JP5134060B2

JP5134060B2 - Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍおよびその使用

Info

Publication number: JP5134060B2
Application number: JP2010217075A
Authority: JP
Inventors: 林文▲キン▼
Original assignee: China Medical University
Current assignee: China Medical University
Priority date: 2010-07-20
Filing date: 2010-09-28
Publication date: 2013-01-30
Anticipated expiration: 2030-09-28
Also published as: KR20120010080A; KR101255894B1; MY151204A; US20120020943A1; JP2012024074A; TW201204374A; US8415135B2; TWI401086B

Description

本発明は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ株およびその使用、とりわけ、単離されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５およびその使用に関する。

Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓは、人間または動物の腸管に存在する主要な細菌の１つである。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓは、人間または動物の体の生理活性に対して有益な効果を及ぼすため、様々なプロバイオティクス産物にしばしば加えられる。例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓは、腸病原体（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属などの）の増殖を阻害できるか、病原体侵入に抵抗することができ、例えば、胃腸管系上皮細胞へのＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの侵入を阻止する。

現在、病原体を阻害するための、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの適用に関する多くの特許がある。例えば、米国特許第５，６０３，９３０号は、エンテロトキシンおよび腸侵入性病原体を阻害できるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｊｏｈｎｓｏｎｉｉを開示し、米国特許第３，９５３，６０９号は、消化器系におけるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の増殖を阻害できるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｌａｃｔｉｓを開示し、米国特許第６，４９１，９５６号は、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ感染に起因する胃炎、十二指腸潰瘍および胃潰瘍を予防および治療できるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓを開示する。

基礎的な生理的／薬理学的活性に加えて、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓが動物の体内で効果的に機能するためには、２つの重要な特徴を有していなければならない。まず、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓは、消化器系で生き残り、腸管に到達してその機能を行うために、動物の胃腸管によって分泌される胃酸およびコリンに対する強い耐性を有しなければならない。次に、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓは、胃腸管で他の病原体と競合し、それらの病原体によって駆逐されるのを避けるために、動物宿主の腸上皮細胞に強く接着できなければならない。さらに、病原体も、腸上皮細胞に接着することによって動物の体を感染させるので、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓが腸の上皮細胞に対して比較的強い接着能を有するならば、病原体を駆逐して、胃腸管を感染から保護することができる。

本発明の発明者は、新生児の排泄物から、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍの新しい株をスクリーニングし、相対インビボおよびインビトロ実験を通して、病原体を阻害することに加えて、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍが胃腸管および尿路の細胞への優れた接着能を有し、それゆえに、胃腸管および尿路を病原性感染から、効果的かつ長期的に保護できることを見出した。本発明者は、この株が病原体の増殖を直接阻害でき、それらの病原体に起因する疾患を予防および治療することも見出した。

台湾特許出願第０９９１２３８５１号米国特許第５，６０３，９３０号米国特許第３，９５３，６０９号米国特許第６，４９１，９５６号台湾公開特許第２００７０８６２２号台湾公開特許第２００６１１９７３号

本発明の主目的は、受託番号ＢＣＲＣ９１０４７２の下に台湾の食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ）に寄託され、受託番号ＤＳＭ２３７８０の下にドイツ微生物細胞培養収集機関（ＤＳＭＺ）に寄託されている、単離されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５を提供することである。

本発明の別の目的は、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５を含む組成物を提供することである。

さらに、本発明のさらなる目的は、病原体を阻害するため、胃腸管を保護するため、および／または尿路を保護するための医薬または健康食品を製造するための、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５の使用を提供することである。

本発明のために実行される詳細な技術および好ましい実施形態は、特許請求されている発明の特徴を当業者がよく理解するように、添付図面と併せて、下記の段落に記載されている。

ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５の遺伝子指紋地図である。

本発明の発明者は、健康な新生児の排泄物をスクリーニングして、それから新しいＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株を分離した。この株は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍと同定され、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５と名付けられた。

上述の通り、望ましい生理作用をもたらすためには、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓは、胃腸管への接着について病原体と競合し、さらに病原体を駆逐するために、動物宿主の腸上皮細胞に強く接着できなければならない。ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５は、市場で一般に見られるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｈａｍｎｏｓｕｓＧＧ（ＬＧＧ）よりもさらに強い胃腸上皮細胞への接着能で胃腸上皮細胞に付着できることが発見された。

胃腸上皮細胞に接着することに加えて、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５は、尿上皮細胞にも堅固に接着することができ、したがって、尿路への接着について病原体と競合し、さらに病原体を除去して、尿路を保護することができる。

ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５は、胃腸管および尿路に対して良好な接着性を有するので、病原体感染を予防または治療するのに使用できる。予防には、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５は、この株が胃腸管または尿路に接着して、これらの産物を摂取する人々を保護できるように、食料、飲料、栄養剤または健康食品に添加することができる。病原菌が胃腸管または尿路に侵入するとき、それらは、接着について、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５と競合できず、したがって、感染機構を始動することができず、体の外に駆逐される。治療には、病原体が人体または動物体の胃腸管または尿路に感染しているときに、例えば、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５を含む医薬を摂取でき、その際、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５に特徴的な、胃腸管および尿路への吸着によって、胃腸管または尿路に接着している病原体が除去され、治療効果をもたらすことになる。それゆえに、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５は、その強い吸着能を介して、病原体が胃腸管または尿路の細胞に接着するのを阻害して、病原体の感染を予防または治療することができる。

胃腸管または尿路への病原体の接着を阻害して、間接的に感染を阻害することに加えて、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５は、病原体の増殖を直接阻害することができ、したがってそれは、これら２つの阻害機構の共働によって胃腸管および／または尿路を保護することができる。それゆえに、テキストで「病原体を阻害する」という句は、胃腸管への病原体の接着の阻害、尿路への病原体の接着の阻害および病原体の増殖の阻害を含む。

ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５は、胃腸管および／または尿路における様々な病原体を阻害するのに使用できる。例えばそれは、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属種、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓおよびこれらの組合せからなる群から選択された病原体を阻害できる。特に、それはＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉを阻害するのに使用できる。

Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉは、グラム陰性、微好気性の病原菌であり、胃および十二指腸における様々な領域で生き残ることができる。Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉの伝染経路は現在のところ、いまだに不明であるが、それは、胃粘膜慢性炎症へと導くことができ、その結果、胃潰瘍および十二指腸潰瘍、または胃癌にさえなる。したがって、世界保健機関（ＷＨＯ）は、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉが１タイプの発癌性微生物であり、発癌性であることが見出された最初の原核生物でもあると発表した。世界人口の半分以上がＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ保菌者であり、ほとんどは開発途上国に住んでいる。現在のところ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉによって誘発される疾患を治療するための主要なアプローチは、抗生物質の使用によるものである。しかし、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉの薬剤耐性のため、もはや、多くの抗生物質は満足な治療結果をもたらさない。ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５は、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉの増殖および腸上皮細胞へのその接着を著しく阻害できるので、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉに起因する様々な疾患を効果的に予防または治療するために、従来の使用と組み合わせるか、または置き換えるのに用いることができる。

さらに、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５は、病原体の増殖を直接阻害できるので、病原体に起因する疾患を予防および治療するのに使用でき、上記疾患は胃腸疾患のみに限定されない。例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属種は、胃腸管、ならびに気道、尿路、静脈および創傷などの領域を感染させ得ることが知られており、したがって、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５によるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属種の増殖の阻害は、前述の領域の感染を治療および予防するのに適用できる。別の態様では、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓは、胃腸管、ならびに口腔および尿路などの粘膜組織を感染させ得、したがって、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５によるＣａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓの増殖の阻害は、口腔または尿路の感染の治療または予防に適用できる。

ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５の接着性特性、および病原体増殖を阻害する能力により、それは、様々な医療用品および健康用品に広範に適用できる。したがって、本発明は、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５を含む組成物も提供する。ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５の前述の特別な特徴に基づいて、本発明の組成物は、病原体を阻害するため、胃腸管を保護するため、尿路を保護するため、またはこれらの組合せのために使用できる。

本発明の組成物は、いかなる形で調製することもできる。例えばそれは、医薬品組成物、食料、飲料、栄養補助剤、乳製品、食品、健康食品、スプレーおよび坐薬からなる群から選択される形に調製することができる。本発明の一実施形態では、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５を食品（例えば、乳製品）に添加することができる。医薬品組成物および食品におけるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの適用は、参照により全体として本明細書に組み込まれている、台湾公開特許第２００７０８６２２号および台湾公開特許第２００６１１９７３号で見ることができる。

本発明の組成物には、接着および病原体増殖の阻害の効果を強化するための、いかなる適した添加物も任意選択で添加できる。代わりに、適用の柔軟性を増大させるために、他の栄養物または製薬成分を組成物に添加することもできる。例えば、本発明の組成物は、制酸剤、他のプロバイオティクスなどの１または複数種の活性成分を、これらの活性成分がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５の有効性に対して有害な効果を有しない限り含有し得る。

本発明は、病原体を阻害するため、胃腸管を保護するため、および／または尿路を保護するための、医薬または健康食品の製造のための、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５の使用も提供する。

以下に、下記の実施例を参照して本発明をさらに例示する。しかし、これらの実施例は、例示を目的として示すのみであり、本発明の範囲を制限しない。

接着分析
実験Ａ．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株の調製
胃腸細胞の接着分析を行うのに用いられるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株には、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｈａｍｎｏｓｕｓＧＧ（ＬＧＧ）、ならびに検査室から分離されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株Ｂ７Ｐ３、Ａ７Ｇ１、Ｂ１Ｔ４、ＩＡ５およびＨＴ５が含まれる。すべてのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ株をＭＲＳ培養溶液（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ、ＵＳＡ）で２回活性化し、それらをＭＲＳ培養液（５ｍＬ）中に移し、培養した。２４時間後に、１ｍＬのブロスを採取し、１０分間遠心処理し（６０００ｒｐｍ）、リン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）で２回すすいで、以下の接着実験へと進んだ。乳酸菌ｒｈａｍｎｏｓｕｓＧＧを対照群として使用した。

実験Ｂ．胃腸管および尿路細胞系の細胞培養
この実験で使用された胃腸管細胞系は、Ｃａｃｏ−２ヒト結腸腺癌（受託番号：ＡＴＣＣＣＲＬ２１０２）およびＡＧＳ胃腺癌（受託番号：ＡＴＣＣＣＲＬ１７３９）であった。使用された尿路細胞系は、Ｈｅｌａヒト子宮頸部上皮細胞（受託番号：ＡＴＣＣＣＣＬ−２）であった。これら（Ｃａｃｏ−２ヒト結腸腺癌、ＡＧＳ胃腺癌、およびＨｅｌａヒト子宮頸部上皮細胞）はすべて、生物資源保存及研究中心（ＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ）（ＢＣＲＣ）、台湾から購入し、細菌、真菌およびマイコプラズマの汚染試験にすでに合格していた。細胞系が得られた後、それらを直ちに、常温下３７℃の水浴中に移し、解凍し、２５ｃｍ²のペトリディッシュ内で培養し、その後、３７℃の、５容量％二酸化炭素を含有する細胞インキュベーター内で培養した。細胞を活性化し、数回、継代し、細胞系が安定となった後、さらなる実験を行った。Ｃａｃｏ−２細胞の培養培地は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＧｉｂｃｏＣｏｒｐから購入）であった。ＡＧＳ細胞の培養培地は、Ｆ−１２培地（ＧｉｂｃｏＣｏｒｐから購入）であった。Ｈｅｌａ細胞の培養培地は、基礎培地（ＭＥＭ（ＧｉｂｃｏＣｏｒｐから購入される））であった。上記の培養培地すべてには、１０容量％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）が添加されていた。

実験Ｃ．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの接着分析
実験Ｂで調製された細胞系を５分間、０．０５容量％トリプシン（１ｍＬ）で処理し、９６ウェルプレートに移した。その際、各ウェルに１×１０⁴細胞を加えた、培地を毎日、新しい培地（２００μＬ）で替えた。次に、実験Ａ（２０μＬ）で調製されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓブロスを細胞に加え、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓを細胞に接着させるために、１時間培養した。１時間の接着後に、培地を除去し、細胞を５回、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）ですすぎ、細胞に接着しなかったＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓを除去し、１０容量％ホルマリン（１００μＬ）を加えて細胞とＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓとを安定化させた。３０分後に、細胞を３回、ＰＢＳですすぎ、最後にクリスタルバイオレット（１００μＬ）で５分間染色し、細胞表面の染色を落すために、直ちに最小量の７５容量％アルコールで洗浄した。

位相差顕微鏡検査を用いて、胃腸管または尿路の上皮細胞への様々なＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの接着能を観察し、ランダム化された顕微鏡領域下で、５０細胞へのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの接着を観察および計算し、各細胞に接着しているＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの平均量を計算した。結果を表１に示す。

表１から分かるように、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５は、他の知られているＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ（国際的によく知られており、市場で一般的に見られるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｈａｍｎｏｓｕｓＧＧも含める）と比較して、胃腸管および尿路の細胞への接着能がさらに良好であり、したがって、さらに長期にわたって、胃腸管および尿路に保護を与えることができる。

病原体の増殖の阻害試験
実験Ｄ．ペトリディッシュ試験
ウェル拡散法（ｗｅｌｌ−ｄｉｆｆｕｓｉｏｎｍｅｔｈｏｄ）を用いて、病原体増殖に対するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの阻害能を評価した。滅菌Ｂｒｕｃｅｌｌａ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ，ＵＳＡ）を細菌ペトリディッシュ内に注ぎ、固めた。次に、終夜培養された、胃腸管の指標病原体、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ（受託番号：ＢＣＲＣ１７０２１）および臨床的に単離されたＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉＣＭＵ８３を寒天培地に均一になすりつけた。ブロスがわずかに乾燥した後、直径７ｍｍの穴を、当該寒天培地上に作り、実験ＡのＭＲＳ培地中で２４時間培養したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５のブロス（７０μＬ）を穴に加えた。さらに、ＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉＣＭＵ２０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属種、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ、ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓおよびＣａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓを含む、他の胃腸病原体を分析するのにも上記の方法を用いた。各試料を繰り返し３回分析し、培養培地を細菌インキュベーターに入れ、１６から１８時間後に、細菌阻害域（環）の直径を測定した。ここで、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｈａｍｎｏｓｕｓＧＧの発酵溶液を陽性対照として用い、ｐＨ６．３のＭＲＳ培地を陰性対照として用いた。結果を表２に示す。

表２の結果は、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｈａｍｎｏｓｕｓＧＧと比較して、本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５が、病原体増殖を阻害するのに、さらに良好な有効性を有し、したがって、病原体に起因する疾患を予防および治療するのに使用できることを例示する。例えば、それは、胃腸管を病原体感染から保護するのに使用できる。

病原体感染の阻害試験および接着試験
Ｃａｃｏ−２細胞、ＡＧＳ細胞およびＨｅｌａ細胞（各１ｍＬ；密度：５×１０⁴細胞／ｍＬ）を２４ウェル細胞培養プレートでそれぞれ培養し、３７℃の、５容量％二酸化炭素／９５容量％空気を含む細胞インキュベーターに入れ、２日間培養し、以下の２種類の試験を行った。

実験Ｅ．予防および保護モード
２日間培養され、均一に混合されたＣａｃｏ−２細胞、ＡＧＳ細胞またはＨｅｌａ細胞に、実験Ａで２４時間培養されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５の発酵溶液（１００μＬ）を加え、細胞を細胞インキュベーターに入れ、０．５時間インキュベートした。次に、細胞に接着しなかったＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓを除去するために、細胞を滅菌食塩水ですすいだ。ＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉＣＭＵ８３、腸管凝集性大腸菌（ＥＡｇｇＥＣ）またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（各１ｍＬ、１×１０⁷ｃｆｕ／ｍＬ）を細胞に加え、均一に混合し、細胞インキュベーターに１時間、細胞を入れ、培養し、病原体を細胞に感染させた。次に、培地を除去し、細胞に感染しなかった病原体を除去するために、細胞を滅菌食塩水ですすいだ。０．１容量％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（１ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ、Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）をさらに加え、感染している病原体を放出させるために、細胞を溶解させた。最後に、溶解した細胞を含有している溶液を収集し、ＰＢＳ溶液（９ｍＬ）中に入れた。溶液を適切に希釈した後、混釈平板法を用いて、細菌数を計算した。ここで、細胞にＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓが加えられなかった実験を対照群として用い、計算結果を下記の式に当てはめて、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５の感染阻害率を計算した。結果を表３に示す。
感染阻害率＝（対照群における病原体の数−Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの添加を行った群における病原体の数）／対照群における病原体の数×１００％

実験Ｆ．治療および除去モード
Ｃａｃｏ−２細胞、ＡＧＳ細胞またはＨｅｌａ細胞をそれぞれ２日間培養し、ＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉＣＭＵ８３、腸管凝集性大腸菌（ＥＡｇｇＥＣ）またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（各１ｍＬで、１×１０⁷ｃｆｕ／ｍＬ）を細胞に加え、病原体を細胞に感染させるために、細胞を０．５時間培養した。次に、細胞に侵入しなかった病原体を除去するために、細胞を滅菌食塩水ですすいだ。実験Ａで２４時間培養されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５の発酵溶液（１００のμＬ）を細胞に加え、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５に病原体を駆逐させるために、細胞を１時間培養した。最後に、細胞に接着しなかったＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓおよび駆逐された病原体を除去するために、細胞を滅菌食塩水ですすいだ。感染している病原体を放出させるために、０．１容量％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（１ｍＬ）を加えて、細胞を溶解させた。溶解した細胞を含有している溶液を収集して、適切に希釈した後、混釈平板法によって細菌数を計算した。ここで、細胞にＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓが加えられなかった実験を対照群として用い、計算結果を上記の式に当てはめて、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５の感染阻害率を計算した。結果を表４に示す。

表３および４から分かるように、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５は、病原体感染を阻害するのに優れた有効性を有する。詳細には、治療および除去モードの結果は、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５は、胃腸管および尿路の細胞への、病原体の接着を効果的に減らし、細胞から病原体をさらに駆逐して、感染を阻害する効果をもたらすことができることを明らかに示した。さらに、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５は、大腸菌またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ属種にも優れた阻害効果を有する。

動物試験
実験Ｇ．実験動物群
６週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｌａｓｃｏ，Ｉｎｃ．、台湾から購入）がこの実験で使われた。マウスの体重は２０から２６ｇにわたり、マウスは、温度が２２℃に維持され、定期的な１２時間の明暗を有する独立したＩＶＣマウス飼育システムで飼育された。マウスに滅菌飼料および逆浸透水を与え、自由摂取させた。マウスを環境に適応させるため、実験を始める前に、これらのマウスに２週間飼料を与えた。マウスをランダムに、１群当たり８匹のマウスの４群に分類した。Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉによって感染する前に、各群のマウスは、様々な濃度の新たに調製されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５ブロス２００μＬで、特定の時間に連続７日間経口給餌され、１日１回給餌された。各群の実験の条件を以下に記載する。

群Ａ：生理食塩水／陰性対照群
滅菌濾過された生理的食塩水によってマウスに給餌した。

群Ｂ：１×１０¹⁰コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍＬのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５の群
ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５をＭＲＳ培養液で２４時間培養し、ブロスを収集し、遠心処理し、生理食塩水中に再溶解させた。細菌濃度を１×１０¹⁰ｃｆｕ／ｍＬに調整し、次に細菌をマウスに給餌した。

群Ｃ：１×１０⁹ｃｆｕ／ｍＬのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５の群
ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５をＭＲＳ培養液で２４時間培養し、ブロスを収集し、遠心処理し、生理食塩水中に再溶解させた。細菌濃度を１×１０⁹ｃｆｕ／ｍＬに調整し、細菌を次にマウスに給餌した。

群Ｄ：１×１０⁸ｃｆｕ／ｍＬのＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５の群
ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５をＭＲＳ培養液で２４時間培養し、ブロスを収集し、遠心処理し、生理食塩水中に再溶解させた。細菌濃度を１×１０⁸ｃｆｕ／ｍＬに調整し、細菌を次にマウスに給餌した。

実験Ｈ．Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ感染試験
マウスにＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５ブロスを７日間給餌した後、その翌日に、２×１０⁷コロニー形成単位（ｃｆｕ）のＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉＣＭＵ８３を含有しているブロスをマウスに経口給餌した。感染を引き起こすために、マウスに３日間連続給餌し、その翌日に、マウスを１日間断食させた。次に、マウスを二酸化炭素で屠殺し、それらの頸部および脊椎骨を分離した。マウスの胃および十二指腸切片（およそ０．５ｇ）を採取して、９．５ｍＬの滅菌ＰＢＳ溶液を含有するｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに入れ、ホモジナイザーで３分間撹拌した。断片化した組織を含有する溶液（１ｍＬ）を採取し、次に滅菌ＰＢＳ溶液で連続的に１０倍希釈した。様々な希釈倍率で希釈された溶液（１００μＬ）を採取し、塗抹平板法によってＢｒｕｃｅｌｌａ寒天培地上にそれぞれプレーティングし、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉをスクリーニングするために、２．５容量％胎児ウシ血清および選択剤ＳＲ１４７Ｅ（Ｏｘｏｉｄ，Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を培地に加えた。この培地を試験して、この実験で使用するＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉＣＭＵ８３をスクリーニングできることを確認した。細菌を培養するために、培地を３７℃で４８時間微好気条件下に置き、細菌のコロニー形成単位（ｃｆｕ）を計算した。各実験の統計分析は３回繰り返し、実験結果はＳＰＳＳ１０．０ソフトウェアによって分析した。最初に、一元配置ＡＮＯＶＡ（分散分析）を用いて各群間の有意差を検定し、判定基準はｐ＜０．０５であった。結果を表５に示す。

表５は、１×１０⁹ｃｆｕ／ｍＬまたは１×１０¹⁰ｃｆｕ／ｍＬの濃度のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５をマウスに給餌した後、マウス胃腸管へのＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉの感染が著しく阻害され、したがって、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５が胃腸管を病原性感染から保護する有効性をもたらし得ることを示す。

実験Ｉ．株の同定
［Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ同定キット分析］
本発明のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５を１６時間ＭＲＳ培養培地で活性化およびインキュベートし、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓの同定を専門とするＡＰＩ５０ＣＨＬ同定キット（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ、ＭａｒｃｙＩ’Ｅｔｏｉｌｅ、Ｆｒａｃｅ）を用いて、株の種を分析および確認した。

［遺伝子配列決定分析］
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ用の特異的プライマーを用いて、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５の１６Ｓ−２３ＳｒＲＮＡ区域のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、結果として生じた産物の配列を分析した。得られたＰＣＲ産物の配列を分析した。配列の一部を配列番号１に示す。
配列番号１
ACATTGCAACAGCGCGTGCCGTATTTTAATTATCGGCTAGCCACAGAGATCTATCCGTTAAACAAACAATTTACTGAGAAATACGGGAATAAGTATGGGAAATATCCCTAGCGAACCCTAAATAATGGCCCCCCTGTCTTGAACAGATAGACTGGCCAAACTCCTACGGGAGAAAACGTTGGGAAATTTTGCTCAATGGGCCCAACCCTGAGGCGCCCCTGCCACATATATGAGGAAAGCCTTCGGGTTATAAAATTTTTTTTCAGCGAGGAGTGAAGTGAGGATAAGAACCTTCTACA

この分析で使用されるプライマーは、ＬＵ−５およびＬａｃ−２であった。それらの配列を下記に示す。
LU-5: 5'-CTAGCGGGTGCGACTTTGTT-3' 配列番号2
Lac-2: 5'-CCTCTTCGCTCGCCGCTACT-3' 配列番号3

［パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）分析］
パルスフィールドゲル電気泳動を用いて、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５のゲノムＤＮＡを分析した。ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５の遺伝子指紋地図を得るための制限酵素としてＳｇｓＩ（ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）を用いた。結果を図１に示す。図１における遺伝子指紋地図は、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５の遺伝子指紋同定の参照として示すのみであり、この株の遺伝子同定結果を限定するために示すものではない。

ＡＰＩ５０ＣＨＬ同定キットの結果によれば、それは、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５がＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍに属していることを示している。ＰＣＲ産物の遺伝子配列の比較の結果によって、この株が新しいＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍであることがさらに証明される。

ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５は、受託番号ＢＣＲＣ９１０４７２の下に台湾の食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ）に寄託され、受託番号ＤＳＭ２３７８０の下にドイツ微生物細胞培養収集機関（ＤＳＭＺ）に寄託された。

上記の実施例は、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５が、胃腸管および尿路への病原体の接着を阻害して、胃腸管の細胞を保護し、病原性感染を減らすことができ、それは病原体の増殖を直接的に阻害することもでき、したがって、それは、これらの２つの阻害機構の共働効果によって胃腸管および尿路を保護できることを明らかにした。

上記の開示は、詳細な技術的内容およびその発明的特徴に関連する。当業者は、本発明の特徴から逸脱せずに記載されている本発明の開示および示唆に基づいて、様々な修正および代替を進めることができる。しかるに、そのような修正および代替は上記の説明で完全に開示されてはいないが、それらは、添付の特許請求の範囲に実質的に包含されている。

Claims

受託番号ＤＳＭ２３７８０の下にドイツ微生物細胞培養収集機関（ＤＳＭＺ）に寄託されている、単離されたＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５。
胃腸管および／または尿路に接着できる、請求項１に記載のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５。
病原体の増殖を阻害できる、請求項１または２に記載のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５。
病原体が胃腸管および／または尿路に接着するのを阻害できる、請求項１から３のいずれかに記載のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５。
病原体が、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属種、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓおよびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項３または４に記載のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５。
病原体がＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉである、請求項３から５のいずれかに記載のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５。
請求項１から６のいずれかに記載のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５を含む組成物。
病原体を阻害するため、胃腸管を保護するため、および／または尿路を保護するために使用される、請求項７に記載の組成物。
病原体が、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属種、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓおよびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項８に記載の組成物。
医薬品組成物、飼料、飲料、栄養補助剤、乳製品、食品、健康食品、スプレーまたは坐薬である、請求項７から９のいずれかに記載の組成物。
病原体を阻害するため、胃腸管を保護するため、および／または尿路を保護するための医薬の製造のための、請求項１から６のいずれかに記載のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍＣＭＵ９９５の使用。
病原体が、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属種、Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓおよびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１１に記載の使用。