[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

JP5086974B2 - Ｐ−カドヘリン抗体 - Google Patents

Ｐ−カドヘリン抗体 Download PDF

Info

Publication number
JP5086974B2
JP5086974B2 JP2008289121A JP2008289121A JP5086974B2 JP 5086974 B2 JP5086974 B2 JP 5086974B2 JP 2008289121 A JP2008289121 A JP 2008289121A JP 2008289121 A JP2008289121 A JP 2008289121A JP 5086974 B2 JP5086974 B2 JP 5086974B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antibody
cadherin
antibodies
seq
binding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2008289121A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2009106287A (ja
Inventor
トッド バウエー クリストファー
ジェリ ボウナー マウリーン
ボイル メラニ−
フリ−ス キャスパーソン ジェラルド
ウィリアム グリッグス デイヴィッド
デイヴィッド ヘッド リチャード
ディーン ジョイ ウィリアム
アレン マッザレッラ リチャード
レイモンド ミンター ラルフ
アレン モファット マーク
リチャード シエレ バレット
リー ヴァナースダレ トッド
Original Assignee
ファイザー・インク
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ファイザー・インク filed Critical ファイザー・インク
Publication of JP2009106287A publication Critical patent/JP2009106287A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5086974B2 publication Critical patent/JP5086974B2/ja
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/582—Recycling of unreacted starting or intermediate materials

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている、２００５年４月２６日に出願された米国仮出願第６０／６７５，３１１号の優先権を主張するものである。
本発明は、Ｐ−カドヘリンと結合する抗体およびその抗原結合部分に関する。本発明はまた、そのような抗体および抗原結合部分をコードする核酸分子、Ｐ−カドヘリン抗体および抗原結合部分を作製する方法、これらの抗体および抗原結合部分を含む組成物、ならびに抗体、抗原結合部分、および組成物を使用する方法にも関する。
カドヘリンは、発生および組織ホメオスタシスの間の細胞間接着を制御する膜貫通糖タンパク質のスーパーファミリーである（Ｇｕｍｂｉｎｅｒ、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１４８：３９９〜４０４（２０００）；Ｙａｇｉら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１４：１１６９〜１１８０（２０００））。カドヘリンの細胞内ドメインは、カテニンやｐ１２０などの細胞質タンパク質と相互作用し、それによって、カドヘリンとアクチン細胞骨格との結合の基礎が形成される。カドヘリンは、５つの細胞外Ｃａ２＋結合ドメイン、および古典的カドヘリンの間で高度に保存されている小さな細胞質ドメインを有する。古典的カドヘリンファミリーの構成要素には、Ｐ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、およびＮ−カドヘリンが含まれる。カドヘリンなどの細胞接着分子は、癌細胞および転移細胞の細胞結合に重大な役割を果たすと考えられる（Ｆｕｒｕｋａｗａら、Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、３８（４）：３４３〜３５２（１９９７））。正常な成体組織中でのＰ−カドヘリン発現は低く、主として、筋上皮細胞、および重層上皮の基底層に制限されている（Ｓｈｉｍｏｙａｍａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４９：２１２８〜３３（１９８９））。Ｐ−カドヘリンは、クローン病や結腸炎などの炎症性腸疾患で上方制御される（Ｈａｒｄｙら、Ｇｕｔ、５０：５１３〜５１９（２００２））。異常なＰ−カドヘリン発現が、細胞増殖、ならびに結腸、乳房、肺、甲状腺、および子宮頚部の腫瘍と関係することも、広範な一連の証拠から現在明らかとなっている（Ｇａｍａｌｌｏ、Ｍｏｄｅｒｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、１４：６５０〜６５４、（２００１）；およびＳｔｅｆａｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２２（７）：１２４２〜１２５２（２００４））。ヒトＰ−カドヘリンは、外陰類表皮癌に対して産生させたＮＣＣ−ＣＡＤ−２９９モノクローナル抗体によって抗原認識されることが報告された（Ｓｈｉｍｏｙａｍａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４９：２１２８〜２１３３（１９８９））。Ｐ−カドヘリンが媒介する接着および細胞内シグナル伝達を調節すると、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍細胞の増殖および生存が低下すると予想される。
したがって、細胞増殖および固形腫瘍の進行においてＰ−カドヘリンが有すると思われる中心的な役割を考慮すると、様々な癌の患者に治療上の利益をもたらすことができる、Ｐ−カドヘリンに対する抗体を生成することが望ましい。
本発明の一態様は、Ｐ−カドヘリン抗体またはその抗原結合部分であり、抗体またはその抗原結合部分は、下記のＡ）からＫ）で記載する複数の機能的特性のうち少なくとも１つを有する。
Ａ）例えば、一実施形態では、抗体またはその抗原結合部分は、Ｅ−カドヘリン（ＫＤ（Ｅ））よりＰ−カドヘリン（ＫＤ（Ｐ））に対して大きい結合親和性を有する。一実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合部分は、１．５以上のＫＤ（Ｅ）／ＫＤ（Ｐ）を有する。さらなる実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合部分は、２以上の、３以上の、５以上の、１０以上の、２０以上の、５０以上の、１００以上の、２００以上の、５００以上の、または１０００以上のＫＤ（Ｅ）／ＫＤ（Ｐ）を有する。ＫＤ（Ｅ）値が０など非常に小さくなり得るので、通常はＫＤ（Ｅ）／ＫＤ（Ｐ）の値に上限はない。しかし、実際的な目的で、ＫＤ（Ｅ）／ＫＤ（Ｐ）の上限は、１×１０６となり得る。Ｐ−カドヘリンとＥ−カドヘリンの両方に対するそのようなＫＤ値は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、フローサイトメトリーやＢＩＡＣＯＲＥ（商標）などの表面プラズモン共鳴など、当業者に知られている任意の技術によって測定することができる。
Ｂ）他の実施形態では、抗体またはその部分は、表面プラズモン共鳴によって測定される１０００ｎＭ以下のＫＤでＰ−カドヘリンと結合する。さらなる実施形態では、抗体または部分は、表面プラズモン共鳴によって測定される５００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、５００ｐＭ未満、または１００ｐＭ未満のＫＤでＰ−カドヘリンと結合する。通常はＫＤの値に下限はない。しかし、実際的な目的で、下限は約１ｐＭであると想定することができる。
Ｃ）他の実施形態では、抗体またはその部分は、表面プラズモン共鳴によって測定される０．０１ｓ−１以下のＰ−カドヘリンに対する解離速度（Ｋｏｆｆ）を有する。例えば、特定の実施形態では、抗体または部分は、０．００５ｓ−１未満の、０．００４ｓ−１未満の、０．００３ｓ−１未満の、０．００２ｓ−１未満の、または０．００１ｓ−１未満の、Ｐ−カドヘリンに対するＫｏｆｆを有する。通常はＫｏｆｆの値に下限はない。しかし、実際的な目的で、下限は約１×１０−７ｓ−１であると想定することができる。
Ｄ）他の実施形態では、Ｐ−カドヘリン抗体またはその部分は、Ｐ−カドヘリン依存性細胞接着アッセイによって測定される１００ｎＭ以下のＩＣ５０を有する。さらなる実施形態では、前記ＩＣ５０は、５０ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、５００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、または１０ｐＭ未満であり、それはＰ−カドヘリン依存性細胞接着アッセイによって測定される。通常は、Ｐ−カドヘリン依存性細胞接着アッセイによって測定されるＩＣ５０の値に下限はない。しかし、実際的な目的で、下限は約１ｐＭであると想定することができる。
Ｅ）他の実施形態では、Ｐ−カドヘリン抗体またはその部分は、Ｐ−カドヘリン依存性細胞凝集アッセイによって測定される１００ｎＭ以下のＩＣ５０を有する。さらなる実施形態では、前記ＩＣ５０は、５０ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、５００ｐＭ未満、２００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、または１ｐＭ未満であり、それはＰ−カドヘリン依存性細胞凝集アッセイによって測定される。通常は、Ｐ−カドヘリン依存性細胞凝集アッセイによって測定されるＩＣ５０の値に下限はない。しかし、実際的な目的で、下限は約１ｐＭであると想定することができる。
Ｆ）他の実施形態では、Ｐ−カドヘリン抗体またはその部分は、Ｐ−カドヘリン依存性スフェロイド破壊アッセイで、ＩｇＧが存在しない対照試料と比較してスフェロイド破壊を少なくとも２倍増大させる。さらなる実施形態では、Ｐ−カドヘリン抗体またはその部分は、Ｐ−カドヘリン依存性スフェロイド破壊アッセイで、ＩｇＧが存在しない対照試料と比較して、スフェロイド破壊を少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも６倍、少なくとも１０倍、または少なくとも１５倍増大させる。
Ｇ）他の実施形態では、Ｐ−カドヘリン抗体またはその部分は、Ｐ−カドヘリンとの結合について、１９４−ｅ０６；１９４−ａ０２；１９４−ｂ０９；１９５−ｅ１１；１９４−ｇ０９；１９６−ｈ０２；１９４−ｅ０１；１９６−ｄ１０；１９６−ｇ０３；１９６−ｅ０６；１９５−ａ０９；１９８−ａ０９；２００−ｈ０６；ｇ−１９４−ｂ０９；ｇ−１９４−ｇ０９；ｇ−１９６−ｇ０３；ｇ−１９６−ｈ０２；ｇ−１９４−ｅ０１；ｇ−１９４−ｅ０６；１２９−１ｃ４；およびｇ−１２９−１ｃ４からなる群から選択される抗体と競合する。
Ｈ）他の実施形態では、Ｐ−カドヘリン抗体またはその部分は、Ｐ−カドヘリンとの結合について、１９４−ｅ０６；１９４−ａ０２；１９４−ｂ０９；１９５−ｅ１１；１９４−ｇ０９；１９６−ｈ０２；１９４−ｅ０１；１９６−ｄ１０；１９６−ｇ０３；１９６−ｅ０６；１９５−ａ０９；１９８−ａ０９；２００−ｈ０６；ｇ−１９４−ｂ０９；ｇ−１９４−ｇ０９；ｇ−１９６−ｇ０３；ｇ−１９６−ｈ０２；ｇ−１９４−ｅ０１；ｇ−１９４−ｅ０６；１２９−１ｃ４；およびｇ−１２９−１ｃ４からなる群から選択される抗体と交差競合する。
Ｉ）他の実施形態では、Ｐ−カドヘリン抗体またはその部分は、１９４−ｅ０６；１９４−ａ０２；１９４−ｂ０９；１９５−ｅ１１；１９４−ｇ０９；１９６−ｈ０２；１９４−ｅ０１；１９６−ｄ１０；１９６−ｇ０３；１９６−ｅ０６；１９５−ａ０９；１９８−ａ０９；２００−ｈ０６；ｇ−１９４−ｂ０９；ｇ−１９４−ｇ０９；ｇ−１９６−ｇ０３；ｇ−１９６−ｈ０２；ｇ−１９４−ｅ０１；ｇ−１９４−ｅ０６；１２９−１ｃ４；およびｇ−１２９−１ｃ４からなる群から選択される抗体と同じＰ−カドヘリンのエピトープと結合する。
Ｊ）他の実施形態では、Ｐ−カドヘリン抗体またはその部分は、１９４−ｅ０６；１９４−ａ０２；１９４−ｂ０９；１９５−ｅ１１；１９４−ｇ０９；１９６−ｈ０２；１９４−ｅ０１；１９６−ｄ１０；１９６−ｇ０３；１９６−ｅ０６；１９５−ａ０９；１９８−ａ０９；２００−ｈ０６；ｇ−１９４−ｂ０９；ｇ−１９４−ｇ０９；ｇ−１９６−ｇ０３；ｇ−１９６−ｈ０２；ｇ−１９４−ｅ０１；ｇ−１９４−ｅ０６；１２９−１ｃ４；およびｇ−１２９−１ｃ４からなる群から選択される抗体と実質的に同じＫＤでＰ−カドヘリンと結合する。
Ｋ）他の実施形態では、Ｐ−カドヘリン抗体またはその部分は、１９４−ｅ０６；１９４−ａ０２；１９４−ｂ０９；１９５−ｅ１１；１９４−ｇ０９；１９６−ｈ０２；１９４−ｅ０１；１９６−ｄ１０；１９６−ｇ０３；１９６−ｅ０６；１９５−ａ０９；１９８−ａ０９；２００−ｈ０６；ｇ−１９４−ｂ０９；ｇ−１９４−ｇ０９；ｇ−１９６−ｇ０３；ｇ−１９６−ｈ０２；ｇ−１９４−ｅ０１；ｇ−１９４−ｅ０６；１２９−１ｃ４；およびｇ−１２９−１ｃ４からなる群から選択される抗体と実質的に同じＫｏｆｆでＰ−カドヘリンと結合する。
本発明のさらなる態様は、配列番号１〜１３および３２０〜３２５のいずれか１つとアミノ酸配列が少なくとも９０％同一であるＶＨドメインを含む、前記のＡ）からＫ）で記載した機能的特性のうち少なくとも１つを有する抗体またはその抗原結合部分である。一実施形態では、前記ＶＨドメインは、配列番号１〜１２および３２０〜３２５のいずれか１つとアミノ酸配列が少なくとも９１％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である。
さらなる実施形態では、抗体またはその部分は、前記のＡ）からＫ）で記載した機能的特性のうち少なくとも１つを有し、配列番号１〜１３および３２０〜３２５のいずれか１つであり、または少なくとも１個の保存的アミノ酸置換を有することにより配列番号１〜１３および３２０〜３２５のいずれか１つと異なるＶＨドメインを含む。例えば、ＶＨドメインは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の保存的アミノ酸置換により配列番号１〜１３および３２０〜３２５のいずれか１つと異なる可能性がある。さらなる実施形態では、これらの保存的アミノ酸置換のいずれかは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３領域中で起こり得る。
本発明のさらなる態様は、配列番号１４〜２３および３２６〜３３１のいずれか１つとアミノ酸配列が少なくとも９０％同一であるＶＬドメインを含む、前記のＡ）からＫ）で記載した機能的特性のうち少なくとも１つを有する抗体またはその抗原結合部分である。一実施形態では、前記ＶＬドメインは、配列番号１４〜２３および３２６〜３３１のいずれか１つとアミノ酸配列が少なくとも９１％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一である。
さらなる実施形態では、抗体またはその部分は、前記のＡ）からＫ）で記載した機能的特性のうち少なくとも１つを有し、配列番号１４〜２３および３２６〜３３１のいずれか１つであり、または少なくとも１個の保存的アミノ酸置換を有することにより配列番号１４〜２３および３２６〜３３１のいずれか１つと異なるＶＬドメインを含む。例えば、ＶＬドメインは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の保存的アミノ酸置換により配列番号１４〜２３および３２６〜３３１のいずれか１つと異なる可能性がある。さらなる実施形態では、これらの保存的アミノ酸置換のいずれかは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３領域中で起こり得る。
本発明の他の態様は、前記のＡ）からＫ）で記載した機能的特性のうち少なくとも１つを有する抗体またはその抗原結合部分であり、そのＶＬおよびＶＨドメインは、抗体１９４−ｅ０６；１９４−ａ０２；１９４−ｂ０９；１９５−ｅ１１；１９４−ｇ０９；１９６−ｈ０２；１９４−ｅ０１；１９６−ｄ１０；１９６−ｇ０３；１９６−ｅ０６；１９５−ａ０９；１９８−ａ０９；２００−ｈ０６；ｇ−１９４−ｂ０９；ｇ−１９４−ｇ０９；ｇ−１９６−ｇ０３；ｇ−１９６−ｈ０２；ｇ−１９４−ｅ０１；ｇ−１９４−ｅ０６；１２９−１ｃ４；およびｇ−１２９−１ｃ４のいずれか１つのＶＬおよびＶＨドメインとアミノ酸配列がそれぞれ少なくとも９０％同一である。例えば、ＶＬおよびＶＨドメインは、抗体１９４−ｅ０６；１９４−ａ０２；１９４−ｂ０９；１９５−ｅ１１；１９４−ｇ０９；１９６−ｈ０２；１９４−ｅ０１；１９６−ｄ１０；１９６−ｇ０３；１９６−ｅ０６；１９５−ａ０９；１９８−ａ０９；２００−ｈ０６；ｇ−１９４−ｂ０９；ｇ−１９４−ｇ０９；ｇ−１９６−ｇ０３；ｇ−１９６−ｈ０２；ｇ−１９４−ｅ０１；ｇ−１９４−ｅ０６；１２９−１ｃ４；およびｇ−１２９−１ｃ４のいずれか１つのＶＬおよびＶＨドメインとアミノ酸配列がそれぞれ少なくとも９１％、９３％、９５％、９７％、９９％または１００％同一である。
本発明の他の態様は、ａ）配列番号１で示されるＶＨドメイン、および配列番号１４で示されるＶＬドメインを含む抗体またはその部分；ｂ）配列番号２で示されるＶＨドメイン、および配列番号１４で示されるＶＬドメインを含む抗体またはその部分；ｃ）配列番号２で示されるＶＨドメイン、および配列番号１５で示されるＶＬドメインを含む抗体またはその部分；ｄ）配列番号３で示されるＶＨドメイン、および配列番号１６で示されるＶＬドメインを含む抗体またはその部分；ｅ）配列番号４で示されるＶＨドメイン、および配列番号１７で示されるＶＬドメインを含む抗体またはその部分；ｆ）配列番号４で示されるＶＨドメイン、および配列番号２３で示されるＶＬドメインを含む抗体またはその部分；ｇ）配列番号５で示されるＶＨドメイン、および配列番号１８で示されるＶＬドメインを含む抗体またはその部分；ｈ）配列番号６で示されるＶＨドメイン、および配列番号２３で示されるＶＬドメインを含む抗体またはその部分；ｉ）配列番号７で示されるＶＨドメイン、および配列番号２３で示されるＶＬドメインを含む抗体またはその部分；ｊ）配列番号８で示されるＶＨドメイン、および配列番号２３で示されるＶＬドメインを含む抗体またはその部分；ｋ）配列番号９で示されるＶＨドメイン、および配列番号２３で示されるＶＬドメインを含む抗体またはその部分；ｌ）配列番号１０で示されるＶＨドメイン、および配列番号１９で示されるＶＬドメインを含む抗体またはその部分；ｍ）配列番号１１で示されるＶＨドメイン、および配列番号２０で示されるＶＬドメインを含む抗体またはその部分；ｎ）配列番号１２で示されるＶＨドメイン、および配列番号２１で示されるＶＬドメインを含む抗体またはその部分；ｏ）配列番号１３で示されるＶＨドメイン、および配列番号２２で示されるＶＬドメインを含む抗体またはその部分；ｐ）配列番号３２０で示されるＶＨドメイン、および配列番号３２６で示されるＶＬドメインを含む抗体またはその部分；ｑ）配列番号３２１で示されるＶＨドメイン、および配列番号３２７で示されるＶＬドメインを含む抗体またはその抗原結合部分；ｒ）配列番号３２２で示されるＶＨドメイン、および配列番号３２８で示されるＶＬドメインを含む抗体またはその部分；ｓ）配列番号３２３で示されるＶＨドメイン、および配列番号３２９で示されるＶＬドメインを含む抗体またはその部分；ｔ）配列番号３２４で示されるＶＨドメイン、および配列番号３３０で示されるＶＬドメインを含む抗体またはその部分；ならびにｕ）配列番号３２５で示されるＶＨドメイン、および配列番号３３１で示されるＶＬドメインを含む抗体またはその部分からなる群から選択される抗体またはその抗原結合部分である。
さらなる実施形態では、上記のａ）〜ｕ）の群で記載した抗体またはその部分のいずれかで、ＶＨおよび／またはＶＬドメインは、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換により、その中に列挙した特定の配列番号と異なる可能性がある。例えば、ＶＨおよび／またはＶＬドメインは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の保存的アミノ酸置換により、列挙した配列番号と異なる可能性がある。さらなる実施形態では、これらの保存的アミノ酸置換のいずれかは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３領域中で起こり得る。
他の実施形態では、本発明は、前記のＡ）からＫ）で記載した機能的特性のうち少なくとも１つを有する抗体またはその抗原結合部分を提供し、それは、配列番号１〜１３および３２０〜３２５のいずれか１つから独立に選択されるＶＨドメイン、または少なくとも１個の保存的アミノ酸置換により配列番号１〜１３および３２０〜３２５のいずれか１つと異なる配列を含み、配列番号１４〜２３および３２６〜３３１のいずれか１つから独立に選択されるＶＬドメイン、または少なくとも１個の保存的アミノ酸置換により配列番号１４〜２３および３２６〜３３１のいずれか１つと異なる配列をさらに含む。例えば、ＶＨおよびＶＬドメインは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の保存的アミノ酸置換により、配列番号１〜１３、３２０〜３２５、１４〜２３、および３２６〜３３１のいずれか１つとそれぞれ独立に異なる可能性がある。
さらなる実施形態では、本発明は、前記のＡ）からＫ）で記載した機能的特性のうち少なくとも１つを有する抗体またはその抗原結合部分を提供し、前記抗体または部分は、配列番号２６〜３７および９１〜２５６のいずれか１つから選択されるＶＨＣＤＲ３、または少なくとも１個の保存的アミノ酸置換により配列番号２６〜３７および９１〜２５６のいずれか１つと異なる配列を含む。例えば、ＶＨＣＤＲ３は、１、２、３、または４個の保存的アミノ酸置換により、配列番号２６〜３７および９１〜２５６のいずれか１つと異なる可能性がある。
さらなる実施形態では、本発明は、前記のＡ）からＫ）で記載した機能的特性のうち少なくとも１つを有する抗体またはその抗原結合部分を提供し、前記抗体または抗原結合部分は、配列番号４０〜４７および２５７〜３１９のいずれか１つから選択されるＶＬＣＤＲ３、または少なくとも１個の保存的アミノ酸置換により配列番号４０〜４７および２５７〜３１９のいずれか１つと異なる配列を含む。例えば、ＶＬＣＤＲ３は、１、２、３、４または５個の保存的アミノ酸置換により、配列番号４０〜４７および２５７〜３１９のいずれか１つと異なる可能性がある。
さらなる実施形態では、本発明は、抗体またはその抗原結合部分を提供し、前記抗体または抗原結合部分は、配列番号２４で示されるＶＨＣＤＲ１、または少なくとも１個の保存的アミノ酸置換により配列番号２４と異なる配列；配列番号２５で示されるＶＨＣＤＲ２、または少なくとも１個の保存的アミノ酸置換により配列番号２５と異なる配列；ならびに配列番号２６〜３７および９１〜２５６のいずれか１つから独立に選択されるＶＨＣＤＲ３、または少なくとも１個の保存的アミノ酸置換により配列番号２６〜３７および９１〜２５６のいずれか１つと異なる配列を含む。例えば、上記に挙げたＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、１、２、３、４または５個の保存的アミノ酸置換により、列挙したそれぞれの配列番号とそれぞれ独立に異なる可能性がある。
さらなる実施形態では、本発明は、抗体またはその抗原結合部分を提供し、前記抗体または抗原結合部分は、配列番号３８で示されるＶＬＣＤＲ１、または少なくとも１個の保存的アミノ酸置換により配列番号３８と異なる配列；配列番号３９で示されるＶＬＣＤＲ２、または少なくとも１個の保存的アミノ酸置換により配列番号３９と異なる配列；ならびに配列番号４０〜４７および２５７〜３１９のいずれか１つから独立に選択されるＶＬＣＤＲ３、または少なくとも１個の保存的アミノ酸置換により配列番号４０〜４７および２５７〜３１９のいずれか１つと異なる配列を含む。例えば、上記に挙げたＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、１、２、３、４または５個の保存的アミノ酸置換により、列挙したそれぞれの配列番号とそれぞれ独立に異なる可能性がある。
本発明は、抗体またはその抗原結合部分をさらに提供し、前記抗体または抗原結合部分は、配列番号２４で示されるＶＨＣＤＲ１；配列番号２５で示されるＶＨＣＤＲ２；配列番号２６〜３７および９１〜２５６のいずれか１つから選択されるＶＨＣＤＲ３；配列番号３８で示されるＶＬＣＤＲ１；配列番号３９で示されるＶＬＣＤＲ２；ならびに配列番号４０〜４７および２５７〜３１９のいずれか１つから選択されるＶＬＣＤＲ３を含む。さらなる実施形態では、挙げたＶＨおよびＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列はまた、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換により、上記で列挙した特定の配列番号とそれぞれ独立に異なる可能性もある。例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、１、２、３、４、または５個の保存的アミノ酸置換により、上記で列挙したそれぞれの特定の配列番号とそれぞれ独立に異なる可能性がある。
本発明は、抗体またはその抗原結合部分をさらに提供し、前記抗体または抗原結合部分は、抗体１９４−ｅ０６；１９４−ａ０２；１９４−ｂ０９；１９５−ｅ１１；１９４−ｇ０９；１９６−ｈ０２；１９４−ｅ０１；１９６−ｄ１０；１９６−ｇ０３；１９６−ｅ０６；１９５−ａ０９；１９８−ａ０９；２００−ｈ０６；ｇ−１９４−ｂ０９；ｇ−１９４−ｇ０９；ｇ−１９６−ｇ０３；ｇ−１９６−ｈ０２；ｇ−１９４−ｅ０１；ｇ−１９４−ｅ０６；１２９−１ｃ４；およびｇ１２９−１ｃ４のいずれかの中で認められるＶＨおよびＶＬのＣＤＲ１、ＶＨおよびＶＬのＣＤＲ２、およびＶＨおよびＶＬのＣＤＲ３を含む。
本発明は、配列番号１〜１３および３２０〜３２５のいずれか１つから選択され、または１〜１０個の保存的アミノ酸置換により配列番号１〜１３および３２０〜３２５のいずれか１つと異なるＶＨドメインを含む抗体またはその抗原結合部分をさらに提供する。
本発明は、配列番号１４〜２３および３２６〜３３１のいずれか１つから選択され、または１〜１０個の保存的アミノ酸置換により配列番号１４〜２３および３２６〜３３１のいずれか１つと異なるＶＬドメインを含む抗体またはその抗原結合部分をさらに提供する。
本発明は、配列番号１〜１３および３２０〜３２５のいずれか１つから独立に選択されるＶＨドメイン、または１〜１０個の保存的アミノ酸置換により配列番号１〜１３および３２０〜３２５のいずれか１つと異なる配列を含み、配列番号１４〜２３および３２６〜３３１のいずれか１つから独立に選択されるＶＬドメイン、または１〜１０個の保存的アミノ酸置換により配列番号１４〜２３および３２６〜３３１のいずれか１つと異なる配列をさらに含む抗体またはその抗原結合部分をさらに提供する。
本発明は、抗体またはその抗原結合部分をさらに提供し、前記抗体または抗原結合部分は、配列番号２４で示されるＶＨＣＤＲ１、または１〜４個の保存的アミノ酸置換により配列番号２４と異なる配列；配列番号２５で示されるＶＨＣＤＲ２、または１〜４個の保存的アミノ酸置換により配列番号２５と異なる配列；ならびに配列番号２６〜３７および９１〜２５６のいずれか１つから選択されるＶＨＣＤＲ３、または１〜４個の保存的アミノ酸置換により配列番号２６〜３７および９１〜２５６のいずれか１つと異なる配列を含む。
本発明は、抗体またはその抗原結合部分をさらに提供し、前記抗体または抗原結合部分は、配列番号３８で示されるＶＬＣＤＲ１、または１〜４個の保存的アミノ酸置換により配列番号３８と異なる配列；配列番号３９で示されるＶＬＣＤＲ２、または１〜４個の保存的アミノ酸置換により配列番号３９と異なる配列；ならびに配列番号４０〜４７および２５７〜３１９のいずれか１つから選択されるＶＬＣＤＲ３、または１〜４個の保存的アミノ酸置換により配列番号４０〜４７および２５７〜３１９のいずれか１つと異なる配列を含む。
本発明は、前記のＡ）からＫ）で記載した機能的特性のうち少なくとも１つを有する抗体またはその抗原結合部分をさらに提供し、前記抗体または抗原結合部分は、配列番号４８で示されるＶＨＦＲ１；配列番号４９で示されるＶＨＦＲ２；配列番号５０〜５５のいずれか１つから選択されるＶＨＦＲ３；配列番号５６および５７のいずれか１つから選択されるＶＨＦＲ４；配列番号５８および５９のいずれか１つから選択されるＶＬＦＲ１；配列番号６０〜６２のいずれか１つから選択されるＶＬＦＲ２；配列番号６３〜６６のいずれか１つから選択されるＶＬＦＲ３；ならびに配列番号６７で示されるＶＬＦＲ４を含む。さらなる実施形態では、挙げたＶＨおよびＶＬのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４配列はまた、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換により、上記で列挙した特定の配列番号とそれぞれ独立に異なる可能性もある。例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の保存的アミノ酸置換により、上記で列挙したそれぞれの特定の配列番号とそれぞれ独立に異なる可能性がある。さらなる実施形態では、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４配列のいずれかは、それぞれ独立に突然変異して、それぞれの生殖系列フレームワーク配列と適合する可能性がある。
本発明のさらなる実施形態は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、またはＩｇＤ分子であり、あるいはそれに由来する、本明細書に記載の抗体のいずれかである。例えば、抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２でよい。例えば、一実施形態では、ＩｇＧはＩｇＧ１であり、重鎖定常領域は配列番号３４４を含み、軽鎖定常領域は配列番号３４５を含み、ただし配列番号３４４のＣ末端リシン残基は切断されていてもよい。
他の実施形態は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂｓ’）２断片、Ｆｖ断片、単鎖Ｆｖ断片、単鎖ＶＨ断片、単鎖ＶＬ断片、ヒト化抗体、キメラ抗体または二重特異性抗体である、上記に記載の抗体または抗原結合部分のいずれかを提供する。
さらなる実施形態は、本明細書に記載の抗体またはその部分のいずれか、および少なくとも１つのさらなる分子成分を含む誘導体化抗体または抗原結合部分である。例えば、少なくとも１つのさらなる分子成分は、他の抗体（例えば、二重特異性抗体またはｄｉａｂｏｄｙ）、検出用作用物質、標識、細胞傷害作用物質、医薬作用物質、および／あるいは抗体または抗体の部分と他の分子（ストレプトアビジン中核領域やポリヒスチジンタグなど）の結合を媒介することができるタンパク質またはペプチドでよい。例えば、本発明の抗体または抗原結合部分を誘導体化することができる有用な検出用作用物質には、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、塩化５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニル、フィコエリスリン、ランタニドリン光体などを含めた蛍光化合物がある。抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどの検出に有用な酵素で標識することもできる。さらなる実施形態では、本発明の抗体またはその部分は、ビオチンで、または二次的レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーの対の配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）で標識することもできる。本発明のさらなる実施形態では、抗体またはその部分のいずれかは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチルまたはエチル基や、含水炭素基などの化学基で誘導体化することもできる。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されているＰ−カドヘリン抗体または抗原結合部分は、固体支持体と結合している。
いくつかの実施形態では、本発明のＰ−カドヘリン抗体のいずれかの重鎖のＣ末端のリシンは切断されている。本発明の様々な実施形態では、Ｐ−カドヘリン抗体の重鎖および軽鎖は、Ｎ末端シグナル配列を含んでもよい。例えば、重鎖シグナル配列は配列番号３４６でよく、軽鎖シグナル配列は配列番号３４７でよい。
さらなる実施形態では、本発明は、ヒト由来である、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合部分のいずれかに関する。
本発明はまた、上記に記載の抗体またはその抗原結合部分のいずれか、および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物をも提供する。
他の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合部分のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子に関する。特定の一実施形態は、配列番号６８〜９０および３３２〜３４３のいずれか１つで示されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子である。本発明はさらに、本明細書に記載の核酸分子のいずれかを含むベクターに関し、ベクターは、核酸分子と作動的に連結した発現調節配列を含んでもよい。
他の実施形態は、本明細書に記載のベクターのいずれか１つを含み、または本明細書に記載の核酸分子のいずれか１つを含む宿主細胞を提供する。本発明はまた、本明細書に記載の抗体または抗原結合部分のいずれかを産生し、あるいは前記抗体または前記抗原結合部分のいずれかの重鎖または軽鎖を産生する単離細胞系統をも含む。
他の実施形態では、本発明は、Ｐ−カドヘリン抗体またはその抗原結合部分を作製する方法に関し、その方法は、本明細書に記載の宿主細胞または細胞系統を適切な条件下で培養するステップと、前記抗体または抗原結合部分を回収するステップとを含む。
本発明はまた、本明細書に記載の核酸のいずれかを含む非ヒト遺伝子導入動物または遺伝子導入植物にも関し、非ヒト遺伝子導入動物または遺伝子導入植物は前記核酸を発現する。
本発明は、Ｐ−カドヘリンと結合する抗体またはその抗原結合部分を単離する方法をさらに提供し、その方法は、本明細書に記載の非ヒト遺伝子導入動物または遺伝子導入植物から抗体を単離するステップを含む。
本発明はまた、その必要がある哺乳動物中の異常細胞増殖を治療する方法をも提供し、その方法は、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合部分のいずれかあるいは医薬組成物のいずれかを前記哺乳動物に投与するステップを含む。本発明は、Ｐ−カドヘリンと結合する抗体またはその抗原結合部分で、その必要がある哺乳動物中の異常細胞増殖を治療する方法をさらに提供し、その方法は、本明細書に記載の核酸分子のいずれかを、前記核酸分子の発現を可能にする適切な条件下で前記哺乳動物に有効量投与するステップとを含む。他の実施形態では、異常細胞増殖を治療する方法は、抗腫瘍剤、抗血管新生剤、シグナル伝達阻害剤、および抗増殖剤から選択される１つまたは複数の物質を、前記異常細胞増殖を治療する際に一緒に有効となる量投与するステップをさらに含む。特定の実施形態では、前記異常細胞増殖は、癌性のものである。
本発明は、Ｐ−カドヘリン依存性細胞凝集を低下させる方法をさらに提供し、その方法は、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合部分のいずれかあるいは本明細書に記載の医薬組成物のいずれかと細胞を接触させるステップを含む。
本発明の他の態様は、ヒトＶＨ−３ファミリー遺伝子を利用する重鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体またはその抗原結合部分である。一実施形態では、例えば、ヒトＶＨ−３ファミリー遺伝子はＶＨ−３−２３である。
本発明の他の態様は、ヒト抗体である、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合部分のいずれかを提供する。さらなる態様では、前記抗体または抗原結合部分はヒト組換え抗体である。
本発明はまた、Ｐ−カドヘリン抗体またはその抗原結合部分を作製する方法をも提供し、その方法は、ファージ上のヒト抗体のライブラリーを合成するステップと、Ｐ−カドヘリンまたはその抗原性部分でライブラリーをスクリーニングするステップと、Ｐ−カドヘリンと結合するファージを単離するステップと、ファージから抗体を得るステップとを含む。
定義および一般的技術
本明細書において別段定義しない限り、本発明に関して使用した科学技術用語は、当業者に通常理解されている意味を含むものとする。さらに、文脈上別段に必要としない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関して使用した命名法およびその技術は、当技術分野で周知のものであり、通常使用されている。
本発明の方法および技術は一般に、別段示さない限り、当技術分野で周知である従来の方法に従って、本明細書全体にわたって引用し論じた種々の一般的参照文献およびより具体的な参照文献に記載されているように実施する。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれている、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（２０００）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００２）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９９８）；ならびにＣｏｌｉｇａｎら、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００３）を参照されたい。酵素反応および精製技術は、当技術分野で通常行われるように、または本明細書に記載のように、製造業者の仕様書に従って実施する。本明細書に記載の分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品および製薬化学に関して使用した命名法ならびにその実験手順および技術は、当技術分野で周知のものであり、通常使用されている。化学合成、化学分析、製剤、処方、送達、および患者の治療には標準的な技術を使用する。
基本的な抗体の構造単位は、テトラマーを含むことが知られている。各テトラマーは、ポリペプチド鎖の２つの同一の対からなり、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識に関与する、約１００〜１２０個以上のアミノ酸からなる可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主としてエフェクター機能に関与する定常領域を規定する。ヒト軽鎖は、κおよびλ軽鎖に分類される。重鎖は、μ、δ、γ、α、またはεに分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥと定義する。重鎖および軽鎖内で、可変領域および定常領域は、約１２個以上のアミノ酸からなる「Ｊ」領域によって結合され、重鎖は、約３個以上のアミノ酸からなる「Ｄ」領域も含む。一般的には、（すべての目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれている）Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第７章（Ｐａｕｌ，Ｗ．編、第２版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州（１９８９））を参照されたい。重鎖／軽鎖の各対の可変領域（ＶＨおよびＶＬ）は、抗体結合部位を形成する。したがって、例えば、完全ＩｇＧ抗体は、２つの結合部位を有する。二機能性または二重特異性抗体を除いて、２つの結合部位は同じである。
重鎖および軽鎖の可変領域は、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域によって結合される比較的保存されているフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示す。「可変」という用語は、可変ドメインの特定の部分の配列が抗体間で大きく異なることを指し、特定の各抗体の、その特定の抗原に対する結合および特異性において使用される。しかし、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均一に分布しているわけではなく、より高度に保存されているＦＲで分離されているＣＤＲ中に集中している。各対の２つの鎖のＣＤＲはＦＲによって整列され、それによって特定のエピトープとの結合が可能となる。Ｎ末端からＣ末端までに、軽鎖も重鎖もドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインに対するアミノ酸の割り当ては、その開示が参照により本明細書に組み込まれている、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、メリーランド州Ｂｅｔｈｅｓｄａ（１９８７および１９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１〜９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：８７８〜８８３（１９８９）の定義に従っている。
下記の用語は、別段示さない限り、下記の意味を有すると理解されるものとする：
特に別段示さない限り、「Ｐ−カドヘリン」という用語はヒトＰ−カドヘリンを指し、それは内在性膜タンパク質であり、細胞間接着を制御する膜貫通糖タンパク質の古典的カドヘリンファミリーの構成要素である。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれているＳｈｉｍｏｙａｍａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１０９（４ Ｐｔ １）、１７８７〜１７９４（１９８９）でヒトＰ−カドヘリンのクローン化および配列が報告されている。Ｐ−カドヘリンという用語は、組換えヒトＰ−カドヘリンおよび組換えキメラ型のＰ−カドヘリンを含むものとし、それは、標準的な組換え発現法によって調製することもでき、あるいは商業的に購入することもできる（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ８６１−ＰＣ−１００）。
特に別段示さない限り、本明細書において「Ｅ−カドヘリン」という用語はヒトＥ−カドヘリンを指し、それは内在性膜タンパク質であり、細胞間接着を制御する膜貫通糖タンパク質の古典的カドヘリンファミリーの構成要素である。Ｅ−カドヘリンは、例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれているＴａｋｅｉｃｈｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：１４５１〜１４５５（１９９１）で記載されている。Ｅ−カドヘリンという用語は、組換えヒトＥ−カドヘリンおよび組換えキメラ型のＥ−カドヘリンを含むものとし、それは、標準的な組換え発現法によって調製することもでき、あるいは商業的に購入することもできる（Ｒ＆Ｄ ６４８−ＥＣ−１００）。
「ポリペプチド」という用語は、天然または人工タンパク質、タンパク質断片、およびタンパク質の配列のポリペプチド類似体を包含する。ポリペプチドは、単量体でもよく、あるいは重合体でもよい。
「単離タンパク質」、「単離ポリペプチド」または「単離抗体」という用語は、その由来または派生元により、（１）その天然の状態でそれに伴う、天然に結合する構成成分と結合せず、（２）同じ種由来の他のタンパク質を含まず、（３）異なる種由来の細胞によって発現され、または（４）天然に存在しないタンパク質、ポリペプチドまたは抗体である。したがって、化学合成され、またはそれが天然に生じる細胞と異なる細胞系で合成されたポリペプチドは、天然に結合するその構成成分から「単離」される。タンパク質はまた、当技術分野で周知のタンパク質精製技術を使用して、単離により、天然に結合する構成成分を実質的に含まなくすることもできる。
単離抗体の例には、Ｐ−カドヘリンを使用してアフィニティー精製されたＰ−カドヘリン抗体、およびｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞系統によって合成されたＰ−カドヘリン抗体がある。
タンパク質またはポリペプチドは、少なくとも約６０〜７５％の試料が単一種のポリペプチドを示すときに、「実質的に純粋」であり、「実質的に均質」であり、または「実質的に精製」されている。ポリペプチドまたはタンパク質は、単量体でもよく、あるいは多量体でもよい。実質的に純粋なポリペプチドまたはタンパク質は、通常約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％ｗ／ｗのタンパク質試料を含み得、より一般には約９５％、好ましくは９９％を超えて純粋であり得る。タンパク質の純度および均質性は、タンパク質試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動、その後当技術分野で周知の染色液でゲルを染色した後の単一ポリペプチドバンドの視覚化など、当技術分野で周知であるいくつかの手段によって示すことができる。特定の目的で、ＨＰＬＣまたは精製の技術分野で周知の他の手段を使用することにより、高解像度をもたらすことができる。
本明細書において「ポリペプチド断片」という用語は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するポリペプチドを指すが、残存するアミノ酸配列は、天然に存在する配列中の対応する位置と同一である。いくつかの実施形態では、断片は、長さが少なくとも５、６、８または１０アミノ酸である。他の実施形態では、断片は、長さが少なくとも１４、少なくとも２０、少なくとも５０、あるいは少なくとも７０、８０、９０、１００、１５０または２００アミノ酸である。
本明細書において「類似体」または「ポリペプチド類似体」という用語は、何らかの基準アミノ酸配列に対する実質的な同一性を有し、基準アミノ酸配列と実質的に同じ機能または活性を有するセグメントを含むポリペプチドを指す。通常、ポリペプチド類似体は、基準配列に対しての保存的アミノ酸置換（あるいは挿入または欠失）を含む。類似体は、長さが少なくとも２０または２５アミノ酸であり得、あるいは長さが少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０または２００アミノ酸以上であり得、しばしば全長ポリペプチドと同程度の長さであり得る。本発明のいくつかの実施形態は、生殖系列アミノ酸配列からの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７個のポリペプチド断片またはポリペプチド類似抗体を含む。抗体またはイムノグロブリン分子の断片または類似体は、本明細書の教示を受けて、当業者により容易に調製することができる。
特定の実施形態では、Ｐ−カドヘリン抗体またはその抗原結合部分に対するアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させ、（２）酸化に対する感受性を低下させ、（３）タンパク質複合体形成の結合親和性を変化させ、（４）そのような類似体の他の物理化学的または機能的特性を付与しまたは改変するが、Ｐ−カドヘリンに対する特異的結合性は依然として保持しているものである。類似体は、天然に存在するペプチド配列に対する様々な置換を含み得る。例えば、単一または複数のアミノ酸置換、好ましくは保存的アミノ酸置換は、天然に存在する配列中で、例えば、分子間接触を形成する（複数の）ドメインの外側にあるポリペプチドの部分中で行うことができる。アミノ酸置換はまた、分子間接触を形成する（複数の）ドメイン中で行うこともでき、それにより、ポリペプチドの活性を向上させることができる。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的な特徴を実質的に変化させるべきでない；例えば、置換アミノ酸は、親配列中に存在するイムノグロブリン結合ドメインを構成する逆方向βシートを変化させ、または親配列を特徴付ける他の型の二次構造を破壊すべきでない。一般に、グリシンおよびプロリンは、逆方向βシート中で使用されない。当技術分野で認められているポリペプチドの二次構造および三次構造の例は、参照により本明細書に組み込まれているＰｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．ＢｒａｎｄｅｎおよびＪ．Ｔｏｏｚｅ編、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、ニューヨーク州Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１））；ならびにＴｈｏｒｎｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５４：１０５（１９９１）に記載されている。
本明細書において、「抗体」という用語は、イムノグロブリンと同義であり、当技術分野で通常知られている通りに理解されるべきである。具体的には、抗体という用語は、抗体を作製する任意の特定の方法により限定されるものではない。例えば、抗体という用語には、それだけに限らないが、組換え抗体、モノクローナル抗体、およびポリクローナル抗体がある。
抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）という用語は、本明細書において、抗原（例えばＰ−カドヘリン）と特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって果たすことができることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語の中に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片という、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片という、ヒンジ領域でのジスルフィド架橋によって連結した２つのＦａｂ断片を含む二価の断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一の腕部のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、（１９８９）３４１：５４４〜５４６）；ならびに（ｖｉ）単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）がある。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされているが、それらは、組換え法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域が対となって一価の分子を形成する単一タンパク質の鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる）としてそれらを作製することを可能にする合成リンカーにより結合することができる；例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４２：４２３〜４２６およびＨｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９〜５８８３（１９８８）を参照されたい。そのような単鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語の中に包含されるものとする。ｄｉａｂｏｄｙなど他の型の単鎖抗体も包含される。ｄｉａｂｏｄｙは、二価の二重特異性抗体であり、ＶＨおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現するが、短すぎて同じ鎖上の２つのドメイン間で対を形成することができないリンカーを使用し、それによって、そのドメインは他の鎖の相補性ドメインと対を形成し、２つの抗原結合部位が生成する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４〜６４４８（１９９３）；Ｐｏｌｊａｋら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２：１１２１〜１１２３（１９９４）を参照）。
さらに、抗体またはその抗原結合部分は、抗体または抗体部分と１つまたは複数の他のタンパク質またはペプチドの共有結合または非共有結合によって形成された大きな免疫接着分子の一部でもよい。そのような免疫接着分子の例には、テトラマーｓｃＦｖ分子を作製するためのストレプトアビジン中核領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、６：９３〜１０１（１９９５））、ならびに二価およびビオチン化ｓｃＦｖ分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチドおよびＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３１：１０４７〜１０５８（１９９４））がある。他の例には、抗体由来の１つまたは複数のＣＤＲを共有結合または非共有結合で分子に組み込んで、それを、Ｐ−カドヘリンなどの対象とする抗原と特異的に結合する免疫接着因子にする場合がある。そのような実施形態では、（複数の）ＣＤＲを、より大きなポリペプチド鎖の一部として組み込むこともでき、他のポリペプチド鎖と共有結合することもでき、あるいは、非共有結合で組み込むこともできる。抗体全体のパパイン消化やペプシン消化などの従来の技術をそれぞれ使用して、抗体全体からＦａｂやＦ（ａｂ’）２断片などの抗体部分を調製することができる。さらに、本明細書に記載のように、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、抗体、抗体部分および免疫接着分子を得ることができる。
本発明に関して本明細書で「抗体」に言及する場合、その抗原結合部分を使用することもできることを理解されたい。抗原結合部分は、特異的結合において完全抗体と競合する。一般には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第７章（Ｐａｕｌ，Ｗ．編、第２版、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州（１９８９））（すべての目的でその全体が参照により組み込まれている）を参照されたい。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術、あるいは完全抗体の酵素的または化学的切断によって作製することができる。いくつかの実施形態では、抗原結合部分には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ｄｉａｂｏｄｙ、およびポリペプチドに対して特異的抗原結合性を付与するのに十分な抗体の少なくとも一部を含むポリペプチドがある。１つまたは複数の結合部位を有する実施形態では、結合部位は互いに同一でもよく、あるいは異なるものでもよい。
本明細書において、「ヒト抗体」という用語は、可変ドメインおよび定常ドメインの配列がヒト配列である任意の抗体を意味する。その用語は、ヒト遺伝子に由来する配列を有するが、例えば、考えられる免疫原性の低下、親和性の増大、望ましくない折りたたみを引き起こす可能性があるシステインの除去などを行うように変化させている抗体を包含する。その用語はまた、ヒト細胞に特有でないグリコシル化を施すことができる、非ヒト細胞中で組換えにより作製されたそのような抗体をも包含する。これらの抗体は、下記に記載のように、様々な形で調製することができる。
本明細書において「キメラ抗体」という用語は、異なる種由来の抗体を含めて、２つ以上の異なる抗体由来の領域を含む抗体を意味する。例えば、キメラ抗体の１つまたは複数のＣＤＲは、ヒトＰ−カドヘリン抗体に由来し得る。一例では、ヒト抗体由来のＣＤＲを、マウスやラットなどの非ヒト抗体由来のＣＤＲと組み合わせることができる。他の例では、すべてのＣＤＲがヒトＰ−カドヘリン抗体に由来し得る。他の例では、複数のヒトＰ−カドヘリン抗体に由来するＣＤＲを、キメラ抗体中で組み合わせることができる。例えば、キメラ抗体は、第１のヒトＰ−カドヘリン抗体の軽鎖のＣＤＲ１、第２のヒトＰ−カドヘリン抗体の軽鎖のＣＤＲ２および第３のヒトＰ−カドヘリン抗体の軽鎖のＣＤＲ３を含んでよく、重鎖のＣＤＲは、１つまたは複数の他のＰ−カドヘリン抗体に由来するものでよい。さらに、「キメラ抗体」という用語は、ヒト抗体および非ヒト抗体を含んだ、上記に挙げた任意の組合せを包含するものとする。
本明細書において、「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト由来の抗体を指し、非ヒト種の抗体配列に特徴的なアミノ酸残基が、ヒト抗体の対応する位置で認められる残基と置換されている。この「ヒト化」の工程が、その結果得られる抗体のヒトでの免疫原性を低下させると考えられる。当技術分野で周知の技術を使用して、非ヒト由来の抗体をヒト化できることが理解されるであろう。例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１４：４３〜４６（１９９３）を参照されたい。対象とする抗体は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジドメイン、および／またはフレームワークドメインを対応するヒト配列と置換する組換えＤＮＡ技術によって工学的に作製することができる。例えば、ＷＯ９２／０２１９０、ならびに米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７９２号、第５，７１４，３５０号、および第５，７７７，０８５号を参照されたい。本明細書において、「ヒト化抗体」という用語は、その意味の範囲内で、キメラヒト抗体およびＣＤＲ移植抗体を含む。本発明のキメラヒト抗体は、非ヒト種の抗体のＶＨおよびＶＬ、ならびにヒト抗体のＣＨおよびＣＬドメインを含む。本発明のＣＤＲ移植抗体は、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを、ヒト以外の動物の抗体のそれぞれＶＨおよびＶＬのＣＤＲと置換することによって得られる。
本明細書において、「ＥＬＩＳＡ」という用語は、酵素結合免疫吸着アッセイを指す。このアッセイは、当業者に周知である。このアッセイの例は、Ｖａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１４：３０９〜３１４（１９９６）、ならびに本出願の実施例７の中に認めることができる。
本明細書において、「表面プラズモン共鳴」という用語は、例えばＢＩＡＣＯＲＥ（商標）系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ、スウェーデンＵｐｐｓａｌａおよびニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）を使用して、バイオセンサーマトリックス内でのタンパク質濃度の変化を検出することによりリアルタイムの生体特異的相互作用の分析を可能にする光学的現象を指す。さらなる記述については、Ｊｏｎｓｓｏｎら、Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．、５１：１９〜２６（１９９３）；Ｊｏｎｓｓｏｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１１：６２０〜６２７（１９９１）；Ｊｏｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．、８：１２５〜１３１（１９９５）；およびＪｏｈｎｓｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８：２６８〜２７７（１９９１）を参照されたい。
「ＫＤ」という用語は、特定の抗体と抗原の相互作用の結合親和性の平衡定数を指す。抗体は、ＫＤが≦１ｍＭ、好ましくは≦１００ｎＭ、最も好ましくは≦１０ｎＭであるとき、抗原と特異的に結合するといえる。ＫＤ結合親和定数は、実施例６で論じるように、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）系を使用して、表面プラズモン共鳴により測定することができる。
「Ｋｏｆｆ」という用語は、特定の抗体と抗原の相互作用の解離速度定数を指す。Ｋｏｆｆ解離速度定数は、実施例６で論じるように、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）系を使用して、表面プラズモン共鳴により測定することができる。
本明細書において、「Ｐ−カドヘリン依存性細胞接着アッセイ」という用語は、固体支持体上に固定化されている受容体Ｐ−カドヘリンと細胞の接着を遮断するＰ−カドヘリン抗体の能力の測定に使用するアッセイを指す。この型のアッセイは、例えば、プラスチックなどの固体支持体上にＰ−カドヘリンを固定化することによって実施することができる。次いで、Ｐ−カドヘリンを過剰発現する細胞を、Ｐ−カドヘリン間の相互作用を介して固体支持体に接着させる。次いで、Ｐ−カドヘリン抗体がある状態およびない状態で接着のレベルを定量することができる。次いで、抗体濃度の関数としての接着を使用して、ＩＣ５０値を決定することができる。実施例３に、Ｐ−カドヘリン抗体のＩＣ５０値の測定に使用したＰ−カドヘリン依存性細胞接着アッセイのさらなる詳細を示す。
本明細書において、「Ｐ−カドヘリン依存性細胞凝集アッセイ」という用語は、その表面上にＰ−カドヘリンを発現している細胞の凝集を遮断するＰ−カドヘリン抗体の能力を測定するアッセイを指す。例えば、この型のアッセイでは、Ｐ−カドヘリンを過剰発現する細胞系統を使用することができ、その細胞を懸濁液中に入れ、Ｐ−カドヘリン依存性の凝集物を形成させる。次いで、凝集アッセイを使用して、抗体がある状態およびない状態で生じる細胞凝集物のサイズを測定することによりこの凝集を防止するＰ−カドヘリン抗体の能力を定量する。次いで、Ｐ−カドヘリン抗体濃度の関数としての細胞凝集物のサイズを使用して、ＩＣ５０値を決定することができる。実施例４に、複数のＰ−カドヘリン抗体のＩＣ５０値の測定に使用したＰ−カドヘリン依存性細胞凝集アッセイのさらなる詳細を示す。
本明細書において、「Ｐ−カドヘリン依存性スフェロイド破壊アッセイ」という用語は、予め形成されたＰ−カドヘリン依存性の細胞凝集物を破壊するＰ−カドヘリン抗体の能力を測定するアッセイを指す。抗体濃度の関数としての凝集物のサイズ低下を測定することによって、ＩＣ５０値を決定することができる。実施例５に、Ｐ−カドヘリン抗体のＩＣ５０値の測定に使用したＰ−カドヘリン依存性スフェロイド破壊アッセイのさらなる詳細を示す。
本明細書において、「分子選択性」という用語は、関連する抗原に対するものより大きい、特定の抗原に対する抗体の結合親和性を指す。例えば、本発明の抗体は、Ｅ−カドヘリンと比べてＰ−カドヘリンに対して選択的であり、これは、Ｐ−カドヘリンに対する抗体の結合親和性が、Ｅ−カドヘリンに対するものより少なくとも２倍、例えば４倍、または１０倍、または５０倍、または１００倍以上大きいことを意味する。そのような結合親和性は、当業者に知られている標準的な技術を使用して測定することができる。
「エピトープ」という用語は、イムノグロブリンまたはＴ細胞受容体またはその他分子と相互作用するものと特異的結合を行うことができる任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は一般に、アミノ酸や含水炭素や糖側鎖などの化学的に活性な表面の分子群からなり、一般に、特定の三次元構造の特徴ならびに特定の荷電の特徴を有する。エピトープは、「直線的」でもよく、あるいは「立体構造的」でもよい。直線的エピトープでは、タンパク質と相互作用分子（抗体など）との相互作用点がすべて、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線的に存在する。立体構造的エピトープでは、相互作用点は、互いに離れているタンパク質上のアミノ酸残基をまたいで存在する。抗原上の所望のエピトープを決定した後、例えば、本発明で記載されている技術を使用して、そのエピトープに対する抗体を生成することができる。あるいは、発見する工程の間に、抗体の生成および特徴付けにより、所望のエピトープについての情報が解明される可能性もある。次いで、この情報から、同じエピトープとの結合について抗体を競合的にスクリーニングすることができる。これを実現する手法は、交差競合試験を行って、互いに競合的に結合する抗体、すなわち抗原との結合について競合する抗体を見つけることである。それらの交差競合に基づいて抗体を「ビニング」する高処理能の方法が、国際特許公開ＷＯ０３／４８７３１に記載されている。
抗体に関して、本明細書において「競合する」という用語は、第１の抗体、またはその抗原結合部分が、結合について第２の抗体、またはその抗原結合部分と競合することを意味し、第１の抗体とその同系エピトープの結合が、第２の抗体の不在下での第１の抗体の結合と比較して、第２の抗体の存在下では検出可能な程度低下する。第２の抗体とそのエピトープの結合も第１の抗体の存在下で検出可能な程度低下する代替の場合も該当するが、そうである必要はない。すなわち、第１の抗体は、第２の抗体が第１の抗体とそのそれぞれのエピトープの結合を阻害しなくても、第２の抗体とそのエピトープの結合を阻害することができる。しかし、同じ程度であれ、大きい程度であれ、あるいは小さい程度であれ、各抗体が他の抗体とその同系エピトープまたはリガンドの結合を検出可能な程度阻害する場合、その抗体は、そのそれぞれの（複数の）エピトープの結合について互いに「交差競合している」といえる。競合抗体と交差競合抗体はどちらも本発明に包含される。そのような競合または交差競合が起こる機構（例えば、立体障害、構造変化、あるいは共通エピトープまたはその一部との結合など）とは無関係に、当業者なら、本明細書で提供される教示に基づいて、そのような競合および／または交差競合抗体が包含され、本明細書で開示される方法に有用となり得ることを理解するであろう。
本明細書において、特定の遺伝子に関して「利用する」という用語は、抗体中の特定の領域のアミノ酸配列が、Ｂ細胞の成熟の間に最終的にその遺伝子から誘導されたことを意味する。例えば、「ヒトＶＨ−３ファミリー遺伝子を利用する重鎖可変領域アミノ酸配列」という語句は、抗体のＶＨ領域が、Ｂ細胞の成熟の間にＶＨ−３ファミリーの遺伝子セグメントから誘導された状況を指す。ヒトＢ細胞中には、３０個を超える別々の機能的重鎖可変遺伝子があり、それを用いて抗体を生成する。したがって、特定の重鎖可変遺伝子の使用は、抗原との結合と機能活性を合わせた特性に関して、抗体と抗原の相互作用の好ましい結合モチーフを示唆するものである。理解されるであろうが、遺伝子利用分析は、抗体の構造の限られた概観しかもたらさない。ヒトＢ細胞がＶ−Ｄ−Ｊ重鎖転写物またはＶ−Ｊκ軽鎖転写物を確率的に生成するとき、それだけに限らないが、体細胞高頻度突然変異、ｎ付加、およびＣＤＲ３伸張を含めて、いくつかの二次的工程が行われる。例えば、Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１５：１４６〜１５６（１９９７）を参照されたい。
本明細書において、２０個の従来のアミノ酸およびその略記法は、従来の使用法に従う。参照により本明細書に組み込まれている、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ − Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版、Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ編、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、マサチューセッツ州Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ（１９９１））を参照されたい。
本明細書において言及される「ポリヌクレオチド」という用語は、長さが少なくとも１０塩基の重合型ヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドあるいは修飾された形態のどちらかの型のヌクレオチドを意味する。その用語は、一本鎖および二本鎖の形態を含む。
本明細書において「単離ポリペプチド」という用語は、ゲノム、ｃＤＮＡ、または合成由来のポリヌクレオチド、あるいはそのいくつかの組合せを意味し、その由来により、「単離ポリヌクレオチド」は、（１）天然ではそれとともに「単離ポリヌクレオチド」が認められるポリヌクレオチドの全部または一部と結合せず、（２）天然では連結していないポリヌクレオチドと作動的に連結し、あるいは（３）大きな配列の一部として天然には存在しない。
本明細書において「天然に存在するヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。本明細書において「修飾ヌクレオチド」という用語は、修飾または置換された糖基（ｓｕｇａｒ ｇｒｏｕｐ）などを有するヌクレオチドを含む。本明細書で言及される「オリゴヌクレオチド結合」という用語は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニラデートやホスホロアミデートなどのオリゴヌクレオチド結合を含む。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれている、ＬａＰｌａｎｃｈｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１４：９０８１（１９８６）；Ｓｔｅｃら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０６：６０７７（１９８４）；Ｓｔｅｉｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１６：３２０９（１９８８）；Ｚｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ、６：５３９（１９９１）；Ｚｏｎら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ｐｐ．８７〜１０８（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、英国Ｏｘｆｏｒｄ（１９９１））；米国特許第５，１５１，５１０号；ＵｈｌｍａｎｎおよびＰｅｙｍａｎ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ、９０：５４３（１９９０）を参照されたい。オリゴヌクレオチドは、必要に応じて、検出用の標識を含んでよい。
「作動的に連結した」配列は、対象とする遺伝子と隣接している発現調節配列と、トランスにまたは離れた所で働いて対象とする遺伝子を調節する発現調節配列の両方を含む。
本明細書において「発現調節配列」という用語は、それと連結したコード配列の発現およびプロセシングの実施に必要なポリヌクレオチド配列を意味する。発現調節配列には、適当な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；スプライシングやポリアデニル化シグナルなどの効率のよいＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（すなわち、Ｋｏｚａｋ共通配列）；タンパク質の安定性を高める配列；ならびに所望されるときにはタンパク質の分泌を高める配列がある。そのような調節配列の性質は、宿主生物に応じて異なる；原核生物では、そのような調節配列には一般にプロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列がある；真核生物では、一般に、そのような調節配列にはプロモーターおよび転写終結配列がある。「調節配列」という用語は、その存在が発現およびプロセシングに不可欠であるすべての構成成分を最小限含むものとし、その存在により有利となるさらなる構成成分、例えばリーダー配列および融合パートナー配列を含むこともできる。
本明細書において「ベクター」という用語は、それと連結している他の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。いくつかの実施形態では、ベクターはプラスミド、すなわちその中にさらなるＤＮＡセグメントを連結することができる環状二本鎖のＤＮＡ片である。いくつかの実施形態では、ベクターはウイルスベクターであり、さらなるＤＮＡセグメントをそのウイルスゲノム中に連結することができる。いくつかの実施形態では、ベクターは、それが導入されている宿主細胞中で自律複製を行うことができる（例えば、細菌性複製起点を有する細菌性ベクターおよびエピソーム性哺乳動物ベクター）。他の実施形態では、ベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中に導入した後宿主細胞のゲノム中に組み込むことができ、それによって宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、特定のベクターは、それと作動的に連結している遺伝子の発現を誘導することができる。そのようなベクターを、本明細書において「組換え発現ベクター」（または単純に「発現ベクター」）と呼ぶ。
本明細書において、「組換え宿主細胞」（または単純に「宿主細胞」）という用語は、その中に組換え発現ベクターが導入されている細胞を意味する。「組換え宿主細胞」および「宿主細胞」が特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫をも意味することを理解されたい。突然変異または環境的な影響により次の世代で特定の変化が生じる可能性があるので、そのような子孫は、実際、親細胞と同一でない可能性があるが、それは依然として本明細書における「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
本明細書において、「生殖系列」という用語は、生殖細胞を介して親から子孫へと伝わる、抗体遺伝子および遺伝子セグメントのヌクレオチド配列を指す。この生殖系列の配列は、Ｂ細胞の成熟過程の間で組換えおよび高頻度突然変異の事象によって変化している、成熟Ｂ細胞中の抗体をコードするヌクレオチド配列と区別される。
核酸配列との関連で、「％配列同一性」という用語は、一致が最大となるように整列させたときに同じである２つの配列中の残基を意味する。配列同一性の比較の長さは、少なくとも約９ヌクレオチド、一般には少なくとも約１８ヌクレオチド、より一般には少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６、４８ヌクレオチド以上の一続きより長くてもよい。ヌクレオチド配列同一性の測定に使用することができる、当技術分野で知られているいくつかの異なるアルゴリズムがある。例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ第１０．０版、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ中のプログラムであるＦＡＳＴＡ、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔを使用して、ポリヌクレオチド配列を比較することができる。例えばプログラムＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３を含むＦＡＳＴＡは、質問配列と検索配列の間で最良の重複領域のアラインメントおよび％配列同一性を提供する（参照により本明細書に組み込まれている、Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８３：６３〜９８（１９９０）；Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１３２：１８５〜２１９（２０００）；Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２６６：２２７〜２５８（１９９６）；Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２７６：７１〜８４（１９９８））。別段の指定がない限り、特定のプログラムまたはアルゴリズムの初期設定パラメーターを使用する。例えば、核酸配列間の％配列同一性は、その初期設定パラメーター（ワードサイズが６、スコア行列についてはＮＯＰＡＭ因子（ＮＯＰＡＭ ｆａｃｔｏｒ））とともにＦＡＳＴＡを使用して、または参照により本明細書に組み込まれるＧＣＧ第６．１版で提供される初期設定パラメーターとともにＧａｐを使用して決定することができる。
ヌクレオチド配列への言及には、別段の指定がない限りその相補体が包含される。したがって、特定の配列を有する核酸への言及には、その相補的配列を有するその相補鎖が包含されることを理解されたい。
核酸またはその断片に言及するとき、「実質的な類似性」または「実質的な配列類似性」という用語は、適当なヌクレオチドの挿入または欠失を用いて他の核酸（またはその相補鎖）と最適に整列させたとき、ヌクレオチド塩基の少なくとも約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％でヌクレオチド配列の同一性があることを意味し、それは、上記で論じたＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴやＧａｐなどの周知である任意の配列同一性アルゴリズムによって測定される。
アミノ酸配列との関連で、「％配列同一性」という用語は、一致が最大となるように整列させたときに同じである２つの配列中の残基を意味する。配列同一性の比較の長さは、少なくとも約５アミノ酸、一般には少なくとも約２０アミノ酸、より一般には少なくとも約３０アミノ酸、典型的には少なくとも約５０アミノ酸、より典型的には少なくとも約１００アミノ酸、さらに典型的には約１５０、２００アミノ酸以上の一続きより長くてもよい。アミノ酸配列同一性の測定に使用することができる、当技術分野で知られているいくつかの異なるアルゴリズムがある。例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ第１０．０版、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ中のプログラムであるＦＡＳＴＡ、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔを使用して、アミノ酸配列を比較することができる。
ポリペプチドに適用するとき、「実質的な同一性」または「実質的な類似性」という用語は、２つのアミノ酸配列が、プログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどにより、そのプログラムとともに供給される初期設定のギャップの重みを使用して最適に整列させたとき、少なくとも７０％、７５％または８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％または９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９７％、９８％または９９％の配列同一性を有することを意味する。特定の実施形態では、同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換により異なっている。
本明細書において、「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、化学的特性（例えば、電荷または疎水性）が類似した側鎖Ｒ基を有する他のアミノ酸残基によって置換されるものである。一般に、保存的アミノ酸置換では、タンパク質の機能的特性は実質的に変化しない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換により互いに異なる場合、％配列同一性を上方に調整して、置換の保存的な性質を修正することができる。この調整を行う手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２４３：３０７〜３１（１９９４）を参照されたい。化学的特性が類似した側鎖を有するアミノ酸の群の例には、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリンおよびスレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；５）塩基性側鎖；リシン、アルギニン、およびヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸；ならびに７）硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンがある。例えば、保存的アミノ酸置換の群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、ロイシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンであり得る。
あるいは、保存的置換は、Ｇｏｎｎｅｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６：１４４３〜４５（１９９２）で開示されているＰＡＭ２５０対数尤度行列で正の値となる任意の変化である。「中程度に保存的な」置換とは、ＰＡＭ２５０対数尤度行列で負でない値となる任意の変化である。
ポリペプチドの配列類似性は通常、配列分析ソフトウェアを使用して測定する。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含めた様々な置換、欠失および他の修飾に割り当てられた類似性の尺度を使用して、配列を整合させる。例えば、ＧＣＧは、「Ｇａｐ」や「Ｂｅｓｔｆｉｔ」などのプログラムを含み、プログラムによって指定される初期設定パラメーターとともにそれを使用して、異なる種の生物由来の相同なポリペプチドなどの密接に関連するポリペプチド間で、または野生型タンパク質とその相同体の間で配列相同性または配列同一性を決定することができる。例えば、ＧＣＧ第６．１版（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、ウィスコンシン州）を参照されたい。初期設定のまたは推奨されているパラメーターを使用するＦＡＳＴＡを使用して、ポリペプチド配列を比較することもできる。ＧＣＧ第６．１版を参照されたい。ＦＡＳＴＡ（例えばＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、質問配列と検索配列の間で最良の重複領域のアラインメントおよび％配列同一性を提供する（Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８３：６３〜９８（１９９０）；Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１３２：１８５〜２１９（２０００））。様々な生物に由来する多数の配列を含むデータベースと本発明の配列を比較するときに好ましい他のアルゴリズムは、プログラムとともに供給される初期設定パラメーターを使用するコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜４１０（１９９０）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：３３８９〜４０２（１９９７）を参照されたい。
相同性について比較するポリペプチドの長さは通常は少なくとも約１６アミノ酸残基となり、一般には少なくとも約２０残基となり、より一般には少なくとも約２４残基となり、典型的には少なくとも約２８残基となり、好ましくは約３５残基を超える長さとなる。多数の異なる生物由来の配列を含むデータベースを検索するとき、アミノ酸配列を比較することが好ましい。
本明細書において、「標識（ｌａｂｅｌ）」または「標識した（ｌａｂｅｌｅｄ）」という用語は、抗体における他の分子の組み込みを指す。一実施形態では、標識は、検出可能なマーカーであり、例えば、放射標識したアミノ酸の組み込み、または印をつけたアビジン（例えば、光学的方法または比色法によって検出することができる蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）によって検出することができるビオチニル部分とポリペプチドの結合である。他の実施形態では、標識またはマーカーは、治療に関するもの、例えば、薬物結合体または毒素でよい。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法が当技術分野で知られ、それを使用することができる。ポリペプチド用の標識の例には、それだけに限らないが、下記のものがある：放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次的レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーの対の配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）、ガドリニウムキレートなどの磁性作用物質、百日咳毒素などの毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジデオキシアンスラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンならびにその類似体または相同体。いくつかの実施形態では、標識を様々な長さのスペーサーアームにより結合して、潜在的な立体障害を低下させる。
「治療有効量」とは、治療する障害の１つまたは複数の症状がそれによりある程度緩和される、投与する治療用作用物質の量を指す。癌の治療に関して、治療有効量とは、下記の効果のうち少なくとも１つを有する量を指す：腫瘍サイズの低下；腫瘍の転移の阻害（すなわち、ある程度の遅延、好ましくは停止）；腫瘍増殖のある程度の阻害（すなわち、ある程度の遅延、好ましくは停止）、および癌と関係する１つまたは複数の症状のある程度の緩和（または、好ましくは消失）。
「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、生物学的障害および／またはそれに付随する症状を緩和または抑制する方法を指す。癌に関しては、これらの用語は単に、癌に罹患している個人の余命が延長し、あるいは疾患の１つまたは複数の症状が軽減されることを意味する。
「接触（Ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」とは、本発明の抗体またはその抗原結合部分と標的Ｐ−カドヘリンまたはそのエピトープを、抗体がＰ−カドヘリンの生物学的活性に影響を及ぼすことができるような形で一緒にすることを指す。そのような「接触」は、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」で、すなわち試験管、ペトリ皿などの中で行うことができる。試験管中では、接触には抗体またはその抗原結合部分とＰ−カドヘリンまたはそのエピトープだけが関与することもあり、あるいは細胞全体が関与することもある。細胞はまた、細胞培養皿中で維持しまたは増殖させ、その環境中で抗体またはその抗原結合部分と接触させることもできる。これに関連して、Ｐ−カドヘリン関連障害に影響を及ぼす特定の抗体またはその抗原結合部分の能力、すなわち抗体のＩＣ５０を、より複雑な生物での抗体のｉｎ ｖｉｖｏ使用を試みる前に決定することができる。生物の外にある細胞については、Ｐ−カドヘリンを抗体またはその抗原結合部分と接触させる複数の方法が存在し、それは当業者に周知である。
本明細書において、「異常細胞増殖」とは、別段示さない限り、正常細胞の異常増殖および異常細胞の増殖を含めて、正常な制御機構と無関係である（例えば接触阻害の喪失）細胞増殖を指す。これには、それだけに限らないが、突然変異したチロシンキナーゼの発現または受容体チロシンキナーゼの過剰発現によって増殖する腫瘍細胞（腫瘍）の異常増殖；異常なチロシンキナーゼの活性化が起こる他の増殖性疾患の良性および悪性細胞の異常増殖；受容体チロシンキナーゼによって増殖する任意の腫瘍の異常増殖；異常なセリン／スレオニンキナーゼの活性化によって増殖する任意の腫瘍の異常増殖；異常なセリン／スレオニンキナーゼの活性化が起こる他の増殖性疾患の良性および悪性細胞の異常増殖；活性化Ｒａｓ癌遺伝子が発現している良性と悪性両方の腫瘍の異常増殖；他の遺伝子における発癌性突然変異の結果Ｒａｓタンパク質が活性化された良性と悪性両方の腫瘍細胞の異常増殖；異常なＲａｓ活性化が起こる他の増殖疾患の良性および悪性細胞の異常増殖が含まれる。そのような良性増殖性疾患の例は、乾癬、良性前立腺肥大、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）、および再狭窄である。「異常細胞増殖」はまた、酵素ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼの活性から生じる良性と悪性両方の細胞の異常増殖を指し、それを含む。
「異常細胞増殖」および「過剰増殖性障害」という用語は、本出願において互換性のあるものとして使用される。
「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」とは、例えば、それだけに限らないが、試験管や培地中など、人工的な環境中で行われる手順を指す。
「ｉｎ ｖｉｖｏ」とは、それだけに限らないが、マウス、ラットやウサギなど、生物内で行われる手順を指す。
ヒトＰ−カドヘリン抗体
本発明は、ヒトＰ−カドヘリンと結合する単離ヒト抗体またはその抗原結合部分に関する。好ましくは、ヒト抗体は、Ｅ−カドヘリンよりＰ−カドヘリンに対して大きい親和性を有する組換えヒトＰ−カドヘリン抗体である。本発明の様々な態様は、そのような抗体および抗原結合部分、ならびにその医薬組成物にも、そのような抗体および抗原結合部分を作製するための核酸、組換え発現ベクターおよび宿主細胞にも関する。本発明の抗体および抗原結合部分を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでヒトＰ−カドヘリンを検出しまたはヒトＰ−カドヘリン活性を阻害する方法も、本発明により包含される。
ヒトを含めたいくつかの種に由来するＰ−カドヘリンのアミノ酸およびヌクレオチド配列が知られている（例えば、アクセッション番号ＮＭ＿００１７９３．３を参照）。ヒトＰ−カドヘリンまたはその抗原性部分は、当業者に周知の方法に従って調製することもでき、あるいは商業的な販売業者から購入することもできる（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ８６１−ＰＣ−１００）。
特定の実施形態では、本発明の抗体は１９４−ｅ０６；１９４−ａ０２；１９４−ｂ０９；１９５−ｅ１１；１９４−ｇ０９；１９６−ｈ０２；１９４−ｅ０１；１９６−ｄ１０；１９６−ｇ０３；１９６−ｅ０６；１９５−ａ０９；１９８−ａ０９；２００−ｈ０６；ｇ−１９４−ｂ０９；ｇ−１９４−ｇ０９；ｇ−１９６−ｇ０３；ｇ−１９６−ｈ０２；ｇ−１９４−ｅ０１；ｇ−１９４−ｅ０６；１２９−１ｃ４；およびｇ−１２９−１ｃ４と称するＩｇＧである。実施例１でさらに詳細に論じるように、ｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーの高処理能スクリーニングを使用して、１２９−１ｃ４ｓｃＦｖを同定し、その後それをＩｇＧに転換した。１２９−１ｃ４は、最初のファージディスプレイスクリーニングの間に同定されたリード抗体に相当し、本発明のいくつかの他の抗体が派生した系統の親抗体である。いくつかのそのように派生した抗体は、１９４−ｅ０６；１９４−ａ０２；１９４−ｂ０９；１９５−ｅ１１；１９４−ｇ０９；１９６−ｈ０２；１９４−ｅ０１；１９６−ｄ１０；１９６−ｇ０３；１９６−ｅ０６；１９５−ａ０９；１９８−ａ０９；および２００−ｈ０６と称され、１２９−１ｃ４親系統内で最適化された抗体に相当する。ｇ−１２９−１ｃ４抗体は、生殖系列化型の１２９−１ｃ４親抗体であり、ＶＨおよびＶＬドメインのフレームワーク領域中の特定のアミノ酸が突然変異して生殖系列フレームワーク領域中のアミノ酸と整合したものである。上記に挙げた任意の抗体を生殖系列化することもでき、その結果、フレームワーク領域配列が、ｇ−１２９−１ｃ４と同様に生殖系列フレームワーク領域と同一となる。例えば、本発明の一実施形態では、抗体ｇ−１９４−ｂ０９、ｇ−１９４−ｇ０９、ｇ−１９６−ｇ０３、ｇ−１９６−ｈ０２、ｇ−１９４−ｅ０１、ｇ−１９５−ｅ１１、ｇ−２００−ｈ０６、およびｇ−１９４−ｅ０６はそれぞれ、生殖系列化型の１９４−ｂ０９、１９４−ｇ０９、１９６−ｇ０３、１９６−ｈ０２、１９４−ｅ０１、１９５−ｅ１１、２００−ｈ０６、および１９４−ｅ０６である。突然変異して生殖系列化型に達した特定のアミノ酸は、生殖系列化抗体対非生殖系列化抗体の配列比較を行うことによって当業者に明らかとなる。下記で論じるように、本発明の抗体の特定のアミノ酸配列を表１〜３および図１に記載する。
重鎖可変領域のＶＨ３遺伝子ファミリーの利用に向けての強い偏向をつけて本発明の抗体を生成した。具体的には、１２９−１ｃ４親抗体はＶＨ３−２３可変遺伝子セグメントから派生した。ヒトＢ細胞中には、３０個を超える別々の機能的重鎖可変遺伝子があり、それを用いて抗体を生成する。したがって、偏向は、抗原との結合と機能活性を組み合わせた特性に関して、抗体と抗原の相互作用の好ましい結合モチーフを示唆するものである。
理解されるであろうが、遺伝子利用分析は、抗体の構造の限られた概観しかもたらさない。ヒトＢ細胞がＶ−Ｄ−Ｊ重鎖転写物またはＶ−Ｊκ軽鎖転写物を確率的に生成するとき、それだけに限らないが、体細胞高頻度突然変異、ｎ付加、およびＣＤＲ３伸張を含めて、いくつかの二次的工程が行われる。例えば、Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１５：１４６〜１５６（１９９７）、および２００２年２月１９日に出願された米国公開特許出願第２００３−００７０１８５号を参照されたい。したがって、本発明の抗体の構造をさらに調べるために、クローンから得られたｃＤＮＡから、抗体の予測アミノ酸配列を生成した。さらに、タンパク質の配列決定によりＮ末端アミノ酸配列を得た。図１に、本発明のいくつかの抗体の重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸の配列を示す。
上記に挙げた特定の各抗体を、表１および２で示す重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）のその可変ドメイン配列により記載することができる。これらの配列番号が指す特定の配列を図１に示す。表１および２に示すように、上記に挙げた抗体の対応するＶＨおよびＶＬのアミノ酸およびＤＮＡ配列は、配列番号１〜２３、６８〜９０、および３２０〜３４３により記載される。
Figure 0005086974
Figure 0005086974
本発明のさらなる抗体および抗原結合部分はまた、表１および２で示す抗体の重鎖および軽鎖可変領域を形成する様々なＣＤＲおよびＦＲ配列を含むものとして記載することもできる。したがって、本発明の抗体の種々のＣＤＲおよびＦＲ配列に対応する配列番号を表３に示す。さらに、１２９−１ｃ４親抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３領域中での多数の無作為化突然変異も実施し、それによりＰ−カドヘリン親和性が向上し、エピトープ競合アッセイ（実施例８を参照）によって測定される１０〜４１７倍の向上に及んだ。これらの突然変異したＶＨおよびＶＬＣＤＲ３配列の配列番号（配列番号９１〜２５６、および２５７〜３１９）も下記の表３の中に含まれる。
Figure 0005086974
抗体を作製する方法
ファージディスプレイライブラリー
本発明の抗体または抗原結合部分は、当技術分野で知られているいくつかの方法に従って調製することができる。例えば、ファージディスプレイ技術を使用して、Ｐ−カドヘリンに対する親和性が様々である抗体のレパートリーを含むライブラリーを提供することができる。次いで、これらのライブラリーをスクリーニングして、Ｐ−カドヘリンに対する所望の親和性を有する抗体を同定し単離することができる。
例えば、組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーをスクリーニングすることによって、本発明の組換えヒトＰ−カドヘリン抗体を単離することができる。好ましくは、ライブラリーは、ヒトＢ細胞から単離されたｍＲＮＡから調製されたヒトＶＬおよびＶＨｃＤＮＡを使用して生成されるｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーである。そのようなライブラリーを調製しスクリーニングする方法は当技術分野で知られている。ファージディスプレイライブラリーを生成するキットが市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）。抗体ディスプレイライブラリーの生成およびスクリーニングで使用することができる他の方法および試薬もある（例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；ＰＣＴ公開ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９１／１７２７１、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９２／１５６７９、ＷＯ９３／０１２８８、ＷＯ９２／０１０４７、およびＷＯ９２／０９６９０；Ｆｕｃｈｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：１３７０〜１３７２（１９９１）；Ｈａｙら、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、３：８１〜８５（１９９２）；Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６：１２７５〜１２８１（１９８９）；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２〜５５４（１９９０）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１２：７２５〜７３４（１９９３）；Ｈａｗｋｉｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２６：８８９〜８９６（１９９２）；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４〜６２８（１９９１）；Ｇｒａｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：３５７６〜３５８０（１９９２）；Ｇａｒｒａｄら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：１３７３〜１３７７（１９９１）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１９：４１３３〜４１３７（１９９１）；Ｂａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：７９７８〜７９８２（１９９１）；ならびにＧｒｉｆｆｉｔｈｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１３：３２４５〜３２６０（１９９４）を参照；これらはすべて、参照により本明細書に組み込まれている）。
ファージディスプレイ技術で使用する抗体のライブラリーを調製する他の方法は、ヒトイムノグロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物をＰ−カドヘリンまたはその抗原性部分で免疫感作して免疫応答を生じさせるステップと、免疫感作した動物から抗体産生細胞を抽出するステップと、抽出した細胞から本発明の抗体の重鎖および軽鎖をコードするＲＮＡを単離するステップと、ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを作製するステップと、プライマーを使用してｃＤＮＡを増幅するステップと、抗体がファージ上で発現するようにファージディスプレイベクター中にｃＤＮＡを挿入するステップとを含む。そのようなレパートリーの作製では、免疫感作した動物由来のＢ細胞を不死化する必要はない。むしろ、初代Ｂ細胞をＤＮＡの供給源として直接使用することができる。Ｂ細胞から得られた、例えば脾臓に由来するｃＤＮＡの混合物を使用して、発現ライブラリー、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中にトランスフェクトするファージディスプレイライブラリーを調製する。最終的に、抗原に対する所望の大きさの結合親和性を生じさせるライブラリーのクローンを同定し、そのような結合に関与する産物をコードするＤＮＡを回収し処置して標準的な組換え発現を行う。ファージディスプレイライブラリーを、予め処置したヌクレオチド配列を使用して構築し、それを類似した形でスクリーニングすることもできる。一般に、重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡは独立に供給され、またはそれらを連結してファージライブラリー中で作製するためのＦｖ類似体を形成する。次いで、Ｐ−カドヘリンに対する親和性が最高である抗体についてファージライブラリーをスクリーニングし、適当なクローンから遺伝物質を回収する。さらなる回数のスクリーニングにより、単離した元の抗体の親和性を高めることができる。
一実施形態では、所望の特徴を有するヒトＰ−カドヘリン抗体を単離し作製するために、本明細書に記載のヒトＰ−カドヘリン抗体を最初に使用して、参照により本明細書に組み込まれているＰＣＴ公開ＷＯ９３／０６２１３に記載のエピトープインプリンティング法を用いてＰ−カドヘリンに対する類似した結合活性を有するヒト重鎖および軽鎖配列を選択する。この方法で使用する抗体ライブラリーは、好ましくは、そのすべてが参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２〜５５４（１９９０）；およびＧｒｉｆｆｉｔｈｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１２：７２５〜７３４（１９９３）に記載のように調製しスクリーニングするｓｃＦｖライブラリーである。ヒトＰ−カドヘリンを抗原として使用して、ｓｃＦｖ抗体ライブラリーをスクリーニングすることができる。Ｐ−カドヘリンに対する親和性が最高である抗体についてファージライブラリーをスクリーニングし、適当なクローンから遺伝物質を回収する。さらなる回数のスクリーニングにより、単離した元の抗体の親和性を高めることができる。
最初のヒトＶＬおよびＶＨドメインを選択した後、最初に選択されたＶＬおよびＶＨセグメントの様々な対をＰ−カドヘリンの結合についてスクリーニングして、好ましいＶＬ／ＶＨ対の組合せを選択する、「混合および整合」実験を行うことができる。この混合および整合実験はまた、下記に記載のように、ＶＨおよびＶＬセグメントを無作為に突然変異させて結合を最適化した後に行うこともできる。さらに、抗体の品質を高めるために、好ましい（複数の）ＶＬ／ＶＨ対のＶＬおよびＶＨセグメントを、好ましくはＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ３領域内で、自然免疫応答中の抗体の親和性成熟に関与するｉｎ ｖｉｖｏ体細胞突然変異の過程と類似した工程で、無作為に突然変異させることもできる。このｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性成熟は、例えば、ＶＨＣＤＲ３またはＶＬＣＤＲ３と相補的なＰＣＲプライマーを使用してそれぞれＶＨおよびＶＬドメインを増幅することによって実現することができ、そのプライマーは、得られたＰＣＲ産物が、ＶＨおよび／またはＶＬＣＤＲ３領域中に無作為突然変異が導入されているＶＨおよびＶＬセグメントをコードするように、４つのヌクレオチド塩基の無作為混合物で特定の位置に「スパイク」が入っている。これらの無作為に突然変異したＶＨおよびＶＬセグメントを、Ｐ−カドヘリンとの結合について再度スクリーニングすることができ、Ｐ−カドヘリンに対する高い親和性および低い解離速度を示す配列を選択することができる。前記で論じたように、無作為に突然変異し、親和性の向上を示した本発明のいくつかのＶＨおよびＶＬＣＤＲ３配列を、配列番号９１〜２５６および２５７〜３１９で示す。
組換えイムノグロブリンディスプレイライブラリーから本発明のＰ−カドヘリン抗体をスクリーニングし単離した後、選択した抗体をコードする核酸をディスプレイパッケージから（例えば、ファージゲノムから）回収し、標準的な組換えＤＮＡ技術によって他の発現ベクター中にサブクローン化することができる。必要に応じて、下記に記載のように、核酸をさらに処理して本発明の他の抗体型を作製することができる。下記に記載のように、コンビナトリアルライブラリーのスクリーニングによって単離された組換えヒト抗体を発現させるために、抗体をコードするＤＮＡを組換え発現ベクター中にクローン化し、宿主細胞中に導入する。
免疫感作
他の実施形態では、そのゲノム内にヒトイムノグロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座の一部または全部を含む非ヒト遺伝子導入動物をＰ−カドヘリン抗原で免疫感作することによってヒトＰ−カドヘリン抗体を作製することができる。例えば、非ヒト動物は、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）動物（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州Ｆｒｅｍｏｎｔ）でよい。
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）マウスは、工学的に作製されたマウスの系統であり、ヒトイムノグロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座の大きな断片を含み、マウス抗体の産生が欠損している。例えば、Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、７：１３〜２１（１９９４）ならびに米国特許第５，９１６，７７１号、第５，９３９，５９８号、第５，９８５，６１５号、第５，９９８，２０９号、第６，０７５，１８１号、第６，０９１，００１号、第６，１１４，５９８号、第６，１３０，３６４号、第６，１６２，９６３号および第６，１５０，５８４号を参照されたい。ＷＯ９１／１０７４１、ＷＯ９４／０２６０２、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９９／４５０３１、ＷＯ９９／５３０４９、ＷＯ００／０９５６０、およびＷＯ００／０３７５０４も参照されたい。
これらの文献中に開示されている方法は、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，９９４，６１９号に記載のように改変することができる。米国特許第５，９９４，６１９号は、ブタおよび雌ウシに由来する新規の培養内部細胞塊（ＣＩＣＭ）細胞および細胞系統、ならびに異種ＤＮＡが挿入されている遺伝子導入ＣＩＣＭ細胞を作製する方法について記載している。ＣＩＣＭ遺伝子導入細胞を使用して、クローン化した遺伝子導入胚、胎児、および子孫を作製することができる。‘６１９の特許はまた、異種ＤＮＡをその子孫に伝達することができる遺伝子導入動物を作製する方法についても記載している。これらの方法で使用することができる非ヒト動物の例には、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ニワトリおよびウマがある。
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）マウスは、完全ヒト抗体の成人様のヒトレパートリーを産生し、抗原特異的なヒト抗体を生成する。いくつかの実施形態では、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）マウスは、メガ塩基サイズの、酵母人工染色体（ＹＡＣ）中のヒト重鎖遺伝子座およびκ軽鎖遺伝子座の生殖系列構造断片の導入により約８０％のヒト抗体Ｖ遺伝子レパートリーを含む。他の実施形態では、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）マウスは、ほぼすべてのヒトλ軽鎖遺伝子座をさらに含む。その開示が参照により本明細書に組み込まれている、Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１５：１４６〜１５６（１９９７）、ＧｒｅｅｎおよびＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８８：４８３〜４９５（１９９８）、ならびにＷＯ９８／２４８９３を参照されたい。
いくつかの実施形態では、ヒトイムノグロブリン遺伝子を含む非ヒト動物は、ヒトイムノグロブリン「ミニ遺伝子座」を有する動物である。ミニ遺伝子座の手法では、Ｉｇ遺伝子座の個々の遺伝子を含めることにより外因性Ｉｇ遺伝子座が模倣される。したがって、１つまたは複数のＶＨ遺伝子、１つまたは複数のＤＨ遺伝子、１つまたは複数のＪＨ遺伝子、μ定常ドメイン、および第２の定常ドメイン（好ましくはγ定常ドメイン）が、動物中への挿入用の構築物中に形成される。この手法は、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，５４５，８０７号、第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，６６１，０１６号、第５，７７０，４２９号、第５，７８９，６５０号、第５，８１４，３１８号、第５，５９１，６６９号、第５，６１２，２０５号、第５，７２１，３６７号、第５，７８９，２１５号および第５，６４３，７６３号に記載されている。
次いで、上記に記載の非ヒト動物を、下記に記載のように、抗体産生を可能にする条件下で、Ｐ−カドヘリン抗原で免疫感作することができる。抗体産生細胞を動物から単離し、対象とするＰ−カドヘリン抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸を、単離した抗体産生細胞から、またはそのような細胞から作製した不死化細胞系統から単離する。その後、当業者に知られている技術を使用して、下記にさらに記載するようにこれらの核酸を工学的に作製して、非ヒト配列の量を減らし、すなわち抗体をヒト化してヒトでの免疫応答を低下させる。
いくつかの実施形態では、Ｐ−カドヘリン抗原は、単離および／または精製されたＰ−カドヘリンでよい。いくつかの実施形態では、Ｐ−カドヘリン抗原はヒトＰ−カドヘリンである。他の実施形態では、Ｐ−カドヘリン抗原は、Ｐ−カドヘリンを発現しまたは過剰発現する細胞でよい。他の実施形態では、Ｐ−カドヘリン抗原は、酵母、昆虫細胞、大腸菌などの細菌、または他の供給源から組換え技術により発現させた組換えタンパク質である。動物の免疫感作は、当技術分野で知られている任意の方法によるものでよい。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）を参照されたい。マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシやウマなどの非ヒト動物を免疫感作する方法は当技術分野で周知である。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上記、および米国特許第５，９９４，６１９号を参照されたい。例えば、Ｐ−カドヘリン抗原は、免疫応答を刺激するアジュバントとともに投与することができる。例示的なアジュバントには、完全または不完全フロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）アジュバント、ＲＩＢＩ（ムラミルジペプチド）、あるいはＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）がある。そのようなアジュバントは、ポリペプチドを局所沈殿物中に隔離することによって急速な分散からそれを保護することができ、または、アジュバントは、宿主を刺激してマクロファージおよび免疫系の他の構成成分にとって走化性のあるファクターを分泌させる物質を含んでよい。好ましくは、ポリペプチドを投与する場合、免疫感作の予定は、いくつかの週にわたって散在させた、ポリペプチドの２回以上の投与を含む。
例えば、上記に記載の遺伝子導入動物をＰ−カドヘリンで免疫感作した後、免疫感作した遺伝子導入動物から初代細胞（例えば脾臓または末梢血Ｂ細胞）を単離することができ、所望の抗原に特異的な抗体を産生する個々の細胞を同定することができる。次いで、個々の各細胞由来のポリアデニル化ｍＲＮＡを単離し、可変領域配列とアニールするセンスプライマー（例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子のＦＲ１領域の大部分または全部を認識する縮重プライマー、ならびに定常または連結領域配列とアニールするアンチセンスプライマー）を使用して逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行う。次いで、重鎖および軽鎖可変ドメインのｃＤＮＡをクローン化し、任意の適切な宿主細胞、例えば骨髄腫細胞中で、重鎖およびκまたはλの定常ドメインなど、それぞれのイムノグロブリン定常領域を有するキメラ抗体としてそれを発現させる。参照により本明細書に組み込まれるＢａｂｃｏｏｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：７８４３〜４８、（１９９６）を参照されたい。次いで、Ｐ−カドヘリン抗体を本明細書に記載のように同定し単離することができる。
抗体を作製するための組換え法
本発明の抗体または抗体部分は、宿主細胞中で、イムノグロブリン軽鎖および重鎖遺伝子の組換え発現によって調製することができる。例えば、抗体を組換えにより発現させるために、抗体のイムノグロブリン軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡ断片を有する１つまたは複数の組換え発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトし、その結果、軽鎖および重鎖が宿主細胞中で発現し、好ましくは、その中で宿主細胞が培養されている培地中に分泌され、その培地から抗体を回収することができる。その開示が参照により本明細書に組み込まれている、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、ニューヨーク州Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９８９）ならびに米国特許第４，８１６，３９７号に記載されているもののような、標準的な組換えＤＮＡ法を使用して、抗体の重鎖および軽鎖遺伝子を得、これらの遺伝子を組換え発現ベクター中に組み込み、ベクターを宿主細胞中に導入する。
突然変異および改変
本発明のＰ−カドヘリン抗体を発現させるために、上記に記載の方法のいずれかを使用して、ＶＨおよびＶＬ領域をコードするＤＮＡ断片を最初に得ることができる。当業者に知られている標準的な方法を使用して、様々な突然変異、欠失、および／または付加をＤＮＡ配列中に導入することもできる。例えば、突然変異したヌクレオチドをＰＣＲプライマー中に組み込み、その結果ＰＣＲ産物が所望の突然変異を含むＰＣＲ媒介突然変異生成や、部位特異的突然変異生成などの標準的な方法を使用して突然変異生成を行うことができる。例えば、行うことができる１つの型の置換は、化学的に反応性のある可能性がある、抗体中の１つまたは複数のシステインを、それだけに限らないが、アラニンやセリンなどの他の残基に変化させることである。例えば、非標準的なシステインの置換があり得る。抗体の可変ドメインのＣＤＲまたはフレームワーク領域中であるいは定常ドメイン中で置換を行うことができる。いくつかの実施形態では、システインは標準的なものである。
重鎖および／または軽鎖の可変ドメイン中で抗体を突然変異させて、例えば抗体の結合特性を変化させることもできる。例えば、１つまたは複数のＣＤＲ領域中で突然変異を起こさせて、Ｐ−カドヘリンに対する抗体のＫＤを増大または低下させ、Ｋｏｆｆを増大または低下させ、あるいは抗体の結合特異性を変化させることができる。部位特異的突然変異生成の技術は、当技術分野で周知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、およびＡｕｓｕｂｅｌら、上記を参照されたい。例えば、実施例８でさらに詳細に論じるように、上記で論じた手順に従って１２９−１ｃ４親の多数の変異ＶＨおよびＶＬＣＤＲ３配列を作製し、それを図１における配列番号９１〜２５６（ＶＨＣＤＲ３変異体）および配列番号２５７〜３１９（ＶＬＣＤＲ３変異体）として示す。
フレームワーク領域または定常ドメイン中で突然変異を起こさせて、Ｐ−カドヘリン抗体の半減期を延長することもできる。例えば、参照により本明細書に組み込まれているＰＣＴ公開ＷＯ００／０９５６０を参照されたい。フレームワーク領域または定常ドメイン中で突然変異を起こさせて、抗体の免疫原性を変化させ、他の分子との共有結合または非共有結合部位をもたらし、あるいは補体結合、ＦｃＲ結合や抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）などの特性を変化させることもできる。本発明によれば、単一の抗体が、可変ドメインの任意の１つまたは複数のＣＤＲまたはフレームワーク領域中であるいは定常ドメイン中で突然変異を有してもよい。
「生殖系列化」として知られる工程では、ＶＨおよびＶＬ配列中の特定のアミノ酸を突然変異させて、生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列中で天然に認められるアミノ酸と整合させることができる。具体的には、ＶＨおよびＶＬ配列中のフレームワーク領域のアミノ酸配列を突然変異させて、生殖系列配列と整合させて抗体を投与したときの免疫原性のリスクを減らすことができる。ヒトＶＨおよびＶＬ遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は当技術分野で知られている（例えば、「Ｖｂａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベースを参照されたい；Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、（１９９２）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：７７６〜７９８；およびＣｏｘら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：８２７〜８３６（１９９４）も参照されたい；そのそれぞれの内容は参照により本明細書に特に組み込まれている）。
行うことができる他の型のアミノ酸置換は、抗体中の潜在的なタンパク質分解性部位を除去することである。そのような部位は、抗体の可変ドメインのＣＤＲまたはフレームワーク領域中であるいは定常ドメイン中で生じる可能性がある。システイン残基の置換およびタンパク質分解性部位の除去によって、抗体産物の異種性のリスクを減らし、したがってその同種性を増大させることができる。他の型のアミノ酸置換は、潜在的なアミド分解部位を形成するアスパラギン−グリシンの対を、その残基の一方または両方を変化させることによって除去することである。他の例では、本発明のＰ−カドヘリン抗体の重鎖のＣ末端にあるリシンを切断することができる。本発明の様々な実施形態では、Ｐ−カドヘリン抗体の重鎖および軽鎖は、配列番号３４６および３４７で示されるものなど、Ｎ末端シグナル配列を含んでもよい。
本発明のＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片を得た後、これらのＤＮＡ断片を標準的な組換えＤＮＡ技術によりさらに処理して、例えば可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子に、Ｆａｂ断片遺伝子に、またはｓｃＦｖ遺伝子に転換することができる。これらの処理では、ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡ断片を、抗体の定常領域や柔軟なリンカーなどの他のタンパク質をコードする他のＤＮＡ断片と作動的に連結する。この文脈で使用する「作動的に連結する」という用語は、２つのＤＮＡ断片によってコードされたアミノ酸配列がインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）のままであるようにその２つのＤＮＡ断片が連結することを意味するものとする。
ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする他のＤＮＡ分子と作動的に連結することによって、完全長重鎖遺伝子に転換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で知られており（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２を参照されたい）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤの定常領域でよいが、最も好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ２の定常領域である。ＩｇＧ１定常領域配列は、Ｇｍ（１）、Ｇｍ（２）、Ｇｍ（３）やＧｍ（１７）など、異なる個人間で生じることが知られている任意の様々な対立遺伝子またはアロタイプでよい。これらのアロタイプは、ＩｇＧ１定常領域中の天然に存在するアミノ酸置換に相当する。例えば、重鎖ＩｇＧ１定常領域は、配列番号３４４でよい。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子では、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖ＣＨ１定常領域だけをコードする他のＤＮＡ分子と作動的に連結することができる。ＣＨ１重鎖定常領域は、任意の重鎖遺伝子に由来するものでよい。
ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする他のＤＮＡ分子と作動的に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に転換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で知られており（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２を参照されたい）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、κまたはλの定常領域でよい。κ定常領域は、Ｉｎｖ（１）、Ｉｎｖ（２）やＩｎｖ（３）など、異なる個人間で生じることが知られている任意の様々な対立遺伝子でよい。λ定常領域は、３つのλ遺伝子のいずれかに由来するものでよい。例えば、軽鎖ＩｇＧ１定常領域は、配列番号３４７でよい。
ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡ断片を、柔軟なリンカーをコードする、例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする他の断片と作動的に連結し、その結果、ＶＨおよびＶＬ配列を、柔軟なリンカーによって連結したＶＬおよびＶＨ領域を有する連続した単鎖タンパク質として発現させることができる（例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９〜５８８３（１９８８）；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２〜５５４（１９９０）を参照されたい）。単鎖抗体は、単一のＶＨおよびＶＬしか使用しない場合は単価でもよく、２つのＶＨおよびＶＬを使用する場合は二価でもよく、あるいは２つより多いＶＬおよびＶＨを使用する場合は多価でもよい。Ｐ−カドヘリンおよび他の分子と特異的に結合する、二重特異性または多価抗体を生成することができる。
他の実施形態では、他のポリペプチドと連結した本発明のＰ−カドヘリン抗体の全部または一部を含む融合抗体または免疫接着分子を作製することができる。他の実施形態では、Ｐ−カドヘリン抗体の可変ドメインだけをポリペプチドと連結する。他の実施形態では、ＶＨおよびＶＬドメインが互いに相互作用して抗原結合部位を形成することができるような形で、Ｐ−カドヘリン抗体のＶＨドメインを第１のポリペプチドと連結し、その一方で、Ｐ−カドヘリン抗体のＶＬドメインを、第１のポリペプチドと結合した第２のポリペプチドと連結する。次いで、ＶＨ−リンカー−ＶＬ抗体を、対象とするポリペプチドと連結する。他の好ましい実施形態では、ＶＨドメインは、リンカーによりＶＬドメインと分離し、その結果ＶＨおよびＶＬドメインが互いに相互作用することができる。さらに、２つ（以上の）単鎖抗体が互いに連結した融合抗体を作製することができる。これは、単一のポリペプチド鎖上で二価または多価の抗体を作製したい場合、あるいは二重特異性抗体を作製したい場合に有用である。
他の実施形態では、Ｐ−カドヘリン抗体をコードする核酸分子を使用して、他の改変抗体を調製することができる。例えば、「Ｋａｐｐａ ｂｏｄｙ」（Ｉｌｌら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、１０：９４９〜５７（１９９７））、「Ｍｉｎｉｂｏｄｙ」（Ｍａｒｔｉｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１３：５３０３〜９（１９９４））、「Ｄｉａｂｏｄｙ」（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４〜６４４８（１９９３））、または「Ｊａｎｕｓｉｎ」（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１０：３６５５〜３６５９（１９９１）およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、（Ｓｕｐｐｌ．）７：５１〜５２（１９９２））を、本明細書の教示を受けて、標準的な分子生物学的技術を使用して調製することができる。
ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含めた種々の方法によって、二重特異性抗体または抗原結合断片を作製することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ＆ Ｌａｃｈｍａｎｎ、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７９：３１５〜３２１（１９９０）、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８：１５４７〜１５５３（１９９２）を参照されたい。さらに、二重特異性抗体を「ｄｉａｂｏｄｙ」または「Ｊａｎｕｓｉｎ」として形成することができる。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体はＰ−カドヘリンの２つの異なるエピトープと結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供するヒトＰ−カドヘリン抗体由来の１つまたは複数の可変ドメインまたはＣＤＲ領域を使用して、上記に記載の改変抗体を調製することができる。
ベクターおよび宿主細胞
本発明の抗体および抗原結合部分を発現させるために、上記に記載のように得られた部分的なまたは完全長の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを発現ベクター中に挿入し、その結果、遺伝子が転写および翻訳調節配列と作動的に連結する。この文脈で、「作動的に連結する」という用語は、抗体遺伝子をベクター中に連結し、その結果、ベクター内の転写および翻訳調節配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳を制御するその意図された機能を果たすことを意味するものとする。発現ベクターおよび発現調節配列は、使用する発現用宿主細胞と適合するように選択する。発現ベクターには、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、カリフラワーモザイクウイルスやタバコモザイクウイルスなどの植物ウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソームなどがある。抗体遺伝子をベクター中に連結し、その結果、ベクター内の転写および翻訳調節配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳を制御するその意図された機能を果たす。発現ベクターおよび発現調節配列は、使用する発現用宿主細胞と適合するように選択する。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、別々のベクター中に挿入することができる。好ましい実施形態では、両方の遺伝子を同じ発現ベクター中に挿入する。抗体遺伝子を、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片上の相補的な制限部位とベクターの連結、または制限部位が存在しない場合には平滑末端連結）によって発現ベクター中に挿入する。
好都合なベクターは、上記に記載のように任意のＶＨまたはＶＬ配列を容易に挿入し発現させることができるように工学的に作製された適当な制限部位を有する機能的に完全なヒトＣＨまたはＣＬイムノグロブリン配列をコードするものである。そのようなベクターでは、通常、挿入されたＪ領域中のスプライス供与部位とヒトＣドメインに先行するスプライス受容部位の間で、またヒトＣＨエキソン内に存在するスプライス領域でもスプライシングが起こる。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域の下流にある天然の染色体部位で起こる。組換え発現ベクターはまた、宿主細胞由来の抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることもできる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドがインフレームでイムノグロブリン鎖のアミノ末端と連結するようにベクター中にクローン化することができる。シグナルペプチドは、イムノグロブリンシグナルペプチドでもよく、あるいは異種性シグナルペプチド（すなわち非イムノグロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）でもよい。
抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中の抗体鎖遺伝子の発現を調節する制御配列を有する。制御配列の選択を含めて、発現ベクターの設計が、形質転換する宿主細胞の選択、所望されるタンパク質の発現レベルなどのファクターに依存する可能性があることが当業者には理解されるであろう。哺乳動物宿主細胞発現に好ましい制御配列には、レトロウイルスＬＴＲ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、シミアンウイルス４０（Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ ４０）（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーなど、哺乳動物細胞中での高レベルのタンパク質発現を誘導するウイルスエレメント、ならびに天然のイムノグロブリンやアクチンのプロモーターなどの強い哺乳動物プロモーターがある。ウイルス制御性エレメントおよびその配列のさらなる記載については、例えば、米国特許第５，１６８，０６２号、米国特許第４，５１０，２４５号および米国特許第４，９６８，６１５号を参照されたい。プロモーターおよびベクター、ならびに植物の形質転換の記載を含めて、植物中で抗体を発現させる方法は、当技術分野で知られている。例えば、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第６，５１７，５２９号を参照されたい。細菌細胞、または真菌細胞、例えば酵母細胞中でポリペプチドを発現させる方法も、当技術分野で周知である。
抗体鎖遺伝子および制御配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中でのベクターの複製を制御する配列（例えば複製起点）や選択マーカー遺伝子などのさらなる配列を有してよい。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進する（例えば、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第４，３９９，２１６号、第４，６３４，６６５号および第５，１７９，０１７号を参照されたい）。例えば、通常、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞上に、Ｇ４１８、ハイグロマイシンやメトトレキセートなどの薬物に対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子には、デヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（ｄｈｆｒ−宿主細胞でメトトレキセート選択／増幅とともに使用する）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｇ４１８選択用）、およびグルタミン酸合成酵素遺伝子がある。
Ｐ−カドヘリン抗体をコードする核酸分子およびこれらの核酸分子を含むベクターを、適切な哺乳動物、植物、細菌または酵母宿主細胞のトランスフェクションに使用することができる。形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞中に導入する、任意の知られている方法によるものでよい。異種性ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞中に導入する方法は当技術分野で周知であり、それにはデキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、原形質体融合、エレクトロポレーション、リポソーム中への（複数の）ポリヌクレオチドの封入、および核中へのＤＮＡの直接微小注入がある。さらに、ウイルスベクターによって、核酸分子を哺乳動物細胞中に導入することができる。細胞を形質転換する方法は当技術分野で周知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第４，３９９，２１６号、第４，９１２，０４０号、第４，７４０，４６１号および第４，９５９，４５５号を参照されたい。例えばアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換、微粒子銃形質転換、直接注入、エレクトロポレーションおよびウイルス性形質転換を含めて、植物細胞を形質転換する方法は、当技術分野で周知である。細菌および酵母細胞を形質転換する方法も、当技術分野で周知である。
発現用の宿主として利用可能な哺乳動物細胞系統は当技術分野で周知であり、それには、米国基準菌株保存機構（ＡＴＣＣ）から入手可能な多数の不死化細胞系統がある。これらには、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２細胞、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、仔ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、アフリカミドリサル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、Ａ５４９細胞、およびいくつかの他の細胞系統がある。特に好ましい細胞系統は、どの細胞系統が高発現レベルを有するかを決定することにより選択される。使用することができる他の細胞系統は、Ｓｆ９やＳｆ２１細胞などの昆虫細胞系統である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞中に導入したとき、宿主細胞を、宿主細胞中での抗体の発現、または、より好ましくはその中で宿主細胞が増殖している培地中への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間培養することによって抗体が産生される。標準的なタンパク質精製方法を使用して、培地から抗体を回収することができる。植物宿主細胞には、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ウキクサ、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモなどがある。細菌宿主細胞には、大腸菌およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種がある。酵母宿主細胞には、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）がある。
さらに、いくつかの知られている技術を使用して、産生細胞系統からの本発明の抗体の産生を高めることができる。例えば、グルタミン合成酵素（ＧＳ系）およびＤＨＦＲ遺伝子発現系は、特定の条件下で発現を高める一般的な手法である。限界希釈クローン化やマイクロドロップ（Ｍｉｃｒｏｄｒｏｐ）技術などの従来の技術を使用して、高発現細胞クローンを同定することができる。ＧＳ系は、欧州特許第０ ２１６ ８４６号、第０ ２５６ ０５５号、第０ ３２３ ９９７号および第０ ３３８ ８４１号で論じられている。
異なる細胞系統によりまたは遺伝子導入動物中で発現した抗体は、互いに異なるグリコシル化を有する可能性が高い。しかし、本明細書で提供する核酸分子によってコードされ、または本明細書で提供するアミノ酸配列を含む抗体はすべて、抗体のグリコシル化とは無関係に、本発明の一部である。
遺伝子導入動物および植物
本発明のＰ−カドヘリン抗体はまた、対象とするイムノグロブリン重鎖および軽鎖配列を遺伝子導入した哺乳動物または植物の発生、ならびにそれから回収可能な形での抗体の産生を介して遺伝子導入により作製することもできる。哺乳動物における遺伝子導入による産生に関して、Ｐ−カドヘリン抗体を、ヤギ、雌ウシ、または他の動物の乳汁中で産生させ、それから回収することができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，８２７，６９０号、第５，７５６，６８７号、第５，７５０，１７２号および第５，７４１，９５７号を参照されたい。いくつかの実施形態では、上記に記載のように、ヒトイムノグロブリン遺伝子座を含む非ヒト遺伝子導入動物を、Ｐ−カドヘリンまたはその免疫原性部分で免疫感作する。植物中で抗体を作製する方法は、例えば、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第６，０４６，０３７号および第５，９５９，１７７号に記載されている。
いくつかの実施形態では、本発明のＰ−カドヘリン抗体またはその抗原結合部分をコードする１つまたは複数の核酸分子を、標準的な遺伝子導入技術により動物または植物中に導入することによって、非ヒト遺伝子導入動物または植物を作製する。上記のＨｏｇａｎおよび米国特許第６，４１７，４２９号を参照されたい。遺伝子導入動物の作製に使用する遺伝子導入細胞は、胚性幹細胞または体細胞または受精卵でよい。遺伝子導入非ヒト生物は、キメラ、非キメラのヘテロ接合体、および非キメラのホモ接合体でよい。例えば、すべてが参照により本明細書に組み込まれている、Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９９９）；Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２０００）；およびＰｉｎｋｅｒｔ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照されたい。いくつかの実施形態では、遺伝子導入非ヒト動物は、対象とする重鎖および／または軽鎖をコードするターゲッティング構築物による標的破壊および置換を有する。任意の遺伝子導入動物中でＰ−カドヘリン抗体を作製することができる。好ましい実施形態では、非ヒト動物はマウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシまたはウマである。非ヒト遺伝子導入動物は、血液、乳汁、尿、唾液、涙液、粘液および他の体液中で前記のコードされたポリペプチドを発現する。
クラススイッチ
当技術分野で知られている任意の方法によって、Ｐ−カドヘリン抗体のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、またはＩｇＤ）およびサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）を決定することができる。一般に、抗体の特定のクラスおよびサブクラスに特異的な抗体を使用して、抗体のクラスおよびサブクラスを決定することができる。そのような抗体は市販されている。クラスおよびサブクラスは、ＥＬＩＳＡ、またはウェスタンブロット法ならびに他の技術によって決定することができる。あるいは、クラスおよびサブクラスは、抗体の重鎖および／または軽鎖の定常ドメインの全部または一部の配列を決定し、そのアミノ酸配列をイムノグロブリンの様々なクラスおよびサブクラスの既知のアミノ酸配列と比較し、抗体のクラスおよびサブクラスを決定することによって決定することもできる。本発明のＰ−カドヘリン抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、またはＩｇＤ分子でよい。例えば、Ｐ−カドヘリン抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブクラスであるＩｇＧでよい。一実施形態では、Ｐ−カドヘリン抗体は、配列番号３４４で示される重鎖定常領域、および配列番号３４５で示される軽鎖定常領域を有し得る。
本発明の一態様は、Ｐ−カドヘリン抗体のクラスまたはサブクラスを他のクラスまたはサブクラスに転換する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＬまたはＣＨをコードする配列を含まない、ＶＬまたはＶＨをコードする核酸分子を、当技術分野で周知の方法を使用して単離する。次いで、核酸分子を、所望されるイムノグロブリンのクラスまたはサブクラス由来のＣＬまたはＣＨをコードする核酸配列と作動的に連結する。これは、上記に記載のように、ＣＬまたはＣＨ鎖を含むベクターまたは核酸分子を使用して実現することができる。例えば、元はＩｇＭであったＰ−カドヘリン抗体を、ＩｇＧにクラススイッチすることができる。さらに、クラススイッチを使用して、１つのＩｇＧサブクラスを他のものに、例えばＩｇＧ１からＩｇＧ２に転換することができる。所望されるアイソタイプを含む本発明の抗体を作製する他の方法は、Ｐ−カドヘリン抗体の重鎖をコードする核酸およびＰ−カドヘリン抗体の軽鎖をコードする核酸を単離するステップと、ＶＨ領域をコードする配列を単離するステップと、ＶＨ配列を、所望されるアイソタイプの重鎖定常ドメインをコードする配列と連結するステップと、細胞中で軽鎖遺伝子および重鎖の構築物を発現させるステップと、所望されるアイソタイプを有するＰ−カドヘリン抗体を収集するステップとを含む。
脱免疫感作抗体
本発明の他の態様では、例えば（参照により本明細書に組み込まれている）ＰＣＴ公開ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７に記載されている技術を使用して、抗体またはその抗原結合部分を脱免疫感作して、その免疫原性を低下させることができる。
誘導体化および標識抗体
本発明のＰ−カドヘリン抗体または抗原結合部分を誘導体化しまたは他の分子（例えば他のペプチドまたはタンパク質）と連結することができる。一般に、Ｐ−カドヘリンの結合が誘導体化または標識によって悪影響を受けないように、抗体またはその部分を誘導体化する。したがって、本発明の抗体および抗体部分は、完全な形態と修飾した形態の、本明細書に記載のヒトＰ−カドヘリン抗体をどちらも含むものとする。例えば、本発明の抗体および抗体部分は、他の抗体（例えば、二重特異性抗体またはｄｉａｂｏｄｙ）、検出用作用物質、標識、細胞傷害作用物質、医薬作用物質、および／あるいは抗体または抗体の部分と他の分子（ストレプトアビジン中核領域やポリヒスチジンタグなど）の結合を媒介することができるタンパク質またはペプチドなど、１つまたは複数の他の分子成分と（化学結合、遺伝子融合、非共有結合またはその他の方法により）機能的に連結することができる。
１つの型の誘導体化抗体は、（同じ型の、または例えば二重特異性抗体を作製するために異なる型の）２つ以上の抗体を架橋することによって作製される。適切な架橋剤には、適当なスペーサーにより分離された２つの別々に反応する基を有する、ヘテロ二官能性であるもの（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、またはホモ二官能性であるもの（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）がある。そのようなリンカーは、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄから入手可能である。
他の型の誘導体化抗体は標識抗体である。本発明の抗体または抗原結合部分を誘導体化することができる有用な検出用作用物質には、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、塩化５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニル、フィコエリスリン、ランタニドリン光体などを含めた蛍光化合物がある。抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどの検出に有用な酵素で標識することもできる。抗体を検出可能な酵素で標識したとき、それは、酵素を使用して、識別できる反応産物を生じさせるさらなる試薬を添加することによって検出される。例えば、作用物質の西洋ワサビペルオキシダーゼが存在するとき、過酸化水素およびジアミノベンチジンを添加すると、着色した反応産物が生じ、それは検出可能である。抗体はまた、ビオチンで標識し、アビジンまたはストレプトアビジンの結合の間接的測定を介して検出することもできる。抗体はまた、二次的レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーの対の配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）で標識することもできる。いくつかの実施形態では、標識を様々な長さのスペーサーアームにより結合して、潜在的な立体障害を低下させる。Ｐ−カドヘリン抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、メチルまたはエチル基や、含水炭素基などの化学基で誘導体化することもできる。これらの基は、抗体の生物学的特徴の向上、例えば血清半減期の延長に有用である。
Ｐ−カドヘリンに対するＰ−カドヘリン抗体の結合親和性
Ｐ−カドヘリンに対するＰ−カドヘリン抗体またはその抗原結合部分の結合親和性（ＫＤ）および解離速度（Ｋｏｆｆ）を、当技術分野で知られている方法によって決定することができる。結合親和性は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、フローサイトメトリー、またはＢＩＡＣＯＲＥ（商標）などの表面プラズモン共鳴によって測定することができる。解離速度は、表面プラズモン共鳴によって測定することができる。好ましくは、結合親和性および解離速度を、表面プラズモン共鳴によって測定する。より好ましくは、結合親和性および解離速度を、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）を使用して測定する。当技術分野で知られている方法を使用することによって、抗体がＰ−カドヘリン抗体と実質的に同じＫＤを有するかどうかを決定することができる。ＫＤおよびＫｏｆｆを決定するそのような方法は、最初のスクリーニング段階の間、ならびにその後の最適化段階の間に使用することができる。
Ｐ−カドヘリン抗体によって認識されるＰ−カドヘリンエピトープの同定
本発明は、Ｐ−カドヘリンと結合し、表１または２で記載した任意の抗体と同じエピトープと競合または交差競合し、かつ／あるいはそれと結合するヒトＰ−カドヘリン抗体を提供する。当技術分野で知られている方法を使用することによって、抗体が、同じエピトープと結合し、または結合について本発明のＰ−カドヘリン抗体と交差競合するかどうかを決定することができる。一実施形態では、本発明のＰ−カドヘリン抗体を飽和条件下でＰ−カドヘリンと結合させ、次いでＰ−カドヘリンと結合する試験抗体の能力を測定する。試験抗体がＰ−カドヘリン抗体と同じ時間でＰ−カドヘリンと結合できる場合、試験抗体は、Ｐ−カドヘリン抗体と異なるエピトープと結合する。しかし、試験抗体が同じ時間でＰ−カドヘリンと結合できない場合、試験抗体は、同じエピトープ、重複するエピトープ、またはヒトＰ−カドヘリン抗体が結合したエピトープに近接しているエピトープと結合する。この実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）、またはフローサイトメトリーを使用して行うことができる。好ましい実施形態では、実験はＥＬＩＳＡを使用して行う。
Ｐ−カドヘリン抗体によるＰ−カドヘリン活性の阻害
いくつかのアッセイを使用して、Ｐ−カドヘリン活性を阻害するＰ−カドヘリン抗体を同定することができる。細胞凝集アッセイは、例えば、Ｐ−カドヘリン依存性の細胞凝集を測定する方法をもたらす。この型のアッセイは、Ｐ−カドヘリンを過剰発現する細胞系統を使用し、その細胞を懸濁液中に入れ、Ｐ−カドヘリン依存性の凝集物を形成させる。次いで、凝集アッセイを使用して、抗体がある状態およびない状態で生じる細胞凝集物のサイズを測定することによりこの凝集を防止するＰ−カドヘリン抗体の能力を定量する。次いで、Ｐ−カドヘリン抗体濃度の関数としての細胞凝集物のサイズを使用して、ＩＣ５０値を決定することができる。実施例４に、複数のＰ−カドヘリン抗体のＩＣ５０値の測定に使用したＰ−カドヘリン依存性凝集アッセイのさらなる詳細を示す。
細胞接着アッセイを使用して、固体支持体上に固定化されている受容体Ｐ−カドヘリンと細胞の接着を遮断するＰ−カドヘリン抗体の能力を測定することもできる。この型のアッセイは、例えば、プラスチックなどの固体支持体上にＰ−カドヘリンを固定化することによって実施することができる。次いで、Ｐ−カドヘリンを過剰発現する細胞を、Ｐ−カドヘリン間の相互作用を介して固体支持体に接着させる。次いで、Ｐ−カドヘリン抗体がある状態およびない状態で接着のレベルを定量することができる。次いで、抗体濃度の関数としての接着を使用して、ＩＣ５０値を決定する。実施例３に、Ｐ−カドヘリン抗体のＩＣ５０値の測定に使用したＰ−カドヘリン依存性細胞接着アッセイのさらなる詳細を示す。
Ｐ−カドヘリン活性の阻害はまた、Ｐ−カドヘリン依存性スフェロイド破壊アッセイを使用して測定することもできる。この型のアッセイは、予め形成されたＰ−カドヘリン依存性の細胞凝集物を破壊するＰ−カドヘリン抗体の能力を測定するものである。抗体濃度の関数としての凝集物のサイズ低下を測定することによって、ＩＣ５０値を決定することができる。実施例５に、Ｐ−カドヘリン抗体のＩＣ５０値の測定に使用したＰ−カドヘリン依存性スフェロイド破壊アッセイのさらなる詳細を示す。様々な抗体またはその抗原結合部分によってＰ−カドヘリン活性の阻害を決定する上記に記載の方法およびアッセイは、最初のスクリーニング段階の間、ならびにその後の最適化段階の間に使用することができる。
分子選択性
Ｅ−カドヘリンなど、他のカドヘリンと比べての本発明のＰ−カドヘリン抗体の選択性は、当技術分野で周知の方法を使用して決定することができる。例えば、ウェスタンブロット法、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法またはＲＩＡを使用して、選択性を決定することができる。実施例７に、Ｅ−カドヘリンと比べてのＰ−カドヘリンに対する特異的抗体の選択性の測定に使用したＥＬＩＳＡアッセイのさらなる詳細を示す。様々な抗体またはその抗原結合部分のＰ−カドヘリンに対する選択性を決定する上記に記載の方法およびアッセイは、最初のスクリーニング段階の間、ならびにその後の最適化段階の間に使用することができる。
医薬組成物および投与
本発明はまた、ヒトを含めた哺乳動物中の異常細胞増殖を治療するための医薬組成物にも関し、それは、異常細胞増殖の治療に有効な量の、本明細書に記載のＰ−カドヘリン抗体またはその抗原結合部分、および薬学的に許容できる担体を含む。
本発明の抗体および抗原結合部分は、対象への投与に適した医薬組成物中に組み込むことができる。通常、医薬組成物は、本発明の抗体または抗原結合部分および薬学的に許容できる担体を含む。本明細書において、「薬学的に許容できる担体」は、生理学的に適合する任意のかつすべての溶媒、分散媒、被覆、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを意味する。薬学的に許容できる担体の一部の例は、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにその組合せである。多数の場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトールなどのポリアルコール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。薬学的に許容できる物質のさらなる例は、湿潤剤、あるいは湿潤剤または乳化剤、保存剤や緩衝剤などの少量の補助物質であり、それは抗体の貯蔵寿命または有効性を高める。
本発明の組成物は、様々な形態、例えば、液剤（例えば、注射可能かつ注入可能な液剤）、分散剤または懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、リポソームおよび坐剤などの液体、半固体、および固体の剤形のものでよい。好ましい形態は、意図される投与形態、および治療への適用によって決まる。通常好ましい組成物は、ヒトの受動的免疫感作に使用するものに類似した組成物など、注射可能なまたは注入可能な溶剤の形態である。好ましい投与形態は、非経口（例えば、静脈内、経皮、腹腔内、筋内）投与である。好ましい実施形態では、静脈内注入または注射によって抗体を投与する。他の好ましい実施形態では、筋内または経皮注射によって抗体を投与する。注射用製剤は、単位剤形で、例えば、保存剤を添加したまたは添加しないアンプルでまたは複数投与量の容器で提供することができる。組成物は、懸濁剤、液剤や油性または水性媒体中のエマルジョン剤などの形態をとることができ、懸濁化剤、安定化剤、および／または分散剤などの製剤用作用物質（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ）を含んでよい。あるいは、有効成分は、使用前に適切な媒体で、例えば、発熱物質を含まない滅菌水で溶く粉末の形態でもよい。
治療用組成物は通常、製造および貯蔵の条件下で無菌的かつ安定でなければならない。組成物は、溶剤、マイクロエマルジョン剤、分散剤、リポソーム、または高い薬物濃度に適した他の規則正しい構造として製剤することができる。注射可能な滅菌溶剤は、必要に応じて上記に列挙した成分の１つまたはその組合せを含む適当な溶媒中に必要量の抗体を入れ、その後濾過滅菌を行うことによって調製することができる。一般に、分散剤は、基礎となる分散媒、および上記に列挙したものから必要な他の成分を含む滅菌媒体中に活性化合物を入れることによって調製する。注射可能な滅菌溶剤調製用の滅菌粉末剤の場合では、好ましい調製方法は、予め滅菌濾過したその溶液から有効成分＋任意のさらなる所望の成分の粉末が得られる真空乾燥および凍結乾燥である。溶剤の適当な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆の使用、分散剤の場合では必要な粒子サイズの維持、および界面活性物質の使用によって維持することができる。注射可能な組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらすことができる。
本発明の抗体または抗体部分は、当技術分野で知られている様々な方法によって投与することができるが、多くの治療への適用では、好ましい投与経路／形態は、経皮、筋内、または静脈内注入である。当業者には理解されるであろうが、投与経路および／または形態は、所望の結果に応じて様々となる。
特定の実施形態では、植込錠、経皮貼布、およびマイクロカプセル化送達系を含めた制御放出製剤など、急速な放出から化合物を保護する担体とともに本発明の抗体組成物を調製することができる。酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸などの生体分解性、生体適合性のポリマーを使用することができる。そのような製剤を調製する多数の方法が一般に当業者に知られている。例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７８）を参照されたい。
さらなる活性化合物を組成物中に組み込むこともできる。特定の実施形態では、本発明の阻害性Ｐ−カドヘリン抗体を、１つまたは複数のさらなる治療用作用物質と同時に製剤および／または投与することができる。これらの作用物質には、それだけに限らないが、他の標的と結合する抗体、抗腫瘍剤、抗血管新生剤、シグナル伝達阻害剤、抗増殖剤、化学療法剤、またはＰ−カドヘリンを阻害するペプチド類似体がある。そのような併用療法は、低投与量の阻害性Ｐ−カドヘリン抗体ならびに同時投与する作用物質を必要とする可能性があり、それによって、種々の単剤療法と関係する、考えられる毒性または合併症が回避される。
本発明の組成物は、「治療有効量」または「予防有効量」の、本発明の抗体または抗原結合部分を含んでよい。「治療有効量」とは、必要な投与量および期間で、所望の治療結果を実現するのに有効な量を指す。抗体または抗原結合部分の治療有効量は、個人の病期、年齢、性別および体重や、個人において所望の応答を誘発する抗体または抗体部分の能力などのファクターに応じて様々となる可能性がある。治療有効量とは、抗体または抗原結合部分の任意の毒性のあるまたは有害な効果より、治療上有益な効果が勝っているものでもある。「予防有効量」とは、必要な投与量および期間で、所望の予防結果を実現するのに有効な量を指す。通常、疾患の前またはその初期段階で対象において予防上の投与を使用するので、予防有効量は、治療有効量より少ない可能性がある。
投与法を調整して、最適な所望の応答（例えば、治療的または予防的応答）をもたらすことができる。例えば、治療の状況の緊急性によって示される通りに、単回ボーラス投与を行うこともでき、いくつかに分割した投与を、時間をかけて行うこともでき、あるいは投与量を比例的に増減することもできる。投与しやすく投与量が均一な単位剤形で非経口組成物を製剤すると特に有利となる。本明細書において、単位剤形とは、治療される哺乳動物対象に対する単位投与量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な薬学的担体とともに所望の治療効果をもたらすように計算された所定の量の活性化合物を含む。本発明の単位剤形の指定は、（ａ）Ｐ−カドヘリン抗体またはその部分の独特の特徴および実現される特定の治療的または予防的効果、ならびに（ｂ）個人における感受性の治療用のそのような抗体を化合する技術に固有の制限によって決定され、それらに直接依存する。
本発明の抗体または抗体部分の治療または予防有効量の例示的であり非限定的な範囲は、０．０２５〜５０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは０．１〜２５、０．１〜１０または０．１〜３ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、製剤は、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．５、１４０ｍＭのＮａＣｌ、および０．２ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０の緩衝液中に５ｍｇ／ｍＬの抗体を含む。緩和する状態の型および重症度によって投与値は様々でよいことに留意されたい。任意の特定の対象について、個々の必要性、および組成物の投与を行いまたは指示する者の職業的判断に従って具体的な投与法をその過程で調整すべきであり、本明細書で示した投与量の範囲は例示的なものにすぎず、特許請求に係る組成物の範囲または実施を限定するものではないことをさらに理解されたい。
本発明の他の態様は、本発明のＰ−カドヘリン抗体または抗原結合部分、あるいはそのような抗体または部分を含む組成物を含むキットを提供する。キットは、抗体または組成物に加えて、診断用または治療用作用物質を含んでよい。キットはまた、診断または治療方法における使用説明書を含んでもよい。好ましい実施形態では、キットは、抗体またはそれを含む組成物、および下記に記載の方法で使用することができる診断用作用物質を含む。他の好ましい実施形態では、キットは、抗体またはそれを含む組成物、および下記に記載の方法で使用することができる１つまたは複数の治療用作用物質を含む。
使用する診断方法
Ｐ−カドヘリン抗体またはその抗原結合部分を診断方法で使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで生体試料中のＰ−カドヘリンを検出することができる。例えば、Ｐ−カドヘリン抗体は、それだけに限らないが、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、フローサイトメトリー、組織の免疫組織化学分析、ウェスタンブロット法または免疫沈降法を含めて、従来のイムノアッセイで使用することができる。本発明のＰ−カドヘリン抗体を使用して、ヒトのＰ−カドヘリンを検出することができる。Ｐ−カドヘリン抗体を使用して、マウス、ラットおよびカニクイザルのＰ−カドヘリンを検出することもできる。
本発明は、生体試料中のＰ−カドヘリンを検出する方法を提供し、その方法は、生体試料を本発明のＰ−カドヘリン抗体と接触させるステップと、結合した抗体を検出するステップとを含む。一実施形態では、Ｐ−カドヘリン抗体を検出可能な標識で直接標識する。他の実施形態では、Ｐ−カドヘリン抗体（一次抗体）を標識せず、Ｐ−カドヘリン抗体と結合することができる二次抗体または他の分子を標識する。当業者には周知であろうが、特定の種およびクラスの一次抗体と特異的に結合することができる二次抗体を選択する。例えば、Ｐ−カドヘリン抗体がヒトＩｇＧである場合、二次抗体は抗ヒトＩｇＧでよい。抗体と結合することができる他の分子には、それだけに限らないが、例えばＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．からどちらも市販されているプロテインＡおよびプロテインＧがある。
抗体または二次抗体に適した標識は前記で論じており、それには、様々な酵素、接合団、蛍光物質、発光物質および放射性物質がある。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼがあり、適切な接合団複合体の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリスリンがあり、発光物質の例にはルミノールがあり、適切な放射性物質の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈがある。
他の実施形態では、検出可能な物質で標識したＰ−カドヘリン標準物質および非標識Ｐ−カドヘリン抗体を利用する競合イムノアッセイによって、生体試料中でＰ−カドヘリンのアッセイを行うことができる。このアッセイでは、生体試料、標識Ｐ−カドヘリン標準物質およびＰ−カドヘリン抗体を混合し、非標識抗体と結合した標識Ｐ−カドヘリン標準物質の量を決定する。生体試料中のＰ−カドヘリンの量は、Ｐ−カドヘリン抗体と結合した標識Ｐ−カドヘリン標準物質の量と反比例する。
いくつかの目的で、上記で開示されているイムノアッセイを使用することができる。例えば、Ｐ−カドヘリン抗体を使用して、培養細胞中でＰ−カドヘリンを検出することができる。好ましい実施形態では、Ｐ−カドヘリン抗体を使用して、様々な化合物で処理されている細胞によって産生されたＰ−カドヘリンの量を決定する。この方法を使用して、Ｐ−カドヘリンのタンパク質レベルを調節する化合物を同定することができる。この方法に従って、１つの試料の細胞を試験化合物でしばらくの間処理し、その一方で他の試料を処理しないままにしておく。全体レベルのＰ−カドヘリンを測定する場合、細胞を溶解し、上記に記載のイムノアッセイの１つを使用して全体のＰ−カドヘリンレベルを測定する。処理細胞対非処理細胞の全体レベルのＰ−カドヘリンを比較して、試験化合物の効果を決定する。
全体のＰ−カドヘリンレベルの測定に好ましいイムノアッセイは、フローサイトメトリーまたは免疫組織化学分析である。ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット法、免疫組織化学分析、内在性膜タンパク質の細胞表面標識および免疫沈降法などの方法は、当技術分野で周知である。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上記を参照されたい。さらに、Ｐ−カドヘリン発現の活性化または阻害について多数の化合物を試験するために、イムノアッセイの規模を高処理能スクリーニングに拡大することができる。
本発明のＰ−カドヘリンを使用して、組織中または組織に由来する細胞中のＰ−カドヘリンのレベルを決定することもできる。いくつかの実施形態では、組織は罹患組織である。その方法のいくつかの実施形態では、組織またはその生検材料を患者から切り出す。次いで、組織または生検材料をイムノアッセイで使用して、例えば、上記で論じた方法によって全体のＰ−カドヘリンレベルまたはＰ−カドヘリンの局在を決定することができる。
本発明の抗体をｉｎ ｖｉｖｏで使用して、Ｐ−カドヘリンを発現する組織および臓器を特定することもできる。本発明のヒトＰ−カドヘリン抗体を使用する１つの利点は、非ヒト由来の抗体、あるいはヒト化またはキメラ抗体を有する抗体と異なり、投与後に抗体に対する実質的な免疫応答を誘発することなく、それをｉｎ ｖｉｖｏで安全に使用できることである。
その方法は、検出可能となるように標識したＰ−カドヘリン抗体またはそれを含む組成物を、そのような診断試験の必要がある患者に投与するステップと、患者に画像化分析を施してＰ−カドヘリン発現組織の位置を決定するステップとを含む。画像化分析は医療技術分野で周知であり、それには、それだけに限らないが、Ｘ線分析、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）またはコンピュータ断層撮影（ＣＴ）がある。抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏ画像化に適した任意の作用物質、例えば、Ｘ線分析に使用することができるバリウムなどの造影剤、あるいはＭＲＩまたはＣＴに使用することができるガドリニウムキレートなどの磁性造影剤で標識することができる。他の標識用作用物質には、それだけに限らないが、９９Ｔｃなどの放射性同位体がある。他の実施形態では、Ｐ−カドヘリン抗体を標識せず、検出可能でありＰ−カドヘリン抗体と結合することができる二次抗体または他の分子を投与することによって画像化を行う。一実施形態では、患者から生検材料を得て、対象とする組織がＰ−カドヘリンを発現するかどうかを決定する。
使用する治療方法
他の実施形態では、本発明は、その必要がある患者にＰ−カドヘリン抗体を投与することによってＰ−カドヘリン活性を阻害する方法を提供する。本明細書に記載の抗体または抗原結合部分のいずれかを治療上使用することができる。好ましい実施形態では、Ｐ−カドヘリン抗体は、ヒト抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。他の好ましい実施形態では、Ｐ−カドヘリンはヒトであり、患者はヒト患者である。あるいは、患者は、Ｐ−カドヘリンが交差反応するＰ−カドヘリンを発現する哺乳動物でもよい。獣医学的な目的で、またはヒト疾患の動物モデルとして、抗体が交差反応するＰ−カドヘリンを発現する非ヒト哺乳動物（例えば、ラット、マウス、またはカニクイザル）に抗体を投与することができる。そのような動物モデルは、本発明の抗体の治療効果を評価するのに有用である可能性がある。
他の実施形態では、Ｐ−カドヘリン抗体またはその抗体部分を、不適切に高レベルのＰ−カドヘリンを発現する患者に投与することができる。抗体は、１回投与することができるが、より好ましくは複数回投与する。抗体は、１日に３回から６カ月以上毎に１回で投与することができる。投与は、１日に３回、１日に２回、１日に１回、２日毎に１回、３日毎に１回、１週間に１回、２週間毎に１回、１カ月毎に１回、２カ月毎に１回、３カ月毎に１回や６カ月毎に１回などの予定で行うことができる。抗体はまた、ミニポンプにより連続して投与することもできる。抗体は、粘膜経路、口腔内経路、鼻内経路、吸入可能な経路、静脈内経路、皮下経路、筋内経路、非経口経路、または腫瘍内経路を介して投与することができる。抗体は、１回、少なくとも２回、あるいは、状態が治療され、緩和しまたは治癒するまで少なくともしばらくの間投与することができる。抗体は一般に、状態が存在する限り投与される。抗体は一般に、上記に記載の医薬組成物の一部として投与される。抗体の投与量は一般に０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１〜２０ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇとなる。抗体の血清濃度は、当技術分野で知られている任意の方法によって測定することができる。
本発明はまた、ヒトを含めた哺乳動物中の異常細胞増殖を治療する方法にも関し、その方法は、異常細胞増殖の治療に有効な、本明細書に記載のＰ−カドヘリン抗体またはその抗原結合部分を前記哺乳動物に治療有効量投与するステップを含む。
この方法の一実施形態では、異常細胞増殖は、それだけに限らないが、中皮腫、肝胆管（肝および胆管）腫瘍、原発性または続発性のＣＮＳ腫瘍、原発性または続発性の脳腫瘍、肺癌（ＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣ）、骨癌、膵癌、皮膚癌、頭頚部癌、皮膚性または眼内黒色腫、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、胃腸（胃、結腸直腸、および十二指腸）癌、乳癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頚部癌、膣癌、外陰部癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、精巣癌、慢性または急性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎または尿管の癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、副腎皮質癌、胆嚢癌、多発性骨髄腫、胆管癌、線維肉腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、あるいは上記の癌の１つまたは複数の組合せを含めた癌である。
本発明の好ましい実施形態では、癌は、肺癌（ＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣ）、頭頚部癌、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、乳癌、腎または尿管の癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、脊髄軸腫瘍、あるいは上記の癌の１つまたは複数の組合せから選択される。
本発明の他の好ましい実施形態では、癌は、肺癌（ＮＳＣＬＣおよびＳＣＬＣ）、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、肛門領域の癌、あるいは上記の癌の１つまたは複数の組合せから選択される。
前記方法の他の実施形態では、前記異常細胞増殖は、それだけに限らないが、乾癬、良性前立腺肥大または再狭窄を含めた良性増殖性疾患である。
本発明はまた、哺乳動物中の異常細胞増殖を治療する方法にも関し、その方法は、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、挿入抗生物質、成長因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、生物学的応答修飾物質、抗体、細胞傷害性物質、抗ホルモン、および抗アンドロゲンからなる群から選択される抗腫瘍剤と組み合わせた、異常細胞増殖の治療に有効な量の、本明細書に記載のＰ−カドヘリン抗体またはその抗原結合部分を前記哺乳動物に投与するステップを含む。
本発明はまた、ヒトを含めた哺乳動物中の異常細胞増殖を治療するための医薬組成物にも関し、それは、薬学的に許容できる担体、ならびに有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、挿入抗生物質、成長因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、生物学的応答修飾物質、抗ホルモン、および抗アンドロゲンからなる群から選択される抗腫瘍剤と組み合わせた、異常細胞増殖の治療に有効な量の、本明細書に記載のＰ−カドヘリン抗体またはその抗原結合部分を含む。
本発明はまた、哺乳動物中の過剰増殖性障害を治療する方法にも関し、その方法は、抗増殖剤、キナーゼ阻害剤、血管新生阻害剤、成長因子阻害剤、ｃｏｘ−Ｉ阻害剤、ｃｏｘ−ＩＩ阻害剤、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、挿入抗生物質、成長因子阻害剤、放射線、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、生物学的応答修飾物質、抗体、細胞傷害性物質、抗ホルモン、スタチン、および抗アンドロゲンからなる群から選択される抗腫瘍剤と組み合わせた、本明細書に記載のＰ−カドヘリン抗体またはその抗原結合部分を前記哺乳動物に治療有効量投与するステップを含む。
本発明の一実施形態では、本明細書に記載のＰ−カドヘリン抗体またはその抗原結合部分および医薬組成物と組み合わせて使用する抗腫瘍剤は、抗血管新生剤、キナーゼ阻害剤、汎性キナーゼ阻害剤または成長因子阻害剤である。好ましい汎性キナーゼ阻害剤には、米国特許第６，５７３，２９３号に記載のＳＵ−１１２４８（Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ、米国ニューヨーク州）がある。
抗血管新生剤には、それだけに限らないが、ＥＧＦ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ＴＩＥ２阻害剤、ＩＧＦ１Ｒ阻害剤、ＣＯＸ−ＩＩ（シクロオキシゲナーゼＩＩ）阻害剤、ＭＭＰ−２（マトリックスメタロプロテイナーゼ２）阻害剤やＭＭＰ−９（マトリックスメタロプロテイナーゼ９）阻害剤などの作用物質がある。好ましいＶＥＧＦ阻害剤には、例えば、カリフォルニア州Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ ＦｒａｎｃｉｓｃｏのＧｅｎｅｎｔｅｃｈの抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体であるＡｖａｓｔｉｎ（ベバシズマブ）がある。
さらなるＶＥＧＦ阻害剤には、ＣＰ−５４７，６３２（Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．、米国ニューヨーク州）、ＡＧ１３７３６（Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．）、ＺＤ−６４７４（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＡＥＥ７８８（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＡＺＤ−２１７１、ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ、／Ａｖｅｎｔｉｓ）、バタラニブ（ＰＴＫ−７８７、ＺＫ−２２２５８４としても知られる：Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＆ Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ）、Ｍａｃｕｇｅｎ（ペガプタニブ八ナトリウム、ＮＸ−１８３８、ＥＹＥ−００１、Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．／Ｇｉｌｅａｄ／Ｅｙｅｔｅｃｈ）、ＩＭ８６２（米国ワシントン州ＫｉｒｋｌａｎｄのＣｙｔｒａｎ Ｉｎｃ．）；およびＲｉｂｏｚｙｍｅ（コロラド州Ｂｏｕｌｄｅｒ）およびＣｈｉｒｏｎ（カリフォルニア州Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ）の合成リボザイムであるアンギオザイム（ａｎｇｉｏｚｙｍｅ）ならびにその組合せがある。本発明の実施で有用なＶＥＧＦ阻害剤は、米国特許第６，５３４，５２４号および第６，２３５，７６４号で開示されており、どちらもすべての目的でその全体が組み込まれている。特に好ましいＶＥＧＦ阻害剤には、ＣＰ−５４７，６３２、ＡＧ１３７３６、バタラニブ、Ｍａｃｕｇｅｎおよびその組合せがある。
さらなるＶＥＧＦ阻害剤は、例えば、ＷＯ９９／２４４４０（１９９９年５月２０日に公開）、ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＩＢ９９／００７９７（１９９９年５月３日に出願）、ＷＯ９５／２１６１３（１９９５年８月１７日に公開）、ＷＯ９９／６１４２２（１９９９年１２月２日に公開）、米国特許第６，５３４，５２４号（ＡＧ１３７３６を開示）、米国特許第５，８３４，５０４号（１９９８年１１月１０日に発行）、ＷＯ９８／５０３５６（１９９８年１１月１２日に公開）、米国特許第５，８８３，１１３号（１９９９年３月１６日に発行）、米国特許第５，８８６，０２０号（１９９９年３月２３日に発行）、米国特許第５，７９２，７８３号（１９９８年８月１１日に発行）、米国特許第６，６５３，３０８号（２００３年１１月２５日に発行）、ＷＯ９９／１０３４９（１９９９年３月４日に公開）、ＷＯ９７／３２８５６（１９９７年９月１２日に公開）、ＷＯ９７／２２５９６（１９９７年６月２６日に公開）、ＷＯ９８／５４０９３（１９９８年１２月３日に公開）、ＷＯ９８／０２４３８（１９９８年１月２２日に公開）、ＷＯ９９／１６７５５（１９９９年４月８日に公開）、およびＷＯ９８／０２４３７（１９９８年１月２２日に公開）に記載され、これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
本発明の抗体またはその抗原結合部分とともに使用することができる他の抗増殖剤には、米国特許出願第０９／２２１９４６号（１９９８年１２月２８日に出願）、第０９／４５４０５８号（１９９９年１２月２日に出願）、第０９／５０１１６３号（２０００年２月９日に出願）、第０９／５３９９３０号（２０００年３月３１日に出願）、第０９／２０２７９６号（１９９７年５月２２日に出願）、第０９／３８４３３９号（１９９９年８月２６日に出願）、および第０９／３８３７５５号（１９９９年８月２６日に出願）で開示され、特許請求されている化合物、ならびに米国仮特許出願第６０／１６８２０７号（１９９９年１１月３０日に出願）、第６０／１７０１１９号（１９９９年１２月１０日に出願）、第６０／１７７７１８号（２０００年１月２１日に出願）、第６０／１６８２１７号（１９９９年１１月３０日に出願）、および第６０／２００８３４号（２０００年５月１日に出願）で開示され、特許請求されている化合物を含めた、酵素ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼの阻害剤、および受容体チロシンキナーゼＰＤＧＦｒの阻害剤がある。上記の特許出願および仮特許出願はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
ＰＤＧＦｒ阻害剤には、それだけに限らないが、２００１年７月７日に公開されたＷＯ０１／４０２１７、および２００４年３月１１日に公開されたＷＯ２００４／０２０４３１で開示されているものがあり、その内容は、すべての目的でその全体が組み込まれている。好ましいＰＤＧＦｒ阻害剤には、ＰｆｉｚｅｒのＣＰ−６７３，４５１およびＣＰ−８６８，５９６、ならびにその薬学的に許容できるその塩がある。
好ましいＧＡＲＦ阻害剤には、ＰｆｉｚｅｒのＡＧ−２０３７（ペリトレキソール（ｐｅｌｉｔｒｅｘｏｌ）および薬学的に許容できるその塩）がある。本発明の実施で有用なＧＡＲＦ阻害剤は、すべての目的でその全体が組み込まれている米国特許第５，６０８，０８２号で開示されている。
本明細書に記載のＰ−カドヘリン抗体またはその抗原結合部分、および本明細書に記載の医薬組成物と組み合わせて使用することができる有用なＣＯＸ−ＩＩ阻害剤の例には、ＣＥＬＥＢＲＥＸ（商標）（セレコキシブ）、パレコキシブ、デラコキシブ、ＡＢＴ−９６３、ＭＫ−６６３（エトリコキシブ）、ＣＯＸ−１８９（ルミラコキシブ）、ＢＭＳ３４７０７０、ＲＳ５７０６７、ＮＳ−３９８、Ｂｅｘｔｒａ（バルデコキシブ）、パラコキシブ（ｐａｒａｃｏｘｉｂ）、Ｖｉｏｘｘ（ロフェコキシブ）、ＳＤ−８３８１、４−メチル−２−（３，４−ジメチルフェニル）−１−（４−スルファモイル−フェニル）−１Ｈ−ピロール、２−（４−エトキシフェニル）−４−メチル−１−（４−スルファモイルフェニル）−１Ｈ−ピロール、Ｔ−６１４、ＪＴＥ−５２２、Ｓ−２４７４、ＳＶＴ−２０１６、ＣＴ−３、ＳＣ−５８１２５およびＡｒｃｏｘｉａ（エトリコキシブ）がある。さらに、ＣＯＸ−ＩＩ阻害剤は、米国特許出願第１０／８０１，４４６号および第１０／８０１，４２９号で開示されており、その内容は、すべての目的でその全体が組み込まれている。
好ましい一実施形態では、抗腫瘍剤は、米国特許第５，４６６，８２３号で開示されているセレコキシブであり、その内容は、すべての目的でその全体が参照により組み込まれている。セレコキシブの構造を下記に示す：
Figure 0005086974
好ましい一実施形態では、抗腫瘍剤は、米国特許第５，６３３，２７２号で開示されているバルデコキシブ（ｖａｌｄｅｃｏｘｉｂ）であり、その内容は、すべての目的でその全体が参照により組み込まれている。バルデコキシブの構造を下記に示す：
Figure 0005086974
好ましい一実施形態では、抗腫瘍剤は、米国特許第５，９３２，５９８号で開示されているパレコキシブであり、その内容は、すべての目的でその全体が参照により組み込まれている。パラコキシブの構造を下記に示す：
Figure 0005086974
好ましい一実施形態では、抗腫瘍剤は、米国特許第５，５２１，２０７号で開示されているデラコキシブであり、その内容は、すべての目的でその全体が参照により組み込まれている。デラコキシブの構造を下記に示す：
Figure 0005086974
好ましい一実施形態では、抗腫瘍剤は、米国特許第６，０３４，２５６号で開示されているＳＤ−８３８１であり、その内容は、すべての目的でその全体が参照により組み込まれている。ＳＤ−８３８１の構造を下記に示す：
Figure 0005086974
好ましい一実施形態では、抗腫瘍剤は、国際公開ＷＯ２００２／２４７１９で開示されているＡＢＴ−９６３であり、その内容は、すべての目的でその全体が参照により組み込まれている。ＡＢＴ−９６３の構造を下記に示す：
Figure 0005086974
好ましい一実施形態では、抗腫瘍剤は、下記に示すロフェコキシブである：
Figure 0005086974
好ましい一実施形態では、抗腫瘍剤は、国際公開ＷＯ１９９８／０３４８４で開示されているＭＫ−６６３（エトリコキシブ）であり、その内容は、すべての目的でその全体が参照により組み込まれている。エトリコキシブの構造を下記に示す：
Figure 0005086974
好ましい一実施形態では、抗腫瘍剤は、国際公開ＷＯ１９９９／１１６０５で開示されているＣＯＸ−１８９（ルミラコキシブ）であり、その内容は、すべての目的でその全体が参照により組み込まれている。ルミラコキシブの構造を下記に示す：
Figure 0005086974
好ましい一実施形態では、抗腫瘍剤は、米国特許第６，１８０，６５１号で開示されているＢＭＳ−３４７０７０であり、その内容は、すべての目的でその全体が参照により組み込まれている。ＢＭＳ−３４７０７０の構造を下記に示す：
Figure 0005086974
好ましい一実施形態では、抗腫瘍剤は、ＮＳ−３９８（ＣＡＳ １２３６５３−１１−２）である。ＮＳ−３９８（ＣＡＳ １２３６５３−１１−２）の構造を下記に示す：
Figure 0005086974
好ましい一実施形態では、抗腫瘍剤は、ＲＳ５７０６７（ＣＡＳ １７９３２−９１−３）である。ＲＳ−５７０６７（ＣＡＳ １７９３２−９１−３）の構造を下記に示す：
Figure 0005086974
好ましい一実施形態では、抗腫瘍剤は、４−メチル−２−（３，４−ジメチルフェニル）−１−（４−スルファモイル−フェニル）−１Ｈ−ピロールである。４−メチル−２−（３，４−ジメチルフェニル）−１−（４−スルファモイル−フェニル）−１Ｈ−ピロールの構造を下記に示す：
Figure 0005086974
好ましい一実施形態では、抗腫瘍剤は、２−（４−エトキシフェニル）−４−メチル−１−（４−スルファモイルフェニル）−１Ｈ−ピロールである。２−（４−エトキシフェニル）−４−メチル−１−（４−スルファモイルフェニル）−１Ｈ−ピロールの構造を下記に示す：
Figure 0005086974
好ましい一実施形態では、抗腫瘍剤は、メロキシカムである。メロキシカムの構造を下記に示す：
Figure 0005086974
本発明の抗体および本明細書に記載の医薬組成物と組み合わせて使用する抗腫瘍剤として有用な他の阻害剤には、プロスタグランジンを作り出す酵素（シクロオキシゲナーゼＩおよびＩＩ）を阻害し、その結果プロスタグランジンのレベルを低下させるアスピリンおよび非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）があり、それだけに限らないが、サルサレート（Ａｍｉｇｅｓｉｃ）、ジフルニサル（Ｄｏｌｏｂｉｄ）、イブプロフェン（Ｍｏｔｒｉｎ）、ケトプロフェン（Ｏｒｕｄｉｓ）、ナブメトン（Ｒｅｌａｆｅｎ）、ピロキシカム（Ｆｅｌｄｅｎｅ）、ナプロキセン（Ａｌｅｖｅ、Ｎａｐｒｏｓｙｎ）、ジクロフェナク（Ｖｏｌｔａｒｅｎ）、インドメタシン（Ｉｎｄｏｃｉｎ）、スリンダック（Ｃｌｉｎｏｒｉｌ）、トルメチン（Ｔｏｌｅｃｔｉｎ）、エトドラク（Ｌｏｄｉｎｅ）、ケトロラック（Ｔｏｒａｄｏｌ）、オキサプロジン（Ｄａｙｐｒｏ）、およびその組合せがある。好ましいＣＯＸ−Ｉ阻害剤には、イブプロフェン（Ｍｏｔｒｉｎ）、ニュープリン、ナプロキセン（Ａｌｅｖｅ）、インドメタシン（Ｉｎｄｏｃｉｎ）、ナブメトン（Ｒｅｌａｆｅｎ）、およびその組合せがある。
本明細書に記載のＰ−カドヘリン抗体またはその抗原結合部分、および本明細書に記載のその医薬組成物と組み合わせて使用する標的作用物質には、Ｉｒｅｓｓａ（ゲフィチニブ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、Ｔａｒｃｅｖａ（エルロチニブまたはＯＳＩ−７７４、ＯＳＩ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（セツキシマブ、Ｉｍｃｌｏｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）、ＥＭＤ−７２００（Ｍｅｒｃｋ ＡＧ）、ＡＢＸ−ＥＧＦ（Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．およびＡｂｇｅｎｉｘ Ｉｎｃ．）、ＨＲ３（キューバ政府（Ｃｕｂａｎ Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ））、ＩｇＡ抗体（Ｅｒｌａｎｇｅｎ−Ｎｕｒｅｍｂｅｒｇ大学）、ＴＰ−３８（ＩＶＡＸ）、ＥＧＦＲ融合タンパク質、ＥＧＦ−ワクチン、抗ＥＧＦｒイムノリポソーム（Ｈｅｒｍｅｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）やその組合せなどのＥＧＦｒ阻害剤がある。
好ましいＥＧＦｒ阻害剤には、Ｉｒｅｓｓａ、Ｅｒｂｉｔｕｘ、Ｔａｒｃｅｖａおよびその組合せがある。
本発明はまた、ＣＰ−７２４，７１４（Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．）、ＣＩ−１０３３（カネルチニブ（ｃａｎｅｒｔｉｎｉｂ）、Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラスツズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、Ｏｍｉｔａｒｇ（２Ｃ４、ペルツズマブ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）、ＴＡＫ−１６５（Ｔａｋｅｄａ）、ＧＷ−５７２０１６（ロナファルニブ（ｌｏｎａｆａｒｎｉｂ）、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＧＷ−２８２９７４（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＥＫＢ−５６９（Ｗｙｅｔｈ）、ＰＫＩ−１６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ｄＨＥＲ２（ＨＥＲ２ワクチン、ＣｏｒｉｘａおよびＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＡＰＣ８０２４（ＨＥＲ２ワクチン、Ｄｅｎｄｒｅｏｎ）、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ二重特異性抗体（Ｄｅｃｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）、Ｂ７．ｈｅｒ２．ＩｇＧ３（Ａｇｅｎｓｙｓ）、ＡＳ ＨＥＲ２（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｒａｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、三官能二重特異性抗体（Ｍｕｎｉｃｈ大学）、ｍＡＢ ＡＲ−２０９（Ａｒｏｎｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ）およびｍＡＢ ２Ｂ−１（Ｃｈｉｒｏｎ）ならびにその組合せなど、汎性ｅｒｂ受容体阻害剤またはＥｒｂＢ２受容体阻害剤から選択される抗腫瘍剤にも関する。好ましいｅｒｂ選択的抗腫瘍剤には、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、ＴＡＫ−１６５、ＣＰ−７２４，７１４、ＡＢＸ−ＥＧＦ、ＨＥＲ３およびその組合せがある。好ましい汎性ｅｒｂｂ受容体阻害剤には、ＧＷ５７２０１６、ＣＩ−１０３３、ＥＫＢ−５６９、およびＯｍｉｔａｒｇならびにその組合せがある。
さらなるｅｒｂＢ２阻害剤には、ＷＯ９８／０２４３４（１９９８年１月２２日に公開）、ＷＯ９９／３５１４６（１９９９年７月１５日に公開）、ＷＯ９９／３５１３２（１９９９年７月１５日に公開）、ＷＯ９８／０２４３７（１９９８年１月２２日に公開）、ＷＯ９７／１３７６０（１９９７年４月１７日に公開）、ＷＯ９５／１９９７０（１９９５年７月２７日に公開）、米国特許第５，５８７，４５８号（１９９６年１２月２４日に発行）、および米国特許第５，８７７，３０５号（１９９９年３月２日に発行）に記載のものがあり、これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。本発明で有用なＥｒｂＢ２受容体阻害剤はまた、米国特許第６，４６５，４４９号、および第６，２８４，７６４号、ならびに国際出願ＷＯ２００１／９８２７７にも記載され、これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
さらに、他の抗腫瘍剤は、作用物質ＢＡＹ−４３−９００６（Ｏｎｙｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）、Ｇｅｎａｓｅｎｓｅ（オーグメロセン（ａｕｇｍｅｒｏｓｅｎ）、Ｇｅｎｔａ）、パニツムマブ（Ａｂｇｅｎｉｘ／Ａｍｇｅｎ）、Ｚｅｖａｌｉｎ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）、Ｂｅｘｘａｒ（Ｃｏｒｉｘａ／ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、Ａｂａｒｅｌｉｘ、Ａｌｉｍｔａ、ＥＰＯ９０６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ディスコデルモライド（ＸＡＡ−２９６）、ＡＢＴ−５１０（Ａｂｂｏｔｔ）、ネオバスタット（Ａｅｔｅｒｎａ）、エンザスタウリン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、コンブレスタチン（Ｃｏｍｂｒｅｓｔａｔｉｎ）Ａ４Ｐ（Ｏｘｉｇｅｎｅ）、ＺＤ−６１２６（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、フラボピリドール（Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＣＹＣ−２０２（Ｃｙｃｌａｃｅｌ）、ＡＶＥ−８０６２（Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＤＭＸＡＡ（Ｒｏｃｈｅ／Ａｎｔｉｓｏｍａ）、Ｔｈｙｍｉｔａｑ（Ｅｘｉｍｉａｓ）、Ｔｅｍｏｄａｒ（テモゾロミド、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ）およびＲｅｖｉｌｉｍｄ（Ｃｅｌｅｇｅｎｅ）ならびにその組合せから選択することができる。
他の抗腫瘍剤は、作用物質ＣｙＰａｔ（酢酸シプロテロン）、Ｈｉｓｔｅｒｅｌｉｎ（酢酸ヒストレリン）、Ｐｌｅｎａｉｘｉｓ（アバレリクスデポー剤）、アトラセンタン（ＡＢＴ−６２７）、サトラプラチン（ＪＭ−２１６）、サロミド（サリドマイド）、Ｔｈｅｒａｔｏｐｅ、テミリフェン（Ｔｅｍｉｌｉｆｅｎｅ）（ＤＰＰＥ）、ＡＢＩ−００７（パクリタキセル）、Ｅｖｉｓｔａ（ラロキシフェン）、アタメスタン（Ｂｉｏｍｅｄ−７７７）、Ｘｙｏｔａｘ（ポリグルタミン酸付加パクリタキセル）、Ｔａｒｇｅｔｉｎ（ベクサロチン（ｂｅｘａｒｏｔｉｎｅ））およびその組合せから選択することができる。
さらに、他の抗腫瘍剤は、作用物質Ｔｒｉｚａｏｎｅ（チラパザミン）、Ａｐｏｓｙｎ（エクシスリンド（ｅｘｉｓｕｌｉｎｄ））、Ｎｅｖａｓｔａｔ（ＡＥ−９４１）、Ｃｅｐｌｅｎｅ（二塩酸ヒスタミン）、Ｏｒａｔｈｅｃｉｎ（ルビテカン）、Ｖｉｒｕｌｉｚｉｎ、Ｇａｓｔｒｉｍｍｕｎｅ（Ｇ１７ＤＴ）、ＤＸ−８９５１ｆ（メシル酸エキサテカン）、Ｏｎｃｏｎａｓｅ（ランピルナーゼ）、ＢＥＣ２（ミツモアブ（ｍｉｔｕｍｏａｂ））、Ｘｃｙｔｒｉｎ（モテキサフィンガドリニウム（ｍｏｔｅｘａｆｉｎ ｇａｄｏｌｉｎｉｕｍ））およびその組合せから選択することができる。
さらなる抗腫瘍剤は、作用物質ＣｅａＶａｃ（ＣＥＡ）、ＮｅｕＴｒｅｘｉｎ（グルクロン酸トリメトレキセート）およびその組合せから選択することができる。さらなる抗腫瘍剤は、作用物質ＯｖａＲｅｘ（オレゴボマブ）、Ｏｓｉｄｅｍ（ＩＤＭ−１）およびその組合せから選択することができる。さらなる抗腫瘍剤は、作用物質Ａｄｖｅｘｉｎ（ＩＮＧ ２０１）、Ｔｉｒａｚｏｎｅ（チラパザミン）およびその組合せから選択することができる。さらなる抗腫瘍剤は、作用物質ＲＳＲ１３（エファプロキシラール）、Ｃｏｔａｒａ（１３１Ｉ ｃｈＴＮＴ １／ｂ）、ＮＢＩ−３００１（ＩＬ−４）およびその組合せから選択することができる。さらなる抗腫瘍剤は、作用物質Ｃａｎｖａｘｉｎ、ＧＭＫワクチン、ＰＥＧ Ｉｎｔｅｒｏｎ Ａ、Ｔａｘｏｐｒｅｘｉｎ（ＤＨＡ／パクリタキセル）およびその組合せから選択することができる。他の好ましい抗腫瘍剤には、ＰｆｉｚｅｒのＭＥＫ１／２阻害剤であるＰＤ３２５９０１、Ａｒｒａｙ ＢｉｏｐｈａｒｍのＭＥＫ阻害剤であるＡＲＲＹ−１４２８８６、Ｂｒｉｓｔｏｌ ＭｙｅｒのＣＤＫ２阻害剤であるＢＭＳ−３８７，０３２、ＰｆｉｚｅｒのＣＤＫ阻害剤であるＰＤ０３３２９９１およびＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａのＡＸＤ−５４３８ならびにその組合せがある。さらに、ＣＣＩ−７７９（Ｗｙｅｔｈ）やラパマイシン誘導体ＲＡＤ００１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）およびＡＰ−２３５７３（Ａｒｉａｄ）などのｍＴＯＲ阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤ＳＡＨＡ（Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｃ．／Ａｔｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）ならびにその組合せを利用することもできる。さらなる抗腫瘍剤には、ａｕｒｏｒａ２阻害剤ＶＸ−６８０（Ｖｅｒｔｅｘ）、Ｃｈｋ１／２阻害剤ＸＬ８４４（Ｅｘｉｌｉｘｉｓ）がある。
下記の細胞傷害作用物質、例えば、エピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ）、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）、パクリタキセル、Ｚｉｎｅｃａｒｄ（デクスラゾキサン）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ）、メシル酸イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ）およびその組合せからなる群から選択される１つまたは複数の作用物質を、本明細書に記載のＰ−カドヘリン抗体またはその抗原結合部分、および本明細書に記載のその医薬組成物と組み合わせて使用することができる。
本発明はまた、それだけに限らないが、エキセメスタン（Ａｒｏｍａｓｉｎ、Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．）、リュープロレリン（ＬｕｐｒｏｎまたはＬｅｕｐｌｉｎ、ＴＡＰ／Ａｂｂｏｔｔ／Ｔａｋｅｄａ）、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ、Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ）、ゴセレリン（Ｚｏｌａｄｅｘ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ドキセルカルシフェロール、ファドロゾール、ホルメスタン、クエン酸タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ、Ｎｏｌｖａｄｅｘ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、Ｃａｓｏｄｅｘ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、Ａｂａｒｅｌｉｘ（Ｐｒａｅｃｉｓ）、Ｔｒｅｌｓｔａｒおよびその組合せを含めたホルモン療法剤と一緒に、本発明の抗体およびその抗原結合部分を使用することを意図するものでもある。
本発明はまた、それだけに限らないが、フルベストラント、トレミフェン、ラロキシフェン、ラソフォキシフェン、レトロゾール（Ｆｅｍａｒａ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を含めた抗エストロゲン、ビカルタミド、フルタミド、ミフェプリストン、ニルタミド、Ｃａｓｏｄｅｘ（登録商標）（４’−シアノ−３−（４−フルオロフェニルスルホニル）−２−ヒドロキシ−２−メチル−３’−（トリフルオロメチル）プロピオンアニリド、ビカルタミド）などの抗アンドロゲンなどのホルモン療法剤およびその組合せにも関する。
さらに、本発明は、単独で、あるいは１つまたは複数の対症療法用製品、例えば、フィルグラスチム（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、オンダンセトロン（Ｚｏｆｒａｎ）、Ｆｒａｇｍｉｎ、Ｐｒｏｃｒｉｔ、Ａｌｏｘｉ、Ｅｍｅｎｄまたはその組合せからなる群から選択される製品と組み合わせて、本発明の抗体を提供するものである。
特に好ましい細胞傷害作用物質には、Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、Ｅｒｂｉｔｕｘ、Ｉｒｅｓｓａ、Ｇｌｅｅｖｅｃ、Ｔａｘｏｔｅｒｅおよびその組合せがある。
下記のトポイソメラーゼＩ阻害剤を抗腫瘍剤として利用することができる：カンプトセシン、イリノテカンＨＣｌ（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、エドテカリン、オラセシン（ｏｒａｔｈｅｃｉｎ）（Ｓｕｐｅｒｇｅｎ）、エキサテカン（Ｄａｉｉｃｈｉ）、ＢＮ−８０９１５（Ｒｏｃｈｅ）およびその組合せ。特に好ましいトポイソメラーゼＩＩ阻害剤には、エピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ）がある。
本発明の抗体は、抗腫瘍剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗生物質、植物由来の抗腫瘍剤、カンプトセシン誘導体、チロシンキナーゼ阻害剤、他の抗体、インターフェロン、および／または生物学的応答修飾物質とともに使用することができる。
アルキル化剤には、それだけに限らないが、ナイトロジェンマスタードＮ−オキシド、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、ブスルファン、ミトブロニトール、カルボコン、チオテパ、ラニムスチン、ニムスチン、テモゾロマイド、ＡＭＤ−４７３、アルトレタミン、ＡＰ−５２８０、アパジコン（ａｐａｚｉｑｕｏｎｅ）、ブロスタリシン（ｂｒｏｓｔａｌｌｉｃｉｎ）、ベンダムスチン、カルムスチン、エストラムスチン、フォテムスチン、グルフォスファミド、イホスファミド、ＫＷ−２１７０、マホスファミド、およびミトラクトールがある；白金配位アルキル化化合物には、それだけに限らないが、シスプラチン、Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（カルボプラチン）、エプタプラチン、ロバプラチン、ネダプラチン、Ｅｌｏｘａｔｉｎ（オキサリプラチン、Ｓａｎｏｆｉ）またはサトラプラチンおよびその組合せがある。特に好ましいアルキル化剤にはＥｌｏｘａｔｉｎ（オキサリプラチン）がある。
代謝拮抗物質には、それだけに限らないが、メトトレキセート、６−メルカプトプリンリボシド、メルカプトプリン、単独のまたはロイコボリンと組み合わせた５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、テガフール、ＵＦＴ、ドキシフルリジン、カルモフール、シタラビン、シタラビンオクホスファート、エノシタビン、Ｓ−１、Ａｌｉｍｔａ（プレメトレキセド（ｐｒｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）二ナトリウム、ＬＹ２３１５１４、ＭＴＡ）、Ｇｅｍｚａｒ（ゲムシタビン、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、フルダラビン、５−アザシチジン、カペシタビン、クラドリビン、クロファラビン、デシタビン、エフロルニチン、エチニルシチジン、シトシンアラビノシド、ヒドロキシ尿素、ＴＳ−１、メルファラン、ネララビン、ノラトレキセド、オクホスファート、プレメトレキセド二ナトリウム（ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｐｒｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、ペントスタチン、ペリトレキソール（ｐｅｌｉｔｒｅｘｏｌ）、ラルチトレキセド、トリアピン（ｔｒｉａｐｉｎｅ）、トリメトレキセート、ビダラビン、ビンクリスチン、ビノレルビン；あるいは、例えば、Ｎ−（５−［Ｎ−（３，４−ジヒドロ−２−メチル−４−オキソキナゾリン−６−イルメチル）−Ｎ−メチルアミノ］−２−テノイル）−Ｌ−グルタミン酸などの欧州特許出願第２３９３６２号で開示されている好ましい代謝拮抗物質の１つ、およびその組合せがある。
抗生物質には、それだけに限らないが、アクラルビシン、アクチノマイシンＤ、アムルビシン、アンナマイシン（ａｎｎａｍｙｃｉｎ）、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エルサミツルシン（ｅｌｓａｍｉｔｒｕｃｉｎ）、エピルビシン、ガラルビシン（ｇａｌａｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン、マイトマイシンＣ、ネモルビシン（ｎｅｍｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ネオカルチノスタチン、ペプロマイシン、ピラルビシン、レベッカマイシン、スチマラマー、ストレプトゾシン、バルルビシン、ジノスタチンおよびその組合せを含めた挿入抗生物質がある。
植物由来の抗腫瘍物質には、例えば、有糸分裂阻害剤、例えばビンブラスチン、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）、パクリタキセルおよびその組合せから選択されるものがある。
細胞傷害性トポイソメラーゼ阻害作用物質には、アクラルビシン、アモナフィド、ベロテカン（ｂｅｌｏｔｅｃａｎ）、カンプトセシン、１０−ヒドロキシカンプトセシン、９−アミノカンプトセシン、ジフロモテカン（ｄｉｆｌｏｍｏｔｅｃａｎ）、イリノテカンＨＣｌ（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、エドテカリン、エピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ）、エトポシド、エキサテカン、ギマテカン（ｇｉｍａｔｅｃａｎ）、ルルトテカン（ｌｕｒｔｏｔｅｃａｎ）、ミトキサントロン、ピラルビシン、ピクサントロン（ｐｉｘａｎｔｒｏｎｅ）、ルビテカン、ソブゾキサン、ＳＮ−３８、タフルポシド（ｔａｆｌｕｐｏｓｉｄｅ）、トポテカン、およびその組合せからなる群から選択される１つまたは複数の作用物質がある。
好ましい細胞傷害性トポイソメラーゼ阻害作用物質には、カンプトセシン、１０−ヒドロキシカンプトセシン、９−アミノカンプトセシン、イリノテカンＨＣｌ（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、エドテカリン、エピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ）、エトポシド、ＳＮ−３８、トポテカン、およびその組合せからなる群から選択される１つまたは複数の作用物質がある。
免疫学的作用物質には、インターフェロンおよび多数の他の免疫増強作用物質がある。インターフェロンには、インターフェロンα、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンβ、インターフェロンγ−１ａ、インターフェロンγ−１ｂ（Ａｃｔｉｍｍｕｎｅ）、またはインターフェロンγ−ｎ１、およびその組合せがある。他の作用物質には、フィルグラスチム、レンチナン、シゾフィラン、ＴｈｅｒａＣｙｓ、ウベニメクス、ＷＦ−１０、アルデスロイキン、アレムツズマブ、ＢＡＭ−００２、ダカルバジン、ダクリズマブ、デニロイキン、ゲムツズマブオゾガマイシン、イブリツモマブ、イミキモド、レノグラスチム、レンチナン、黒色腫ワクチン（Ｃｏｒｉｘａ）、モルグラモスチム、ＯｎｃｏＶＡＸ−ＣＬ、サルグラモスチム、タソネルミン、テクロイキン（ｔｅｃｌｅｕｋｉｎ）、サイマラシン（ｔｈｙｍａｌａｓｉｎ）、トシツモマブ、Ｖｉｒｕｌｉｚｉｎ、Ｚ−１００、エプラツズマブ、ミツモマブ（ｍｉｔｕｍｏｍａｂ）、オレゴボマブ、ペムツモマブ（ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）（Ｙ−ｍｕＨＭＦＧ１）、Ｐｒｏｖｅｎｇｅ（Ｄｅｎｄｒｅｏｎ）およびその組合せがある。
生物学的応答修飾物質は、組織細胞の生存、増殖や分化など、生体の防御機構または生物学的応答を修飾して、それが抗腫瘍活性を有するように誘導する作用物質である。そのような作用物質には、クレスチン、レンチナン、シゾフィラン、ピシバニール、ウベニメクスおよびその組合せがある。
他の抗癌剤には、アリトレチノイン、アンプリゲン、アトラセンタン、ベキサロテン、ボルテゾミブ、Ｂｏｓｅｎｔａｎ、カルシトリオール、エクシスリンド、フィナステリド、フォテムスチン、イバンドロン酸、ミルテフォシン、ミトキサントロン、ｌ−アスパラギナーゼ、プロカルバジン、ダカルバジン、ヒドロキシカルバミド、ペグアスパルガーゼ、ペントスタチン、タザロテン、Ｔｅｌｃｙｔａ（ＴＬＫ−２８６、Ｔｅｌｉｋ Ｉｎｃ．）、Ｖｅｌｃａｄｅ（ボルテゾミブ、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ）、トレチノインおよびその組合せがある。
他の抗血管新生性化合物には、アシトレチン、フェンレチニド、サリドマイド、ゾレドロン酸、アンギオスタチン、アピリジン（ａｐｌｉｄｉｎｅ）、シレングチド（ｃｉｌｅｎｇｔｉｄｅ）、コンブレタスタチンＡ−４、エンドスタチン、ハロフジノン、レビマスタット（ｒｅｂｉｍａｓｔａｔ）、レモバブ（ｒｅｍｏｖａｂ）、Ｒｅｖｌｉｍｉｄ、スクワラミン、ウクライン、Ｖｉｔａｘｉｎおよびその組合せがある。
白金配位化合物には、それだけに限らないが、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、およびその組合せがある。
カンプトセシン誘導体には、カンプトセシン、１０−ヒドロキシカンプトセシン、９−アミノカンプトセシン、イリノテカン、ＳＮ−３８、エドテカリン、トポテカンおよびその組合せがある。
他の抗腫瘍剤には、ミトキサントロン、ｌ−アスパラギナーゼ、プロカルバジン、ダカルバジン、ヒドロキシカルバミド、ペントスタチン、トレチノインおよびその組合せがある。
ＣＴＬＡ４（細胞傷害性リンパ球抗原４）抗体などの抗腫瘍免疫応答を増強することができる抗腫瘍剤、およびＭＤＸ−０１０（Ｍｅｄａｒｅｘ）や米国特許第６，６８２，７３６号で開示されているＣＴＬＡ４化合物などのＣＴＬＡ４を遮断することができる他の作用物質；ならびに他のファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤などの抗増殖剤、例えばファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤を利用することもできる。本発明で使用することができる、さらなる特定のＣＴＬＡ４抗体には、米国仮出願第６０／１１３，６４７号（１９９８年１２月２３日に出願）、米国特許第６，６８２，７３６号に記載のものがあり、これらはどちらも参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
本発明で使用することができる特定のＩＧＦ１Ｒ抗体には、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている国際特許出願ＷＯ２００２／０５３５９６に記載のものがある。
本発明で使用することができる特定のＣＤ４０抗体には、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている国際特許出願ＷＯ２００３／０４０１７０に記載のものがある。
放射線療法に反応してＴＮＦαを発現させるＴＮＦｅｒａｄｅ（ＧｅｎｅＶｅｃ）などの遺伝子治療剤を抗腫瘍剤として使用することもできる。
本発明の一実施形態では、本明細書に記載のＰ−カドヘリン抗体またはその抗原結合部分、ならびにその医薬組成物と組み合わせて、スタチンを使用することができる。スタチン（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤）は、アトロバスタチン（Ｌｉｐｉｔｏｒ、Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．）、プロバスタチン（Ｐｒｏｖａｓｔａｔｉｎ）（Ｐｒａｖａｃｈｏｌ、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ロバスタチン（Ｍｅｖａｃｏｒ、Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｃ．）、シンバスタチン（Ｚｏｃｏｒ、Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｃ．）、フルバスタチン（Ｌｅｓｃｏｌ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、セリバスタチン（Ｂａｙｃｏｌ、Ｂａｙｅｒ）、ロスバスタチン（Ｃｒｅｓｔｏｒ、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ロボスタチン（Ｌｏｖｏｓｔａｔｉｎ）およびナイアシン（Ａｄｖｉｃｏｒ、Ｋｏｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、その誘導体および組合せからなる群から選択することができる。
好ましい実施形態では、スタチンは、アトロバスタチンおよびロバスタチン、その誘導体および組合せからなる群から選択される。
抗腫瘍剤として有用な他の作用物質には、Ｃａｄｕｅｔがある。
Ｐ−カドヘリン抗体または抗原結合部分と少なくとも１つのさらなる治療用作用物質の組合せを使用して、本明細書に記載のように過剰増殖性障害または異常細胞増殖を治療する任意の方法では、Ｐ−カドヘリン抗体をさらなる治療用作用物質と結合し、またはそれで誘導体化することができる。少なくとも１つのさらなる治療用作用物質を別々に投与することもでき、あるいは誘導体化しないまたは結合しない形で投与することもできる。少なくとも１つのさらなる治療用作用物質を誘導体化せずまたは抗体と結合しないとき、それを抗体と同じ医薬製剤内で投与することもでき、あるいは別々の製剤で投与することもできる。
遺伝子治療
本発明の抗体および抗体部分をコードする核酸分子を、遺伝子治療を介してその必要がある患者に投与することができる。その治療は、ｉｎ ｖｉｖｏで行ってもよく、あるいはｅｘ ｖｉｖｏで行ってもよい。好ましい実施形態では、重鎖と軽鎖をどちらもコードする核酸分子を患者に投与する。より好ましい実施形態では、Ｂ細胞が抗体の産生に特殊化しているので、核酸分子がＢ細胞の染色体中に安定に組み込まれるように核酸分子を投与する。好ましい実施形態では、前駆Ｂ細胞にｅｘ ｖｉｖｏでトランスフェクトしまたは感染させ、その必要がある患者中にそれを再度移植する。他の実施形態では、前駆Ｂ細胞または他の細胞に、対象とする細胞型に感染することが知られているウイルスを使用してｉｎ ｖｉｖｏで感染させる。遺伝子治療に使用する典型的なベクターには、リポソーム、プラスミド、およびウイルスベクターがある。例示的なウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスである。ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの感染後、治療した患者から試料を採取し、当技術分野で知られまたは本明細書で論じた任意のイムノアッセイを使用することによって抗体発現のレベルをモニターすることができる。
好ましい実施形態では、遺伝子治療の方法は、Ｐ−カドヘリン抗体の重鎖またはその抗原結合部分をコードする単離核酸分子を投与するステップと、核酸分子を発現させるステップとを含む。他の実施形態では、遺伝子治療の方法は、Ｐ−カドヘリン抗体の軽鎖またはその抗原結合部分をコードする単離核酸分子を投与するステップと、核酸分子を発現させるステップとを含む。より好ましい方法では、遺伝子治療の方法は、本発明のＰ−カドヘリン抗体の重鎖またはその抗原結合部分をコードする単離核酸分子、および軽鎖またはその抗原結合部分をコードする単離核酸分子を投与するステップと、核酸分子を発現させるステップとを含む。遺伝子治療の方法はまた、併用療法に関して前記で論じた作用物質のいずれかなど、他の治療用作用物質を投与するステップを含むこともできる。
本発明をよりよく理解できるように、下記の実施例を示す。これらの実施例は、例示の目的のものにすぎず、どんな形であれ本発明の範囲を限定するものと解釈すべきでない。
下記の実施例および調製では、「ＢＳＡ」はウシ血清アルブミンを意味し、「ＥＤＴＡ」はエチレンジアミン四酢酸を意味し、「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドを意味し、「ＭＯＰＳ」は３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸を意味し、「ＭＥＳ」は２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸を意味し、「ＰＢＳ」はリン酸緩衝食塩水を意味し、「ｄＰＢＳ」はダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）リン酸緩衝食塩水を意味し、「ＨＥＭＡ」は２−ヒドロキシ−エチルメタクリレートを意味し、「ＤＭＥＭ」はダルベッコ改変イーグル培地を意味し、「ＦＢＳ」はウシ胎児血清を意味し、「ＮＥＡＡ」は非必須アミノ酸を意味し、「ＨＥＰＥＳ」はＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸を意味し、「ＤＭＦ」はジメチルホルムアミドを意味する。
（実施例１）
ｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーのスクリーニング
組換えヒトＰ−カドヘリン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、８６１−ＰＣ−１００）を抗原として使用して、ｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーをスクリーニングした。ファージミドベクター中にクローン化した大型のｓｃＦｖヒト抗体ライブラリーを選択に使用した（Ｖａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１４：３０９〜３１４（１９９６））。組換えヒトＰ−カドヘリンおよびＰ−カドヘリンを発現する集密状態の単層ＨＣＴ１１６細胞上での一連の反復選択サイクルで、Ｐ−カドヘリンを認識したｓｃＦｖをファージディスプレイライブラリーから単離した。簡潔に述べると、ライブラリーとともにインキュベートした後、結合したファージをＰ−カドヘリンから回収し、結合しなかったファージを洗い流した。次いで結合したファージをＶａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１４：３０９〜３１４（１９９６）に記載のように救済し、選択工程を反復した。基本的にはＶａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１４：３０９〜３１４（１９９６）に記載のように、選択過程の結果得られたものから典型的な割合のクローンにファージ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を施して、Ｐ−カドヘリンとの結合について試験した。組換えヒトＰ−カドヘリン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびＰ−カドヘリンを発現する集密状態の単層Ａ４３１細胞という２つの異なる抗原をＥＬＩＳＡで使用した。Ｖａｕｇｈａｎ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１４：３０９〜３１４（１９９６）およびＯｓｂｏｕｒｎ，Ｊ．Ｋ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３：２９３〜３０２（１９９８）に記載のように、ＥＬＩＳＡ陽性クローンにＤＮＡ配列決定を施した。独特のＥＬＩＳＡ陽性クローンを全ＩｇＧ分子に転換し、実施例４で記載するＰ−カドヘリン依存性接着アッセイでＰ−カドヘリンを中和するその能力について試験した。このスクリーニングの結果に基づいて、抗体１２９−１ｃ４（Ａ４３１接着アッセイでＩＣ５０が１〜３μＭ）を、リード親系統としてさらなる最適化用に選択した。
（実施例２）
リード最適化
抗体の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ３領域のオリゴヌクレオチド特異的突然変異生成によって、１２９−１ｃ４に由来するファージディスプレイライブラリーを作製した。ＣｌａｃｋｓｏｎおよびＬｏｗｍａｎ、Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、２００４）に記載の標準的な分子生物学的技術を使用してライブラリーを構築した。親和性に基づく選択をそれにより行った；ライブラリーとともにインキュベートした後、組換えヒトＰ−カドヘリン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をプロテインＧ被覆常磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ、１００．０３）によって捕捉し、結合したファージを磁性選択により回収し、その一方で、結合しなかった複合体を洗い流した。選択の間に、存在する組換えヒトＰ−カドヘリンの濃度を（４回にわたって２５ｎＭから１０ｐＭまで）低下させながら、選択工程を反復した。さらに、ＶＨＣＤＲ３およびＶＬＣＤＲ３ライブラリーからの選択の結果得られたものをさらなるファージディスプレイライブラリー中に再度混合し、２回を超える過程の親和性に基づく選択を行って選択した。選択過程の結果得られたものから典型的な割合のクローンに、実施例８に記載の１２９−１ｃ４エピトープ競合アッセイにおいて、ｓｃＦｖとしてスクリーニングを施した。
（実施例３）
Ｐ−カドヘリン依存性接着アッセイ
下記のプロトコールを使用して、上記の実施例２で記載した抗体発見の最適化段階の間にＩｇＧに転換したいくつかの最適化ｓｃＦｖを使用するＰ−カドヘリン依存性接着アッセイでＩＣ５０値を決定した。これらの抗体について測定した平均のＩＣ５０値を下記の表４に示す。
組換えヒトＰ−カドヘリンＦｃ（Ｒ＆Ｄ、Ｃａｔ．８６１−ＰＣ）を、使用する２４時間前にＭｉｌｌｉＱ水中で２ｍＭのＣａＣｌ２を含む濃度１ｍｇ／ｍＬに再調製し、４℃で貯蔵した。Ａ４３１細胞を下記の通りに培養し調製した。Ａ４３１細胞（ＥＣＡＣＣ番号８５０９０４０２）をＮｕｎｃトリプルフラスコ（面積３×１７５ｃｍ２）に入れて、１０％のウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．１０１００−１４７）および１％の非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．１１１４０−０３５）を含む最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ ３１０９５）中で通常通りに培養した。培養した細胞は、アッセイで使用するために回収した時点で約８０％の集密状態であった。考えられる継代関連の影響から保護するために、継代４回目から８回目の間の細胞を通常使用し、４８時間または７２時間培養した後にそれを回収した。０．２５％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ ２５２００−０５６）で、細胞が解離するのにちょうど十分な時間（７〜１０分）かけてＡ４３１細胞を回収し、次いで組織培養用培地中にそれを１ｍＬ当たり細胞約２×１０８個の密度に直ちに希釈した。次いでＡ４３１細胞を遠心分離し（１２００ｒｐｍ）、アッセイ用緩衝液（終濃度で１ｍＭのＣａＣｌ２を補充したハンクス（Ｈａｎｋｓ）平衡塩類溶液（Ｍｇ２＋およびＣａ２＋を含まず、フェノールレッドを含まない）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．１４１７５−０５３））中に再懸濁し、それを再度遠心分離し、１ｍＬ当たり細胞２×１０６個の最終密度で再度アッセイ用緩衝液中に再懸濁した。
ＩｇＧ段階希釈物の調製およびＡ４３１細胞との事前インキュベーションを下記の通りに行った。各試験ＩｇＧまたはその部分１８０μＬに、１０％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ａ−９５７６）を含むアッセイ用緩衝液２０μＬを補充して、ＢＳＡ濃度を１％に標準化した。最初に抗ネズミ／ヒトＰ−カドヘリン基準ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ、Ｃａｔ．ＡＦ−７６１）をＭｉｌｌｉＱ水中に再懸濁して１ｍｇ／ｍＬストックを得た。次いでこのストック溶液４０μＬをアッセイ用緩衝液１４０μＬ中に入れてさらに希釈した。次いで、１０％のＢＳＡを含むアッセイ用緩衝液２０μＬを添加して、抗体０．２ｍｇ／ｍＬおよびＢＳＡ０．１％の２００μＬを得た。最初に２×９０μＬのＡＦ−７６１ポリクローナル抗体または試験ＩｇＧをＧｒｅｉｎｅｒ９６穴ポリプロピレン製希釈用プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｃａｔ．７８０２７１）のカラム１に添加することによって、二連の段階希釈物を調製した。次いでアッセイ用緩衝液６０μＬをカラム２〜１１に添加した。次いで、カラム１〜１１にかけて左から右へとプレートを横断して６０μＬ中に３０μＬを入れる（１：３）希釈物を調製した。次いで、アッセイ用緩衝液６０μＬ単独を穴１２Ａ〜Ｄに添加して、最大の接着を規定した。穴１２Ｅ〜Ｈに（アッセイ用緩衝液中）２５ｍＭのＥＤＴＡ６０μＬを添加することによって最小の接着を規定した。次いで、Ａ４３１細胞懸濁液（アッセイ用緩衝液１ｍＬ当たり細胞２×１０６個−上記で概略を述べた通りに調製）をすべての穴に添加し、攪拌後、プレートを３７℃で１時間事前にインキュベートした。
試験ＩｇＧの段階希釈およびＡ４３１細胞との事前インキュベーションと並行して、Ｐ−カドヘリンで被覆したアッセイ用プレートを下記の通りに調製した。組換えヒトＰ−カドヘリンＦｃを被覆用緩衝液（Ｍｇ２＋およびＣａ２＋を含まないＰＢＳ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．１４１９０−０９４）で濃度１０μｇ／ｍＬに希釈し、それをＦｌｕｏｒｏｎｕｎｃ９６穴アッセイ用プレート（Ｎｕｎｃ、Ｃａｔ．４３７９５８）上に分注した（１穴当たり１００μＬ）。次いでプレートを室温で１時間３０分インキュベートした。次いで、Ｔｅｃａｎ９６穴プレート洗浄器を使用して、ＰＢＳでプレートを３回洗浄した。ブロッキング処理のためにアッセイ用緩衝液を１穴当たり２００μＬ添加し、プレートをさらに１時間室温でインキュベートした。次いで、前記に記載のように、ＰＢＳでプレートを３回洗浄した。
次いで、１穴当たり１００μＬの事前にインキュベートしたＩｇＧ／Ａ４３１物質を、Ｇｒｅｉｎｅｒ９６穴希釈用プレートからＰ−カドヘリンで被覆したアッセイ用プレートに移した。移した時点で、確実に細胞が均質となるようにピペットで出し入れすることによってＩｇＧ／Ａ４３１物質を混合した。次いで、アッセイ用プレートを３７℃で３０〜４５分間インキュベートすることによって接着工程を行った。インキュベーションの終了時に、プレートから培地を穏やかに吸引し、細胞洗浄緩衝液（終濃度で１ｍＭのＣａＣｌ２を補充したハンクス平衡塩類溶液（Ｍｇ２＋およびＣａ２＋を含まず、フェノールレッドを含まない−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．１４１７５−０５３））を穴に再度満たすことによって、接着しなかった細胞を除去した。次いで、細胞洗浄緩衝液槽上でプレートを反転させて１５分置いて、残存している接着しなかった細胞を除去した。このインキュベーションの終了時に、穴の内容物を穏やかに吸引した。
接着した細胞の定量を下記の通りに行った。１穴当たり１００μＬの溶解／アルカリ性ホスファターゼ検出用混合試薬（ジエタノールアミン基質緩衝液５×濃縮液（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｃａｔ．３４０６４）を水で１：５に希釈し、その後１×溶液２５ｍＬ当たりに１５ｍｇＰＮＰＰ錠（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎ−２６４０）１錠を溶解したもの）を添加し、その後３７℃で３０〜６０分間インキュベートすることによって、接着した細胞を検出した。次いで、阻害のない状態で約０．８の最大ＯＤ値を得ることを目的として、１ＭのＮａＯＨ（１穴当たり５０μＬ）を添加して反応を停止した。次いで、標準的なプレートリーダーを使用して、４０５ｎｍでの吸光度を測定した。
次いで、結果を下記の通りに分析した。カラム１２の穴Ａ〜Ｄを１００％接着、カラム１２の穴Ｅ〜Ｈを０％接着とみなして、最初に生データを下記の通りに％接着の値に転換した：
％接着＝｛（値−最小接着）／（最大−最小接着）｝＊１００
次いで、ＩｇＧ阻害剤の濃度に対する％接着をプロットし、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してＩＣ５０値を決定した。部分的な阻害が観察された場合、曲線の中点ではなく真の５０％阻害が得られるＩｇＧの濃度としてＩＣ５０の値をつける。表４でＩＣ５０値を報告する。
Figure 0005086974
別々のＡ４３１接着アッセイを２回行って、１２９−１ｃ４系統に由来するいくつかの生殖系列化した最適化ＩｇＧを、その非生殖系列化同等物と比較して調べた。これらの実験では、新たなバッチのＰ−カドヘリン（ＣＦＲ−１３４０４１）に変更することが必要であり、このことが、他のデータと比較したＩＣ５０値のわずかな増大と関係すると思われる。２回の実験からいくつかの生殖系列化ＩｇＧについて平均をとったデータを表５に示す。前記で言及したように、ｇ−１９４−ｂ０９その他は、生殖系列化型の１９４−ｂ０９その他を指す。
Figure 0005086974
（実施例４）
Ｐ−カドヘリン依存性細胞凝集アッセイ
下記のプロトコールを使用して、上記の実施例２で記載した抗体発見の最適化段階の間にＩｇＧに転換したいくつかの最適化ｓｃＦｖを使用するＰ−カドヘリン依存性凝集アッセイでＩＣ５０値を決定した。懸濁増殖物中に入れたときに、Ｐ−カドヘリンを過剰発現する細胞系統が堅固な多細胞凝集物を形成するので、細胞凝集に干渉するＰ−カドヘリン抗体の存在下で細胞凝集を測定することができる。いくつかの抗体について測定した平均のＩＣ５０値を下記の表６に示す。
プレートの調製を下記の通りに行った。各９６穴アッセイ用プレートをポリＨＥＭＡ（９０％エタノール、１０％メタノール中１２ｍｇ／ｍＬ）５０μＬで被覆し、６時間〜１晩かけてそれを蒸発させ、その後、使用前に３×１００μＬの滅菌Ｈ２Ｏで洗浄した。次いで細胞を下記の通りに培養した。（Ｐ−カドヘリンＧ４１８ｒを安定に発現する）ヒト細胞系統ＳＷ４８０由来の細胞を完全増殖培地（ｑｓ ＤＭＥＭ（ｉｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、１１９９５−０６５）、１０％ＦＢＳ（Ｏｍｅｇａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＦＢ−０２）、１：１００ＮＥＡＡ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、１１１４０−０５０）、１：１００ピルビン酸ナトリウム（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、１１３６０−０７０）、１：１００グルタミン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、２５０３０−０５１）、１：１００ペニシリン／ストレプトリシン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、１５０７０−０６３）、１：１００ジェネティシン５０ｍｇ／ｍＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０１３１−０３５））＋Ｇ４１８（５００μｇ／ｍＬ）中で継代し、次いで、１週間当たり２回、１：３〜４に分割した。次いで、培養物を増殖培地＋１０％ＤＭＳＯ中で凍結させた。
１日目に、ＳＷ４８０：ｐＣＡＤ細胞および対照のＳＷ４８０：ｐＣＬＮＸ（対照ベクターが安定）を、１：３以下に希釈して、１００ｍｍ皿１枚当たり細胞５×１０６個で播いた。次いで、細胞を４８時間培養して増殖させた。各１００ｍｍ皿では細胞が約１０×１０６個となり、または２×９６穴プレートに十分な個数となった。
３日目に、培地を除去し、その後ｄＰＢＳ（ダルベッコＰＢＳ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、１４０４０−１３３））で洗浄し、その後細胞に１００ｍｍ皿当たり３ｍＬのトリプシン処理を行った。次いで、遊離後、２倍の体積（６ｍＬ）の完全増殖培地で中和を実施した。次いで、ピペットを使用して１０ｍＬでプレートを３回洗浄してクラスターを破壊した。次いで、細胞を計数し、１０００ｒｐｍで５分間Ｂｅｃｋｍａｎの遠心分離機を使用してペレットを得た。次いで培地を吸引し、ペレットを最初に＜１ｍＬの完全増殖培地中で指でのボルテックス、次いでｐ１０００ピペットにより再懸濁し、次いで細胞濃度を１．３Ｍ／ｍＬに標準化した。単独で細胞が分散している状態を顕微鏡観察により確認した。
次いで、９６穴プレートをｄＰＢＳおよび５％ＦＢＳで３０分間ブロッキング処理することによって試薬プレートを調製した。次いで１×１００μＬのｄＰＢＳを使用してプレートを洗浄し、その後それを吸引し、軽くはじいて乾燥させた。９６穴プレートの１穴で処理プレートの３穴に十分な４×［ＩｇＧ］の濃度を使用してｄＰＢＳで試験ＩｇＧの希釈系列を調製した。１穴当たり３０μＬ中４００００個の細胞を９６穴の洗浄したポリＨＥＭＡ被覆Ｃｏｓｔａｒ３５９０非組織培養用プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５９０）に等分に分注した。次いで試薬１０μＬを９６穴プレートの各穴に移した。８連ピペットを使用して１処理当たり３連の試料を処理した。次いで、２５０ｒｐｍで振盪した状態で、加湿した３７℃、５％のＣＯ２インキュベーター中で１晩（１６〜１８時間）インキュベーションを行った。
４日目に、振盪した細胞４０μＬを、ポリリシン被覆９６穴プレート（ＢｉｏＣｏａｔポリリシン被覆９６穴プレート：ＢＤ ３５６５１６）に移した。次いで穴を完全増殖培地６０μＬですすぎ、軽くたたくことによってプレートを振盪し、それをポリリシン被覆プレートに移した。必要な場合には、さらなる５０μＬ洗浄を実施した。加湿した３７℃、５％のＣＯ２インキュベーター中でインキュベーションを６０分間続けた。過度にピペットで出し入れすることなくできるだけ穏やかにすべての細胞を定量的に移すこのステップでは注意を払った。次いで、ドラフトチャンバー内で固定溶液（７．４％ホルムアミド（３７％重量／体積−Ｓｉｇｍａ、Ｆ１５５８７））１００μＬを添加することによって細胞を固定し、その後室温で＞３０分間インキュベートした。
次いで、細胞を洗浄するために、液体をデカントして収集ビーカーまたはトレイに入れ、軽くはじいて残存している液体を除去し、ペーパータオル上で穏やかに軽くたたいた。次いで１穴当たり１００μＬのｄＰＢＳを入れて洗浄し、その後１５分間インキュベートした。次いで、上記の通りにデカントし、Ｈｏｅｓｃｈｔ（ｄＰＢＳ中１μｇ／ｍＬのＨｏｅｓｃｈｔ−Ｈｏｅｓｃｈｔ １０ｍｇ／ｍＬ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、３３３４２）を１００μＬ入れ、その後３０分間インキュベートすることによって細胞を染色した。次いで細胞を２回洗浄し、顕微鏡観察のために穴中のｄＰＢＳ１００μＬを残存させた。
次いで、１穴当たりの凝集対象物の数を測定し（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）、（試験ＩｇＧがある状態での）平均の対象物計数値を、ＩｇＧ（例えば、Ｇｔ−抗Ｐ−カドヘリン、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＦ７６１）または培地単独の対照の計数値と比較した。ＩｇＧ阻害剤の濃度に対する対象物計数値をプロットし、ＩＣ５０値を決定した。本発明のいくつかの抗体のＩＣ５０値を表６で報告する。
Figure 0005086974
（実施例５）
Ｐ−カドヘリン依存性スフェロイド破壊アッセイ
下記のスフェロイド破壊アッセイは、（実施例４に記載の）凝集アッセイの変法であり、１晩かけて細胞凝集物を形成させた後Ｐ−カドヘリンおよび対照の抗体を添加する。次いで、試験試薬を添加してさらに２４時間置いた後分析を行う。
下記のようにしてプレートの調製を行った。各９６穴アッセイ用プレートをポリＨＥＭＡ（９０％エタノール、１０％メタノール中１２ｍｇ／ｍＬ）５０μＬで被覆し、６時間〜１晩かけてそれを蒸発させ、その後、使用前に３×１００μＬの滅菌Ｈ２Ｏで洗浄した。次いで細胞を下記の通りに培養した。（Ｐ−カドヘリンＧ４１８ｒを安定に発現する）ヒト細胞系統ＳＷ４８０由来の細胞を完全増殖培地（ｑｓ ＤＭＥＭ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、１１９９５−０６５）、１０％ＦＢＳ（Ｏｍｅｇａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＦＢ−０２）、１：１００ＮＥＡＡ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、１１１４０−０５０）、１：１００ピルビン酸ナトリウム（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、１１３６０−０７０）、１：１００グルタミン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、２５０３０−０５１）、１：１００ペニシリン／ストレプトリシン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、１５０７０−０６３）、１：１００ジェネティシン５０ｍｇ／ｍＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０１３１−０３５））＋Ｇ４１８（５００μｇ／ｍＬ）中で継代し、次いで、１週間当たり２回、１：３〜４に分割した。次いで、培養物を増殖培地＋１０％ＤＭＳＯ中で凍結させた。
１日目に、ＳＷ４８０：ｐＣＡＤ細胞および対照のＳＷ４８０：ｐＣＬＮＸ（対照ベクターが安定）を、１：３以下に希釈して、１００ｍｍ皿１枚当たり細胞５×１０６個で播いた。次いで、細胞を４８時間培養して増殖させた。各１００ｍｍ皿では細胞が約１０×１０６個となり、または２×９６穴プレートに十分な個数となった。
３日目に、培地を除去し、その後ｄＰＢＳ（ダルベッコＰＢＳ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、１４０４０−１３３））で洗浄し、その後細胞に１００ｍｍ皿当たり３ｍＬのトリプシン処理を行った。次いで、遊離後、２倍の体積（６ｍＬ）の完全増殖培地で中和を実施した。次いで、ピペットを使用して１０ｍＬでプレートを３回洗浄してクラスターを破壊した。次いで、細胞を計数し、１０００ｒｐｍで５分間Ｂｅｃｋｍａｎの遠心分離機を使用してペレットを得た。次いで培地を吸引し、ペレットを最初に＜１ｍＬの完全増殖培地中で指でのボルテックス、次いでｐ１０００ピペットにより再懸濁し、次いで細胞濃度を１ｍＬ当たり１．０×１０６個に標準化した。単独で細胞が分散している状態を顕微鏡観察により確認した。
１穴当たり４０μＬ中４００００個の細胞を９６穴の洗浄したポリＨＥＭＡ被覆Ｃｏｓｔａｒ３５９０非組織培養用プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５９０）に等分に分注した。次いで、２５０ｒｐｍで振盪した状態で、加湿した３７℃、５％のＣＯ２インキュベーター中で１晩（１６〜１８時間）インキュベーションを行った。
４日目に、次いで９６穴プレートをｄＰＢＳおよび５％ＦＢＳで３０分間ブロッキング処理することによって試薬プレートを調製した。次いで１×１００μＬのｄＰＢＳを使用してプレートを洗浄し、その後それを吸引し、軽くはじいて乾燥させた。９６穴プレートの１穴で処理プレートの３穴に十分な５×［ＩｇＧ］の濃度を使用してｄＰＢＳで試験ＩｇＧの希釈系列を調製した。次いで試薬１０μＬを９６穴プレートの各穴に移した。８連ピペットを使用して１処理当たり３連の試料を処理した。次いで、２５０ｒｐｍで振盪した状態で、加湿した３７℃、５％のＣＯ２インキュベーター中でインキュベーションを行った（２０〜２４時間）。
５日目に、振盪した細胞５０μＬを、ポリリシン被覆９６穴プレート（ＢｉｏＣｏａｔポリリシン被覆９６穴プレート：ＢＤ ３５６５１６）に移した。次いで穴を完全増殖培地５０μＬですすぎ、軽くたたくことによってプレートを振盪し、それをポリリシン被覆プレートに移した。必要な場合には、さらなる５０μＬ洗浄を実施した。加湿した３７℃、５％のＣＯ２インキュベーター中でインキュベーションを６０分間続けた。過度にピペットで出し入れすることなくできるだけ穏やかにすべての細胞を定量的に移すこのステップでは注意を払った。次いで、ドラフトチャンバー内で固定溶液（７．４％ホルムアミド（３７％重量／体積−Ｓｉｇｍａ、Ｆ１５５８７））１００μＬを添加することによって細胞を固定し、その後室温で＞３０分間インキュベートした。
次いで、細胞を洗浄するために、液体をデカントして収集ビーカーまたはトレイに入れ、軽くはじいて残存している液体を除去し、ペーパータオル上で穏やかに軽くたたいた。次いで１穴当たり１００μＬのｄＰＢＳを入れて洗浄し、その後１５分間インキュベートした。次いで、上記の通りにデカントし、Ｈｏｅｓｃｈｔ（ｄＰＢＳ中１μｇ／ｍＬのＨｏｅｓｃｈｔ−Ｈｏｅｓｃｈｔ １０ｍｇ／ｍＬ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、３３３４２）を１００μＬ入れ、その後３０分間インキュベートすることによって細胞を染色した。次いで細胞を２回洗浄し、顕微鏡観察のために穴中のｄＰＢＳ１００μＬを残存させた。次いで、１穴当たりの凝集対象物の数を測定し（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）、（試験ＩｇＧがある状態での）平均の対象物計数値を、ＩｇＧ（例えば、Ｇｔ−抗Ｐ−カドヘリン、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＦ７６１）または培地単独の対照の計数値と比較した。ＩｇＧ阻害剤の濃度に対する対象物計数値をプロットしてＩＣ５０値を決定することができる。その代わりに、表７に示すように、対象物計数値を、１つの定められた濃度での対照に対する破壊の倍数として表した。
Figure 0005086974
（実施例６）
Ｐ−カドヘリン抗体のＫＤおよびＫｏｆｆの測定
ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）３０００機器を使用した表面プラズモン共鳴によるＰ−カドヘリンｓｃＦｖ単鎖抗体の親和性の測定（ＫＤおよびＫｏｆｆ）を、製造業者のプロトコールを使用して下記の通りに行った。
動態分析を行うために、通常通りのアミン結合を使用して、組換えヒトＰ−カドヘリン／Ｆｃ融合タンパク質（ｈＣａｄ／Ｆｃ）およびマウスＰ−カドヘリン／Ｆｃ融合タンパク質（ｍＣａｄ／Ｆｃ）を、ＣＭ５ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）センサーチップの別々のフローセル上に固定化した。２．０ｍＭのＣａＣｌ２を含む１０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ４．５を固定化用緩衝液として使用して表面を調製し、ｈＣａｄ／ＦｃおよびｍＣａｄ／Ｆｃ融合タンパク質についてそれぞれ５８００および１６００ＲＵのタンパク質密度を得た。１Ｍ塩酸エタノールアミン、ｐＨ８．５を使用して、未反応のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの失活を行った。活性化／失活したブランク表面を対照表面として使用した。２００〜０．７８ｎＭの濃度で流動用緩衝液中のｓｃＦｖ抗体試料を調製した（流動用緩衝液のみを含む０ｎＭの溶液をゼロ基準として含めた）。試料を無作為化し、２．０ｍＭのＣａＣｌ２を含むＨＢＳ−Ｐ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％のＳｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）を流動用緩衝液として使用して、それぞれフローセル全体にわたって３連で１分間注入した。流速２５μＬ／分を使用して親和性定数を決定した。抗体の解離を５分間モニターし、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ１．５を（２５μＬ／分で）１２秒注入することによって表面を再生した。生データは、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ（（Ｃ）ＢｉｏＬｏｇｉｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）ソフトウェアパッケージを使用して処理し、ＣＬＡＭＰ（（Ｃ）ＢｉｏＬｏｇｉｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）ソフトウェアパッケージを使用して分析した。単純な１：１のラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合モデルにデータを全体的に適合させた。
表８に、本発明の単鎖抗Ｐ−カドヘリン抗体の親和性定数を列挙する。
Figure 0005086974
（実施例７）
Ｐ−カドヘリン抗体の選択性の決定
下記のプロトコールを使用して、Ｅ−カドヘリンと比べてのＰ−カドヘリンに対する様々な抗体の選択性を決定した。
ＰＢＳ＋０．５ｍＭのＣａＣｌ２中で１μｇ／ｍＬの組換えヒトＰ−カドヘリン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、８６１−ＰＣ−１００）および組換えヒトＥ−カドヘリン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、６４８−ＥＣ−１００）で、Ｅｘｉｑｏｎタンパク質固定化プレート（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の穴上を被覆した。３％Ｍａｒｖｅｌ／ＰＢＳ＋０．５ｍＭのＣａＣｌ２中で試料ＩｇＧのブロッキング処理を１時間行った後、５０ｎＭ（７．５μｇ／ｍＬ）から０．６４ｎＭ（０．０９６μｇ／ｍＬ）に至るまでそれを滴定し、２つの異なる抗原で被覆した穴に２連で添加した。４℃で１晩平衡化した後、１×ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ＋０．５ｍＭのＣａＣｌ２で３回、次いで１×ＰＢＳ＋０．５ｍＭのＣａＣｌ２で３回プレートを洗浄した。次いで、３％Ｍａｒｖｅｌ／ＰＢＳ＋０．５ｍＭのＣａＣｌ２中で１：５０００に希釈した抗ヒトＦａｂペルオキシダーゼ結合体５０μＬを各穴に添加し、それを室温で１時間平衡化した。１×ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ＋０．５ｍＭのＣａＣｌ２で３回、１×ＰＢＳ＋０．５ｍＭのＣａＣｌ２で３回プレートを洗浄し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ；Ｓｉｇｍａ）５０μｌを各穴に添加し、２０分間発色反応を起こさせた後、０．５ＭのＨ２ＳＯ４を１穴当たり２５μＬ添加することによってそれを停止した。４５０ｎｍで吸光度の値を読み取った後、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してデータを分析して、Ｐ−カドヘリンおよびＥ−カドヘリンとの結合についての各抗体の相対的ＫＤ値を計算した。得られたデータの概要を表９に示す。
Figure 0005086974
（実施例８）
エピトープ競合アッセイ
下記のプロトコールを使用してエピトープ競合アッセイでＩＣ５０値を測定して、Ａ４３１細胞の表面上の天然Ｐ−カドヘリンから親ＩｇＧをはずす親系統内での変異ｓｃＦｖの能力を測定した。阻害性ｓｃＦｖの存在下で結合したビオチン化親ＩｇＧの量を、ユーロピウムストレプトアビジンおよびＤＥＬＦＩＡ定量法を用いて検出する。いくつかのｓｃＦｖについて測定したＩＣ５０値を表１０に示す。
標準的な方法に従って培養し、約８０％の集密状態で回収したＡ４３１細胞（ＥＣＡＣＣ番号８５０９０４０２）を、使用する前日に、９６穴Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎコラーゲン被覆プレート（ＢＤ、Ｃａｔ．６４０７）中に１穴当たり細胞２．５×１０４個で播いた。次いで、ＰＢＳ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ．１４１９０−０９４、カルシウム、マグネシウム、および炭酸水素ナトリウムを含まない）貯留槽中に浸すことによって３回洗浄した後、ブロッキング用緩衝液（ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ．１４１９０−０９４）＋３％Ｍａｒｖｅｌ（Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｏｄｓ Ｌｔｄ．））を１穴当たり２００μＬ添加し、それを室温で２時間インキュベートした。次いで、上記の通りにプレートをＰＢＳで３回洗浄した。
高処理能スクリーニングでもＩＣ５０プロファイル作成でも、Ｇｒｅｉｎｅｒ希釈用プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ９６穴ポリプロピレンプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｃａｔ．７８０２７１））中に、合計体積６０μＬのアッセイ用緩衝液中のｓｃＦｖ／ＩｇＧ物質を最初に調製した。次いで、５０μＬを従属Ｇｒｅｉｎｅｒプレートから直接アッセイ用プレート上に移し、結合反応を室温で２時間３０分進行させた。結合反応の終了時にプレートをＰＢＳで３回洗浄した後、ユーロピウムで標識したストレプトアビジン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｃａｔ．１２４４−３６０、ＤＥＬＦＩＡアッセイ用緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｃａｔ．４００２−００１０）中での１：１０００希釈物）を添加し、それを室温でさらに１時間インキュベートした。
次いで、プレートを緩衝液貯留槽中に反復して浸すことにより、ＤＥＬＦＩＡ洗浄用緩衝液（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｃａｔ．４０１０−００１０）でプレートを７回洗浄した。最後に、ＤＥＬＦＩＡエンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｃａｔ．４００１−００１０、１穴当たり１００μＬ）を添加した後、標準的なＤＥＬＦＩＡのプロトコールを使用して、互換性のあるリーダー（例えば、ＷａｌｌａｃまたはＥｎｖｉｓｉｏｎ）上でプレートを読み取った。
Ｇｒｅｉｎｅｒ希釈用プレートの準備−ＨＴＳ
最適化の段階に応じて別々に高処理能スクリーニング（ＨＴＳ）の条件を構成した。個々のＶＨおよびＶＬ鎖の最適化から得られたもののＨＴＳでは、最終［ペリプレップ］を１２．５％で固定し、その結果親ｓｃＦｖが部分的阻害を示した。後の、ＶＨ：ＶＬ組換えライブラリーから得られたもののＨＴＳでは、最終ペリプレップ濃度を１．７％に低下させ、この条件下で、ＶＨを最適化した基準ｓｃＦｖ（ＴＯＰ−１０８−Ｃ０１）が部分的阻害を示した。関連する基準ｓｃＦｖが部分的阻害を示すようなペリプレップ濃度の最適化により、改良されたクローンを同定する余地が残された。
これらの最終ｓｃＦｖペリプレップ濃度を実現するために、下記の手順を採用した：
ｉ）Ｃｙｂｉｗｅｌｌ機器を使用して、必要とする体積（下記を参照）のペリプレップ試料物質を、深い穴の試料プレートからＧｒｅｉｎｅｒ希釈用プレートへと、カラム１〜１１中に移した。
［最終ペリプレップ］ 移す体積
［１２．５％］ ＝７．５ｕＬ
［１．７％］ ＝（１：１０希釈したペリプレップ）１０．０ｕＬ
（ペリプレップ１０μＬをそのまま試料プレートからアッセイ用緩衝液を９０μＬ含むＧｒｅｉｎｅｒ希釈用プレート中に（Ｃｙｂｉｗｅｌｌを使用して）移すことによって、１：１０に予め希釈したペリプレップを調製した。）
ｉｉ）次いで、適当な体積のアッセイ用緩衝液を添加することによって、カラム１〜１１の体積を３０μＬにした。
ｉｉｉ）次いで、アッセイ用緩衝液３０μＬをカラム１２（Ａ〜Ｄ）（全結合の穴）に添加した。
ｉｖ）アッセイ用緩衝液中の過剰量非標識親ＩｇＧ（１２９−１ｃ４）３０μＬをカラム１２（Ｅ〜Ｈ）に添加して非特異的結合を規定した。これを濃度１０００ｎＭで添加して終濃度５００ｎＭにした。
ｖ）水溶性試薬ＥＺ−ｌｉｎｋ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｅｒｂｉｏ／Ｐｉｅｒｃｅ、製品番号２１３３６）を使用して１２９−１ｃ４ ＩｇＧをビオチン化した。１／１０体積の１Ｍ ＮａＨＣＯ３および１／１０体積のジメチルホルムアミドを添加することによってＩｇＧ溶液を補充した。ＥＺ−ｌｉｎｋ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ試薬をＤＭＦ中に溶解し、次いで、ＩｇＧより５倍過剰なモル濃度でそれを添加し、反応を室温で２０分間進行させた。次いで、ＢＳＡ（０．１％）を添加することによってビオチン化ＩｇＧを安定化した。アッセイ用緩衝液中のビオチン化親１２９−１ｃ４ ＩｇＧ３０μＬを全穴に添加して、最終体積６０μＬ中で終濃度１．５ｎＭにした（すなわち、ユーロピウム標識ＩｇＧを２×終濃度で添加した）。
ｖｉ）攪拌によりＧｒｅｉｎｅｒプレートの内容物を混合した後、５０μＬを直接アッセイ用プレートに移し、（前記に記載のように）結合反応を室温で２時間３０分進行させた。
Ｇｒｅｉｎｅｒ希釈用プレートの準備−ＩＣ５０プロファイル作成
ｉ）１穴当たり３０μＬのアッセイ用緩衝液を標準的なＧｒｅｉｎｅｒ希釈用プレートのカラム２〜１１および穴１２Ａ〜１２Ｄに添加した。
ｉｉ）アッセイ用緩衝液中の過剰量非標識１２９−１ｃ４親ＩｇＧ３０μＬをカラム１２（Ｅ〜Ｈ）に添加して非特異的結合を規定した。これは濃度１０００ｎＭで添加して終濃度５００ｎＭにすべきである。
ｉｉｉ）９６穴アッセイ用プレート１枚当たりに、１１点ある２連のＩＣ５０滴定物４つが準備できるように、カラム１にそれぞれ希釈していないｓｃＦｖ Ｈｉｓ−プレップ２×４５μＬを添加した。次いで、カラム１から１５μＬを取ってカラム２中へと混合し、その後カラム２から１５μＬを取ってカラム３中へと混合する（以下略）ことによって、２連の１：３段階希釈を行った。カラム１１中へと混合した後、１５μＬを除去した（すなわち、除去して最終体積３０μＬを残した）。
ｉｖ）アッセイ用緩衝液中のビオチン化１２９−１ｃ４親ＩｇＧ３０μＬを全穴に添加して、最終体積６０μＬ中で終濃度１．５ｎＭにした（すなわち、ユーロピウム標識ＩｇＧを２×終濃度で添加した）。
ｖ）攪拌によりＧｒｅｉｎｅｒプレートの内容物を混合した後、５０μＬを直接アッセイ用プレートに移し、前記に記載のように、結合反応を室温で２時間３０分進行させた。
ＨＴＳでは、ＭＯＰＳ／ＥＤＴＡ／ソルビトール、ｐＨ７．４（ＭＥＳ、ｐＨ７．４）を含む塩基性緩衝液中の細菌ペリプラズムの粗抽出物（ｓｃＦｖペリプレップ）として９６穴の形式でｓｃＦｖを発現させた。ＩＣ５０プロファイル作成では、ＰＢＳの塩基性緩衝液中でのアフィニティー精製にｓｃＦｖのＨｉｓタグを使用する低処理能の精製形態でｓｃＦｖを発現させた。
ＨＴＳでもＩＣ５０分析でも、下記の等式に従って最初に生データを％結合のデータに転換した：
％結合＝｛（値−非特異的結合）／（全結合−非特異的結合）｝＊１００
次いで、標準的なＥｘｃｅｌテンプレートを使用してＨＴＳデータをさらに分析して、関連する基準ｓｃＦｖより大きな阻害（低い％結合）を示すヒットを同定した。ＩＣ５０分析では、Ｐｒｉｓｍ第４．０版曲線適合ソフトウェアを使用して％結合のデータを分析した。実施例２に記載のように、ｓｃＦｖは、１２９−１ｃ４親ＩｇＧの変異体であり、ＶＨおよびＶＬのＣＤＲ３領域が無作為に突然変異している。ＶＨＣＤＲ３変異配列は、図１に配列番号９１〜２５６として示す。ＶＬＣＤＲ３変異配列は、図１に配列番号２５７〜３１９として示す。親１２９−１ｃ４ ＩｇＧを上回る結合性の向上を示したいくつかのｓｃＦｖのＩＣ５０値を表１０に示す。１２９−１ｃ４親のｓｃＦｖ変異体はそれぞれ、２つの配列番号：ＶＨＣＤＲ３およびＶＬＣＤＲ３によって特定される。参考として、親１２９−１ｃ４ ＩｇＧのＩＣ５０は１０８．３ｎＭであった。
Figure 0005086974
本明細書で引用したすべての刊行物、特許および特許出願は、個々の各刊行物または特許出願が参照により組み込まれることが具体的にかつそれぞれ独立に示された場合と同様に、参照により本明細書に組み込まれている。理解を明確にすることを目的とする例証および実例により上記の発明をある程度詳細に説明してきたが、添付した特許請求の範囲の趣旨または範囲を逸脱することなく、それに特定の変更および改変を加えることができることが、本発明の教示に照らして、当業者には容易に明らかとなるであろう。
配列番号１〜３４７のアミノ酸および核酸配列を示す図である。

Claims (7)

  1. ヒトＰ−カドヘリンに結合する抗体をコードする塩基配列を含むＤＮＡであって、ここで当該抗体は
    ａ）配列番号２４で示されるＶＨ ＣＤＲ１、
    ｂ）配列番号２５で示されるＶＨ ＣＤＲ２、
    ｃ）配列番号２９で示されるＶＨ ＣＤＲ３、
    ｄ）配列番号３８で示されるＶＬ ＣＤＲ１、
    ｅ）配列番号３９で示されるＶＬ ＣＤＲ２及び
    ｆ）配列番号４４で示されるＶＬ ＣＤＲ３
    を含む、当該ＤＮＡ。
  2. 配列番号３２１で示されるＶＨドメインを含む抗体をコードする塩基配列を含む、請求項１に記載のＤＮＡ。
  3. 配列番号３２７で示されるＶＬドメインを含む抗体をコードする塩基配列を含む、請求項１に記載のＤＮＡ。
  4. ＶＨドメインが配列番号３２１を含み、ＶＬドメインが配列番号３２７を含む抗体をコードする塩基配列を含む、ＤＮＡ。
  5. ＶＨドメインが配列番号３２１を含み、ＶＬドメインが配列番号３２７を含み、重鎖定常領域が配列番号３４４を含み、軽鎖定常領域が配列番号３４５を含み、ただし配列番号３４４のＣ末端リシン残基が切断されていてもよいヒトＰ−カドヘリンに結合する抗体をコードする塩基配列を含むＤＮＡ。
  6. 請求項１から５に記載の一つ以上の何れかのＤＮＡを含むベクター。
  7. 請求項６に記載のベクターを含む形質転換体。
JP2008289121A 2005-04-26 2008-11-11 Ｐ−カドヘリン抗体 Expired - Fee Related JP5086974B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US67531105P 2005-04-26 2005-04-26
US60/675,311 2005-04-26

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2008508328A Division JP4253037B2 (ja) 2005-04-26 2006-04-13 Ｐ−カドヘリン抗体

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2009106287A JP2009106287A (ja) 2009-05-21
JP5086974B2 true JP5086974B2 (ja) 2012-11-28

Family

ID=36722281

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2008508328A Expired - Fee Related JP4253037B2 (ja) 2005-04-26 2006-04-13 Ｐ−カドヘリン抗体
JP2008289121A Expired - Fee Related JP5086974B2 (ja) 2005-04-26 2008-11-11 Ｐ−カドヘリン抗体

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2008508328A Expired - Fee Related JP4253037B2 (ja) 2005-04-26 2006-04-13 Ｐ−カドヘリン抗体

Country Status (32)

Country Link
US (3) US7452537B2 (ja)
EP (4) EP2444419A1 (ja)
JP (2) JP4253037B2 (ja)
KR (3) KR101203328B1 (ja)
CN (1) CN101184778B (ja)
AP (1) AP2552A (ja)
AR (2) AR053456A1 (ja)
AU (1) AU2006238930B2 (ja)
BR (1) BRPI0608096A2 (ja)
CA (2) CA2763671A1 (ja)
CR (1) CR9471A (ja)
CU (1) CU23764A3 (ja)
DO (1) DOP2006000098A (ja)
EA (1) EA012970B1 (ja)
GE (1) GEP20115226B (ja)
GT (1) GT200600176A (ja)
HK (1) HK1117172A1 (ja)
HN (1) HN2006015949A (ja)
IL (2) IL186413A (ja)
MA (1) MA29991B1 (ja)
MX (1) MX2007013304A (ja)
MY (1) MY146773A (ja)
NO (2) NO20074916L (ja)
NZ (1) NZ562234A (ja)
PE (1) PE20061376A1 (ja)
PH (1) PH12014501872A1 (ja)
TN (1) TNSN07398A1 (ja)
TW (2) TW201035110A (ja)
UA (1) UA95775C2 (ja)
UY (1) UY37223A (ja)
WO (1) WO2006114704A2 (ja)
ZA (1) ZA200708548B (ja)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007102525A1 (en) * 2006-02-28 2007-09-13 Oncotherapy Science, Inc. Methods for damaging cells using effector functions of anti-cdh3 antibodies
NL1031818C2 (nl) * 2006-05-15 2007-11-23 Pfizer P-Cadherineantilichamen.
CN101641373B (zh) * 2007-02-08 2015-02-11 默沙东公司 Dkk-1的特异性抗体
US20130136689A1 (en) * 2007-06-05 2013-05-30 Christian Rohlff Proteins
EP2192179B9 (en) 2007-08-20 2017-11-15 Oncotherapy Science, Inc. Cdh3 peptide and medicinal agent comprising the same
EP2313504B1 (en) 2008-06-30 2015-01-07 Oncotherapy Science, Inc. Anti-cdh3 antibodies labeled with radioisotope label and uses thereof
EP3450459B1 (en) 2009-12-28 2021-05-26 OncoTherapy Science, Inc. Anti-cdh3 antibodies and uses thereof
HUE037817T2 (hu) * 2010-02-10 2018-09-28 Fujifilm Ri Pharma Co Ltd Radioaktív fémmel jelölt anti-cadherin-ellenanyag
JP2014015396A (ja) * 2010-10-29 2014-01-30 Perseus Proteomics Inc 高い親和性を有する抗ｃｄｈ３抗体
ES2690469T3 (es) * 2010-10-29 2018-11-21 Perseus Proteomics Inc. Anticuerpo anti-CDH3 que tiene alta capacidad de internalización
CA2830972C (en) * 2011-04-19 2018-11-20 Pfizer Inc. Combinations of anti-4-1bb antibodies and adcc-inducing antibodies for the treatment of cancer
DK2809681T3 (en) * 2012-01-31 2019-03-11 Regeneron Pharma ANTI-ASIC1 antibodies and uses thereof
US9534058B2 (en) 2012-02-08 2017-01-03 Abbvie Stemcentrx Llc Anti-CD324 monoclonal antibodies and uses thereof
KR102359214B1 (ko) 2014-04-04 2022-02-07 델 마 파마슈티컬스 폐의 비소세포 암종 및 난소암을 치료하기 위한 디안하이드로갈락티톨 및 이의 유사체 또는 유도체
CA2895659A1 (en) * 2014-07-01 2016-01-01 Pfizer Inc. Bispecific heterodimeric diabodies and uses thereof
MA40913A (fr) 2014-11-14 2017-09-20 Novartis Ag Conjugués anticorps-médicament
WO2016166360A1 (en) * 2015-04-17 2016-10-20 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Bispecific antibody constructs for cdh3 and cd3
EP3843756A2 (en) 2018-08-30 2021-07-07 HCW Biologics, Inc. Methods of treating aging-related disorders
CN113365663A (zh) 2018-08-30 2021-09-07 Hcw生物科技公司 单链嵌合多肽和其用途
SG11202101779RA (en) 2018-08-30 2021-03-30 Hcw Biologics Inc Multi-chain chimeric polypeptides and uses thereof
CA3143035A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 HCW Biologics, Inc. Multi-chain chimeric polypeptides and uses thereof
AU2021220196A1 (en) 2020-02-11 2022-08-04 HCW Biologics, Inc. Methods of activating regulatory T cells
CA3169231A1 (en) 2020-02-11 2021-08-19 HCW Biologics, Inc. Methods of treating age-related and inflammatory diseases
EP4103600A1 (en) 2020-02-11 2022-12-21 HCW Biologics, Inc. Chromatography resin and uses thereof
CN115836087A (zh) 2020-04-29 2023-03-21 Hcw生物科技公司 抗cd26蛋白及其用途
AU2021283199A1 (en) 2020-06-01 2023-01-05 Immunitybio, Inc. Methods of treating aging-related disorders
US12024545B2 (en) 2020-06-01 2024-07-02 HCW Biologics, Inc. Methods of treating aging-related disorders
WO2021247003A1 (en) 2020-06-01 2021-12-09 HCW Biologics, Inc. Methods of treating aging-related disorders
CA3218789A1 (en) * 2021-05-13 2022-11-17 Yuhong SHEN Antibody conjugate comprising anti-p-cadherin antibody and uses thereof
WO2023168363A1 (en) 2022-03-02 2023-09-07 HCW Biologics, Inc. Method of treating pancreatic cancer

Family Cites Families (149)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
DE3668186D1 (de) 1985-04-01 1990-02-15 Celltech Ltd Transformierte myeloma-zell-linie und dieselbe verwendendes verfahren zur expression eines gens, das ein eukaryontisches polypeptid kodiert.
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
GB8607683D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Ici Plc Anti-tumor agents
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
WO1991004745A1 (en) 1989-09-27 1991-04-18 Athena Neurosciences, Inc. Compositions for cell adhesion inhibition and methods of use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
SG48759A1 (en) 1990-01-12 2002-07-23 Abgenix Inc Generation of xenogenic antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
EP0585287B1 (en) 1990-07-10 1999-10-13 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5165424A (en) 1990-08-09 1992-11-24 Silverman Harvey N Method and system for whitening teeth
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
WO1992003917A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International Homologous recombination in mammalian cells
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ATE300615T1 (de) 1990-08-29 2005-08-15 Genpharm Int Transgene mäuse fähig zur produktion heterologer antikörper
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
EP0619841B1 (en) * 1990-10-30 1998-07-08 La Jolla Cancer Research Foundation T-cadherin adhesion molecule
DK0564531T3 (da) 1990-12-03 1998-09-28 Genentech Inc Berigelsesfremgangsmåde for variantproteiner med ændrede bindingsegenskaber
ATE363532T1 (de) 1991-03-01 2007-06-15 Dyax Corp Verfahren zur herstellung bindender miniproteine
DE4110405A1 (de) 1991-03-28 1992-10-01 Birchmeier Walter Prof Dr Verfahren zum nachweis der differenzierung und der invasivitaet von karzinomzellen
ATE269401T1 (de) 1991-04-10 2004-07-15 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer rezeptoren mittels phagemiden
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
ATE181571T1 (de) 1991-09-23 1999-07-15 Medical Res Council Methoden zur herstellung humanisierter antikörper
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
US5777085A (en) 1991-12-20 1998-07-07 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies reactive with GPIIB/IIIA
DE69334255D1 (de) 1992-02-06 2009-02-12 Novartis Vaccines & Diagnostic Marker für Krebs und biosynthetisches Bindeprotein dafür
ATE208374T1 (de) 1992-02-18 2001-11-15 Otsuka Kagaku Kk Beta-laktam und cepham verbindungen und ihre herstellung
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
EP2325203A2 (en) 1992-04-17 2011-05-25 Doheny Eye Institute Cadherin materials and methods
US5646250A (en) * 1992-04-17 1997-07-08 Doheny Eye Institute Cadherin polypeptides
US5597725A (en) * 1992-04-17 1997-01-28 Doheny Eye Institute Cadherin-specific antibodies and hybridoma cell lines
AU675661B2 (en) 1992-07-24 1997-02-13 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6177401B1 (en) 1992-11-13 2001-01-23 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften Use of organic compounds for the inhibition of Flk-1 mediated vasculogenesis and angiogenesis
AU5669494A (en) 1992-11-17 1994-06-08 Yale University Human homolog of the e-cadherin gene and methods based thereon
ATE193301T1 (de) 1993-03-09 2000-06-15 Genzyme Corp Verfahren zur isolierung von proteinen aus milch
GB9323884D0 (en) * 1993-11-19 1994-01-05 Eisai London Res Lab Ltd Physiological modulation
US5466823A (en) 1993-11-30 1995-11-14 G.D. Searle & Co. Substituted pyrazolyl benzenesulfonamides
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
IL112248A0 (en) 1994-01-25 1995-03-30 Warner Lambert Co Tricyclic heteroaromatic compounds and pharmaceutical compositions containing them
US5610281A (en) * 1994-05-03 1997-03-11 Brigham & Women's Hospital, Inc. Antibodies for modulating heterotypic E-cadherin interactions with human T lymphocytes
US5608082A (en) 1994-07-28 1997-03-04 Agouron Pharmaceuticals, Inc. Compounds useful as antiproliferative agents and GARFT inhibitors
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
US6046037A (en) 1994-12-30 2000-04-04 Hiatt; Andrew C. Method for producing immunoglobulins containing protection proteins in plants and their use
US5633272A (en) 1995-02-13 1997-05-27 Talley; John J. Substituted isoxazoles for the treatment of inflammation
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6091001A (en) 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
AU705616B2 (en) 1995-04-21 1999-05-27 Cell Genesys, Inc. Generation of large genomic DNA deletions
KR20050085971A (ko) 1995-04-27 2005-08-29 아브게닉스, 인크. 면역화된 제노마우스 유래의 인간 항체
WO1996034096A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5880141A (en) 1995-06-07 1999-03-09 Sugen, Inc. Benzylidene-Z-indoline compounds for the treatment of disease
GB9520822D0 (en) 1995-10-11 1995-12-13 Wellcome Found Therapeutically active compounds
GB9624482D0 (en) 1995-12-18 1997-01-15 Zeneca Phaema S A Chemical compounds
DE69709319T2 (de) 1996-03-05 2002-08-14 Astrazeneca Ab, Soedertaelje 4-anilinochinazolin derivate
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US5994619A (en) 1996-04-01 1999-11-30 University Of Massachusetts, A Public Institution Of Higher Education Of The Commonwealth Of Massachusetts, As Represented By Its Amherst Campus Production of chimeric bovine or porcine animals using cultured inner cell mass cells
US6180651B1 (en) 1996-04-04 2001-01-30 Bristol-Myers Squibb Diarylmethylidenefuran derivatives, processes for their preparation and their uses in therapeutics
CN1098256C (zh) 1996-04-12 2003-01-08 G·D·瑟尔公司 作为cox－2抑制剂前药的取代的苯磺酰胺衍生物
US6280739B1 (en) * 1996-04-18 2001-08-28 Genetics Institute, Inc. Method of inhibiting angiogenesis using secreted proteins
US6207639B1 (en) * 1996-07-12 2001-03-27 Mcgill University Compounds and methods for modulating neurite outgrowth
US6346512B1 (en) * 1996-07-12 2002-02-12 Mcgill University Compounds and methods for modulating cell adhesion
US6169071B1 (en) * 1996-07-12 2001-01-02 Mcgill University Compounds and methods for modulating cell adhesion
US6333307B1 (en) * 1996-07-12 2001-12-25 Mcgill University Compounds and method for modulating neurite outgrowth
AU722985B2 (en) * 1996-07-12 2000-08-17 Mcgill University Compounds and methods for modulating cell adhesion
HRP970371A2 (en) 1996-07-13 1998-08-31 Kathryn Jane Smith Heterocyclic compounds
CN1230185A (zh) 1996-07-13 1999-09-29 葛兰素集团有限公司 双环芳杂环化合物用作蛋白质酪氨酸激酶的抑制剂
ATE227283T1 (de) 1996-07-13 2002-11-15 Glaxo Group Ltd Kondensierte heterozyklische verbindungen als protein kinase inhibitoren
RS49881B (sr) 1996-07-18 2008-08-07 Merck Frosst Canada Ltd., Supstituisani piridini kao selektivni inhibitori ciklooksigenaze-2
US6312921B1 (en) * 1996-07-26 2001-11-06 Genetics Institute, Inc. Secreted proteins and polynucleotides encoding them
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
WO1998016241A1 (en) 1996-10-15 1998-04-23 Vanderbilt University Method of disrupting cellular adhesion
US5895748A (en) * 1996-11-27 1999-04-20 Johnson; Keith R. Panel of antibodies for detecting cadherins and catenins in tissues and method of using the panel of antibodies
KR100643058B1 (ko) 1996-12-03 2006-11-13 아브게닉스, 인크. 복수의 Ｖн 및 Ｖк 영역을 함유하는 인간 면역글로불린 유전자좌를 갖는 트랜스제닉 포유동물 및 이로부터 생성된 항체
SE9604731D0 (sv) 1996-12-20 1996-12-20 Tamas Bartfai Konsulting Ab A component of intercellular junctions in the endothelium
JP3128203B2 (ja) * 1997-02-10 2001-01-29 一男 坪田 分泌腺細胞とリンパ球との接着阻害剤
WO2002024719A1 (en) 2000-09-20 2002-03-28 Human Genome Sciences, Inc. 21 human secreted proteins
US6034256A (en) 1997-04-21 2000-03-07 G.D. Searle & Co. Substituted benzopyran derivatives for the treatment of inflammation
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
JP2002511852A (ja) 1997-05-07 2002-04-16 スージェン・インコーポレーテッド 蛋白質キナーゼ活性の調節剤としての２−インドリノン誘導体
GB2339430A (en) 1997-05-21 2000-01-26 Biovation Ltd Method for the production of non-immunogenic proteins
JP2002501532A (ja) 1997-05-30 2002-01-15 メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド 新規血管形成阻害薬
US6121027A (en) 1997-08-15 2000-09-19 Surmodics, Inc. Polybifunctional reagent having a polymeric backbone and photoreactive moieties and bioactive groups
ATE368665T1 (de) 1997-08-22 2007-08-15 Astrazeneca Ab Oxindolylchinazolinderivate als angiogenesehemmer
CO4960662A1 (es) 1997-08-28 2000-09-25 Novartis Ag Ciertos acidos 5-alquil-2-arilaminofenilaceticos y sus derivados
JP2001518470A (ja) 1997-09-26 2001-10-16 メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド 新規な血管形成阻害剤
US6203788B1 (en) 1997-09-29 2001-03-20 Adherex Inc. Compounds and methods for regulating cell adhesion
HUP0100287A3 (en) 1997-11-11 2003-04-28 Pfizer Prod Inc Thienopyrimidine and thienopyridine derivatives useful as anticancer agents
US6248864B1 (en) * 1997-12-31 2001-06-19 Adherex Technologies, Inc. Compounds and methods and modulating tissue permeability
RS49779B (sr) 1998-01-12 2008-06-05 Glaxo Group Limited, Biciklična heteroaromatična jedinjenja kao inhibitori protein tirozin kinaze
GB9800575D0 (en) 1998-01-12 1998-03-11 Glaxo Group Ltd Heterocyclic compounds
JPH11292900A (ja) 1998-01-20 1999-10-26 Gsf Forschungszentrum Fuer Umwelt & Gesundheit Gmbh ヒト悪性腫瘍の診断および治療の基礎としてのｅ−カドヘリンの突然変異体
KR20010034554A (ko) 1998-03-03 2001-04-25 레이몬드, 엠. 위티 치료제로서의 ｃｄ147 결합 분자
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
IL139934A (en) 1998-05-29 2007-10-31 Sugen Inc History 2 - Indulinone converted to pyrrole and pharmaceutical preparations containing them
UA60365C2 (uk) 1998-06-04 2003-10-15 Пфайзер Продактс Інк. Похідні ізотіазолу, спосіб їх одержання, фармацевтична композиція та спосіб лікування гіперпроліферативного захворювання у ссавця
US6277824B1 (en) * 1998-07-10 2001-08-21 Adherex Technologies Compounds and methods for modulating adhesion molecule function
EP1105427A2 (en) 1998-08-17 2001-06-13 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
EP1953229A3 (en) * 1998-10-15 2008-12-24 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Metastatic breast and colon cancer regulated genes
AU776910B2 (en) 1998-12-08 2004-09-23 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung Modifying protein immunogenicity
UA76936C2 (en) 1998-12-23 2006-10-16 Pfizer Human monoclonal antibody binding the antigen-4 of cytotoxic t-lymphocyte (ctla-4), nucleic acid, cell line, method of obtaining transgenic mammal, method to increase producing il-2 or ifn-? in the t-cells of a patient, method to treat and pharmaceutical composition used in treatment of cancer, inflammation or autoimmune disease, including the antibody
EE05627B1 (et) 1998-12-23 2013-02-15 Pfizer Inc. CTLA-4 vastased inimese monoklonaalsed antikehad
UA71945C2 (en) 1999-01-27 2005-01-17 Pfizer Prod Inc Substituted bicyclic derivatives being used as anticancer agents
JP3270834B2 (ja) 1999-01-27 2002-04-02 ファイザー・プロダクツ・インク 抗がん剤として有用なヘテロ芳香族二環式誘導体
AU780815B2 (en) 1999-06-23 2005-04-21 University Of Vermont And State Agricultural College, The Methods and products for manipulating uncoupling protein expression
TWI262914B (en) 1999-07-02 2006-10-01 Agouron Pharma Compounds and pharmaceutical compositions for inhibiting protein kinases
US6794132B2 (en) * 1999-10-02 2004-09-21 Biosite, Inc. Human antibodies
US6517529B1 (en) 1999-11-24 2003-02-11 Radius International Limited Partnership Hemodialysis catheter
UA75055C2 (uk) 1999-11-30 2006-03-15 Пфайзер Продактс Інк. Похідні бензоімідазолу, що використовуються як антипроліферативний засіб, фармацевтична композиція на їх основі
EA005996B1 (ru) 2000-02-15 2005-08-25 Сьюджен, Инк. Пирролзамещенный 2-индолинон, фармацевтическая композиция (варианты), способ модулирования каталитической активности протеинкиназы, способ лечения или профилактики нарушения в организме, связанного с протеинкиназой
OA12291A (en) 2000-06-22 2004-03-18 Pfizer Prod Inc Substituted bicyclic derivatives for the treatmentof abnormal cell growth.
AU2001278076A1 (en) 2000-07-26 2002-02-05 Applied Genomics, Inc. Bstp-5 proteins and related reagents and methods of use thereof
IL156690A0 (en) 2000-12-29 2004-01-04 Savient Pharmaceuticals Inc Specific human antibodies for selective cancer therapy
HUP0302525A2 (hu) 2001-01-05 2003-10-28 Abgenix, Inc. Az inzulinszerű növekedési faktor I receptor elleni ellenanyagok
AR042586A1 (es) 2001-02-15 2005-06-29 Sugen Inc 3-(4-amidopirrol-2-ilmetiliden)-2-indolinona como inhibidores de la protein quinasa; sus composiciones farmaceuticas; un metodo para la modulacion de la actividad catalitica de la proteinquinasa; un metodo para tratar o prevenir una afeccion relacionada con la proteinquinasa
WO2002097395A2 (en) * 2001-05-31 2002-12-05 Chiron Corporation P-cadherin as a target for anti-cancer therapy
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
CA2467633C (en) 2001-12-03 2012-03-27 Abgenix, Inc. Antibody categorization based on binding characteristics
SI1517921T1 (sl) * 2002-06-28 2006-10-31 Domantis Ltd Dvojno-specificni ligandi z zvisano serumsko razpolovno dobo
WO2004018648A2 (en) 2002-08-26 2004-03-04 Case Western Reserve University Methods for treating patients and identifying therapeutics
PA8580301A1 (es) 2002-08-28 2005-05-24 Pfizer Prod Inc Nuevos derivados de benzoimidazol utiles como agentes antiproliferativos
EP1560597A4 (en) 2002-10-29 2007-06-27 Pharmacia Corp DIFFERENTIALLY EXPRESSED GENES INVOLVED IN CANCER, POLYPEPTIDES CODED THEREWITH, AND METHODS OF USING GENES
EP1562986A2 (en) 2002-11-14 2005-08-17 Adherex Technologies, Inc. Compounds and methods for modulating functions of classical cadherins
WO2004072117A2 (en) 2003-02-13 2004-08-26 Pharmacia Corporation Antibodies to c-met for the treatment of cancers
JP6943759B2 (ja) 2017-12-28 2021-10-06 株式会社東海理化電機製作所 シフト装置

Also Published As

Publication number Publication date
US20060240001A1 (en) 2006-10-26
MY146773A (en) 2012-09-28
WO2006114704A2 (en) 2006-11-02
KR20070116155A (ko) 2007-12-06
CU23764A3 (es) 2012-02-15
NZ562234A (en) 2009-09-25
MX2007013304A (es) 2007-12-13
CN101184778A (zh) 2008-05-21
KR101203328B1 (ko) 2012-11-20
EP2444420A1 (en) 2012-04-25
US20090118487A1 (en) 2009-05-07
TW201035110A (en) 2010-10-01
HK1117172A1 (en) 2009-01-09
CA2604357A1 (en) 2006-11-02
BRPI0608096A2 (pt) 2009-11-10
KR20100038467A (ko) 2010-04-14
KR20110113785A (ko) 2011-10-18
KR101193797B1 (ko) 2012-10-23
DOP2006000098A (es) 2006-10-31
US7452537B2 (en) 2008-11-18
GT200600176A (es) 2006-11-28
JP2009106287A (ja) 2009-05-21
AU2006238930B2 (en) 2010-12-23
CR9471A (es) 2007-12-04
ZA200708548B (en) 2008-11-26
CA2763671A1 (en) 2006-11-02
EP2444419A1 (en) 2012-04-25
EP1877444A2 (en) 2008-01-16
TWI379838B (en) 2012-12-21
AU2006238930A1 (en) 2006-11-02
WO2006114704A3 (en) 2007-03-22
IL186413A (en) 2016-09-29
NO20074916L (no) 2007-10-25
JP4253037B2 (ja) 2009-04-08
TW200718712A (en) 2007-05-16
PE20061376A1 (es) 2006-12-19
KR100990027B1 (ko) 2010-10-26
PH12014501872A1 (en) 2016-08-31
EA200702087A1 (ru) 2008-02-28
NO20181306A1 (no) 2007-10-25
UA95775C2 (uk) 2011-09-12
US7928214B2 (en) 2011-04-19
IL186413A0 (en) 2008-01-20
AR085624A2 (es) 2013-10-16
AP2007004191A0 (en) 2007-10-31
JP2008538909A (ja) 2008-11-13
US20110182884A1 (en) 2011-07-28
TNSN07398A1 (fr) 2009-03-17
GEP20115226B (en) 2011-06-10
US8974781B2 (en) 2015-03-10
AR053456A1 (es) 2007-05-09
IL234657A0 (en) 2014-11-30
UY37223A (es) 2018-11-30
CA2604357C (en) 2012-01-17
CN101184778B (zh) 2012-05-30
MA29991B1 (fr) 2008-12-01
EP2444421A1 (en) 2012-04-25
HN2006015949A (es) 2011-01-17
EA012970B1 (ru) 2010-02-26
AP2552A (en) 2013-01-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5086974B2 (ja) Ｐ−カドヘリン抗体
KR101536487B1 (ko) 액티빈 수용체 유사 키나제-1에 대한 인간 모노클로날 항체
NL1031818C2 (nl) P-Cadherineantilichamen.
CA2763805A1 (en) P-cadherin antibodies
AU2014218362A1 (en) Human Monoclonal Antibodies to Activin Receptor-like Kinase-1

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20090413

RD03 Notification of appointment of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423

Effective date: 20090413

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20111220

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20120315

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20120904

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20120907

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 5086974

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150914

Year of fee payment: 3

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees