JP5011012B2 - 核酸抽出装置 - Google Patents

Description

本発明は、核酸を含有する試料から核酸を抽出するための核酸抽出装置に関する。

遺伝情報を担う物質である核酸の分析は、学術研究や医療等の多岐の分野で実施されている。核酸の分析方法としては、主にＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）等の核酸増幅技術を利用されることが多い。

ＰＣＲとは核酸を塩基配列特異的に増幅する方法であり、極微量の目的遺伝子の検出や定量が可能である。ＰＣＲ等の核酸分析においては生物試料等から抽出した核酸を用いるが、この核酸抽出では分析反応に対する阻害物質、例えば、分析結果に擬陽性をもたらすような外部環境に由来する核酸等を含むコンタミネーション物質の影響を排除する必要がある。

生物試料等から核酸を抽出する方法としては、フェノールやクロロホルム等の毒劇物を使用し、エタノール沈殿等の操作を行う従来方法があるが、近年では、非特許文献１に記載されるようなカオトロピック物質の存在下でシリカ含有核酸結合性固相等に核酸が結合する性質を利用する方法や、特許文献１に記載されているようなカオトロピック物質と水溶性有機溶媒の存在下でアセチルセルロース等の有機高分子に核酸が結合する性質を利用する方法がより一般的となっている。

特許文献１に記載された方法は、アセチルセルロース等の有機高分子を核酸結合用の部材として備える抽出カートリッジに核酸を含有する溶液を投入し、加圧によって核酸結合用部材を通して溶液を排出し、核酸を核酸結合用部材に結合させる方法である。この方法においては、溶液全量が排出された直後の抽出カラム内部の圧力変化を解析し、圧力開放弁を作動させて抽出カラム内部の加圧エアを放出することにより、残留加圧エアによるミスト状の排出液飛散を抑止してコンタミネーション発生リスクを軽減させている。

また、特許文献２には、抽出カラムからの排出液を仕切りのある空間に吐出することで、複数個設置した抽出カラムからの排出液によるコンタミネーションの発生を防止している。

特開２００５−２０４５７８号公報 特開２００６−１９７８５１号公報 J.Clin.Microbiol.,28(3),495-503 (1990)

ところで、核酸抽出装置においては、抽出カラム内の溶液は、理想的には、全工程で全て排出されていることが望ましい。

しかしながら、抽出カラム内の溶液を全量排出させる場合、抽出カラム内に液体が残っているうちは液体が連続した状態で排出されているが、残量が少なくなると気体と液体の混合状態での排出となり、最終的には霧状ミストとなる。

ミストは空気中を浮遊し、抽出カラムの外周側面に付着し、抽出カラムを移動させる際にこのカラムより離れ、他の抽出カラムや容器、試薬ボトル等に付着し、コンタミネーションを発生させる可能性がある。

核酸抽出処理装置は小型化の傾向にあり、各々の検体を処理する位置が近接する、または同時に複数検体の処理を行なうなど、コンタミネーション発生のリスクは高まりつつある。

また、抽出処理された核酸は後の工程で増幅処理をされる場合があり、その場合は更にリスクが増大する。例えば、前述のＰＣＲの増幅技術を用いた場合、３０サイクルで１０億倍程度に増幅することが可能であり、核酸含有試料から発生するわずかなミストの飛散が非常に大きな影響を与えることになる。

従来技術においては、核酸含有ミストの飛散をある程度抑制することが可能であるが、外部への飛散を確実に防止することは困難である。

本発明の目的は、溶液排出時のコンタミネーションの要因となるミストの飛散を防止することが可能な核酸抽出方法及び装置を実現することである。

上記課題を解決するため、本発明は次のように構成される。

核酸結合性固相を有する抽出カラムに供給された液体を加圧して上記核酸結合性固相を通して上記抽出カラムから排出し、核酸含有液体試料から目的の核酸を抽出する核酸抽出方法において、抽出カラムの液体排出口に、上記抽出カラムから排出された液体を収容する液体収容タンクを接続し、抽出カラムに供給された液体を加圧して上記核酸結合性固相を通して上記抽出カラムから排出し、上記液体収容タンク内の気体と共に浮遊する液体成分を捕捉し、上記気体と共に浮遊する液体成分を除去した後に、上記気体を上記液体収容タンク外に送気する。

本発明により、溶液排出時のコンタミネーションの要因となるミストの飛散を防止することが可能な核酸抽出方法及び装置を実現することができる。

以下、本発明の実施形態について添付図面を参照して説明する。

なお、以下に説明する実施形態は、本発明による核酸抽出装置を核酸精製用装置に適用した場合の例である。

図１は本発明の第１の実施形態における溶液排出流路の概略構成図、図２は本発明の第１の実施形態における抽出カラムの概略構成図、図３は本発明が適用される核酸精製用装置の概略構成平面図、図４は核酸精製用装置の動作系のブロックダイヤグラム、図５は本発明の第１の実施形態における動作フローチャートである。

図１において、本発明の第１の実施形態における溶液排出流路は密閉流路となっている。この密閉流路は、抽出カラム保持ブロック３７と、液受けタンク５４と、開閉バルブ５３と、保護フィルタ５１と、吸引ファン５２とにより形成される。

抽出カラム保持ブロック３７は、抽出カラム３５を設置する台座であり、液受けタンク５４と接続されている。抽出カラム３５は抽出カラム保持ブロック３７に設けられた筒状の連通穴に収まるように設置されている。抽出カラム３５は、溶液排出時には、図４に示す加圧ポンプ１０を連通させるために下方向に押し下げられた加圧ノズル１２及びシール部材３６を介して抽出カラム保持ブロック３７と密着し、排液流路が隙間無く接続される。

排液受けタンク５４は、抽出カラム保持ブロック３７の下方に位置し、抽出カラム３５の排出開口部３２より排出された液体を一時的に保持する機能を持つ。排液受けタンク５４の材質は排出される液体による侵食、変形、溶解等の影響がないものが望ましい。例えば金属であればステンレスや、樹脂であればPP（ポリプロピレン）である。

また、開閉バルブ５３は、排液受けタンク５４の下部に位置し、排液受けタンク５４内に一時的に保持された排出液の排出液回収ボトル（図示せず）への排出を制御する機能を有する。開閉バルブ５３は、電磁弁、ピンチコック等、任意に流路の開閉ができるもので、かつ、排液受けタンク５４と同様に液体による機能低下が無い材質、例えばテフロン（登録商標）で形成されていることが望ましい。

保護フィルタ５１は密閉流路内にあり、後述する吸引手段よりも流路の上流側に設置されている。この保護フィルタ５１は、密閉流路内に発生したミストを捕捉し、抽出カラム３５より排出されたミストが密閉流路外に飛散するのを防ぐ機能を有する。なお、保護フィルタ５１に要求される性能は、例えば粒径が０．３μmの粒子に対して９９．９７％以上の粒子捕集率を有するＨＥＰＡフィルタ相当以上のものが望ましい。

吸引ファン５２は、密閉流路内の気体を吸引し、保護フィルタ５１へ気体を誘導する機能を有する。吸引ファン５２は保護フィルタ５１による圧力損失での吸引効率低下を防ぐため、より吸引力、もしくは風量の大きなものが望ましい。例えばシロッコファンである。

次に、本発明の第１の実施形態における抽出カラム３５内から液体を排出する動作について説明する。ここでは、本発明を第２洗浄液の排出工程に適用した場合について説明する。なお、抽出カラム３５は抽出カラム保持ブロック３７上に設置されており、既に第２洗浄液が分注されているものとする。

抽出カラム３５内の第２洗浄液を排出するため、加圧ポンプ１０（後述する図４に示す）と接続された加圧ノズル１２を抽出カラム３５上に下降させる。加圧ノズル１２の先端には抽出カラム３５と加圧ノズル１２との接続を確実なものとするためのシール部材３６が取り付けてある。シール部材３６は弾力性のある樹脂であり、例えばシリコンゴムである。

加圧ノズル１２と抽出カラム３５とを接触させた後、更に一定量加圧ノズル１２を下降させ、シール部材３６を圧縮させつつ密着させる。次に、吸引ファン５２を動作させる。この吸引ファン５２の動作により、密閉流路内の気体は吸引ファン５２の方向へ流動する。この時、気体は密閉流路の内壁に沿って流動する。本発明の第１の実施形態では密閉流路中に仕切り板５５が設けられている。この仕切り板５５は、吸引ファン５２と対向するように配置され、抽出カラム３５から排出された気体が、液受けタンク５４の底部方向に流れた後に、吸引ファン５２の方向に流動するように形成される。

つまり、仕切り板５５の設置により、図１に気体の流れ９９として示すように、密閉流路内の気体は抽出カラム３５の排出開口部３２から、ほぼ垂直下方に流動した後、方向を変えて吸引ファン５２の方向に流動する。

なお、保護フィルタ５１を介して吸引ファン５２へ向かう気体の流動が、垂直方向において一度、吸引ファン５２の位置よりも低い位置を通過することで、抽出カラム３５より排出される溶液が排出開口部３２の鉛直下降方向に流動が実現できれば、仕切り板５５は必ずしも設ける必要はない。

このような気体の流れが形成された後、加圧ポンプ１０を動作させ、抽出カラム３５内を加圧する。この結果、抽出カラム３５内の内部圧力が上昇し、第２洗浄液を排出する。第２洗浄液の排出開始直後の排出液は、抽出カラム３５の排出開口部３２から連続して排出され、自重で液受けタンク５４の下部に到達する。

これに対して、抽出カラム３５内の内容液量が僅かとなると、排出液中に気体が巻き込まれ、液滴状となり、最終的には霧状となる。霧状となった溶液は吸引ファン５２によって作られた気体の流れの中心となり、気流に包まれるようにして吸引ファン５２の方向へ流動される。そして、溶液を含むミストは保護フィルタ５１によって捕捉されるため、密閉流路外部に排出されることは無い。

抽出カラム３５内の溶液の密閉流路内への排出が終了すると、加圧ポンプ１０の動作が停止されると共に、吸引ファン５２の動作を停止し、所定時間後、密閉流路の洗浄液を排出容器内に排出する。

以上のように、抽出カラム３５からの排出液を一旦収容する液受けタンクを、核酸抽出に使用される送気ユニットとして構成することにより、コンタミネーションの原因となる溶液を含むミスト（気体と共に浮遊する液体成分）の密閉流路外への飛散を防止することが出来る。

図２は、本発明の第１の実施形態における抽出カラム３５の一例を示す図である。この図２に示した例は、核酸結合性固相を備える抽出カラムである。

図２において、抽出カラム３５は、核酸含有液体試料、洗浄液、溶出液等の溶液を投入する開口部３０、加圧機構を接続する接続部３１、溶液を排出する為の排出開口部３２が形成された配管部３８を備え、配管３８内部に核酸結合性固相３３を保持部材３４により固定化したものである。

核酸結合性固相３３としては、例えば、ガラス、シリカ、ケイソウ土等、或いは、アセチルセルロース等を含有する固相であり、連続する複数の通液孔を有して通液可能であり、通液の際に溶液との十分な接触効率を得られるように、微細且つ緊密なフィルタ状の構造であるものが使用できる。

保持部材３４は、核酸結合性固相３３の形状や設置位置を維持することができ、且つ、連続する複数の通液孔を有し通液可能である部材が使用でき、例えばプリプロピレン粒子の焼結体等が使用できる。

図２に示す抽出カラム３５において、抽出カラム３５の内部容量を２ｍｌ、抽出カラム３５の材質をポリプロピレン、核酸結合性固相３３を平均粒子保持径０．７μmのガラス繊維濾紙、保持部材３４を平均粒子保持径約１００マイクロμｍのポリプロピレン粒子焼結体としたものを使用する。

抽出カラム３５の核酸結合性固相３３の通液孔は、微細且つ緊密な構造であり、試料と結合液の混合液のような粘性の大きい溶液に対しては通液抵抗が大きく、通液処理を効率的に行う為には大きな圧力を印加する必要がある。しかし、大きな圧力の印加により溶液を通液させた場合は、溶液全量を排出する直後の残圧が大きく、ミスト状や液滴状の排出液の飛散が発生し得るため、コンタミネーション発生リスクを排除することが必要となる。

次に、図３を用いて核酸の精製用装置１００の概略構成を説明する。図３において、核酸の精製用装置１００は、水平方向（Ｘ方向）に移動可能な２本のアーム１６、１７を具備する。一方のアーム１６には、抽出カラム３５内の液体を加圧する加圧ノズル１２を保持する加圧ノズルホルダ１８がアーム１６の長さ方向に沿って水平方向（Ｙ方向）に移動可能に取り付けられている。

他方のアーム１７には、分注ノズル（図示せず）を保持するノズルホルダ１９がアーム１７の長さ方向に沿って水平方向（Ｙ方向）に移動可能に取り付けられている。

加圧ノズル１２、分注ノズルは、対応するアーム１６、１７に対し、いずれも上下方向（Ｚ方向）に動作できる。アーム１６の水平移動領域とアーム１７の水平移動領域とは、部分的にオーバーラップするので、各アームの取り付け高さ位置を違えてある。

本体架台上の作業面５には、未使用の多数の分注用チップ４２を載置したチップラック４１が所定エリアにセットされる。これらのチップラック４１は、各分注用チップ４２を挿入し上下方向に保持し得る穴を有しており、分注用チップ４２の先端が作業面５又はチップラック４１底面に接触しないような高さを持った箱形をなしている。チップラック４１は最大２５本までの分注用チップ４２を保持できる。

作業面５には、さらに処理ブロック６１が配置されており、処理ブロック６１上には未使用の処理容器２１を事前に設置しておく。処理対象となる検体、すなわち核酸を含有する試料を収容した検体容器２０が複数本ずつ保持される検体ラック１４が所定エリアにセットされる。この例では、検体ラック１４は５本の検体容器２０を保持できる。

また、作業面５には、未使用の精製品用容器２８を複数個保持した精製品容器ラック２７が所定エリアにセットされる。この精製品用容器２８は、精製処理がなされた核酸含有液を試料別に回収するものである。この例では、容器ラック２７は、５本の精製品用容器２８を保持できる。

作業面５には、試薬分注ノズルに接続された分注用チップ４２を試薬分注ノズルから取り外すためのチップ外し器６５が配置される。作業面５上の所定位置には、核酸結合性固相３３への核酸の結合を促進する結合促進物質の溶液を収容した結合試薬ボトル２３、抽出カラム３５内の固相３３を洗浄するための洗浄液を収容した第１洗浄液ボトル２４、第２洗浄液ボトル２５、固相３３に結合された核酸を溶出させるための溶出液を収容した溶出液ボトル２６がセットされる。

抽出カラム３５を加圧する加圧ポンプ１０と、検体、結合試薬、第１洗浄液、第２洗浄液、溶解液を吸引、分注するシリンジポンプ１１（図４に示す）は、それぞれ、アーム１６、１７上の加圧ノズル１２、試薬分注ノズルに取り付けられており、加圧ポンプ１０は抽出カラム３５内の溶液の排出と、シリンジポンプ１１（図４に示す）は各溶液の吸入動作と排出動作を行なう。

試薬分注ノズルへの分注用チップ４２の装着は、チップラック４１上において、試薬分注ノズルを降下して分注用チップ４２をノズルの先端に嵌合することにより達成される。また、試薬分注ノズルに接続された分注用チップ４２を試薬分注ノズルから取り外す場合は、チップ外し器６５を利用する。試薬分注ノズルより取り外された分注用チップ４２は、チップ廃棄口に落下し回収箱（図示せず）内に回収される。なお、６２は廃液ユニット、６３は溶離ユニット、６４は抽出カラムハンドラー、６７及び６８は待機位置である。

次に、核酸の精製用装置１００の電気系構成について図４を参照して説明する。図４において、動作制御部としてのＰＣ８０には、操作条件及び検体情報を入力するための操作パネルとしてのキーボード８１、入力情報や警告情報等を表示するための表示装置としてのＣＲＴ８２、装置の各機構部を制御する機構制御部８３等が接続される。

機構制御部８３は、加圧ポンプ１０に吸排動作を行わせるためのピストン駆動用のステッピングモータ７１、シリンジポンプ１１に吸排動作を行わせるためのプランジャ駆動用のステッピングモータ７２、加圧ノズルホルダ１８を水平移動及び上下動させるためのステッピングモータ７３、分注ノズルホルダ１９を水平移動及び上下動させるためのステッピングモータ７４、アーム１６を水平移動させるためのステッピングモータ７５、アーム１７を水平移動させるためのステッピングモータ７６、抽出カラムハンドラー６３を動作させるためのステッピングモータ７７の動作を制御する。また、機構制御部８３は、開閉弁５３、吸引ファン５２の動作を制御する。核酸精製用装置１００の各部は、所定のプログラムに従って動作される。

次に、本発明の第１の実施形態による密閉流路を用いた核酸抽出装置での一連の抽出工程について説明する。図５は、核酸抽出工程の動作フローチャートである。

核酸の抽出方法は、（１）核酸含有試料に結合試薬を添加した混合液を抽出カラムに投入し、抽出カラム内部を加圧して混合液を核酸結合性固相内部を通して排出する結合工程と、（２）第一洗浄液を抽出カラムに投入し、抽出カラム内部を加圧して洗浄液を核酸結合性固相内部を通して排出する第１洗浄工程と、（３）第２洗浄液を抽出カラムに投入し、抽出カラム内部を加圧して洗浄液を核酸結合性固相内部を通して排出する第２浄工程と、（４）溶出液を抽出カラムに投入し、抽出カラム内部を加圧して洗浄液を核酸結合性固相内部を通して排出し、核酸溶液を得る溶出工程とを備える。

なお、核酸含有試料としては、例えば、全血、血漿、血清、尿、大便、唾液、喀痰、精液等の体液、動植物の組織や細胞、微生物、細菌、ウイルス等、及びそれらの懸濁物、或いは溶解物が使用できる。

また、結合試薬としては、核酸含有試料中の核酸を遊離化し、且つ核酸と核酸結合性固相の結合を促進し得るものであり、各種のカオトロピック塩が使用できる。カオトロピック塩としては、チオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジン、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、過塩素酸ナトリウム等を使用できる。また、核酸の遊離化を促進する為に界面活性剤やタンパク質分解酵素等が使用できる。

界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤が好ましく、ポリオキシエチレン（10）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノラウレート等が使用できる。また、核酸含有試料に内在、或いは外部環境に由来する核酸分解酵素を不活性化する為に、2-メルカプトエタノールやジチオトレイトール等の還元剤やエチレンジアミン四酢酸塩等の金属キレート剤が使用できる。また、核酸の遊離化を促進するために、加温、攪拌、ホモジナイズ、超音波等の処理を併用することができる。また、核酸と核酸結合性固相の結合を促進する為に有機溶媒を使用できる。

有機溶媒としては水溶性有機溶媒が好ましく、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、アセトン、ジエチレングリコールジメチルエーテル、乳酸エチル等が使用できる。

次に、核酸抽出装置を用いた核酸の抽出工程を詳細に説明する。核酸含有試料を検体容器２０に入れて検体ラック１４に保持させ、装置１００上の検体設置位置に設置する。分注チップ４２を有するチップラック４１、各ボトル２３、２４、２５、２６、処理容器２１、及び精製品用容器２８を、それぞれ所定の場所にセットした後、精製用装置１００による核酸抽出操作を開始する。

まず、待機位置６７に位置していたアーム１７とノズルホルダ１９とを動作させ、分注ノズルをチップラック４１上へ移動し、第１番目の分注用チップ４２を分注ノズルに嵌合する。次いで、取り付けた分注用チップ４２を検体ラック１４上へ移動し、目的とする検体容器２０へ降下し、シリンジポンプ１１に吸引動作させることにより分注用チップ４２内に所定量の核酸含有試料を吸引する。

次に、分注用チップ４２を検体容器２０内から上昇させ、分注用チップ４２の先端に少量の空気を引入し、次いで、分注ノズルを処理ブロック６１上の第１番目の処理容器２１まで移動する。そして、分注用チップ４２を検体容器２０内に降下し、シリンジポンプ１１の吐出動作により処理容器２１内に所定量の検体を吐出する。

その後、分注ノズルをチップ外し器６５まで移動させ、分注用チップ４２を分注ノズルより取り外す。取外された分注チップ４２はチップ外し器６５の下方に位置する使用済みチップ回収箱（図示せず）内に自然落下し、回収される。

次に、ノズルホルダ１９を動作させ、分注ノズルをチップラック４１上へ移動し、第２番目の分注用チップ４２を分注ノズルに嵌合する。次いで、取り付けた分注用チップ４２を結合試薬ボトル２３上へ移動し、このボトル２３内へ降下し、シリンジポンプ１１に吸引動作させることにより、分注用チップ４２内に所定量の結合試薬を吸引する。

次に、分注用チップ４２を結合試薬ボトル２３内から上昇させ、分注用チップ４２の先端に少量の空気を引入し、次いで、分注ノズルを処理ブロック６１上の第１番目の処理容器２１まで移動し、分注用チップ４２を処理容器２１内に降下し、シリンジポンプ１１の吐出動作により所定量の結合試薬を吐出する。

結合試薬の吐出後に、再び、既に処理容器２１内に吐出されている結合試薬および核酸含有試料の全量を同じ分注用チップ４２内への吸入し、さらに、吐出して、この吸引吐出動作を繰り返し行う。これにより、核酸含有試料と結合試薬とを混合する。その後、処理容器２１内の溶液全量を分注用チップ４２内に吸引する。

分注チップ４２内への混合溶液の吸引後、分注用チップ４２の先端に少量の空気を引き込んだ後、排液ユニット６２上の第１番目の抽出カラム３５の位置へ移動する。その後、分注用チップ４２の先端を抽出カラム３５内まで下降させ、分注用チップ４２の混合液全量を吐出する。吐出終了後、分注ノズルをチップ外し器６５の位置まで移動し、分注用チップ４２を廃棄する。

次に、アーム１６に取り付けられた加圧ノズル１２を前工程までの溶液を吐出された抽出カラム３５上まで移動させる。その後、加圧ノズル３５を下降させ、下降ノズル３５の先端に取り付けられているシール部材３６を介して抽出カラム３５に密着させる。

次に、加圧ポンプ１０を動作させ、抽出カラム３５内の溶液を排出させる。抽出カラム３５から排出された混合液は、一旦、液受けタンク５４内に納められる。液受けタンク５４の下部には開閉弁５３を介して排出液回収ボトル（図示せず）が接続されており、抽出カラム３５を通して排出された溶液は、開閉弁５３を開状態とすることで、全て排出液回収ボトルに回収される。

抽出カラム３５内の結合試薬と検体の混合液を排出後、加圧ノズルを上昇させ、一旦待機位置６８に移動させる。

以上の動作が図５のステップ１００〜１０４の動作に対応する。

次に、図５のステップ１０５〜１０８の動作を説明する。
待機位置に位置していたアーム１７とノズルホルダ１９とを動作させ、分注ノズルをチップラック４１上へ移動し、第３番目の分注用チップを分注ノズル１３に嵌合する。次いで、取り付けた分注用チップ４２を第１洗浄液ボトル２４上へ移動し、ボトル２４内へ降下し、シリンジポンプ１１に吸引動作させることにより、分注用チップ４２内に所定量の第１洗浄試薬を吸引する。

第１洗浄液としては、核酸と核酸結合性固相の結合を維持して、タンパク質等の非特異的な結合物を除去し得るものであり、結合液において用いることができるカオトロピック塩、界面活性剤、還元剤、金属キレート剤、有機溶媒等を含む溶液が使用できる。

次に、分注用チップ４２を第１洗浄試薬ボトル２３内から上昇させ、分注用チップ４２の先端に少量の空気を引入し、次いで、分注ノズルを抽出カラム３５上まで移動し、分注用チップ４２を抽出カラム３５内に降下させ、シリンジポンプ１１の吐出動作により所定量の第１洗浄試薬を排出する。その後、分注ノズルをチップ外し器６５まで移動させ、分注用チップ４２を分注ノズルより取り外す。

次に、アーム１７に取り付けられた加圧ノズル１２を前工程までの溶液が吐出された抽出カラム３５上まで移動させる。その後、加圧ノズル１２を下降させ、加圧ノズル１２の先端に取り付けられているシール部材３６を介して抽出カラム３５に密着させる。次に、加圧ポンプ１０を動作させ、抽出カラム３５内の第１洗浄液を排出させる。抽出カラム３５から排出された第１洗浄液は、一旦、液受けタンク５４内に納められた後、開閉弁５３を開状態として全て排出液回収ボトル５６に回収される。抽出カラム３５内の第１洗浄液を排出後、加圧ノズル１２を上昇させ、一旦待機位置６８に移動させる。

以上の動作が図５のステップ１０５〜１０８の動作に対応する。

次に、図５のステップ１０９〜１１７の動作を説明する。

待機位置に位置していたアーム１７とノズルホルダ１９を動作させ、分注ノズルをチップラック４１上へ移動し、第４番目の分注用チップ４２を分注ノズルに嵌合する。次いで、取り付けた分注用チップ４２を第２洗浄液ボトル２５上へ移動し、このボトル２５内へ降下し、シリンジポンプ１１に吸引動作させることにより、分注用チップ４２内に所定量の第２洗浄試薬を吸引する。

次に、分注用チップ４２を第２洗浄試薬ボトル２５内から上昇させ、分注用チップ４２の先端に少量の空気を引入し、次いで、分注ノズルを抽出カラム３５上まで移動し、分注用チップ４２を抽出カラム３５内に降下させる。そして、シリンジポンプ１１の吐出動作により所定量の第２洗浄試薬を抽出カラム３５に排出する。

第２洗浄液としては、核酸と核酸結合性固相３３との結合を維持して、第１洗浄液で除去しきれなかった非特異的な結合物と第１洗浄液の残留成分を除去し、且つ、次工程の溶出液に持ち越されて後段の分析反応を阻害しない水準まで除去可能なものであり、エタノールやアセトン等の揮発性を有する有機溶媒等を含有する溶液が使用できる。

次に、分注ノズルをチップ外し器６５まで移動させ、分注用チップ４２を分注ノズルから取り外す。

次に、アーム１６に取り付けられた加圧ノズル１２を前工程までの溶液が吐出された抽出カラム３５上まで移動させる。その後、加圧ノズル１２を下降させ、加圧ノズル１２先端に取り付けられているシール部材３６を介して抽出カラム３５に密着させる。次に、吸引ファン５２を動作させ、抽出カラム３５の排出開口部３２付近の気体を吸引ファン５２の方向へ吸引し、流動させる。

次に、加圧ポンプ１０を動作させ、抽出カラム３５内の溶液及び第２洗浄液を排出する。

その後、加圧ノズル１２を僅かに上昇させ、加圧ポンプ１０を加圧開始位置まで移動させる。次に、再び加圧ノズル１２を下降させ、抽出カラム３５に密着させる。次に、加圧ポンプ１０を動作させ、抽出カラム３５内の溶液の排出動作を繰り返す。

排出動作を指定回数（例えば１０回）繰り返した後、加圧ノズル１２を上昇させ、一旦、待機位置６８に移動させる。排出動作完了後、吸引ファン５２を停止させ、気体の流動を停止する。気体の流動が停止するまで待ち時間を置いた後、開閉弁５３を開状態とし、廃液受けタンク５４内の液体を排出し、開閉弁５３を閉とする。

以上の動作が図５のステップ１０９〜１１７の動作に対応する。

次に、図５のステップ１１８〜１２３の動作を説明する。

抽出カラムハンドラー６４にて抽出カラム３５を排液ユニット６２から溶出ユニット６３へ移動させる。次に待機位置に位置していたアーム１７とノズルホルダ１９を動作させ、分注ノズルをチップラック４１上へ移動し、第５番目の分注用チップ４２を分注ノズルに嵌合する。次いで、取り付けた分注用チップ４２を溶出液ボトル２６上へ移動し、このボトル２６内へ降下し、シリンジポンプ１１に吸引動作させることにより、分注用チップ４２内に所定量の溶出液を吸引する。

次に、分注用チップ４２を溶出液ボトル２５内から上昇させ、分注用チップ４２の先端に少量の空気を引入する。次いで、分注ノズルを抽出カラム３５上まで移動し、分注用チップ４２を抽出カラム３５内に降下させ、シリンジポンプ１１の吐出動作により所定量の溶出液を吐出する。溶出液としては、核酸を核酸結合性固相３３から溶出し、且つ、後段の分析反応を阻害する成分を含有しないものであり、核酸分解酵素を含有しない純水、或いは低塩濃度緩衝液等が使用できる。

次に、分注ノズルをチップ外し器６５まで移動させ、分注用チップ４２を分注ノズルより取り外す。そして、アーム１６に取り付けられた加圧ノズル１２を前工程までの溶液を吐出された抽出カラム３５上まで移動させる。その後、加圧ノズル１２を下降させ、シール部材３６を介して抽出カラム３５に密着させる。

次に、加圧ポンプ１０を動作させ、抽出カラム３５内の溶液を排出させる。排出された溶液は溶出ユニット６２下部のある精製品容器ラック２７上の精製品容器２８内に排出される。設置された抽出カラム３５内の溶液排出後、加圧ノズル１２を上昇させ、一旦、待機位置６８に移動した後、停止する。

以上の動作により１検体分の核酸抽出作業が終了する。

本発明の第１の実施形態においては、抽出カラム３５内の核酸含有溶液等を密閉流路内に排出しながら、核酸含有溶液等のミストを含んだ気体を、ミストを捕捉する保護フィルタ５１を介して外部に放出し、抽出カラム３５内の核酸含有溶液等の排出終了後、密閉流路内の核酸含有溶液等を回収するように構成している。

したがって、本発明の第１の実施形態によれば、溶液排出時のコンタミネーションの要因となるミストの飛散を防止することが可能な核酸抽出方法及び装置を実現することができる。

なお、上述した例では、１つの検体を処理する場合について説明したが、複数検体を同時に処理することも可能である。図３に示した核酸精製用装置１００の場合、最大５検体分まで同時に設置が可能である。この場合、検体分注、結合試薬、第１洗浄試薬、第２洗浄試薬、溶出試薬の分注は検体毎に分注作業を繰返し行い、加圧による抽出カラム３５内の各溶液の排出は必要なポンプを複数個備えることで複数の抽出カラム３５の同時加圧が可能となる。

また、密閉流路はお互いの気流の干渉を避けるため、複数個の抽出カラム３５毎に流路を設置する必要はあるが、密閉流路内の気体を流動させるための手段は共通化することも可能である。

なお、抽出後の核酸を対象とする後段の分析反応としては、PCR（；Polymerase Chain Reaction）、RT-PCR（；Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）、LCR（；Ligase Chain Reaction）、SDA（；Strand Displacement Amplification）、NASBA（；Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）、TMA（；Transcription-Mediated Amplification）、 LAMP（；Loop-mediated isothermal amplification）、 ICAN（；Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）等の核酸増幅、逆転写反応、核酸伸長反応、制限酵素等の酵素反応、或いは電気泳動等の核酸分析が適用できる。

次に、本発明の第２の実施形態について図６を参照して説明する。本発明の第２の実施形態では、密閉流路内の気体の流動を起こすための送気ポンプ９０が用いられ、吸引ファン５２は省略されている。送気ポンプ９０は送気流路９１によって抽出カラム保持ブロック３７に接続されている。その他の構成は、第１の実施形態と同様であるので、詳細な説明は省略する。

図６において、抽出カラム保持ブロック３７には、送気流路９１を通って流入する気体を密閉流路内に導入するための開口部９５が複数個形成される。これらの開口部９５を、抽出カラム３５の排出開口部３２近傍に形成することで、気体の流れを液受けタンク５４の底部方向に向けることができ、排出開口部３２から排出されるミストを保護フィルタ５１へ導くと共に、吹き返しによる抽出カラム３５への付着を防止することができる。

本発明の第２の実施形態においても、第１の実施形態と同様な効果を得ることができる。

なお、本発明の第２の実施形態において、上述した第１の実施形態の吸引ファン５２と組み合わせ、送気ポンプ９０と吸引ファン５２とを同時に機能させることも有効である。

また、本発明の第２の実施形態において、送気流路９１中にヒータを設置することも可能である。抽出カラム保持ブロック３７に流入する気体を加熱することにより、気体中を流動したミストが加熱され短時間で蒸発し、保護フィルタ５１に直接付着するミスト量を削減する効果が期待できる。

また、ヒータで加熱する部位として、抽出カラム保持ブロック３７を加熱することも可能である。この場合、核酸精製工程に影響が出ないよう、一定範囲内に温度を制御する必要がある。

次に、本発明の第３の実施形態について図７を参照して説明する。本発明の第３の実施形態では、密閉流路内の気体の流動を起こすために真空ポンプ９３が用いられ、吸引ファン５２及び保護フィルタ５１は省略されている。真空ポンプ９３は、開閉バルブ９４及び真空バッファタンク９２を介して密閉流路に接続されている。その他の構成は、第１の実施形態と同様であるので、詳細な説明は省略する。

開閉バルブ９４は、通常、閉となっており、閉となった状態で真空バッファタンク９２を一定以上の真空状態になるように吸引している。抽出カラム３５より内容液を液受けタンク５４へ排出すると同時に、開閉バルブ９４を開くことで真空バッファタンク９２内へ密閉流路内の空気が吸引される。これにより、気体の流動を起こし、密閉流路内のミストを真空バッファタンク９２内に吸引する。

密閉流路内に気体の流動を起こす時間は真空バッファタンク９２に容量が大ききほど、また、真空ポンプ９３の能力が高いほど長くなるが、真空ポンプ９３を連続動作させた状態で開閉バルブ９４を適切なタイミングで開状態にすることを繰り返すことで断続的に気体の流動を起こすことも可能である。

真空バッファタンク９２内に収容されたミストは、別途廃棄処理等を行なうことが可能である。

以上のように、本発明の第３の実施形態においては、抽出カラム３５からの核酸含有溶液等を密閉流路内に放出しながら、核酸含有溶液等のミストを含んだ気体を、真空バッファタンク９２内に吸引し、その後、密閉流路内の核酸含有溶液等を回収するように構成している。

したがって、本発明の第３の実施形態によれば、溶液排出時のコンタミネーションの要因となるミストの飛散を防止することが可能な核酸抽出方法及び装置を実現することができる。

また、図１に示した、抽出カラム保持ブロック３７と、液受けタンク（液収容タンク）５４と、保護フィルタ５１と、吸引ファン５２と、仕切り板５５とにより、核酸抽出装置に使用される送気ユニットが構成され、この送気ユニットは核酸抽出装置の部品として別個、取り扱い等が可能である。

また、送気ユニットとしては、図６に示した、抽出カラム保持ブロック３７と、液受けタンク（液収容タンク）５４と、保護フィルタ５１と、送気ポンプ９０と、仕切り板５５と、送気流路９１とにより構成されるものがある。

さらに、送気ユニットとしては、図７に示した、抽出カラム保持ブロック３７と、液受けタンク（液収容タンク）５４と、真空ポンプ９３と、真空バッファタンク９２と、開閉バルブ９４と、仕切り板５５とにより構成されるものもある。

本発明の第１の実施形態における溶液排出流路の概略構成図である。 本発明の第１の実施形態における抽出カラムの概略構成図である。 本発明が適用される核酸精製用装置の概略構成平面図である。 核酸精製用装置の動作系のブロックダイヤグラムである。 本発明の第１の実施形態における動作フローチャートである。 本発明の第２の実施形態における溶液排出流路の概略構成図である。 本発明の第３の実施形態における溶液排出流路の概略構成図である。

符号の説明

５・・・作業面、１０・・・加圧ポンプ、１１・・・シリンジポンプ、１２・・・加圧ノズル、１４・・・検体ラック、１６、１７・・・アーム、１８・・・加圧ノズルホルダ、１９・・・分注ノズルホルダ、２０・・・検体容器、２１・・・処理容器、２３・・・結合試薬ボトル、２４・・・第１洗浄液ボトル、２５・・・第２洗浄液ボトル、２６・・・溶出液ボトル、２７・・・精製品容器ラック、２８・・・精製品用容器、３０・・・開口部、３１・・・接続部、３２・・・排出開口部、３３・・・核酸結合性固相、３４・・・保持部材、３５・・・抽出カラム、３６・・・シール部材、３７・・・抽出カラム保持ブロック、３８・・・配管部、４１・・・チップラック、４２・・・分注用チップ、５１・・・保護フィルタ、５２・・・吸引ファン、５３・・・開閉弁、５４・・・排液受けタンク、５５・・・仕切り板、６１・・・処理ブロック、６２・・・排液ユニット、６３・・・溶出ユニット、６４・・・抽出カラムハンドラー、６５・・・チップ外し器、６７、６８・・・待機位置、７１〜７７・・・ステッピングモータ、８０・・・ＰＣ、８１・・・キーボード、８２・・・ＣＲＴ、８３・・・機構制御部、９０・・・送気ポンプ、９１・・・送気流路、９２・・・真空バッファタンク、９３・・・真空ポンプ、９４・・・開閉バルブ、９５・・・開口部、９９・・・気体の流れ、１００・・・精製用装置

Claims (10)

1. 核酸結合性固相を有する抽出カラムに供給された液体を加圧して上記核酸結合性固相を通して上記抽出カラムから排出し、核酸含有液体試料から目的の核酸を抽出する核酸抽出方法において、
   内部に仕切り板が配置され上記抽出カラムから排出された液体を収容する液体収容タンクを抽出カラムの液体排出口に接続し、
   抽出カラムに供給された液体を加圧して上記核酸結合性固相を通して上記抽出カラムから上記液体収容タンク内に排出し、
   上記液体収容タンク内の気体を、上記抽出カラムの液体排出口付近から、上記液体収容タンクの底部に向かって流し、上記液体収容タンク内の気体と共に浮遊する液体成分を捕捉し、上記気体と共に浮遊する液体成分を除去した後に、上記気体を上記液体収容タンク外に送気することを特徴とする核酸抽出方法。
2. 核酸結合性固相を有する抽出カラムと、この抽出カラムに供給された液体を加圧して上記核酸結合性固相を通して上記抽出カラムから排出させる加圧手段とを有し、核酸含有液体試料から目的の核酸を抽出する核酸抽出装置において、
   抽出カラムの液体排出口に接続され、上記抽出カラムから排出された液体を収容する液体収容タンクと、
   上記液体収容タンクの側面に配置され、上記液体収容タンク内の気体と共に浮遊する液体成分を捕捉する保護フィルタと、
   上記液体収容タンクの側面に配置され、上記液体収容タンク内の上記浮遊液体成分が、気体と共に上記保護フィルタに向かって流れるように送気し、上記保護フィルタを通過した気体を上記液体収容タンク外に排気する吸引ファンと、
   を備えることを特徴とする核酸抽出装置。
3. 請求項２記載の核酸抽出装置において、上記液体収容タンクの内部に、上記保護フィルタに対向する位置に配置された仕切り板を備え、上記吸引ファンにより送気される気体は、上記抽出カラムの液体排出口付近から、上記液体収容タンクの底部に向かって流れた後、上記保護フィルタに向かって流れることを特徴とする核酸抽出装置。
4. 核酸結合性固相を有する抽出カラムと、この抽出カラムに供給された液体を加圧して上記核酸結合性固相を通して上記抽出カラムから排出させる加圧手段とを有し、核酸含有液体試料から目的の核酸を抽出する核酸抽出装置において、
   抽出カラムの液体排出口に接続され、上記抽出カラムの液体排出口との接続部分付近に送気流路が形成され、上記抽出カラムから排出された液体を収容する液体収容タンクと、
   上記液体収容タンクの側面に配置され、上記液体収容タンク内の気体と共に浮遊する液体成分を捕捉する保護フィルタと、
   上記送気流路を通して、気体を液体収容タンク内に送り、上記液体収容タンク内の上記浮遊液体成分が、気体と共に上記保護フィルタに向かって流れるように送気する送気ポンプと、
   を備え、上記液体収容タンクの内部に、上記保護フィルタに対向する位置に配置された仕切り板が形成され、上記送気ポンプにより送気される気体は、上記抽出カラムの液体排出口付近から、上記液体収容タンクの底部に向かって流れた後、上記保護フィルタに向かって流れることを特徴とする核酸抽出装置。
5. 請求項４記載の核酸抽出装置において、上記送気流路には、送気ポンプから上記液体収容タンク内に送気される気体を加熱するヒータが配置されていることを特徴とする核酸抽出装置。
6. 核酸結合性固相を有する抽出カラムと、この抽出カラムに供給された液体を加圧して上記核酸結合性固相を通して上記抽出カラムから排出させる加圧手段とを有し、核酸含有液体試料から目的の核酸を抽出する核酸抽出装置において、
   抽出カラムの液体排出口に接続され、上記抽出カラムから排出された液体を収容する液体収容タンクと、
   上記液体収容タンクの側面に開閉バルブを介して接続され、上記液体収容タンク内の気体と共に浮遊する液体成分を捕捉する真空バッファタンクと、
   上記真空バッファタンクに接続され、上記液体収容タンク内の上記浮遊液体成分が、気体と共に上記真空バッファタンクに向かって流れるように送気する真空ポンプと、
   を備えることを特徴とする核酸抽出装置。
7. 請求項６記載の核酸抽出装置において、上記液体収容タンクの内部に配置された仕切り板を備え、上記真空ポンプにより真空バッファタンクを介して送気される気体は、上記抽出カラムの液体排出口付近から、上記液体収容タンクの底部に向かって流れた後、上記真空バッファタンクに向かって流れることを特徴とする核酸抽出装置。
8. 核酸結合性固相を有する抽出カラムを用いて、核酸含有液体試料から目的の核酸を抽出する核酸抽出装置に使用される送気ユニットであって、
   抽出カラムの液体排出口に接続され、上記抽出カラムから排出された液体を収容する液体収容タンクと、
   上記液体収容タンクの側面に配置され、上記液体収容タンク内の気体と共に浮遊する液体成分を捕捉する保護フィルタと、
   上記液体収容タンクの側面に配置され、上記保護フィルタを通過した気体を上記液体収容タンク外に排気する吸引ファンと、
   上記液体収容タンクの内部の上記保護フィルタに対向する位置に配置され、上記吸引ファンにより送気される気体を、上記抽出カラムの液体排出口付近から、上記液体収容タンクの底部に向かって流れた後、上記保護フィルタに向かって流すための仕切り板と、
   を備えることを特徴とする核酸抽出装置に使用される送気ユニット。
9. 核酸結合性固相を有する抽出カラムを用いて、核酸含有液体試料から目的の核酸を抽出する核酸抽出装置に使用される送気ユニットであって、
   抽出カラムの液体排出口に接続され、上記抽出カラムの液体排出口との接続部分付近に送気流路が形成され、上記抽出カラムから排出された液体を収容する液体収容タンクと、
   上記液体収容タンクの側面に配置され、上記液体収容タンク内の気体と共に浮遊する液体成分を捕捉する保護フィルタと、
   上記液体収容タンクの上記送気流路を通して、気体を液体収容タンク内に送る送気ポンプと、
   上記液体収容タンクの内部の上記保護フィルタに対向する位置に配置され、上記送気ポンプにより送気される気体を、上記抽出カラムの液体排出口付近から、上記液体収容タンクの底部に向かって流れた後、上記保護フィルタに向かって流すための仕切り板と、
   を備えることを特徴とする核酸抽出装置に使用される送気ユニット。
10. 核酸結合性固相を有する抽出カラムを用いて、核酸含有液体試料から目的の核酸を抽出する核酸抽出装置に使用される送気ユニットであって、
    抽出カラムの液体排出口に接続され、上記抽出カラムから排出された液体を収容する液体収容タンクと、
    上記液体収容タンクの側面に配置され、上記液体収容タンク内の気体と共に浮遊する液体成分を捕捉する保護フィルタと、
    上記液体収容タンクの側面に開閉バルブを介して接続される真空バッファタンクと、
    上記真空バッファタンクに接続される真空ポンプと、
    上記液体収容タンクの内部に配置され、上記真空ポンプにより真空バッファタンクを介して送気される気体を、上記抽出カラムの液体排出口付近から、上記液体収容タンクの底部に向かって流れた後、上記真空バッファタンクに向かって流すための仕切り板と、
    を備えることを特徴とする核酸抽出装置に使用される送気ユニット。

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