JP4869562B2 - 走査型共焦点顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、標本に対して光を走査しながら照射し、標本からの検出光（蛍光）を検出する光走査型共焦点顕微鏡に関するものである。

光走査型共焦点顕微鏡として、蛍光色素を標識した標本に対し対物レンズを介してレーザ光を照射することで蛍光色素を励起し、この励起により標本から発せられる検出光（蛍光）を光学系を介して検出器で検出するようにしたものがある。

ところで、最近、１つの標本に複数の蛍光色素を標識した多重染色標本が用いられるようになっており、このような多重染色標本について、それぞれの蛍光色素に対応する蛍光を検出するには、標本からの検出光を各蛍光色素ごとに複数チャンネルに分光し、これらチャンネルごとに検出光を取り込むようにしたものも考えられている。

特許文献１は、このような考えに基づいたもので、波長の異なる光を発生する複数の光源を蛍光指示薬や蛍光タンパクを発現させた標本部位の励起波長ごとに用意し、これら光源により標本を励起し、それぞれに発光する蛍光を波長ごとに設けられた検出器により検出するようになっている。この場合、蛍光波長ごとに波長選択するための光学フィルタと分光ダイクロイックミラーを始め、励起光と蛍光を分離するためのダイクロイックミラーが設けられている。
特開２０００−３５４００号公報

ところが、このような特許文献１のものは、検出する蛍光波長に応じて、検出光路と検出器が必要であり、このため複数の蛍光波長を検出するには、これら蛍光波長毎に検出器が必要となる。この結果、検出器の数により波長分離を可能にする数が制限され、また、検出器の数を増やすと、検出光学ユニット全体が大型化し、価格的にも高価になってしまう。

また、標本の蛍光波長に応じて、光学フィルタなどの光学素子を選択する必要がある。そのため、波長に合せてフィルタを変更する必要があり、そのための手段として、予め多数のフィルタを用意して、これらフィルタを検出波長毎に切り替えるようにしたものが考えられる。しかし、この方法では、フィルタの数に制限があり、標本の種類が多くなると、フィルタの数が足りなくなるという問題が発生する。

フィルタの数の増加を解決する手段として、分光方式の検出器も考えられている。この方法では、分光器を駆動する機構や蛍光波長を選択するためのスリットなどが必要となる。しかし、これらの駆動は機械的であり、これら機械的な駆動には、１０ｍｓ以上の速度を必要とするため、高速の切り替えが難しい。

また、分光方式においては、マルチアノードＰＭＴを用いることで、多波長検出を可能にしたものも開発されている。しかし、マルチアノードＰＭＴは、波長選択の分解能がそれほど高くないため、各種の蛍光波長に対応して、微細な波長合せが難しいという問題がある。また、このマルチアノードＰＭＴは、検出感度もそれほど期待できないため、明るい画像が取得できないといった問題もある。

一方、励起光と蛍光を分離するために、複数のダイクロイックミラーを使用し、これらダイクロイックミラーを励起波長に応じて切り替えて使用するか、あるいは、ダイクロイックミラーの波長特性として、レーザ光波長を反射し蛍光を透過するような多波長バンドのダイクロイックミラーを用いる必要がある。しかし、複数のダイクロイックミラーを用いるのでは、検出光学ユニット全体が大型化してしまい、また、多波長バンドのダイクロイックミラーを用いるものも、現在開発されているものとして、３〜４波長バンドのダイクロイックミラーが存在するが、光学設計的に高度な技術を要し、製造も膜層を多層膜にする必要があるなど製造の難易度が高く、価格的に高価になってしまう。

さらに、分光方式でないフィルタタイプにおいて、レーザ波長を時分割で切り替えて画像を取得する方式も考えられている。しかし、この方法では、フィルタを高速に切り替える必要があり、機械的な駆動方法を採用したのでは速度的な問題が発生する。

本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、安価で構成でき、広い波長領域を効率よく利用可能な走査型共焦点顕微鏡を提供することを目的とする。

上記の目的を達成するために、本発明の一態様による走査型共焦点顕微鏡は、ＬＥＤ光源と、前記ＬＥＤ光源からの光を伝送するマルチモード光ファイバと、前記光ファイバからの光を前記標本上で２次元走査する光走査手段と、前記光走査手段により走査された光を標本に収束させるとともに当該標本から発する検出光を集光する対物レンズと、前記対物レンズにより集光された検出光を前記光ファイバより手前で検出器へ向けて分岐する分岐手段と、前記分岐手段で分岐された検出光を共焦点検出するためのピンホールと、前記光走査手段による２次元走査中において、検出光を取り込むタイミングでは前記ＬＥＤ光源の光量を大きくするよう前記ＬＥＤ光源を制御し、検出光を取り込まないタイミングでは前記ＬＥＤ光源の光量を小さくするよう前記ＬＥＤ光源を制御する制御手段と、を具備することを特徴とする。

本発明によれば、入力周波数によって回折する光の波長を決定可能とした音響光学素子を用いることにより、検出波長を自在に選択でき、多波長を簡単に、高精度に検出できる光走査型共焦点顕微鏡を提供できる。

以下、本発明の実施の形態及び参照例を図面に従い説明する。

（第１の参照例）
図１は、本発明の第１の実施の形態に係る光走査型共焦点顕微鏡の概略構成を示すものである。図１において、１は光源としてのレーザ光源ユニットで、このレーザ光源ユニット１は、異なる波長のレーザ光を発振するレーザ光源２、３、４を有している。

レーザ光源４からのレーザ光の光路上には、反射ミラー５が配置されている。また、レーザ光源３からのレーザ光の光路上には、反射ミラー５で反射されるレーザ光との交点上にダイクロイックミラー６が配置されている。ダイクロイックミラー６は、これら２つのレーザ光路を合成するもので、レーザ光源３からのレーザ光を反射し、反射ミラー５で反射されるレーザ光を透過するようになっている。レーザ光源２からのレーザ光の光路上には、ダイクロイックミラー６からのレーザ光との交点上にダイクロイックミラー７が配置されている。ダイクロイックミラー７は、これら２つのレーザ光路を合成するもので、レーザ光源３からのレーザ光を透過し、ダイクロイックミラー６からのレーザ光を反射するようになっている。

ダイクロイックミラー７により合成されたレーザ光の光路上には、波長切替手段、レーザ光ＯＮ／ＯＦＦ手段、レーザ光強度制御手段として音響光学可変フィルタ（以下、ＡＯＴＦとする）８が配置されている。ＡＯＴＦ８は、レーザ光源２、３、４からのレーザ光に対して波長選択、ＯＮ／ＯＦＦ制御及び強度制御を行なうものである。

ＡＯＴＦ８の出射端には、ファイバとしてシングルモードファイバ９の入射端が配置され、このシングルモードファイバ９を介してレーザ光源ユニット１からのレーザ光を走査ユニット１０に導入するようになっている。

走査ユニット１０は、シングルモードファイバ９の出射側に、レーザ光を平行光にするコリメートレンズ１１が配置されている。

コリメートレンズ１１の平行光の光路上には、音響光学素子１２が配置されている。音響光学素子１２についての詳細は後述する。

音響光学素子１２を透過した光路上には、集光レンズ１３が配置されている。集光レンズ１３は、音響光学素子１２を透過した平行光を集光するもので、この集光位置に、ピンホール１４が配置されている。

ピンホール１４を透過した光路には、コンフォーカルレンズ１５が配置されている。コンフォーカルレンズ１５は、ピンホール１４を透過した光を再び平行光に変換する。コンフォーカルレンズ１５により平行光となった光路には、光走査手段として走査光学ユニット１６が配置されている。走査光学ユニット１６は、直交する２方向に光を偏向するための２枚のミラー（不図示）を有し、これらのミラーによりレーザ光を２次元方向に走査するようになっている。

走査光学ユニット１６で２次元走査されたレーザ光の光路上には、リレーレンズ１７を介して結像レンズ１８、対物レンズ１９が配置されている。リレーレンズ１７は、走査光学ユニット１６からの光束を対物レンズ１９の瞳径程度に拡大するもので、結像レンズ１８を通して対物の瞳位置に光を満たす役割を有している。

これにより、走査光学ユニット１６で２次元走査されたレーザ光は、リレーレンズ１７、結像レンズ１８、対物レンズ１９を介して標本２０の焦点位置に結像される。また、標本２０から発した蛍光は、対物レンズ１９、結像レンズ１８、リレーレンズ１７、走査光学ユニット１６、コンフォーカルレンズ１５まで戻るようになっている。

コンフォーカルレンズ１５に戻った蛍光は、ピンホール１４に集光される。この場合、ピンホール１４は、標本２０面上の焦点位置と共役に配置されており、ピンホール１４によって共焦点効果を得られるようにしている。

そして、ピンホール１４を透過した標本２０面上の焦点位置からの蛍光は、集光レンズ１３で平行光となり、再び音響光学素子１２に導かれる。

音響光学素子１２は、超音波を印加することで屈折率の変化を誘起し、光が屈折を受ける現象を利用したデバイスで、超音波の周波数、つまり入力周波数によって、回折する光の波長を決定できるようになっている。具体的には、特定周波数における選択可能な光の波長幅は、３ｎｍ程度であるが、一般的な蛍光波長を取得するには、１０ｎｍから４０ｎｍ程度の幅が必要であることから、音響光学素子１２に対し複数の異なる周波数を同時に入力することによって、３ｎｍから数十ｎｍまでの蛍光波長を一度に検出できるようになる。つまり、検出波長幅を決定するには、異なる周波数をどれだけ入れるかによって決定される。また、回折光の強度は、入力信号の大きさ、例えば電圧値を制御することで可能であり、この電圧の値によって、回折光強度を０〜９０％の範囲で制御することが可能になる。

音響光学素子１２により回折される蛍光の光路は、Ｐ成分と、Ｓ成分の２つ偏光成分２０１、２０２に分離される。

一方の偏光成分２０１の光路には、検出手段として検出器２２が配置されている。検出器２２は、偏光成分２０１の蛍光を検出するもので、検出した光を光電変換して出力するようになっている。また、他方の偏光成分２０２の光路には、検出器２３が配置されている。検出器２３は、偏光成分２０２の蛍光を検出するもので、検出した光を光電変換して出力するようになっている。

他方の偏光成分２０２の光路には、反射ミラー２４が配置されている。この反射ミラー２４は、光路に対して挿脱可能になっており、光路中に挿入されている状態（図示状態）では、偏光成分２０２の蛍光を反射し、検出器２２に導入するようにしている。つまり、反射ミラー２４が光路に挿入されている状態（図示状態）では、Ｐ成分と、Ｓ成分の２つ偏光成分２０１、２０２の蛍光が検出器２２で検出され、反射ミラー２４が光路から退避している状態では、Ｐ成分と、Ｓ成分の２つ偏光成分２０１、２０２の蛍光が各別に検出器２２、２３で検出されるようになっている。

ＡＯＴＦ８、走査光学ユニット１６、音響光学素子１２、検出器２２、２３および反射ミラー２４には、制御ユニット２５が接続されている。制御ユニット２５には、パーソナルコンピュータ（以下、ＰＣ）２６が接続されている。

制御ユニット２５は、ＰＣ２６の指示により各機器のに制御を実行するもので、ＡＯＴＦ８に対して、レーザ光の波長切替えと光の強度を制御を行なう。また、走査光学ユニット１６の走査に同期して、ＡＯＴＦ８によるレーザ光のＯＮ／ＯＦＦも制御する。これは、標本２０上の所望する領域だけで、蛍光を検出する場合に有効である。また、走査型共焦点レーザ顕微鏡においては、走査光学ユニット１６を走査するときに、往復走査する場合と片側走査する場合があるが、片側走査する場合は、蛍光を検出しない戻り走査時にＡＯＴＦ８に対しレーザ光をＯＦＦするように制御する。

制御ユニット２５によるＡＯＴＦ８の制御は、制御ユニット２５からの電気信号により行なう。また、ＡＯＴＦ８のＯＮ／ＯＦＦは、ＡＯＴＦ８に入力する周波数信号をＯＮ／ＯＦＦすることで行う。さらに、レーザ光の波長選択は、ＡＯＴＦ８に入れる周波数で決定される。例えば、２つ以上の周波数をＡＯＴＦ８に入れれば、２つ以上の波長のレーザ光のＯＮ／ＯＦＦをすることができる。

また、制御ユニット２５は、音響光学素子１２での各種の制御も行なう。この場合、蛍光の検出波長幅を大きく取りたければ、複数の異なる周波数を一度に入力する。また、検出波長域を切り替えるには、異なる入力周波数を選択的に切り替えるように制御する。さらに、入力信号の振幅（強さ）を変えることによって、光の回折強度（透過量）を変えることもできる。例えば、標本２０からの光として、光量の大きな反射光を検出するときに、５０％程度の透過量とすることで、レーザ光源ユニット１からの光を標本２０に導入し、標本２０からの反射光を検出器２２（２３）に導くことが可能である。この場合、標本２０からの反射光は、検出器２２（２３）に戻るが、レーザ光源ユニット１からの光は、標本２０からの反射光の導入方向と逆で、検出器２２（２３）に戻らないので、光アイソレータとして機能させることができる。

さらに、制御ユニット２５は、反射ミラー２４の光路への挿脱も制御する。この場合、反射ミラー２４を光路に挿入すると、蛍光のＰ成分と、Ｓ成分の２つ偏光成分２０１、２０２が検出器２２で検出でき、また、反射ミラー２４を光路から退避させると、蛍光のＰ成分と、Ｓ成分の２つ偏光成分２０１、２０２がそれぞれ検出器２２、２３で検出できるようにしている。

次に、このように構成した参照例の作用を説明する。

この場合、制御ユニット２５は、ＡＯＴＦ８によるレーザ光の波長を切替えと音響光学素子１２の入力周波数の切り替えを高速で行なうとともに、検出器２２（２３）での蛍光検出のタイミングと走査光学ユニット１６の２次元走査を同期させるように制御する。

この状態から、レーザ光源ユニット１のレーザ光源２，３，４からのレーザ光がＡＯＴＦ８を介して順に切り替えられると、、シングルモードファイバ９を介して走査ユニット１０のコリメートレンズ１１に入射し、平行光となって、音響光学素子１２に導かれる。

音響光学素子１２を出射したレーザ光は、集光レンズ１３で集光され、ピンホール１４を通ってコンフォーカルレンズ１５により平行光となって走査光学ユニット１６に入射し、２次元走査される。走査光学ユニット１６で２次元走査されたレーザ光は、リレーレンズ１７、結像レンズ１８、対物レンズ１９を介して標本２０の焦点位置に結像される。

この場合、標本２０として、複数の蛍光色素を標識した多重染色標本が用いられていると、レーザ光源２，３，４の異なる波長のレーザ光の励起により、波長の異なる蛍光が発生する。これら蛍光は、対物レンズ１９、結像レンズ１８、リレーレンズ１７、走査光学ユニット１６を介してコンフォーカルレンズ１５に戻り、ピンホール１４に集光される。

そして、ピンホール１４で共焦点検出された蛍光は、集光レンズ１３で平行光となり、再び音響光学素子１２に導かれる。

この場合、音響光学素子１２は、制御ユニット２５により、ＡＯＴＦ８でのレーザ光の波長切り替えに応じて、入力周波数が切り替えられ、蛍光検出の波長域を高速で切り替える。これにより、標本２０からの波長の異なる蛍光は、音響光学素子１２で順次回折され検出器２２（２３）に導びかれる。このとき、反射ミラー２４を光路に挿入しておけば、各波長の蛍光のＰ成分と、Ｓ成分の２つ偏光成分２０１、２０２を検出器２２で検出でき、反射ミラー２４を光路から退避させれば、蛍光のＰ成分と、Ｓ成分の２つ偏光成分２０１、２０２がそれぞれ検出器２２、２３で検出することができる。

ここで、具体例として、標本２０に標識された複数の蛍光色素として、ＦＩＴＣとローダミンの場合を例に説明すると、ＦＩＴＣは、４９０ｎｍの励起により、５１５ｎｍ程度の蛍光を発生し、ローダミンは、５５０ｎｍの励起により、５８０ｎｍ程度の蛍光を発生する。説明上、レーザ光源ユニット１のレーザ光源として、ＦＩＴＣには、アルゴンレーザの４８８ｎｍ、ローダミンには、ＨｅＮｅレーザの５４３ｎｍを使用する。

まず、アルゴンレーザからのレーザ光を音響光学素子１２、対物レンズ１９を介して標本２０上に集光させると、標本２０の中でＦＩＴＣで標識された部位が励起される。励起された部位からは、５２０ｎｍの波長の蛍光が発生し、この蛍光が音響光学素子１２に導入される。このとき、音響光学素子１２に対し５２０ｎｍに相当する周波数を入力すると、５２０ｎｍの光だけが回折され、回折された光は、検出器２２（２３）により検出され、画像化される。

次に、ＨｅＮｅレーザからのレーザ光を音響光学素子１２、対物レンズ１９を介して標本２０上に集光させると、今度は、標本２０の中でローダミンで標識された部位が励起される。励起された部位からは、５８０ｎｍの波長の蛍光が発生し、この蛍光が音響光学素子１２に導入される。このとき、音響光学素子１２に対し５８０ｎｍに相当する周波数を入すると、５８０ｎｍの光だけが回折され、回折された光は、検出器２２（２３）により検出され、画像化される。

この例では、ＦＩＴＣで標識された部位とローダミンで標識された部位の画像を別々に取得するようにしたが、走査光学ユニット１６において、Ｘ方向については、同じ位置について２度ずつラインスキャンを行ない、１度目のスキャンでＦＩＴＣ、２度目のスキャンでローダミンのそれぞれの蛍光を検出するように、ＡＯＴＦ８でのレーザ光の波長選択と音響光学素子１２への入力周波数を高速に切り替えることで、ほぼ同時に２種類波長の蛍光を検出することができる。この場合、Ｘ方向の同じラインごとに検出したデータについて、Ｙ方向を１ライン分ずらしながら画像を生成することによりフレーム画像を取得することができる。

また、ＦＩＴＣとローダミンのそれぞれの蛍光検出をライン毎ではなく、ピクセル毎に行えば、ほぼ同時に２つの画像を取得できる。このようなピクセル毎の蛍光検出では、音響光学素子１２の入力信号の周波数切り替えをμｓｅｃオーダーで行なう必要がある。

また、上述では、検出器が１個の場合においても２波長の蛍光検出をほぼ同時にできる例を述べているが、例えば標本２０が２つ以上の蛍光色素で標識されているときは、従来では、２つ以上の検出器を必要としていたが、音響光学素子１２への入力周波数を高速に切り替えることで、検出器は１個で多波長の検出が可能となる。つまり、レーザ光源の波長の切り替えに合せて、音響光学素子１２の音響光学素子１２への入力周波数を高速に切り替えるようにすることで、多波長蛍光のほぼ同時性をもった画像を検出することが可能となる。

従って、このようにすれば、ＡＯＴＦ８によるレーザ光源ユニット１からのレーザ光の波長切り替えに応じて音響光学素子１２の入力周波数を制御することにより検出波長を自在に選択できるので、多重染色標本から発せられる波長の異なる蛍光を、１個の検出器２２により簡単に、精度よく検出することができる。これにより、従来、異なる蛍光波長の蛍光を検出する場合、検出したい蛍光波長毎に検出光路と検出器を用意したり、複数の光学フィルタを切り替える手段を有するものと比べ、構成を簡単にでき、価格的にも安価にできる。

また、ＡＯＴＦ８や音響光学素子１２の制御は、ＰＣ２６においてＡＯＴＦ８の切替順序や音響光学素子１２の入力周波数の切り替えなどのメニューを作成しておけば、簡単に制御条件を変更することが可能である。このことは、現在存在しない蛍光波長の特性を有する新たな蛍光試薬が開発されたとしても、これら蛍光波長の検出にも簡単に対応することができる。

さらに、光学フィルタを追加するなどのメンテナンス作業を必要としないばかりか、ユーザが自由にプログラマブルに波長を変えられることから、新たな実験をしたいような場合にフィルタを購入することなく、直ちに実験を始めることができる。

さらに、ダイクロイックミラー（ＤＭ）、光学フィルタなどの光学素子の使用数を大幅に少なくできるので、光学系がシンプルになり、装置の小型化が可能である。また、光学素子が多いと各光学素子を通過するごとに、蛍光強度が低下していくという不都合があるが、光学系がシンプルなことから、常に明るい画像検出が可能である。

なお、図１では、レーザ光源ユニット１からのレーザ光の導入光路と、標本２０からの蛍光の検出光路に共通のピンホール１４が入っており、導入光路では、標本２０上に光を結像するスポット径を決定する役割を持たせ、また、検出光路では、焦点があった光だけを検出する役割を持たせるようになっているが、導入光路と検出光路を分離した構成とすることも可能である。ピンホール１４を共通化した場合は、安価に構成できるメリットがあり、分離する場合は、装置の構成を自由にできるメリットがある。

（第１の参照例の変形例）
第１の参照例では、音響光学素子１２の入力周波数を印加しても回折を受けない０次側にレーザ光源ユニット１からのレーザ光を導入し、１次回折光が得られる側に検出器２２（２３）を配置するようにしたが、音響光学素子１２の１次光からレーザ光を導入し、０次光側に検出器２２を配置するようにしてもよい。

このようにすると、音響光学素子１２でレーザ光の波長を選択しながら、検出器２２で蛍光を検出することが可能である。この場合、標本２０が１つの波長で２つの蛍光を発生する場合は対応ができないが、音響光学素子１２で入力周波数を選択しないで画像が取得できる。また、このような構成では、音響光学素子１２の回折効率を１００％確保できないため、検出器２２の前にレーザ波長に応じたバリアフィルタを入れることが望ましい。それ以外は、上述した第１の参照例と同じである。

（第２の参照例）
次に、本発明の第２の参照例を説明する。

この場合、図１で示した光走査型共焦点顕微鏡の概略構成については、同様なので、同図を援用するものとする。

この第２の参照例では、走査ユニット１０へのレーザ光の導入路にシングルモードファイバ９を設けているが、シングルモードファイバ９に代えて図１に示すようにマルチモードファイバ３１を設けるようにしている。

一般に、レーザ顕微鏡では、レーザ光源から出力されたレーザ光を顕微鏡本体に導くために、光ファイバがよく用いられる。レーザ顕微鏡において最大限の解像力を発揮させるためには、標本を理想的な点光源で照明する必要がある。レーザ光が複数のモードの光を含んでいると、理想的な結像が阻害される。そのために、レーザ光の伝送に用いる光ファイバとして、単一モードの、光のみを伝播させるシングルモードファイバが使用されていた。シングルモードファイバを用いることにより、レーザ光は単一モードのままで標本へ導かれる。特に、シングルモードファイバを使用することで、一般的なコンベンショナル顕微鏡より１．３倍程度の高分解能を得ることも可能である。

ところが、光走査型共焦点顕微鏡では、高分解の要求だけではなく、上述したように多重染色標本の内部観察するのに用いられ、広い波長領域に亘って異なる波長のレーザ光を伝送することがある。生物研究の分野では、標本を標識するための種々の蛍光試薬とともに、２光子励起法やケージド試薬の解除のような特殊な観察方法が利用されている。これらを用いた観察のために、照射光としても種々の波長のレーザ光が用いられる。しかし、シングルモードファイバは、その特性上、伝播可能な波長帯域に制限がある。従来のレーザ顕微鏡では、このように広い波長範囲（例えば可視、紫外、赤外）を使用するにあたり、前述の観点から各帯域のレーザ光を単一モードで伝送するために、それぞれの帯域専用のシングルモードファイバを使用していた。これに伴い、複数の光ファイバで伝送されてくるレーザ光を最終的に一本の顕微鏡光軸に正確に統合するために、レーザ光を合成するための精密な光学系が必要だった。このため、高価なシングルモードファイバを複数用いることによる装置の高額化や、合成光学系の精密な調整の手間と光量ロスの問題があった。

これに対し、マルチモードファイバ３１は、シングルモードファイバのコア径が２〜５μｍ程度であったものを、２〜２０００μｍもの径の大きなものを使用することができるため、３００〜２０００ｎｍ程度の広波長領域に亘って光透過率が良い状態を確保でき、損失の少ない光伝送が可能になる。このため、シングルモードファイバを使用するのに比べ、使用するファイバ本数を大幅に少なくでき、価格的に安価にできる。

マルチモードファイバは、ファイバ自体の価格もシングルモードファイバより安価である。マルチモードファイバはレーザ光を複数のモードで伝送するため、マルチモードファイバを使用した場合には理想的な点光源を得ることはできない。しかし、ピンホール１４を備えていることにより、立体的な標本の観察に重要な共焦点効果は確保される。解像度はシングルモードファイバ使用時に比較すると低下するが、解像度を限界レベルまで要求しない観察用途に対して、安価で構成の簡単な走査型共焦点蹟微鏡を提供できる。

（第３の参照例）
次に、本発明の第３の参照例を説明する。

この場合、図１で示した光走査型共焦点顕微鏡の概略構成については、同様なので、同図を援用するものとする。

この場合も、第２の参照例と同様にシングルモードファイバ９に代えて図１に示すようにマルチモードファイバ３１を用いるようにしている。このようなマルチモードファイバ３１を用いると、第２の参照例で述べたような利点を得られる。

マルチモードファイバ３１を使用すると、上述したようにコア径を大きくできるため、光源として、レーザ光源２、３、４を用いているが、レーザ光源以外の各種の光源を使用することができる。例えば、コア径が２〜５μｍ程度のシングルモードファイバでは、ＬＥＤ、キセノンランプあるいは水銀ランプなどの光源を導入することが難しく、導入できても、０、１％も透過させることができない。また、シングルモードファイバは、可視領域の波長で波長幅２００ｎｍ程度のものしか、製作することができない。

これに対して、マルチモードファイバ３１を使用すると、上述したようにコア径を２〜２０００μｍにも大きくでき、３００〜２０００ｎｍもの広波長領域に亘って光透過率を良好に確保できるので、レーザ光源ユニット１の光源として、ＬＥＤ、キセノンランプ、水銀ランプなどの光の波長幅の広い光源を使用しても、効率のよいシステムが実現できる。

従来では、紫外波長と可視域波長で、ファイバを分けて導入していたが、マルチモードファイバ３１では、その必要がなくなり、その分、光学部品を少なくすることができ、安価で小型なシステムが構築できる。また、ＬＥＤ、水銀ランプ、キセノンランプなどの光源は、レーザ光源に比べて安価に入手することができるので、安価なシステムが構築できる。

なお、光源として、水銀ランプやキセノンランプを用いた場合は、光源から対物レンズまでの間の光路上に、励起波長を選択する波長選択素子（液晶シャッターを利用すると高速な切り替えが可能である。）を入れることが望ましい。また、光源としてＬＥＤを用いた場合は、ＬＥＤを電気的にＯＮ／ＯＦＦすることで励起波長を選択することが可能である。この場合は、ＬＥＤの波長特性がレーザ光源に較べて、ブロードであるために、ＬＥＤからの光の光路上に励起波長に合せたフィルタを設けておくことが望ましい。

（第４の参照例）
次に、本発明の第４の参照例を説明する。

この場合、図１で示した光走査型共焦点顕微鏡の概略構成については、同様なので、同図を援用するものとする。

この場合、シングルモードファイバ９に代えてマルチモードファイバ３１を用いると、光源としてＬＥＤを用いることができる。このようなＬＥＤを用いた光走査型共焦点顕微鏡では、走査光学ユニット１６の走査に応じてＬＥＤより発せられる光の光量を切り替えることにより、効率的な画像取得を行なうことができる。ＬＥＤは、水銀ランプやキセノンランプなどの他の光源に比べると、光量が小さいが、光量の切り替えを高速で行なうことができるので、例えば画像を取り込むときは光量を大きくし、画像を取り込まないときは光量を小さくするように制御すると、平均電力を下げることができる。つまり、ＬＥＤには定格電力が決っているが、この定格電力は、時間単位で決っているので、画像を取り込むときの光量と画像を取り込まないときは光量の割合を２：１とすれば、光量を大きくするときの電流の値を平均電力時の電流値の２倍に上げることが可能になる。こうすることで、ＬＥＤの定格電流の２倍の電流を供給し、光量を十分に大きくした状態で、画像を取り込むことができるので、効率的な画像取得を行なうことができる。

勿論、この場合も、マルチモードファイバ３１を使用することで、第２の参照例で述べたような利点を得ることができる。

（第５の参照例）
次に、本発明の第５の参照例を説明する。

この場合、図１で示した光走査型共焦点顕微鏡の概略構成については、同様なので、同図を援用するものとする。

生物系の実験において、ＦＲＡＰという手法がある。このＦＲＡＰは、細胞の特定部位の蛍光を退色させることによる一連の流れを解析する手法である。つまり、細胞内では、タンパクの移動が常に起きているために、退色した部位が、時間とともに復帰する現象があり、この一連の流れで解析する手法のことである。

しかし、細胞の特定部位の蛍光の退色から復帰までの過程を検出する場合、蛍光を退色させるため光源から光の強度を強める必要があるが、従来の技術では、光源の光の強度を強めると、光源の光が検出器に戻ってしまい、検出精度を低下させるという問題を生じる。このため、光源からの光の戻りをできるだけ除去する必要がある。

そこで、従来では、光源からの光が戻らないように光路中にダイクロイックミラや波長選択するためのフィルタを配置したり、検出器のダイナミックレンジを、検出器に印加する電圧で制御するようにしている。しかし、光路中にダイクロイックミラやフィルタを配置するのでは、使用する光学部品が多くなって、価格的に高価なものとなり、また、検出器に印加する電圧するにも、制御するための電圧は高圧なため、ｍＳオーダでしか切り替えを行なうことができず、精度の良い制御が難しい。

これに対して第４の参照例では、レーザ光源ユニット１からのレーザ光は、検出器２２（２３）側には戻らないが、レーザ光のパワー強度にほぼ比例して、強い強度の蛍光を検出器２２（２３）で検出する必要がある。この場合、強度の強い蛍光を検出器２２（２３）にそのまま入射してしまうと、検出器２２（２３）のダイナミックレンジが足りなくなることがある。

この場合、音響光学素子１２により回折する光を弱めてあげれば、検出器２２（２３）のダイナミックレンジ以内で検出することが可能となる。このためには、音響光学素子１２に対する入力信号の大きさ、例えば電圧値を制御するようにする。この電圧値の制御によって回折光の強度を０〜９０％の範囲で制御することが可能となり、強度の強い蛍光についても、検出器２２（２３）のダイナミックレンジ以内で検出することができる。

また、検出器２２（２３）で検出された蛍光を光電変換した後の電気信号のレベルを見ながら、退色具合を観察し、退色を判断したレベルで、画像を取得するようにすれば、退色直後の画像が取得できるので、退色後の時間経過を無駄なく測定することができる。

なお、上述では、音響光学素子１２への電圧値を制御することで回折光の強度を変えるような説明をしたが、蛍光の波長はブロードな波長で戻ってくるので、蛍光の波長の裾野を検出するようにすれば、同じ効果を実現できる。つまり、図１の構成では、音響光学素子１２において高速で波長範囲を可変できるので、退色中は、蛍光波長の裾野で検出し、画像取得中は、蛍光画像を検出するようにすればよい。そして、画像取得と退色中の画像取得の切り替えを退色中の輝度情報から判断して、蛍光画像を取得するようにすれば、ＦＲＡＰの実験が可能となる。

（一実施形態）
次に、本発明の一実施形態を説明する。

図２は、本発明の一実施形態にかかるレーザ走査顕微鏡の概略構成を示している。図２において、４１はレーザ光源ユニットで、このレーザ光源ユニット４１も、異なる波長のレーザ光を発振するレーザ光源４２、４３、４４を有している。また、これらレーザ光源４２、４３、４４からのレーザ光の光路には、反射ミラー４５、ダイクロイックミラー４６，４７を有するレーザ光路合成手段が設けられている。

レーザ光源ユニット４１のレーザ光路合成手段からの光路には、マルチモードファイバ４８の入射端が配置されている。この場合、マルチモードファイバ４８には、コア径が２〜２０００μｍで、３００〜２０００ｎｍ程度の広波長領域に亘って良好な光透過率を得られるものが用いられている。

マルチモードファイバ４８の出射端からの光の光路には、ダイクロイックミラー４９、５０が配置されている。ダイクロイックミラー４９は、レーザ光源５１からのレーザ光をマルチモードファイバ４８からのレーザ光に合成するものである。この場合、レーザ光源５１は、マルチモードファイバ４８の波長領域を外れた波長のレーザ光を発生するものである。ダイクロイックミラー５０は、各レーザ光源４２〜４４、５１からのレーザ光を透過し、後述する標本５７からの検出光（蛍光）を反射するような特性を有している。

ダイクロイックミラー５０の透過光路上には、走査光学ユニット５２が配置されている。この走査光学ユニット５２は、直交する２方向に光を偏向するための２枚のミラー５２ａ、５２ｂを有し、これらのミラー５２ａ、５２ｂによりレーザ光を２次元方向に走査するようになっている。

走査光学ユニット５２で２次元走査されたレーザ光の光路上には、瞳投影レンズ５３、反射ミラー５４、結像レンズ５５、対物レンズ５６および標本５７が配置されている。この場合、走査光学ユニット５２で２次元走査されたレーザ光は、瞳投影レンズ５３、反射ミラー５４、結像レンズ５５、対物レンズ５６を通り、不図示のステージ上に保持された標本５７上に集光され、また、標本５７から発せられる検出光（蛍光）は、対物レンズ５６、結像レンズ５５、反射ミラー５４、瞳投影レンズ５３、走査光学ユニット５２を通り、ダイクロイックミラー５０まで戻るようになっている。

ダイクロイックミラー５０の反射光路には、バリアフィルタ５８、コンフォーカルレンズ５９およびピンホール６０が配置されている。

バリアフィルタ５８は、レーザ光源４２〜４４、５１からのレーザ光のそれぞれの波長をカットし、標本５７からの検出光（蛍光）の波長域を透過するような特性を有している。コンフォーカルレンズ５９は、ダイクロイックミラー５０を反射してきた検出光をピンホール６０に集光させようにしている。ピンホール６０は、標本５７上の焦点位置と共役に配置されており、ピンホール６０上に集光した光に対して共焦点効果を得られるようにしている。

ピンホール６０を透過した光路には、光路分割手段としてのダイクロイックミラー６１が配置されている。ダイクロイックミラー６１で分割された一方の光路には、第１の検出手段としてバンドパスフィルタ６２を介して検出器６３が配置され、他方のの光路には、第２の検出手段としてバンドパスフィルタ６４を介して検出器６５が配置されている。検出器６３は、バンドパスフィルタ６２を透過される特定波長の検出光（蛍光）を検出し、検出器６５は、バンドパスフィルタ６４を透過される特定波長の検出光（蛍光）を検出するものである。

このような構成によると、レーザ光源ユニット４１のレーザ光源４２，４３，４４からのレーザ光が出力されると、マルチモードファイバ４８を介してダイクロイックミラー５０に入射する。ダイクロイックミラー５０を透過したレーザ光は、走査光学ユニット５２に入射し、２次元走査される。走査光学ユニット５２で２次元走査されたレーザ光は、瞳投影レンズ５３、反射ミラー５４、結像レンズ５５、対物レンズ５６を介して標本５７の焦点位置に結像される。

この場合、標本５７として、複数の蛍光色素を標識した多重染色標本が用いられていると、レーザ光源４２，４３，４４の異なる波長のレーザ光の励起により、波長の異なる蛍光が発生する。

これらの蛍光は、対物レンズ５６、結像レンズ５５、反射ミラー５４、瞳投影レンズ５３、走査光学ユニット５２を通り、ダイクロイックミラー５０まで戻される。そして、ダイクロイックミラー５０で反射し、バリアフィルタ５８により標本５７からの検出光（蛍光）が透過し、コンフォーカルレンズ５９により、ピンホール６０に集光される。

そして、ピンホール６０での共焦点効果により得られた検出光は、ダイクロイックミラー６１で２光路に分割され、バンドパスフィルタ６２を介して検出器６３で検出されると同時に、バンドパスフィルタ６４を介して検出器６５で検出される。

従って、このようにすれば、レーザ光源ユニット４１からのレーザ光を導入するファイバとしてマルチモードファイバ４８を用いることにより、第２の参照例で述べたような利点を得られる。また、シングルモードファイバのコア径が２〜５μｍ程度であったものが、マルチモードファイバ４８では、２〜２０００μｍもの径の大きなものを使用することができる。これにより、３００〜２０００ｎｍ程度の広波長領域に亘って光透過率が良い状態を確保できるので、レーザ光源４２，４３，４４からの波長の異なるレーザ光に対して損失の少ない伝送が可能になる。このため、シングルモードファイバを使用するのに比べ、使用するファイバ本数を大幅に少なくでき、価格的に安価にできる。

また、上述では、光源として、レーザ光源４２、４３、４４を用いているが、これらレーザ光源以外の各種の光源を使用することができる。例えば、コア径が２〜５μｍ程度のシングルモードファイバでは、ＬＥＤ、キセノンランプあるいは水銀ランプなどの光源を導入することが難しく、導入できても、０、１％も透過させることができない。また、シングルモードファイバは、可視領域の波長で波長幅２００ｎｍ程度のものしか、製作することができない。これに対して、マルチモードファイバ４８を使用すると、上述したようにコア径を２〜２０００μｍにも大きくでき、３００〜２０００ｎｍもの広波長領域に亘って光透過率を良好に確保できるので、ＬＥＤ、キセノンランプ、水銀ランプなどの光の波長幅の広い光源を使用することができる。

この場合、光源として水銀ランプやキセノンランプを用いた場合は、光源から対物レンズまでの間の光路上に、励起波長を選択する波長選択素子（液晶シャッターを利用すると高速な切り替えが可能である。）を入れることが望ましい。また、光源としてＬＥＤを用いた場合は、ＬＥＤを電気的にＯＮ／ＯＦＦすることで励起波長を選択することが可能である。この場合は、ＬＥＤの波長特性がレーザ光源に較べて、ブロードであるために、ＬＥＤからの光の光路上に励起波長に合せたフィルタを設けておくことが望ましい。

さらに、マルチモードファイバ４８を用いると、光源としてＬＥＤを用いることができるので、このようなＬＥＤを用いたレーザ走査顕微鏡では、走査光学ユニット５２の走査に応じてＬＥＤからの光の光量を切り替えることにより、効率的な画像取得を行なうことができる。ＬＥＤは、水銀ランプやキセノンランプなどの他の光源に比べると、光量が小さいが、光量の切り替えを高速で行なうことができるので、例えば走査光学ユニット５２の２次元走査で、画像を取り込むタイミングでは光量を大きくし、画像を取り込まないタイミングでは光量を小さくするように制御すると、平均電力を下げることができる。つまり、ＬＥＤには定格電力が決っているが、この定格電力は、時間単位で決っているので、画像を取り込むときの光量と画像を取り込まないときは光量の割合を２：１とすれば、光量を大きくするときの電流の値を平均電力時の電流値の２倍に上げることが可能になる。こうすることで、ＬＥＤの定格電流の２倍の電流を供給し、光量を十分に大きくした状態で、画像を取り込むことができるので、効率的な画像取得を行なうことができる。

なお、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。

さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。

本発明の第１乃至第４の参照例にかかる光走査型共焦点顕微鏡の概略構成を示す図。 本発明の一実施形態にかかるレーザ顕微鏡の概略構成を示す図。

符号の説明

１…レーザ光源ユニット、２．３、４…レーザ光源
５…反射ミラー、６…ダイクロイックミラー
７…ダイクロイックミラー、８…ＡＯＴＦ
９…シングルモードファイバ、１０…走査ユニット
１１…コリメートレンズ、１２…音響光学素子
１３…集光レンズ、１４…ピンホール
１５…コンフォーカルレンズ、１６…走査光学ユニット
１７…リレーレンズ、１８…結像レンズ
１９…対物レンズ、２０…標本、２２．２３…検出器
２４…反射ミラー、２５…制御ユニット
２６…ＰＣ、３１…マルチモードファイバ
４１…レーザ光源ユニット、４２．４３、４４…レーザ光源
４５…反射ミラー、４６．４７…ダイクロイックミラー
４８…マルチモードファイバ、４９．５０…ダイクロイックミラー
５１…レーザ光源、５２…走査光学ユニット
５２ａ．５２ｂ…ミラー、５３…瞳投影レンズ
５４…反射ミラー、５５…結像レンズ、５６…対物レンズ
５７…標本、５８…バリアフィルタ、５９…コンフォーカルレンズ
６０…ピンホール、６１…ダイクロイックミラー
６２、６４…バンドパスフィルタ、６３、６５…検出器
２０１．２０２…偏光成分

Claims (1)

1. ＬＥＤ光源と、
   前記ＬＥＤ光源からの光を伝送するマルチモード光ファイバと、
   前記光ファイバからの光を前記標本上で２次元走査する光走査手段と、
   前記光走査手段により走査された光を標本に収束させるとともに当該標本から発する検出光を集光する対物レンズと、
   前記対物レンズにより集光された検出光を前記光ファイバより手前で検出器へ向けて分岐する分岐手段と、
   前記分岐手段で分岐された検出光を共焦点検出するためのピンホールと、
   前記光走査手段による２次元走査中において、検出光を取り込むタイミングでは前記ＬＥＤ光源の光量を大きくするよう前記ＬＥＤ光源を制御し、検出光を取り込まないタイミングでは前記ＬＥＤ光源の光量を小さくするよう前記ＬＥＤ光源を制御する制御手段と、
   を具備することを特徴とする走査型共焦点顕微鏡。

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