JP4808614B2 - 上皮成長因子受容体の欠失型変異体を認識する抗体、およびそれらの使用 - Google Patents
上皮成長因子受容体の欠失型変異体を認識する抗体、およびそれらの使用 Download PDFInfo
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Description
akiら、(1988).Amplification of the Structurally and Functionally Altered Epidermal Growth Factor Receptor Gene(c-erbB)in Human Brain Tumors.Molecular and Cellular Biology 8:1816〜1820;Maldenら、(1988).Selective Amplification of the Cytoplasmic Domain of the Epidermal Growth Factor Receptor Gene in Glioblastoma Multiforme.Cancer Research 4:2711〜2714)。
uct in Vivo and In Vitro.Cell 40:609〜618;Krisら、(1985).Antibodies Against a Synthetic Peptide as a Probe for the Kinase Activity of the Avian EGF Receptor and v-erB Protein.Cell 40:619〜625)、キナーゼドメインは制御されておらず構成的に活性を有するので、v-erbBタンパク質は発癌性であるという推測がもたらされている(Downwardら、1984)。
ture microdissection and immunohistochemical analysis.Int J Cancer.98(3):357〜61(2002))、50〜70%のグリオームがEGFRvIIIを発現し(Wikstrand、CJ.ら、Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas malignant gliomas.Cancer Research 55(14):3140〜3148(1995);Moscatello、G.ら、Frequent expression of a mutant epidermal growth factor receptor in multiple human tumors.Cancer Res.55(23):5536〜9(1995))、16%のNSCL癌がEGFRvIIIを発現し(Garcia de Palazzo、IEら、Expression of mutated epidermal growth factor receptor by non-small cell lung carcinomas.Cancer Res.53(14):3217〜20(1993))、75%の卵巣癌がEGFRvIIIを発現し(Moscatello、G.ら、Frequent expression of a mutant epidermal growth factor receptor in multiple human tumors.Cancer Res.55(23):5536〜9(1995))、および68%の前立腺癌がEGFRvIIIを発現する(Olapade-Olaopa、EO.ら、Evidence for the differential expression of a variant EGF receptor protein in human prostate cancer.Br J Cancer.82(1):186〜94(2000))。
(a)配列番号138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16、および17で同定される抗体13.1.2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342および333のCDR1領域のアミノ酸配列からなる群から選択される配列からなるCDR1、
(b)配列番号138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16、および17で同定される抗体13.1.2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342および333のCDR2領域のアミノ酸配列からなる群から選択される配列からなるCDR2、および
(c)配列番号138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16、および17で同定される抗体13.1.2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342および333のCDR3領域のアミノ酸配列からなる群から選択される配列からなるCDR3、
を含む重鎖アミノ酸配列を含む単離した抗体を含む。一実施形態では、抗体はモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、またはヒト化抗体である。一実施形態では、抗体は薬剤として許容可能な担体、希釈剤、および/または治療剤と結合させる。一実施形態では、治療剤は毒素である。一実施形態では、毒素はDM-1またはAuristatin Eである。
(a)配列番号140、19、20、21、29、23、25、26、28、33、31および32で同定される抗体13.1.2、131、170、150、123、095、139、250、211、318、342、および333のCDR1領域のアミノ酸配列からなる群から選択される配列からなるCDR1、
(b)配列番号140、19、20、21、29、23、25、26、28、33、31および32で同定される抗体13.1.2、131、170、150、123、095、139、250、211、318、342、および333のCDR1領域のアミノ酸配列からなる群から選択される配列からなるCDR2、および
(c)配列番号140、19、20、21、29、23、25、26、28、33、31および32で同定される抗体13.1.2、131、170、150、123、095、139、250、211、318、342、および333のCDR1領域のアミノ酸配列からなる群から選択される配列からなるCDR3、
を含む軽鎖アミノ酸配列を含む単離した抗体を含む。
(a)配列番号138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16、および17で同定される抗体13.1.2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342および333のCDR1領域のアミノ酸配列からなる群から選択される配列からなるCDR1、
(b)配列番号138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16、および17で同定される抗体13.1.2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342および333のCDR2領域のアミノ酸配列からなる群から選択される配列からなるCDR2、および
(c)配列番号138、2、4、5、7、9、10、12、13、15、16、および17で同定される抗体13.1.2、131、170、150、095、250、139、211、124、318、342および333のCDR3領域のアミノ酸配列からなる群から選択される配列からなるCDR3、
を含む重鎖アミノ酸配列をさらに含むことができる。
他に定義しない限り、本明細書で使用する科学および技術用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈によって他に必要とされない限り、単数形の語は複数形を含み、複数形の語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載する細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴまたはポリヌクレオチド化学およびハイブリダイゼーションの技術に関して使用する名称は、当分野においてよく知られており一般的に使用されている名称である。組換えDNA、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換(例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション)用の、標準的な技法を使用する。酵素反応および精製技法は、製造者の仕様書に従い、あるいは当分野で一般的に行われているように、あるいは本明細書に記載するのと同様に行う。前述の技術および手順は、当分野でよく知られている従来の方法に従い、本明細書中に引用し論じる様々な一般的およびさらに詳細な参照文献中に記載されたのと同様に一般的に行う。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、ニューヨーク、1989)を参照のこと。本明細書に記載する、分析化学、合成有機化学、ならびに医療および薬剤化学の実験手順および技法に関して使用する名称は、当分野においてよく知られており一般的に使用されている名称である。化学合成、化学分析、薬剤調製、配合、および送達、ならびに患者の治療用の、標準的な技法を使用する。
と予想される場合、残基は「重要である」と考えられる。一実施形態では、残基を変えることによって結合の損失をもたらす場合、残基は「重要である」と考えられる。
基本的な抗体の構造単位は、テトラマーを含むことが知られている。それぞれのテトラマーは、それぞれの対が1つの「軽」鎖(約25kDa)および1つの「重」鎖(約50〜70kDa)を有する、ポリペプチド鎖の2つの同一な対から構成される。それぞれの鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担う約100〜110以上のアミノ酸の可変領域を含む。それぞれの鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主に担う定常領域を定義する。ヒト軽鎖はkappaおよびlambda軽鎖としてクラスされる。重鎖はmu、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンとしてクラスされ、それぞれIgM、IgD、IgG、IgA、およびIgEとして抗体のアイソタイプを定義する。軽鎖および重鎖内では、可変領域と定常領域は約12以上のアミノ酸の「J」領域によって接合しており、重鎖は約10以上のアミノ酸の「D」領域も含む。Fundamental Immunology Ch.7(Paul、W.、ed.、第2版.Raven Press、ニューヨーク(1989))を概略的に参照のこと。それぞれの軽鎖/重鎖対の可変領域が、抗体結合部位を形成する。
一実施形態では、抗体のエピトープに対する結合能力を増大させるために、前に記載したモデルを使用する。抗体はエピトープとさらに容易に結合することができ、したがって高い結合定数(ka)を有する。あるいは、抗体はエピトープからゆっくりと解離することができ、したがって低い解離定数(kd)を有し、あるいはエピトープ-パラトープ相互作用のKDは値が小さい可能性があり、したがってエピトープとパラトープの間の結合度が高くなる可能性がある。
ヒト抗体は、マウスまたはラット可変領域および/または定常領域を有する抗体に関するいくつかの問題点を回避する。このようなマウスまたはラット由来タンパク質の存在は抗体の迅速な除去をもたらす可能性があり、あるいは患者による抗体に対する免疫応答の生成をもたらす可能性がある。マウスまたはラット由来抗体の使用を避けるために、げっ歯類が完全ヒト抗体を生成するように、げっ歯類にヒト抗体の機能を導入することによって、完全ヒト抗体を作製することができる。
本明細書で論じるように、EGFRvIII抗体の機能は、その作用形式の少なくとも一部分に重要であるようである。機能によって、例えばEGFRvIIIに関して作用するEGFRvIII抗体の活性が意味される。したがっていくつかの点で、EGFRvIIIに対する治療候補としての抗体の作製に関して、抗体は補体を固定し細胞毒性リンパ球を補い、したがってCDCおよびADCCに関与することができることが望ましい可能性がある。以下の:マウスIgM、マウスIgG2a、マウスIgG2b、マウスIgG3、ヒトIgM、ヒトIgG1、ヒトIgG3、およびヒトIgAを非制限的に含めた、同じであることが可能であるいくつかのアイソタイプの抗体が存在する。さらに、EGFRvIIIに対する治療候補としての抗体の作製に関して、抗体はナチュラルキラー(NK)細胞などのエフェクター細胞上のFc受容体と関与することによって、抗体依存性細胞毒性作用(ADCC)を活性化することができることが望ましい可能性がある。以下の:マウスIgG2a、マウスIgG2b、マウスIgG3、ヒトIgG1、およびヒトIgG3を非制限的に含めた、ADCCが可能であるいくつかのアイソタイプの抗体が存在する。作製する抗体は最初にこのようなアイソタイプを有している必要はないが、作製する抗体は任意のアイソタイプを有し、その後で、当分野でよく知られている従来の技法を使用して、抗体のアイソタイプを変えることができることは理解されよう。このような技法には、特に直接的な組換え技法の使用(例えば米国特許第4,816,397号を参照のこと)、および細胞-細胞融合技法(例えば米国特許第5,916,771号および米国特許第6,207,418号)がある。
EGFRvIIIに関して本明細書で生成および特徴付けする抗体の活性に基づいて、抗体成分以外の他の療法のモダリティーの設計を容易にする。このようなモダリティーには非制限的に、最新の抗体療法剤、例えば二重特異的抗体、免疫毒素、および放射標識療法剤など、ペプチド療法剤、遺伝子療法剤、特に細胞内発現抗体、アンチセンス療法剤、および小分子の作製がある。
理解されるように、薬剤、毒素、または他の分子と結合した抗体(免疫複合体または免疫毒素)は、抗体などの特異的結合分子によって特異的に結合することができる分子を発現する細胞を、標的殺傷する際に非常に有用である。前に論じたように、EGFRvIIIが任意の正常組織において発現されることは知られていない。さらにEGFRvIIIは、多数のヒト腫瘍において顕著な発現を示す。したがってEGFRvIIIは、免疫毒素を用いた標的として非常に魅力的な分子である。
(a) 単純なカルボン酸を有するC-3エステル (米国特許第4,248,870号、米国特許第4,265,814号、米国特許第4,308,268号、米国特許第4,308,269号、米国特許第4,309,428号、米国特許第4,317,821号、米国特許第4,322,348号および米国特許第4,331,598号)、および
(b) N-メチル-L-アラニンの誘導体を有するC-3エステル (米国特許第4,137,230号、米国特許第4,260,608号、米国特許第5,208,020号、およびChem.Pharm.Bull.12:3441(1984))
静脈内、皮下または筋肉内注射などの他の非経口投与経路によって、長時間の作用は、それほど頻繁ではなくより好都合な投与スケジュールを可能にするであろう。
本明細書に記載する抗体は、以下に記載したのと同様のXenoMouse(登録商標)技術を使用することによって調製した。したがってこのようなマウスは、ヒト免疫グロブリン分子および抗体を生成することができ、マウス免疫グロブリン分子および抗体の生成に欠陥がある。これを達成するために使用される技術は、本明細書に開示する特許、出願、および参照文献中に開示されている。しかしながら詳細には、それに由来するマウスおよび抗体のトランスジェニック生成の一実施形態が、1996年12月3日に出願された米国特許出願第08/759,620号、および1998年6月11日に公開された国際特許出願WO98/24893、ならびに2000年12月21日に公開されたWO00/76310中に開示されている。Mendezら、Nature Genetics 15:146〜156(1997)も参照のこと。
(A.EGFRvIII PEP3-KLH抗原の調製)
実施例2と関連して、14-merヒトEGFRvIII PEP3(LEEKKGNYVVTDHC(配列番号56))ペプチドをR&D Systemsによってカスタム合成した。次いで、PEP3ペプチドを以下のようにキーホールリンペットヘモシニアン(KLH)と結合させた。EGFRvIII PEP3(200mcg)(R&D)を蒸留水を用いて最終容量が165mclになるまで50mcgのキーホールリンペットヘモシニアン(KLH;Pierce、イリノイ州ロックフォード)と混合させた。250mclの複合体用緩衝液(0.1M MES、0.9M NaCl、pH4.7)を添加し、10mg/mlのストック溶液である1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸(EDC、Pierce、イリノイ州ロックフォード)25mclの添加によってEGFRvIII PEP3およびKLHを架橋した。この複合体を室温で2時間インキュベートし、PBS pH7.4を用いて1kDaフィルタ(遠心フィルタ;Millipore、マサチューセッツ州ベッドフォード)を介して反応していないEDCを遠心分離によって除去した。
B300.19/EGFRvIIIトランスフェクタントを調製するために、野生型EGFRをA431細胞から予めクローニングし、EGFR遺伝子を、6〜273残基をコードするコドンが欠失し、欠失の接合部で生成されるグリシン残基をコードするコドンを有するEGFRvIIIをコードするように改変した。欠失GTT(バリン)およびCGT(アルギニン)を囲むコドンの範囲内で欠失が起こり、欠失後に生成されるコドンはGGT(グリシン)である(Wikstrandら、J Neurovirol.4(2):148〜58(1998))。
Micro-fast RNAキット(Invitrogen、オンタリオ州バーリントン)を用いてPolyA+mRNAをA431(ATCC)細胞から抽出した。ランダムpdN6プライマーおよびM-MuLV逆転写酵素(NEB、New England Biolabs、マサチューセッツ州ビバリー)を用いてpolyA+mRNAから全cDNAを合成した。Pfu DNAポリメラーゼを用いて、
プライマー:センス5'-GGATCTCGAGCCAGACCGGAACGACAGGCCACCTC-3';(配列番号62)と
アンチセンス5'-CGGATCTCGAGCCGGAGCCCAGCACTTTGATCTT-3'(配列番号63)
を用いてA431 cDNAから2.3kbのPCR産物を増幅した。
プライマー対のC13659/C29538およびC29539/C14288(BioSource International)を用いて、プラスミドWt-EGFR/pWBFNP鋳型から増幅されたPCR産物をライゲーションし、EGFR細胞外ドメインのアミノ酸6から273までをコードする配列内で欠失を導入し、発現ベクターpWBDHFR2内にサブクローニングした(国際特許出願No.WO99/45031)。用いたC29538およびC29539は、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(NEB、New England Biolabs、マサチューセッツ州ビバリー):
C13659:5'-CGGATGAATTCCCAGACCGGACGACAGGCCACCTC-3'(センス)(配列番号64);
C29538:5'-CTTTCTTTTCCTCCAGAGCC-3'(アンチセンス)(配列番号65);
C29539:5'-GTAATTATGTGGTGACAGATC-3'(センス)(配列番号66);
C14288:5'-CGGATCTCGAGCTCAAGAGAGCTTGGTTGGGAGCT-3'(アンチセンス)(配列番号67)
によってリン酸化した。
700μlのDMEM/HI培地内でトランスフェクションごとにB300.19細胞(8×106)を用いた。EGFRvIII-FL/pWBDHFR20μgおよびCMV-PuroプラスミドDNA2μgを添加した。Bio-Rad Gene Pulserを用いて300ボルト/960μFで細胞をエレクトロポレートした。エレクトロポレートした後、細胞を氷上で10分間冷却し、その後、10mlの非選択培地(DMEM/HIグルコース、10%FBS、50μMBME、L-グルタミン2mM、100単位のペニシリン-G/ml、100単位のMCGストレプトマイシン/ml)を添加した。細胞を7.5%CO2、37℃で48時間インキュベートした。
EGFRvIIIウサギFc融合タンパク質を生成するために、本発明者はまずウサギFcをコードするDNAを含有するベクターを構築した。これをEGFRvIIIをコードするDNAにライゲーションした。このアプローチを以下により詳細に述べる。
プライマー1322/867(下記)を用いて、ウサギIgGのHinge-CH2-CH3ドメインをコードする721bp断片を増幅した。
#1322(センス):5'-GGTGGCGGTACCTGGACAAGACCGTTGCG-3'(配列番号68)
#867(アンチセンス):5'-ATAAGAATGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGAGCGGGA-3'(配列番号69)
プライマー1290/1293(下記)を用いることで、PfuポリメラーゼによってEGFRvIII-FL/pWBDHFRプラスミド鋳型から1165bp産物を増幅した。
#1290(センス):5'-CTACTAGCTAGCCACCATGCGACCCTCCGGGA-3'(配列番号70)
#1293(アンチセンス):5'-CGGGGTACCCGGCGATGGACGGGATC-3'(配列番号71)
以下のように、リン酸カルシウムのトランスフェクションによってプラスミドEGFRvIII-RbFc/pCEP4を293F細胞(Gibco、ニューヨーク州グランドアイランド)内に導入した。トランスフェクションの1日前に、1×106個の293F細胞をゼラチンでコーティングされた100mmの組織培養ペトリ皿上に播種し、5%CO2、37℃でインキュベートした。トランスフェクションの2〜3時間前に、細胞を新鮮な非選択培地(DMEM/F12、10%FBS、L-グルタミン2mM、ペニシリンG 100U/ml、MCGストレプトマイシン100U/ml)10mlに与えた。トランスフェクション試薬をマイクロチューブ内で以下のように調製した。DNA(EGFRvIII-RbFc/pCEP4)10μgを62μlの2Mリン酸カルシウムおよび脱イオン水と混合し、最終容量が500μlとなるようにした。別のチューブピペットで500μlの2XHBSを取り出し、トランスフェクション試薬を移すのに用いた。
抗体の適定用のEGFRvIIIペプチド-OVA(実施例3)を以下のように産生した。
0日目にγ-1定常領域を有する抗体を産生する8匹のXenoMouseマウス(XenoMouse Glマウス)を免疫し、このプロトコルにしたがい、11、21、32、44、および54日目に追加免疫を行い、58日目に融合を実施した。すべての注射について、尻尾の根元における皮下投与に加え、腹腔内投与を介してすべての免疫を行った。0日目に完全フロイントアジュバント(CFA)(Sigma、ミズーリ州セントルイス)と1:1v/vで混合されたパイロジェンを含まないDPBSに懸濁された1.5×107個のB300.19/EGFRvIIIトランスフェクト細胞(実施例1A)を用いて免疫を行った。11、21、および32日目に、不完全フロイントアジュバント(IFA)(Sigma、ミズーリ州セントルイス)と1:1v/vで混合された、DPBS中の1.5×107個のB300.19/EGFRvIIIトランスフェクト細胞を用いて追加免疫を行った。44日目にIFAと1:1v/vで混合されたDPBS内のPEP3(EGFRvIIIペプチド)-KLH複合体5μg(実施例1)を用いて追加免疫を行い、54日目にアジュバントを含まない、DPBS内のPEP3(EGFRvIIIペプチド)-KLH複合体5μgを用いて最後の追加免疫を行った。
(XenoMouse動物の免疫感作)
γ-1定常領域(XenoMouseG1マウス)を有する抗体を産生するXenoMouseマウス、γ-2定常領域(XenoMouseXMG2マウス)を有する抗体を産生するXenoMouseマウス、およびγ-4定常領域(XenoMouseG4マウス)を有する抗体を産生するXenoMouseマウスに連続して免疫することにより、ヒトEGFRvIIIに対するヒトモノクローナル抗体を作製した。
ELISAによって抗hEGFRvIII抗体力価を測定した。EGFRvIII-RbFc(2.5μg/ml)、対照RbFc(2μg/ml)、EGFRvIIIペプチド-OVA(2μg/ml)(実施例1)、対照OVA(4μg/ml)のいずれかをCostar Labcoat Universal Binding Polystyrene 96ウェルプレート(Corning、マサチューセッツ州アクトン)上に4℃で一晩コーティングした。結合されていない抗原を含有する溶液を取り出し、プレートをUV光(365nm)で4分間(4000マイクロジュール)処理した。プレートをdH2Oで5回洗浄した。EGFRvIIIで免疫したXenoMouse(登録商標)動物すなわちnaive XenoMouse(登録商標)動物由来の血清の力価を、2サンプルずつ1:100希釈からはじめて、1:2希釈の2%ミルク/PBS中で測定した。最後のウェルはブランクとした。dH2Oでプレートを5回洗浄した。ヤギ抗ヒトIgG Fc特異的ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP、Pierce、イリノイ州ロックフォード)を結合した抗体を室温で1時間、最終濃度1μg/mLで添加した。プレートをdH2Oで5回洗浄した。TMB発色基質(メリーランド州ガイザースベルグ)を添加して、30分間プレートを発色させ、1Mリン酸の添加によってELISAを中断した。個々のXenoMouse(登録商標)動物の特定の力価を450nmにおける吸光度から測定し、表3.3および表3.4に示す。力価は、血清の希釈度の逆数を示すことから、その数が大きくなるとhEGFRvIIIに対する液性免疫応答が亢進することを意味する。
先に考察した動物由来のB細胞を採取し、培養した。EGFRvIIIペプチド特異的抗体を分泌するB細胞をBabcookら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、93:7843〜7848(1996)に記載のように単離した。ELISAを用いて、一次EGFRvIIIペプチドOVA特異的ウェルを同定した。500個、150個、もしくは50個の細胞/ウェルでの245枚の96ウェルプレートでXenoMouse動物由来の約500万個のB細胞を培養し、EGFRvIIIペプチド-OVA上でスクリーニングし、抗原特異的なウェルを同定した。約515個のウェルは、バックグラウンドを大幅に超えるODを示した。代表的な試料を表3.5に示す。
限界抗原分析は、他のすべての抗原特異的抗体に対してB細胞培養上清中に存在する抗原特異的抗体を親和性でランクづけする方法である。コーティング抗原が極めて少ないの存在下で、最も高い親和性を有する抗体のみが、平衡状態で任意の検出可能なレベルで結合できる(例えば、国際特許出願No.WO03/48730)。
EGFRvIIIペプチド-OVA-Elisaにおける陽性のウェルの上清について、NR6細胞(NR6M細胞)上に安定的に発現したネイティブ形態のEGFRvIIIに対する結合能を分析した(Batraら、Epidermal growth factor ligand-independent,unregulated,cell transforming potential of a naturally occurring human mutant EGFRvIII gene.Cell Growth Differ.6(10):1251〜9(1995)参照)。NR6M細胞を1ウェル当たり8000個の細胞で播種し、96ウェルFMATプレートで一晩インキュベートした。次いでウェル内に15μlを残して培地を取り出した。B細胞の培養上清15μlを添加し、15μlの抗ヒトIgG Fc Cy5を最終濃度1μg/mlでウェルに添加した。次いで、それを4℃で2時間インキュベートの状態にした。細胞をPBS150μlで洗浄し、そしてFMATで読み取る前に固定した。結果を全蛍光強度として示した(表3.8)。ヒト抗EGFRvIII mAb13.1.2を最終濃度1μg/mlで開始するポジティブ対照として用い、ネガティブ対照は同濃度のPK16.3.1とした。試験試料244個中134個はNR6M細胞に結合し、そのうち62個は8000を超える総蛍光量を有していた。これらの結合した134個のうち6個は偽陽性であった。
上位60のネイティブ結合性B細胞培養上清を、受容体に対するインターナリゼーション能力についてさらにアッセイした。NR6 M細胞を8000個の細胞/ウェルで96ウェルFMATプレート内に播種し、一晩インキュベートした。培地を取り出し、全容量30μl培地でB細胞の培養上清10〜15μlを2サンプル添加した。次いで、二次抗体(最終濃度1.5μg/mlでSS Alexa647抗ヒトIgG Fab)15μlを添加し、混合物を氷上で1時間インキュベートした。培地の効果を調べるために、不適切なB細胞の培養上清を用いた。ヒト抗EGFRvIII mAb13.2.1を、1μg/ml(最終濃度)で開始するポジティブ対照として用い、ネガティブ対照は同濃度のPK16.3.1(ヒト抗KLHIgG2抗体)とした。インキュベーション後、細胞を冷却PBSで洗浄し、50μlの培地をすべてのウェルに添加し、2サンプルの一方を37℃で30分間インキュベートし、他方を氷上で維持した。インキュベーション後、培地を取り出し、冷却した50mMグルタチオン100μlを37℃でインキュベートしたセットに添加し、冷却した培地100μlを他方のセットに添加し、次いで両方のセットを氷上に1時間放置した。次いで細胞を冷却PBS100μlで洗浄し、1%パラホルムアルデヒドで固定し、FMATで読み取った。「グルタチオン存在下での全蛍光/グルタチオン非存在下での全蛍光」×100で計算して、結果を%インターナリゼーションとして示した。代表的なデータを表3.9に挙げる。
このアッセイを行うのに多数の特定試薬を必要とした。これらの試薬を以下のように調製した。
SRBCを25%ストックとしてRPMI培地内に保存した。SRBC1.0mlを未使用のエッペンドルフチューブに小分けすることによってSRBCの濃縮細胞ペレット250μlを得た。微量遠心機を用いた8000rpm(6800rcf)パルス回転によってSRBCをペレット状にし、上清を回収し、ペレットをpH8.6のPBS1.0mlに再懸濁し、そして遠心分離を繰り返した。洗浄サイクルを2回繰り返し、次いでSRBCペレットを15mlのファルコンチューブに移し、pH8.6のPBSによって5mlにした。分離した50mlのファルコンチューブ、スルホ-NHSビオチン2.5mgをpH8.6のPBS45mlに添加した。ビオチンが完全に溶解してから、SRBC5mlを添加し、チューブをRTで1時間回転した。SRBCを3000rpmで5分間遠心分離し、上清を回収した。ビオチン化したSRBCをエッペンドルフチューブに移し、pH7.4のPBS以外では上記のように3回洗浄し、次いで15mlのファルコンチューブ内で免疫細胞用培地(RPMI1640)によって5mlになるようにした(5%B-SRBCストック)。ストックを必要になるまで4℃で保存した。
5%B-SRBCストック1mlを未使用のエッペンドルフチューブ内に移した。上記のようにB-SRBC細胞を3回洗浄し、pH7.4のPBS1.0mlに再懸濁することで最終濃度5%(v/v)を得た。10mg/mlのストレプトアビジン(CalBiochem、カリフォルニア州サンディエゴ)ストック溶液10μlを添加し、チューブをRTで20分間混合し回転した。洗浄工程を繰り返し、SA-SRBCをpH7.4のPBS1ml(5%(v/v))に再懸濁した。
SA-SRBCを10μg/mlのビオチン化したEGFRvIIIペプチド-OVAでコーティングし、20分間RTで混合し回転させた。上記のようにSRBCをpH7.4のPBS1.0mlで2回洗浄した。EGFRvIIIでコーティングしたSRBCをRPMI(+10%FCS)で再懸濁し、最終濃度を5%(v/v)にした。
5%SA-SRBC10μlおよび5%EGFRvIIIペプチドでコーティングされたSRBC10μlを、PBS40μlを含有する別の未使用の1.5mlのエッペンドルフチューブにそれぞれ添加した。対照ヒト抗EGFRvIII抗体を45μg/mlでSRBCの各試料に添加した。チューブをRTで25分間回転し、次いで細胞をPBS100μlで3回洗浄した。細胞をPBS50μlに再懸濁し、Alexa488(Molecular Probes、オレゴン州ユージン)に結合したヤギ抗ヒトIgG Fc抗体40mcg/mLとともにインキュベートした。RTで25分間チューブを回転し、次いでPBS100μlで洗浄し、細胞をPBS10μlに再懸濁した。染色細胞10μlをクリーンなガラス顕微鏡スライド上にスポットし、ガラスカバースリップで覆って蛍光下で観察し、そして0〜4の任意のスケールでスコアリングした。
様々なアッセイによって対象の免疫グロブリンを分泌するB細胞クローンを含有するものとして予め同定された単一のミクロ培養ウェルの中身を回収した。100〜1000μlのピペットマンを用いて、37℃のRPMI(10%FCS)を添加することによってウェルの含量を回復させた。ピペッティングによって細胞を再懸濁し、次いで未使用の1.5mlのエッペンドルフチューブ(最終容量約500〜700μl)に移した。微量遠心機で2500rpm(660rcf)、室温で1分間細胞を遠心分離し、次いでチューブを180度回転させ、再度2500rpmで1分間回転させた。凍結培地を回収し、免疫細胞をRPMI(10%FCS)100μl中に再懸濁し、次いで遠心分離した。RPMI(10%FCS)でのこの洗浄を繰り返し、細胞をRPMI(10%FCS)60μl中に再懸濁し、使用準備ができるまで氷上で保存した。
予めシリコーンエッジでスライドガラス(2×3インチ)を調製し、RTで一晩、保存可能な状態にした。使用前に、スライドを約5μlのSigmaCoat(Sigma、オンタリオ州オークビル)で処理し、ガラス表面上を均一にふき取り、乾燥させ、次いで完全にふき取った。細胞の試料60μlに、EGFRvIIIペプチドでコーティングした各SRBC(5%v/vストック)を60μlずつ、RPMI(10%FCS)で調製した4×モルモット補体(Sigma、オンタリオ州オークビル)ストック、および4×濃縮血清ストック(10%FCSを含むRPMI中で1:150)を添加した。混合物を調製したスライド上にスポットし(10〜15μl)、これらスポットを希釈されていないパラフィンオイルで覆った。スライドを37℃で最低45分間インキュベートした。EGFRvIIIに特異的な形質細胞をプラークにより同定し、顕微操作によってピックアップした(表3.10参照)。
可変領域をコードする遺伝子を、単一の顕微操作された形質細胞においてRT-PCRによって解析した。mRNAを抽出し、逆転写酵素PCRを実施することでcDNAを生成した。ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、可変重鎖および軽鎖をコードするcDNAを特異的に増幅させた。ヒト可変重鎖領域をIgG1発現ベクター中にクローニングした。pcDNA3.1+/Hygro(Invitrogen、オンタリオ州バーリントン)の複数のクローニング部位内にヒトIgG1の定常ドメインをクローニングすることにより、このベクターを生成した。ヒト可変軽鎖領域をIgK発現ベクター中にクローニングした。ヒトIgKの定常ドメインをpcDNA3.1+/Neo(Invitrogen、オンタリオ州バーリントン)の複数のクローニング部位内にクローニングすることにより、これらのベクターを生成した。次いで、重鎖および軽鎖発現ベクターを70%コンフルエントのヒト胎児腎臓293細胞の60mmディッシュ内に同時リポフェクションし、トランスフェクトされた細胞が24〜72時間において元の形質細胞と同一の特異性を有する組み換え抗体を分泌できた。上清(3mL)をHEK293細胞から回収し、ヒトIgGを特異的に検出するサンドイッチELISAを用いてインタクト(intact)抗体の分泌を求めた(表3.11)。ELISAを用いて組み換え抗体のEGFRvIIIに対する結合を介して特異性を評価した(表3.11)。
クローニングされた重鎖および軽鎖のcDNAを両方向でシークエンシングし、分析することで抗体の生殖細胞系配列の派生を決定し、生殖細胞系配列からの変化を同定した。上記配列を図3A〜3Kおよび(配列番号34〜55)に示す。重鎖および軽鎖の各配列とこれらの由来である生殖細胞系配列の比較について図4〜7に示す。さらに、図4および図5において、ハイブリドーマ由来の13.1.2抗体の配列をその生殖細胞系配列と比較する。
この実施例では、抗EGFRvIII抗体のNR6M細胞への結合を測定した。特に、XenoMaxに由来するIgG1組み換え抗体の定量されていない上清のNR6MおよびNR6Wt細胞に対する結合能についてアッセイした。細胞を10000/ウェルで播種し、FMAT96ウェルプレート内で37℃で一晩インキュベートした。培地を取り出し、ミニリポ(mini lipo)上清(力価低下)40μlを添加し、細胞を氷上で1時間インキュベートした。ヒト13.1.2のEGFRvIII抗体およびABXEGF(E7.6.3、米国特許第6235883号)抗体をポジティブ対照として添加した。PK16.3.1抗体をネガティブ対象として用いた。細胞を冷PBSで洗浄し、二次抗体を1μg/ml、40μl/ウェルで添加し(SSAlexa抗ヒトIgGFc)、氷上で1時間インキュベートした。次いで、細胞を冷却PBSで洗浄し、固定し、FMATによって読み取った。カウンタースクリーニングによるNR6Wt細胞に対する結合への特異性について、すべての抗体を試験した。
より大規模な産生において、重鎖および軽鎖の発現ベクター(2.5μgの各鎖/ディッシュ)をHEK293細胞で70%コンフルエントであった10枚の100mmのディッシュ内にリポフェクトした。トランスフェクトした細胞を37℃で4日間インキュベートし、上清(6mL)を回収し、6mLの新鮮な培地と交換した。7日目に、上清を取り出し、最初の回収物とともにプールした(10枚のプレートから全部で120mL)。プロテイン-A セファロース(Amersham Biosciences、ニュージャージー州ピスカタウェイ)アフィニティクロマトグラフィー(1mL)を用いて各抗体を上清から精製した。pH2.5の0.1Mグリシン500mcLを用いてプロテイン-Aカラムから抗体を溶出した。溶出液をpH7.4のPBSで透析し、フィルタで無菌化した。非還元SDS-PAGEによって抗体を分析することで純度および収量を評価した。さらに、OD250におけるUV分析によって濃度を測定した。
XenoMax由来のIgG1組み換え抗体を発現させ、先に説明したように精製し、定量した。さらに、抗体をNR6M細胞のEGFRvIII受容体に対するそのインターナリゼーション能についてアッセイした。250,000個のNR6M細胞0.25μg/mlを一次抗体(SC95、SC131、SC133、SC139、SC150、SC170、SC211、SC230、SC250および対照としてヒト13.1.2)とともに3回、96ウェルV底プレート内で氷上で7分間インキュベートした。PBS中の冷却10%FCSで細胞を洗浄し、3μg/mlで二次抗体(SSAlexa抗ヒトIgGFab)Fabを添加し、氷上で7分間インキュベートした。細胞をPBS中の冷却10%FCSで1回洗浄し、次いで冷培地で再懸濁した。次いで、3サンプルのうちの2セットを37℃でインキュベートし、残存する1セットを4℃で1時間インキュベートした。その後で4℃でインキュベートされた細胞および37℃でインキュベートされた1セットの細胞をグルタチオンによって氷上で1時間処理した(前記の通り)。次いで、PBS中の冷却1%FCS100μlで細胞を洗浄して再懸濁し、FACSによって分析した。%インターナリゼーションをFACS分析から得られた幾何学的平均値から計算した[(グルタチオン存在下の37℃での平均値-グルタチオン存在下の4℃での平均値)/(グルタチオン非存在下の37℃での平均値-グルタチオン存在下の4℃での平均値)]。NAとは、FACS分析を実施したものの、データを表3.12に示さなかったことを意味する。
本発明の特定の抗体が結合するエピトープを決定するために、特異的なEGFRvIIIペプチド配列由来の合成ペプチドを用い、6つのヒトモノクローナル抗体および3つのマウスモノクローナル抗体(mabs)のEGFRvIIIに対するエピトープをマッピングした。マッピングした抗体は、ヒトハイブリドーマ由来の抗EGFRvIII13.1.2抗体、ヒトXenoMax由来の抗EGFRvIII131、139、250、095、および211抗体、ならびにマウス抗EGFRvIII H10、Y10、およびB9抗体(Dr.D.Bigner、デューク大学を由来)であった。
EGFRvIII-ウサギFc融合タンパク質
H1477-EGFRvIII発現コンストラクトでトランスフェクトしたH80ヒト腫瘍細胞系
(これらの細胞は、EGFRとEGFRvIIIの両方を発現する。)
EGFR-精製野生型EGFRタンパク質
A431-野生型EGFRのみを発現するヒト腫瘍細胞系
A549-野生型EGFRのみを発現するヒト腫瘍細胞系
H80-野生型EGFRのみを発現するヒト腫瘍細胞系
EGFR Biacore-特異性の高感度試験として、精製EGFRに対する結合性についてBiacoreでmAbを試験した。
精製抗体の特異性は、野生型もしくは変異体EGFRをトランスフェクトしたNR6細胞においてFACS解析を実施することによって確認した。細胞を5μg/mlずつの各抗体とともに氷上で1時間インキュベートし、FAC緩衝液で洗浄し、続いてPE結合ヤギ抗ヒトIgGとともにインキュベートした。
変異体EGF受容体を認識する抗体は、遺伝子増幅が発生している細胞上の野生型EGF受容体のサブセットと交差反応することが示されている(Johnsら、Int.J.Cancer.98:398、2002)。同定されたヒトEGFRvIII抗体が類似の特性を有するか否か判定するために、培養中の種々の細胞における同抗体の野生型EGF受容体に対する認識能について試験した。抗体を指定された細胞系とともに4℃でインキュベートした。FACS緩衝液で洗浄後、フィコエリスリン(phycoerythrin)結合二次抗体を添加し、インキュベーションを継続した。分析対象のすべての細胞系が野生型EGFRを発現した。野生型EGFRの1つのサブセットは、抗体XG1-131によって、A431とSF-539細胞上では認識されたが、A498もしくはSKRC-52細胞上では認識されなかった。EGFRvIIIに対する別種の抗体である13.1.2は、この野生型EGFRのサブセットを認識しなかった。併せて考慮すると、これらのデータは、変異体EGFRvIIIを認識する抗体のサブセットのみが細胞表面上の野生型EGFRを認識できることを示唆する。変異体EGFRvIIIを認識する特定の抗体における野生型EGF受容体の小集団に対する認識能は、EGFRの総密度に依存しないが、腫瘍細胞に固有の新規な立体構造エピトープを意味する可能性が高い。EGFRvIIIを認識する抗体における野生型受容体の小集団と交差反応する能力は、変異体受容体の接合部内の特異的なエピトープおよびこの特徴的なエピトープに対する抗体の親和性の両方によって決定できる(本明細書におけるエピトープマッピングの結果および親和性を決定する切片を参照)。
1群の細胞系に関してFACS解析を実施することによって精製抗体の特異性を確認した。ヒト膠芽細胞腫系であるH80およびEGFRvIIIを高レベルに発現するH1477(H80-EGFRvIII)、ヒト類表皮癌系であるA431、およびヒト肺癌細胞系であるA549を細胞系として用いた。ATCC(米国メリーランド州ロックヴィル)から得たA431およびA549以外のすべての細胞系は、Dr.Bignerから得た。細胞を10μg/mlずつの各抗体とともに氷上で30分間インキュベートし、FACS緩衝液で洗浄し、続いてJackson ImmunoResearch(米国ペンシルベニア州ウェストグローブ)製PE結合ヤギ抗ヒトIgGとともにインキュベートした。図9A〜9Lおよび10A〜10Dでは、暗色のヒストグラムは不適切なIgGで染色された細胞を示し、縁取られたすなわち白色のヒストグラムは適切な抗体の染色について示す。抗EGFRvIII抗体13.1.2、131および139は、トランスフェクトした細胞系のEGFRvIIIタンパク質に結合する。結果の一部をまとめるグラフを図9M〜9Pに示す。
以下の研究では、EGFRvIII特異的抗体を用いることで、毒素と結合した二次抗体を膠芽細胞腫細胞系(H80)およびEGFRvIIIでトランスフェクトした膠芽細胞腫細胞系(H1477)の中に誘導した。Pharmingen(BD Biosciences Pharmingen)製のマウス抗ヒトIgG(cat#555784)を毒素AEFP(Seattle Genetics、Inc.)およびマイタンシン(maytansine)(DM1、Immunogen Inc.)と結合することで、mah-AEFP(マウス抗ヒトIgG-AEFP)およびmah-DM1(マウス抗ヒトIgG-DM1)を生成した。サポリンと結合したヤギ抗ヒトIgGであるHum-ZAP(TM、cat#IT-22-250、アフィニティ精製したヤギ抗ヒトIgG-サポリン)は、Advanced Targeting Systems(米国カリフォルニア州サンディエゴ)製である。H80およびH1477細胞を、1ウェル当たり100μlの増殖培地内に1000個の細胞を有する96ウェルプレートに播種した。24時間後、一次抗体を結合二次抗体と1:3で混合し、6個のウェル上で1:5で連続希釈した。希釈された一次抗体および毒素結合二次抗体との混合物100μlを、最終の開始濃度で一次抗体0.1μg/mlおよび二次抗体0.3μg/mlで、細胞が入ったウェル内に添加した。プレートにおいて3日間連続培養させた。4日目には、Promega(米国ワイオミング州マディソン)製のCellTiter-Glo試薬(cat#G7571)を添加し、発光を読み取った。図11A〜11I、図12A〜12I、および図13A〜13Iは、この実験から得られた結果を示す。H1477(黒丸)におけるHum-ZAPが介在する抗原特異的な死を、大半のEGFRvIIIに特異的な試験mAbにおけるH80(黒四角)の場合と比較する。MAbs XG1-131およびXG1-139は、mah-AEFPにより、かつ程度は低下するがmah-DM1によって抗原特異的な二次的な死をもたらした。試験抗体の中で、XG1-131の挙動は、13.1.2、XG1-095、XG1-139、XG1-150、XG1-170、XG1-250およびXG1-211よりも少なくとも対数で1だけ優れていた。IgG1をネガティブ対象として用い、抗原陽性細胞(H1477)を抗原ネガティブ細胞(H80)と比較した。
二次細胞毒性アッセイに加え、clonogenic assayによりEGFRvIII特異的抗体を試験した。特異的なEGFRvIII抗体は、直接毒素と結合した二次抗体を、EGFRvIIIでトランスフェクトされた膠芽細胞腫細胞系(H1477)内に誘導し、細胞内部で毒素が放出され、最終的には細胞におけるコロニーを形成するだけの増殖能が低下した。したがって、生成したこれらのEGFRvIII抗体-毒素の適用により、一次抗体および二次毒素抗体処理後に細胞を再播種する際に、クローン数が低下した。この実施例では、H80およびH1477の細胞を1ウェル当たり30、000個の細胞で6枚のウェルプレートに播種し、一晩インキュベートした。一次抗体および二次毒素抗体を比率1:3で混合した。この抗体混合物を適切なウェル内に最終濃度が一次抗体0.5μg/mlおよび二次毒素抗体1.5μg/mlで添加した。これを37℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、毒素混合物を適切に配置し、細胞を1×トリプシン溶液を用いてウェルから離した。細胞を計数し、1ウェル当たり200個の細胞で新たな6ウェルプレート内に播種した。各処理グループにつき3サンプルずつ播種した。コロニーが形成されて目視もしくは顕微鏡下で同定できるまで、これらのプレートを37℃の培養器内で2〜3週間インキュベートした。培地を吸引し、メタノール中の5Mメチレンブルーを1時間かけて添加した。プレートを水で注ぎ、コロニーを計数した。図14Aおよび図14Bはこの実験から得られた結果を示す。示されるように、mab-AEFP二次毒素抗体は、3種類のEGFRvIII試験抗体とともにコロニー形成を阻害した。
抗体が薬物を腫瘍細胞に送達できるさらなる証拠は、細胞毒性薬物による抗体の直接結合によって与えられる。以下の例では、EGRvIII抗体13.1.2を、ペプチドリンカーを介してオーリスタチン(auristatin)EMMAEおよびAEFPの複合体と直接結合させ(MMAEとAEFPの両方はSeattle Geneticsから入手可能で、先に説明されている)、マイタンシン(DM1)をチオールリンカーと結合させた(DM1は免疫原由来で先に説明されている)。EGFRvIII抗原であるH1477を発現した細胞に前記結合物を添加した際、特異的な細胞毒性が観察された。抗原H80を発現しなかった細胞は、極めて高濃度の抗体に暴露された場合にのみ死んだ。この実験から得られた結果を図15A〜15Cに示す。
抗体が細胞毒性薬物を細胞に送達できるか否かを決定するための任意の方法は、in vivoにおいてヒト腫瘍の成長における結合抗体の効果を評価することである。この実施例は、かかる一方法を示す。H1477膠芽細胞腫細胞をin vitroにおいて培養し、トリプシン処理によって回収し、その後、以後に説明するようにマトリゲル中に包埋した。500万個の細胞を雌ヌードマウス内に皮下注射し、腫瘍が約0.5cm3の大きさに至るまで成長させた。この時点で、動物を無作為に複数のグループに分け、4日ごとに経静脈での指定の濃度を有する結合抗体による処理を開始した。図16における結果は、抗体13.1.2がマイタンシン(dEGFR-DM1)またはオーリスタンシンE(dEGFR-MMAE)と結合する場合には、膠芽細胞腫の後退を誘発可能であることを示している。非結合薬物に相当する量の抗体を投与する場合(グループ2)、腫瘍の成長に関して何の効果もなく、in vivoにおける腫瘍細胞の標的化には抗体を毒素とコンジュゲートさせることが必要であることは明らかである。
1日目:マトリゲル中で500万個の細胞を有する腫瘍の8週齢nu/nu雌マウス内への移植
22日目:表11.1に示すように、4日ごと、経静脈で実施された抗体プロドラッグ処理
EGFRvIIIに特異的に結合することで知られる2つのマウスモノクローナル抗体(B9、IgG1およびY10、IgG2(Dr.Bigner、デューク大学))の組合せを用いて種々の癌患者由来の凍結組織切片を染色することにより、ヒト腫瘍におけるEGFRvIIIの発現を測定した。同切片をアイソタイプが同じである対照抗体で染色した。すべての患者の試料から得られた染色結果をまとめたものを表12.1に示す。
実施例11の方法を用いることで、肺癌および神経膠腫が治療されることになる。これは動物モデルの作製によって幅広く検討されることになる。膠芽細胞腫および肺癌に対する動物モデルを以下のように作製する。wt-EGFRを発現する肺癌細胞を、EGFRvIIIでトランスフェクトする。同細胞をnu/nuマウスの肺の中に注射し、腫瘍が上記に匹敵するステージに進行させる。次いで、抗EGFRvIII結合物を必要に応じて1から10日ごとに上記のように静脈内に注射する。次いで、それら癌細胞の大きさおよび予防または持続的成長の抑制をモニターすることで、これらの抗EGFRvIII抗体および抗体-毒素の組合せの有効性を判定することになる。当業者によって認識されるように、これは本明細書において開示される抗体のいずれかに対して実施可能である。
EGFRvIIIエピトープ内部における結合にとって不可欠なこれらのアミノ酸残基の正体をさらに決定するために、エピトープペプチド内のアミノ酸の置換解析を実施した。実施例4に由来する配列、すなわちLEEKKGNYVVTD(配列番号59)から開始した。この実施例では、マッピングされたエピトープの各アミノ酸を20種類の全L-アミノ酸によって1回につき1個置換することにより、あらゆる単一部位の置換が可能な類似体を合成し、スクリーニングすることでペプチド結合のフォーマットに関する詳細な情報を提供した。mAb131および13.1.2についての個別の置換パターンを同定した。これら置換から得られた結果について表14.1にまとめる。
mAbの131および13.1.2の重鎖および軽鎖をシャッフリングし、293T細胞内に一過的にトランスフェクトした。72時間後、上清を収集し、ELISAによって分泌およびEGFrVIII抗原に対する結合についてアッセイした。
本実施例は、これら実施形態のタンパク質において三次元構造がいかにして生成できるかを実証する。Accelrys(カリフォルニア州サンディエゴ)製InsightIIモデリングパッケージを用い、抗体131の可変領域の三次元構造モデルを相同モデリングアプローチを通じて生成させた。同モデルを以下の表16.1に記載される可変領域配列から構築した。残基の番号付与を軽鎖アミノ酸から開始し、重鎖アミノ酸へと継続した。
本実施例では、結合に重要である残基を示唆するモデルを試験する1つの方法を示す。また、本実施例からいくつかの変異抗体がもたらされる。131クローンの変異抗体は、単一残基の変異をmAb 131の重鎖や軽鎖に導入することで作成される。これらの変異体を分析して、点変異によって変化した側鎖が抗原への結合に及ぼす影響を明らかにした。
Accelrys(カリフォルニア州サンディエゴ)が販売するInsightIIモデリングパッケージと同じモデリング法によって、抗体13.1.2の可変領域の3次元構造モデルを作成した。このモデルは、下記の表18.1に示す可変領域配列から、既知のX線結晶構造をテンプレートに形成された。
実施例14のエピトープマッピング研究から、エピトープがmAb 13.2.1のパラトープに結合するために必要なアミノ酸は6残基からなるペプチドEEKKGN(配列番号127)の中に存在することが明らかにされた。したがって、この6残基ペプチドを13.1.2構造モデルのCDR領域と組み合わせて結合モデルを作成した。まず、ペプチドEEKKGN(配列番号127)のモデルを作成した。これは前記の方法と同様に行われたが、今回はProtein Data Bankで同定された1I8IのX線結晶構造をテンプレートとして使用した。次に、このペプチド構造を長い溝の中にマニュアル操作で置いて、初期複合体を形成した。InsightIIの結合モジュールを用いて立体配座空間および配向空間をモンテカルロ法で自動的に検索した。ファイ角、プシー角、およびカイ角に完全な回転自由度を与えることによってペプチドの立体配座に柔軟性を持たせた。結合の過程において、結合溝から5オングストローム以内にある残基は可動性を有したが、それ以外の抗体の残基は固定された。モンテカルロ検索によって発見された信頼性の高い配置にsimulated annealingおよびエネルギー最小化を行い、最終複合構造モデルを得た。得られた各結合モデルで、InsightIIパッケージのDiscover_3モジュールを用いて抗体とペプチドとの相互作用エネルギーを算出した。全結合モデルの相互作用エネルギーを評価し、全体的な抗体-ペプチドの相互作用がもっとも強いモデルを検討した。これらの相互作用エネルギーを図19Aおよび図19Bに示す。
本実施例では、部位特異的変異導入法によって抗体の親和性を改善する合理的デザインの基礎として結合モデルがどのように利用できるかを示す。13.1.2パラトープの各残基をin silicoで他の19種のアミノ酸のそれぞれに変化させた。結果として、19×20、すなわち計380種の仮想変異体が形成された。残基の置換後に50段階からなるエネルギー最小化を行って変異を起こし、側鎖の変化によって局所立体配座の変化を誘発した。ペプチド全体とパラトープ全体との相互作用エネルギーを各変異体で算出した。全体の相互作用エネルギーが野生型の13.1.2よりも高い変異体は、ペプチドEEKKGN(配列番号127)に対してより強い親和性を秘め、EGFRvIII蛋白質全体に対しても強い親和性を有する可能性があると考えられた。これらの変異体の大半は野生型の13.1.2よりもクーロン相互作用が強かったが、ファンデルワールス(VdW)相互作用は野生型抗体よりも弱い変異体もあった。野生型抗体13.1.2のVdW相互作用エネルギーは-9.689kcal/molであることを考慮して、VdW相互作用エネルギーが-8.5kcal/molよりも低い変異体は除外した。相互作用エネルギーの総和が野生型13.1.2よりも高い残りの変異体を表20.1に列挙する。比較用に、野生型のデータを最下段に記載する。エネルギーの単位はすべてkcal/molとする。
本実施例では、結合に重要な残基を示唆する前記モデルを検証する1つの方法を示す。また、本実施例によっていくつかの変異抗体がもたらされる。13.1.2の変異抗体は、13.1.2 mAbの重鎖や軽鎖に単一残基の変異を導入することで作成される。これらの変異体を分析して、種々の側鎖が抗原との結合に及ぼす影響を明らかにした。部位特異的変異導入法によって誘発された一連の変異を表21.1にまとめる。
本実施例では、EGFRvIII変異体の作成法を示す。EGFRvIIIの細胞外領域をコードする1092塩基対の断片を、9712と9713のプライマー対(Qiagen、カリフォルニア州バレンシア)
プライマー#9712:5'-ataaaagcttctggaggaaaagaaaggtaatta-3'(センス)(配列番号128)
プライマー#9713:5'-TTATTGGTACCTCAGGCGATGGACGGGATCTTA-3'(アンチセンス)(配列番号129)
を用いて、Pfu DNAポリメラーゼ酵素(Stratagene、カリフォルニア州ラホイヤ)で増幅したプラスミドテンプレートEGFRvIII-rbIgG/pCEP4(前記のとおり)から作成した。プライマー#9712をHindIII部位に、プライマー#9713をKpnI部位に導入した。PCR産物をカラム(Qiagenカラム精製キット、カリフォルニア州バレンシア)にかけて精製し、HindIIIおよびKpnI(NEB、New England Biolabs、マサチューセッツ州ベバリー)で消化し、ゲル精製(Qiagenゲル精製キット、カリフォルニア州バレンシア)した。T4 DNAリガーゼ(NEB、New England Biolabs、マサチューセッツ州ベバリー)で断片とpFLAG-CMV-1(Sigma、ミズーリ州セントルイス)のライゲーションを行い、HindIIIおよびKpnI(NEB、New England Biolabs、マサチューセッツ州ベバリー)で直鎖化した。得られたベクターをEGFRvIII/pFLAG-CMV-1#1と名付けた。
本実施例では、EGFRvIII蛋白質変異体の作成法を示す。まず、500μgのEGFRvIII/pFLAG-CMV-1#1プラスミドDNAを25mlのOpti-MEMI(Invitrogen、オンタリオ州バーリントン)に再懸濁し、25mlのOpti-MEMIに再懸濁した500μlの293fectin(Invitrogen、オンタリオ州バーリントン)と合わせた。混合物を室温で20分間反応させてから、2%のFBSと50μg/mlのG418(Invitrogen、オンタリオ州バーリントン)を含む1Lの293FreeStyle培地(Invitrogen、オンタリオ州バーリントン)に調製した293T細胞(1×109)と混ぜ合わせた。細胞を、8%CO2下37℃で7日間、125rpmで震盪しながら培養した。
以下の実施例には、Biacore実験(表面プラズモン共鳴)およびKinExA実験が含まれる。これらの実施例では、前記実施例で産生された種々の抗体およびその変異体が期待どおりの結合特性を有することを明らかにするための試験法について示す。対象となった変異体はすべて13.1.2を背景に有するものであった。
表面プラズモン共鳴実験はすべてBiacore 2000光学バイオセンサー(Biacore,Inc.、ニュージャージー州ピスカタウェイ)を使用して行った。結合平衡除外法はすべてKinExA 3000(Sapidyne Instruments,Inc.、アイダホ州ボイシ)を使用して行った。
Pep-3のNH2-LEEKKGNYVVTDHG-OH(分子量1590Da)(配列番号130)の合成は外注にして、Anatech,Inc.(カリフォルニア州サンノゼ)から購入した。mAbはすべて社内で調製した。分子量39,907の抗原EGFRvIIIpflag(遊離SH基を介した凝集を阻害するためにヨード酢酸と反応させた)も社内で調製した。ウシ血清アルブミン(BSA)フラクションV(#BP1605-100)はFisher Scientific(ペンシルバニア州ピッツバーグ)から購入した。その他の一般的な試薬はすべてSigma-Aldrich,Inc(ミズーリ州セントルイス)から購入した。
標準EDC/NHSおよび炭水化物カップリングを用いて、mAbを共有結合でCM5 センサーチップに固定化した。質量の移動と密集を最低限に抑えるために、最大抗原結合反応(Rmax)が50〜100RUを超えないような濃度でmAbを固定化した。対照として使用する各チップの対照フローセルでは、活性化や阻害をmAbなしで行った。
KinExA実験はすべて室温で行った(約23℃)。すべての平衡実験において、抗原を連続的に希釈してmAb結合部位濃度が一定の溶液を作成した。最初の10の滴定点までは2倍希釈を行い、11番目と12番目の連続する希釈は10倍希釈とした。すべての実験で、試料の流速は0.25mL/分、標識抗体の流速は0.5mL/分とした。次に、抗原/抗体試料が平衡に達するようにした。これには約48〜72時間を要した。pep-3/mAb 131 KinExA実験では、KD制御滴定におけるpep-3の開始濃度は352nM、定数[mAb結合部位]=219pMとした。mAb制御滴定では、開始時[pep-3]は251nM、[mAb結合部位]は11nMとした。pep-3/mAb 131を用いたKD制御実験では、各試料1.25mLをフローセルから採取した。250μLの試料を抗体制御実験で分析した。すべての平衡実験で、試料ごとに2、3回反復して測定を行った。KinExAソフトウェア(バージョン2.4、Sapidyne Instruments)を用いたところ、平衡滴定データは二重曲線分析において1:1結合モデルに適合した。
野生型mAb 131の結合キネティクスを、Biacoreの表面プラズモン共鳴(SPR)装置を用いて観察した。KDは380pMと著明な低値であり、これはきわめて緩徐なkdと急速なkaに起因していた。曲線のあてはめに基づく他のキネティクスパラメーターの推定値は、ka=2.246x106、kd=8.502x10-4であった。
実施例24と同様に、Pep-3(EGFRvIIIエピトープ)に対するmAb 13.1.2の結合キネティクスを検討した。推定KDは67nMであったが、実験ごとに若干の違いがみられた。曲線をあてはめて他のキネティクスパラメーターの推定値を導き出したところ、ka=2.835x105、kd=0.01922であった。
実施例24と同様に、Pep-3(EGFRvIIIエピトープ)に対するmAb 095の結合キネティクスを検討した。推定KDは66nMであった。曲線をあてはめてキネティクスパラメーターの推定値を導き出したところ、ka=1.491x105、kd=9.927x10-3であった。
実施例24と同様に、Pep-3(EGFRvIIIエピトープ)に対するmAb 139の結合キネティクスを検討した。推定KDは290nMであった。曲線をあてはめてキネティクスパラメーターの推定値を導き出したところ、ka=10328、kd=2.981x10-3であった。
抗体の結合特性をさらに完全に分析するために、KinExA実験を実施してmAb 131の結合特性を明らかにした。二重曲線分析から導き出したKDは1.74x10-10であった。KinExA実験では、mAb 131に対するEGFRvIIIpflagのKDは6.266x10-11であった。
13.1.2抗体の結合特性をさらに完全に分析するために、KinExA実験を実施してmAb 13.1.2の結合特性を明らかにした。二重曲線分析から導き出したKDは7.538x10-10であった。また、本実施例の抗原はEGFRvIIIpflagの変異体であり、ヨード酢酸(IAA)と相互作用を起こした。
前記の実施例およびKinExA試験の結果を下記の表30.1に示す。表30.1の括弧内の数字は95%信頼区間である。「ND」は未測定を意味し、「*」はpep-3ではなく(ヨード酢酸と反応した)EGFRvIIIpflagとの結合であることを表す。
Pep-3(EGFRvIIIエピトープ)に対するmAb L99T-5.3の結合キネティクスを検討した。最初の段階として、標準EDC/NHSカップリング反応を用いて、5,600共鳴単位(RU)から8,000RUのmAb L99T-5.3をCM5センサーチップの2つのフローセル(Fc)に固定化し、5,600共鳴単位(RU)から8,000RUのmAb 13.1.2を1つのFcに固定化した。この表面密度によって生じたpep-3との結合シグナルは100RU未満であった。合わせて2つのCM5センサーチップを用いて両方のmAbを固定化した。これと過去に収集したデータとを合わせると、それぞれの抗体に対して計5回の独立した実験が行われ、95%信頼区間が算出された。すべての試験でBiacore 2000光学バイオセンサーを使用した。
実施例32〜38では、Biacore装置を用いて変異mAbの結合キネティクスについてさらに検討した。これらの実施例の第1段階として、5,600共鳴単位(RU)から8,000RUの対象mAbをCM5センサーチップのフローセル(Fc)1つに標準EDC/NHSカップリング反応を用いてそれぞれ固定化した。この表面密度によって生じたpep-3との結合シグナルは100RU未満であった。各フローセルに特有のmAbを固定化して、計3つのCM5センサーチップですべての変異mAbを固定化した。3つのセンサーチップのうち2つでは、1つのフローセルにmAb 13.1.2が含まれていた。すべての試験でBiacore 2000光学バイオセンサーを使用した。
mAb L217Q-10.1のPep-3(EGFRvIIIエピトープ)に対する結合キネティクスを検討した。推定KDは92nMであった。曲線をあてはめて導き出した他のキネティクスパラメーターの推定値は、ka=2.04x105、kd=0.01885であった。
実施例32と同様に、mAb L217N-2.1のPep-3(EGFRvIIIエピトープ)に対する結合キネティクスを検討した。推定KDは185nMであった。曲線をあてはめて導き出した他のキネティクスパラメーターの推定値は、ka=2.198x105、kd=0.04069であった。
実施例32と同様に、mAb N35G-3.1のPep-3(EGFRvIIIエピトープ)に対する結合キネティクスを検討した。推定KDは204nMであった。曲線をあてはめて導き出した他のキネティクスパラメーターの推定値は、ka=1.497x105、kd=0.03057であった。
実施例32と同様に、mAb L99H-9.2のPep-3(EGFRvIIIエピトープ)に対する結合キネティクスを検討した。推定KDは395nMであった。曲線をあてはめて導き出した他のキネティクスパラメーターの推定値は、ka=83390、kd=0.03293であった。
実施例32と同様に、mAb Y172R-1.2のPep-3(EGFRvIIIエピトープ)に対する結合キネティクスを検討した。推定KDは927nMであった。曲線をあてはめて導き出した他のキネティクスパラメーターの推定値は、ka=82237、kd=0.07622であった。
実施例32と同様に、mAb L99N-4.1のPep-3(EGFRvIIIエピトープ)に対する結合キネティクスを検討した。推定KDは1.4μMであった。キネティクスが速すぎて適合しなかったので、KDの測定には定常状態(平衡)結合モデルを使用してmAb L99N-4.1を適合させた。
表38.1に示すように、結合特性の向上したmAbが開発された。95%信頼区間を括弧内に記す。L99T-5.3ではkaが増加してkdが減少しており、したがって全体のKDは小さくなった。13.1.2およびL99T-5.3に対するPep-3の結合については、平衡解離定数および複合体形成速度定数の統計学的有意差(95%信頼区間で比較)は存在してもごく小さいが、L99T-5.3に対するPep-3の結合の方がわずかに親和性の高くなるような自然なバイアスが存在すると見受けられる。また、同じバイオセンサーチップを用いた場合は、L99T-5.3の方が13.1.2よりも常に高い親和性を示すと考えられた。
他の実施形態では、ちょうど6アミノ酸長のペプチドだけではなく多様な長さのペプチドに前記実施例を使用でき、これは不可欠な結合残基がペプチドに含まれている限り実施可能である。例えば、6アミノ酸のペプチドEEKKGN(配列番号127)の代わりに7アミノ酸のペプチドEEKKGNY(配列番号131)を使用することができる。エピトープとしてどのような大きさのペプチドも使用できる。他の実施形態では、LEEKKGNYVVTDHC(配列番号56)、LEEKKGNYVVTD(配列番号59)、LEEKKGNYVVT(配列番号132)、およびEEKKGNYVVT(配列番号57)の中からペプチドを選択した。ここで開示された短い断片から全長のペプチドやその変異体まで、あらゆる大きさのペプチドが使用可能である。
本実施例は、13.1.2構造モデルのCDR領域に複合させた7残基ペプチドに対する1組の結合モデルの作成について示す。また、本実施例では1つの結合モデルを他の結合モデルの中から選別する方法を示す。
多数の異なる研究で、in vitroでの抗体の親和性成熟が成功している。一般的には、分子生物学的手法で無作為化変異体ライブラリーを作成する必要があり、そして、優れた結合能を有するクローンを増幅するために、選択/スクリーニング法を開発する必要がある。次に、選択された変異体を精製して親和性を測定しなければならない。この過程では、長く面倒な一連の実験が要求される。以下の実施例は、抗体-抗原複合体構造のみを利用してin silicoでの選択によって親和性成熟の正確な予測が可能であることを示す。
本実施例では、in silicoの抗体-抗原結合エネルギー特性シミュレーションが親和性成熟に使用できることを示す。特に、本実施例では、Fab-12(rhuMab VEGFとして知られるIgG型)のVEGF(血管内皮成長因子)に対する結合キネティクスが前記のin silicoの過程を通じて予測できることを示す。
Chothiaらは、各免疫グロブリン鎖の超可変領域の「標準クラス」という点から抗体構造を記述している(J.Mol.Biol.1987年8月20日;196(4):901〜17)。種々の免疫グロブリンのFabおよびVL断端の原子構造を分析して、抗原結合部位のアミノ酸配列と3次元構造との関連を明らかにした。Chothiaらは、パッキング、水素結合、または独特のφ立体配座、ψ立体配座、あるいはω立体配座をとる能力を介して超可変領域の主鎖立体配座に主として責任を負う残基はあまりないことを発見した。これらの残基は、超可変領域内や保存されたβシートの枠組みの中に生じることが知られている。構造が明らかにされていない免疫グロブリンの配列を検討することによって、Chothiaらは、多くの免疫グロブリンの超過変領域は構造が既知の抗体のそれと大きさが類似していることを示した。さらに、観察された立体配座に責任を負う部位に相同の残基が含まれることも示している。
上記の記述および実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態を詳述したものであり、発明者が意図した最良の方法が説明されている。しかし、前記が文中で詳細に記述されているように見受けられたとしても、本発明の実施方法は多様であり、本発明は添付の請求項およびその均等物に従って解釈されなければならない。
Claims (19)
- 重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含む単離したヒトモノクローナル抗体であって、毒素と結合している抗体であり、
前記重鎖ポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖ポリペプチドが、配列番号19のアミノ酸配列を含み、または前記重鎖ポリペプチドが、配列番号142のアミノ酸配列を含み、かつ前記軽鎖ポリペプチドが、配列番号144のアミノ酸配列を含み、
EEKKGNYVVT(配列番号94)を含むペプチドに特異的に結合する、抗体。 - 前記重鎖ポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ポリペプチドが、配列番号19のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の単離したヒトモノクローナル抗体。
- 前記重鎖ポリペプチドが、配列番号142のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖ポリペプチドが、配列番号144のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の単離したヒトモノクローナル抗体。
- 重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含む単離したヒトモノクローナル抗体であって、DM1と結合している抗体であり、
前記重鎖ポリペプチドが、配列番号2のアミノ酸配列を含み、
前記軽鎖ポリペプチドが、配列番号19のアミノ酸配列を含み、
EEKKGNYVVT(配列番号94)を含むペプチドに特異的に結合する、抗体。 - 重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含む単離したヒトモノクローナル抗体であって、DM1と結合している抗体であり、
前記重鎖ポリペプチドが、配列番号142のアミノ酸配列を含み、
前記軽鎖ポリペプチドが、配列番号144のアミノ酸配列を含み、
EEKKGNYVVT(配列番号94)を含むペプチドに特異的に結合する、抗体。 - 前記毒素が、メイタンシノイド(DM-1)およびサポリンからなる群から選択される、請求項1から3のいずれか一項に記載の単離したヒトモノクローナル抗体。
- 前記毒素が、メイタンシノイド(DM-1)を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の単離したヒトモノクローナル抗体。
- 前記毒素が、サポリンを含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の単離したヒトモノクローナル抗体。
- 標的細胞をin vitroで殺傷する方法であって、
標的細胞を請求項1から8のいずれか一項に記載の少なくとも1つの抗体と接触させることを含む、方法。 - 前記毒素と結合した抗体が、前記ペプチドを発現しない細胞に対してよりも前記標的細胞に対して少なくとも10倍毒性がある、請求項9に記載の方法。
- 前記抗体が、ペプチドリンカーによって毒素と結合している、請求項9に記載の方法。
- 前記抗体が、二次抗体によって毒素と結合している、請求項9に記載の方法。
- 上皮成長因子受容体vIII(EGFRvIII)を発現する癌細胞の治療のための医薬の調製における、請求項1から8のいずれか一項に記載の少なくとも1つの抗体の使用。
- 前記癌細胞が上皮細胞である、請求項13に記載の使用。
- 前記癌細胞が肺、結腸、胃、腎臓、前立腺、胸部、膠芽細胞または卵巣癌細胞からなる群から選択される、請求項13に記載の使用。
- 前記癌細胞が膠芽細胞である、請求項15に記載の使用。
- 請求項1から8のいずれか一項に記載の抗体、および薬剤として許容可能な担体または希釈剤を含む組成物。
- 請求項1から8のいずれか一項に記載の単離したヒトモノクローナル抗体からなる癌治療剤。
- 前記治療が膠芽細胞腫のための治療である、請求項18に記載の癌治療剤。
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