JP5003867B2 - Magnetic particle, method for producing the same, and probe-coupled particle - Google Patents
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Description
本発明は、磁性粒子およびその製造方法、ならびにプローブ結合粒子に関する。 The present invention relates to a magnetic particle, a method for producing the same, and a probe binding particle.
近年、磁性粒子は、磁気分離による洗浄が容易で、抗原と抗体との免疫反応やDNA同士またはDNAとRNAとのハイブリダイゼーション、医薬品候補物質と体内物質の相互作用などの研究において優れた反応場を提供できることから、特に診断薬や医薬品研究用などの生化学用途への応用が活発になっている。 In recent years, magnetic particles can be easily washed by magnetic separation and have excellent reaction fields in studies such as immune reactions between antigens and antibodies, hybridization between DNA or DNA and RNA, and interactions between drug candidates and internal substances. In particular, application to biochemical uses such as diagnostics and pharmaceutical research has become active.
中でも、生化学用担体粒子としては、物理吸着感作用として主にポリスチレン粒子が、化学結合感作用として主にカルボキシル基変性ポリスチレン粒子が広く使用されている。しかしながら、これらの粒子は、細胞、タンパク、DNAなどの試験検体中に存在する、目的としない他の生理活性物質等の吸着(以下、本明細書において「非特異吸着」という)が大きく、この非特異吸着が感作粒子の性能を阻害する。すなわち、非特異吸着はこれらの粒子を使用するうえでの大きな障害になっていた。 Among them, as the carrier particles for biochemistry, mainly polystyrene particles are widely used as a physical adsorption sensation effect, and mainly carboxyl group-modified polystyrene particles are used as a chemical bond sensation effect. However, these particles have a large adsorption (hereinafter referred to as “non-specific adsorption” in the present specification) of other undesired physiologically active substances present in test specimens such as cells, proteins and DNA. Nonspecific adsorption impairs the performance of the sensitized particles. That is, non-specific adsorption has been a major obstacle to using these particles.
非特異吸着の少ない生化学用担体としては、アガロース、セファロースなど糖鎖に基づくゲル体が使用されているが、結合したプローブの活性が低くなる傾向があり、十分なシグナルが得られないことが多い。 As a biochemical carrier with little nonspecific adsorption, gel bodies based on sugar chains such as agarose and sepharose are used, but the activity of the bound probe tends to be low, and a sufficient signal may not be obtained. Many.
磁性粒子に関しても同様に、非特異吸着を低減させることが求められており、その目的から粒子表面にグリシジル基を導入した磁性粒子が提案されている。例えば、特開2006−131771号公報では、超常磁性微粒子をスチレンおよびグリシジルメタクリレートに分散させ、超音波処理で微分散させてから重合する方法が提案されている。しかしながら、この方法では、磁性体の被覆が不十分で非特異吸着の低減が不十分であるうえに、平均粒子径が200nm以下と粒子径が小さいため磁気分離性も不十分である。 Similarly, magnetic particles are required to reduce non-specific adsorption, and magnetic particles having glycidyl groups introduced on the particle surface have been proposed for that purpose. For example, Japanese Patent Laid-Open No. 2006-131771 proposes a method in which superparamagnetic fine particles are dispersed in styrene and glycidyl methacrylate and then finely dispersed by ultrasonic treatment and then polymerized. However, in this method, the coating of the magnetic material is insufficient and the reduction of nonspecific adsorption is insufficient, and the average particle size is 200 nm or less and the particle size is small, so that the magnetic separation property is also insufficient.
本出願人は、特許第3738847号公報で、磁性体の脱落、鉄イオンなどの磁性体成分に由来する物質の溶出がなく、均一粒子径を有する診断薬用粒子を簡便かつ効率的に製造することを目的として、2層のポリマーコートを設ける工程を含む磁性粒子の製造方法を開示し、さらに、特開2005−83904号公報および特開2005−83905号公報で、非特異吸着を低減した磁性粒子を開示したが、さらなる非特異吸着の低減が望まれている。 The present applicant, in Japanese Patent No. 3738847, is capable of easily and efficiently producing diagnostic pharmaceutical particles having a uniform particle size without dropping off of a magnetic material and elution of a substance derived from a magnetic material component such as iron ions. For this purpose, a method for producing magnetic particles including a step of providing a two-layer polymer coat is disclosed, and further, in JP 2005-83904 A and JP 2005-83905 A, magnetic particles with reduced non-specific adsorption are disclosed. However, further reduction of non-specific adsorption is desired.
なお、必ずしも非特異吸着を低減させる目的ではないが、グリシジル基を導入した磁性粒子として、例えば、特表平2−501753号公報では、核粒子の存在下、磁性体とモノマーとの混合物を重合し、さらにポリマーコートする方法が提案されている。しかしながら、この方法では、磁性体とモノマーとの混合物のうち、核粒子上で重合する部分はわずかであり、結果的に極めて少量の磁性体しか核粒子に取り込むことができないため、磁気分離性に劣る。 Although not necessarily the purpose of reducing non-specific adsorption, as a magnetic particle into which a glycidyl group is introduced, for example, in Japanese Translation of PCT Publication No. 2-501753, a mixture of a magnetic substance and a monomer is polymerized in the presence of a core particle. In addition, a method for further polymer coating has been proposed. However, in this method, the portion of the mixture of the magnetic substance and the monomer that is polymerized on the core particle is very small, and as a result, only a very small amount of the magnetic substance can be taken into the core particle. Inferior.
また、特表平10−505118号公報では、グリシジル基を導入した磁性粒子にアミノ基を導入する反応が記載されているが、この磁性粒子はイオン交換を目的とした多孔質の粒子であり、非特異吸着が著しい。 In addition, JP 10-505118 A describes a reaction of introducing an amino group into a magnetic particle into which a glycidyl group has been introduced. This magnetic particle is a porous particle for the purpose of ion exchange, Non-specific adsorption is remarkable.
さらに、特表2006−511935号公報では、粒子表面および内部に磁性体を析出させ、さらにグリシジル基を有するポリマーでコートする提案がなされている。しかしながら、この方法では、粒子表面にまで磁性粒子を析出させた場合、グリシジル基を有するポリマーでのコートのみでは磁性粒子の被覆が不十分であり、非特異吸着性を低減させることができない。
本発明は、タンパクや核酸等の非特異吸着が少なく、特に、生化学・医薬品分野で特出する高感度と低ノイズを発現する磁性粒子およびその製造方法ならびにプローブ結合粒子に関する。 The present invention relates to a magnetic particle that exhibits low non-specific adsorption of proteins, nucleic acids, and the like, and that expresses high sensitivity and low noise that are particularly outstanding in the fields of biochemistry and pharmaceuticals, a method for producing the same, and probe-binding particles.
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、粒径dの磁性母粒子の表面に粒径d/2以下の非磁性子粒子を設けたうえで、最外層にグリシジル基を有する第1ポリマー層を形成し、さらにこの第1ポリマー層に、酸素原子、窒素原子および硫黄原子からなる群より選ばれた少なくとも1種の原子を1個以上含む極性基を導入することにより、生化学・医薬品分野で特出する高感度および低ノイズを発現し、かつ、表面が凸凹であることにより単位重量あたりの表面積が比較的大きいため捕捉物質の結合量が多い磁性粒子が得られることを見出し、本発明を完成させた。本発明によれば、以下の態様の磁性粒子およびその製造方法ならびにプローブ結合粒子を提供することができる。 In order to achieve the above object, the present inventors have conducted intensive research. As a result, nonmagnetic child particles having a particle size of d / 2 or less are provided on the surface of magnetic mother particles having a particle size of d, and glycidyl is formed in the outermost layer. Forming a first polymer layer having a group, and introducing a polar group containing at least one atom selected from the group consisting of an oxygen atom, a nitrogen atom and a sulfur atom into the first polymer layer; This produces magnetic particles with high sensitivity and low noise that are outstanding in the biochemical / pharmaceutical field, and with a relatively large surface area per unit weight due to the uneven surface, resulting in a high binding amount of the trapping substance. The present invention has been completed. According to the present invention, it is possible to provide the following magnetic particles, a method for producing the same, and probe-bound particles.
本発明の一態様に係る磁性粒子の製造方法は、
粒径dの磁性母粒子の表面に、粒径d/2以下の非磁性子粒子を設ける第1の工程、
前記磁性母粒子および前記非磁性子粒子を被覆するように、グリシジル基を有する第1ポリマー層を形成する第2の工程、並びに、
前記第1ポリマー層に、酸素原子、窒素原子および硫黄原子からなる群より選ばれた少なくとも1種の原子を1個以上含む極性基を導入する第3の工程
を含む。
A method for producing magnetic particles according to an aspect of the present invention includes:
A first step of providing non-magnetic child particles having a particle size of d / 2 or less on the surface of magnetic base particles having a particle size of d,
A second step of forming a first polymer layer having a glycidyl group so as to cover the magnetic mother particles and the non-magnetic child particles; and
A third step of introducing a polar group containing at least one atom selected from the group consisting of an oxygen atom, a nitrogen atom and a sulfur atom into the first polymer layer;
本発明において、母粒子とは、本発明の磁性粒子の中心体となる粒子をいい、子粒子とは、母粒子の表面を被覆する粒子をいう。 In the present invention, the mother particle refers to a particle that becomes the central body of the magnetic particle of the present invention, and the child particle refers to a particle that covers the surface of the mother particle.
上記磁性粒子の製造方法において、前記第3の工程が、アミノ基を導入する反応を含むことができる。 In the method for producing magnetic particles, the third step may include a reaction for introducing an amino group.
上記磁性粒子の製造方法において、前記第3の工程が、アルデヒド基を導入する反応を含むことができる。 In the method for producing magnetic particles, the third step may include a reaction for introducing an aldehyde group.
上記磁性粒子の製造方法において、前記第3の工程が、カルボキシル基を導入する反応を含むことができる。この場合、前記第3の工程がさらに、前記カルボキシル基を活性エステル基に変換する反応を含むことができる。 In the method for producing magnetic particles, the third step may include a reaction for introducing a carboxyl group. In this case, the third step may further include a reaction for converting the carboxyl group into an active ester group.
上記磁性粒子の製造方法において、前記第2の工程は、複数のグリシジル基を有する第1ポリマー層を形成する工程であり、前記グリシジル基の一部を加水分解する工程をさらに含むことができる。 In the magnetic particle manufacturing method, the second step is a step of forming a first polymer layer having a plurality of glycidyl groups, and may further include a step of hydrolyzing a part of the glycidyl groups.
上記磁性粒子の製造方法において、前記磁性母粒子は、核粒子と、該核粒子の表面に形成された超常磁性微粒子を含む磁性体層と、該磁性体層の表面に設けられた疎水性の第2ポリマー層と、を含み、
前記第2の工程は、前記第2ポリマー層および前記非磁性子粒子を被覆するように前記第1ポリマー層を形成する工程であることができる。この場合、
前記磁性母粒子は、水系媒体中で正または負の表面荷電を有し、前記非磁性子粒子は、前記水系媒体中で負または正の表面荷電を有し、前記第1の工程は、前記磁性母粒子と前記非磁性子粒子とを前記水系媒体中で混合することにより、前記磁性母粒子の表面に前記非磁性子粒子を吸着させる工程を含むことができる。さらにこの場合、前記磁性母粒子は、前記水系媒体中で正の表面荷電を有し、前記非磁性子粒子は、前記水系媒体中で負の表面荷電を有することができる。
In the method for producing magnetic particles, the magnetic mother particles include core particles, a magnetic layer containing superparamagnetic fine particles formed on the surface of the core particles, and a hydrophobic layer provided on the surface of the magnetic layer. A second polymer layer,
The second step may be a step of forming the first polymer layer so as to cover the second polymer layer and the nonmagnetic child particles. in this case,
The magnetic mother particles have a positive or negative surface charge in an aqueous medium, the non-magnetic child particles have a negative or positive surface charge in the aqueous medium, and the first step includes the step of A step of adsorbing the nonmagnetic child particles on the surface of the magnetic mother particles by mixing the magnetic mother particles and the nonmagnetic child particles in the aqueous medium may be included. Furthermore, in this case, the magnetic mother particles can have a positive surface charge in the aqueous medium, and the non-magnetic child particles can have a negative surface charge in the aqueous medium.
本発明の一態様に係る磁性粒子は、
粒径dの磁性母粒子と、
前記磁性母粒子の表面上に存在する粒径d/2以下の非磁性子粒子と、
前記磁性母粒子および前記非磁性子粒子を被覆するように設けられた、アミノ基および2,3−ジヒドロキシプロピル基を有する第1ポリマー層と、
を含む。
The magnetic particles according to one aspect of the present invention are:
Magnetic base particles having a particle size d;
Non-magnetic child particles having a particle diameter of d / 2 or less present on the surface of the magnetic mother particles;
A first polymer layer having an amino group and a 2,3-dihydroxypropyl group provided so as to cover the magnetic mother particle and the non-magnetic child particle;
including.
本発明の一態様に係る磁性粒子は、
粒径dの磁性母粒子と、
前記磁性母粒子の表面上に存在する粒径d/2以下の非磁性子粒子と、
前記磁性母粒子および前記非磁性子粒子を被覆するように設けられた、アルデヒド基および2,3−ジヒドロキシプロピル基を有する第1ポリマー層と、
を含む。
The magnetic particles according to one aspect of the present invention are:
Magnetic base particles having a particle size d;
Non-magnetic child particles having a particle diameter of d / 2 or less present on the surface of the magnetic mother particles;
A first polymer layer having an aldehyde group and a 2,3-dihydroxypropyl group provided so as to cover the magnetic mother particle and the non-magnetic child particle;
including.
本発明の一態様に係る磁性粒子は、
粒径dの磁性母粒子と、
前記磁性母粒子の表面上に存在する粒径d/2以下の非磁性子粒子と、
前記磁性母粒子および前記非磁性子粒子を被覆するように設けられた、カルボキシル基および2,3−ジヒドロキシプロピル基を有する第1ポリマー層と、
を含む。
The magnetic particles according to one aspect of the present invention are:
Magnetic base particles having a particle size d;
Non-magnetic child particles having a particle diameter of d / 2 or less present on the surface of the magnetic mother particles;
A first polymer layer having a carboxyl group and a 2,3-dihydroxypropyl group provided so as to cover the magnetic mother particle and the non-magnetic child particle;
including.
本発明の一態様に係る磁性粒子は、
粒径dの磁性母粒子と、
前記磁性母粒子の表面上に存在する粒径d/2以下の非磁性子粒子と、
前記磁性母粒子および前記非磁性子粒子を被覆するように設けられた、活性エステル基および2,3−ジヒドロキシプロピル基を有する第1ポリマー層と、
を含む。
The magnetic particles according to one aspect of the present invention are:
Magnetic base particles having a particle size d;
Non-magnetic child particles having a particle diameter of d / 2 or less present on the surface of the magnetic mother particles;
A first polymer layer having an active ester group and a 2,3-dihydroxypropyl group provided so as to cover the magnetic mother particle and the non-magnetic child particle;
including.
上記磁性粒子において、前記磁性母粒子は、核粒子と、該核粒子の表面に形成された超常磁性微粒子を含む磁性体層と、該磁性体層の表面に設けられた疎水性の第2ポリマー層と、を含み、前記第1ポリマー層は、前記第2ポリマー層および前記非磁性子粒子を被覆するように形成されることができる。 In the magnetic particle, the magnetic mother particle includes a core particle, a magnetic layer including superparamagnetic fine particles formed on the surface of the core particle, and a hydrophobic second polymer provided on the surface of the magnetic layer. And the first polymer layer may be formed to cover the second polymer layer and the non-magnetic child particles.
上記磁性粒子はプローブ結合に用いることができる。 The magnetic particles can be used for probe binding.
本発明の一態様に係るプローブ結合粒子は、上記磁性粒子と、該磁性粒子に結合するプローブとを含む。 A probe-coupled particle according to one embodiment of the present invention includes the magnetic particle and a probe that binds to the magnetic particle.
上記磁性粒子は、磁性母粒子および非磁性子粒子を被覆するように、上記極性基を有する第1ポリマー層が設けられていることにより、タンパク質や核酸等の非特異吸着が少ないため、生化学・医薬品分野で特出する高感度および低ノイズを発現し、生化学検査用として高いS/N比を得ることができる。また、上記磁性粒子は、磁性母粒子の表面上に非磁性子粒子が存在することにより、表面が凸凹であるので、単位重量あたりの表面積が大きいため、捕捉物質の結合量が多い。 Since the first magnetic layer having the polar group is provided so as to cover the magnetic mother particle and the nonmagnetic child particle, the magnetic particle has less nonspecific adsorption of protein, nucleic acid, etc. -High sensitivity and low noise that are outstanding in the pharmaceutical field can be expressed, and a high S / N ratio can be obtained for biochemical tests. Further, since the surface of the magnetic particle is uneven due to the presence of non-magnetic child particles on the surface of the magnetic mother particle, the surface area per unit weight is large, so that the binding amount of the trapping substance is large.
また、上記磁性粒子の製造方法によれば、タンパクや核酸等の非特異吸着が少なく、特に、生化学・医薬品分野で特出する高感度と低ノイズを発現できる磁性粒子を効率よく製造することができる。 In addition, according to the above method for producing magnetic particles, it is possible to efficiently produce magnetic particles that have less nonspecific adsorption of proteins, nucleic acids, etc., and that can express high sensitivity and low noise, which are particularly outstanding in the fields of biochemistry and pharmaceuticals. Can do.
さらに、上記プローブ結合粒子によれば、プローブの脱離が少なく、非特異吸着が少なく、かつ高感度である。 Furthermore, according to the probe binding particles, there is little desorption of the probe, less nonspecific adsorption, and high sensitivity.
以下、本発明の一実施形態に係る磁性粒子およびその製造方法ならびにプローブ結合粒子について説明する。 Hereinafter, a magnetic particle, a method for producing the magnetic particle, and a probe binding particle according to an embodiment of the present invention will be described.
1.磁性粒子およびその製造方法
本実施形態に係る磁性粒子は、粒径dの磁性母粒子と、磁性母粒子の表面上に存在する粒径d/2以下の非磁性子粒子と、磁性母粒子および前記非磁性子粒子を被覆するように設けられた第1ポリマー層とを含むことができる。この場合、第1ポリマー層は、酸素原子、窒素原子および硫黄原子からなる群より選ばれた少なくとも1種の原子を1個以上含む極性基を含むことができる。
1. Magnetic Particle and Method for Producing the Same Magnetic particles according to the present embodiment include a magnetic mother particle having a particle size d, a non-magnetic child particle having a particle size of d / 2 or less present on the surface of the magnetic mother particle, a magnetic mother particle, and And a first polymer layer provided to cover the non-magnetic child particles. In this case, the first polymer layer can include a polar group including at least one atom selected from the group consisting of an oxygen atom, a nitrogen atom, and a sulfur atom.
本実施形態に係る磁性粒子の製造方法は、粒径dの磁性母粒子の表面に、粒径d/2以下の非磁性子粒子を設ける第1の工程、前記磁性母粒子および前記非磁性子粒子を被覆するように、グリシジル基を有する第1ポリマー層を形成する第2の工程、並びに、前記第1ポリマー層に、酸素原子、窒素原子および硫黄原子からなる群より選ばれた少なくとも1種の原子を1個以上含む極性基を導入する第3の工程を含む。 The method for producing magnetic particles according to this embodiment includes a first step of providing nonmagnetic child particles having a particle size of d / 2 or less on the surface of magnetic mother particles having a particle size d, the magnetic mother particles, and the nonmagnetic child. A second step of forming a first polymer layer having a glycidyl group so as to coat the particles, and at least one selected from the group consisting of an oxygen atom, a nitrogen atom and a sulfur atom in the first polymer layer A third step of introducing a polar group containing one or more atoms of
1.1.磁性粒子の構成および製造
本発明の一実施形態に係る磁性粒子は、磁性母粒子および非磁性子粒子を含み、非磁性子粒子は磁性母粒子の表面上に存在する。ここで、「非磁性子粒子が磁性母粒子の表面上に存在する。」とは、(a)非磁性子粒子が磁性母粒子の表面と接触している場合だけでなく、例えば、(b)磁性母粒子が後述する第2ポリマー層を含む場合に、非磁性子粒子が磁性母粒子の表面と接触しておらず、非磁性子粒子が磁性母粒子の表面から浮き上がった状態にある場合も含む。(b)である場合、隣り合う非磁性体粒子の間に第2ポリマー層が存在することができる。
1.1. Configuration and Production of Magnetic Particles Magnetic particles according to an embodiment of the present invention include magnetic mother particles and nonmagnetic child particles, and the nonmagnetic child particles are present on the surface of the magnetic mother particles. Here, “the nonmagnetic child particles are present on the surface of the magnetic mother particles” means not only (a) the nonmagnetic child particles are in contact with the surface of the magnetic mother particles, but also, for example, (b ) When the magnetic mother particle includes a second polymer layer to be described later, the non-magnetic child particle is not in contact with the surface of the magnetic mother particle, and the non-magnetic child particle is lifted from the surface of the magnetic mother particle. Including. In the case of (b), a second polymer layer can be present between adjacent non-magnetic particles.
本実施形態に係る磁性粒子においては、非磁性子粒子が磁性母粒子の表面上において、上記(a)および(b)の少なくとも一方の状態であることができる。 In the magnetic particles according to the present embodiment, the nonmagnetic child particles can be in at least one of the above states (a) and (b) on the surface of the magnetic mother particles.
本実施形態に係る磁性粒子は、複数の非磁性子粒子が磁性母粒子の表面を被覆するように存在するのが好ましく、複数の非磁性子粒子が均一な厚さを有する被覆層を構成していることがより好ましい。 The magnetic particles according to the present embodiment preferably exist so that a plurality of nonmagnetic child particles coat the surface of the magnetic mother particles, and the plurality of nonmagnetic child particles constitute a coating layer having a uniform thickness. More preferably.
非磁性子粒子は、例えば、磁性母粒子の表面に吸着されていてもよいし、あるいは、磁性母粒子の表面または該表面の上方に固定されていてもよい。非磁性子粒子が磁性母粒子の表面に吸着されている場合、吸着は例えば物理的吸着および化学的吸着のいずれかであってもよい。また、磁性母粒子の表面または該表面の上方に非磁性子粒子を固定する方法としては、例えば、他の層(例えば後述する第1ポリマー層)によって、磁性母粒子および非磁性子粒子を被覆する方法が挙げられる。 For example, the nonmagnetic child particles may be adsorbed on the surface of the magnetic mother particles, or may be fixed on the surface of the magnetic mother particles or above the surface. When the nonmagnetic child particles are adsorbed on the surface of the magnetic mother particles, the adsorption may be, for example, physical adsorption or chemical adsorption. In addition, as a method for fixing the nonmagnetic child particles on the surface of the magnetic mother particles or above the surface, for example, the magnetic mother particles and the nonmagnetic child particles are coated with another layer (for example, a first polymer layer described later). The method of doing is mentioned.
本発明において、「物理的吸着」とは、化学反応を伴わない吸着を意味する。「物理的吸着」の原理としては、例えば、疎水/疎水吸着、溶融結合または吸着、融着結合または吸着、水素結合、ファンデルワールス結合などが挙げられる。 In the present invention, “physical adsorption” means adsorption without chemical reaction. The principle of “physical adsorption” includes, for example, hydrophobic / hydrophobic adsorption, melt bonding or adsorption, fusion bonding or adsorption, hydrogen bonding, van der Waals bonding, and the like.
本実施形態に係る磁性粒子の粒子径は、0.1〜10μmであることが好ましく、0.2〜5μmであることがより好ましい。前記粒子径が0.1μm未満である場合、十分な磁気応答性が発現されず、当該粒子を分離するために相当に長い時間を要し、また、分離するために相当に大きい磁力が必要となるため好ましくない。一方、前記粒子径が10μmを超える場合、当該粒子が分散媒中で沈降しやすくなるため、標的物質を捕捉する際に分散媒を攪拌する操作が必要となり、また、粒子の重量に対する表面積の割合が小さくなるため、十分な量の標的物質を捕捉することが困難となることがある。 The particle size of the magnetic particles according to this embodiment is preferably 0.1 to 10 μm, and more preferably 0.2 to 5 μm. When the particle diameter is less than 0.1 μm, sufficient magnetic responsiveness is not exhibited, it takes a considerably long time to separate the particles, and a considerably large magnetic force is necessary to separate them. Therefore, it is not preferable. On the other hand, when the particle diameter exceeds 10 μm, the particles are likely to settle in the dispersion medium, so that an operation of stirring the dispersion medium is necessary when capturing the target substance, and the ratio of the surface area to the weight of the particles Therefore, it may be difficult to capture a sufficient amount of the target substance.
本実施形態に係る磁性粒子は、分散体または乾燥粉体として使用することができる。分散体に用いる分散媒としては、例えば水系媒体が挙げられる。水系媒体は特に限定されないが、例えば、水、水系溶剤を含む水が挙げられる。水系溶剤としては、例えば、アルコール類(例えば、エタノール、アルキレングリコール、モノアルキルエーテルなど)が挙げられる。分散媒には分散剤を含んでいてもよい。 The magnetic particles according to this embodiment can be used as a dispersion or a dry powder. Examples of the dispersion medium used for the dispersion include an aqueous medium. The aqueous medium is not particularly limited, and examples thereof include water and water containing an aqueous solvent. Examples of the aqueous solvent include alcohols (for example, ethanol, alkylene glycol, monoalkyl ether, etc.). The dispersion medium may contain a dispersant.
水系分散体は、通常、第3の工程の後、蒸留水などの水系溶媒で洗浄し、水系溶媒を加えて攪拌、ホモジナイザー、超音波などの処理により得られる。溶媒乾燥粉体は、水系分散体の加熱乾燥、真空乾燥、スプレードライ、凍結乾燥などによって得られる。 The aqueous dispersion is usually obtained after the third step by washing with an aqueous solvent such as distilled water, adding an aqueous solvent and stirring, homogenizer, ultrasonic treatment, or the like. The solvent-dried powder can be obtained by heat drying, vacuum drying, spray drying, freeze drying or the like of an aqueous dispersion.
次に、本実施形態に係る磁性粒子およびその製造方法を構成する各構成要素について詳細に説明する。 Next, each component constituting the magnetic particle and the method for producing the magnetic particle according to the present embodiment will be described in detail.
1.2.磁性母粒子
1.2.1.磁性母粒子の構成および製造
磁性母粒子は、磁石で集めることが可能な公知の粒子状物質であり、その粒径dは、好ましくは0.1〜10μm、より好ましくは0.2〜5μm、さらに好ましくは0.5〜3μmである。粒径dが0.1μm未満であると、磁力による分離精製に長時間を要する場合があり、一方、粒径dが10μmを超えると、生化学物質結合量が少ない場合がある。
1.2. Magnetic mother particle 1.2.1. Configuration and production of magnetic mother particles Magnetic mother particles are known particulate substances that can be collected with a magnet, and the particle size d thereof is preferably 0.1 to 10 μm, more preferably 0.2 to 5 μm, More preferably, it is 0.5-3 micrometers. If the particle size d is less than 0.1 μm, it may take a long time for separation and purification by magnetic force, whereas if the particle size d exceeds 10 μm, the amount of biochemical substance binding may be small.
磁性母粒子は、均質な磁性体粒子であってもよく、あるいは不均質な磁性体粒子であってもよい。しかしながら、上述の好ましい粒径範囲にある均質な磁性体粒子は常磁性である物質が多く、磁力による分離精製を繰り返すと媒質への再分散が困難になる場合がある。このため、磁性母粒子は、残留磁化が少ない、超常磁性微粒子を含む不均質な粒子であるのが好ましい。 The magnetic mother particles may be homogeneous magnetic particles or heterogeneous magnetic particles. However, the homogeneous magnetic particles in the above preferred particle size range are often paramagnetic substances, and re-dispersion in the medium may become difficult if separation and purification by magnetic force is repeated. For this reason, the magnetic mother particles are preferably heterogeneous particles including superparamagnetic fine particles with little residual magnetization.
このような不均質構造の磁性母粒子の具体的な形態としては、例えば、(a)有機ポリマー等の非磁性体の連続相中に超常磁性微粒子が分散している粒子、(b)超常磁性微粒子の2次凝集体をコアとし、有機ポリマー等の非磁性体をシェルとする粒子、(c)有機ポリマー等の非磁性体からなる核粒子と、該核粒子の表面に設けられた超常磁性微粒子の2次凝集体層(磁性体層)とを含む粒子が挙げられる。これらの中では、優れた磁気応答性を有し粒子径を均一に制御できる点で、(c)超常磁性微粒子を含む磁性体層が核粒子の表面に形成された磁性母粒子が好ましい。以下、(c)の磁性母粒子の構成について説明する。 Specific examples of such heterogeneous magnetic base particles include (a) particles in which superparamagnetic fine particles are dispersed in a continuous phase of a nonmagnetic material such as an organic polymer, and (b) superparamagnetic. Particles having a secondary aggregate of fine particles as a core and a non-magnetic material such as an organic polymer as a shell, (c) Core particles made of a non-magnetic material such as an organic polymer, and superparamagnet provided on the surface of the core particles And particles including a secondary aggregate layer (magnetic layer) of fine particles. Among these, (c) a magnetic base particle in which a magnetic layer containing superparamagnetic fine particles is formed on the surface of the core particle is preferable in that it has excellent magnetic response and the particle diameter can be uniformly controlled. Hereinafter, the configuration of the magnetic mother particle (c) will be described.
(c)の磁性母粒子においては、例えば、磁性母粒子は、核粒子と、核粒子の表面上に存在する超常磁性微粒子(2次凝集体)とを含むことができる。この場合、磁性母粒子は、例えば、核粒子の表面に超常磁性微粒子を物理的に吸着させることにより得ることができる。「超常磁性微粒子が核粒子の表面上に存在する。」とは、(i)超常磁性微粒子が核粒子の表面と接触している場合、(ii)例えば磁性母粒子が後述する第2ポリマー層を含む場合に、超常磁性微粒子が核粒子の表面と接触しておらず、超常磁性微粒子が核粒子の表面から浮き上がっている状態にある場合も含む。磁性母粒子においては、超常磁性微粒子が核粒子の表面上において、上記(i)および(ii)の少なくとも一方の状態であることができる。 In the magnetic mother particle (c), for example, the magnetic mother particle can include a core particle and superparamagnetic fine particles (secondary aggregates) present on the surface of the core particle. In this case, the magnetic mother particles can be obtained, for example, by physically adsorbing superparamagnetic fine particles on the surface of the core particles. “Superparamagnetic fine particles are present on the surface of the core particles” means that (ii) when the superparamagnetic fine particles are in contact with the surface of the core particles, (ii) the second polymer layer in which the magnetic mother particles are described later, for example. When the superparamagnetic fine particles are not in contact with the surface of the core particles, the superparamagnetic fine particles are in a state of being lifted from the surface of the core particles. In the magnetic mother particle, the superparamagnetic fine particles can be in at least one of the above states (i) and (ii) on the surface of the core particle.
この場合、磁性母粒子は、磁性体層が核粒子の表面を被覆するように存在するのが好ましく、複数の超常磁性微粒子が均一な厚さを有する磁性体層を構成していることがより好ましい。 In this case, the magnetic mother particle is preferably present so that the magnetic layer covers the surface of the core particle, and more preferably, the plurality of superparamagnetic fine particles constitute a magnetic layer having a uniform thickness. preferable.
1.2.2.核粒子
核粒子は、基本的に非磁性物質であり、有機物質および無機物質のいずれも使用可能であり、診断薬用粒子の使用目的等によって適宜選択することができる。有機物質の代表例としては、例えばポリマーを挙げることができる。かかるポリマーとしては、特に、ビニル系ポリマーが好ましく、最も好ましくは、架橋ポリスチレン、架橋ポリメチルメタクリレートである。これらポリマーは、カルボキシル基などの官能基が導入されていても良い。
1.2.2. Core particle The core particle is basically a non-magnetic substance, and either an organic substance or an inorganic substance can be used, and can be appropriately selected depending on the purpose of use of the diagnostic drug particle. As a typical example of the organic substance, for example, a polymer can be mentioned. Such a polymer is particularly preferably a vinyl polymer, and most preferably crosslinked polystyrene or crosslinked polymethyl methacrylate. These polymers may have a functional group such as a carboxyl group introduced therein.
核粒子の平均粒子径は、好ましくは、0.1〜10μm、さらに好ましくは0.2〜5μm、最も好ましくは0.3〜2μmである。核粒子の平均粒子径が0.1μm未満では、磁気分離性に劣る場合がある。一方、核粒子の平均粒子径が10μmを超えると、重力沈降が著しくなり、プローブを結合した粒子として反応場が不均一になる場合がある。 The average particle diameter of the core particles is preferably 0.1 to 10 μm, more preferably 0.2 to 5 μm, and most preferably 0.3 to 2 μm. When the average particle diameter of the core particles is less than 0.1 μm, the magnetic separation property may be inferior. On the other hand, when the average particle diameter of the core particles exceeds 10 μm, gravity sedimentation becomes significant, and the reaction field may become non-uniform as particles bound with the probe.
核粒子の材質は、複合化の際の加工性、軽量性の観点からポリマーなどの有機物質が好ましい。なお、本発明において「平均粒子径」とは、電子顕微鏡写真上にて100個の粒子の粒子径を無作意に測定して求めたものである。 The material of the core particles is preferably an organic substance such as a polymer from the viewpoints of processability and lightness at the time of compounding. In the present invention, the “average particle size” is obtained by randomly measuring the particle size of 100 particles on an electron micrograph.
上述した特定範囲の平均粒子径を有する核粒子としてのポリマー粒子は、例えばビニル系モノマーの懸濁重合、あるいはポリマーバルクの粉砕によって得ることもできる。均一な粒子径を有する核粒子の作製方法としては、特公昭57−24369号公報記載の膨潤重合法、あるいは本出願人が先に提案した重合方法(特開昭61−215602号公報、同61−215603号公報、同61−215604号公報)によって容易に製造することができる。 The polymer particles as the core particles having an average particle diameter in the specific range described above can also be obtained, for example, by suspension polymerization of a vinyl monomer or pulverization of a polymer bulk. As a method for producing core particles having a uniform particle size, a swelling polymerization method described in JP-B-57-24369 or a polymerization method previously proposed by the present applicant (Japanese Patent Laid-Open Nos. 61-215602, 61). -215603 and 61-215604).
1.2.3.磁性体層
磁性体層は超常磁性微粒子から構成される。超常磁性微粒子としては、粒子径20nm以下(好ましくは粒子径5〜20nm)の酸化鉄系の微粒子が代表的であり、MnFe2O4(Mn=Co、Ni、Mg、Cu、Li0.5Fe0.5等)で表現されるフェライト、Fe3O4で表現されるマグネタイト、あるいはγ−Fe2O3が挙げられ、飽和磁化が強く、かつ残留磁化が少ないγ−Fe2O3およびFe3O4のいずれか一方を含むことが好ましい。
1.2.3. Magnetic layer The magnetic layer is composed of superparamagnetic fine particles. As the superparamagnetic fine particles, iron oxide-based fine particles having a particle size of 20 nm or less (preferably a particle size of 5 to 20 nm) are typical, and MnFe 2 O 4 (Mn = Co, Ni, Mg, Cu, Li 0.5 Fe 0.5 or the like), magnetite expressed by Fe 3 O 4 , or γ-Fe 2 O 3 , and γ-Fe 2 O 3 having strong saturation magnetization and low residual magnetization, and preferably contains one of Fe 3 O 4.
核粒子と超常磁性微粒子との比(核粒子:超常磁性微粒子)は、重量比で95:5〜20:80が好ましい。超常磁性微粒子がこの範囲の量より少ないと、磁気分離性に劣る場合がある。超常磁性微粒子がこの範囲の量より多いと、核粒子の対する量が過剰となり、複合化されない超常磁性微粒子が多くなる場合がある。 The weight ratio of the core particles to the superparamagnetic fine particles (nuclear particles: superparamagnetic fine particles) is preferably 95: 5 to 20:80. If the amount of superparamagnetic particles is less than this range, the magnetic separation property may be inferior. When the amount of superparamagnetic fine particles is larger than this range, the amount of the core particles becomes excessive, and the number of superparamagnetic fine particles that are not complexed may increase.
超常磁性微粒子は、核粒子と後工程で使用する単量体モノマーとの親和性や相溶性との観点から、表面が疎水化されたものが望ましい。超常磁性微粒子の表面の疎水化処理方法としては、特許第3738847号に記載の方法が挙げられる。このような超常磁性微粒子は、公知の磁性流体から適当な貧溶媒で粒子を析出、洗浄することによっても得られる。 The superparamagnetic fine particles preferably have a hydrophobized surface from the viewpoint of the affinity and compatibility between the core particles and the monomer monomer used in the subsequent step. Examples of the method for hydrophobizing the surface of superparamagnetic fine particles include the method described in Japanese Patent No. 3738847. Such superparamagnetic fine particles can also be obtained by precipitating and washing particles from a known magnetic fluid with a suitable poor solvent.
1.2.4.磁性体層の形成
超常磁性微粒子を含む磁性体層を核粒子の表面に形成する方法としては、核粒子と超常磁性微粒子とを混合し、核粒子の表面に超常磁性微粒子を物理的に吸着させることにより、磁性体層を形成する方法が好ましい。核粒子の表面に超常磁性微粒子を吸着させる方法としては、例えば、核粒子と超常磁性微粒子とをドライブレンドして、物理的に強い力を外部から加えることにより双方の粒子を複合化させる方法により作製する方法が挙げられる。物理的に強い力を負荷する方法としては、例えば、乳鉢、自動乳鉢、ボールミル、ブレード加圧式粉体圧縮法、メカノフュージョン法のようなメカノケミカル効果を利用するもの、あるいは、ジェットミル、ハイブリダイザー等の高速気流中衝撃法を利用するものが挙げられる。効率よくかつ強固に複合化を実施するには、物理的吸着力が強いことが望ましい。物理的吸着力が強い複合化を実施するには、攪拌翼付き容器中で攪拌翼の周速度が好ましくは15m/秒以上、より好ましくは30m/秒以上、さらに好ましくは40〜150m/秒で複合化を実施することが挙げられる。撹拌翼の周速度が15m/秒より低いと、核粒子の表面に超常磁性微粒子を吸着させるのに十分なエネルギーを得ることができないことがある。なお、撹拌翼の周速度の上限については、特に制限はないが、使用する装置、エネルギー効率等の点から自ずと決定される。
1.2.4. Formation of magnetic layer The method of forming a magnetic layer containing superparamagnetic fine particles on the surface of the core particles is to mix the core particles with the superparamagnetic fine particles and physically adsorb the superparamagnetic fine particles on the surface of the core particles. Therefore, a method of forming a magnetic layer is preferable. As a method of adsorbing superparamagnetic fine particles on the surface of the core particles, for example, by dry blending the core particles and the superparamagnetic fine particles, and applying a physically strong force from the outside to combine both particles The method of producing is mentioned. As a method of applying a physically strong force, for example, a mortar, an automatic mortar, a ball mill, a method using a mechanochemical effect such as a blade pressure type powder compression method, a mechanofusion method, a jet mill, a hybridizer The thing using the impact method in high-speed air currents, such as these, is mentioned. It is desirable that the physical adsorption force is strong in order to efficiently and firmly perform the composite. In order to carry out complexing with a strong physical adsorption force, the peripheral speed of the stirring blade is preferably 15 m / second or more, more preferably 30 m / second or more, and further preferably 40 to 150 m / second in a vessel equipped with a stirring blade. It is possible to carry out compounding. When the peripheral speed of the stirring blade is lower than 15 m / sec, it may not be possible to obtain sufficient energy for adsorbing the superparamagnetic fine particles on the surface of the core particles. In addition, although there is no restriction | limiting in particular about the upper limit of the peripheral speed of a stirring blade, It determines automatically from points, such as an apparatus to be used and energy efficiency.
1.2.5.疎水性の第2ポリマー層
次に、磁性母粒子の最外層を構成することができる疎水性の第2ポリマー層(以下、単に「第2ポリマー層」ともいう)の構成およびその形成方法について述べる。
1.2.5. Hydrophobic Second Polymer Layer Next, the configuration of a hydrophobic second polymer layer (hereinafter also simply referred to as “second polymer layer”) capable of constituting the outermost layer of the magnetic mother particles and a method for forming the same will be described. .
第2ポリマー層は上述したように、磁性母粒子において、核粒子および磁性体層を被覆する。すなわち、磁性母粒子において、第2ポリマー層は、表面が超常磁性微粒子で覆われた核粒子をさらに被覆するように形成されることができる。磁性母粒子が第2ポリマー層を含むことにより、超常磁性微粒子が溶出するのを効果的に防止することができる。 As described above, the second polymer layer covers the core particle and the magnetic layer in the magnetic mother particle. That is, in the magnetic mother particle, the second polymer layer can be formed so as to further cover the core particle whose surface is covered with superparamagnetic fine particles. By including the second polymer layer in the magnetic mother particles, it is possible to effectively prevent the superparamagnetic fine particles from eluting.
第2ポリマー層を形成するためのモノマー(以下、「第2モノマー部」ともいう)は、80重量%以上の疎水性モノマーを含み、好ましくは95重量%以上の疎水性モノマーを含み、さらに好ましくは98重量%以上の疎水性モノマーを含む。第2モノマー部中の疎水性モノマーが80重量%未満であると、非特異吸着が悪化する場合がある。ここで、疎水性モノマーとは、25℃における水への溶解度が2.5重量%以下の重合性モノマーの単体および混合物である。疎水性モノマーは単官能性(非架橋性)モノマー、架橋性モノマーのいずれであってもよく、単官能性モノマーおよび架橋性モノマーの混合物でもよい。 The monomer for forming the second polymer layer (hereinafter also referred to as “second monomer part”) contains 80% by weight or more of hydrophobic monomer, preferably 95% by weight or more of hydrophobic monomer, and more preferably Contains 98% by weight or more of hydrophobic monomers. If the hydrophobic monomer in the second monomer portion is less than 80% by weight, non-specific adsorption may deteriorate. Here, the hydrophobic monomer is a simple substance or a mixture of polymerizable monomers having a solubility in water at 25 ° C. of 2.5% by weight or less. The hydrophobic monomer may be either a monofunctional (non-crosslinkable) monomer or a crosslinkable monomer, or may be a mixture of a monofunctional monomer and a crosslinkable monomer.
磁性母粒子の存在下で、副原料である重合開始剤、乳化剤、分散剤、電解質、架橋剤、分子量調節剤などが必要に応じて添加された液体中で、主原料である80重量%以上の疎水性モノマーを含む第2モノマー部を重合することにより、磁性母粒子の最外層を構成する第2ポリマー層を形成することができる。このように、重合によって第2ポリマー層を形成することにより、超常磁性微粒子の溶出を抑制することができ、かつ、後述する非磁性子粒子との結合を促進することができる。 In the presence of magnetic mother particles, auxiliary materials such as polymerization initiators, emulsifiers, dispersants, electrolytes, cross-linking agents, molecular weight regulators, etc. are added as necessary, and the main raw materials are 80% by weight or more. By polymerizing the second monomer part containing the hydrophobic monomer, a second polymer layer constituting the outermost layer of the magnetic mother particles can be formed. Thus, by forming a 2nd polymer layer by superposition | polymerization, elution of superparamagnetic fine particles can be suppressed and the coupling | bonding with the nonmagnetic child particle mentioned later can be accelerated | stimulated.
第2モノマー部に使用可能な疎水性モノマーのうち単官能性モノマーとしては、スチレン、α−メチルスチレン、ハロゲン化スチレンなどの芳香族ビニル単量体、メチルアクリレート、エチルアクリレート、エチルメタクリレート、ステアリルアクリレート、ステアリルメタクリレート、シクロヘキシルアクリレート、シクロヘキシルメタクリレート、イソボニルアクリレート、イソボニルメタクリレートなどのエチレン性不飽和カルボン酸アルキルエステルなどを例示することができる。また、疎水性モノマーのうち架橋性モノマーとしては、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ペンタエリスリトールトリメタクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサアクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサメタクリレートなどの多官能性(メタ)アクリレート、ブタジエン、イソプレンなどの共役ジオレフィン、ジビニルベンゼン、ジアリルフタレート、アリルアクリレート、アリルメタクリレートなどを例示することができる。 Among the hydrophobic monomers that can be used in the second monomer part, monofunctional monomers include aromatic vinyl monomers such as styrene, α-methylstyrene, and halogenated styrene, methyl acrylate, ethyl acrylate, ethyl methacrylate, and stearyl acrylate. Examples thereof include ethylenically unsaturated carboxylic acid alkyl esters such as stearyl methacrylate, cyclohexyl acrylate, cyclohexyl methacrylate, isobornyl acrylate and isobornyl methacrylate. Among the hydrophobic monomers, crosslinkable monomers include ethylene glycol diacrylate, ethylene glycol dimethacrylate, trimethylolpropane triacrylate, trimethylolpropane trimethacrylate, pentaerythritol triacrylate, pentaerythritol trimethacrylate, dipentaerythritol hexaacrylate. And polyfunctional (meth) acrylates such as dipentaerythritol hexamethacrylate, conjugated diolefins such as butadiene and isoprene, divinylbenzene, diallyl phthalate, allyl acrylate, and allyl methacrylate.
第2モノマー部は、20重量%以下の非疎水性モノマー(親水性モノマー)を含んでいてもよい。非疎水性モノマーのうち、単官能性モノマーとしては、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、イタコン酸などのカルボキシル基を有するモノマー、2−ヒドロキシエチルアクリレート、2−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリセロールアクリレート、グリセロールメタクリレート、メトキシエチルアクリレート、メトキシエチルメタクリレート、ポリエチレングリコールアクリレート、ポリエチレングリコールメタクリレート、2−ジメチルアミノエチル(メタ)アクリレート、2−ジエチルアミノエチル(メタ)アクリレート、2−ジメチルアミノプロピル(メタ)アクリレート、3−ジメチルアミノプロピル(メタ)アクリレートなどの親水性官能基(例えば水酸基、アミノ基、アルコキシ基、等)を有する(メタ)アクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、N−メチロールアクリルアミド、N−メチロールメタクリルアミド、ダイアセトンアクリルアミド、N−(2−ジエチルアミノエチル)(メタ)アクリルアミド、N−(2−ジメチルアミノプロピル)(メタ)アクリルアミド、N−(3−ジメチルアミノプロピル)(メタ)アクリルアミド、スチレンスルホン酸およびそのナトリウム塩、2−アクリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸およびそのナトリウム塩、イソプレンスルホン酸およびそのナトリウム塩、N,N−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドおよびその塩化メチル4級塩、アリルアミンなどの共重合可能なモノマーとの共重合体などを例示できる。非疎水性モノマーのうち、架橋性モノマーとして、ポリエチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート、ポリビニルアルコールのポリ(メタ)アクリルエステルなどの親水性のモノマーを例示することができる。第2モノマー部に含まれる非疎水性モノマーは、20重量%以下であり、好ましくは5重量%以下であり、さらに好ましくは2重量%以下である。 The second monomer portion may contain 20% by weight or less of a non-hydrophobic monomer (hydrophilic monomer). Among non-hydrophobic monomers, monofunctional monomers include monomers having a carboxyl group such as acrylic acid, methacrylic acid, maleic acid, itaconic acid, 2-hydroxyethyl acrylate, 2-hydroxyethyl methacrylate, glycerol acrylate, glycerol methacrylate , Methoxyethyl acrylate, methoxyethyl methacrylate, polyethylene glycol acrylate, polyethylene glycol methacrylate, 2-dimethylaminoethyl (meth) acrylate, 2-diethylaminoethyl (meth) acrylate, 2-dimethylaminopropyl (meth) acrylate, 3-dimethylamino (Meth) acrylates having hydrophilic functional groups such as propyl (meth) acrylate (for example, hydroxyl group, amino group, alkoxy group, etc.) , Acrylamide, methacrylamide, N-methylol acrylamide, N-methylol methacrylamide, diacetone acrylamide, N- (2-diethylaminoethyl) (meth) acrylamide, N- (2-dimethylaminopropyl) (meth) acrylamide, N- (3-dimethylaminopropyl) (meth) acrylamide, styrenesulfonic acid and its sodium salt, 2-acrylamido-2-methylpropanesulfonic acid and its sodium salt, isoprenesulfonic acid and its sodium salt, N, N-dimethylaminopropyl Examples thereof include copolymers of acrylamide and its copolymerizable monomer such as methyl chloride quaternary salt and allylamine. Among the non-hydrophobic monomers, hydrophilic monomers such as polyethylene glycol diacrylate, polyethylene glycol dimethacrylate, and poly (meth) acrylic ester of polyvinyl alcohol can be exemplified as the crosslinkable monomer. The non-hydrophobic monomer contained in the second monomer part is 20% by weight or less, preferably 5% by weight or less, and more preferably 2% by weight or less.
第2モノマー部中の架橋性モノマー(疎水性モノマー、非疎水性モノマーあわせて)の比率は、第2ポリマー層を構成するモノマー部100重量%中に好ましくは1〜40重量%であり、さらに好ましくは5〜20重量%である。第2モノマー部中の架橋性モノマーの比率が40重量%を超えると、粒子が多孔質化して非特異吸着を増加させることがある。 The ratio of the crosslinkable monomer (including the hydrophobic monomer and the non-hydrophobic monomer) in the second monomer part is preferably 1 to 40% by weight in 100% by weight of the monomer part constituting the second polymer layer, Preferably, it is 5 to 20% by weight. When the ratio of the crosslinkable monomer in the second monomer part exceeds 40% by weight, the particles may become porous and increase nonspecific adsorption.
重合開始剤としては、水への溶解性の観点から分類すると、油溶性重合開始剤が好ましい。水溶性の重合開始剤を用いると複合粒子表面での重合でなく、磁性体被覆粒子を含まない疎水性モノマーのみが重合した新粒子が多量に生じる傾向がある。 The polymerization initiator is preferably an oil-soluble polymerization initiator from the viewpoint of solubility in water. When a water-soluble polymerization initiator is used, there is a tendency that not only polymerization on the surface of the composite particles but a large amount of new particles in which only a hydrophobic monomer not containing magnetic substance-coated particles is polymerized is generated.
油溶性重合開始剤としては、ベンゾイルペルオキシド、ラウロイルペルオキシド、ターシャリーブチルペルオキシ2−エチルヘキサネート、3,5,5−トリメチルヘキサノイルペルオキシド、アゾビスイソブチロニトリル等の過酸化化合物、アゾ化合物などを挙げることができる。 Examples of oil-soluble polymerization initiators include benzoyl peroxide, lauroyl peroxide, tertiary butyl peroxy 2-ethylhexanate, 3,5,5-trimethylhexanoyl peroxide, peroxide compounds such as azobisisobutyronitrile, azo compounds, etc. Can be mentioned.
水溶性開始剤としては、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム、過硫酸ナトリウム等の過硫酸塩、過酸化水素、2−2アゾビス(2−アミノプロパン)鉱酸塩、アゾビスシアノ吉草酸およびそのアルカリ金属塩およびアンモニウム塩等があげられ、また、過硫酸塩、過酸化水素塩と重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、塩化第一鉄等を組み合わせたレドックス開始剤もあげられ、中でも過硫酸塩が好適に用いられる。これらの重合開始剤のモノマー全体に対する割合は0.01〜8重量%の範囲が好適に用いられる。 Water-soluble initiators include potassium persulfate, ammonium persulfate, persulfates such as sodium persulfate, hydrogen peroxide, 2-2 azobis (2-aminopropane) mineral acid salt, azobiscyanovaleric acid and its alkali metal salts, and Examples thereof include ammonium salts, and redox initiators in which persulfate, hydrogen peroxide salt and sodium bisulfite, sodium thiosulfate, ferrous chloride, etc. are combined. Among them, persulfate is preferably used. . The ratio of these polymerization initiators to the whole monomer is preferably in the range of 0.01 to 8% by weight.
乳化剤としては、通常使用されている陰イオン性乳化剤または非イオン性乳化剤、カチオン性乳化剤等を単独もしくは組み合わせて用いることができる。例えば陰イオン性乳化剤としては、高級アルコール硫酸エステルのアルカリ金属塩、アルキルベンゼンスルホン酸のアルカリ金属塩、コハク酸ジアルキルエステルスルホン酸のアルカリ金属塩、アルキルジフェニルエーテルジスルホン酸のアルカリ金属塩、ポリオキシエチレンアルキル(またはアルキルフェニル)エーテルの硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキル(またはアルキルフェニル)エーテルのリン酸エステル塩、ナフタレンスルホン酸ナトリウムのホルマリン縮合物などの陰イオン性乳化剤の他、エレミノールJS−2、JS−5〔製品名、三洋化成(株)製〕、ラテムルS−120、S−180A、S−180、PD−104〔製品名、花王(株)製〕、アクアロンHS−10、HS−20、KH−10〔製品名、第一工業製薬(株)製〕、アデカリアソープSE−10N、SR−10〔製品名、旭電化工業(株)製〕などの反応性乳化剤などを挙げることができる。 As the emulsifier, a commonly used anionic emulsifier, nonionic emulsifier, cationic emulsifier or the like can be used alone or in combination. Examples of anionic emulsifiers include alkali metal salts of higher alcohol sulfates, alkali metal salts of alkylbenzene sulfonic acids, alkali metal salts of dialkyl ester succinic acids, alkali metal salts of alkyl diphenyl ether disulfonic acids, polyoxyethylene alkyl ( In addition to anionic emulsifiers such as sulfate esters of alkylphenyl) ether, phosphate esters of polyoxyethylene alkyl (or alkylphenyl) ether, and formalin condensates of sodium naphthalenesulfonate, Eleminol JS-2, JS- 5 [Product name, manufactured by Sanyo Chemical Co., Ltd.], Latemuru S-120, S-180A, S-180, PD-104 [Product name, manufactured by Kao Corporation], Aqualon HS-10, HS-20, KH -10 [Product name, 1st Work Pharmaceutical Co., Ltd.], ADEKAREASOAP SE-10N, SR-10 [product name, and the like can be mentioned reactive emulsifier such as Asahi Denka Kogyo Co., Ltd.].
また、非イオン性乳化剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルなどのほか、アクアロンRS−20(第一工業製薬(株)製)、アデカリアソープNE−20(旭電化工業(株)製)などの反応性非イオン性乳化剤を挙げることができる。 Examples of nonionic emulsifiers include polyoxyethylene alkyl ether and polyoxyethylene alkylphenyl ether, Aqualon RS-20 (manufactured by Daiichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.), Adekari Soap NE-20 (Asahi Denka). And reactive nonionic emulsifiers such as those manufactured by Kogyo Co., Ltd.
また、カチオン性乳化剤としては、アルキルアミン(塩)、ポリオキシエチレンアルキルアミン(塩)、第4級アルキルアンモニウム(塩)、アルキルピリジニウム(塩)などを挙げることができる。 Examples of the cationic emulsifier include alkylamine (salt), polyoxyethylene alkylamine (salt), quaternary alkylammonium (salt), alkylpyridinium (salt), and the like.
第2ポリマー層の形成における重合系へのモノマーの添加方法は、とくに制限されず、一括方式、分割方式あるいは連続添加方式のいずれであっても良い。重合温度は重合開始剤によって異なるが、通常10〜90℃好ましくは30〜85℃であり、重合に要する時間は通常1〜30時間程度である。 The method for adding the monomer to the polymerization system in the formation of the second polymer layer is not particularly limited, and may be any of a batch method, a division method, or a continuous addition method. The polymerization temperature varies depending on the polymerization initiator, but is usually 10 to 90 ° C, preferably 30 to 85 ° C, and the time required for the polymerization is usually about 1 to 30 hours.
また、第2ポリマー層の厚さは、好ましくは0.005〜20μmであり、より好ましくは0.01〜5μmである。また、第2ポリマー層は磁性体層を完全に被覆していることが好ましい。 The thickness of the second polymer layer is preferably 0.005 to 20 μm, more preferably 0.01 to 5 μm. The second polymer layer preferably completely covers the magnetic layer.
本実施形態に係る磁性粒子において、第2ポリマー層が磁性母粒子の最外層を構成することにより、超常磁性微粒子の漏出を防止することができる。特に、本実施形態に係る磁性粒子において、磁性母粒子が核粒子と、核粒子の表面に形成された超常磁性微粒子を含む磁性体層とを含む場合、第2ポリマー層が磁性母粒子の最外層を構成することにより、超常磁性微粒子の漏出を効果的に防止することができる。 In the magnetic particles according to this embodiment, leakage of superparamagnetic fine particles can be prevented by the second polymer layer constituting the outermost layer of the magnetic mother particles. In particular, in the magnetic particle according to the present embodiment, when the magnetic base particle includes a core particle and a magnetic layer including superparamagnetic fine particles formed on the surface of the core particle, the second polymer layer is the top of the magnetic base particle. By constituting the outer layer, leakage of superparamagnetic fine particles can be effectively prevented.
1.3.非磁性子粒子
非磁性子粒子は基本的に非磁性物質であり、有機物質および無機物質のいずれも使用可能であるが、好ましくは有機物質である。有機物質の代表例としては、例えばポリマーを挙げることができる。かかるポリマーとしては、上述の核粒子を製造する際に使用できるものを用いることができる。上述のようにモノマー成分を選択することにより、正または負の表面荷電を有する官能基を表面に有する非磁性子粒子を得ることができる。このような官能基としては特に限定されないが、例えば、アミノ基、カルボキシル基、カルボニル基、アルデヒド基、ヒドロキシル基、メルカプト基、スルホン基、イソシアネート基、チオイソシアネート基、エポキシ基、チオエポキシ基、アジリジン基、オキサゾリン基などが挙げられる。
1.3. Non-magnetic child particles Non-magnetic child particles are basically non-magnetic substances, and both organic substances and inorganic substances can be used, but organic substances are preferred. As a typical example of the organic substance, for example, a polymer can be mentioned. As this polymer, what can be used when manufacturing the above-mentioned core particle can be used. By selecting the monomer component as described above, non-magnetic child particles having a functional group having a positive or negative surface charge on the surface can be obtained. Such a functional group is not particularly limited. For example, amino group, carboxyl group, carbonyl group, aldehyde group, hydroxyl group, mercapto group, sulfone group, isocyanate group, thioisocyanate group, epoxy group, thioepoxy group, aziridine group And an oxazoline group.
非磁性子粒子の粒径は、磁性母粒子の粒径dに対してd/2以下であり、好ましくはd/100〜d/4であり、より好ましくはd/50〜d/6である。非磁性子粒子の粒径がd/2を超えると、非磁性子粒子が磁性母粒子に吸着しないことがあり、また、吸着したとしても生化学物質結合量が劣ることがある。 The particle size of the non-magnetic child particles is d / 2 or less, preferably d / 100 to d / 4, more preferably d / 50 to d / 6 with respect to the particle size d of the magnetic mother particles. . If the particle size of the non-magnetic child particles exceeds d / 2, the non-magnetic child particles may not be adsorbed to the magnetic mother particles, and even if adsorbed, the biochemical substance binding amount may be inferior.
本実施形態に係る磁性粒子において、1つの磁性母粒子の表面上に存在する複数の非磁性子粒子のCV(Coefficient of Variation)値は、30%以下、好ましくは20%以下、より好ましくは10%以下である。 In the magnetic particle according to the present embodiment, the CV (Coefficient of Variation) value of a plurality of non-magnetic child particles present on the surface of one magnetic mother particle is 30% or less, preferably 20% or less, more preferably 10 % Or less.
上述したように、非磁性子粒子は磁性母粒子の表面を被覆するように設けられる。ここで、非磁性子粒子を磁性母粒子の表面に設ける方法としては、磁性母粒子の表面に非磁性子粒子を物理的に吸着させる方法のほか、クーロン引力を用いる方法が好適である。クーロン引力を用いる方法としては、例えば、水系媒体中で正または負の表面荷電を有する磁性母粒子と、これと逆の表面荷電(負または正)を有する非磁性子粒子とを水系媒体中で混合する工程が挙げられる。中でも、(i)カルボキシル基など常用される、アニオン性官能基を磁性粒子表面に容易に導入可能であり、(ii)DNAなどのアニオン性生体物質の非特異的吸着が少なくなるという点で、磁性母粒子が正の表面荷電を有することが好ましい。この場合、正の表面荷電を有する磁性母粒子と負の表面荷電を有する非磁性子粒子とを水系媒体中で混合することにより、磁性母粒子の表面に非磁性子粒子を吸着させる。ここで、水系媒体としては、磁性粒子の欄で例示したものを使用することができる。 As described above, the nonmagnetic child particles are provided so as to cover the surfaces of the magnetic mother particles. Here, as a method of providing the nonmagnetic child particles on the surface of the magnetic mother particles, a method of using a Coulomb attractive force is suitable in addition to a method of physically adsorbing the nonmagnetic child particles on the surface of the magnetic mother particles. As a method using the Coulomb attractive force, for example, a magnetic mother particle having a positive or negative surface charge in an aqueous medium and a non-magnetic child particle having a reverse surface charge (negative or positive) in the aqueous medium are used. The process of mixing is mentioned. Among them, (i) a commonly used anionic functional group such as a carboxyl group can be easily introduced on the surface of the magnetic particle, and (ii) nonspecific adsorption of anionic biological substances such as DNA is reduced. It is preferable that the magnetic mother particle has a positive surface charge. In this case, magnetic mother particles having a positive surface charge and nonmagnetic child particles having a negative surface charge are mixed in an aqueous medium to adsorb the nonmagnetic child particles on the surface of the magnetic mother particles. Here, as the aqueous medium, those exemplified in the column of magnetic particles can be used.
磁性母粒子および非磁性子粒子の表面荷電を正または負に調整する方法は、公知のコロイド界面化学的手法を用いればよく、例えば、以下の(a)〜(f)の方法を使用することができる。 As a method for adjusting the surface charge of the magnetic mother particle and the non-magnetic child particle to be positive or negative, a known colloid interfacial chemical method may be used. For example, the following methods (a) to (f) are used. Can do.
(a)水系媒体中で正の表面荷電を有する磁性母粒子を作製する方法としては、例えば、(i)酸化鉄系の超常磁性微粒子を表面処理せずに使用することにより該超常磁性微粒で核粒子を被覆し、該超常磁性微粒子の等電点(通常pH9.5程度)未満の水分散体とする方法、(ii)N−β(アミノエチル)γ−アミノプロピルトリメトキシシランなどのアミン系シランカップリング剤で表面処理した超常磁性微粒子を使用する方法、(iii)第2ポリマー層の形成時に、重合性モノマーとしてN,N−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドなどのカチオン基を有するモノマーを使用し、かつ/または、副原料として2,2’−アゾビス(2−メチルプロピオンアミジン)2塩酸塩などのカチオン基を有する開始剤を使用し、かつ/または、乳化剤としてカチオン性乳化剤を使用して重合を行う方法などが挙げられる。 (A) As a method for producing magnetic mother particles having a positive surface charge in an aqueous medium, for example, (i) using superparamagnetic fine particles by using iron oxide-based superparamagnetic fine particles without surface treatment; A method of coating the core particles to form an aqueous dispersion having an isoelectric point (usually about pH 9.5) of the superparamagnetic fine particles, (ii) an amine such as N-β (aminoethyl) γ-aminopropyltrimethoxysilane (Iii) a monomer having a cationic group such as N, N-dimethylaminopropylacrylamide is used as a polymerizable monomer when forming the second polymer layer. And / or using an initiator having a cationic group such as 2,2′-azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride as an auxiliary material, and / or The method of performing polymerization using a cationic emulsifier as an emulsifier can be mentioned.
(b)水系媒体中で負の表面荷電を有する磁性母粒子を作製する方法としては、例えば、(i)酸化鉄系の超常磁性微粒子を表面処理せずに使用することにより該超常磁性微粒で核粒子を被覆し、該超常磁性微粒子の等電点(通常pH9.5程度)を越える水分散体とする方法、(ii)長鎖脂肪酸などで表面処理した超常磁性微粒子を使用する方法、(iii)第2ポリマー層の形成時に、重合性モノマーとしてメタクリル酸などのアニオン基を有するモノマーを使用し、および/または、副原料として過硫酸カリウムなどのアニオン基を有する開始剤を使用し、および/または、乳化剤としてアニオン性乳化剤を使用して重合を行う方法などが挙げられる。 (B) As a method for producing magnetic mother particles having a negative surface charge in an aqueous medium, for example, (i) using superparamagnetic fine particles by using iron oxide-based superparamagnetic fine particles without surface treatment. (Ii) a method of using superparamagnetic fine particles surface-treated with a long-chain fatty acid or the like, covering the core particles to form an aqueous dispersion exceeding the isoelectric point (usually about pH 9.5) of the superparamagnetic fine particles; iii) using a monomer having an anionic group such as methacrylic acid as a polymerizable monomer and / or using an initiator having an anionic group such as potassium persulfate as an auxiliary material when forming the second polymer layer; and A method of performing polymerization by using an anionic emulsifier as an emulsifier may be used.
(c)非磁性子粒子がポリマーからなる場合、水系媒体中で正の表面荷電を有する非磁性子粒子を作製する方法としては、ポリマー粒子の重合時に、重合性モノマーとしてN,N−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドなどのカチオン基を有するモノマーを使用し、かつ/または、副原料として2,2’−アゾビス(2−メチルプロピオンアミジン)2塩酸塩などのカチオン基を有する開始剤を使用し、かつ/または、乳化剤としてカチオン性乳化剤を使用して重合を行う方法が挙げられる。 (C) When the nonmagnetic child particles are made of a polymer, a method for producing nonmagnetic child particles having a positive surface charge in an aqueous medium includes N, N-dimethylamino as a polymerizable monomer during polymerization of the polymer particles. Using a monomer having a cationic group such as propylacrylamide and / or using an initiator having a cationic group such as 2,2′-azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride as an auxiliary material, and / or Or the method of superposing | polymerizing using a cationic emulsifier as an emulsifier is mentioned.
(d)非磁性子粒子が酸化金属からなる場合、水系媒体中で正の表面荷電を有する非磁性子粒子を作製する方法としては、酸化金属の等電点を越える水分散体とする方法が挙げられる。 (D) When the nonmagnetic child particles are made of a metal oxide, a method for producing a nonmagnetic child particle having a positive surface charge in an aqueous medium is a method of forming an aqueous dispersion exceeding the isoelectric point of the metal oxide. Can be mentioned.
(e)非磁性子粒子がポリマーからなる場合、水系媒体中で負の表面荷電を有する非磁性子粒子を作製する方法としては、ポリマー粒子の重合時に、重合性モノマーとしてメタクリル酸などのアニオン基を有するモノマーを使用し、かつ/または、副原料として過硫酸カリウムなどのアニオン基を有する開始剤を使用し、かつ/または、乳化剤としてカチオン性乳化剤を使用して重合を行う方法が挙げられる。 (E) When the non-magnetic child particles are made of a polymer, a method for producing non-magnetic child particles having a negative surface charge in an aqueous medium includes an anionic group such as methacrylic acid as a polymerizable monomer during polymerization of the polymer particles. And / or using an initiator having an anionic group such as potassium persulfate as an auxiliary material and / or using a cationic emulsifier as an emulsifier.
(f)非磁性子粒子が酸化金属からなる場合、水系媒体中で負の表面荷電を有する非磁性子粒子を作製する方法としては、酸化金属の等電点未満の水分散体とする方法が挙げられる。 (F) When the nonmagnetic child particles are made of a metal oxide, a method for producing a nonmagnetic child particle having a negative surface charge in an aqueous medium is a method of forming an aqueous dispersion having a lower isoelectric point of the metal oxide. Can be mentioned.
磁性母粒子の表面に非磁性子粒子を吸着させるためには、水系媒体中で正の表面荷電を有する磁性母粒子と、負の表面荷電を有する非磁性子粒子とを水系媒体中で混合するのがより好ましく、上記(a)〜(c)の方法により作製された水系媒体中で正の表面荷電を有する磁性母粒子と、上記(e)の方法により作製された負の表面荷電を有する非磁性子粒子とを水系媒体中で混合するのがさらに好ましい。このような工程を採用することにより、鉄イオンなどの生化学反応妨害物質の溶出がよりいっそう少なくなり、かつ、生化学物質結合量がよりいっそう多くなる。 In order to adsorb non-magnetic child particles on the surface of magnetic mother particles, magnetic mother particles having a positive surface charge and non-magnetic child particles having a negative surface charge are mixed in an aqueous medium. More preferably, the magnetic mother particles having a positive surface charge in the aqueous medium produced by the methods (a) to (c) above and the negative surface charge produced by the method (e) above. More preferably, the non-magnetic child particles are mixed in an aqueous medium. By adopting such a process, the elution of biochemical reaction interfering substances such as iron ions is further reduced, and the biochemical substance binding amount is further increased.
水系媒体中で正または負の表面荷電を有する磁性母粒子と、これと逆の表面荷電を有する非磁性子粒子とを水系媒体中で混合する工程では、非磁性子粒子を攪拌および/または超音波分散しながら、磁性母粒子を徐々に加えていく方法が好ましい。また、磁性母粒子と非磁性子粒子との混合比率はそれぞれの粒径の比によって異なるが、非磁性子粒子の吸着が完了した状態で、なお、吸着していない非磁性子粒子が残留するような比率であると分散系が安定するため、本実施形態に係る磁性粒子の作製が容易となる。なお、残留した非磁性子粒子は、磁気分離により、本実施形態に係る磁性粒子と容易に分離精製することができる。 In the step of mixing the magnetic mother particles having a positive or negative surface charge in the aqueous medium and the nonmagnetic child particles having the opposite surface charge in the aqueous medium, the nonmagnetic child particles are stirred and / or super A method of gradually adding the magnetic mother particles while dispersing the sound waves is preferable. Further, the mixing ratio of the magnetic mother particles and the non-magnetic child particles varies depending on the ratio of the respective particle sizes, but the non-magnetic child particles that are not adsorbed remain in the state where the adsorption of the non-magnetic child particles is completed. When the ratio is such, the dispersion system is stabilized, and thus the magnetic particles according to this embodiment can be easily produced. The remaining nonmagnetic child particles can be easily separated and purified from the magnetic particles according to the present embodiment by magnetic separation.
水系媒体中で正または負の表面荷電を有する磁性母粒子と、これと逆の表面荷電を有する非磁性子粒子とを水系媒体中で混合する工程では、非磁性子粒子の結合を促進するイオン性化合物を添加することが好ましい。このようなイオン性化合物としては、磁性母粒子が正の表面荷電を有する場合、塩酸、硝酸、硫酸などの酸性化合物を、磁性母粒子が負の表面荷電を有する場合、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなどの塩基性化合物をそれぞれ例示することができる。 In the step of mixing a magnetic mother particle having a positive or negative surface charge in an aqueous medium and a non-magnetic child particle having a surface charge opposite to this in the aqueous medium, ions that promote binding of the non-magnetic child particles It is preferable to add a functional compound. Such ionic compounds include acidic compounds such as hydrochloric acid, nitric acid and sulfuric acid when the magnetic mother particles have a positive surface charge, and sodium hydroxide and hydroxide when the magnetic mother particles have a negative surface charge. Examples include basic compounds such as potassium and ammonia.
磁性母粒子の表面に非磁性子粒子が吸着する様式は、非磁性子粒子がなるべく多く吸着した一層吸着が好ましい。このような吸着様式であると生化学物質結合量がよりいっそう多く、かつ、非特異な生化学物質の結合が少なくなり、ノイズが減少する。 The mode in which the nonmagnetic child particles are adsorbed on the surface of the magnetic mother particles is preferably one-layer adsorption in which as many nonmagnetic child particles as possible are adsorbed. In such an adsorption mode, the amount of biochemical substance binding is further increased, and the binding of non-specific biochemical substances is reduced, thereby reducing noise.
1.4.第1ポリマー層
本実施形態に係る磁性粒子は、磁性母粒子および非磁性子粒子の露出面を被覆する第1ポリマー層を含む。この第1ポリマー層は、酸素原子、窒素原子および硫黄原子からなる群より選ばれた少なくとも1種の原子を1個以上含む。また、この極性基は、グリシジル基を有する第1ポリマー層を磁性母粒子および非磁性子粒子を被覆するように形成し、この第1ポリマー層のグリシジル基を化学修飾することにより得ることができる。
1.4. First Polymer Layer The magnetic particles according to this embodiment include a first polymer layer that covers the exposed surfaces of the magnetic mother particles and the nonmagnetic child particles. The first polymer layer includes at least one atom selected from the group consisting of oxygen atom, nitrogen atom and sulfur atom. The polar group can be obtained by forming a first polymer layer having a glycidyl group so as to cover the magnetic mother particles and the nonmagnetic child particles, and chemically modifying the glycidyl group of the first polymer layer. .
1.4.1.第1ポリマー層の構成および形成方法
まず、グリシジル基を有する第1ポリマー層(以下、単に「第1ポリマー層」ともいう)の構成およびその形成方法について述べる。第1ポリマー層は上述したように、磁性母粒子および非磁性子粒子を被覆するように設けられている。
1.4.1. Configuration and Forming Method of First Polymer Layer First, a configuration of a first polymer layer having a glycidyl group (hereinafter, also simply referred to as “first polymer layer”) and a forming method thereof will be described. As described above, the first polymer layer is provided so as to cover the magnetic mother particles and the nonmagnetic child particles.
また、磁性母粒子の表面を第2ポリマー層が構成する場合、第2ポリマー層ならびに第2ポリマー層を被覆する非磁性子粒子を被覆するように、第1ポリマー層を設けることができる。 Further, when the surface of the magnetic mother particle is constituted by the second polymer layer, the first polymer layer can be provided so as to cover the second polymer layer and the nonmagnetic child particles covering the second polymer layer.
第1ポリマー層は、好適な低非特異吸着性の粒子表面を形成するための官能基導入を主目的とする。低非特異吸着性の粒子表面は、例えばプローブ結合用磁性粒子の表面として好適である。また、第1ポリマー層は、磁性母粒子の表面に非磁性子粒子を固定させる機能を有する。 The primary purpose of the first polymer layer is to introduce a functional group for forming a suitable low non-specific adsorptive particle surface. The particle surface with low nonspecific adsorption is suitable, for example, as the surface of magnetic particles for probe binding. Further, the first polymer layer has a function of fixing nonmagnetic child particles on the surface of the magnetic mother particles.
第1ポリマー層を形成するためのモノマー(以下、「第1モノマー部」ともいう)は、20重量%以上のグリシジル基含有モノマーを含み、好ましくは40重量%以上のグリシジル基含有モノマーを含み、さらに好ましくは80重量%以上のグリシジル基含有モノマーを含む。第1ポリマー層を構成するその他のモノマーとしては、上記第2モノマー部に使用するモノマーとして例示したものを使用することができる。所定量のグリシジル基含有モノマーを含む第1モノマー部を重合することにより、2以上のグリシジル基を有する第1ポリマー層を得ることができる。第1ポリマー層に含まれるグリシジル基は通常2以上である。 The monomer for forming the first polymer layer (hereinafter also referred to as “first monomer part”) contains 20% by weight or more of glycidyl group-containing monomer, preferably 40% by weight or more of glycidyl group-containing monomer, More preferably, it contains 80% by weight or more of a glycidyl group-containing monomer. As another monomer which comprises a 1st polymer layer, what was illustrated as a monomer used for the said 2nd monomer part can be used. By polymerizing the first monomer portion containing a predetermined amount of the glycidyl group-containing monomer, a first polymer layer having two or more glycidyl groups can be obtained. The number of glycidyl groups contained in the first polymer layer is usually 2 or more.
第1ポリマー層は、第2ポリマー層の形成方法と基本的に同様の方法にて形成することができる。すなわち、第2ポリマー層が表面に形成された磁性母粒子の存在下で、副原料である重合開始剤、乳化剤、分散剤、電解質、架橋剤、分子量調節剤などが必要に応じて添加された液体中で、主原料である第1モノマー部の重合を行うことにより、第1ポリマー層を形成することができる。 The first polymer layer can be formed by basically the same method as the method for forming the second polymer layer. That is, in the presence of the magnetic mother particles having the second polymer layer formed on the surface, auxiliary materials such as a polymerization initiator, an emulsifier, a dispersant, an electrolyte, a crosslinking agent, and a molecular weight modifier were added as necessary. The first polymer layer can be formed by polymerizing the first monomer part as the main raw material in the liquid.
ここで、グリシジル基を含む共重合性モノマーとしては、グリシジルアクリレート、グリシジルメタクリレート、アリルグリシジルエーテル等を例示できる。 Here, examples of the copolymerizable monomer containing a glycidyl group include glycidyl acrylate, glycidyl methacrylate, and allyl glycidyl ether.
第1モノマー部には、架橋性モノマーがさらに含まれることが好ましく、その比率は、第1モノマー部100重量%中に好ましくは1〜40重量%であり、さらに好ましくは5〜20重量%である。第1モノマー部中の架橋性モノマーの比率が40重量%を超えると、粒子が多孔質化して非特異吸着を増加させることがある。 The first monomer part preferably further contains a crosslinkable monomer, and the ratio thereof is preferably 1 to 40% by weight, more preferably 5 to 20% by weight in 100% by weight of the first monomer part. is there. When the ratio of the crosslinkable monomer in the first monomer portion exceeds 40% by weight, the particles may become porous and increase nonspecific adsorption.
第1ポリマー層の形成における重合系へのモノマーの添加方法は、とくに制限されず、一括方式、分割方式あるいは連続添加方式のいずれであっても良い。重合温度は重合開始剤によって異なるが、通常10〜90℃好ましくは30〜85℃であり、重合に要する時間は通常1〜30時間程度である。 The method for adding the monomer to the polymerization system in the formation of the first polymer layer is not particularly limited, and may be any of a batch method, a division method, or a continuous addition method. The polymerization temperature varies depending on the polymerization initiator, but is usually 10 to 90 ° C, preferably 30 to 85 ° C, and the time required for the polymerization is usually about 1 to 30 hours.
第1ポリマー層の厚さは、第2ポリマー層に比較して薄くすることが可能であり、好ましくは0.005〜5μmであり、より好ましくは0.005〜1μmである。 The thickness of the first polymer layer can be made thinner than that of the second polymer layer, and is preferably 0.005 to 5 μm, more preferably 0.005 to 1 μm.
1.4.2.第1ポリマー層への極性基の導入
第3の工程すなわち第1ポリマー層への極性基の導入は例えば、第1ポリマー層中のグリシジル基を化学修飾することにより行うことができる。第3の工程は例えば以下の反応を含むことができる。これらの反応は2以上を組み合わせても良い。
(a)アミノ基を導入する反応、
(b)アルデヒド基を導入する反応、
(c)−1.カルボキシル基を導入する反応、
(c)−2.カルボキシル基を導入した後、該カルボキシル基を活性エステル基に変換する反応
1.4.2. Introduction of polar groups into the first polymer layer The third step, that is, introduction of polar groups into the first polymer layer can be carried out, for example, by chemically modifying the glycidyl groups in the first polymer layer. The third step can include, for example, the following reaction. Two or more of these reactions may be combined.
(A) a reaction for introducing an amino group,
(B) a reaction for introducing an aldehyde group,
(C) -1. Reaction to introduce a carboxyl group,
(C) -2. Reaction that converts carboxyl group into active ester group after introducing carboxyl group
すなわち、第1ポリマー層のグリシジル基を化学修飾することにより、酸素原子、窒素原子および硫黄原子からなる群より選ばれた少なくとも1種の原子を1個以上含む極性基を導入することができる。ここで、前記極性基はプローブと反応可能な官能基であることが好ましく、例えば、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、および活性エステル基から選択される少なくとも1つであることが好ましい。例えば、得られた磁性粒子の第1ポリマー層が前記極性基および後述する2,3−ジヒドロキシプロピル基を有する場合、プローブとの結合性が良好であり、かつ、非特異吸着が少ない。 That is, by chemically modifying the glycidyl group of the first polymer layer, a polar group containing at least one kind of atom selected from the group consisting of an oxygen atom, a nitrogen atom and a sulfur atom can be introduced. Here, the polar group is preferably a functional group capable of reacting with the probe, for example, at least one selected from an amino group, an aldehyde group, a carboxyl group, and an active ester group. For example, when the first polymer layer of the obtained magnetic particles has the polar group and a 2,3-dihydroxypropyl group described later, the binding property with the probe is good and non-specific adsorption is small.
以下、上記反応について順に述べる。 Hereinafter, the above reactions will be described in order.
1.4.2−1.アミノ基を導入する反応
(a)アミノ基を導入する反応は、より具体的には、グリシジル基を有する第1ポリマー層が形成された粒子にアミノ化剤を作用させることにより、第1ポリマー層にアミノ基を導入する反応である。この反応により、アミノ基導入磁性粒子が得られる。このアミノ基導入磁性粒子は、プローブ結合用として好適に用いることができる。
1.4.2.1-1. Reaction for Introducing Amino Group (a) More specifically, the reaction for introducing an amino group is performed by causing an aminating agent to act on the particles on which the first polymer layer having a glycidyl group is formed. This is a reaction for introducing an amino group. By this reaction, amino group-introduced magnetic particles are obtained. This amino group-introduced magnetic particle can be suitably used for probe binding.
アミノ化剤としては、例えば、アンモニア、分子中に2個のアミノ基を有する有機化合物(ジアミン)、あるいは、分子中に3個以上のアミノ基を有する有機化合物を挙げることができ、分子中に2個以上のアミノ基を有する有機化合物がより好ましい。 Examples of the aminating agent include ammonia, an organic compound having two amino groups in the molecule (diamine), or an organic compound having three or more amino groups in the molecule. An organic compound having two or more amino groups is more preferable.
ここで、ジアミンとしては、エチレンジアミン、プロピレンジアミン、o−フェニレンジアミンなどの1級ジアミンなどが挙げられる。また、分子中に3個以上のアミノ基を有する有機化合物としては、1,2,3−トリアミノプロパン、テトラ(アミノメチル)メタン、1,3,5-トリアミノベンゼン、1,2,3,4−テトラアミノベンゼンなどが挙げられる。 Here, examples of the diamine include primary diamines such as ethylenediamine, propylenediamine, and o-phenylenediamine. Examples of organic compounds having three or more amino groups in the molecule include 1,2,3-triaminopropane, tetra (aminomethyl) methane, 1,3,5-triaminobenzene, 1,2,3. , 4-tetraaminobenzene and the like.
アミノ基を導入する反応は、乾燥粒子をそのままアミノ化剤に分散させて実施してもよいし、あるいは、粒子を水系溶媒に分散させた状態で実施しても良い。水系溶媒とは、水溶性有機溶媒と水との混合溶媒、あるいは、水である。ここで、水溶性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、アセトン、ジメチルホルムアミドなどを例示できる。アミノ基を導入する反応の好ましい温度、時間は、第1ポリマー層中のグリシジル基の濃度、溶媒の有無、溶媒の種類などによって異なるが、通常、4℃〜100℃、好ましくは、20℃〜80℃で、通常、10分〜48時間、好ましくは、1時間〜24時間である。なお、アミノ基を導入する反応では、全てのグリシジル基がアミノ化される必要はない。 The reaction for introducing an amino group may be carried out by dispersing the dried particles in the aminating agent as they are, or may be carried out in a state where the particles are dispersed in an aqueous solvent. The aqueous solvent is a mixed solvent of a water-soluble organic solvent and water, or water. Here, examples of the water-soluble organic solvent include methanol, ethanol, acetone, dimethylformamide and the like. The preferable temperature and time for the reaction for introducing the amino group vary depending on the concentration of the glycidyl group in the first polymer layer, the presence or absence of the solvent, the type of the solvent, etc., but usually 4 ° C to 100 ° C, preferably 20 ° C to At 80 ° C., it is usually 10 minutes to 48 hours, preferably 1 hour to 24 hours. In the reaction for introducing an amino group, it is not necessary that all glycidyl groups are aminated.
本実施形態に係る磁性粒子におけるアミノ基の量は、好ましくは0.1μmol/g〜100μmol/gであり、より好ましくは0.5μmol/g〜50μmol/gである。アミノ基の量が0.1μmol未満ではプローブの結合量が少なくなりシグナルが劣る場合があり、100μmol/gを超えると非特異吸着が増える場合がある。 The amount of amino groups in the magnetic particles according to this embodiment is preferably 0.1 μmol / g to 100 μmol / g, more preferably 0.5 μmol / g to 50 μmol / g. When the amount of amino group is less than 0.1 μmol, the amount of binding of the probe decreases and the signal may be inferior, and when it exceeds 100 μmol / g, nonspecific adsorption may increase.
アミノ基を導入する反応の前に、2以上のグリシジル基の一部を加水分解してもよい。また、アミノ基を導入する反応と同時に、2以上のグリシジル基の一部を加水分解してもよい。あるいは、アミノ基を導入する反応の後に、残留する2以上のグリシジル基の全てあるいは一部を加水分解してもよい。 Prior to the reaction for introducing an amino group, a part of two or more glycidyl groups may be hydrolyzed. Moreover, you may hydrolyze a part of two or more glycidyl groups simultaneously with reaction which introduce | transduces an amino group. Alternatively, after the reaction for introducing an amino group, all or part of the remaining two or more glycidyl groups may be hydrolyzed.
グリシジル基を加水分解することにより、2,3−ジヒドロキシプロピル基が生成する。第1ポリマー層が2,3−ジヒドロキシプロピル基を有することにより、非特異吸着を低減することができる。グリシジル基の加水分解は、例えば、水系溶媒中で適当な酸触媒または塩基触媒によって進行する。好ましくは、アミノ基を導入する反応の前または後に、水溶媒中で、硫酸などの酸触媒を用いてグリシジル基を加水分解する。これにより、加水分解を速やかにかつ確実に行うことができる。この場合、加水分解の好ましい温度は、通常4℃〜100℃、好ましくは20℃〜80℃であり、加水分解の好ましい時間は、通常5分〜24時間、好ましくは30分〜12時間である。 By hydrolyzing the glycidyl group, a 2,3-dihydroxypropyl group is generated. When the first polymer layer has 2,3-dihydroxypropyl groups, nonspecific adsorption can be reduced. The hydrolysis of the glycidyl group proceeds, for example, with an appropriate acid catalyst or base catalyst in an aqueous solvent. Preferably, before or after the reaction for introducing the amino group, the glycidyl group is hydrolyzed in an aqueous solvent using an acid catalyst such as sulfuric acid. Thereby, hydrolysis can be performed promptly and reliably. In this case, the preferred temperature for hydrolysis is usually 4 ° C. to 100 ° C., preferably 20 ° C. to 80 ° C., and the preferred time for hydrolysis is usually 5 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 12 hours. .
アミノ基を導入する反応によって得られる磁性粒子の一例としては、例えば、粒径dの磁性母粒子と、磁性母粒子の表面上に存在する粒径d/2以下の非磁性子粒子と、磁性母粒子および非磁性子粒子を被覆するように設けられた、アミノ基および2,3−ジヒドロキシプロピル基を有する第1ポリマー層とを含む磁性粒子が挙げられる。ここで、磁性母粒子は、核粒子と、核粒子の表面に形成された超常磁性微粒子を含む磁性体層と、磁性体層の表面に設けられた疎水性の第2ポリマー層とを含み、第1ポリマー層は、第2ポリマー層および非磁性子粒子を被覆するように設けられることができる。第1ポリマー層がアミノ基および2,3−ジヒドロキシプロピル基を有することにより、プローブとの結合性が良好であり、かつ、非特異吸着が非常に少ない。 Examples of magnetic particles obtained by the reaction for introducing an amino group include, for example, a magnetic mother particle having a particle size d, a nonmagnetic child particle having a particle size of d / 2 or less present on the surface of the magnetic mother particle, and magnetic properties. Examples thereof include magnetic particles including a first polymer layer having an amino group and a 2,3-dihydroxypropyl group provided so as to cover the mother particle and the nonmagnetic child particle. Here, the magnetic mother particle includes a core particle, a magnetic layer containing superparamagnetic fine particles formed on the surface of the core particle, and a hydrophobic second polymer layer provided on the surface of the magnetic layer, The first polymer layer can be provided to cover the second polymer layer and the nonmagnetic child particles. Since the first polymer layer has an amino group and a 2,3-dihydroxypropyl group, the binding property to the probe is good and nonspecific adsorption is very small.
1.4.2−2.アルデヒド基を導入する反応
(b)アルデヒド基を導入する反応は、より具体的には、第1ポリマー層に含まれるグリシジル基を加水分解によりジオール基に変換し、酸化剤を用いて該ジオール基を酸化的開列することにより、アルデヒド基を生成させる反応である。この反応により、アルデヒド基導入磁性粒子が得られる。このアルデヒド基導入磁性粒子は、プローブ結合用として好適に用いることができる。
1.4.2.2. Reaction for Introducing Aldehyde Group (b) More specifically, the reaction for introducing an aldehyde group is performed by converting a glycidyl group contained in the first polymer layer into a diol group by hydrolysis, and using an oxidizing agent to convert the diol group. Is a reaction in which an aldehyde group is generated by oxidative cleavage. By this reaction, aldehyde group-introduced magnetic particles are obtained. The aldehyde group-introduced magnetic particles can be suitably used for probe binding.
グリシジル基の加水分解の条件は、上記(a)アミノ基を導入する反応で説明した通りである。 The conditions for hydrolysis of the glycidyl group are as described in the above (a) reaction for introducing an amino group.
ジオールのアルデヒド化に適する酸化剤としては、過ヨウ素酸、過ヨウ素酸塩、四酢酸鉛などの公知の酸化剤が挙げられる。このうち、過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウムなどの過ヨウ素酸塩は、水系溶媒中で容易に反応が進むため好ましい。 Examples of oxidizing agents suitable for aldehyde aldehydes include known oxidizing agents such as periodic acid, periodate, and lead tetraacetate. Among these, periodates such as sodium periodate and potassium periodate are preferable because the reaction easily proceeds in an aqueous solvent.
アルデヒド基を導入する反応は、過ヨウ素酸塩など水系溶媒が適する酸化剤の場合、例えば、グリシジル基の加水分解の後、洗浄、磁気分離により上清を除き、酸化剤水溶液を加えて、反応を実施することができる。また、四酢酸鉛など有機溶媒が適する酸化剤の場合、グリシジル基を加水分解した後、洗浄、磁気分離により上清を除き、さらに乾燥させた後、酸化剤溶液に乾燥粒子を分散させてアルデヒド化を実施することが好ましい。アルデヒド基を導入する反応の好ましい温度および時間は、第1ポリマー層中のグリシジル基の濃度、加水分解の程度、溶媒の種類などによって異なるが、反応温度は通常4℃〜100℃、好ましくは20℃〜80℃であり、反応時間は通常1分〜12時間、好ましくは10分〜6時間である。なお、アルデヒド基を導入する反応では、全てのグリシジル基がアルデヒド化される必要はない。 The reaction to introduce an aldehyde group is performed when an aqueous solvent such as periodate is an appropriate oxidizing agent. For example, after hydrolysis of the glycidyl group, the supernatant is removed by washing and magnetic separation, and an aqueous oxidizing agent solution is added. Can be implemented. In the case of an oxidizing agent suitable for an organic solvent such as lead tetraacetate, after hydrolyzing the glycidyl group, the supernatant is removed by washing and magnetic separation, and further dried, and then the dried particles are dispersed in the oxidizing agent solution. It is preferable to carry out. The preferred temperature and time of the reaction for introducing the aldehyde group vary depending on the concentration of glycidyl group in the first polymer layer, the degree of hydrolysis, the type of solvent, etc., but the reaction temperature is usually 4 ° C. to 100 ° C., preferably 20 The reaction time is usually 1 minute to 12 hours, preferably 10 minutes to 6 hours. In the reaction for introducing an aldehyde group, not all glycidyl groups need to be aldehyded.
本実施形態に係る磁性粒子におけるアルデヒド基の量は、好ましくは0.1μmol/g〜100μmol/gであり、より好ましくは0.5μmol/g〜50μmol/gである。アルデヒド基の量が0.1μmol未満ではプローブの結合量が少なくなりシグナルが劣る場合があり、100μmol/gを超えると非特異吸着が増える場合がある。 The amount of aldehyde groups in the magnetic particles according to this embodiment is preferably 0.1 μmol / g to 100 μmol / g, more preferably 0.5 μmol / g to 50 μmol / g. When the amount of aldehyde groups is less than 0.1 μmol, the amount of binding of the probe decreases and the signal may be inferior. When it exceeds 100 μmol / g, nonspecific adsorption may increase.
アルデヒド基を導入する反応によって得られる磁性粒子の一例としては、例えば、粒径dの磁性母粒子と、磁性母粒子の表面上に存在する粒径d/2以下の非磁性子粒子と、磁性母粒子および非磁性子粒子を被覆するように設けられた、アルデヒド基および2,3−ジヒドロキシプロピル基を有する第1ポリマー層とを含む磁性粒子が挙げられる。ここで、磁性母粒子は、核粒子と、核粒子の表面に形成された超常磁性微粒子を含む磁性体層と、磁性体層の表面に設けられた疎水性の第2ポリマー層と、を含み、第1ポリマー層は、第2ポリマー層および非磁性子粒子を被覆するように設けられることができる。第1ポリマー層がアルデヒド基および2,3−ジヒドロキシプロピル基を有することにより、アミノ基を有するプローブと混合することにより該プローブと容易に結合するためプローブの結合が容易であり、かつ、非特異吸着が少ない。 Examples of magnetic particles obtained by a reaction for introducing an aldehyde group include, for example, a magnetic mother particle having a particle size d, a non-magnetic child particle having a particle size of d / 2 or less present on the surface of the magnetic mother particle, and magnetic Examples thereof include magnetic particles including a first polymer layer having an aldehyde group and a 2,3-dihydroxypropyl group provided so as to cover the mother particle and the nonmagnetic child particle. Here, the magnetic mother particle includes a core particle, a magnetic layer containing superparamagnetic fine particles formed on the surface of the core particle, and a hydrophobic second polymer layer provided on the surface of the magnetic layer. The first polymer layer can be provided so as to cover the second polymer layer and the non-magnetic child particles. Since the first polymer layer has an aldehyde group and a 2,3-dihydroxypropyl group, it can be easily combined with the probe by mixing with the probe having an amino group, so that the probe can be easily combined and non-specific. Less adsorption.
1.4.2−3.カルボキシル基を導入する反応
(c)−1.カルボキシル基を導入する反応としては、例えば、(i)第1ポリマー層に含まれるグリシジル基にカルボキシル化剤(例えば、ジカルボン酸、アミノカルボン酸、あるいは、分子中に3個以上のカルボキシル基を有する有機化合物)を作用させる反応、(ii)第1ポリマー層に含まれるグリシジル基を加水分解して得られた水酸基に、カルボキシル化剤(例えば、カルボン酸無水物、カルボン酸塩化物)を作用させる反応、(iii)適当な脱水触媒の存在下で、第1ポリマー層に含まれるグリシジル基を加水分解して得られた水酸基に、分子中に2個以上のカルボキシル基を有する有機化合物(例えば、ジカルボン酸、あるいは、分子中に3個以上のカルボキシル基を有する有機化合物)を作用させる反応などが挙げられる。この反応により、カルボキシル基導入磁性粒子が得られる。このカルボキシル基導入磁性粒子は、プローブ結合用として好適に用いることができる。
1.4.2-3. Reaction for introducing carboxyl group (c) -1. Examples of the reaction for introducing a carboxyl group include (i) a carboxylating agent (for example, dicarboxylic acid, aminocarboxylic acid, or three or more carboxyl groups in the molecule) in the glycidyl group contained in the first polymer layer. (Ii) a carboxylating agent (for example, carboxylic acid anhydride, carboxylic acid chloride) is allowed to act on the hydroxyl group obtained by hydrolyzing the glycidyl group contained in the first polymer layer. Reaction, (iii) in the presence of a suitable dehydration catalyst, an organic compound having two or more carboxyl groups in the molecule to a hydroxyl group obtained by hydrolyzing the glycidyl group contained in the first polymer layer (for example, The reaction etc. which make dicarboxylic acid or the organic compound which has a 3 or more carboxyl group in a molecule | numerator act are mentioned. Through this reaction, carboxyl group-introduced magnetic particles are obtained. The carboxyl group-introduced magnetic particles can be suitably used for probe binding.
導入されるカルボキシル基量の制御のしやすさから、上記(ii)の反応が好ましく、(ii)第1ポリマー層に含まれるグリシジル基を加水分解して得られた水酸基に、カルボキシル化剤としてカルボン酸無水物を作用させる反応が特に好ましい。ここで、カルボン酸無水物は、多価カルボン酸無水物であり、その具体例としては、無水イタコン酸、無水コハク酸、無水シトラコン酸、無水ドデセニルコハク酸、無水トリカルバニル酸、無水グルタル酸、無水マレイン酸、無水ヘキサヒドロフタル酸、無水メチルテトラヒドロフタル酸、無水ハイミック酸等の脂肪族ジカルボン酸無水物;1,2,3,4−ブタンテトラカルボン酸二無水物、シクロペンタンテトラカルボン酸二無水物等の脂環族多価カルボン酸二無水物;無水フタル酸、無水ピロメリット酸、無水トリメリット酸、無水ベンゾフェノンテトラカルボン酸等の芳香族多価カルボン酸無水物を挙げることができる。このうち、無水コハク酸、無水マレイン酸、無水フタル酸などの1,2−ジカルボン酸無水物がより好ましい。 The reaction of (ii) above is preferable because of the ease of control of the amount of carboxyl groups introduced, and (ii) a hydroxyl group obtained by hydrolyzing the glycidyl group contained in the first polymer layer is used as a carboxylating agent. A reaction in which a carboxylic anhydride is allowed to act is particularly preferred. Here, the carboxylic acid anhydride is a polyvalent carboxylic acid anhydride, and specific examples thereof include itaconic anhydride, succinic anhydride, citraconic anhydride, dodecenyl succinic anhydride, tricarbanilic anhydride, glutaric anhydride, maleic anhydride. Aliphatic dicarboxylic anhydrides such as acid, hexahydrophthalic anhydride, methyltetrahydrophthalic anhydride, and hymic anhydride; 1,2,3,4-butanetetracarboxylic dianhydride, cyclopentanetetracarboxylic dianhydride And alicyclic polyvalent carboxylic acid dianhydrides such as phthalic anhydride, pyromellitic anhydride, trimellitic anhydride, and benzophenone tetracarboxylic anhydride. Of these, 1,2-dicarboxylic anhydrides such as succinic anhydride, maleic anhydride, and phthalic anhydride are more preferable.
第1ポリマー層に含まれるグリシジル基を加水分解して得られた水酸基に、カルボキシル化剤としてカルボン酸無水物を作用させる具体的な方法としては、例えば、カルボン酸無水物を溶解させた有機溶剤に、加水分解した粒子の乾燥粉体を分散し、室温〜80℃で1〜24時間攪拌する方法が挙げられる。ここで用いられる有機溶剤としては、限定されないが、例えば、ピリジン、アセトン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミドなどが挙げられる。また、触媒としては、硫酸、p−トルエンスルホン酸、塩化亜鉛、酢酸ナトリウム、ピリジン、4−ジメチルアミノピリジン、4−ピロリジノピリジン、トリエチルアミンを使用してもよい。これらの有機溶剤、触媒のうち、ピリジンが有機溶剤兼触媒として好適である。 As a specific method for allowing a carboxylic acid anhydride to act as a carboxylating agent on the hydroxyl group obtained by hydrolyzing the glycidyl group contained in the first polymer layer, for example, an organic solvent in which the carboxylic acid anhydride is dissolved And a method of dispersing a dried powder of hydrolyzed particles and stirring at room temperature to 80 ° C. for 1 to 24 hours. Examples of the organic solvent used here include, but are not limited to, pyridine, acetone, methyl ethyl ketone, tetrahydrofuran, dimethylformamide, and the like. As the catalyst, sulfuric acid, p-toluenesulfonic acid, zinc chloride, sodium acetate, pyridine, 4-dimethylaminopyridine, 4-pyrrolidinopyridine, and triethylamine may be used. Of these organic solvents and catalysts, pyridine is suitable as an organic solvent and catalyst.
なお、本実施形態に係る磁性粒子上の全ての水酸基がエステル化される必要はなく、水酸基の一部がエステル化されずに水酸基のまま残ることが好ましい。 In addition, it is not necessary for all the hydroxyl groups on the magnetic particles according to the present embodiment to be esterified, and it is preferable that a part of the hydroxyl groups remain as hydroxyl groups without being esterified.
上記(i)〜(iii)の場合、カルボキシル基を導入する反応の前に、2以上のグリシジル基の一部を加水分解するか、あるいは、カルボキシル基を導入する反応と同時に、2以上のグリシジル基の一部を加水分解するのが好ましい。また、上記(i)の場合、カルボキシル基を導入する反応の後に、残留する2以上のグリシジル基の全てあるいは一部を加水分解してもよい。 In the case of the above (i) to (iii), a part of two or more glycidyl groups are hydrolyzed before the reaction for introducing a carboxyl group, or two or more glycidyls are simultaneously formed with the reaction for introducing a carboxyl group. It is preferred to hydrolyze part of the group. In the case of (i) above, all or part of the remaining two or more glycidyl groups may be hydrolyzed after the reaction for introducing a carboxyl group.
本実施形態に係る磁性粒子におけるカルボキシル基の量は、好ましくは0.1μmol/g〜100μmol/gであり、より好ましくは0.5μmol/g〜50μmol/gである。カルボキシル基の量が0.1μmol未満ではプローブの結合量が少なくなりシグナルが劣る場合があり、一方、100μmol/gを超えると非特異吸着が増える場合がある。 The amount of carboxyl groups in the magnetic particles according to this embodiment is preferably 0.1 μmol / g to 100 μmol / g, more preferably 0.5 μmol / g to 50 μmol / g. If the amount of the carboxyl group is less than 0.1 μmol, the amount of binding of the probe decreases and the signal may be inferior. On the other hand, if it exceeds 100 μmol / g, nonspecific adsorption may increase.
カルボキシル基を導入する反応によって得られる磁性粒子の一例としては、例えば、粒径dの磁性母粒子と、磁性母粒子の表面上に存在する粒径d/2以下の非磁性子粒子と、磁性母粒子および非磁性子粒子を被覆するように設けられた、カルボキシル基および2,3−ジヒドロキシプロピル基を有する第1ポリマー層とを含む磁性粒子が挙げられる。ここで、磁性母粒子は、核粒子と、核粒子の表面に形成された超常磁性微粒子を含む磁性体層と、磁性体層の表面に設けられた疎水性の第2ポリマー層と、を含み、第1ポリマー層は、第2ポリマー層および非磁性子粒子を被覆するように設けられることができる。第1ポリマー層がカルボキシル基および2,3−ジヒドロキシプロピル基を有することにより、非特異吸着が少ないうえに、生化学分野で広く扱われるカルボキシル基が導入されているため、従来の知見を生かして該粒子を利用することができる。 Examples of magnetic particles obtained by the reaction for introducing a carboxyl group include, for example, magnetic mother particles having a particle size d, non-magnetic child particles having a particle size of d / 2 or less present on the surface of the magnetic mother particles, and magnetic Examples thereof include magnetic particles including a first polymer layer having a carboxyl group and a 2,3-dihydroxypropyl group, which is provided so as to cover the mother particle and the nonmagnetic child particle. Here, the magnetic mother particle includes a core particle, a magnetic layer containing superparamagnetic fine particles formed on the surface of the core particle, and a hydrophobic second polymer layer provided on the surface of the magnetic layer. The first polymer layer can be provided so as to cover the second polymer layer and the non-magnetic child particles. Since the first polymer layer has a carboxyl group and a 2,3-dihydroxypropyl group, non-specific adsorption is small and a carboxyl group widely used in the biochemical field has been introduced. The particles can be utilized.
1.4.2−4.カルボキシル基を導入した後、該カルボキシル基を活性エステル基に変換する反応
(c)−2.カルボキシル基を導入した後、該カルボキシル基を活性エステル基に変換する反応としては、例えば、上記カルボキシル基を導入する反応によって得られるカルボキシル基導入磁性粒子をさらに適当な活性化剤で修飾することにより、活性エステル基を導入する方法が挙げられる。この反応により、活性エステル基導入磁性粒子が得られる。この活性エステル基導入磁性粒子は、プローブ結合用として好適に用いることができる。適当な活性化剤としては、N−ヒドロキシスクシンイミド、N−ヒドロキシスルホスクシンイミドが挙げられる。また、活性エステル基は特に限定されないが、例えば、N−スクシンイミジルオキシカルボニル基、N−スルホスクシンイミジルオキシカルボニル基が挙げられる。
1.4.2-4. Reaction which converts this carboxyl group into an active ester group after introducing a carboxyl group (c) -2. As a reaction for converting the carboxyl group into an active ester group after introducing the carboxyl group, for example, the carboxyl group-introduced magnetic particles obtained by the reaction for introducing the carboxyl group are further modified with an appropriate activator. And a method of introducing an active ester group. By this reaction, active ester group-introduced magnetic particles are obtained. This active ester group-introduced magnetic particle can be suitably used for probe binding. Suitable activators include N-hydroxysuccinimide and N-hydroxysulfosuccinimide. The active ester group is not particularly limited, and examples thereof include an N-succinimidyloxycarbonyl group and an N-sulfosuccinimidyloxycarbonyl group.
活性エステル基を導入する具体的な方法としては、例えば、カルボキシル基導入磁性粒子の水分散体に、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩およびN−ヒドロキシスクシンイミドを加えて、室温〜80℃で1〜24時間攪拌する方法が挙げられる。 As a specific method for introducing an active ester group, for example, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride and N-hydroxysuccinimide are added to an aqueous dispersion of carboxyl group-introduced magnetic particles. And a method of stirring at room temperature to 80 ° C. for 1 to 24 hours.
本実施形態に係る磁性粒子における活性化エステル基の量は、好ましくは0.1μmol/g〜100μmol/gであり、より好ましくは0.5μmol/g〜50μmol/gである。活性化エステル基の量が0.1μmol未満ではプローブの結合量が少なくなりシグナルが劣る場合があり、一方、100μmol/gを超えると非特異吸着が増える場合がある。 The amount of the activated ester group in the magnetic particles according to the present embodiment is preferably 0.1 μmol / g to 100 μmol / g, more preferably 0.5 μmol / g to 50 μmol / g. When the amount of the activated ester group is less than 0.1 μmol, the amount of binding of the probe is small and the signal may be inferior. On the other hand, when it exceeds 100 μmol / g, nonspecific adsorption may increase.
活性エステル基を導入する反応によって得られる磁性粒子の一例としては、例えば、粒径dの磁性母粒子と、磁性母粒子の表面上に存在する粒径d/2以下の非磁性子粒子と、磁性母粒子および非磁性子粒子を被覆するように設けられた、活性エステル基および2,3−ジヒドロキシプロピル基を有する第1ポリマー層とを含む磁性粒子が挙げられる。ここで、磁性母粒子は、核粒子と、該核粒子の表面に形成された超常磁性微粒子を含む磁性体層と、該磁性体層の表面に設けられた疎水性の第2ポリマー層と、を含み、第1ポリマー層は、第2ポリマー層および非磁性子粒子を被覆するように設けられることができる。第1ポリマー層が活性エステル基および2,3−ジヒドロキシプロピル基を有することにより、アミノ基を有するプローブと混合することにより該プローブと容易に結合するためプローブとの結合が容易であり、かつ、プローブの剥離が少ないうえに、非特異吸着が少ない。 As an example of magnetic particles obtained by a reaction for introducing an active ester group, for example, a magnetic mother particle having a particle size d, a non-magnetic child particle having a particle size of d / 2 or less present on the surface of the magnetic mother particle, Examples thereof include magnetic particles including a first polymer layer having an active ester group and a 2,3-dihydroxypropyl group, which is provided so as to cover the magnetic mother particle and the nonmagnetic child particle. Here, the magnetic mother particle is a core particle, a magnetic layer containing superparamagnetic fine particles formed on the surface of the core particle, a hydrophobic second polymer layer provided on the surface of the magnetic layer, And the first polymer layer can be provided to cover the second polymer layer and the non-magnetic child particles. When the first polymer layer has an active ester group and a 2,3-dihydroxypropyl group, it can be easily combined with the probe by mixing with the probe having an amino group, and thus the binding with the probe is easy, and There is little peeling of the probe and non-specific adsorption.
1.5.用途
本実施形態に係る磁性粒子は、プローブ結合用粒子として好適に使用することができ、より具体的には、生化学分野での化合物担体用粒子および診断薬用の化学結合担体用粒子等のアフィニティー担体として利用でき、特に、抗原または抗体等の一次プローブを結合させた免疫検査用およびプロテオーム用のプローブ結合用磁性粒子として、特出する高感度および低ノイズを発現することができる。
1.5. Applications The magnetic particles according to the present embodiment can be suitably used as probe-binding particles. More specifically, the affinity for compound carrier particles in biochemical fields and chemical binding carrier particles for diagnostic agents, etc. It can be used as a carrier, and can exhibit particularly high sensitivity and low noise as magnetic particles for probe binding for immunoassay and proteome to which a primary probe such as an antigen or antibody is bound.
本実施形態に係るプローブ結合用磁性粒子において、検査対象となる物質は、免疫検査用試薬および被検査試料に含まれる生体関連物質、化学物質、および生物である。本発明において、「生体関連物質」とは、生体に関わるすべての物質をいう。生体関連物質としては、例えば、生体に含まれる物質、生体に含まれる物質から誘導された物質、生体内で利用可能な物質が挙げられる。 In the probe-binding magnetic particles according to the present embodiment, the substances to be tested are biological substances, chemical substances, and living organisms contained in the immunological test reagent and the sample to be tested. In the present invention, “biologically related substance” refers to all substances related to a living body. Examples of the biological substance include substances contained in the living body, substances derived from the substance contained in the living body, and substances that can be used in the living body.
生体関連物質は特に限定されないが、例えば、タンパク質(例えば、酵素、抗体、アプタマー、受容体等)、ペプチド(例えばグルタチオン等)、核酸(例えば、DNAやRNA等)、糖質、脂質、ホルモン(例えば、黄体形成ホルモン、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、インシュリン、グルカゴン、成長ホルモン等)、およびその他の細胞または物質(例えば、血小板、赤血球、白血球等の各種血球細胞を含む各種血液由来物質、各種浮遊細胞や、ウイルス・細菌・真菌・原虫・寄生虫などの構成要素であるタンパク質や核酸)が挙げられる。タンパク質としては、より具体的には、生体由来のタンパク質、前立腺特異マーカー、膀胱ガンマーカー等の各種ガンのマーカーとなるタンパク質等が挙げられる。 The biological substance is not particularly limited. For example, proteins (for example, enzymes, antibodies, aptamers, receptors, etc.), peptides (for example, glutathione), nucleic acids (for example, DNA and RNA), carbohydrates, lipids, hormones ( For example, luteinizing hormone, human chorionic gonadotropin, thyroid stimulating hormone, insulin, glucagon, growth hormone, etc.) and other cells or substances (eg, various blood cells including various blood cells such as platelets, red blood cells, white blood cells, etc.) Substances, various floating cells, and proteins and nucleic acids that are constituents of viruses, bacteria, fungi, protozoa, parasites, etc.). More specifically, examples of proteins include biological proteins, proteins that serve as markers for various cancers such as prostate-specific markers, bladder cancer markers, and the like.
検査対象となる化学物質は特に限定されないが、例えば、ダイオキシン類等の環境汚染物質、医薬品(例えば、抗生物質、抗がん剤、抗てんかん剤等)があげられる。 The chemical substance to be inspected is not particularly limited, and examples thereof include environmental pollutants such as dioxins and pharmaceuticals (for example, antibiotics, anticancer agents, antiepileptic agents, etc.).
検査対象となる生物は特に限定されないが、例えば、各種癌細胞、各種浮遊細胞、ウイルス(例えば、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、HIVウイルス、風疹ウイルス、インフルエンザウイルス等)、細菌(例えば、淋菌、MRSA、大腸菌等)、真菌(例えば、カンジダ、白癬菌、クリプトコックス、アルペルギルス等)、原虫・寄生虫(例えば、トキソプラズマ、マラリア等)等が挙げられる。 The organism to be examined is not particularly limited. For example, various cancer cells, various floating cells, viruses (for example, hepatitis B virus, hepatitis C virus, herpes simplex virus, HIV virus, rubella virus, influenza virus, etc.), Examples include bacteria (for example, Neisseria gonorrhoeae, MRSA, E. coli, etc.), fungi (for example, Candida, ringworm, Cryptocox, alpergillus, etc.), protozoa and parasites (for example, Toxoplasma, malaria, etc.).
本実施形態に係るプローブ結合用磁性粒子のうち、アルデヒド基導入粒子および活性エステル基導入粒子によれば、実際に使用するに当たり、プローブと該粒子とを混合するだけで、該粒子の表面にプローブを化学的に結合させることができる。 Among the magnetic particles for binding probes according to the present embodiment, according to the aldehyde group-introduced particles and active ester group-introduced particles, the probe and the particles are mixed on the surface of the particles when actually used. Can be chemically coupled.
本実施形態に係るプローブ結合用磁性粒子のうち、アミノ基導入粒子およびカルボキシル基導入粒子によれば、アミノ基またはカルボキシル基が粒子の表面に導入されているため、実際に使用するに当たり、水溶性カルボジイミドなどの公知の活性化剤により、プローブまたは該粒子のカルボキシル基を活性化させて、プローブと該粒子とを混合することで、該粒子の表面にプローブを化学的に結合させることができる。 Among the probe-bonding magnetic particles according to the present embodiment, according to the amino group-introduced particles and carboxyl group-introduced particles, the amino group or carboxyl group is introduced on the surface of the particle. By activating the carboxyl group of the probe or the particle with a known activator such as carbodiimide and mixing the probe and the particle, the probe can be chemically bonded to the surface of the particle.
プローブを該粒子の表面に結合させた後、過剰のプローブを洗浄し、必要に応じて未反応の活性基を不活化する。不活化剤として、エタノールアミン、トリス(ヒドロキシメチルアミノ)メタン等の水酸基を含有する不活化剤を使用するのが好ましい。また、プローブを該粒子の表面に結合させた後、通常行われるブロッキングの操作は不要であるが、上述の不活化工程において、アルブミン、スキムミルク、カゼイン等のブロッキング剤を併用してもかまわない。以降は、粒子を用いた通常の工程に移行すればよい。 After binding the probe to the surface of the particle, excess probe is washed and unreacted active groups are inactivated as necessary. As the inactivating agent, it is preferable to use an inactivating agent containing a hydroxyl group such as ethanolamine or tris (hydroxymethylamino) methane. Further, after the probe is bonded to the surface of the particle, a blocking operation that is usually performed is not necessary, but a blocking agent such as albumin, skim milk, or casein may be used in combination in the inactivation step described above. Thereafter, the process may be shifted to a normal process using particles.
本実施形態に係るプローブ結合用磁性粒子に担持することができるプローブは、タンパク質(抗原または抗体)、核酸、または、化合物であり、このうち抗原または抗体が好ましい。この場合、抗原または抗体としては、被検体中に一般に含まれている成分に反応するものであれば特に制限されないが、例えば、アンチプラスミン検査用抗アンチプラスミン抗体、Dダイマー検査用抗Dダイマー抗体、FDP検査用抗FDP抗体、tPA検査用抗tPA抗体、TAT検査用抗トロンビン=アンチトロンビン複合体抗体、FPA検査用抗FPA抗体等の凝固線溶関連検査用抗原または抗体;BFP検査用抗BFP抗体、CEA検査用抗CEA抗体、AFP検査用抗AFP抗体、フェリチン検査用抗フェリチン抗体、CA19−9検査用抗CA19−9抗体等の腫瘍関連検査用抗原または抗体;アポリポタンパク検査用抗アポリポタンパク抗体、β2−ミクロブロブリン検査用抗β2−ミクロブロブリン抗体、α1−ミクログロブリン検査用抗α1―ミクログロブリン抗体、免疫グロブリン検査用抗免疫グロブリン抗体、CRP検査用抗CRP抗体等の血清蛋白関連検査用抗原または抗体;HCG検査用抗HCG抗体等の内分泌機能検査用抗原または抗体;HBs抗原検査用抗HBs抗体、HBs抗体検査用HBs抗原、HCV抗体検査用HCV抗原、HIV−1抗体用HIV−1抗原、HIV−2抗体検査用HIV−2抗原、HTLV−1検査用HTLV−1抗原、マイコプラズマ症検査用マイコプラズマ抗原、トキソプラズマ検査用トキソプラズマ抗原、ASO検査用ストレプトリジンO抗原等の感染症関連検査用抗原または抗体;抗DNA抗体検査用DNA抗原、RF検査用熱変成ヒトIgG等自己免疫関連検査用抗原または抗体;ジゴキシン検査用抗ジゴキシン抗体、リドカイン検査用抗リドカイン抗体等の薬物分析用抗原または抗体等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。抗体としては、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらを用いてもかまわない。 The probe that can be carried on the probe-binding magnetic particles according to the present embodiment is a protein (antigen or antibody), nucleic acid, or compound, and of these, the antigen or antibody is preferable. In this case, the antigen or antibody is not particularly limited as long as it reacts with a component generally contained in a subject. For example, anti-antiplasmin antibody for antiplasmin test, anti-D dimer antibody for D dimer test Anti-FDP antibody for FDP test, Anti-tPA antibody for tPA test, Anti-thrombin = antithrombin complex antibody for TAT test, Anticoagulation-related test antigen or antibody such as anti-FPA antibody for FPA test; Anti-BFP for BFP test Anti-Apolipoprotein for testing apolipoprotein such as antibodies, anti-CEA antibodies for CEA testing, anti-AFP antibodies for AFP testing, anti-ferritin antibodies for testing ferritin, anti-CA19-9 testing for CA19-9 Antibody, anti-β2-microblob antibody for β2-microblob test, α1-microglob Anti-α1-microglobulin antibody for serum test, anti-immunoglobulin antibody for immunoglobulin test, serum protein-related test antigen or antibody such as anti-CRP antibody for CRP test; endocrine function test antigen such as anti-HCG antibody for HCG test or Antibody: Anti-HBs antibody for HBs antigen test, HBs antigen for HBs antibody test, HCV antigen for HCV antibody test, HIV-1 antigen for HIV-1 antibody, HIV-2 antigen for HIV-2 antibody test, HTLV-1 test HTLV-1 antigen, Mycoplasma antigen for Mycoplasma test, Toxoplasma antigen for Toxoplasma test, Streptridine O antigen for ASO test, etc. Antigen-related test antigen or antibody; Anti-DNA antibody test DNA antigen, RF test heat-modified human Antigens or antibodies for autoimmune related tests such as IgG; antidigoxin anti And antigens for drug analysis such as anti-lidocaine antibodies for lidocaine testing, and the like, but are not limited thereto. As the antibody, either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody may be used.
また、本実施形態に係るプローブ結合用磁性粒子は、酵素・ホルモン等のタンパク質、DNA・RNA等の核酸、脂質、あるいは生理活性糖鎖化合物を粒子表面に化学結合法で感作させるアフィニティー担体としても利用できる。さらに、本実施形態に係るプローブ結合用磁性粒子に、解析対象の化学物質(被解析化学物質;リガンド分子に該当する)を化学結合により固定化し、タンパク物質等との特異的相互作用を用いて当該相互作用を解析および/または測定することによって、被解析化学物質と特異的な相互作用を有するタンパク質等(ターゲット分子に該当する)を選別し、精製することが可能である。 In addition, the magnetic particles for probe binding according to the present embodiment are used as affinity carriers for sensitizing proteins such as enzymes and hormones, nucleic acids such as DNA and RNA, lipids, or bioactive sugar chain compounds to the particle surface by a chemical binding method. Can also be used. Furthermore, a chemical substance to be analyzed (chemical substance to be analyzed; corresponding to a ligand molecule) is immobilized on the probe-binding magnetic particles according to the present embodiment by chemical bonding, and a specific interaction with a protein substance or the like is used. By analyzing and / or measuring the interaction, a protein or the like (corresponding to the target molecule) having a specific interaction with the chemical substance to be analyzed can be selected and purified.
具体的には、粒子に結合させるリガンド分子としては、本実施形態に係るプローブ結合用磁性粒子が有する官能基の少なくとも1つと反応しうる官能基を有する物質であれば特に限定されないが、例えば、核酸、ペプチド核酸、ホルモン、分子量500〜100万のタンパク質、糖鎖、多糖類、細胞、アプタマー、ウイルス、酵素、各種のアフィニティー用タグ捕捉物質、ビオチン等の補酵素、特定の生理活性作用を有する(あるいは、特定の生理活性作用を有する可能性がある)化学物質等を使用することができる。 Specifically, the ligand molecule to be bound to the particle is not particularly limited as long as it is a substance having a functional group capable of reacting with at least one of the functional groups of the probe-binding magnetic particle according to the present embodiment. Nucleic acids, peptide nucleic acids, hormones, proteins with a molecular weight of 500 to 1,000,000, sugar chains, polysaccharides, cells, aptamers, viruses, enzymes, various affinity tag capture substances, coenzymes such as biotin, and specific physiological activity A chemical substance or the like (or possibly having a specific physiological activity) can be used.
2.実施例
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。なお、各実施例および比較例において、評価は以下の方法で行った。
2. Examples Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited thereto. In each example and comparative example, the evaluation was performed by the following method.
2.1.評価方法
2.1.1.抗体結合量
後述する各実施例で得られた粒子および比較例で得られた粒子をそれぞれ、抗AFP(αフェトプロテイン)抗体と化学結合させた後、BCA(Bicinchoninic Acid)法により粒子に対する抗体の結合量を評価した。
2.1. Evaluation method 2.1.1. Antibody binding amount The particles obtained in each of the examples described below and the particles obtained in the comparative example were chemically bonded to an anti-AFP (α-fetoprotein) antibody, and then the antibody was bound to the particles by the BCA (Bicinchoninic Acid) method. The amount was evaluated.
2.1.2.CLEIA(化学発光酵素免疫法)によるシグナル測定
抗AFP抗体を感作させた、後述する各実施例・比較例で得られた粒子の分散液10μl(粒子50μg相当)をテストチューブに取り、ウシ胎児血清(FCS)で100ng/mLに希釈したAFP抗原(日本バイオテスト社製)の標準検体50μlと混合し、37℃で10分間反応した。磁気分離して粒子を分離し上清を除いた後、2次抗体としてアルカリフォスファターゼ(以下、「ALP」という。)で標識した抗AFP抗体(富士レビオ株式会社製、ルミパルスAFP−Nに付属の試薬を使用)40μlを添加し、37℃で10分間反応させた。次いで、磁気分離し上清を除いた後、PBSで3回洗浄を繰り返して得られた粒子を50μlの0.01%Tween20に分散させ、新しいチューブに移し替えた。ALPの基質液(ルミパルス基質液:富士レビオ株式会社製)100μlを加え、37℃で10分間反応させた後、化学発光量を測定した。化学発光の測定には、ベルトールジャパン株式会社製の化学発光測定装置(商品名:Lumat LB9507)を用いた。
2.1.2. Signal measurement by CLEIA (chemiluminescent enzyme immunoassay) 10 μl of a dispersion of particles (corresponding to 50 μg of particles) obtained by sensitizing anti-AFP antibody and obtained in each of Examples and Comparative Examples to be described later is placed in a test tube and calf fetus The mixture was mixed with 50 μl of a standard sample of AFP antigen (manufactured by Nippon Biotest) diluted to 100 ng / mL with serum (FCS), and reacted at 37 ° C. for 10 minutes. After separating the particles by magnetic separation and removing the supernatant, an anti-AFP antibody labeled with alkaline phosphatase (hereinafter referred to as “ALP”) as a secondary antibody (manufactured by Fujirebio Inc., attached to Lumipulse AFP-N) Using reagent) 40 μl was added and allowed to react at 37 ° C. for 10 minutes. Next, after magnetic separation and removal of the supernatant, the particles obtained by repeating washing three times with PBS were dispersed in 50 μl of 0.01% Tween 20, and transferred to a new tube. After adding 100 μl of ALP substrate solution (Lumipulse substrate solution: manufactured by Fujirebio Inc.) and reacting at 37 ° C. for 10 minutes, the amount of chemiluminescence was measured. For the measurement of chemiluminescence, a chemiluminescence measuring device (trade name: Lumat LB9507) manufactured by Bertol Japan KK was used.
2.1.3.ノイズ測定
上記CLEIA(化学発光酵素免疫測定)によるシグナルの測定で、標準検体と混合しなかったこと以外は同様の方法にて、ノイズとしての化学発光量を測定した。
2.1.3. Noise measurement The amount of chemiluminescence as noise was measured by the same method except that the signal was measured by CLEIA (chemiluminescence enzyme immunoassay) and not mixed with a standard sample.
2.2.合成例(磁性粒子の作製)
2.2.1.合成例1(核粒子の作製)
75%ジ(3,5,5−トリメチルヘキサノイル)パーオキサイド溶液(日本油脂製「パーロイル355−75(S)」、以下、「パーロイル」という)1gを1%ドデシル硫酸ナトリウム水溶液10gに混合し、超音波分散機にて微細乳化した。これを粒径0.77μmのポリスチレン粒子6.5gおよび水20.5gの入ったリアクターに入れ、25℃で12時間攪拌した。別の容器にて、スチレン48gおよびジビニルベンゼン2gを0.1%ドデシル硫酸ナトリウム水溶液200gで乳化させた液を前記リアクターに入れ、40℃で2時間攪拌した後、75℃に昇温して8時間重合した。室温まで冷却した後、遠心分離により粒子のみ取り出したものをさらに水洗し、乾燥および粉砕して核粒子(1)を得た。核粒子(1)の数平均粒径は1.5μmであった。
2.2. Synthesis example (production of magnetic particles)
2.2.1. Synthesis Example 1 (Preparation of core particles)
1 g of 75% di (3,5,5-trimethylhexanoyl) peroxide solution (“Perroyl 355-75 (S)” manufactured by NOF Corporation, hereinafter referred to as “parroyl”) is mixed with 10 g of 1% sodium dodecyl sulfate aqueous solution. And finely emulsified with an ultrasonic disperser. This was put into a reactor containing 6.5 g of polystyrene particles having a particle size of 0.77 μm and 20.5 g of water, and stirred at 25 ° C. for 12 hours. In a separate container, a solution obtained by emulsifying 48 g of styrene and 2 g of divinylbenzene with 200 g of a 0.1% sodium dodecyl sulfate aqueous solution was placed in the reactor, stirred at 40 ° C. for 2 hours, then heated to 75 ° C. and heated to 8 ° C. Polymerized for hours. After cooling to room temperature, the particles taken out by centrifugation were further washed with water, dried and pulverized to obtain core particles (1). The number average particle diameter of the core particles (1) was 1.5 μm.
2.2.2.合成例2(磁性母粒子(1)の作製)
油性磁性流体(商品名:「EXPシリーズ」,(株)フェローテック製)にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥することにより、疎水化処理された表面を有するフェライト系の超常磁性微粒子(1)(平均一次粒子径:0.01μm)を得た。
2.2.2. Synthesis Example 2 (Preparation of magnetic mother particles (1))
After adding acetone to oily magnetic fluid (trade name: “EXP series”, manufactured by Ferrotec Co., Ltd.) to precipitate and precipitate the particles, this is dried to obtain a ferrite-based surface having a hydrophobized surface. Superparamagnetic fine particles (1) (average primary particle size: 0.01 μm) were obtained.
上記核粒子(1)15gおよび上記超常磁性微粒子(1)15gをミキサーでよく混合し、この混合物をハイブリダイゼーションシステムNHS−0型(奈良機械製作所(株)製)を使用して、羽根(撹拌翼)の周速度100m/秒(16200rpm)で5分間処理し、超常磁性微粒子(1)からなる磁性体層を表面に有する磁性母粒子(1)(平均数粒子径:2.0μm)を得た。 15 g of the above core particles (1) and 15 g of the above superparamagnetic fine particles (1) are mixed well with a mixer, and this mixture is mixed with a blade (stirring) using a hybridization system NHS-0 type (manufactured by Nara Machinery Co., Ltd.). The magnetic base particles (1) (average number particle diameter: 2.0 μm) having a magnetic layer composed of superparamagnetic fine particles (1) on the surface are obtained by processing at a peripheral speed of 100 m / sec (16200 rpm) of the wings). It was.
2.2.3.合成例3(第2ポリマー層を有する磁性母粒子(A−1)の作製)
上記合成例2で得られた磁性母粒子(1)30gと、分散剤としてノニオン性乳化剤「エマルゲン150」(花王(株)製)0.25%およびカチオン性乳化剤「コータミン24P」(花王(株)製)0.25%を含む水溶液750gを1Lセパラブルフラスコに投入し充分に分散させた。別の容器にノニオン性乳化剤「エマルゲン150」0.25%およびカチオン性乳化剤「コータミン24P」0.25%を含む水溶液150gを入れ、これにモノマーとしてシクロヘキシルメタクリレート30gおよびN,N−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド7.5g、重合開始剤としてターシャリーブチルペルオキシ2−エチルヘキサネート(日本油脂(株)製;パーブチルO)1.5gを添加、混合して、モノマー乳化物を作製した。前記セパラブルフラスコをイカリ型撹拌羽を用いて200rpm撹拌下で、N2ガスでパージしながら60℃に昇温した後、前記モノマー乳化物を2時間かけて前記セパラブルフラスコに連続添加した。連続添加終了後、80℃で2時間攪拌を続けて反応を完結させ、母粒子コート層(第2ポリマー層)が表面に形成された磁性母粒子を得た。この磁性母粒子の水分散体を磁気精製および遠心精製した。以上のようにして作製した磁性母粒子を磁性母粒子(A−1)とする。磁性母粒子(A−1)の粒径dを透過型電子顕微鏡写真の100個の粒子径の計測により測定した結果、2.8μmであった。
2.2.3. Synthesis Example 3 (Preparation of magnetic mother particle (A-1) having second polymer layer)
30 g of the magnetic mother particles (1) obtained in Synthesis Example 2 above, 0.25% of a nonionic emulsifier “Emulgen 150” (manufactured by Kao Corporation) and a cationic emulsifier “Cotamine 24P” (Kao Corporation) )) 750 g of an aqueous solution containing 0.25% was put into a 1 L separable flask and sufficiently dispersed. In a separate container, 150 g of an aqueous solution containing 0.25% of a nonionic emulsifier “Emulgen 150” and 0.25% of a cationic emulsifier “Cotamine 24P” was placed, and 30 g of cyclohexyl methacrylate and N, N-dimethylaminopropylacrylamide were used as monomers. 7.5 g of a tertiary butyl peroxy 2-ethylhexanate (manufactured by NOF Corporation; Perbutyl O) as a polymerization initiator was added and mixed to prepare a monomer emulsion. The temperature of the separable flask was raised to 60 ° C. while purging with N 2 gas under stirring at 200 rpm using a squid stirring blade, and then the monomer emulsion was continuously added to the separable flask over 2 hours. After completion of the continuous addition, stirring was continued at 80 ° C. for 2 hours to complete the reaction, and magnetic mother particles having a mother particle coat layer (second polymer layer) formed on the surface were obtained. The magnetic mother particle aqueous dispersion was magnetically purified and centrifuged. The magnetic mother particle produced as described above is referred to as magnetic mother particle (A-1). It was 2.8 micrometers as a result of measuring the particle size d of a magnetic mother particle (A-1) by measurement of 100 particle diameters of a transmission electron micrograph.
2.2.4.合成例4(ヘテロ凝集磁性粒子の作製)
スチレン/メタクリル酸=95/5共重合体からなる平均粒径0.1μmの非磁性子粒子(B−1)5gを含む水分散体1000gをビーカーに入れ、水浴中で間接超音波をかけながら、別の容器で調製した磁性母粒子(A−1)6gと、0.1M HCl50gと、ノニオン性乳化剤「エマルゲン150」0.5%とを含む水溶液500gを前記ビーカーへ滴下して、磁性母粒子(A−1)に非磁性子粒子(B−1)を吸着させた。得られた粒子分散体を磁気精製し、磁性母粒子(A−1)に非磁性子粒子(B−1)が吸着した磁性粒子(1)を得た。
2.2.4. Synthesis Example 4 (Preparation of hetero-aggregated magnetic particles)
1000 g of an aqueous dispersion containing 5 g of non-magnetic child particles (B-1) made of styrene / methacrylic acid = 95/5 copolymer and having an average particle diameter of 0.1 μm is placed in a beaker and subjected to indirect ultrasonic waves in a water bath. Then, 500 g of an aqueous solution containing 6 g of magnetic mother particles (A-1) prepared in another container, 50 g of 0.1M HCl, and 0.5% of a nonionic emulsifier “Emulgen 150” was dropped into the beaker, and the magnetic mother Nonmagnetic child particles (B-1) were adsorbed on the particles (A-1). The obtained particle dispersion was magnetically purified to obtain magnetic particles (1) in which the nonmagnetic child particles (B-1) were adsorbed to the magnetic mother particles (A-1).
この磁性粒子(1)をSEM観察したところ、磁性母粒子(A−1)の表面に非磁性小粒子(B−1)が吸着しているのが観察された。 When this magnetic particle (1) was observed by SEM, it was observed that the nonmagnetic small particles (B-1) were adsorbed on the surfaces of the magnetic mother particles (A-1).
2.2.5.合成例5(第1ポリマー層の形成)
磁性粒子(1)6gと、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム0.5%を含む水溶液150gとを500mLセパラブルフラスコに投入し充分に分散させた。別の容器にドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム0.5%を含む水溶液0.75gを入れ、これにモノマーとしてグリシジルメタクリレート0.15gおよびトリメチロールプロパントリアクリレート0.0214g、重合開始剤としてパーロイル0.0075gを添加、混合して、モノマー乳化物を作製した。前記セパラブルフラスコへ、イカリ型撹拌羽を用いた200rpm撹拌下で、N2ガスでパージしながら前記モノマー乳化物全量を加え、80℃に昇温し3時間攪拌を続けて、磁性母粒子(A−1)および非磁性粒子(1)の表面に第1ポリマー層が形成された磁性粒子(2)を得た。
2.2.5. Synthesis Example 5 (Formation of first polymer layer)
6 g of magnetic particles (1) and 150 g of an aqueous solution containing 0.5% sodium dodecylbenzenesulfonate were charged into a 500 mL separable flask and sufficiently dispersed. In a separate container, 0.75 g of an aqueous solution containing 0.5% sodium dodecylbenzenesulfonate was added, and 0.15 g of glycidyl methacrylate and 0.0214 g of trimethylolpropane triacrylate as monomers, and 0.0075 g of parroyl as a polymerization initiator were added thereto. The monomer emulsion was prepared by adding and mixing. To the separable flask, the whole amount of the monomer emulsion was added while purging with N 2 gas while stirring at 200 rpm using a squid type stirring blade. The temperature was raised to 80 ° C. and stirring was continued for 3 hours. Magnetic particles (2) in which a first polymer layer was formed on the surfaces of A-1) and nonmagnetic particles (1) were obtained.
この磁性粒子(2)の水分散体を磁気精製および遠心精製した。磁性粒子(2)をSEM観察したところ、磁性母粒子(A−1)の表面に非磁性子粒子(B−1)が吸着し、磁性母粒子(A−1)(第2ポリマー層)および非磁性子粒子(B−1)を被覆するように新たなポリマー層(第1ポリマー層)が形成されているのが観察された。また、磁性粒子(2)の断面の透過型電子顕微鏡写真を撮影し、この断面の異なる30箇所で測定された第1ポリマー層の平均厚さは0.01μmであった。 The aqueous dispersion of magnetic particles (2) was magnetically purified and centrifuged. When the magnetic particles (2) were observed with an SEM, the nonmagnetic child particles (B-1) were adsorbed on the surface of the magnetic mother particles (A-1), and the magnetic mother particles (A-1) (second polymer layer) and It was observed that a new polymer layer (first polymer layer) was formed so as to cover the nonmagnetic particle (B-1). In addition, a transmission electron micrograph of the cross section of the magnetic particle (2) was taken, and the average thickness of the first polymer layer measured at 30 locations having different cross sections was 0.01 μm.
2.3.実施例(第1ポリマー層への極性基の導入)
2.3.1.実施例1(カルボキシル基導入プローブ結合用粒子)
上記合成例より得られた磁性粒子(2)の水分散液から磁気分離により単離した粒子1.0gに1%硫酸水溶液10gを加え、間接超音波を20分間照射して該粒子を分散させ、次いで、該粒子の分散液を60℃で5時間撹拌した(グリシジル基の加水分解)。
2.3. Example (Introduction of polar group into first polymer layer)
2.3.1. Example 1 (Carboxyl group-introduced probe binding particles)
10 g of 1% sulfuric acid aqueous solution is added to 1.0 g of particles isolated by magnetic separation from the aqueous dispersion of magnetic particles (2) obtained from the above synthesis example, and the particles are dispersed by irradiation with indirect ultrasonic waves for 20 minutes. Subsequently, the dispersion liquid of the particles was stirred at 60 ° C. for 5 hours (hydrolysis of glycidyl group).
続いて磁気分離により該粒子を単離し、純水に分散させ磁気分離して洗浄する操作を5回繰り返し乾燥させた。得られた乾燥粒子1.0gを10mlのピリジンで洗浄した後5mlのピリジンに分散させ、無水コハク酸3g/25mlピリジン溶液を加え60℃で2時間反応させた(カルボキシル基の導入)。 Subsequently, the operation of isolating the particles by magnetic separation, dispersing in pure water, magnetic separation and washing was repeated 5 times. 1.0 g of the obtained dried particles were washed with 10 ml of pyridine and then dispersed in 5 ml of pyridine. A succinic anhydride 3 g / 25 ml pyridine solution was added and reacted at 60 ° C. for 2 hours (introduction of carboxyl group).
反応後、磁気を用いて前記粒子を分離し、アセトンで3回、続いて0.1M水酸化ナトリウム水溶液で3回、さらに蒸留水で4回洗浄してから蒸留水に分散させて、1.0gのカルボキシル基導入磁性粒子(Ca−2)を含む1%分散液を得た。 After the reaction, the particles are separated using magnetism, washed 3 times with acetone, then 3 times with 0.1 M aqueous sodium hydroxide solution and 4 times with distilled water, and then dispersed in distilled water. A 1% dispersion containing 0 g of carboxyl group-introduced magnetic particles (Ca-2) was obtained.
カルボキシル基導入磁性粒子(Ca−2)の1wt%水分散液500μlをチューブに取り、磁気スタンドにて磁気分離し、上澄みを除去した。100mM MES(pH5)にて3回洗浄後、500μlの同Bufferに分散し、これに抗AFP抗体0.1mg、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)0.05mgを添加し、室温下5時間撹拌を行った。反応終了後、磁気分離して上澄みを除去した。次いで、PBS(−)緩衝液にて5回洗浄した後、PBS(−)緩衝液500μlで前記粒子を分散させて、プローブ(抗体)結合磁性粒子(抗体感作粒子)の分散液を得た。 500 μl of a 1 wt% aqueous dispersion of carboxyl group-introduced magnetic particles (Ca-2) was taken in a tube, magnetically separated by a magnetic stand, and the supernatant was removed. After washing 3 times with 100 mM MES (pH 5), 500 μl of the same buffer was dispersed, and 0.1 mg of anti-AFP antibody and 0.05 mg of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) were added thereto. The mixture was added and stirred at room temperature for 5 hours. After completion of the reaction, the supernatant was removed by magnetic separation. Next, after washing 5 times with PBS (−) buffer, the particles were dispersed with 500 μl of PBS (−) buffer to obtain a dispersion of probe (antibody) -bound magnetic particles (antibody-sensitized particles). .
得られた抗体感作粒子の抗体結合量、CLEIAによるシグナル測定、およびノイズ測定の結果を表1に示す。 Table 1 shows the antibody binding amount of the obtained antibody-sensitized particles, signal measurement by CLEIA, and noise measurement results.
2.3.2.実施例2(活性エステル基導入プローブ結合用粒子)
実施例1で得られたカルボキシル基導入磁性粒子(Ca−2)を含む1%分散液100mLをビーカーに取り、磁気分離で上澄みを除去した。100mM MES(pH5)にて該粒子を3回洗浄後、100mLの同Bufferに分散させ、N−ヒドロキシコハク酸イミド0.16gおよびEDC0.18gを加えて、室温下2時間該粒子の分散液の撹拌を行った(活性エステル基の導入)。
2.3.2. Example 2 (Active ester group-introduced probe binding particles)
100 mL of a 1% dispersion containing the carboxyl group-introduced magnetic particles (Ca-2) obtained in Example 1 was placed in a beaker, and the supernatant was removed by magnetic separation. The particles were washed 3 times with 100 mM MES (pH 5), dispersed in 100 mL of the same buffer, 0.16 g of N-hydroxysuccinimide and 0.18 g of EDC were added, and the dispersion of the particles was allowed to stand at room temperature for 2 hours. Stirring was performed (introduction of an active ester group).
反応終了後、磁気分離および分散を繰り返して5回洗浄し、さらに蒸留水に前記粒子を分散させて、1.0gの活性エステル基導入磁性粒子(Ac−2)を含む1%分散液を得た。 After completion of the reaction, the magnetic separation and dispersion were repeated and washed five times, and the particles were further dispersed in distilled water to obtain a 1% dispersion containing 1.0 g of active ester group-introduced magnetic particles (Ac-2). It was.
活性エステル基導入磁性粒子(Ac−2)の1wt%水分散液500μlをチューブに取り、磁気スタンドにて磁気分離し、上澄みを除去した。100mM MES(pH5)にて該粒子を3回洗浄後、500μlの同Bufferに分散させ、これに抗AFP抗体0.1mgを添加し、室温下2時間撹拌を行った。反応終了後、磁気分離して上澄みを除去した。次いで、PBS(−)緩衝液にて5回洗浄した後、PBS(−)緩衝液500μlで前記粒子を分散させることにより、プローブ(抗体)結合磁性粒子(抗体感作粒子)の分散液を得た。 500 μl of a 1 wt% aqueous dispersion of active ester group-introduced magnetic particles (Ac-2) was placed in a tube and magnetically separated using a magnetic stand, and the supernatant was removed. The particles were washed three times with 100 mM MES (pH 5), dispersed in 500 μl of the same buffer, 0.1 mg of anti-AFP antibody was added thereto, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. After completion of the reaction, the supernatant was removed by magnetic separation. Next, after washing 5 times with PBS (−) buffer, the particles are dispersed with 500 μl of PBS (−) buffer to obtain a dispersion of probe (antibody) -bound magnetic particles (antibody-sensitized particles). It was.
得られた抗体感作粒子の抗体結合量、CLEIAによるシグナル測定、およびノイズ測定の結果を表1に示す。 Table 1 shows the antibody binding amount of the obtained antibody-sensitized particles, signal measurement by CLEIA, and noise measurement results.
2.3.3.実施例3(アミノ基導入プローブ結合用粒子)
グリシジル基を有する第1ポリマー層が形成された磁性粒子(2)の水分散液から磁気分離によって単離した粒子をアセトンに分散させ、磁気分離して洗浄する操作を5回繰り返した後、前記粒子を再びアセトンに分散させ、磁気分離により上清を除去した後、該粒子を乾燥させた。次に、該粒子0.50gを100mlフラスコに入れ、エチレンジアミン25gを加えた後、間接超音波を20分間照射して分散させてから、窒素雰囲気下で50℃にて3時間加熱攪拌した(アミノ基の導入)。
2.3.3. Example 3 (Amino group-introduced probe binding particles)
After repeating the operation of dispersing the particles isolated by magnetic separation from the aqueous dispersion of the magnetic particles (2) having the first polymer layer having a glycidyl group dispersed in acetone, magnetically separating and washing, five times, The particles were dispersed again in acetone, the supernatant was removed by magnetic separation, and the particles were dried. Next, 0.50 g of the particles were placed in a 100 ml flask, 25 g of ethylenediamine was added, and then dispersed by irradiation with indirect ultrasonic waves for 20 minutes, and then heated and stirred at 50 ° C. for 3 hours in a nitrogen atmosphere (amino) Group introduction).
冷却後、磁気分離により前記粒子を単離し、該粒子を蒸留水に分散させ、磁気分離して洗浄する操作を5回繰り返した後、磁気分離により上清を除去し、次に、1%硫酸水溶液5gに該粒子を加え、間接超音波を20分間照射して分散させ、次いで、60℃で5時間攪拌した(残留グリシジル基の加水分解)。 After cooling, the particles are isolated by magnetic separation, dispersed in distilled water, magnetically separated and washed, and then the supernatant is removed by magnetic separation. Then, 1% sulfuric acid is removed. The particles were added to 5 g of an aqueous solution, dispersed by irradiation with indirect ultrasonic waves for 20 minutes, and then stirred at 60 ° C. for 5 hours (hydrolysis of residual glycidyl groups).
続いて、磁気分離により前記粒子を単離し、純水に分散させ磁気分離して洗浄する操作を5回繰り返した後、乾燥させることにより、0.49gのアミノ基導入磁性粒子(Am−2)を得た。 Subsequently, the operation of isolating the particles by magnetic separation, dispersing in pure water, magnetic separation and washing 5 times was repeated, followed by drying to give 0.49 g of amino group-introduced magnetic particles (Am-2) Got.
アミノ基導入磁性粒子(Am−2)を、濃度が1wt%になるように純水に希釈分散して、水分散液を調製した。次に、この水分散液500μlをチューブに取り、磁気スタンドにて磁気分離し、上澄みを除去した。100mM MES(pH5)にて3回洗浄後、500μlの同Bufferに分散し、これに抗AFP抗体0.1mgを添加し、さらに、EDC0.05mgを加え撹拌した後、室温下3時間撹拌を行った。反応終了後、磁気分離して上澄みを除去した。次いで、PBS(−)緩衝液にて5回洗浄した後、PBS(−)緩衝液500μlで粒子を分散させることにより、プローブ(抗体)結合磁性粒子(抗体感作粒子)の分散液を得た。 The amino group-introduced magnetic particles (Am-2) were diluted and dispersed in pure water to a concentration of 1 wt% to prepare an aqueous dispersion. Next, 500 μl of this aqueous dispersion was taken in a tube and magnetically separated using a magnetic stand, and the supernatant was removed. After washing 3 times with 100 mM MES (pH 5), dispersed in 500 μl of the same buffer, 0.1 mg of anti-AFP antibody was added thereto, 0.05 mg of EDC was further added, and the mixture was stirred for 3 hours at room temperature. It was. After completion of the reaction, the supernatant was removed by magnetic separation. Next, after washing 5 times with PBS (−) buffer, the particles were dispersed with 500 μl of PBS (−) buffer to obtain a dispersion of probe (antibody) -bound magnetic particles (antibody-sensitized particles). .
得られた抗体感作粒子の抗体結合量、CLEIAによるシグナル測定、およびノイズ測定の結果を表1に示す。 Table 1 shows the antibody binding amount of the obtained antibody-sensitized particles, signal measurement by CLEIA, and noise measurement results.
2.3.4.実施例4(アルデヒド基導入プローブ結合用粒子)
グリシジル基を有する第1ポリマー層が形成された磁性粒子(2)の水分散液から磁気分離によって単離した粒子0.5gに、1%硫酸水溶液5gを加え、間接超音波を20分間照射して分散させ、次いで、60℃で5時間攪拌した(グリシジル基の加水分解)。
2.3.4. Example 4 (aldehyde group-introduced probe binding particles)
5 g of 1% sulfuric acid aqueous solution is added to 0.5 g of particles isolated by magnetic separation from an aqueous dispersion of magnetic particles (2) having a first polymer layer having a glycidyl group and irradiated with indirect ultrasonic waves for 20 minutes. And then stirred at 60 ° C. for 5 hours (hydrolysis of glycidyl group).
続いて、磁気分離により前記粒子を単離し、純水に分散させ磁気分離して洗浄する操作を5回繰り返した。さらに磁気分離により単離した前記粒子に5.6mg/mL過ヨウ素酸ナトリウム水溶液20mLを加え、攪拌しながら室温で1時間反応させた(アルデヒド基の導入)。 Subsequently, the operation of isolating the particles by magnetic separation, dispersing in pure water, magnetically separating and washing was repeated five times. Furthermore, 20 mL of a 5.6 mg / mL sodium periodate aqueous solution was added to the particles isolated by magnetic separation, and the mixture was reacted for 1 hour at room temperature with stirring (introduction of aldehyde group).
次に、磁気分離により前記粒子を単離し、その上清のホルムアルデヒド量をPIERCE社製Glycoprotein Carbohydrate Estimation Kitで定量したところ、粒子1g当たり11μmolのアルデヒド基が導入されていることが確認できた。次いで、この粒子を蒸留水に分散させ、磁気分離して洗浄する操作を5回繰り返した後、蒸留水に分散させて、0.49gのアルデヒド基導入磁性粒子(AL−2)を含む1%分散液を得た。 Next, the particles were isolated by magnetic separation, and the amount of formaldehyde in the supernatant was quantified using a Glycoprotein Carbohydrate Estimation Kit manufactured by PIERCE. As a result, it was confirmed that 11 μmol of aldehyde groups were introduced per gram of particles. Then, the operation of dispersing the particles in distilled water, magnetically separating and washing was repeated 5 times, and then dispersed in distilled water to contain 1% containing 0.49 g of aldehyde group-introduced magnetic particles (AL-2). A dispersion was obtained.
アルデヒド基導入磁性粒子(AL−2)の1wt%水分散液500μlをチューブに取り、磁気スタンドにて磁気分離し、上澄みを除去した。citrate−carbinateバッファー pH10にて3回洗浄した後、500μlの同Bufferに分散し、これに抗AFP抗体0.1mgを添加し、室温下5時間撹拌を行った。反応終了後、磁気分離して上澄みを除去した。次いで、tris−HClバッファー(pH7.4)500μlを加え、室温で2時間撹拌を行った。さらに、PBS(−)緩衝液にて5回洗浄した後、PBS(−)緩衝液500μlで前記粒子を分散させることにより、プローブ(抗体)結合磁性粒子(抗体感作粒子)の分散液を得た。 500 μl of a 1 wt% aqueous dispersion of aldehyde group-introduced magnetic particles (AL-2) was taken in a tube, magnetically separated by a magnetic stand, and the supernatant was removed. After washing 3 times with citrate-carbinate buffer pH 10, it was dispersed in 500 μl of the same buffer, 0.1 mg of anti-AFP antibody was added thereto, and the mixture was stirred at room temperature for 5 hours. After completion of the reaction, the supernatant was removed by magnetic separation. Subsequently, 500 μl of tris-HCl buffer (pH 7.4) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. Furthermore, after washing 5 times with PBS (−) buffer, the particles are dispersed with 500 μl of PBS (−) buffer to obtain a dispersion of probe (antibody) -bound magnetic particles (antibody-sensitized particles). It was.
得られた抗体感作粒子の抗体結合量、CLEIAによるシグナル測定、およびノイズ測定の結果を表1に示す。 Table 1 shows the antibody binding amount of the obtained antibody-sensitized particles, signal measurement by CLEIA, and noise measurement results.
2.3.5.比較例1(第1ポリマー層への極性基の導入を行わない例)
上記「合成例1〜4」と同様の工程手順に従って、微粒子からなる磁性体層を表面に有する磁性母粒子(A−1)を得た。次いで、グリシジルメタクリレート0.15gおよびトリメチロールプロパントリアクリレート0.0214gの代わりに、スチレン0.075gおよびメタクリル酸0.075gを用いる以外は合成例5と同様の手順にて、磁性粒子(2)に相当する磁性粒子(2−1)を得た。この磁性粒子(2−1)の第1ポリマー層は、グリシジル基を含んでいない。
2.3.5. Comparative Example 1 (example in which a polar group is not introduced into the first polymer layer)
Magnetic base particles (A-1) having a magnetic layer made of fine particles on the surface were obtained according to the same process procedure as in “Synthesis Examples 1 to 4”. Next, in the same procedure as in Synthesis Example 5, except that 0.075 g of styrene and 0.075 g of methacrylic acid were used instead of 0.15 g of glycidyl methacrylate and 0.0214 g of trimethylolpropane triacrylate, magnetic particles (2) were formed. Corresponding magnetic particles (2-1) were obtained. The first polymer layer of the magnetic particle (2-1) does not contain a glycidyl group.
磁性粒子(2−1)の1wt%水分散液500μlをチューブに取り、磁気スタンドにて磁気分離し、上澄みを除去した。100mM MES(pH5)にて該粒子を3回洗浄後、500μlの同Bufferに分散させ、これに抗AFP抗体0.1mg、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)0.05mgを添加し、室温下5時間撹拌を行った。反応終了後、磁気分離して上澄みを除去した。次いで、PBS(−)緩衝液にて5回洗浄した後、PBS(−)緩衝液500μlで前記粒子を分散させて、プローブ(抗体)結合磁性粒子(抗体感作粒子)の分散液を得た。 500 μl of a 1 wt% aqueous dispersion of magnetic particles (2-1) was taken in a tube, magnetically separated by a magnetic stand, and the supernatant was removed. The particles were washed three times with 100 mM MES (pH 5), and then dispersed in 500 μl of the same buffer, to which 0.1 mg of anti-AFP antibody, 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) 0 .05 mg was added and stirred at room temperature for 5 hours. After completion of the reaction, the supernatant was removed by magnetic separation. Next, after washing 5 times with PBS (−) buffer, the particles were dispersed with 500 μl of PBS (−) buffer to obtain a dispersion of probe (antibody) -bound magnetic particles (antibody-sensitized particles). .
得られた抗体感作粒子の抗体結合量、CLEIAによるシグナル測定、およびノイズ測定の結果を表1に示す。 Table 1 shows the antibody binding amount of the obtained antibody-sensitized particles, signal measurement by CLEIA, and noise measurement results.
2.3.6.比較例2(非磁性子粒子を含まない例)
上記「合成例1,2」と同様の手順に従って、超常磁性微粒子からなる磁性体層を表面に有する磁性母粒子(1)を得た。次に、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム0.5重量%水溶液375gを1Lセパラブルフラスコに投入し、次いで、磁性母粒子(1)15gを投入し、ホモジナイザーで分散した後、60℃に加熱した。別の容器に入れたドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム0.5重量%水溶液100gに、モノマーとしてメチルメタクリレート(MMA)18gおよびトリメチロールプロパントリメタクリレート(TMP)2g、ならびにパーロイル0.4gを入れて分散させたプレエマルジョンを、60℃にコントロールした前記1Lセパラブルフラスコに1時間30分かけて滴下した(以上、第2ポリマー層の形成)。
2.3.6. Comparative Example 2 (example not containing non-magnetic child particles)
Magnetic base particles (1) having a magnetic layer made of superparamagnetic fine particles on the surface were obtained according to the same procedure as in “Synthesis Examples 1 and 2”. Next, 375 g of a 0.5% by weight aqueous solution of sodium dodecylbenzenesulfonate was charged into a 1 L separable flask, then 15 g of magnetic mother particles (1) were charged, dispersed with a homogenizer, and heated to 60 ° C. Methyl methacrylate (MMA) 18 g, trimethylolpropane trimethacrylate (TMP) 2 g, and paroyl 0.4 g were dispersed in 100 g of a 0.5 wt% aqueous solution of sodium dodecylbenzenesulfonate in a separate container. The pre-emulsion was dropped into the 1 L separable flask controlled at 60 ° C. over 1 hour 30 minutes (formation of the second polymer layer).
滴下終了後、60℃に保持して1時間攪拌した後、別の容器に入れたドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム0.5重量%水溶液75gに、モノマーとしてグリシジルメタクリレート10.5gおよびTMP1.5g、ならびにパーロイル0.3gを入れて分散させたプレエマルジョンを、60℃にコントロールした上記1Lセパラブルフラスコに1時間30分かけて滴下した。その後75℃に昇温し、さらに2時間重合を続けて、反応を完了させた(以上、第1ポリマー層の形成)。 After completion of the dropwise addition, the mixture was kept at 60 ° C. and stirred for 1 hour, and then 10.5 g of glycidyl methacrylate and 1.5 g of TMP as monomers, and paroyl were added to 75 g of a 0.5 wt% aqueous solution of sodium dodecylbenzenesulfonate in a separate container. A pre-emulsion in which 0.3 g was added and dispersed was dropped into the 1 L separable flask controlled at 60 ° C. over 1 hour and 30 minutes. Thereafter, the temperature was raised to 75 ° C., and polymerization was further continued for 2 hours to complete the reaction (formation of the first polymer layer).
次いで、磁気を用いて前記セパラブルフラスコ中の粒子を分離し、蒸留水を用いて洗浄した。以上の工程により、グリシジル基を有する第1ポリマー層が形成された磁性粒子(2−2)を得た。 Next, the particles in the separable flask were separated using magnetism and washed with distilled water. The magnetic particle (2-2) in which the 1st polymer layer which has a glycidyl group was formed by the above process was obtained.
磁性粒子(2)の代わりに磁性粒子(2−2)を用いて、上記「実施例1〜4」と同様の工程手順により、カルボキシル基導入磁性粒子(Ca−2−2)、活性エステル基導入磁性粒子(Ac−2−2)、アミノ基導入磁性粒子(Am−2−2)、アルデヒド基導入磁性粒子(AL−2−2)を得た。 By using the magnetic particles (2-2) instead of the magnetic particles (2), the carboxyl group-introduced magnetic particles (Ca-2-2) and the active ester groups are obtained by the same procedure as in the above “Examples 1-4”. Introduced magnetic particles (Ac-2-2), amino group-introduced magnetic particles (Am-2-2), and aldehyde group-introduced magnetic particles (AL-2-2) were obtained.
さらに、これらの磁性粒子(Ca−2−2)、(Ac−2−2)、(Am−2−2)、(AL−2−2)を用いて「実施例1〜4」と同様の手法により抗AFP抗体を感作し、プローブ(抗体)結合磁性粒子(抗体感作粒子)の分散液を得た。 Further, using these magnetic particles (Ca-2-2), (Ac-2-2), (Am-2-2), and (AL-2-2), the same as in "Examples 1-4" The anti-AFP antibody was sensitized by a technique to obtain a dispersion of probe (antibody) -bound magnetic particles (antibody-sensitized particles).
得られた抗体感作粒子の抗体結合量、CLEIAによるシグナル測定、およびノイズ測定の結果を表1に示す。 Table 1 shows the antibody binding amount of the obtained antibody-sensitized particles, signal measurement by CLEIA, and noise measurement results.
2.3.7.比較例3(グリシジル基を有する第1ポリマー層を形成しない例)
第1ポリマー層の形成において、グリシジルメタクリレート10.5gおよびTMP1.5gの代わりに、シクロヘキシルメタクリレート10.5gおよびメタクリル酸1.5gを用いる以外は比較例1と同様の手順にて、磁性粒子(2−3)を得た。
2.3.7. Comparative Example 3 (example in which the first polymer layer having a glycidyl group is not formed)
In the formation of the first polymer layer, in the same procedure as in Comparative Example 1 except that 10.5 g of cyclohexyl methacrylate and 1.5 g of methacrylic acid were used instead of 10.5 g of glycidyl methacrylate and 1.5 g of TMP, magnetic particles (2 -3) was obtained.
磁性粒子(2−3)の1wt%水分散液500μlをチューブに取り、磁気スタンドにて磁気分離し、上澄みを除去した。100mM MES(pH5)にて3回洗浄後、500μlの同Bufferに分散し、これに抗AFP抗体0.1mg、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)0.05mgを添加し、室温下5時間撹拌を行った。反応終了後、磁気分離して上澄みを除去した。次いで、PBS(−)緩衝液にて5回洗浄した後、PBS(−)緩衝液500μlで前記粒子を分散させて、プローブ(抗体)結合磁性粒子(抗体感作粒子)の分散液を得た。 500 μl of a 1 wt% aqueous dispersion of magnetic particles (2-3) was placed in a tube and magnetically separated using a magnetic stand, and the supernatant was removed. After washing 3 times with 100 mM MES (pH 5), 500 μl of the same buffer was dispersed, and 0.1 mg of anti-AFP antibody and 0.05 mg of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) were added thereto. The mixture was added and stirred at room temperature for 5 hours. After completion of the reaction, the supernatant was removed by magnetic separation. Next, after washing 5 times with PBS (−) buffer, the particles were dispersed with 500 μl of PBS (−) buffer to obtain a dispersion of probe (antibody) -bound magnetic particles (antibody-sensitized particles). .
得られた抗体感作粒子の抗体結合量、CLEIAによるシグナル測定、およびノイズ測定の結果を表1に示す。 Table 1 shows the antibody binding amount of the obtained antibody-sensitized particles, signal measurement by CLEIA, and noise measurement results.
表1によれば、実施例1〜3で得られた磁性粒子は、磁性母粒子および非磁性子粒子を被覆するように、極性基(アミノ基、活性エステル基、カルボキシル基、アルデヒド基)を有する第1ポリマー層が設けられていることにより、タンパク質や核酸等の非特異吸着が少ないため、生化学・医薬品分野で特出する高感度および低ノイズを発現し、生化学検査用として高いS/N比を得ることができることが理解できる。また、上記磁性粒子は、実施例1〜3で得られた磁性粒子は、磁性母粒子の表面を被覆するように非磁性子粒子が存在することにより、表面が凸凹であるので、単位重量あたりの表面積が大きいため、抗体の結合量が大きい。 According to Table 1, the magnetic particles obtained in Examples 1 to 3 have polar groups (amino groups, active ester groups, carboxyl groups, aldehyde groups) so as to cover the magnetic mother particles and the nonmagnetic child particles. By providing the first polymer layer, there is little non-specific adsorption of proteins, nucleic acids, etc., so that high sensitivity and low noise that are outstanding in the biochemistry / pharmaceutical field are expressed, and high S for biochemical testing. It can be seen that the / N ratio can be obtained. In addition, since the magnetic particles obtained in Examples 1 to 3 have uneven surfaces due to the presence of non-magnetic child particles so as to cover the surfaces of the magnetic mother particles, Because of the large surface area, the amount of antibody binding is large.
これに対して、比較例1で得られた磁性粒子は、第1ポリマー層への極性基の導入を行わなかったため、実施例1〜3で得られた磁性粒子と比較してノイズが大きかったと推測される。また、比較例2で得られた磁性粒子は、非磁性子粒子を含まないため、実施例1〜3で得られた磁性粒子と比較して抗体の結合量が少なかったと推測される。さらに、比較例3で得られた磁性粒子は、第1ポリマー層がグリシジル基を含まないため、実施例1〜3で得られた磁性粒子と比較してノイズが大きかったと推測される。 On the other hand, since the magnetic particles obtained in Comparative Example 1 did not introduce polar groups into the first polymer layer, the noise was larger than the magnetic particles obtained in Examples 1 to 3. Guessed. Moreover, since the magnetic particles obtained in Comparative Example 2 do not contain non-magnetic child particles, it is presumed that the amount of antibody binding was less than that of the magnetic particles obtained in Examples 1 to 3. Furthermore, since the 1st polymer layer does not contain a glycidyl group, it is estimated that the magnetic particle obtained by the comparative example 3 was noisy compared with the magnetic particle obtained by Examples 1-3.
Claims (9)
前記磁性母粒子および前記非磁性子粒子を被覆するように、グリシジル基を有する第1ポリマー層を形成する第2の工程、並びに、
前記第1ポリマー層に、アミノ基、アルデヒド基またはカルボキシル基を導入する第3の工程
を含む、磁性粒子の製造方法。 A first step of providing non-magnetic child particles having a particle size of d / 2 or less on the surface of magnetic base particles having a particle size of d,
A second step of forming a first polymer layer having a glycidyl group so as to cover the magnetic mother particles and the non-magnetic child particles; and
A method for producing magnetic particles, comprising a third step of introducing an amino group, an aldehyde group, or a carboxyl group into the first polymer layer.
前記磁性母粒子および前記非磁性子粒子を被覆するように、グリシジル基を有する第1ポリマー層を形成する第2の工程、並びに、
前記第1ポリマー層に、カルボキシル基を導入し、さらに、前記カルボキシル基を活性エステル基に変換する第3の工程
を含む、磁性粒子の製造方法。 A first step of providing non-magnetic child particles having a particle size of d / 2 or less on the surface of magnetic base particles having a particle size of d,
A second step of forming a first polymer layer having a glycidyl group so as to cover the magnetic mother particles and the non-magnetic child particles; and
A third step of introducing a carboxyl group into the first polymer layer and further converting the carboxyl group into an active ester group
A method for producing magnetic particles , comprising:
前記グリシジル基の一部を加水分解する工程をさらに含む、請求項1または2に記載の磁性粒子の製造方法。 The second step is a step of forming a first polymer layer having a plurality of glycidyl groups,
The method for producing magnetic particles according to claim 1, further comprising a step of hydrolyzing a part of the glycidyl group.
前記磁性母粒子の表面上に存在する粒径d/2以下の非磁性子粒子と、
前記磁性母粒子および前記非磁性子粒子を被覆するように設けられた、アミノ基および2,3−ジヒドロキシプロピル基を有する第1ポリマー層と、
を含む、磁性粒子。 Magnetic base particles having a particle size d;
Non-magnetic child particles having a particle diameter of d / 2 or less present on the surface of the magnetic mother particles;
A first polymer layer having an amino group and a 2,3-dihydroxypropyl group provided so as to cover the magnetic mother particle and the non-magnetic child particle;
Magnetic particles containing
前記磁性母粒子の表面上に存在する粒径d/2以下の非磁性子粒子と、
前記磁性母粒子および前記非磁性子粒子を被覆するように設けられた、アルデヒド基および2,3−ジヒドロキシプロピル基を有する第1ポリマー層と、
を含む、磁性粒子。 Magnetic base particles having a particle size d;
Non-magnetic child particles having a particle diameter of d / 2 or less present on the surface of the magnetic mother particles;
A first polymer layer having an aldehyde group and a 2,3-dihydroxypropyl group provided so as to cover the magnetic mother particle and the non-magnetic child particle;
Magnetic particles containing
前記磁性母粒子の表面上に存在する粒径d/2以下の非磁性子粒子と、
前記磁性母粒子および前記非磁性子粒子を被覆するように設けられた、カルボキシル基および2,3−ジヒドロキシプロピル基を有する第1ポリマー層と、
を含む、磁性粒子。 Magnetic base particles having a particle size d;
Non-magnetic child particles having a particle diameter of d / 2 or less present on the surface of the magnetic mother particles;
A first polymer layer having a carboxyl group and a 2,3-dihydroxypropyl group provided so as to cover the magnetic mother particle and the non-magnetic child particle;
Magnetic particles containing
前記磁性母粒子の表面上に存在する粒径d/2以下の非磁性子粒子と、
前記磁性母粒子および前記非磁性子粒子を被覆するように設けられた、活性エステル基および2,3−ジヒドロキシプロピル基を有する第1ポリマー層と、
を含む、磁性粒子。 Magnetic base particles having a particle size d;
Non-magnetic child particles having a particle diameter of d / 2 or less present on the surface of the magnetic mother particles;
A first polymer layer having an active ester group and a 2,3-dihydroxypropyl group provided so as to cover the magnetic mother particle and the non-magnetic child particle;
Magnetic particles containing
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JP5800149B2 (en) * | 2009-06-16 | 2015-10-28 | Jsr株式会社 | Target cell detection method |
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CN103134926B (en) * | 2013-02-27 | 2015-05-27 | 上海交通大学 | Magnetic microsphere carrier and its making method |
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Family Cites Families (6)
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