JP5020118B2 - 蛍光解析装置及び解析方法 - Google Patents

Description

本発明は、測定試料中の蛍光プローブから発生する蛍光を検出して、測定試料についての解析を行う蛍光解析装置、及び蛍光解析方法に関するものである。

蛍光相関分光法（ＦＣＳ: Fluorescence CorrelationSpectroscopy）は、極低濃度の蛍光物質が存在する溶液の測定試料中の微小領域に励起光を照射して測定領域とするとともに、その微小な測定領域内で発生した蛍光の強度を時系列的に測定してその自己相関関数を求めることによって、測定試料中での蛍光物質の並進拡散運動等についての情報を得るものである（例えば特許文献１、２、非特許文献１〜３を参照）。このようなＦＣＳによる蛍光解析は、例えば臨床診断における免疫分析に適用することができる。
米国特許第６２００８１８号公報 特開２００４−３４７６０８号公報 Thorsten Winkler et al.,"Confocal fluorescence coincidence analysis: An approach to ultrahigh-throughput screening", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.96,pp.1375-1378, 1999 Bo Huang et al., "PhotonCounting Histogram: One-Photon Excitation", ChemPhysChem 2004, 5,pp.1523-1531 Kerstin Korn et al.,"Gene expression analysis using single molecule detection", NucleicAcids Research, 2003, Vol.31, No.16 e89

ＦＣＳによる免疫分析などの蛍光解析では、蛍光物質によって標識された分子プローブ（蛍光プローブ）を測定試料に加え、測定領域内にある蛍光プローブから発生する蛍光を検出するとともに、その自己相関関数から並進拡散運動等についての情報を取得する。これにより、分析対象となる試料中の標的分子と、蛍光プローブとの反応量を知ることができ、測定試料についての情報を取得することができる。このような試料解析方法は、ホモジニアス・アッセイにおける非分離型の計測方法であるため、ＥＬＩＳＡ法などのヘテロジニアス・アッセイに比べて、消耗品類の消費を少なくしてランニングコストを低減することが可能である。また、解析装置の小型化、低価格化も可能である。

一方、ＦＣＳによる蛍光解析において、微量物質の検出という観点から、その測定感度の向上が求められている。ＦＣＳにおける測定感度を向上するための構成として、キャピラリやマイクロチップなどの流路、あるいはピエゾアクチュエータなどによる振動によって測定試料に流れを付与する構成が用いられている。

このように測定試料に流れを付与する構成では、測定試料中において、分子が並進拡散運動に加えて流れによる移動運動をすることにより、微小な測定領域に対する分子の通過頻度を高めることができ、これによって測定感度を向上することが可能である。しかしながら、このような構成では、自己相関関数を用いた並進拡散運動についての解析が分子の移動運動のために複雑化し、特に移動運動の速度が大きくなった場合には、並進拡散運動についての蛍光解析が困難となるという問題がある。

本発明は、以上の問題点を解決するためになされたものであり、測定領域内にある蛍光プローブからの蛍光を測定することによる測定試料の蛍光解析を容易化することが可能な蛍光解析装置、及び蛍光解析方法を提供することを目的とする。

このような目的を達成するために、本発明による蛍光解析装置は、（１）測定試料に対して設定された測定領域に励起光を照射する励起光照射手段と、（２）励起光照射手段によって励起光が照射された測定試料の測定領域内にある蛍光プローブから発生する蛍光を検出する蛍光検出手段と、（３）蛍光検出手段から出力される検出信号に基づいて、蛍光検出手段で検出された光子数を所定の計数時間幅で時系列的に計数する光子計数手段と、（４）光子計数手段によって取得される時系列の光子数測定データに対する蛍光解析について、その解析条件を設定する解析条件設定手段と、（５）解析条件設定手段によって設定された解析条件に基づいて、蛍光プローブを含む測定試料についての測定結果を示す光子数測定データに対して蛍光解析を行う測定結果解析手段とを備え、（６）解析条件設定手段は、解析条件として、光子数測定データをビニングするビン幅と、そのビン幅における蛍光プローブ１分子に対する基準光子数とを設定し、測定結果解析手段は、解析条件設定手段によって設定されたビン幅で光子数測定データをビニングし、基準光子数を参照して測定試料の測定領域内にある蛍光プローブの個数についての蛍光解析を行うとともに、（７）解析条件設定手段は、光子数測定データでの光子数のＳＮ比である測定ＳＮ比のビン幅による変化と、ショットノイズ特性を仮定した場合の光子数のＳＮ比である基準ＳＮ比のビン幅による変化とを用いて、ビン幅を設定することを特徴とする。

また、本発明による蛍光解析方法は、（１）測定試料に対して設定された測定領域に励起光を照射する励起光照射ステップと、（２）励起光照射ステップで励起光が照射された測定試料の測定領域内にある蛍光プローブから発生する蛍光を検出する蛍光検出ステップと、（３）蛍光検出ステップで取得される検出信号に基づいて、蛍光検出ステップで検出された光子数を所定の計数時間幅で時系列的に計数する光子計数ステップと、（４）光子計数ステップで取得される時系列の光子数測定データに対する蛍光解析について、その解析条件を設定する解析条件設定ステップと、（５）解析条件設定ステップで設定された解析条件に基づいて、蛍光プローブを含む測定試料についての測定結果を示す光子数測定データに対して蛍光解析を行う測定結果解析ステップとを備え、（６）解析条件設定ステップは、解析条件として、光子数測定データをビニングするビン幅と、そのビン幅における蛍光プローブ１分子に対する基準光子数とを設定し、測定結果解析ステップは、解析条件設定ステップで設定されたビン幅で光子数測定データをビニングし、基準光子数を参照して測定試料の測定領域内にある蛍光プローブの個数についての蛍光解析を行うとともに、（７）解析条件設定ステップにおいて、光子数測定データでの光子数のＳＮ比である測定ＳＮ比のビン幅による変化と、ショットノイズ特性を仮定した場合の光子数のＳＮ比である基準ＳＮ比のビン幅による変化とを用いて、ビン幅を設定することを特徴とする。

上記した蛍光解析装置、及び蛍光解析方法においては、励起光照射系及び蛍光検出系によって測定試料中に微小な測定領域を設定するとともに、その測定領域内にある蛍光プローブから発生する蛍光を検出して、時系列の光子数測定データを生成する。そして、測定結果の光子数測定データに対してビニングのビン幅と、蛍光プローブ１分子当たりの測定光子数に対応する基準光子数とを解析条件として設定し、それらの解析条件に基づいて、測定領域内での蛍光プローブの個数についての蛍光解析（フォトンバースト解析）を行っている。

このように、所定の計数時間幅で取得された光子数測定データを設定されたビン幅でビニングし直し、そのビニングされた測定データに基準光子数を適用してフォトンバースト解析を行うことにより、例えば測定試料中での標的分子と蛍光プローブとの反応についての解析など、測定領域内にある蛍光プローブからの蛍光を測定することによる測定試料の蛍光解析を容易化することが可能となる。

さらに、このようなフォトンバースト解析において、光子数測定データに対するビン幅の設定について、測定されたＳＮ比のビン幅依存性に対して、ショットノイズ特性を仮定した場合の基準ＳＮ比のビン幅依存性を求め、それらの関係からビニングのビン幅を設定している。このような構成によれば、フォトンバースト解析で光子数測定データに適用されるビン幅について、測定試料に対して実際に取得された測定データの特性に合わせて、好適に設定することができる。これにより、測定試料に対する蛍光測定の感度、及びフォトンバースト解析の解析精度を向上することが可能となる。

ここで、蛍光解析装置は、蛍光プローブを含む測定試料に対して流れを付与する流れ付与手段を備えることが好ましい。同様に、蛍光解析方法は、蛍光プローブを含む測定試料に対して流れを付与する流れ付与ステップを備えることが好ましい。上記構成による光子数測定データに対するフォトンバースト解析法、及びその解析条件の設定法は、蛍光プローブを含む測定試料に対して流れを付与した状態で蛍光測定を行う構成において、特に有効に用いることができる。

フォトンバースト解析の解析条件であるビン幅の具体的な設定方法については、蛍光解析装置は、解析条件設定手段が、光子数測定データでの測定シグナル量Ｓに対して、光子数測定データでの測定ノイズ量Ｎ、及びショットノイズ特性を仮定した場合の基準ノイズ量Ｎ’を求め、測定ＳＮ比Ｓ／Ｎと、基準ＳＮ比Ｓ／Ｎ’とを用いて定義されるビン幅設定用の評価量
ｄＮ／Ｓ＝（Ｎ−Ｎ’）／Ｓ
を参照して、ビン幅を設定することが好ましい。

同様に、蛍光解析方法は、解析条件設定ステップにおいて、光子数測定データでの測定シグナル量Ｓに対して、光子数測定データでの測定ノイズ量Ｎ、及びショットノイズ特性を仮定した場合の基準ノイズ量Ｎ’を求め、測定ＳＮ比Ｓ／Ｎと、基準ＳＮ比Ｓ／Ｎ’とを用いて定義されるビン幅設定用の評価量
ｄＮ／Ｓ＝（Ｎ−Ｎ’）／Ｓ
を参照して、ビン幅を設定することが好ましい。

このように、測定ＳＮ比Ｓ／Ｎと基準ＳＮ比Ｓ／Ｎ’とを比較することによって定義された下記の式（１）の評価量

を用いることにより、光子数測定データに対するビン幅を好適に評価、設定することが可能となる。また、この場合の具体的なビン幅の設定方法の一例としては、評価量ｄＮ／Ｓのビン幅（時間幅）依存性において、評価量ｄＮ／Ｓが最大となる時間幅によってビン幅を設定する方法を用いることができる。

また、上記構成において求められるショットノイズ特性による基準ノイズ量Ｎ’、及び基準ＳＮ比Ｓ／Ｎ’については、蛍光解析装置は、解析条件設定手段が、測定ノイズ量Ｎのビン幅による変化に対して基準ビン幅を設定し、基準ビン幅における測定ノイズ量Ｎを初期値として、基準ノイズ量Ｎ’のビン幅による変化を求めることが好ましい。同様に、蛍光解析方法は、解析条件設定ステップにおいて、測定ノイズ量Ｎのビン幅による変化に対して基準ビン幅を設定し、基準ビン幅における測定ノイズ量Ｎを初期値として、基準ノイズ量Ｎ’のビン幅による変化を求めることが好ましい。

また、フォトンバースト解析のもう１つの解析条件である基準光子数の具体的な設定方法については、蛍光解析装置は、解析条件設定手段が、光子数測定データから蛍光相関分光法によって求められた自己相関関数の波形と、光子数測定データで測定された単位時間当たりの蛍光強度と、設定されたビン幅とによって、そのビン幅における基準光子数を設定することが好ましい。

同様に、蛍光解析方法は、解析条件設定ステップにおいて、光子数測定データから蛍光相関分光法によって求められた自己相関関数の波形と、光子数測定データで測定された単位時間当たりの蛍光強度と、設定されたビン幅とによって、そのビン幅における基準光子数を設定することが好ましい。

このような構成によれば、光子数測定データから求められた自己相関関数Ｇ（τ）の波形によって測定領域内での蛍光プローブの平均分子数を求めるとともに、算出された平均分子数と、測定された単位時間当たりの蛍光強度とを参照することによって、ビニングのビン幅に対する基準光子数を好適に設定することができる。

具体的な設定方法の一例としては、自己相関関数の波形から測定領域内にある蛍光プローブの平均分子数を求めるとともに、その蛍光プローブの平均分子数と、単位時間当たりの蛍光強度とによって単位時間当たりの蛍光プローブ１分子当たりの蛍光強度を求める。そして、求められた単位時間当たりの蛍光プローブ１分子当たりの蛍光強度と、設定されたビン幅とによって、そのビン幅での基準光子数となる蛍光プローブ１分子当たりの平均光子数を設定する方法を用いることができる。

本発明の蛍光解析装置、及び蛍光解析方法によれば、測定試料の蛍光測定で得られた光子数測定データに対して、ビニングのビン幅と、蛍光プローブ１分子に対する基準光子数とを解析条件として設定し、測定領域内での蛍光プローブの個数についてのフォトンバースト解析を行うとともに、ビン幅の設定において、測定ＳＮ比のビン幅依存性と、ショットノイズ特性を仮定した場合の基準ＳＮ比のビン幅依存性とを用いてビン幅を設定することにより、測定試料の蛍光解析が容易化されるとともに、測定試料に対する蛍光測定の感度、及びフォトンバースト解析の解析精度を向上することが可能となる。

以下、図面とともに本発明による蛍光解析装置、及び蛍光解析方法の好適な実施形態について詳細に説明する。なお、図面の説明においては同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。また、図面の寸法比率は、説明のものと必ずしも一致していない。

図１は、本発明による蛍光解析装置の一実施形態の構成を概略的に示す図である。本実施形態による蛍光解析装置１Ａは、測定試料Ｓ中の蛍光プローブについて、測定試料Ｓに対して設定された測定領域内にある蛍光プローブから発生する蛍光を検出して時系列の光子数測定データを取得し、得られた光子数測定データに対して所定の蛍光解析を行うことで測定試料Ｓについての情報を取得するものである。以下においては、測定試料Ｓ中にあって測定対象となる蛍光物質（蛍光物質によって標識された分子等を含む）を「蛍光プローブ」とする。

本蛍光解析装置１Ａによる解析対象の一例としては、図２に示す標的分子（ターゲット物質）Ｔ、及び蛍光プローブＰ１、Ｐ２を含むものが挙げられる。図２の模式図は、生体分子などの標的分子Ｔに対する蛍光プローブＰの特異的結合を利用して標的分子Ｔについての情報を取得するホモジニアス・アッセイの一例を示すものである。

具体的には、図２においては、３個所の認識部位ｔ１〜ｔ３を有する標的分子Ｔを含む試料（図２（ａ））に対し、認識部位ｔ１に特異的に結合する認識部位を有する蛍光標識された分子プローブＰ１、及び認識部位ｔ２に特異的に結合する認識部位を有する蛍光標識された分子プローブＰ２（図２（ｂ））を蛍光プローブとして混合し、図２（ｃ）に示すようにそれらを反応させて、蛍光解析の対象となる測定試料Ｓとする。このような測定試料Ｓに対して、後述するように蛍光プローブの個数についての蛍光解析（フォトンバースト解析）を行うことにより、標的分子Ｔの情報を取得することができる。以下、本実施形態による蛍光解析装置１Ａの構成について、蛍光解析方法とともに説明する。

図１に示す蛍光解析装置１Ａは、試料ホルダ１０と、還流装置１２と、対物レンズ２０と、ダイクロイックミラー２１と、励起光源２２と、反射ミラー２３と、光フィルタ２４と、結像レンズ２５と、ピンホール２６と、光検出器２７とを備えており、これらの各要素が本蛍光解析装置１Ａにおける蛍光顕微鏡部を構成している。また、この蛍光顕微鏡部の各要素に加えて、本蛍光解析装置１Ａは、検出信号処理部３０と、光子計数部３５と、測定制御部５０とを備えて構成されている。

試料ホルダ１０は、蛍光測定及び解析の対象となる蛍光プローブを含む測定試料Ｓを保持する試料保持手段であり、その底面がスライドグラスとして機能する容器状の流路部材によって構成されている。また、本実施形態の蛍光解析装置１Ａでは、流路部材１０内に保持された測定試料Ｓに対して、還流装置１２が設けられている。また、図１に示すように、流路部材１０と還流装置１２との間には、溶液状の測定試料Ｓが流れる循環流路が設けられている。還流装置１２は、このような試料の循環流路において、流路部材１０とともに、試料Ｓの液体試料に対して所定の方向及び流速で流れを付与する流れ付与手段として機能する。

図３は、試料ホルダとして用いられる流路部材１０の構成の一例を示す図であり、図３（ａ）は側面図、図３（ｂ）は底面図を示している。本構成例の流路部材１０は、その上方部分を構成する流路本体１３と、下方部分を構成するカバー部材１８とによって構成されている。流路本体１３は、例えばガラス基板からなり、その上面と下面との間で貫通する導入流路１４、排出流路１５と、導入流路１４及び排出流路１５の間に下方に開放された状態で形成された溝状の主流路１６とを有している。

また、カバー部材１８は、例えばカバーガラスからなり、流路本体１３の溝状の主流路１６を下方から覆うように設けられている。このような構成において、導入流路１４、主流路１６、及び排出流路１５によって、流路部材１０内での試料流路１１が構成されている。また、これらのうちで主流路１６は、試料Ｓの蛍光測定に用いられる測定流路となっている。測定流路１６の構成の一例としては、その幅が１００μｍ、高さが２５μｍの矩形の断面形状を有する流路構造が挙げられる。このような流路構造は非常に小さいため、流路部材１０及び還流装置１２によって流れが付与される測定試料Ｓは、微量の液体試料となる。また、還流装置１２は、測定制御部５０によって駆動制御されている。

測定試料Ｓを保持する流路部材の試料ホルダ１０に対し、所定位置に対物レンズ２０が設置されている。対物レンズ２０としては、例えば水浸（液浸）系の対物レンズを好適に用いることができる。また、このような対物レンズ２０に対し、試料ホルダ１０は、その形状が対物レンズ２０の作動距離に対応するように構成されている。図１に示すように、試料ホルダ１０として流路部材を用いた構成では、対物レンズ２０は流路部材１０内の試料流路１１に対して所定位置に配置される。

図１に示す構成では、対物レンズ２０、ダイクロイックミラー２１、及び励起光源２２によって、測定試料Ｓに対して設定された測定領域に励起光を照射する励起光照射手段が構成されている。また、励起光源２２としては、例えばレーザ光源を好適に用いることができる。励起光源２２から供給された励起レーザ光は、ダイクロイックミラー２１によって反射され、対物レンズ２０を介して集光されつつ、試料ホルダ１０内の測定試料Ｓへとビームスポットとして集光、照射される（励起光照射ステップ）。ここで、励起光源２２の具体的な一例としては、波長４７３ｎｍ、５３２ｎｍ、または６３５ｎｍのレーザ光を供給するレーザ光源を用いることができる。

また、図１に示す構成では、対物レンズ２０、反射ミラー２３、光フィルタ２４、結像レンズ２５、ピンホール２６、及び光検出器２７によって、励起光が照射された測定試料Ｓの測定領域内にある蛍光プローブから発生する蛍光を検出する蛍光検出手段が構成されている。測定試料Ｓの蛍光プローブからの蛍光は対物レンズ２０によって収集され、ダイクロイックミラー２１を透過した後、反射ミラー２３によって光検出器２７に向けて反射される。反射ミラー２３によって光路が変更された蛍光は、光フィルタ２４を通過し、結像レンズ２５によって結像されつつ光検出器２７に入射する。

光フィルタ２４としては、例えば、試料Ｓからの散乱光、迷光等の余分な光成分を除去するための、測定対象の蛍光プローブの蛍光スペクトルに合わせて選択されたバンドパスフィルタを用いることができる。また、結像レンズ２５と光検出器２７との間には、ピンホール２６が設置されている。ピンホール２６は、結像レンズ２５によって集光される蛍光に対して共焦点となる位置に設置されており、焦点外れの光を除去して、試料Ｓ中に形成されたビームスポットの測定領域からの蛍光のみを通過させる構成となっている。

ピンホール２６を通過した蛍光は光検出器２７によって検出され、その検出結果を示す電気信号である検出信号が出力される（蛍光検出ステップ）。以上の励起光照射手段及び蛍光検出手段により、測定試料Ｓにおいて微小な測定領域を設定し、試料Ｓの測定領域に励起光を照射するとともに、測定領域内にある蛍光プローブからの蛍光を検出する共焦点光学系による蛍光顕微鏡が構成されている。光検出器２７の具体的な一例としては、光電子増倍管を用いることができる。

ここで、上記構成の蛍光顕微鏡によって測定試料Ｓ中に設定される測定領域は、例えば１ｆｌ（フェムトリットル）程度の極微小領域である。また、試料Ｓに含まれる蛍光プローブの分子濃度の一例として、その濃度を１ｎＭとすると、測定領域内での蛍光プローブの平均分子数は６・１０^２３×１・１０^−９×１・１０^−１５＝０．６個である。また、図２に例示したようなホモジニアス・アッセイでは、その標的分子の濃度は例えば１ｐＭ程度である。ただし、これらの数値は測定領域等についての設定の一例であり、具体的な設定は個々の場合で異なる。

蛍光検出手段の光検出器２７から出力された検出信号は、検出信号処理部３０へと入力される。検出信号処理部３０は、例えばプリアンプなどの信号増幅回路、及びディスクリミネータ（波高弁別器）などの信号処理回路によって構成され、光検出器２７からのアナログの検出信号に対して所定の信号処理を行って、光検出器２７での個々の単一光子検出イベントを示す検出パルス信号列を生成し出力する。

検出信号処理部３０から出力される検出パルス信号列は、光子計数部３５へと入力される。光子計数部３５は、光検出器２７からの検出信号（検出信号処理部３０で信号処理された検出パルス信号列）に基づいて、蛍光検出手段の光検出器２７で検出された光子数を所定の計数時間幅（時間分解能）で時系列的に計数して、時系列の光子数測定データを生成する光子計数手段である（光子計数ステップ）。このような構成により、測定試料Ｓに対する単一光子計数による蛍光測定が可能となる。

ここで、本蛍光解析装置１Ａにおいては、この光子計数部３５での計数時間幅が、蛍光解析におけるビン幅の初期条件（最小ビン幅）となる。また、光子計数部３５において計数される光子数測定データは、測定試料Ｓからの蛍光による光子検出イベントに加えて、光検出器２７等によるノイズイベント、及びバックグラウンドイベント等を含んでいる。

光子計数部３５としては、具体的には例えば、マルチチャンネルスケーラ（ＭＣＳ）を用いることができる。また、光子計数部３５での計数時間幅となるＭＣＳの計数時間分解能は、例えば２００ｎｓｅｃ（ナノ秒）程度である。

光子計数部３５において生成された時系列の光子数測定データは測定制御部５０に入力され、この測定制御部５０において、測定データに対して蛍光解析が行われる。本実施形態においては、測定制御部５０は、解析条件設定部５１と、測定結果解析部５２とを有しており、光子数測定データに対して測定試料Ｓの測定領域内にある蛍光プローブの個数についての蛍光解析（フォトンバースト解析）を行って、測定試料Ｓについての情報を取得するように構成されている。このような測定制御部５０は、例えば、蛍光解析用のソフトウェアが動作する制御用コンピュータによって構成することができる。

解析条件設定部５１は、光子計数部３５において所定の計数時間幅（初期ビン幅）で取得される時系列の光子数測定データに対して実行すべき蛍光解析について、その解析条件を設定する設定手段である（解析条件設定ステップ）。また、測定結果解析部５２は、解析条件設定部５１によって設定された解析条件に基づき、蛍光プローブを含む測定試料Ｓについての測定結果を示す光子数測定データに対する蛍光解析としてフォトンバースト解析を行う解析手段である（測定結果解析ステップ）。

解析条件設定部５１は、測定データに対する解析条件として、光子数測定データをビニングするためのビン幅（各ビンの時間幅）と、そのビン幅における蛍光プローブ１分子に対する基準光子数とを設定する。ここで、光子数測定データに対するビン時間幅は、好ましくは光子計数部３５での初期ビン幅の整数倍に設定される。この場合、時間的に連続する所定個数の計数データを加算することで、光子数測定データのビニングを容易に行うことができる。また、このビニングのビン幅は、解析部５２で実行される蛍光解析に対応して、フォトンバースト解析を精度良く実行する上で好適な値に設定する必要がある。

具体的には、設定部５１は、光子数測定データでの光子数のＳＮ比である測定ＳＮ比のビン幅による変化と、ショットノイズ特性を仮定した場合の光子数のＳＮ比である基準ＳＮ比のビン幅による変化とを用いてビニングのビン幅を設定する。また、設定部５１は、設定されたビン幅に対し、そのビン幅における蛍光プローブ１分子に対する基準光子数を求める。すなわち、設定されたビン幅でのビニング後の測定データについて、各ビンの計数データに対して蛍光プローブ１分子に相当する光子数を求め、フォトンバースト解析における基準光子数とする。

測定結果解析部５２は、上記のように設定された解析条件に基づき、設定されたビン幅で光子数測定データをビニングして蛍光解析用の測定データを生成し、そのビニング後の測定データに対して基準光子数を適用、参照して、測定試料Ｓの測定領域内にある蛍光プローブの個数についてのフォトンバースト解析を行う。これにより、例えば測定試料Ｓ中にある標的分子の情報など、測定試料Ｓについての情報を取得することができる。

上記実施形態による蛍光解析装置、及び蛍光解析方法の効果について説明する。

図１に示す蛍光解析装置１Ａ、及び蛍光解析方法においては、対物レンズ２０、励起光源２２、及び光検出器２７等を含む励起光照射系及び蛍光検出系によって測定試料Ｓ中に微小な測定領域を設定する。また、その測定領域内にある蛍光プローブ（例えば蛍光プローブを標識している蛍光物質）から発生する蛍光を光検出器２７で検出して、その検出信号から光子計数部３５において時系列の光子数測定データを生成する。

そして、解析条件設定部５１において、測定結果の光子数測定データに対してビニングのビン幅と、蛍光プローブ１分子当たりの測定光子数に対応する基準光子数とを解析条件として設定するとともに、測定結果解析部５２において、それらの解析条件に基づいて、測定領域内での蛍光プローブの個数についての蛍光解析であるフォトンバースト解析を行っている。

このように、測定試料Ｓに対して所定の計数時間幅（初期ビン幅）で取得された光子数測定データを設定されたビン幅でビニングし直し、そのビニング後の測定データに基準光子数を適用してフォトンバースト解析を行うことにより、例えば測定試料Ｓ中での標的分子と蛍光プローブとの反応についての解析など、測定領域内にある蛍光プローブからの蛍光を測定することによる測定試料Ｓの蛍光解析を容易化することが可能となる。

さらに、このような測定試料Ｓの蛍光解析において、光子数測定データに対するビン幅の設定について、測定されたＳＮ比のビン幅依存性に対して、ショットノイズ特性を仮定した場合の基準ＳＮ比のビン幅依存性を求め、それらの関係からビニングのビン幅を設定している。このような構成によれば、フォトンバースト解析で光子数測定データに適用されるビン幅について、測定試料Ｓに対して実際に取得された測定データの特性に合わせて好適に設定することができる。これにより、測定試料Ｓに対する蛍光測定の感度、及びフォトンバースト解析の解析精度を向上することが可能となる。

また、図１の蛍光解析装置１Ａでは、光子計数部３５で取得された時系列の光子数測定データを、解析条件設定部５１及び測定結果解析部５２を含む測定制御部５０に入力し、この測定制御部５０において、上記構成に対応した蛍光解析プログラム等を動作させることによって、測定データに対する蛍光解析を実行する構成としている。これにより、光子数測定データに対するビン幅の設定、変更を含む蛍光解析を、測定データの内容に応じて好適に実行することができる。

また、本実施形態による蛍光解析装置１Ａでは、試料ホルダ１０の流路部材内に保持された測定試料Ｓに対して、測定試料Ｓに流れを付与する流れ付与手段として還流装置１２を設けている。上記構成による光子数測定データに対するフォトンバースト解析法、及びその解析条件の設定法は、蛍光プローブを含む測定試料Ｓに対して還流装置１２等の流れ付与手段によって流れを付与した状態で蛍光測定を行う構成において、特に有効に用いることができる。

すなわち、測定試料Ｓに流れを付与する構成では、蛍光測定の測定感度が向上する一方で、蛍光相関分光法を用いた自己相関関数による並進拡散運動についての解析が困難になるという問題がある。これに対して、上記構成による解析条件の設定、及びフォトンバースト解析法を適用することにより、このような蛍光測定データについても好適に解析を実行することが可能となる。また、試料Ｓに流れを付与する流れ付与手段については、上記のように試料流路１１を有する流路部材１０、及び還流装置１２を用いることで、測定試料Ｓに対して簡易に流れを付与することができる。

図１に示した蛍光解析装置１Ａ、及び解析装置１Ａにおいて実行される蛍光解析方法について、さらに具体的に説明する。

まず、流路部材１０及び還流装置１２による測定試料Ｓに対する流れの付与について説明する。上述したように、測定試料Ｓに流れを付与する構成では、試料Ｓ中において分子が並進拡散運動に加えて流れによる移動運動をする。これにより、測定試料Ｓ中で設定された微小な測定領域に対する分子の通過頻度を高めることができ、試料Ｓに対する測定感度を向上することが可能となる。

図４は、光子数測定データに対して蛍光相関分光法を適用して得られた自己相関関数を示すグラフである。このグラフは、蛍光プローブ濃度が４．５×１０^−１１Ｍの測定試料Ｓに対して６０秒間の蛍光測定を行うとともに、その測定結果の光子数測定データに対して蛍光相関分光法による解析を行って得られた自己相関関数Ｇ（τ）を示している。

この図４のグラフにおいて、横軸は自己相関関数を算出する際の時間遅れのパラメータに対応する時間τ（ｓｅｃ）を示し、縦軸は規格化された自己相関関数を示している。また、グラフＡ１は、試料Ｓに対する流れの付与を行わなかった場合（フローなし）の自己相関関数を示し、グラフＡ２は、流れを付与した場合（フローあり）の自己相関関数を示している。

グラフＡ１は、試料Ｓに対する流れの付与なしの状態における、試料Ｓ中での蛍光プローブの並進拡散運動を示している。また、流れの付与を行ったグラフＡ２では、測定試料Ｓ中で、並進拡散運動を上回る移動速度で規則的な流れが発生し、それが自己相関関数において観測されている。また、試料Ｓの流速を制御することで、グラフＡ１、Ａ２の中間となる波形を得ることができ、この場合、並進拡散運動及び試料Ｓの流れによる移動運動の両者の効果が自己相関関数において観測される。

これらのグラフＡ１、Ａ２からわかるように、フローありのグラフＡ２では、フローなしのグラフＡ１に比べて、蛍光プローブの移動速度が１桁程度大きくなっている。これにより、上記したように試料Ｓでの測定領域に対する分子の通過頻度を高め、その測定感度を向上することができる。

また、蛍光プローブの蛍光色素分子の励起状態については、上記のように蛍光プローブの移動速度を向上させた場合、測定領域の通過時間が短くなることにより、蛍光プローブに対する励起光照射による励起時間が短くなる。このため、フローなしの条件では三重項状態への遷移が頻繁に確認されるものでも、フローありとすることによってその頻度が減少し、１分子当たりに対する蛍光強度を好適に測定することが可能となる。

このように、還流装置１２を用いた流れの付与によって試料Ｓでの測定領域に対する蛍光プローブの通過頻度を高めた場合、試料Ｓ中での蛍光プローブの濃度は変化しないために測定領域内での平均滞在プローブ数は変動せず、測定領域に対する蛍光プローブの出入りの速さが変化する。これに対して、上記構成の蛍光解析装置１Ａでは、蛍光プローブの移動速度に応じて光子数測定データのビニングのビン幅を設定して、精度良くフォトンバースト解析を行うことができる。このような構成では、試料Ｓに対する流れの付与のあり・なし、及び流れの付与ありの場合の流速などの測定条件に応じて、最適な解析条件を設定して蛍光解析を行うことが可能である。

ここで、蛍光相関分光法によって求められる自己相関関数Ｇ（τ）について、簡単に説明しておく。自己相関関数Ｇ（τ）は、時系列の光子数測定データをＦ（ｔ）として、下記の式（２）

によって求めることができる。また、自己相関関数の算出においては、上記の式（２）において、自己相関関数を求める際の時間遅れτを測定データＦ（ｔ）の時間分解能の整数倍、図１に示した構成では光子計数部３５での計測時間幅（初期ビン幅）の整数倍に設定すれば、単純に時系列の光子数測定データＦ（ｔ）でのビン間の積によって、自己相関関数Ｇ（τ）を求めることができる。

また、時間遅れτ＝０の場合の自己相関関数Ｇ（τ＝０）については、自分自身のビンの積であるために、光検出器２７のノイズの影響等を無視することができない。したがって、このＧ（０）を求める場合には、τ＞０の範囲でのＧ（τ）の波形から推定することが好ましい。また、Ｇ（０）の推定においては、τ＝０の近傍では光検出器２７のアフターパルスによる固定ノイズの重畳等の問題が発生する可能性があるので、Ｇ（τ）の波形全体を取り扱って波形解析を行うことが好ましい。

一般に、蛍光相関分光法において１成分系の波形解析では、自己相関関数Ｇ（τ）は、下記の式（３）

によって求められる。この式（３）によれば、時間遅れτ＝０のときに、Ｇ（τ）のｙ切片について
Ｇ（τ＝０）＝１／ｎ
の関係が得られる。

ここで、上記の式（３）において、ｎは測定試料Ｓの測定領域内における蛍光プローブの平均分子数を示し、また、τ_Ｄは拡散時定数、ｒ_０、ｚ_０は構造パラメータ（ストラクチャパラメータ）をそれぞれ示している。これらの変数は、式（２）によって算出された自己相関関数Ｇ（τ）に対して、フィッティング計算による波形解析を行うことによって求めることができる。また、このとき、上記したＧ（τ）のｙ切片により、測定試料Ｓ中での蛍光プローブの濃度を示す平均分子数ｎが求められる。このようにして得られる平均分子数ｎは、後述するように、フォトンバースト解析に用いられる基準光子数の設定において参照することができる。

上記した自己相関関数Ｇ（τ）について詳述すると、自己相関関数Ｇ（τ）は、光子数測定データＦ（ｔ）に対し、下記の式（４）

によって定義される。ここで、δＦ（ｔ）は蛍光ゆらぎを示すものであり、

によって定義される。

このδＦ（ｔ）を用い、また、蛍光ゆらぎδＦ（ｔ）と平均蛍光強度＜Ｆ＞との積の和が０に収束すると仮定すると、上記した式（２）の右辺は下記のように変形できる。

すなわち、この式（６）に示すように、上記仮定のもとでは、自己相関関数Ｇ（τ）の定義式（４）は、式（２）のように表すことができる。また、自己相関関数の波形解析に用いられる式（３）は、定義式（４）に対してレーザ光強度分布式、拡散方程式などを用いてパラメータを導入して式を解くことで得られるものである。

なお、自己相関関数の式（３）に関しては、三重項状態に遷移する過程をも含めると式はさらに複雑化し、また、多成分系、フロー系などの因子が増えていった場合、そのパラメータを正確に決定することが困難となる。一方、１成分系の解析では、同一の試料Ｓを測定する場合、拡散時定数τ_Ｄを固定することができる。また、構造パラメータは、測定領域が再現性良く構築できているかを示すため、共焦点光学系と、蛍光プローブとが標準状態であることを確認する上でも有効である。

蛍光プローブを含む測定試料Ｓに対して流れを付与する流れ付与手段については、図１に示した実施形態では流路部材１０及び還流装置１２を用いて構成された液体試料の循環流路を例示したが、具体的には、このような構成以外にも様々な構成の流れ付与手段を用いて良い。

次に、光子数測定データに対するフォトンバースト解析の解析条件であるビン幅の設定方法について説明する。

光子数測定データに対してフォトンバースト解析を行う際の解析条件であるビニングのビン幅の具体的な設定方法については、解析条件設定部５１において、光子数測定データでの測定シグナル量Ｓに対して、光子数測定データでの測定ノイズ量Ｎ、及びショットノイズ特性を仮定した場合の基準ノイズ量Ｎ’を求め、測定ＳＮ比Ｓ／Ｎと、基準ＳＮ比Ｓ／Ｎ’とを用いて定義される式（１）のビン幅設定用の評価量ｄＮ／Ｓ

を参照して、ビン幅を設定することが好ましい。

このように、測定ＳＮ比Ｓ／Ｎと、基準ＳＮ比Ｓ／Ｎ’とを比較することで得られる評価量ｄＮ／Ｓを用いることにより、光子数測定データに対するビン幅を好適に評価、設定することが可能となる。また、この場合の具体的なビン幅の設定方法の一例としては、評価量ｄＮ／Ｓのビン幅（時間幅）依存性において、評価量ｄＮ／Ｓが最大となる時間幅によってビン幅を設定することが好ましい。

上記した評価量ｄＮ／Ｓ、及びそれを用いたビン幅の設定について具体的に説明する。図５は、光子数測定データにおけるＳＮ比のビン幅依存性を示すグラフである。この図５のグラフにおいて、横軸は光子数測定データをビニングする際のビン時間幅（ｓｅｃ）を示し、縦軸はそれぞれのビン幅に対して得られたＳＮ比Ｓ／Ｎを示している。また、グラフＢ１は、フローなしの場合の測定ＳＮ比を示し、グラフＢ２は、フローありの場合の測定ＳＮ比を示している。

ここで、光子数測定データにおけるＳＮ比の算出において、シグナル量Ｓについては、光子計数部３５によって所定の測定時間（例えば６０秒間）で記録された光子数のビン時間幅当たりの平均値を測定シグナル量Ｓとしている。また、ノイズ量Ｎについては、ビン時間幅に対する光子数のばらつき度合、すなわち測定光子数の標準偏差を測定ノイズ量Ｎとしている。これらの測定シグナル量Ｓ及び測定ノイズ量Ｎにより、測定ＳＮ比Ｓ／Ｎを求めることができる。

図５における測定ＳＮ比のグラフＢ１、Ｂ２において、ビン幅が１μｓｅｃ程度と小さい場合には、ＳＮ比は蛍光プローブの運動速度等の影響をほとんど受けず、発光現象そのもののＳＮ比を示す。このとき、測定時間内の各ビンでの光子数は、ショットノイズ特性と同様のポアソン分布を示し、ビン時間幅をｗ_ｔとすると、光子数の平均値である測定シグナル量Ｓは、時間幅ｗ_ｔに比例して増加する。また、光子数の標準偏差である測定ノイズ量Ｎは、ポアソン分布の特性から時間幅の平方根√ｗ_ｔに比例する。

したがって、測定ＳＮ比のビン幅依存性において、ビン時間幅が小さくショットノイズ特性と同様の特性を示す領域では、測定ＳＮ比Ｓ／Ｎはビン時間幅ｗ_ｔの平方根√ｗ_ｔに比例する。また、このようにショットノイズ特性が成り立つ領域では、ビン幅が２桁大きくなると、Ｓ／Ｎ比は１桁向上する。

一方、光子数測定データのビン幅を大きくしていくと、各ビンで計数される光子数、及びそのＳＮ比は、測定試料Ｓ内での蛍光プローブの運動速度、及びそれによる測定領域に対する蛍光プローブの出入りの影響を受け、それが光子数測定データにおける蛍光ゆらぎとして観測される。このとき、測定ＳＮ比のビン幅依存性は、蛍光ゆらぎによってショットノイズ特性から外れることとなる。したがって、蛍光ゆらぎによるＳＮ比のショットノイズ特性からの外れ度合を評価することにより、蛍光プローブの移動運動についての情報を取得するために好適なビン時間幅ｗ_ｔを評価することができる。

その具体的な方法としては、例えば、測定シグナル量Ｓに対し、光子数測定データで実際に測定されたノイズ量Ｎに加えて、ショットノイズ特性を仮定した場合のノイズ量を基準ノイズ量Ｎ’として求める。そして、測定ノイズ量ＮによるＳＮ比Ｓ／Ｎが、基準ノイズ量Ｎ’によるＳＮ比Ｓ／Ｎ’からどれくらい外れているかを評価することにより、光子数測定データの蛍光解析において適用すべきビン時間幅を好適に設定することができる。また、この場合のショットノイズ特性からのＳＮ比のずれの評価においては、上記した式（１）の評価量ｄＮ／Ｓを好適に用いることができる。

ここで、測定ノイズ量Ｎに対する基準ノイズ量Ｎ’の算出においては、光子数測定データで得られている測定ノイズ量Ｎのビン幅による変化に対して基準ビン幅を設定し、その基準ビン幅における測定ノイズ量Ｎを初期値として、ショットノイズ特性による基準ノイズ量Ｎ’のビン幅による変化を求めることが好ましい。図６は、このような方法で求められた測定ＳＮ比及び基準ＳＮ比のビン幅依存性を示すグラフである。

この解析例では、ビン時間幅が小さい領域で測定ＳＮ比がショットノイズ特性と同様の特性を示すことを考慮して、最小ビン幅（例えば、光子計数部３５で光子数を計数する際の初期ビン幅）を基準ビン幅としている。そして、最小ビン幅での光子数測定データから得られる光子数の標準偏差である測定ノイズ量Ｎを初期値とし、ショットノイズ特性においてノイズ量が√ｗ_ｔに比例することを利用して基準ノイズ量Ｎ’のビン幅依存性を求めている。

図６においては、このようにして求められたノイズ量について、測定シグナル量Ｓ及び測定ノイズ量Ｎによって算出されるＳＮ比Ｓ／ＮのグラフＣ１、及び基準ノイズ量Ｎ’によって算出されるＳＮ比Ｓ／Ｎ’のグラフＣ０を示している。これらのグラフＣ０、Ｃ１により、ビン時間幅ｗ_ｔが大きくなるにつれて、測定ＳＮ比Ｓ／Ｎがショットノイズ特性による基準ＳＮ比Ｓ／Ｎ’から外れていくことがわかる。

図６に示した測定ＳＮ比Ｓ／Ｎ、及び基準ＳＮ比Ｓ／Ｎ’を用いることにより、上記したビン幅設定用の評価量ｄＮ／Ｓ＝（Ｎ−Ｎ’）／Ｓを求めることができる。図７は、ビン幅設定用の評価量ｄＮ／Ｓのビン幅依存性を示すグラフである。この図７のグラフにおいて、横軸は光子数測定データをビニングする際のビン時間幅（ｓｅｃ）を示し、縦軸はそれぞれのビン幅に対して得られた評価量ｄＮ／Ｓを示している。また、グラフＤ１は、フローなしの場合のｄＮ／Ｓを示し、グラフＤ２は、フローありの場合のｄＮ／Ｓを示している。

このような評価量ｄＮ／Ｓのビン幅依存性を参照することにより、光子数測定データに対してフォトンバースト解析を行う際に好適なビン時間幅を設定することができる。すなわち、ｄＮ／Ｓのビン幅による変化において、測定ＳＮ比がショットノイズ特性と同様の特性を示している領域では、上記した評価量ｄＮ／Ｓの値は小さくなる。一方、測定試料Ｓ中での蛍光プローブの移動運動による蛍光ゆらぎの影響が大きい領域では、ｄＮ／Ｓの値は大きくなる。また、このようにｄＮ／Ｓの値が大きくなることは、そのビン幅を適用した光子数測定データにおいて、蛍光プローブに対する測定感度が高くなっていることを示している。

光子数測定データの蛍光解析におけるビニングのビン幅の設定においては、このような評価量ｄＮ／Ｓの特性を考慮し、評価量ｄＮ／Ｓ＝（Ｎ−Ｎ’）／Ｓが最大となる時間幅によってビン幅を設定することが好ましい。このような設定方法では、図７に示す例において、フローなしの場合、グラフＤ１を参照して、光子数測定データに対するビニングのビン幅はｗ_ｔ＝０．７３ｍｓｅｃに設定される。また、フローありの場合、グラフＤ２を参照して、ビン幅はｗ_ｔ＝０．１０ｍｓｅｃに設定される。

あるいは、評価量ｄＮ／Ｓを用いたビン幅の具体的な設定方法については、上記のようにｄＮ／Ｓが最大となる時間幅によってビニングのビン幅を設定する方法に限らず、具体的には様々な構成を用いることが可能である。そのような構成としては、例えばｄＮ／Ｓが最大となるピーク位置から所定割合以上、例えば７０％以上のｄＮ／Ｓ値を有する範囲を設定し、その範囲内で選択した時間幅によってビン幅を設定する構成等を用いることができる。

次に、光子数測定データに対するフォトンバースト解析の解析条件である基準光子数の設定方法について説明する。

光子数測定データに対してフォトンバースト解析を行う際の解析条件である蛍光プローブ１分子に対する基準光子数については、解析条件設定部５１において、光子数測定データ、及び解析条件として設定されたビン幅から蛍光プローブ１分子当たりの平均光子数を求め、得られた平均光子数を基準光子数とすることが好ましい。

また、光子数測定データからの平均光子数の算出においては、光子数測定データに対して蛍光相関分光法を適用して得られる自己相関関数を利用し、測定データから蛍光相関分光法によって求められた自己相関関数の波形と、測定データで測定された単位時間当たりの蛍光強度と、設定されたビン幅とによって、そのビン幅における基準光子数となる蛍光プローブ１分子当たりの平均光子数を設定することが好ましい。この場合、光子数測定データから求められた自己相関関数Ｇ（τ）の波形によって測定領域内での蛍光プローブの平均分子数を求めるとともに、算出された平均分子数と、測定された単位時間当たりの蛍光強度とを参照して、ビン幅に対する基準光子数を好適に設定することができる。

このような設定方法の一例としては、自己相関関数Ｇ（τ）の波形から測定領域内にある蛍光プローブの平均分子数を求めるとともに、その蛍光プローブの平均分子数と、単位時間当たりの蛍光強度とによって、単位時間当たりの蛍光プローブ１分子当たりの蛍光強度を求める。そして、求められた単位時間当たりの蛍光プローブ１分子当たりの蛍光強度と、設定されたビン幅とによって、そのビン幅での基準光子数となる蛍光プローブ１分子当たりの平均光子数を設定する方法を用いることができる。

基準光子数の設定の具体例について説明する。まず、光子数測定データから図４に示した自己相関関数Ｇ（τ）を求める。ここで、上述したように、測定試料Ｓの測定領域内における蛍光プローブの平均分子数をｎとすると、Ｇ（τ＝０）＝１／ｎが成り立つ。したがって、自己相関関数Ｇ（τ）に対して波形解析を行って、そのｙ切片を求めることにより、蛍光プローブの平均分子数ｎを求めることができる。また、この平均分子数は測定試料Ｓのフローのあり・なりによって変化することはないので、実際の蛍光測定条件にかかわらず、例えばフローなしでの光子数測定データから平均分子数ｎを求めれば良い。

次に、実際の蛍光測定条件で得られた光子数測定データから、単位時間当たりの平均蛍光強度を求める。そして、得られた平均分子数ｎ及び平均蛍光強度から、蛍光プローブ１分子当たりの蛍光強度（ＦＰＭ：Fluorescence Intensity Per Molecule）が算出され、さらに、このＦＰＭの値と、設定されたビン時間幅とによって、そのビン幅での基準光子数となる蛍光プローブ１分子当たりの平均光子数が求められる。

例えば、図４に示した測定例では、フローなしの測定（グラフＡ１）での平均蛍光強度は２．７３ｋｃｐｓであり、また蛍光相関分光法を適用して求められた測定領域内における蛍光プローブの平均分子数はｎ＝０．１５個であった。また、実際の蛍光測定条件をフローあり（グラフＡ２）とすると、その条件での蛍光強度は５．２４ｋｃｐｓであった。このとき、バックグラウンドが３００ｃｐｓであることを考慮して、蛍光プローブ１分子当たりの蛍光強度がＦＰＭ＝３２．９ｋｃｐｓと求められる。

また、この蛍光測定条件での光子数測定データに対して、図７のグラフＤ２を参照して測定データのビニングのビン幅を０．１ｍｓｅｃに設定すると、このビン幅における蛍光プローブ１分子当たりの平均光子数は３．２９カウントとなる。すなわち、光子数測定データにおいてビン幅を０．１ｍｓｅｃに設定すると、測定試料Ｓ中で蛍光プローブ１分子が測定領域内に入った場合、平均で３．２９カウントの光子計数値が得られる。

したがって、この平均光子数３．２９カウントを基準光子数として、光子数測定データをビニングして得られたデータにおける各ビンでの光子数を解析することにより、測定領域内にある蛍光プローブの個数についてのフォトンバースト解析を実行することが可能となる。例えば上記の例では、ビン幅０．１ｍｓｅｃでビニングされた光子数測定データにおいて、ビンの光子数（計数されたイベント数）が３〜４カウントであれば、測定領域内に蛍光プローブが１分子存在すると推定できる。また、ビンの光子数が６〜７カウントであれば、測定領域内に蛍光プローブが２分子存在すると推定できる。また、蛍光プローブが３分子以上存在する場合についても、同様の方法で推定が可能である。

例えば、図２に示した分子系を測定対象として蛍光解析を行った場合、上記方法でフォトンバースト解析を行うことにより、標的分子Ｔについての定量的な測定が可能となる。また、標的分子に対して２種類の異なる蛍光プローブが関与する場合でも、それぞれを同一の蛍光色素で標識し、それらの蛍光プローブを等量として上記方法で蛍光解析を行うことにより、標的分子の定量が可能である。

このような方法は３種類以上の異なる蛍光プローブが関与する場合も同様に適用可能である。このように蛍光プローブ数が多い場合には、フォトンバースト解析による標的分子の識別精度が高くなる。また、例えば上記のように、測定領域内における蛍光プローブの平均分子数が０．１５個と小さい場合には、標的分子と反応していないフリーの蛍光プローブが偶然２個以上、測定領域に入ってくる確率は低い。したがって、蛍光プローブに対してフォトンバースト解析を行って２個以上の蛍光プローブの計数イベントを識別することにより、標的分子の情報を確実に取得することができる。また、上記方法は、異なる蛍光色素で標識された複数種類の蛍光プローブが関与する場合にも適用が可能である。

蛍光プローブ１分子に対して設定される基準光子数を用いた光子数測定データの解析方法については、具体的には様々な方法を用いて良い。そのような方法の一例として、例えば、基準光子数に基づいて測定データに対して光子数の閾値を設定し、その閾値を適用して標的分子によるイベントを識別する方法を用いることができる。あるいは、光子数測定データでの各ビンの光子数を基準光子数で規格化し、得られた規格化光子数データを参照して測定領域内での蛍光プローブの個数、及びその時間変化を評価する方法を用いることができる。

次に、図１に示した蛍光解析装置１Ａにおいて実行される蛍光解析方法について、その具体例とともにさらに説明する。図８〜図１５は、本発明による蛍光解析方法の一例を示すフローチャートである。

図８は、光子数測定データの取得方法の一例を示すフローチャートである。図８に示す測定方法は、例えば解析条件設定用の測定データを取得する際に用いられる。この方法では、まず、蛍光測定に用いる蛍光標識された分子プローブを、測定試料Ｓとして試料ホルダ１０に入れる（ステップＳ１０１）。そして、この測定試料Ｓに対して、図１に示した蛍光解析装置１Ａにおいてフローなしの条件で測定を行い、光子計数部３５によって光子数測定データを取得する（Ｓ１０２）。取得された測定データは測定制御部５０に入力され、データ格納部のメモリ等に保存される（Ｓ１０３）。

次に、フローありの条件で蛍光測定を行うかどうかが確認される（Ｓ１０４）。測定を行う必要がある場合には、還流装置１２によって試料Ｓに流れを付与し（Ｓ１０５）、フローありの状態で蛍光測定（Ｓ１０６）、及び測定データの取得、保存（Ｓ１０７）を行う。なお、この蛍光解析方法では、蛍光測定の際に励起光源２２から供給される励起光の強度について、全ての測定で励起光強度を同一とすることが好ましい。また、光検出器２７による蛍光の検出については、光検出器２７が飽和しないように最高計数値以下となる条件で測定を行うことが好ましい。

続いて、測定制御部５０の解析条件設定部５１において、取得された光子数測定データを用い、測定データに対してフォトンバースト解析を行うために必要な解析条件が設定される（Ｓ１０８）。ここでの解析条件の設定は、フローなしの蛍光測定のみが行われている場合には、その測定データを用いて行われる。また、フローなし・ありでそれぞれ蛍光測定が行われている場合には、それら両者の測定データを用いて解析条件の設定が行われる。また、解析条件の設定が不要であれば、このステップＳ１０８は行う必要はない。

図９は、図８のステップＳ１０８で行われる解析条件設定方法の一例を示すフローチャートである。この方法では、まず、解析条件設定用に取得された光子数測定データに対して、分子数についての解析を行って、測定試料Ｓの測定領域内における蛍光プローブの平均分子数ｎを求める（Ｓ１２１）。次に、ビン幅についての解析を行って、蛍光解析に用いるビニングのビン幅を設定する（Ｓ１２２）。

さらに、ステップＳ１２１で求められた平均分子数ｎ、及び測定データでの平均蛍光強度から、蛍光プローブ１分子当たりの蛍光強度（ＦＰＭ）を算出し（Ｓ１２３）、このＦＰＭの値と、ステップＳ１２２で設定されたビン幅とによって、そのビン時間幅での基準光子数となる蛍光プローブ１分子当たりの平均光子数を求める。これにより、光子数測定データに対するフォトンバースト解析の解析条件のビン幅及び基準光子数が設定され（Ｓ１２４）、設定された解析条件を保存して（Ｓ１２５）、解析条件の設定を終了する。

図９の解析条件設定方法に示すステップＳ１２１の分子数解析（蛍光プローブの濃度解析）は、例えば図１０に示す手順で実行することができる。

図１０の解析例では、まず、フローなしの条件で取得された光子数測定データをデータ格納部から読み込み（Ｓ１３１）、その時系列の測定データに蛍光相関分光法を適用して自己相関関数Ｇ（τ）を導出する（Ｓ１３２）。そして、単成分のフィッティング計算などによって自己相関関数の波形解析を行って（Ｓ１３３）、そのｙ切片のＧ（τ＝０）を算出する（Ｓ１３４）。このＧ（０）の値の逆数により、上述したように、測定試料Ｓの測定領域内における蛍光プローブの平均分子数ｎを導出することができる（Ｓ１３５）。

また、図９の解析条件設定方法に示すステップＳ１２２のビン幅解析（測定データの時間分解能についての解析）は、例えば図１１に示す手順で実行することができる。

図１１の解析例では、まず、試料解析において実際に適用される蛍光測定条件に応じてフローなし、またはフローありの条件で取得された光子数測定データを読み込むとともに（Ｓ１４１）、ビン幅の解析処理のための処理条件を読み込む（Ｓ１４２）。この場合の処理条件としては、例えば、図７に示した評価量ｄＮ／Ｓを用いてビン幅解析を行う場合に、解析を実行するビン時間幅の範囲（例えば初期ビン幅から１秒程度まで）、及びその解析間隔、解析点数などの条件がある。このような処理条件は、例えば解析を実行するビン時間幅のテーブルとして用意しても良い。

次に、光子数測定データに対して、測定ＳＮ比についてのデータ処理を実行する（Ｓ１４３）。この測定データ処理は、図６のグラフＣ１に示す測定ＳＮ比Ｓ／Ｎのビン幅による変化を導出する処理である。図１２は、測定データ処理の一例を示すフローチャートである。

図１２に示す測定データ処理では、まず、最初に測定ＳＮ比の導出を行うビン幅（例えば最小ビン幅である光子数測定データの初期的なビン幅）を設定する（Ｓ１５１）。そして、そのビン幅について、必要に応じて時系列の測定データに対してビニングを行う（Ｓ１５２）。さらに、得られたデータから測定シグナル量Ｓとなる測定光子数の平均値、及び測定ノイズ量Ｎとなる標準偏差を算出して（Ｓ１５３）、それらの値からそのビン幅での測定ＳＮ比Ｓ／Ｎを導出する（Ｓ１５４）。

測定ＳＮ比Ｓ／Ｎを導出したら、測定データ処理に必要な全てのビン幅についてＳＮ比の導出を終了したかどうかが確認され（Ｓ１５５）、終了していなければ、ビン幅を変更して（Ｓ１５６）、測定ＳＮ比Ｓ／Ｎの導出処理を繰り返す。全てのＳＮ比の導出を終了していれば、測定データ処理を終了する。具体的に、例えば最小ビン幅２００ｎｓに対してビン幅１μｓで解析を行う場合、連続するビンを５個ずつ積算することで光子数測定データをビニングし、得られたビニング後の測定データから測定ＳＮ比が求められる。

図１１に戻って、測定データ処理が終了したら、さらに、光子数測定データに対して、基準ＳＮ比についてのデータ処理を実行する（Ｓ１４４）。この基準データ処理は、図６のグラフＣ０に示す基準ＳＮ比Ｓ／Ｎ’のビン幅による変化を導出する処理である。図１３は、基準データ処理の一例を示すフローチャートである。

図１３に示す基準データ処理では、まず、光子数測定データに対して基準ＳＮ比の初期値を決めるための基準ビン幅（例えば最小ビン幅）が設定され、その基準ビン幅における測定シグナル量Ｓとなる測定光子数の平均値、及び測定ノイズ量Ｎとなる標準偏差を算出して（Ｓ１６１）、それらの値から基準ＳＮ比Ｓ／Ｎ’の初期値となる基準ビン幅でのＳＮ比Ｓ／Ｎを導出する（Ｓ１６２）。さらに、続いて基準ＳＮ比の導出を行うビン幅を設定し（Ｓ１６３）、そのビン幅について、ショットノイズ特性による基準ＳＮ比Ｓ／Ｎ’を、上記初期値に基づいて導出する（Ｓ１６４）。

基準ＳＮ比Ｓ／Ｎ’を導出したら、基準データ処理に必要な全てのビン幅についてＳＮ比の導出を終了したかどうかが確認され（Ｓ１６５）、終了していなければ、ビン幅を変更して（Ｓ１６６）、基準ＳＮ比Ｓ／Ｎ’の導出処理を繰り返す。全てのＳＮ比の導出を終了していれば、基準データ処理を終了する。具体的に、例えば基準ビン幅２００ｎｓに対してビン幅１μｓで解析を行う場合、ビン幅が５倍となっているため、５の平方根を初期値に積算することで基準ＳＮ比が求められる。

図１１に戻って、測定データ処理、及び基準データ処理が終了したら、求められた測定ＳＮ比Ｓ／Ｎ、及び基準ＳＮ比Ｓ／Ｎ’を用いて差分計算を行って、ビン幅設定用の評価量ｄＮ／Ｓ＝（Ｎ−Ｎ’）／Ｓを算出する（Ｓ１４５）。そして、この評価量ｄＮ／Ｓのビン幅による変化（図７参照）に基づいて、フォトンバースト解析に用いるビン幅を決定する（Ｓ１４６）。

図１４は、光子数測定データの取得方法の他の例を示すフローチャートである。図１４に示す測定方法は、例えば標的分子及び蛍光プローブを含む測定試料Ｓについて蛍光解析を行うための測定データを取得する際に用いられる。この方法では、まず、解析対象となる標的分子を含む解析対象試料を試料ホルダ１０に入れ（Ｓ２０１）、さらに蛍光プローブを混合して標的分子と反応させて、測定試料Ｓを準備する（Ｓ２０２）。

次に、フローありの条件で蛍光測定を行うかどうかが確認される（Ｓ２０３）。試料Ｓに対する流れの付与ありの条件で測定を行う場合には、還流装置１２によって試料Ｓに流れを付与し（Ｓ２０４）、その状態で蛍光測定を行って光子数測定データを取得する（Ｓ２０５）。一方、フローなしの条件で測定を行う場合には、還流装置１２を動作させない状態で蛍光測定を行って光子数測定データを取得する（Ｓ２０６）。

取得された光子数測定データは測定制御部５０に入力され、データ格納部に保存される（Ｓ２０７）。さらに、得られた光子数測定データについての蛍光解析を続けて実行する必要がある場合には、測定制御部５０の測定結果解析部５２において、先に解析条件設定部５１によって設定された解析条件に基づいて蛍光解析が行われる（Ｓ２０８）。

図１５は、図１４のステップＳ２０８で行われる測定結果解析方法の一例を示すフローチャートである。この方法では、まず、解析対象となる光子数測定データを読み込むとともに（Ｓ２２１）、フォトンバースト解析のために設定された解析条件を読み込む（Ｓ２２２）。次に、解析条件設定部５１で解析条件として設定されたビン幅を参照し、そのビン幅で光子数測定データに対してビニング処理を行い（Ｓ２２３）、さらに、ビニング後の測定データに基準光子数を適用して、フォトンバースト解析を行う（Ｓ２２４）。

このフォトンバースト解析について、例えば基準光子数に基づいてイベント識別の閾値を設定して解析を行う場合を例として説明すると、ビニング後の光子数データの各ビンでの計数値に対して閾値を適用し、測定光子数が閾値を超えている場合をバースト条件に適合した１イベントとして識別して、そのイベント数をカウントする。

続いて、この測定データが校正用のものかどうかが確認される（Ｓ２２５）。そして、校正用の測定データであった場合には、フォトンバースト解析の結果から校正曲線（蛍光解析において用いられる検量線）が作成される（Ｓ２２６）。ここで、校正用の蛍光測定は、解析対象の標的分子の濃度等の値が既知の試料を測定試料Ｓとし、濃度が異なる複数の試料Ｓに対して蛍光測定及び解析を行う。そして、標的分子の濃度値と、フォトンバースト解析で得られたイベント数とを関連付けることで、標的分子の量を見積もるための検量線となる校正曲線が作成される。

また、測定データが標的分子の濃度が未知であって解析対象となる試料Ｓに対するものであった場合には、作成済の校正曲線と、フォトンバースト解析で得られたイベント数とによって、その試料Ｓでの蛍光プローブの反応量、あるいは標的分子の濃度などの必要な数値を算出する（Ｓ２２７）。なお、上記した校正曲線の作成においては、フォトンバースト解析での閾値を可変とし、最適な校正曲線が得られるように解析条件の閾値を調整、設定する構成としても良い。

本発明による蛍光解析装置、及び蛍光解析方法は、上記実施形態及び構成例に限られるものではなく、様々な変形が可能である。例えば、蛍光測定に用いられる蛍光顕微鏡等の装置構成については、図１はその一例を示すものであり、具体的には様々な構成を用いて良い。また、試料Ｓに対する流れの付与については、上記実施形態はフローの方向を限定するものではなく、どの方向性においても上記構成を適用することができる。

また、測定対象となる試料Ｓについては、図２に示す標的分子及び蛍光プローブを混合した試料に限られるものではなく、一般にフォトンバースト解析を適用可能のものであれば、蛍光物質を含む様々な測定試料に対して上記構成を適用可能である。また、上記構成の蛍光解析装置は、低ランニングコストを実現可能なことから、多数の検査を低額で行う必要がある臨床診断分野や食品検査分野、あるいはさらに創薬等で大量の処理を必要とするスクリーニング分野など、様々な分野に適用することが可能である。

本発明は、測定領域内にある蛍光プローブからの蛍光を測定することによる測定試料の蛍光解析を容易化することが可能な蛍光解析装置、及び蛍光解析方法として利用可能である。

蛍光解析装置の一実施形態の構成を示す図である。 蛍光解析装置による解析対象の一例を示す図である。 試料ホルダとして用いられる流路部材の構成の一例を示す図である。 光子数測定データに対して得られた自己相関関数を示すグラフである。 光子数測定データにおけるＳＮ比のビン幅依存性を示すグラフである。 測定ＳＮ比及び基準ＳＮ比のビン幅依存性を示すグラフである。 ビン幅設定用の評価量ｄＮ／Ｓのビン幅依存性を示すグラフである。 光子数測定データの取得方法の一例を示すフローチャートである。 解析条件設定方法の一例を示すフローチャートである。 分子数解析の一例を示すフローチャートである。 ビン幅解析の一例を示すフローチャートである。 測定データ処理の一例を示すフローチャートである。 基準データ処理の一例を示すフローチャートである。 光子数測定データの取得方法の他の例を示すフローチャートである。 測定結果解析方法の一例を示すフローチャートである。

符号の説明

１Ａ…蛍光解析装置、Ｓ…測定試料（液体試料）、１０…試料ホルダ（流路部材）、１１…試料流路、１２…還流装置、１３…流路本体、１４…導入流路、１５…排出流路、１６…主流路（測定流路）、１８…カバー部材、２０…対物レンズ、２１…ダイクロイックミラー、２２…励起光源、２３…反射ミラー、２４…光フィルタ、２５…結像レンズ、２６…ピンホール、２７…光検出器、３０…検出信号処理部、３５…光子計数部、５０…測定制御部、５１…解析条件設定部、５２…測定結果解析部。

Claims (12)

1. 測定試料に対して設定された測定領域に励起光を照射する励起光照射手段と、
   前記励起光照射手段によって前記励起光が照射された前記測定試料の前記測定領域内にある蛍光プローブから発生する蛍光を検出する蛍光検出手段と、
   前記蛍光検出手段から出力される検出信号に基づいて、前記蛍光検出手段で検出された光子数を所定の計数時間幅で時系列的に計数する光子計数手段と、
   前記光子計数手段によって取得される時系列の光子数測定データに対する蛍光解析について、その解析条件を設定する解析条件設定手段と、
   前記解析条件設定手段によって設定された前記解析条件に基づいて、前記蛍光プローブを含む前記測定試料についての測定結果を示す前記光子数測定データに対して蛍光解析を行う測定結果解析手段とを備え、
   前記解析条件設定手段は、前記解析条件として、前記光子数測定データをビニングするビン幅と、そのビン幅における蛍光プローブ１分子に対する基準光子数とを設定し、
   前記測定結果解析手段は、前記解析条件設定手段によって設定された前記ビン幅で前記光子数測定データをビニングし、前記基準光子数を参照して前記測定試料の前記測定領域内にある前記蛍光プローブの個数についての蛍光解析を行うとともに、
   前記解析条件設定手段は、前記光子数測定データでの光子数のＳＮ比である測定ＳＮ比のビン幅による変化と、ショットノイズ特性を仮定した場合の光子数のＳＮ比である基準ＳＮ比のビン幅による変化とを用いて、前記ビン幅を設定することを特徴とする蛍光解析装置。
2. 前記解析条件設定手段は、前記光子数測定データでの測定シグナル量Ｓに対して、前記光子数測定データでの測定ノイズ量Ｎ、及びショットノイズ特性を仮定した場合の基準ノイズ量Ｎ’を求め、前記測定ＳＮ比Ｓ／Ｎと、前記基準ＳＮ比Ｓ／Ｎ’とを用いて定義されるビン幅設定用の評価量
   ｄＮ／Ｓ＝（Ｎ−Ｎ’）／Ｓ
   を参照して、前記ビン幅を設定することを特徴とする請求項１記載の蛍光解析装置。
3. 前記解析条件設定手段は、前記評価量ｄＮ／Ｓが最大となる時間幅によって前記ビン幅を設定することを特徴とする請求項２記載の蛍光解析装置。
4. 前記解析条件設定手段は、前記測定ノイズ量Ｎのビン幅による変化に対して基準ビン幅を設定し、前記基準ビン幅における測定ノイズ量Ｎを初期値として、基準ノイズ量Ｎ’のビン幅による変化を求めることを特徴とする請求項２または３記載の蛍光解析装置。
5. 前記解析条件設定手段は、前記光子数測定データから蛍光相関分光法によって求められた自己相関関数の波形と、前記光子数測定データで測定された単位時間当たりの蛍光強度と、前記ビン幅とによって、そのビン幅における前記基準光子数を設定することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項記載の蛍光解析装置。
6. 前記蛍光プローブを含む前記測定試料に対して流れを付与する流れ付与手段を備えることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項記載の蛍光解析装置。
7. 測定試料に対して設定された測定領域に励起光を照射する励起光照射ステップと、
   前記励起光照射ステップで前記励起光が照射された前記測定試料の前記測定領域内にある蛍光プローブから発生する蛍光を検出する蛍光検出ステップと、
   前記蛍光検出ステップで取得される検出信号に基づいて、前記蛍光検出ステップで検出された光子数を所定の計数時間幅で時系列的に計数する光子計数ステップと、
   前記光子計数ステップで取得される時系列の光子数測定データに対する蛍光解析について、その解析条件を設定する解析条件設定ステップと、
   前記解析条件設定ステップで設定された前記解析条件に基づいて、前記蛍光プローブを含む前記測定試料についての測定結果を示す前記光子数測定データに対して蛍光解析を行う測定結果解析ステップとを備え、
   前記解析条件設定ステップは、前記解析条件として、前記光子数測定データをビニングするビン幅と、そのビン幅における蛍光プローブ１分子に対する基準光子数とを設定し、
   前記測定結果解析ステップは、前記解析条件設定ステップで設定された前記ビン幅で前記光子数測定データをビニングし、前記基準光子数を参照して前記測定試料の前記測定領域内にある前記蛍光プローブの個数についての蛍光解析を行うとともに、
   前記解析条件設定ステップにおいて、前記光子数測定データでの光子数のＳＮ比である測定ＳＮ比のビン幅による変化と、ショットノイズ特性を仮定した場合の光子数のＳＮ比である基準ＳＮ比のビン幅による変化とを用いて、前記ビン幅を設定することを特徴とする蛍光解析方法。
8. 前記解析条件設定ステップにおいて、前記光子数測定データでの測定シグナル量Ｓに対して、前記光子数測定データでの測定ノイズ量Ｎ、及びショットノイズ特性を仮定した場合の基準ノイズ量Ｎ’を求め、前記測定ＳＮ比Ｓ／Ｎと、前記基準ＳＮ比Ｓ／Ｎ’とを用いて定義されるビン幅設定用の評価量
   ｄＮ／Ｓ＝（Ｎ−Ｎ’）／Ｓ
   を参照して、前記ビン幅を設定することを特徴とする請求項７記載の蛍光解析方法。
9. 前記解析条件設定ステップにおいて、前記評価量ｄＮ／Ｓが最大となる時間幅によって前記ビン幅を設定することを特徴とする請求項８記載の蛍光解析方法。
10. 前記解析条件設定ステップにおいて、前記測定ノイズ量Ｎのビン幅による変化に対して基準ビン幅を設定し、前記基準ビン幅における測定ノイズ量Ｎを初期値として、基準ノイズ量Ｎ’のビン幅による変化を求めることを特徴とする請求項８または９記載の蛍光解析方法。
11. 前記解析条件設定ステップにおいて、前記光子数測定データから蛍光相関分光法によって求められた自己相関関数の波形と、前記光子数測定データで測定された単位時間当たりの蛍光強度と、前記ビン幅とによって、そのビン幅における前記基準光子数を設定することを特徴とする請求項７〜１０のいずれか一項記載の蛍光解析方法。
12. 前記蛍光プローブを含む前記測定試料に対して流れを付与する流れ付与ステップを備えることを特徴とする請求項７〜１１のいずれか一項記載の蛍光解析方法。

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