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999003988A1 (fr) * | 1997-07-18 | 1999-01-28 | Ajinomoto Co., Inc. | Procede de production de nucleosides de purine par fermentation |
| WO2001021774A1 (fr) * | 1999-09-21 | 2001-03-29 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Nouveau gene transaldolase |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JPN6012000059; Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． Ｖｏｌ．１４８, 1975, ｐ．５１３-５２０ * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20090005392A (ko) | 2009-01-13 |
| US8236531B2 (en) | 2012-08-07 |
| EP2011861A8 (en) | 2009-04-08 |
| CN101432418B (zh) | 2012-11-14 |
| WO2007125783A1 (ja) | 2007-11-08 |
| EP2011861A4 (en) | 2009-01-07 |
| CN101432418A (zh) | 2009-05-13 |
| JPWO2007125783A1 (ja) | 2009-09-10 |
| US20100047874A1 (en) | 2010-02-25 |
| EP2011861A1 (en) | 2009-01-07 |
| KR101173533B1 (ko) | 2012-08-13 |
| BRPI0709635A2 (pt) | 2011-07-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5104754B2 (ja) | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 | |
| JP5251505B2 (ja) | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 | |
| US8298791B2 (en) | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing purine-derived substance | |
| EP1004663A1 (en) | Process for producing purine nucleosides via fermentation | |
| JP5488594B2 (ja) | プリンリボヌクレオシド及びリボヌクレオチドの製造方法 | |
| JP4760711B2 (ja) | バチルス属又はエシェリヒア属に属する細菌を使用した発酵によるプリンヌクレオシド及びヌクレオチドの製造方法 | |
| JP4352716B2 (ja) | バチルス属に属するイノシン生産菌及びイノシンの製造法 | |
| JP5583311B2 (ja) | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 | |
| KR100779865B1 (ko) | 발효에 의한 뉴클레오타이드의 제조방법 | |
| JP2007075108A6 (ja) | プリンヌクレオシド生産菌及びプリンヌクレオシド製造法 | |
| JP2007075108A (ja) | プリンヌクレオシド生産菌及びプリンヌクレオシド製造法 | |
| JP2007075109A6 (ja) | プリンヌクレオシド生産菌及びプリンヌクレオシド製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100318 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20100318 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120110 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120308 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120904 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20121016 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130319 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130401 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Ref document number: 5251505 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20160426 Year of fee payment: 3 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |