JP4733433B2 - ビーズアレイ用蛍光読取装置及びビーズアレイ用蛍光読取方法 - Google Patents

Description

本発明は、ライフサイエンス分野における蛍光画像の取得に関し、特にビーズアレイにおける正確な蛍光検出に好適である。

従来、ライフサイエンス分野における蛍光画像の取得は、特にＤＮＡチップに代表される平板チップの蛍光物質を検出する装置である。これらは、２次元に配置されたスポットを読取るものであり、配列の形状情報は事前に装置側に設定を行い、配列の形状情報に基づき大まかな位置を割り出し、蛍光情報とすり合わせを行って、各スポットに検出マトリクスを合わせる手法が取られている。

例えば、下記特許文献１には、表面にコート層を有するビーズの該コート層中にナノ粒子が存在する機能性ビーズを流路に導き、該流路において該機能性ビーズに電圧を印加することにより該ナノ粒子特有の波長の光を発光させ、該発光から該機能性ビーズを識別するビーズ読み取り方法、および読み取り装置が開示されている。この場合、ビーズ配列の形状情報が事前に分かっていることを前提条件としている。
特開２００４−２２６２３４号公報

しかしながら、上記技術は、事前に明確になっている配列形状情報に基づいているために、配列時と検出時で配列形状が異なるものや配列形状情報を得られないものに関しては効力を発揮出来ない。具体的には、ビーズチップアレイでは溝幅１３０μｍに対しガラスビーズの直径は１００μｍであるので、配列時には千鳥の配列になったりどちらかの壁面に偏った配列になったりとその挙動を制御することは困難である。また、検出前の反応工程に於いては配列部分に検体を往復送液するために若干の隙間や壁面に偏った配列部分においてビーズが移動するために配列時とは配列形状が異なる。このため、事前に配列形状情報を与えたとしても、検出時には実際の位置とは異なることになり、従来の方法では正しく検出することは困難であるいう問題がある。さらに、ビーズの位置の検出には取得された蛍光を用いるが、発現解析に於いては非常に低蛍光のものがあり、この場合ビーズの有無さえもわからないことになって、配列順序で検査項目の管理を行うビーズチップアレイでは適用できない問題がある。

そこで、本発明は、ビーズ位置の認識を自動で行い、ビーズの蛍光を正しく検出することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明は、蛍光を検出する際、同時にビーズの反射光を検出することで、ビーズ位置を認識しようとするものである。

ビーズの反射光は蛍光物質の有無に関わらず、全てビーズに於いて同様の検出が可能であり、全てのビーズの位置を検出すれば検出位置の蛍光のみを数値化することで正しく検出可能である。そのため、蛍光物質の吸収波長の光源で蛍光物質を蛍光させ、波長選択フィルタで蛍光波長のみを第１の検出器で検出し、蛍光波長以外の波長を第２の検出器で検出することで反射光を取得し、取得した反射光のデータを画像処理することでビーズの輪郭を取り出し、輪郭から中心位置を検出してビーズ位置の認識を行い、ビーズ位置に基づき蛍光を数値化することを特徴とする。

本発明によれば、ビーズの位置認識を蛍光画像に頼らず、他の手段である反射画像を用いることで、どのような条件下でもビーズ認識を可能にしたことによって、正しくビーズ位置を取得でき、正しいビーズ位置に対して蛍光を取得することで、各々のビーズの蛍光を正しく検出可能である。

また、ビーズ位置の検出は自動で行われるので、事前に配列形状情報を入力する必要がなく、入力ミスによる被害を根絶することが出来るため、蛍光検出の精度はさらに向上する。

また、配列時の形状が千鳥や偏りが生じ、個々のビーズアレイでその違いが有ったとしても正しいビーズ位置に対して蛍光を取得することで、各々のビーズの蛍光を正しく検出可能である。

以下、本発明を実施する場合の一形態を図面を参照して具体的に説明する。
図１、図２は、本発明の実施の一形態のビーズアレイ用蛍光読取装置の光学構成を示すブロック図である。

ビーズアレイ用蛍光読取装置は、図１に示すように、蛍光励起用光源１と蛍光励起用光源１から照射されるビームを適正なビーム幅に変換するビームエキスパンダ３と光路を取り回すためのミラー５と被対象物２０方向にビームを曲げるミラー８と被対象物２０に焦点を合わせる瞳レンズ１９と被対象物２０からの戻り光を受光系に引き出す穴付ミラー７と被対象物からの蛍光光を選択的に分岐反射する第１のダイクロイックミラー９と蛍光光の波長選択する波長選択フィルタ１１と蛍光光を第１の受光器（検出器）１７に結像させる結像レンズ１３と焦点深度を狭めるピンホール１５と、被対象物２０の反射光を受光するために蛍光光以外の波長を選択分離する第２のダイクロイックミラー１０と蛍光光以外の波長を選択する第２の波長選択フィルタ１２と蛍光光以外の波長を第２の受光器（検出器）１８に結像させる結像レンズ１４と焦点深度を狭めるピンホール１６と前記光学系を搭載する光学プレート２１から構成される。

図３は前述の光学系に接続されるデータ処理系の構成図である。第１の受光器１７で受光した蛍光光の電気信号は変換手段３１によってディジタル信号に変換される。同様に第２の受光器１８で受光した蛍光光以外の波長の光成分の電気信号は変換手段３２によってディジタル信号に変換される。それぞれ変換されたディジタル信号はデータ捕集手段３３によって維持的に蓄えられ転送手段によってコンピュータに送られる。

上記、構成によれば被対象物２０の蛍光物質は、適正なビームエキスパンダ３とミラー５とミラー７とミラー８とを通過した励起用光源１のビームにより励起される。蛍光光は瞳レンズ１９によって収集され、ミラー７によって受光系に送られる。ミラー７は穴付ミラーを採用し、励起光は穴を通過し、被対象物２０からの光は全方位に照射された光を瞳レンズによって集約するので励起光よりもビーム幅は広くミラー７の反射面で受光系に反射される。被対象物からの光は蛍光光のみではなく励起光の反射光も含まれる。ミラー７では同様に反射光も受光系に送る。受光系ではダイクロイックミラー９によって蛍光光のみが選択分離され、さらに蛍光光の純度を上げるために第１の波長選択フィルタ１１を通過し、結像レンズ１３で結像されピンホール１５で焦点位置以外の成分を除去し、第１の受光器１７で電気信号に変換される。ミラー７で取り出される蛍光光以外の反射光成分は第２のダイクロイックミラー１０を通過し、蛍光光以外の波長を選択分離され更に蛍光光成分を除去するために第２の波長選択フィルタ１２を通過し、第２の結像レンズ１４で結像され第２のピンホール１６で焦点位置以外の成分を除去し、第２の受光器１８で電気信号に変換される。第１及び第２の受光器１７，１８によって電気信号に変換された蛍光光成分と反射光成分はそれぞれ第１、第２の変換手段によってディジタル信号に変換される。変換手段は16bitのＡ／Ｄ変換機を用いることで実現できる。Ａ／Ｄ変換機の入力側にはＡ／Ｄ変換機の入力に相応しい信号振幅になるよう増幅器などを入れることもある。Ａ／Ｄ変換機の量子化数は実施の形態では16bitを用いたが、他のビット数でも良く、量子化数を増やした場合、量子化ノイズ低減することが期待できる。ディジタル化された蛍光光成分と反射光成分はシフトレジスタとメモリから構成されるデータ捕集部３３に送られ一時的にデータとして保管される。データ捕集部３３と変換手段３１、３２は制御手段３４で入出力のタイミングなどの制御がされる。転送手段３５は制御手段３４によってコンピュータにデータを出力する。データの出力は16bitパラレル方式を用いているが、より高速なデータ転送にはパケット方式のＬＡＮ（ローカルエリアネットワーク）やＵＳＢ(Universal Serial Bus)方式を用いることが適当である。

上記構成によって、被対象物の蛍光光および反射光をデータ化して、コンピュータ上に取り込むことが出来る。

図４はコンピュータに取り込んだ蛍光光および反射光のデータから被対象物の各々のビーズを認識し、中心位置を算出し、配列形状情報を得て、蛍光画像演算するアルゴリズムの大きな流れを示した概略図である。先ずファイル化された蛍光光および反射光のデータをアプリケーション上に読み込む手段４１と読み込んだ反射成分のデータから画像処理にてビーズを認識し、中心位置を算出し、配列形状情報を得る反射画像処理手段４２と配列形状情報から当該ビーズの蛍光量の解析を行う蛍光画像解析手段４３と蛍光量の解析手法を使用者が指示する演算処理入力手段４６と該解析手法に基づき蛍光量の解析を行う該当演算手段４４と演算結果をモニタ上に表示する結果表示手段４５と結果を保存する手段４７から構成される。

本発明で特筆すべきは反射光を用いてビーズの位置情報を得、これに基づき蛍光量を定量化することにある。そこで、反射画像処理手段４２について図５〜図７を用いて詳しく述べる。

反射画像処理手段４２では先ず16bitモノラルの反射光成分のデータを24bitＲＧＢ変換処理５１で24bitＲＧＢカラーデータに変換する。これはモノラルの濃淡（輝度）に色温度情報を付加する目的である。色温度情報に対し閾値を設け、その閾値に対してモノクロ２値化処理５２で２値化する。Ｘ、Ｙラインスキャン手段５３で２値化されたイメージファイルに対しＸ、Ｙ軸にライン検索を行いＸ軸とＹ軸が交差するラインの中心を仮の原点とする。（図５）

その後ビーズ基準点検索手段５４では仮原点から４５度位置の４点を外周基準点とする。外周基準点からビーズの輪郭を認識する輪郭認識手段５５を行い、輪郭認識手段５５で得られた輪郭から中心座標を算出する中心座標算出手段５６を行う。この時点でも真のビーズ中心位置は出ないので次に原点ズレ補正手段５７でビーズの外形（１００μｍ）寸法と輪郭との一致を検索し、真の中心位置に補正する。（図６）

更に認識したビーズの配置情報（中心位置情報）から溝（流路）方向に対してはみ出るような特定の不正データを除外する流路補正手段５８を行い、最終的に認識結果描画手段５９で認識結果をモニタ上に表示することで各々のビーズに対しての中心位置認識が可能となり、ビーズチッププレート上の配列形状情報が得られる。配列形状情報が得られれば既存の蛍光画像認識手段を用いれば蛍光量の定量化が可能となる。（図７）

図８及び図９に他の実施態様を示す。図１、図２に示す構成に対して第２の励起光源２と第２のビームエキスパンダ４と第１の励起光光路の同軸上に第２の励起光を導くミラー６が追加された構成である。本構成に拠れば、第２の励起光源２は反射光専用とし、積極的に反射光を取り出すための構成である。

図１０は図１に示す構成から被対象物２０の反射光を受光するために蛍光光以外の波長を選択分離する第２のダイクロイックミラー１０と蛍光光以外の波長を選択する第２の波長選択フィルタ１２と蛍光光以外の波長を第２の受光器１８に結像させる結像レンズ１４と焦点深度を狭めるピンホール１６を取り除き、第１の波長選択フィルタ１１を挿抜可能な構成としたものであり、反射光と蛍光光を時間的に同時ではなく順次に取得する方法の場合本構成でよい。本構成では部品点数が少なくなるので効果は変わりないまま安価に構成可能である。

本発明の一実施の形態のビーズアレイ用蛍光読取装置の光学構成を示すブロック図の上面図。 ビーズアレイ用蛍光読取装置の光学構成を示すブロック図の側面図。 ビーズアレイ用蛍光読取装置の信号制御構成を示すブロック図。 ビーズアレイ用蛍光読取装置のソフトウェアの概略構成を示す流れ図。 ビーズ位置検出ソフトウェアの詳細流れ図（１）。 ビーズ位置検出ソフトウェアの詳細流れ図（２）。 ビーズ位置検出ソフトウェアの詳細流れ図（３）。 本発明の他の実施の形態のビーズアレイ用蛍光読取装置の光学構成を示すブロック図。 本発明の他の実施の形態のビーズアレイ用蛍光読取装置の光学構成を示すブロック図。 本発明の他の実施の形態のビーズアレイ用蛍光読取装置の光学構成を示すブロック図。

符号の説明

１…蛍光励起用光源、２…第２の蛍光励起用光源、３…ビームエキスパンダ、４…第２のビームエキスパンダ、５…ミラー、６…ミラー、７…ミラー、８…ミラー、９…第１のダイクロイックミラー、１０…第２のダイクロイックミラー、１１…波長選択フィルタ、１２…第２の波長選択フィルタ、１３…結像レンズ、１４…第２の結像レンズ、１５…ピンホール、１６…第２のピンホール、１７…第１の受光器、１８…第２の受光器、１９…瞳レンズ、２０…被対象物、２１…光学プレート、３１…第１の変換手段、３２…第２の変換手段、３３…データ捕集手段、３４…制御手段、３５…転送手段、３６…コンピュータ、４１…画像読み込み手段、４２…反射光画像処理手段、４３…蛍光画像処理手段、４４…該当演算手段、４５…結果表示手段、４６…演算処理入力手段、４７…結果の保存手段、５１…24bitＲＧＢ変換手段、５２…モノクロ2値化処理手段、５３…ＸＹラインスキャン手段、５４…ビーズ基準点検索手段、５５…輪郭認識手段、５６…中心座標算出手段、５７…原点ズレ補正手段、５８…流路補正手段、５９…認識結果描画手段

Claims (9)

1. 樹脂に溝を形成し該溝にビーズを配列したビーズチップアレイの蛍光画像の取得を行う装置に於いて、蛍光色素の吸収波長を発光する励起光源と、蛍光量を検出する第１の検出器と、励起光源の光を一点に集約する対物レンズと、蛍光波長を選択する波長選択フィルタと、励起波長を通過させ蛍光波長を分岐する第１のダイクロイックミラーを有し、さらに蛍光波長以外の波長を選択分離する第２のダイクロイックミラーと蛍光波長以外の光を検出する第２の検出器を有し、さらに当該第２の検出器で検出された２次元画像からビーズの輪郭を取り出し、当該輪郭から各ビーズの中心位置を自動的に取得する第１の画像処理部と、取得された各ビーズの中心位置に相当するビーズの蛍光量を前記第１の検出器で検出して数値化する第２の蛍光画像処理部を有することを特徴とするビーズアレイ用蛍光読取装置。
2. 請求項１のビーズアレイ用蛍光読取装置において、前記第１の画像処理部は、前記第２の検出器で検出された２次元画像からビーズの仮原点を検出し、当該仮原点に対して所定の方向に複数の外周基準点を定め、当該外周基準点毎にビーズの輪郭を認識し、認識された輪郭からビーズの中心位置を算出することを特徴とするビーズアレイ用蛍光読取装置。
3. 請求項１のビーズアレイ用蛍光読取装置において、前記第１の画像処理部は、ビーズの外径寸法とビーズの輪郭との一致を検索し、検索結果に基づいて、算出された前記ビーズの中心位置を補正することを特徴とするビーズアレイ用蛍光読取装置。
4. 請求項１から３のいずれかのビーズアレイ用蛍光読取装置において、第１及び第２の検出器の直前に焦点を絞るピンホールと対物レンズと共役関係の結像レンズをそれぞれ配置し、共焦点光学系を形成したことを特徴とするビーズアレイ用蛍光読取装置。
5. 請求項１から３のいずれかのビーズアレイ用蛍光読取装置において、ビーズチップアレイのビーズ配列に対して対物レンズを２次元に移動する機構を有し、蛍光波長及び蛍光波長以外の波長をそれぞれ２次元に取得できることを特徴とするビーズアレイ用蛍光読取装置。
6. 請求項１から３のいずれかのビーズアレイ用蛍光読取装置において、対物レンズに対してビーズチップアレイのビーズ配列を２次元に移動するステージ機構を有し、蛍光波長及び蛍光波長以外の波長をそれぞれ２次元に取得できることを特徴とするビーズアレイ用蛍光読取装置。
7. 請求項１から３のいずれかのビーズアレイ用蛍光読取装置において、取得したビーズの前記中心位置に基づき第１の検出器から取得した２次元画像のビーズ以外の異物を検出し、数値化から除外する機能を有することを特徴とするビーズアレイ用蛍光読取装置。
8. 請求項１から７のいずれかのビーズアレイ用蛍光読取装置において、励起光源のほかに第２の検出器専用の光源を有し、第１の検出及び第２の検出を独立に行うことを特徴とするビーズアレイ用蛍光読取装置。
9. 樹脂に溝を形成し該溝にビーズを配列したビーズチップアレイの蛍光画像の取得を行う方法に於いて、励起光源によって蛍光色素の吸収波長を発光させ、該蛍光量を第１の検出器で検出し、第１のダイクロイックミラーで励起波長を通過させるとともに蛍光波長を分岐させ、さらに第２のダイクロイックミラーで蛍光波長以外の波長を選択分離させ、第２の検出器で該蛍光波長以外の光を検出し、さらに当該第２の検出器で検出された２次元画像からビーズの輪郭を取り出し、当該輪郭から各ビーズの中心位置を自動的に取得し、取得された各ビーズの中心位置に相当するビーズの蛍光量を前記第１の検出器で検出して数値化することを特徴とするビーズアレイ用蛍光読取方法。

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