JP4918281B2

JP4918281B2 - 尿中有形成分分析装置

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Inventors: 庸介田中; 貴道内藤; 正継小篠; 瑠美高田
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Description

本発明は尿中有形成分分析装置に関する。さらに詳しくは、フローサイトメトリーを応用して尿中に含まれる成分を光学的に測定・分析する尿中有形成分分析装置に関する。

尿中有形成分の一般的な測定項目には、赤血球、白血球、上皮細胞、円柱及び細菌があるが、このうち、円柱とはTomm-Horsfallムコ蛋白が、少量の血漿蛋白（アルブミン）の存在のもとで腎尿細管腔内において凝固沈澱したものが基質となり、その基質内に血液細胞や腎尿細草上皮細胞などが包埋されたものである。円柱は、大きさが数十μｍ以上の大きなものが存在し、その形状からシリンダー（cylinder）又は尿細管腔を鋳型として形成されることからキャスト（cast）と呼ばれている（円柱の存在は尿細管腔に一時的な閉塞があったことを意味し、腎実質障害を示唆する所見として重要であり、とくに血液細胞、上皮円柱などを封入する物は臨床的意義が高い）。

さらに、上皮細胞は、偏平上皮細胞と移行上皮細胞からなる。偏平上皮細胞は円形又は多角形の極めて薄いもので、尿道の一部が剥離したものであり、一方、移行上皮細胞は、梨型や紡績形など多様な形態を有し、腎盂、尿道膀胱及び内尿道口までを構成する細胞である。大きさは数十μｍのものから、表層型では１００μｍ以上の大きさのものまである。

赤血球の測定は、腎臓の糸球体から尿道に至る経路における出血の有無を判定する上で重要であり、特に腎尿路系疾患、出血性疾患、白血病などの患者の尿に多く見られる。赤血球は一般に８μｍ前後の大きさで両面が凹状の円盤状の細胞であるが、尿中ではダメージを受けていることが多く、特に糸球体由来の赤血球は変形して、大きさも小さくなっている。さらにダメージを受けた赤血球は、溶血して内容物が溶出してしまっている。

また、白血球は腎、尿路感染症、腎結核などの患者の尿に多く見られ、炎症や感染症を早期に発見することができる。大きさは６〜１４μｍ位の大きさである。
細菌の測定は感染の有無を調べる検査であり、当該細菌の大きさは、球菌が０．５〜２μｍ位の球型の菌で、桿菌は長径が２〜１０μｍ位の菌である。球菌は増殖すると、一列に数珠状に連なる連鎖型や、不規則に連なりブドウの房状に連なるブドウ型などの集塊となっている。

従来より尿中の有形成分の分析は、一般検査室で主として顕微鏡を用いた目視検査により行われている。この方法では、まず、尿を遠心分離して濃縮し、その沈渣物を場合によっては染色後、顕微鏡スライド上に載置し、顕微鏡下で分類・計数を行っている。
この顕微鏡での検査は、まず１００倍の低倍率視野（LPF）で尿中有形成分の有無、尿検体の状態を把握し、４００倍の高倍率視野（HPF）で、各成分の分類が行われている。測定項目のうち、円柱は出現しているとしても個数は非常に少ないが、その検出は臨床的に有用性が高いので、低倍率視野（LPF）で探すようにされている。他の有形成分は高倍率視野（HPF）で分類され、赤血球、白血球は高倍率視野（HPF）で個数を報告するようにされている。
このように尿中有形成分検査は３つの要因を備えており、定性検査であり（細菌＋＋）、定量検査であり（赤血球５個／ＨＰＦ）、形態検査である（変形赤血球を認む）といわれている。

尿中有形成分検査の自動化としては、自動顕微鏡装置が提案されている。フロー式自動顕微鏡装置としては、ＵＡ−２０００(シスメックス社製)が用いられており、この装置は尿検体を濃縮することなしに、扁平形のフローセルに流し、フローセルで流れているところを撮像して記憶する装置である。記憶された撮像画像は、大きさで仕分けられており、ユーザがその画像を見て、各有形成分に分類するようになっている。

このような自動顕微鏡方式でも近年、有形成分を自動的に分類する装置が提案されているが、尿中有形成分は形態が多様であり、ダメージを受けた有形成分も多く、撮像画像を精度よく分類することには困難が伴っている。特に小型有形成分である、赤血球、とりわけ破砕赤血球、細菌、及び結晶を精度よく分類することは難しく、ユーザが再分類をするようにされている。

尿中有形成分検査の自動分類装置として、フローサイトメータによる尿中有形成分測定装置ＵＦ−１００（シスメックス社製）が提案されている。この装置では尿中有形成分を染色試薬で染色して、散乱光信号及び蛍光信号を組み合わせて、赤血球、白血球、上皮細胞、円柱及び細菌の分類を行うものである。

分類試薬は各有形成分の膜および核を染色する色素が用いられ、尿中有形成分の形態を保持するような組成で構成されている（特許文献１参照）。前述したように、尿中有形成分は形態も多様であり、ダメージを受けた有形成分も多く、フローサイトメータの散乱光信号強度と蛍光信号強度を組み合わせるだけでは精度良く分類することは難しい。そこで散乱光信号の強度とパルス幅、蛍光信号の強度とパルス幅を組み合わせることによって、尿中有形成分をそれぞれ分類するようにされている(特許文献２参照)。このフローサイトメータによる尿中有形成分測定装置は、様々な工夫で尿中有形成分の分類、形態情報を提供するように構成されている。例えば、赤血球の散乱光信号を解析することによって、尿中赤血球の由来（糸球体由来または糸球体由来）の情報を提供している（特許文献３参照）。
この装置によって、尿中有形成分が自動的に分類することが可能となり、尿検査の自動化に大きく寄与している。

このように散乱光信号や蛍光信号を様々解析する装置を用いても、測定精度が妨げられる検体がある。その一つとして、白血球と上皮細胞とで測定結果に誤りがある検体がある。上皮細胞の多くは、扁平上皮細胞や移行上皮細胞の表層などの細胞、は白血球より大きいが、移行上皮細胞の中層から深層、尿細管上皮細胞などのなかには白血球と大きさが同じくらい小型の上皮細胞（小円形上皮細胞）があり、同じように核をもつ細胞であるため蛍光染色も同じ程度であり、出現領域がオーバーラップしてしまうことがある。

尿検体によっては結晶が含まれている検体がある。結晶は染色されないため、大半は赤血球より蛍光強度の低い位置に分布する。ところが結晶によっては、例えば尿酸結晶は自家蛍光により、蛍光強度の大きい位置にまで分布するものがある。尿中の結晶数は、赤血球などに比べて非常に多くの数が含まれていることがあるため、赤血球の測定結果に誤りがある検体がある。特許文献４には、赤血球出現領域の側方散乱光信号を調べて、当該領域の赤血球数の信頼性を評価する方法が提案されている。
一方、尿の細菌検査も、臨床目的によってはより高感度な検査を行うことが要求されている。しかし、顕微鏡を用いた目視検査で、少ない数の細菌を検出することは、特に小型の細菌では難しく、高感度な検査には用いられていない。この場合は、試料を培養して細菌を検査する培養検査が、尿中有形成分検査とは別途細菌質検査室で行われている。培養検査には培養する日数がかかるため、培養せずに高感度な細菌検査を行うことが提案されている。

フローサイトメータによる細菌分析、すなわち細菌を染色試薬で染色して、散乱光信号と蛍光信号とで細菌を測定する方法が提案されている。特許文献５，６には、細菌以外の夾雑物を溶解するようにカチオン性界面活性剤を含む染色試薬とすることで、細菌と同じ位の大きさの夾雑物が含まれている尿のような試料も精度良く測定する方法が記載されている。

特開平８−１７０９６０号公報特開平５−３２２２８５号公報特開平１１−２９６２０７号公報特開平１１−２３４４６号公報特開２００１−２５８５９０号公報特開２００２−２０２３０２号公報

尿中有形成分検査も前述した装置によって、自動化が進み、従来の顕微鏡検査より、検査の定量化が進んできている。
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、尿中有形成分検査の定量化、高精度化を向上させることができる装置、特に、尿中の白血球と上皮細胞とを精度よく弁別し、計数することが可能な装置を提供することを目的とする。

本発明の第１の観点に係る尿中有形成分分析装置は、
尿検体中の有形成分を分析する尿中有形成分分析装置であって、
尿検体と染色試薬を混合して試料を調製する試料調製部と、
前記試料調製部によって調製された試料へ光を照射する光源と、
前記試料から発せられる前方散乱光を受光する前方散乱光受光部、前記試料から発せられる側方散乱光を受光する側方散乱光受光部、及び前記試料から発せられる蛍光を受光する蛍光受光部を備える光学検出部と、
前記光学検出部により検出された前方散乱光強度及び蛍光強度によって白血球及び上皮細胞の第１出現範囲をそれぞれ特定し、前方散乱光強度及び側方散乱光強度によって白血球及び上皮細胞の第２出現範囲をそれぞれ特定し、第１及び第２出現範囲によって識別される白血球と上皮細胞とをそれぞれ計数する制御部と、
を備えることを特徴としている。

本発明の第１の観点に係る尿中有形成分分析装置では、尿検体と染色試薬とが混合された測定試料から、２種類の散乱光（前方散乱光及び側方散乱光）と蛍光とを受光し、これらの前方散乱光、側方散乱光及び蛍光に基づいて、尿中の白血球及び上皮細胞を測定する構成としている。一般的に前方散乱光強度は粒子（尿中有形成分）のサイズを反映しており、側方散乱光強度は粒子の内容物を反映していると考えられている。つまり、これらの散乱光強度は、粒子の異なる特性を示すパラメータとして尿中有形成分の分析に用いることが可能である。その一方で、蛍光強度は白血球の核の状態を反映している。このようにそれぞれ異なる３つの情報（前方散乱光強度、側方散乱光強度及び蛍光強度）を使用することにより、白血球の分類を高精度に行うことが可能となる。また、本発明によれば白血球及び上皮細胞を精度よく弁別して計数することができる。

前記制御部は、前記光学検出部により検出された第１の試料の前方散乱光強度及び蛍光強度によって白血球及び上皮細胞の第１出現範囲をそれぞれ特定し、前方散乱光強度及び側方散乱光強度によって白血球及び上皮細胞の第２出現範囲をそれぞれ特定し、第１及び第２出現範囲によって識別される白血球と上皮細胞をそれぞれ計数し、前記光学検出部により検出された第２の試料の前方散乱光強度及び蛍光強度に基づいて、尿中の細菌を計数するように構成されていることが好ましい。

上記尿中有形成分分析装置では、第１の試料を用いて白血球及び上皮細胞をそれぞれ計数し、且つ第２の試料を用いて尿中の細菌を計数する構成としたので、１つの分析装置で少なくとも白血球及び上皮細胞と細菌とをそれぞれ高精度に測定することが可能となる。そして、細菌だけを独立して測定していることから、前述したような細菌の存在に起因する、自動分類装置における信頼性の低下（細菌は、大きいものから小さいものまでそのサイズが多様であり、また分布に規則性がないことから、画像上、他の白血球や赤血球等の成分とクロスオーバーしてしまい、成分の正確な区分けを困難にしている）を抑制することができる。また、顕微鏡による再検を指示する「Ｒｅｖｉｅｗ」の判定をする場合でも、信頼性が低い理由を付した「Ｒｅｖｉｅｗ」の判定をすることができる。

上記尿中有形成分分析装置は、
尿検体を第１のアリコートと第２のアリコートとに分配する検体分配部をさらに備え、
前記試料調製部は、前記第１のアリコートに第１の染色試薬を混合して第１の試料を調製する第１試料調製部、及び前記第２のアリコートに第２の染色試薬を混合して第２の試料を調製する第２試料調製部を備え、
前記光学検出部は、前記第１及び第２の試料のそれぞれから発せられる前方散乱光、側方散乱光、及び蛍光を検出し、
前記制御部は、前記光学検出部により検出された第１の試料の前方散乱光強度及び蛍光強度によって白血球及び上皮細胞の第１出現範囲をそれぞれ特定し、前方散乱光強度及び側方散乱光強度によって白血球及び上皮細胞の第２出現範囲をそれぞれ特定し、第１及び第２出現範囲によって識別される白血球と上皮細胞をそれぞれ計数し、光学検出部により検出された第２の試料の前方散乱光強度及び側方散乱光強度のうちの少なくとも一方と蛍光強度に基づいて、尿中の細菌を計数するように構成されていることが好ましい。１つの尿検体から、白血球及び上皮細胞を測定するための第１の試料と、細菌を測定するための第２の試料とをそれぞれ調製し、前記第１の試料により少なくとも白血球及び上皮細胞をそれぞれ計数し、且つ前記第２の試料により細菌を計数する構成とすることにより、より一層高精度に白血球及び上皮細胞と細菌とを計数することが可能となる。
また、光学検出部を第１の試料と第２の試料とで共用しているので、装置構成を簡略化することができ、製品コストを低減させるとともに、装置を小型化することができる。

尿中有形成分には、赤血球、白血球、上皮細胞、円柱、及び細菌が含まれることが好ましい。また、上皮細胞は、扁平上皮細胞、移行上皮細胞、及び尿細管上皮細胞のうち少なくとも一つを含まれることが好ましい。
本発明の第２の観点に係る尿中有形成分分析方法は、尿検体中の有形成分を分析する尿中有形成分分析方法であって、
尿検体と染色試薬を混合して試料を調製し、
調製された試料に光が照射されることで前記試料から発せられる前方散乱光、側方散乱光、及び蛍光を検出し、
検出された前方散乱光強度及び蛍光強度によって白血球及び上皮細胞の第１出現範囲をそれぞれ特定し、前方散乱光強度及び側方散乱光強度によって白血球及び上皮細胞の第２出現範囲をそれぞれ特定し、第１及び第２出現範囲によって識別される白血球と上皮細胞をそれぞれ計数する。

本発明の尿中有形成分分析装置によれば、尿中に含まれる有形成分の分析を高精度に行うことができる。

以下、添付図面を参照しつつ、本発明の尿中有形成分分析装置の実施の形態を詳細に説明する。
図１は、本発明の一実施の形態に係る尿中有形成分分析装置及びこれに付属したパソコンの斜視説明図である。なお、図１では、分かり易くするために尿中有形成分分析装置の構成要素を収容する筐体を部分的に省略している。

[装置の構成]
図１において、尿中有形成分分析装置Ｕは、試料を調製するための試料調製部２と、サンプルラック（試験管立て）３を移送するラックテーブル４と、試料から尿中有形成分や細菌の情報を検出するための光学検出部５と、回路部１４とを備えている。筐体側面にはアーム１５を介して支持台１６が取り付けられ、その上にパソコン１３が設置されている。パソコン１３は、尿中有形成分分析装置Ｕの回路部１４とＬＡＮ接続されている。

図２は前記試料調製部２及び光学検出部５の概略機能構成を示す図である。図において、試験管Ｔに入った尿（検体）は、吸引管１７を用いて図示しないシリンジポンプにより吸引され、検体分配部１によって試料調製部へ分注される。本実施の形態における試料調製部は試料調製部（第１試料調製部）２ｕと試料調製部（第２試料調製部）２ｂとで構成されており、検体分配部１は、試料調製部２ｕと試料調製部２ｂのそれぞれに尿（検体）の定量されたアリコートが分配される。

試料調製部２ｕの尿アリコートは、希釈液１９ｕと染色液（染色試薬）１８ｕが混合されて当該染色液（染色試薬）１８ｕに含まれる色素により染色が施される。この染色試料は赤血球、白血球、上皮細胞、円柱等の比較的大きい尿中有形成分を分析するための懸濁液となる。
一方、試料調製部２bの尿アリコートは、希釈液１９bと染色液（染色試薬）１８bが混合されて当該染色液（染色試薬）１８bに含まれる色素により染色が施される。この染色試料は細菌を分析するための懸濁液となる。

以上のようにして調製された２種類の懸濁液（試料）は、先に試料調製部２ｕの懸濁液（第１の試料）が光学検出部５に導かれ、シースフローセル５１においてシース液に包まれた細い流れを形成し、そこに、レーザ光が照射される。その後同様に、試料調製部２ｂの懸濁液（第２の試料）が光学検出部５に導かれ、シースフローセル５１において細い流れを形成し、レーザ光が照射される。このような動作は、後述のマイクロコンピュータ１１（制御装置）の制御により、図示しない駆動部や電磁弁等を動作させることにより、自動的に行われる。

図３は、光学検出部５の構成を示す図である。図において、コンデンサレンズ５２は、光源である半導体レーザ５３から放射されたレーザ光をシースフローセル５１に集光し、集光レンズ５４は尿中の有形成分の前方散乱光を散乱光受光部であるフォトダイオード５５に集光する。また、他の集光レンズ５６は前記有形成分の側方散乱光と側方蛍光とをダイクロイックミラー５７に集光する。ダイクロイックミラー５７は、側方散乱光を散乱光受光部であるフォトマルチプライヤ５８へ反射し、側方蛍光を蛍光受光部であるフォトマルチプライヤ５９の方へ透過させる。これらの光信号は、尿中の有形成分の特徴を反映したものとなっている。そして、フォトダイオード５５、フォトマルチプライヤ５８及びフォトマルチプライヤ５９は光信号を電気信号に変換し、それぞれ、前方散乱光信号（ＦＳＣ）、側方散乱光信号（ＳＳＣ）及び側方蛍光信号（ＳＦＬ）を出力する。これらの出力は、図示しないプリアンプにより増幅された後、次段の処理に供される。

なお、光源として、前記半導体レーザに代えてガスレーザを用いることもできるが、低コスト、小型、且つ低消費電力である点より半導体レーザを採用するのが好ましく、半導体レーザの採用により製品コストを低減させるとともに、装置の小型化及び省電力化を図ることができる。また、半導体レーザのうち、低コスト且つ長寿命であり、メーカーからの供給が安定していることから、赤色半導体レーザを用いるのが好ましい。

図６は、尿中有形成分分析装置Ｕの全体構成を示すブロック図である。図において、尿中有形成分分析装置Ｕは、前述した検体分配部１、試料調製部２及び光学検出部５と、この光学検出部５の出力をプリアンプにより増幅したものに対して増幅やフィルタ処理等を行うアナログ信号処理回路６と、アナログ信号処理回路６の出力をディジタル信号に変換するＡ／Ｄコンバータ７と、ディジタル信号に対して所定の波形処理を行うディジタル信号処理回路８と、ディジタル信号処理回路８に接続されたメモリ９と、アナログ信号処理回路６及びディジタル信号処理回路８と接続されたマイクロコンピュータ１１と、マイクロコンピュータ１１に接続されたＬＡＮアダプタ１２とを備えている。外部のパソコン１３は、このＬＡＮアダプタ１２を介して尿中有形成分分析装置ＵとＬＡＮ接続されており、このパソコン１３により、尿中有形成分分析装置Ｕで取得したデータの解析が行われる。前記アナログ信号処理回路６、Ａ／Ｄコンバータ７、ディジタル信号処理回路８及びメモリ９は、光学検出部５の出力する電気信号に対する信号処理回路１０を構成している。

（尿中有形成分測定試薬）
これら尿中有形成分を測定する試薬としては、特開平８-１７０６９０に詳細な説明がある。この試薬の一つの実施形態は、染料としては、核を有していない有形成分をも染色するために、膜染色をする染料が選ばれる。試薬としては、赤血球溶血を防ぐ目的と安定した蛍光強度を得るために浸透圧補償剤が加えられ、分類測定に適するような浸透圧となるよう１００〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇに調整される。この試薬によって尿中有形成分の細胞膜、核（膜）が染色される。膜染色する色素を含有する染色試薬としては縮合ベンゼン誘導体が用いられ、例えば、シアニン系色素であるＮＫ−５２９（商品名。林原生物化学研究所製）を用いることができる。なお、この染色試薬は、細胞膜だけでなく核膜も染色するようになっている。このような染色試薬を用いると、白血球や上皮等の有核細胞では、細胞質（細胞膜）における染色強度と核（核膜）における染色強度とが合わさり、これによって白血球や上皮等の有核細胞を赤血球等の核のない尿中有形成分と弁別することができる。

（細菌分析用試薬）
細菌を、同じ位の大きさの夾雑物が含まれている尿のような試料からも精度良く測定する試薬としては、特開２００１−２５８５９０に詳細な説明がある。この試薬の一つの実施形態は、染料としては核酸を染色する染料が用いられる。
また、核染色する色素を含有する染色試薬としては、例えば、以下の（化１）に示される特開２００２−２０２３０２号公報記載のシアニン系色素を用いることができる。

このうち、特に、次の（化２）に示されるシアニン系色素を好適に用いることができる。

この場合において、少なくとも赤血球を含む尿中有形成分を測定するための尿検体に加えられる染色試薬（第１の染色試薬）が膜染色する色素を含有し、一方、細菌を測定するための尿検体に加えられる染色試薬（第２の染色試薬）が核酸を染色する色素を含有しているのが好ましい。尿中有形成分には、赤血球のような核を有しないものが含まれているため、第１の染色試薬が膜染色する色素を含有することにより、このような核を有しないものも含めて尿中有形成分を検出することができる。また、第２の染色試薬が核染色する色素を含有することにより、細菌の核が効果的に染色され、サイズの小さい細菌であっても当該細菌を精度よく測定することが可能となる。
また、前記第１の染色試薬及び前記第２の染色試薬は、吸収波長のピークが前記半導体レーザの発光波長の近傍に存在するのが好ましい。第１の染色試薬及び前記第２の染色試薬の吸収波長のピークを、半導体レーザの発光波長の近傍に存在するように選定することにより、染色された尿中有形成分及び細菌を半導体レーザにより測定することが可能になる。図４は、このような第１の染色試薬の一例（ＮＫ−５２９（商品名。林原生物化学研究所製）を含有する染色試薬））の吸収波長と吸光度との関係を示しており、赤色半導体レーザの発光波長（６３５ｎｍ）の近傍の６４０ｎｍに吸収波長のピークが存在している。また、図５は、第２の染色試薬の一例（前記（化２）で示される、特開２００２−２０２３０２号公報記載のシアニン系色素を含有する染色試薬））の吸収波長と吸光度との関係を示しており、赤色半導体レーザの発光波長（６３５ｎｍ）の近傍の６３６ｎｍに吸収波長のピークが存在している。なお、図５は、試薬の温度が１５℃の場合と３５℃の場合について吸光度の変化が示されているが、常温前後の温度であれば、試薬の吸光度に大きな変化がないことが分かる。

細菌測定用試薬、染料が膜を通過して染色が早く進むこと、粘液糸や赤血球破片などの夾雑物を収縮させるように、カチオン系界面活性剤が含まれる。
この場合、界面活性剤により細菌の細胞膜にダメージを与えることができるため、第２の染色試薬が含有する色素により効率よく細菌の核酸を染色することができる。その結果、前記細菌の測定を短時間の染色処理で、さらに精度よく行うことができる。なお、第２のアリコートに界面活性剤を混合する場合、尿中有形成分の測定が完了した後に細菌の測定が行われるように構成するのが好ましい。第２の試料には界面活性剤が含まれることから、細菌を測定した後に尿中有形成分の測定を行うと、試料のキャリーオーバーにより第１の試料に界面活性剤が混入し、赤血球を含む尿中有形成分の膜にダメージを与え当該尿中有形成分の測定に影響を与えることがあるが、かかる構成とすることにより、第１の試料に界面活性剤が混入するのを防止することができ、精度よく尿中有形成分の測定を行うことができる。

本発明では、１つの尿検体から、少なくとも赤血球を含む尿中有形成分を測定するための第１の試料と、細菌を測定するための第２の試料とをそれぞれ調製し、前記第１の試料により少なくとも赤血球を含む尿中有形成分を測定し、且つ前記第２の試料により細菌を測定する構成としている。これにより、１つの分析装置で少なくとも赤血球を含む尿中有形成分と細菌とをそれぞれ高精度に測定することが可能となる。また、光学検出部を第１の試料と第２の試料とで共用しているので、装置構成を簡略化することができ、製品コストを低減させるとともに、装置を小型化することができる。

図７は本実施の形態に係る尿中有形成分分析装置の定量機構及び試料調製部の概略斜視図であり、図８はその説明図である。本実施の形態では、所定量の尿検体を試料調製部（第１試料調製部）２ｕと試料調製部（第２試料調製部）２ｂとに分配する定量機構として、常用されているサンプリングバルブ３０が採用されている。このサンプリングバルブ３０は、２枚の円盤状の固定素子と、両固定素子に挟まれた可動素子とからなっており、前記可動素子はモータ３１により回動操作される。

前記サンプリングバルブ３０は、互いに重ね合わされた２枚のアルミナセラミック製の円盤３０ａ、３０ｂを備えている。円盤３０ａ、３０ｂの内部には試料を流通するための流路が形成されており、一方の円盤３０ｂがその中心軸を回転中心として回転することにより前記流路が分断され、これによって試料を定量するようになっている。かかるサンプリングバルブ３０は、内部に試料用の流路３２を有する流体カセット３３を介して前記試料調製部２ｂと一体的に構成されている。すなわち、サンプリングバルブ３０、流体カセット３３及び試料調製部２ｂは、熱的に一体となるように、互いに密着した状態で配設されており、サンプリングバルブ３０の温度が、試料調製部２ｂの温度と略等しくなるように構成されている。これに対し、試料調製部２ｕは、筐体に固定された取付プレート３４に所定のクリアランスＳを設けてボルト３５で固定されており、このため試料調製部２ｕは、前記サンプリングバルブ３０や試料調製部２ｂとは、熱的に略隔離された状態となっている。

前記試料調製部２ｕ及び試料調製部２ｂは、それぞれ温度調節部を構成するヒータ３６ｕ、３６ｂによって加熱されるが、少なくとも赤血球を含む尿中有形成分を測定するための第１の試料を調製する試料調製部２ｕの温度を第１の温度に調節するとともに、細菌を測定するための第２の試料を調製する試料調製部２ｂの温度を前記第１の温度よりも高い第２の温度に調節している。具体的には、試料調製部２ｕは３５±２℃程度になるように、試料調製部２ｂは、これよりも高い４２±２℃程度になるように調節される。試料の温度を高くするほど、当該試料に含まれる赤血球や細菌等の所定部位（膜や核）を速く染色することができ、測定時間を短縮することができるが、一方、赤血球は、高温によりダメージを受け易く、温度を高くしすぎると正確な測定を行うことができなくなる。そこで、他の尿中有形成分に比べて耐熱性の高い細菌を測定するための第２の試料の温度を尿中有形成分を測定するための第１の試料の温度よりも高くなるように調節することにより、換言すれば、試料調製部２ｕと試料調製部２ｂとをそれぞれ測定に適した温度に調節することにより、赤血球を含む尿中有形成分及び細菌をともに高精度に測定することができる。なお、試料調製部２ｕと試料調製部２ｂの温度は、例えばサーミスタにより測定することができる。そして、この測定結果に基づいて前記ヒータ３６ｕ、３６ｂをオンオフ制御することにより、試料調製部２ｕ及び試料調製部２ｂを前記所定範囲の温度に調節することができる。

また、サンプリングバルブ３０と試料調製部２ｂとを熱的に一体となるように構成することにより、サンプリングバルブ３０にて温度調節された試料が試料調製部２ｂに供給される際に冷えるのを防止することができることから、温度調節のロスを低減させることができる。この場合、試料調製部２ｂよりも低温に保たれる試料調製部２ｕに供給される試料については、サンプリングバルブ３０から供給される際に、前記クリアランスＳを試料の流路が通るようにすることで自然に低下させることができる。

[分析手順]
つぎに、図９〜１０に示されるフローチャートに従って、本発明の尿中有形成分分析装置を用いた尿の分析手順について説明する。

まず、ホストコンピュータで管理されている検体番号や、当該検体番号と関連付けられた患者の氏名、年齢、性別、診療科等の患者情報や、測定項目等の検体情報を予め当該ホストコンピュータから取得しておく（ステップＳ１）。ついで、測定実行の指示がパソコン１３のキーボードやマウスからなる入力手段によりなされる（ステップＳ２）。この指示を受けて、試料入りの試験管Ｔが立てられたサンプルラック３がラックテーブル４により所定の吸引位置の移送される（ステップＳ３）。この吸引位置において、前記試験管Ｔが回転させられ、当該試験管Ｔの外周面に貼付されたＩＤラベルのバーコードが読み取られる（ステップＳ４）。これにより、試料の検体番号を知ることができ、この検体番号をステップＳ１において取得した検体情報と照合させることにより、当該試料の測定項目を特定することができる。

ついで、吸引管１７が下降して試験管Ｔ内の試料中に当該吸引管１７の先端部が挿入され、この状態で前記試料を軽く吸引及び吐出することを繰り返すことにより、試料が攪拌される（ステップＳ５）。攪拌後、所定量（８００μＬ）の試料が吸引され、サンプリングバルブ３０によって、少なくとも赤血球を含む尿中有形成分（ＳＥＤ）を測定するための試料を調製する試料調製部２ｕと、尿中に含まれる細菌（ＢＡＣ）を測定するための試料を調製する試料調製部２ｂとにそれぞれ１５０μＬ及び６２．５μＬずつ分注される（ステップＳ７及びステップＳ１１）。

試料調製部２ｕには、前記試料とともに所定量の染色液（染色試薬）及び希釈液が定量されて分注される（ステップＳ８及びステップＳ９）。一方、試料調製部２ｂにも同様にして、前記試料とともに所定量の染色液（染色試薬）及び希釈液が定量されて分注される（ステップＳ１２及びステップＳ１３）。試料調製部２ｕ及び試料調製部２ｂは、それぞれヒータ３６ｕ、３６ｂによって所定温度になるように加温されており、この状態でプロペラ状の攪拌具（図示せず）により試料の攪拌が行われる（ステップＳ１０及びステップＳ１４）。なお、ステップＳ９において試料調整部２ｕに分注される希釈液には界面活性剤が含まれており、これにより細菌膜にダメージが与えられ、細菌の核を効率よく染色することが可能となる。

ついで、光学検出部５のシースフローセル５１にシース液が送液され（ステップＳ１５）、その後、まず尿中有形成分（ＳＥＤ）測定用の試料が光学検出部５に導かれ、前記シースフローセル５１においてシース液に包まれた細い流れ（シースフロー）が形成される（ステップＳ１６）。そして、このようにして形成されたシースフローに半導体レーザ５３からのレーザビームが照射される（ステップＳ１７）。尿中有形成分の測定を先に行うのは、細菌測定用試料には界面活性剤が含まれることから、細菌を測定した後に尿中有形成分の測定を行うと、試料のキャリーオーバーにより尿中有形成分測定用の試料に界面活性剤が混入し、赤血球を含む尿中有形成分の膜にダメージを与え当該尿中有形成分の測定に影響を与えることがあるからである。

前記レーザビームの照射により生じる尿中有形成分の前方散乱光、蛍光及び側方散乱光は、それぞれフォトダイオード５５、フォトマルチプライヤ５９及びフォトマルチプライヤ５８により受光されて電気信号に変換され、前方散乱光信号（ＦＳＣ）、蛍光信号（ＦＬ）及び側方散乱光信号（ＳＳＣ）として出力される（ステップＳ１８〜２０）。これらの出力は、プリアンプにより増幅される（ステップＳ２１〜２３）。

一方、尿中有形成分（ＳＥＤ）測定用の試料による測定が終了すると、引き続いてステップＳ１４で調製された試料を用いて尿中の細菌が測定される。この場合、尿中有形成分の測定で用いた光学検出部５により、前記ステップＳ１５〜２３と同様にして前方散乱光信号（ＦＳＣ）及び蛍光信号（ＦＬ）が出力され、且つ増幅される。

増幅された前記前方散乱光信号（ＦＳＣ）、蛍光信号（ＦＬ）及び側方散乱光信号（ＳＳＣ）は、前記信号処理回路１０（図６参照）においてディジタル信号に変換されるとともに所定の波形処理が施され（ステップＳ２４〜２７）、ＬＡＮアダプタ１２を介してパソコン１３に送られる。なお、ステップＳ２５における「ＦＬＨ」は、蛍光信号（ＦＬ）を高いゲインで増幅した高感度なものであり、ステップＳ２６「ＦＬＬ」は同じく蛍光信号（ＦＬ）を低いゲインで増幅した低感度なものである。

そして、パソコン１３において尿中有形成分（ＳＥＤ）の生データが作成される（ステップＳ２８）とともに、このデータに基づいてスキャッタグラムが作成される（ステップＳ２９）。ついで、アルゴリズム解析により作成したスキャッタグラムのクラスタリングが行われ（ステップＳ３０）、各クラスタ毎に粒子の計数が行われる（ステップＳ３１）。

また、細菌についても同様にして、増幅された前記前方散乱光信号（ＦＳＣ）及び蛍光信号（ＦＬ）は、前記信号処理回路１０においてディジタル信号に変換されるとともに所定の波形処理が施される（ステップＳ３２〜３４）。なお、ステップＳ３２における「ＦＳＣＨ」は、前方散乱光信号（ＦＳＣ）を高いゲインで増幅した高感度なものであり、ステップＳ３３「ＦＳＣＬ」は同じく前方散乱光信号（ＦＳＣ）を低いゲインで増幅した低感度なものである。

そして、ＬＡＮアダプタ１２を介してパソコン１３に送られる。そして、パソコン１３において細菌（ＢＡＣ）の生データが作成される（ステップＳ３５）とともに、このデータに基づいてスキャッタグラムが作成される（ステップＳ３６）。ついで、アルゴリズム解析により作成したスキャッタグラムのクラスタリングが行われ（ステップＳ３７）、各クラスタ毎に粒子の計数が行われる（ステップＳ３８）。
以上のようにして得られる測定結果は、パソコン１３の表示手段であるディスプレイ上に表示される（ステップＳ３９）。

尿中有形成分（ＳＥＤ）の測定結果は、前方散乱光、側方散乱光及び蛍光の各信号からスキャッタグラムが生成される。
図１１ａは、横軸を蛍光強度（低感度）（ＦＬＬ）とし、縦軸を前方散乱光強度（ＦＳＣ）としたときのスキャッタグラムである。蛍光信号強度の大きな領域に核を有する大きな細胞である上皮細胞（ＥＣ）と白血球（ＷＢＣ）が現れる。大半の上皮細胞は白血球より細胞が大きく、白血球より蛍光強度の大きな領域に出現するが、小型上皮細胞には白血球と出現領域がオーバラップするものもある。この両者を識別するために側方散乱光信号が用いられる。図１１ｂは、横軸を側方散乱光強度（ＳＳＣ）、縦軸を前方散乱光強度（ＦＳＣ）としたときのスキャッタグラムである。上皮細胞は白血球より側方散乱光強度が大きい領域に出現するため、このスキャッタグラムより上皮細胞の識別が行われる。

図１１ｃは、横軸を蛍光強度（高感度）（ＦＬＨ）とし、縦軸を前方散乱光強度（ＦＳＣ）としたときのスキャッタグラムであり、蛍光強度が低い領域を表したものである。赤血球（ＲＢＣ）は核を有していないので蛍光強度の低い領域に分布する。結晶によっては赤血球の出現領域に現れることもあるので、結晶の出現を確認するため側方散乱光信号が用いられる。図１１ｂは、横軸を側方散乱光強度（ＳＳＣ）とし、縦軸を前方散乱光強度（ＦＳＣ）としたときのスキャッタグラムである。結晶は側方散乱光強度の分布中心が一定せず、大きい領域にも出現するため、このスキャッタグラムより赤血球との識別が行われる。

図１１ｄは、横軸を蛍光幅（ＦＬＬＷ）とし、縦軸を蛍光幅２（ＦＬＬＷ２）としたときのスキャッタグラムである。ＦＬＬＷは、細胞膜が染色された有形成分を捉える蛍光信号の幅を表しており、ＦＬＬＷ２は、核などのより強い蛍光信号の幅を表している。図に示すように、円柱（ＣＡＳＴ）のＦＬＬＷは大きく、内容物がある円柱（Ｐ．ＣＡＳＴ）はＦＬＬＷ２が大きい。また、内容物のない円柱（ＣＡＳＴ）はＦＬＬＷ２が低い領域に出現する。

もう一方の細菌測定結果においては、前方散乱光信号と蛍光信号とからスキャッタグラムが生成される。
図１１ｅは、横軸を蛍光強度（高感度）（Ｂ−ＦＬＨ）とし、縦軸を前方散乱光強度（高感度）（Ｂ−ＦＳＣ）としたときのスキャッタグラムである。尿中有形成分測定では、図１１ｃのスキャッタグラムのように、細菌の出現領域は粘液糸（ＭＵＣＵＳ）、ＹＬＣ（酵母様真菌）、ＳＰＥＲＭ（精子）の出現領域とオーバラップする。しかし、細菌測定では、細菌測定試薬によって、粘液糸や赤血球破片などの夾雑物を収縮させるため、細菌だけが独立して出現する領域が現れるとともに、尿中有形成分測定の場合に比べて約１０倍感度を上げて測定しているため、小型細菌も高精度に検出でき、正確な細菌測定結果が提供される。

本発明では、前述したように、細菌だけを独立して測定していることから、細菌の存在に起因する、自動分類装置における信頼性の低下を抑制することができる。また、顕微鏡による再検を指示する「Ｒｅｖｉｅｗ」の判定をする場合でも、信頼性が低い理由を付した「Ｒｅｖｉｅｗ」の判定をすることができる。

図１１ｂに細菌（ＢＡＣＴ）の標準的な出現領域を示しているが、出現領域は細菌の種類によって異なる。
図１３は、球菌が大量に出現して連鎖している検体の測定例である。このスキャッタグラムでは、細菌（ＢＡＣＴ）が出現している領域が、横軸（蛍光強度）に対して約４５度の角度で分布している。つまり、細菌（ＢＡＣＴ）が前方散乱光強度（ＦＳＣ）の高い領域にも出現している。このような検体では、尿中有形成分（ＳＥＤ）測定において、広範な範囲で細菌が出現し、赤血球出現領域のうちの前方散乱光強度（ＦＳＣ）の低い領域にまで細菌が現れてしまう。このような検体では赤血球測定の信頼性が低い。
一方、図１２は、桿菌が含まれている検体の測定例である。このスキャッタグラムでは、細菌（ＢＡＣＴ）が出現している領域が、横軸（蛍光強度）に対して低角度（約５〜１０度）の角度で分布している。つまり、細菌（ＢＡＣＴ）が前方散乱光強度（ＦＳＣ）の低い領域に出現している。このような検体では、桿菌が大量に含まれていても、細菌出現領域は赤血球出現領域より前方散乱光強度（ＦＳＣ）が低い領域であり、赤血球測定は細菌の影響を受けることがない。
同様に尿中有形成分（ＳＥＤ）測定での白血球（ＷＢＣ）出現領域への細菌の影響も、細菌測定（ＢＡＣ）での細菌分布から確認することができる。

このように細菌測定（ＢＡＣ）から、細菌の分布を得ることで、尿中有形成分（ＳＥＤ）の測定における細菌出現領域を推定することにより、他の有形成分の測定信頼性が確認される。したがって、細菌測定（ＢＡＣ）の分布に応じて、顕微鏡による再検指示「Ｒｅｖｉｅｗ」の判定をすることができ、擬陽性の判定を減らし、適切な再検指示をすることができる。また、信頼性の高い分画ができないことに起因する再検の判定を減らすこともできる。

また、尿中の細菌濃度が５×１０^３個／ｍｌ以上のときに、当該尿中の細菌を測定することができるように構成することができる。具体的には、測定時間を長く設定したり、測定試料の量を多く設定したりすることにより、５×１０^３個／ｍｌという低濃度の細菌を測定することができる。尿中の細菌濃度が５×１０^３個／ｍｌ以上のときに、当該尿中の細菌を測定することができるように構成することにより、尿検査で求められている感度で細菌測定を行うことができる。

本発明の尿中有形成分分析装置の一実施の形態及びこれに付属したパソコンの斜視説明図である。尿中有形成分分析装置の試料調製部及び光学検出部の概略機能構成を示す図である。光学検出部の構成を示す図である。第１の染色試薬の一例の吸収波長と吸光度との関係を示す図である。第２の染色試薬の一例の吸収波長と吸光度との関係を示す図である。図１に示される尿中有形成分分析装置の全体構成を示すブロック図である。尿中有形成分分析装置の定量機構及び試料調製部の概略斜視図である。尿中有形成分分析装置の定量機構及び試料調製部の説明図である。本発明の尿中有形成分分析装置を用いた尿の分析手順を示すフローチャート（前半部）である。本発明の尿中有形成分分析装置を用いた尿の分析手順を示すフローチャート（後半部）である。従来の自動分類装置において得られたスキャッタグラムの一例を示す図である。図１１と同じ検体について、本発明の尿中有形成分分析装置において得られた細菌系のスキャッタグラムを示す図である。図１１と同じ検体について、本発明の尿中有形成分分析装置において得られた沈査系のスキャッタグラムを示す図である。

符号の説明

１検体分配部
２試料調製部
３サンプルラック
４ラックテーブル
５光学検出部
１３パソコン
１５アーム
１６支持台
１７吸引管
１８染色液
１９希釈液
３０サンプリングバルブ
３１モータ
３２流路
３３流体カセット
３４取付プレート
３６ヒータ
Ｕ尿中有形成分分析装置
Ｔ試験管
Ｓクリアランス

Claims

尿検体中の有形成分を分析する尿中有形成分分析装置であって、
尿検体と染色試薬を混合して試料を調製する試料調製部と、
前記試料調製部によって調製された試料へ光を照射する光源と、
前記試料から発せられる前方散乱光を受光する前方散乱光受光部、前記試料から発せられる側方散乱光を受光する側方散乱光受光部、及び前記試料から発せられる蛍光を受光する蛍光受光部を備える光学検出部と、
前記光学検出部により検出された前方散乱光強度及び蛍光強度によって白血球及び上皮細胞の第１出現範囲をそれぞれ特定し、前方散乱光強度及び側方散乱光強度によって白血球及び上皮細胞の第２出現範囲をそれぞれ特定し、第１及び第２出現範囲によって識別される白血球と上皮細胞とをそれぞれ計数する制御部と、
を備えることを特徴とする尿中有形成分分析装置。
前記制御部は、前記光学検出部により検出された第１の試料の前方散乱光強度及び蛍光強度によって白血球及び上皮細胞の第１出現範囲をそれぞれ特定し、前方散乱光強度及び側方散乱光強度によって白血球及び上皮細胞の第２出現範囲をそれぞれ特定し、第１及び第２出現範囲によって識別される白血球と上皮細胞をそれぞれ計数し、前記光学検出部により検出された第２の試料の前方散乱光強度及び蛍光強度に基づいて、尿中の細菌を計数するように構成されている請求項１に記載の尿中有形成分分析装置。
尿検体を第１のアリコートと第２のアリコートとに分配する検体分配部をさらに備え、
前記試料調製部は、前記第１のアリコートに第１の染色試薬を混合して第１の試料を調製する第１試料調製部、及び前記第２のアリコートに第２の染色試薬を混合して第２の試料を調製する第２試料調製部を備え、
前記光学検出部は、前記第１及び第２の試料のそれぞれから発せられる前方散乱光、側方散乱光、及び蛍光を検出し、
前記制御部は、前記光学検出部により検出された第１の試料の前方散乱光強度及び蛍光強度によって白血球及び上皮細胞の第１出現範囲をそれぞれ特定し、前方散乱光強度及び側方散乱光強度によって白血球及び上皮細胞の第２出現範囲をそれぞれ特定し、第１及び第２出現範囲によって識別される白血球と上皮細胞をそれぞれ計数し、光学検出部により検出された第２の試料の前方散乱光強度及び側方散乱光強度のうち少なくとも一方と蛍光強度に基づいて、尿中の細菌を計数するように構成されている請求項１に記載の尿中有形成分分析装置。
尿中有形成分には、赤血球、白血球、上皮細胞、円柱、及び細菌が含まれる請求項１〜３のいずれか１項に記載の尿中有形成分分析装置。
上皮細胞は、扁平上皮細胞、移行上皮細胞、及び尿細管上皮細胞のうち少なくとも一つを含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の尿中有形成分分析装置。
尿検体中の有形成分を分析する尿中有形成分分析方法であって、
尿検体と染色試薬を混合して試料を調製し、
調製された試料に光が照射されることで前記試料から発せられる前方散乱光、側方散乱光、及び蛍光を検出し、
検出された前方散乱光強度及び蛍光強度によって白血球及び上皮細胞の第１出現範囲をそれぞれ特定し、前方散乱光強度及び側方散乱光強度によって白血球及び上皮細胞の第２出現範囲をそれぞれ特定し、第１及び第２出現範囲によって識別される白血球と上皮細胞をそれぞれ計数する尿中有形成分分析方法。