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JP4885452B2 - 細菌性組成物及びその使用 - Google Patents

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Description

本発明の主題は、Lactobacillus acidophilus PTA-4797、Lactobacillus plantarum PTA-4799、Lactobacillus salivarius PTA-4800、Lactobacillus paracasei PTA-4798、Bifidobacterium bifidum PTA-4801、Bifidobacterium lactis PTA-4802、及びBifidobacterium lactis PTA-5658からなる群から選択される少なくとも一つの株を含む、免疫変調特性を有する細菌性組成物である。
本発明の他の主題は、前述の群から選択される少なくとも一つの株を使用する工程を含む免疫変調方法である。
本発明の主題は、免疫変調特性を有する細菌性組成物、媒体に免疫変調特性を提供するための免疫変調方法、及びこの組成物の使用である。免疫変調とは、健常者または病的状態のいずれかにおいて、グローバルな免疫機能を改善する能力である。
細菌の中では、あるもの、特に乳酸細菌及び腸内細菌は、腸内媒体の免疫系にポジティブな影響を有し、「プロバイオティック」細菌または株と称される。
用語「プロバイオティック細菌または株」は、生きたまま摂取された場合に、腸内フローラのバランス及び／または腸内免疫系に対して作用を与えることによって、宿主に有益な効果を発揮する株を意味すると解される。これらのプロバイオティック株は、生きたまま消化管の上部を通過する能力を有する。それらは非病原性で非毒性であり、一方で消化管の現住フローラとのエコロジカルな相互作用を通じて健康に有益な作用を発揮し、他方でＧＡＬＴ（消化管関連免疫組織）に対する効果を通じて免疫系にポジティブに影響する能力を発揮する。プロバイオティックの定義によれば、それらの細菌が十分な数で与えられた場合、消化管に沿って全て生きたまま移動する能力を有する。それらは投与期間の間で現住フローラの一部となる。コロニー形成（または一過的コロニー形成）と称されるものは、フローラの潜在的な病原性微生物の抑制及び消化管免疫系との相互作用のような有益な効果を、プロバイオティック細菌に発揮させる。
特に乳製品において最も広く使用されているプロバイオティック株は、主に以下の属：Lactobacillus属、Streptococcus属、Enterococcus属、及びBifidobacterium属、及びSacharomyces属の細菌及び酵母である。
当該細菌について報告されたプロバイオティック効果の中では、例えばラクトース耐性の改善、胃腸感染及び泌尿生殖器感染の予防及び／または治療、ある種のガンの減少、血中コレステロールの減少などが引用できる。しかしながら、前述の属から由来する全ての個々の株が当該効果を有するわけではなく、注意深く選択されたいくつかのもののみが有するに過ぎないことが強調されるべきである。
かくして、能力のあるプロバイオティック株に対する必要性を満たすために、有効な免疫系の刺激（免疫変調）が可能である株またはその混合物を選択することが必要になっている。
従って、本発明が解決しようとする課題は、プロバイオティック特性を有する細菌性組成物を提供することである。
本発明の目的は、これらの必要性を満たすことである。
この目的のために、本発明は、Lactobacillus acidophilus PTA-4797、Lactobacillus plantarum PTA-4799、Lactobacillus salivarius PTA-4800、Lactobacillus paracasei PTA-4798、Bifidobacterium bifidum PTA-4801、Bifidobacterium lactis PTA-4802、及びBifidobacterium lactis PTA-5658からなる群から選択される少なくとも一つの株を含む、免疫変調特性を有する細菌性組成物を提供する。
本発明の主題はまた、前述の細菌性組成物を含む食品または製薬組成物である。
本発明の別の主題は、媒体に免疫変調特性を提供するための方法である。
本発明の別の主題は、胃腸系における治療または予防目的のためヒトまたは動物に投与されるキャリアの調製におけるこの組成物の使用である。
本発明の組成物は、利用可能な株の範囲を富化する疑義のない価値を提供する利点を有する。
そのような組成物は、胃腸系において、特に炎症性及び／またはアレルギー性反応の減少において、治療または予防目的のためヒトまたは動物に投与される場合、特に有利である。
本発明の利点はまた、制約的に許容可能なキャリア内にまたは食料品内にとりこめられた場合に、全てのその特性を保存することである。
本発明の他の利点及び特徴は、以下の記載及び実施例を読むことでより明確に把握されるであろうが、それらは純粋に説明の目的のため与えられ、本発明を制限するものではない。
先ず第一に、本発明の主題は、Lactobacillus acidophilus PTA-4797、Lactobacillus plantarum PTA-4799、Lactobacillus salivarius PTA-4800、Lactobacillus paracasei PTA-4798、Bifidobacterium bifidum PTA-4801、Bifidobacterium lactis PTA-4802、及びBifidobacterium lactis PTA-5658からなる群から選択される少なくとも一つの株を含む、免疫変調特性を有する細菌性組成物である。
本発明によって使用されるLactobacillus acidophilusはグラム陽性株である。有利にはそれはカタラーゼ陰性株であり、乳酸の生産を生ずるホモ発酵性代謝を有する。
本発明によって使用されるLactobacillus acidophilusはまた、バクテリオシン、ラクタシンを生産して良く、それは他の微生物に対して活性である。
好ましくはそれは、酸性ｐＨ条件の下でペプシンに対して良好な耐性を示すLactobacillus acidophilusである（前記細菌の少なくとも約73％が処理の40分後にいまだ生存する）。
とりわけ本発明によって使用されるLactobacillus acidophilusは、パンクレアチンに対する非常に良好な耐性を示す（前記細菌の少なくとも100％が処理の40分後にいまだ生存する）。
有利には本発明によって使用されるLactobacillus acidophilusは、胆汁酸塩に対して良好な耐性を示す。
好ましくは、「疎水性」である、即ち極性または無極性の疎水性有機溶媒、例えばn-デカン、クロロホルム、ヘキサデカン、またはキシレンに対して高親和性を示すと記載されるLactobacillus acidophilusが使用されるであろう。
本発明によって使用されるLactobacillus acidophilusは、サイトカインの生産を誘導できる。このサイトカインの誘導の検出は、単離抹消血単核細胞（PBMC)）のin vitroの刺激についての試験によって実施された。この試験の過程で誘導されたサイトカインの中では、インターロイキン10（IL10）、γ-インターフェロン（γ-IFN）、及び主要壊死因子α（TNFα）が挙げられる。他方で、本発明によって使用されるLactobacillus acidophilusは、この同じ試験を使用して、インターロイキン12（IL12）はほとんど全く分泌を誘導しない。
本発明によって使用されるLactobacillus acidophilusは、Lactobacillus acidophilus PTA-4797である。このLactobacillus acidophilus株は、ブタペスト条約に従って、American Type Culture Collectionに寄託されており、受託番号PTA-4797と記録されている。
本発明に係る組成物の一つの実施態様は、Lactobacillus acidophilus PTA-4797を含む細菌性組成物である。
本発明に係るプロバイオティック細菌からなる組成物はまた、少なくとも一つのLactobacillus plantarum株を含む。
本発明によって使用されるLactobacillus plantarum株は好ましくはグラム陽性株である。有利にはそれはカタラーゼ陰性株であり、乳酸の生産を生ずるホモ発酵性代謝を有する。
好ましくはそれは、酸性ｐＨ条件の下でペプシンに対して良好な耐性を示すLactobacillus plantarumである（前記細菌の少なくとも約95％が処理の40分後にいまだ生存する）。
とりわけ本発明によって使用されるLactobacillus plantarumは、パンクレアチンに対する非常に良好な耐性を示す（前記細菌の少なくとも79％が処理の40分後にいまだ生存する）。
有利には本発明によって使用されるLactobacillus plantarumは、胆汁酸塩に対して良好な耐性を示す。
本発明によって使用されるLactobacillus plantarumは、サイトカインの生産を誘導できる。このサイトカインの誘導の検出は、単離抹消血単核細胞（PBMC)）のin vitroの刺激についての試験によって実施された。この試験の過程で誘導されたサイトカインの中では、インターロイキン10（IL10）、γ-インターフェロン（γ-IFN）、及び主要壊死因子α（TNFα）が挙げられる。他方で、本発明によって使用されるLactobacillus plantarumは、この同じ試験を使用して、インターロイキン12（IL12）はほとんど全く分泌を誘導しない。
本発明によって使用されるLactobacillus plantarumは、Lactobacillus plantarum PTA-4799である。このLactobacillus plantarum株は、ブタペスト条約に従って、American Type Culture Collectionに寄託されており、受託番号PTA-4799と記録されている。
本発明に係る組成物の一つの実施態様は、Lactobacillus plantarum PTA-4799を含む細菌性組成物である。
本発明に係るプロバイオティック細菌からなる組成物はまた、少なくとも一つのLactobacillus salivarius株を含んでも良い。
本発明によって使用されるLactobacillus salivarius株は好ましくはグラム陽性株である。有利にはそれはカタラーゼ陰性株であり、乳酸の生産を生ずるホモ発酵性代謝を有する。
とりわけ本発明によって使用されるLactobacillus salivariusは、パンクレアチンに対する非常に良好な耐性を示す（前記細菌の少なくとも100％が処理の40分後にいまだ生存する）。
有利には本発明によって使用されるLactobacillus salivariusは、胆汁酸塩に対して良好な耐性を示す。
本発明によって使用されるLactobacillus salivariusは、サイトカインの生産を誘導できる。このサイトカインの誘導の検出は、単離抹消血単核細胞（PBMC)）のin vitroの刺激についての試験によって実施された。この試験の過程で誘導されたサイトカインの中では、インターロイキン10（IL10）、及び主要壊死因子α（TNFα）が挙げられる。他方で、本発明によって使用されるLactobacillus salivariusは、この同じ試験を使用して、インターロイキン12（IL12）、及びγ-インターフェロン（γ-IFN）はほとんど全く分泌を誘導しない。
本発明によって使用されるLactobacillus salivariusは、Lactobacillus salivarius PTA-4800である。このLactobacillus salivarius株は、ブタペスト条約に従って、American Type Culture Collectionに寄託されており、受託番号PTA-4800と記録されている。
本発明に係る組成物の一つの実施態様は、Lactobacillus salivarius PTA-4800を含む細菌性組成物である。
本発明に係るプロバイオティック細菌からなる組成物はまた、少なくとも一つのLactobacillus paracasei株を含んでも良い。
本発明によって使用されるLactobacillus paracasei株は好ましくはグラム陽性株である。有利にはそれはカタラーゼ陰性株であり、乳酸の生産を生ずるホモ発酵性代謝を有する。
好ましくはそれは、酸性ｐＨ条件の下でペプシンに対して微弱な耐性を示すLactobacillus paracaseiである（前記細菌の少なくとも約17.5％が処理の40分後にいまだ生存する）。
とりわけ本発明によって使用されるLactobacillus paracaseiは、パンクレアチンに対する非常に良好な耐性を示す（前記細菌の少なくとも100％が処理の40分後にいまだ生存する）。
有利には本発明によって使用されるLactobacillus paracaseiは、胆汁酸塩に対して良好な耐性を示す。
本発明によって使用されるLactobacillus paracaseiは、サイトカインの生産を誘導できる。このサイトカインの誘導の検出は、単離抹消血単核細胞（PBMC)）のin vitroの刺激についての試験によって実施された。この試験の過程で誘導されたサイトカインの中では、インターロイキン10（IL10）、γ-インターフェロン（γ-IFN）、及び主要壊死因子α（TNFα）が挙げられる。他方で、本発明によって使用されるLactobacillus paracaseiは、この同じ試験を使用して、インターロイキン12（IL12）はほとんど全く分泌を誘導しない。
本発明によって使用されるLactobacillus paracaseiは、Lactobacillus paracasei PTA-4798である。このLactobacillus paracasei株は、ブタペスト条約に従って、American Type Culture Collectionに寄託されており、受託番号PTA-4798と記録されている。
本発明に係る組成物の一つの実施態様は、Lactobacillus paracasei PTA-4798を含む細菌性組成物である。
本発明に係るプロバイオティック細菌からなる組成物はまた、少なくとも一つのBifidobacterium bifidum株を含んでも良い。
本発明によって使用されるBifidobacterium bifidum株は好ましくはグラム陽性株である。有利にはそれはカタラーゼ陰性株であり、乳酸と酢酸の生産を生ずるヘテロ発酵性代謝を有する。
本発明によって使用されるBifidobacterium bifidumは、サイトカインの生産を誘導できる。このサイトカインの誘導の検出は、単離抹消血単核細胞（PBMC)）のin vitroの刺激についての試験によって実施された。この試験の過程で誘導されたサイトカインの中では、インターロイキン10（IL10）、γ-インターフェロン（γ-IFN）、及び主要壊死因子α（TNFα）が挙げられる。他方で、本発明によって使用されるBifidobacterium bifidumは、この同じ試験を使用して、インターロイキン12（IL12）はほとんど全く分泌を誘導しない。
本発明によって使用されるBifidobacterium bifidumは、Bifidobacterium bifidum PTA-4801である。このBifidobacterium bifidum株は、ブタペスト条約に従って、American Type Culture Collectionに寄託されており、受託番号PTA-4801と記録されている。
本発明に係る組成物の一つの実施態様は、Bifidobacterium bifidum PTA-4801を含む細菌性組成物である。
本発明に係るプロバイオティック細菌からなる組成物はまた、少なくとも一つのBifidobacterium lactis株を含んでも良い。
本発明によって使用されるBifidobacterium lactis株は好ましくはグラム陽性株である。有利にはそれはカタラーゼ陰性株であり、乳酸と酢酸の生産を生ずるヘテロ発酵性代謝を有する。
本発明によって使用されるBifidobacterium lactisは、サイトカインの生産を誘導できる。このサイトカインの誘導の検出は、単離抹消血単核細胞（PBMC)）のin vitroの刺激についての試験によって実施された。この試験の過程で誘導されたサイトカインの中では、インターロイキン10（IL10）、γ-インターフェロン（γ-IFN）、及び主要壊死因子α（TNFα）が挙げられる。他方で、本発明によって使用されるBifidobacterium lactisは、この同じ試験を使用して、インターロイキン12（IL12）はほとんど全く分泌を誘導しない。
本発明によって使用されるBifidobacterium lactisは、Bifidobacterium lactis PTA-4802またはBifidobacterium lactis PTA-5658である。Bifidobacterium lactis PTA-4802株は、ブタペスト条約に従って、American Type Culture Collectionに寄託されており、受託番号PTA-4802と記録されている。
Bifidobacterium lactis PTA-5658株は、ブタペスト条約に従って、American Type Culture Collectionに寄託されており、受託番号PTA-5658と記録されている。
本発明に係る組成物の一つの実施態様は、Bifidobacterium lactis PTA-4802を含む細菌性組成物である。
本発明に係る組成物の一つの実施態様は、Bifidobacterium lactis PTA-5658を含む細菌性組成物である。
本発明に係る組成物の別の実施態様は、Lactobacillus acidophilus PTA-4797、Lactobacillus plantarum PTA-4799、Bifidobacterium lactis PTA-4802からなる群から選択される少なくとも一つの株を含む、免疫変調特性を有する細菌性組成物である。
とりわけ本発明に係る組成物は、Lactobacillus acidophilus PTA-4797、Lactobacillus plantarum PTA-4799、Lactobacillus salivarius PTA-4800、Lactobacillus paracasei PTA-4798、Bifidobacterium bifidum PTA-4801、Bifidobacterium lactis PTA-4802、及びBifidobacterium lactis PTA-5658からなる群から選択される少なくとも二つの株を含んでも良い。
とりわけ本発明に係る組成物は、Lactobacillus acidophilus PTA-4797、Lactobacillus plantarum PTA-4799、Lactobacillus salivarius PTA-4800、Lactobacillus paracasei PTA-4798、Bifidobacterium bifidum PTA-4801、Bifidobacterium lactis PTA-4802、及びBifidobacterium lactis PTA-5658からなる群から選択される三つの株を含んでも良い。
とりわけ本発明に係る組成物は、Bifidobacterium bifidum PTA-4801、Bifidobacterium lactis PTA-4802、及びBifidobacterium lactis PTA-5658から選択されるBifidobacterium属の株と、Lactobacillus salivarius PTA-4800との混合物を含んでも良い。
とりわけ本発明に係る組成物は、Bifidobacterium bifidum PTA-4801、Bifidobacterium lactis PTA-4802、及びBifidobacterium lactis PTA-5658から選択されるBifidobacterium属の株と、Lactobacillus acidophilus PTA-4797との混合物を好ましくは含んでも良い。
とりわけ本発明に係る組成物は、Bifidobacterium bifidum PTA-4801、Bifidobacterium lactis PTA-4802、及びBifidobacterium lactis PTA-5658から選択されるBifidobacterium属の株と、Lactobacillus plantarum PTA-4799との混合物を好ましくは含んでも良い。
好ましくは本発明に係る組成物は、Lactobacillus acidophilus PTA-4797、Lactobacillus plantarum PTA-4799、Lactobacillus salivarius PTA-4800、Lactobacillus paracasei PTA-4798、Bifidobacterium bifidum PTA-4801、Bifidobacterium lactis PTA-4802、及びBifidobacterium lactis PTA-5658の混合物を含んで良い。
本発明に係る組成物は、凍結した前後の細菌懸濁物の形態で、または凍結乾燥パウダーの形態で使用しても良い。実際に、使用される形態に関わらず、前記組成物は凍結されて良い。
前記組成物中の各細菌の相対割合は、例えば少なくとも２の株が存在する場合、99/1から1/99まで制限されることなく変化できる。
本発明に係る組成物は、106から1011CFUの細菌／ｇ組成物、とりわけ108から1011CFUの細菌／ｇ組成物を含んでも良い。用語「CFU」は「コロニー形成単位」を意味する。用語「ｇ組成物」は、食料品または製薬調製物を意味するように解され、凍結乾燥形態で存在するならば、好ましくは109から1011CFU／gを意味すように解される。
本発明に係る組成物は、治療、一次的な予防、または再発、特に炎症性腸疾患の予防及び／または減少のために有用である。
本発明に係る細菌性組成物は、免疫系のホメオスタシスを維持するのにも有用である。
本発明に係る細菌性組成物は、アレルギー発生の予防及び／または減少にも有用である。
本発明に係る細菌性組成物は、免疫アジュバントとしても有用である。
本発明の他の主題は、Lactobacillus acidophilus PTA-4797、Lactobacillus plantarum PTA-4799、Lactobacillus salivarius PTA-4800、Lactobacillus paracasei PTA-4798、Bifidobacterium bifidum PTA-4801、Bifidobacterium lactis PTA-4802、及びBifidobacterium lactis PTA-5658からなる群から選択される少なくとも一つの株を使用する工程を含む免疫変調方法である。
本発明に係る組成物は、食料品または医薬調製物の形態で使用されて良い。
用語「製薬調製物」は、例えばカプセルまたは錠剤の形態の調製物を意味するように解される。
本発明の主題はまた、前述の細菌性組成物を含む食料、食用サプリメント、または製薬組成物である。
好ましくは、本発明に係る組成物を含む食料組成物は、食料サプリメント、飲料品、またはミルクベースのパウダーである。
とりわけ、本発明に係る組成物を含む食料組成物は乳製品である。
より好ましくは、本発明に係る組成物を含む食料組成物は幼児用の製剤である。
本発明に係る食料または制約組成物は、免疫変調特性を有して良い。
本発明の別の主題は、胃腸系における治療または予防目的のための、ヒトまたは動物に投与されるキャリアの調製におけるこの組成物の使用である。
本発明はまた、炎症性腸疾患の予防に有用である、前述の細菌性組成物を含む製薬組成物を提供する。
本発明はまた、免疫変調に有用な前述の細菌性組成物を含む製薬組成物を提供する。
図１、３及び５は注射のスケジュールである。
図２、４、６、７及び８はWallaceスコアとAmehoスコア及び重量の損失である。
本発明の具体的であるが制限的ではない実施例が以下に記載されるであろう。
１／ＰＢＭＣ試験
ＰＢＭＣ（抹消血単核細胞）を、既知のドナーから由来したヒトの血液から遠心分離によって調製し、さらにFicoll勾配で精製する。細胞を回収し、洗浄し、(赤血球細胞を除去し)、計数する。
標準条件によって細菌を調製し、正確な希釈（リンガー溶液中で10-7、10-8、10-9）に従ってアガロース培地でのプレーティングにより計数する。
細胞を３回洗浄し、ＰＢＳバッファー中に懸濁する。
ＰＢＭＣ細胞を、適切なＣＯ２の条件下で細菌を用いて４８時間刺激する（ネガティブコントロールとしてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を使用する）。
サイトカイン発現レベルをＥＬＩＳＡ（「固相酵素免疫検定法」）によって測定する。ＥＬＩＳＡプレートを抗サイトカイン抗体で被覆し（一晩の処理）、抗体をtween 80のような界面活性剤でブロックする。
15,62から2000pg/mlの検出範囲をカバーする既知の濃度のサイトカインについて、正確なスタンダードを調製する（一晩のインキュベート）。抗サイトカイン検出及び定量を、基質に対するストレプタビジン反応で実施する（10mg dABTS／10mlのクエン酸バッファー0.1M、pH4,35／20μlのH2O2）。
サイトカインは、炎症前／Th1 TNFα、IFNγ、IL12)または炎症後(IL10)のそれぞれである。
Figure 0004885452
２／L. acidophillus PTA-4797、L. plantarum PTA-4799、L. salivarius PTA-4800、B. bifidum PTA-4801、B. lactis PTA-5658、またはB. lactis PTA-4802からなる各種の組成物の調製
２−１／Lactobacillus acidophilus PTA-4797、Lactobacillus plantarum PTA-4799、及びBifidobacterium lactis PTA-4802を含む３の株の混合物を調製する。この混合物をＬＡＢと称する。
化学的に誘導されたマウスの消化管炎症を減少させる目的で、in vivoでの本発明に係るこの混合物の免疫変調能力を示すための動物試験を実施した。いくつかの動物モデルをセットアップし、ヒトの炎症腸疾患のモデルとした。
第一のモデルでは、第０、７及び１４日目に１ｍｇ／マウスのＴＮＢＳ（大腸炎誘導試薬であるトリニトロベンゼンスルホン酸）と、第２０日目に２ｍｇ／マウスのＴＮＢＳの注射により、慢性大腸炎を誘導させる。注射のスケジュールが図１に示されている。第−４から−１、６、９、１３、及び１９日目での細菌（ＬＡＢ）の取り込みについて巨視的効果及び組織化学的効果を調べ、標準スコア（それぞれWallaceスコア及びAmehoスコア）に従って第２２日目に記録する。
得られた結果（図２参照）は、
− 粘膜の増大の減少
− 炎症の減少
− 体重の減少
によって評価した大腸の症状の改善を明らかに示した。
２−２／第二のモデルの慢性大腸炎もまた使用し(Camoglio等, Eur J Immunol 2000)、そこでは第０、７、及び１４日目での直腸内経路により、２ｍｇ／マウスのＴＮＢＳを注射した。投与のスケジュールは図３に示されている。第-５から−１、５、及び１２日目での細菌の取り込み（前述の２−１のＬＡＢ）について巨視的効果及び組織化学的効果を調べ、標準スコア（それぞれWallaceスコア及びAmehoスコア）に従って第１６日目に記録する。
得られた結果（図４参照）は、
− 壊死領域の不在
− 粘膜の増大の減少
− 炎症の減少
によって評価した大腸の症状の改善を明らかに示した。
２−３／第三の急性モデルのマウス大腸炎もセットアップした。第０日目に１００ｍｇ／ｋｇのＴＮＢＳを注射する。これは急性大腸炎を生ずる。注射のスケジュールが図５に示されている。第−５から０日目での別個の株または株の混合物の取り込み（１０８細菌／マウス）について巨視的効果及び組織化学的効果を調べ、第２日目に記録する（図６、７、８参照）。
図６は、Bifidobacterium lactis PTA-4802、またはLactobacillus acidophilus PTA-4797の、それぞれ明らかに巨視的に改良する株をマウスに注射した際に得られるWallaceスコアを示す。
急性大腸炎の症状の明白な巨視的改善が、個々の細菌株及び細菌の混合物について表される（図６）。
２−４／一般的に、マウスにおける全てのTNBS誘導大腸炎モデルは、これらのマウスに対する本発明に係る株の接種が、腸内フローラから腸間膜リンパ節及び脾臓へ、大腸炎の誘導の後に自生種の細菌の腸間移動のレベルを有意に減少したことを示す。さらに、本発明に係る細菌下部の移動は観察されなかった。
３／ペプシンに対する耐性
この試験の目的は、酸性環境におけるペプシン溶液の存在下での培養の後に生存する細菌の数を測定することによる、胃腸バリアの通過に対する細菌の耐性を評価することである。−８０℃で凍結した１００μlのストック培養物を、１０ｍｌのＭＲＳ(Man Rogosa Sharp)培養培地に植菌し、３０℃または３７℃で一晩インキュベートする。次いで細胞をｐＨ７でＰＢＳ中で３回洗浄し、ペレットを1ｍｌのＰＢＳバッファー中に懸濁し、３００μｌのＮａＣｌ（0.5％）を補ったｐＨ2の1ｍｌの濾過ペプシン溶液で4のチューブに２００μｌの等量で植菌する。Ｔ＝0（植菌時）、Ｔ＝0+5分；Ｔ＝0+20分；Ｔ＝0+40分；Ｔ＝0+60分でインキュベートしたチューブから採取した１００μｌの等量物で細胞カウントを実施し、１００μｌの10-5、10-6及び10-7の希釈物をグルコースに配置する（1ｍｌのリンガー溶液で作製された連続的な10倍の希釈物）。生存細胞のパーセンテージを、希釈シリーズの読み取りから各インキュベーション時間について計算する。
下の表に示された全ての結果は、三重の実験の結果である。
Figure 0004885452
４／パンクレアチンに対する耐性
この試験の目的は、酸性環境におけるパンクレアチン溶液の存在下での培養の後に生存する細菌の数を測定することによる、胃腸移動の通過に対する細菌の耐性を評価することである。略記すると、−８０℃で凍結した１００μlのストック培養物を、１０ｍｌのＭＲＳ(Man Rogosa Sharp)培養培地に植菌し、３０℃または３７℃で一晩インキュベートする。細胞をｐＨ７でＰＢＳ中で３回洗浄し、ペレットを1ｍｌのＰＢＳバッファー中に懸濁し、３００μｌのＮａＣｌ（0.5％）を補ったｐＨ8の1ｍｌの濾過パンクレアチン溶液で4のチューブに２００μｌの等量で植菌する。Ｔ＝0（植菌時）、Ｔ＝0+5分；Ｔ＝0+20分；Ｔ＝0+40分；Ｔ＝0+60分；Ｔ＝0+120分でインキュベートしたチューブから採取した１００μｌの等量物で細胞カウントを実施し、１００μｌの10-5、10-6及び10-7の希釈物をＭＲＳに配置する（1ｍｌのリンガー溶液で作製された連続的な10倍の希釈物）。生存細胞のパーセンテージを、希釈シリーズの読み取りから各インキュベーション時間について計算する。下の表に示された全ての結果は、三重の実験の結果である。
Figure 0004885452
４／胆汁酸塩に対する耐性
実験方法は以下の通りである。−８０℃で凍結した１００μlのストック培養物を、１０ｍｌのＭＲＳ(Man Rogosa Sharp)培養培地に植菌し、３０℃または３７℃で一晩インキュベートする。光学密度（ＯＤ）を測定し、希釈物を二つのボトルで調製する（ＯＤ＝0.05から0.1）、一方の培養ボトルに、0.3％の胆汁塩の溶液（濾過した12％の溶液750μｌ）を補い、正確な温度でインキュベートする。胆汁塩を含まないコントロールボトルにおいて0.3のＯＤに到達するまで、ＯＤを規則的に測定する。補ったボトルのＯＤを測定する時点で、同じ0.3のＯＤを得るのに必要な時間を測定し始める。それゆえ株の耐性は、生育時間の遅延として評価される。
感受性（０；６０分より大きい）、慣用（１；１５から６０分の間）、または耐性（２；１５分未満）として結果を記録する。下の表に示された全ての結果は、三重の実験の結果である。
Figure 0004885452
６／疎水性及び有機溶媒に対する親和性
Rosdenberg等, 1980 (FEMS Microbiol. Letters 9; 29-33)に記載されたＭＡＴＳ試験を使用した。略記すると前記試験は、（in vitro増殖条件で普通に一晩生育させて、ＰＢＳで二度洗浄した）二つの混和不可能な液体水性相と五つの各溶媒における細菌の分配に基づく細菌細胞壁の疎水性と極性を（光学密度を測定することによって）。増殖培地はＭＲＳ(Man Rogosa Sharp)であり、水性相はＰＢＳのようなバッファーである。溶媒はデカン、ヘキサデカン、酢酸エチル、クロロホルム、及びキシレンであった。
酸性溶媒であるクロロホルムに対する親和性は、細菌の電子ドナー性質（塩基性反応）を反映する。
塩基性溶媒である酢酸エチルに対する親和性は、細菌の電子受容体性質（酸性反応）を反映する。
無極性溶媒（デカン、ヘキサデカン、キシレン）に対する親和性は、細菌の疎水性特性を反映する。
高い疎水性は、細胞壁表面のグリコプロテインの存在に関連し、低い疎水性は、細胞壁表面のポリサッカリドの存在に関連するであろう。
疎水性％＝（１−Ａ／Ａ０）×１００
− Ａ０：５４０ｎｍでの初期ＯＤ（ＰＢＳ中でＯＤ＝ほぼ0,6に設定）
− Ａ：ボルテックス処理と安定化期間の後の水性相の光学密度（1ｍｌについて）
Figure 0004885452
図１は注射のスケジュールである。 図２はWallaceスコアとAmehoスコア及び重量の損失である。 図３は注射のスケジュールである。 図４はWallaceスコアとAmehoスコア及び重量の損失である。 図５は注射のスケジュールである。 図６はWallaceスコアとAmehoスコア及び重量の損失である。

Claims (9)

  1. ラクトバシラス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）PTA-4800の株を含む、炎症性腸疾患の予防及び／または減少のための細菌性組成物。
  2. ラクトバシラス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）PTA-4798、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）PTA-4801、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）PTA-4802、及びビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）PTA-5658からなる群から選択される少なくとも一つの株を更に含む、請求項１に記載の細菌性組成物。
  3. ラクトバシラス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）PTA-4798、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）PTA-4801、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）PTA-4802、及びビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）PTA-5658からなる群から選択される少なくとも二つの株を更に含む、請求項１に記載の細菌性組成物。
  4. ラクトバシラス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）PTA-4798、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）PTA-4801、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis） PTA-4802、及びビフィドバクテリウム・ラクティス（Bifidobacterium lactis）PTA-5658の混合物を含む、請求項１に記載の細菌性組成物。
  5. 106から1011CFUの細菌／ｇ組成物を含むことを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の細菌性組成物。
  6. 108から1011CFUの細菌／ｇ組成物を含むことを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の細菌性組成物。
  7. 請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物を含む、食料、食用サプリメント、または製薬組成物。
  8. 乳製品であることを特徴とする、請求項７に記載の組成物。
  9. 幼児用の製剤であることを特徴とする、請求項７または８に記載の組成物。
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