JP4772065B2 - 多量体形成ポリペプチドの単量体型から多量体型を分別検出する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、多量体形成ポリペプチドの単量体型から多量体型を分別検出する方法及びこれのための免疫分析キットに関するものである。
蛋白質を構成するポリペプチドの多量体形成は、蛋白質の機能に必要なものとして一般に知られている。しかしながら、多量体型は、種々の蛋白質において、疾患または疾病を誘発する場合が多い。特に、蛋白質は、正常的な状態では単量体として存在するが、非正常的な状態(例えば、ミスフォールディング形に転換)になると、多量体(または凝集形)に転換される。
ミスフォールディングされて、凝集された(または蓄積された)、即ち、機能的に関連のある構造(conformation)を有しない蛋白質は、正常的な生理活性を示さないことが知られている。正しくフォールディングされていないか、正しくフォールディングされた状態を維持できない場合、多様な形態の生理学的機能不全を誘発し、その結果、多様な形態の疾患を誘発する(Massimo Stefani, et al., J. Mol. Med. 81:678-699(2003); and Radford SE, et al., Cell. 97:291-298(1999))。正しくない構造、即ち、正常的に機能を果たすものとは異なる構造を有する蛋白質分子の存在により、生命体において多い疾患が誘発される。
例えば、蛋白質の非正常的な凝集またはミスフォールディングに係わる疾患または疾病は、アルツハイマー疾患、クロイツフェルト・ヤコブ病、海綿状脳症 (Spongiform encephalopathies)、パーキンソン疾患、ハンチントン疾患、筋萎縮性側索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis)、セルピン欠乏症(Serpin deficiency)、肺気腫(emphysema)、硬変症(cirrhosis)、第II型糖尿病、一次全身性アミロイド症、二次全身性アミロイド症、フロント一時的痴呆(Fronto-temporal dementias)、老人全身性アミロイド症、家族性アミロイドポリニューロパチー(familial amyloid polyneuropathy)、遺伝性大脳アミロイドアンギオパチー(hereditary cerebral amyloid angiopathy)、及び血透析関連アミロイド症を含む。
凝集関連疾患の初期診断が集中的に研究された。しかしながら、単量体(正常)形から多量体(凝集)形を分別検出する方法及び接近は、いまだに提示されていない。
人間の散発性、変種、医原性、及び家族性クロイツフェルト・ヤコブ病、クル(kuru)、家族性致命的不眠症、及びゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカ病、羊及びヤギのスクレイピー、猫の海綿状脳症、ミンク海綿状脳症、シカ、エルク及びムースの慢性消耗性疾患、及び家畜の狂牛病は、致命的な神経退行性疾患であり、これは、伝達性海綿状脳症(TSE)によるものである(Prusiner S.B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13363-13383(1998); and Hope J. Curr. Opin. Genet. Dev. 10, 568-57(2000))。プリオン蛋白質(PrPSc)の非正常的なイソフォームまたはスクレイピー型は、ＴＳＥの主なる原因と知られてきた(Caughey B. Trends Biochem. Sci. 26:235-42(2001))。
プリオン蛋白質(PrPC)の正常型は、α−螺旋及び無秩序な部分を含み、単量体型として存在して(Zahn, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:145-150(2000))、スクレイピー型(PrPSc)は、高度のβ−シート構造を有して、多量体(凝集)型または少なくとも二量体型として存在する(Caughey, B., et al., J. Biol. Chem. 273:32230-35(1998))。α−螺旋からβ−シート構造への構造的な変化は、神経病理学の原因となり得る疾病の中心事件である。
ＰｒＰCが蛋白質分解酵素に敏感(PrPsen)である反面、ＰｒＰScは、部分的に蛋白質分解(PrPres)に抵抗性があり、高分子量の凝集体を形成し易い(Bolton D. C. Lancet, 358:164-5 (2001))。前記後者の特徴は、ＰｒＰresを形成させる構造的な変化の分析を難しくするか、或いは構造的な変化の特徴付けを難しくする。
蛋白質分解酵素Ｋ(PK)の分解方法は、ＥＬＩＳＡで検出されるスクレイピー型のみを残して、細胞型を分解することにより、多様な形態のＰｒＰ(スクレイピー型)の抵抗性を区別するに利用されてきた。しかしながら、前記ＰＫ分解方法に対して、問題が提起された。ＰｒＰ構造、濃度、組織抗体、分解時間及び緩衝液がＰＫ敏感度に影響を与え、ＰＫ分解方法の信頼度を大きく低下させる。
したがって、より高い信頼度及び便利性を有する、単量体型(例えば、PrPの細胞型)から多量体型(例えば、PrPのスクレイピー型)を分別検出する新しい接近法を開発する必要がある。
本明細書全体にかけて多数の特許文献及び論文が参照されて、その引用は、括弧内に表示されている。引用された特許文献及び論文の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
上述の点に鑑みて、本発明者らは、多量体形成ポリペプチドの単量体型から多量体(凝集)型の新規な分別検出方法を開発するために鋭意研究した結果、独特の一組の捕獲及び検出抗体を利用する新規な免疫分析方法を開発した。
したがって、本発明の目的は、生試料内の多量体形成ポリペプチドの単量体型から多量体型を分別検出する方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、生試料内の多量体形成ポリペプチドの単量体型から多量体型を分別検出するためのキットを提供することにある。
本発明のまた他の目的は、凝集反応(agglutination)に基づいた、多量体形成ポリペプチドの単量体型から多量体型を分別検出する方法を提供することにある。
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。
本発明の一様態によると、本発明は、(a)単量体型、多量体型、または単量体型及び多量体型を捕獲する、多量体形成ポリペプチド上のエピトープを認識する捕獲抗体に生試料を接触させるステップと、(b)前記ステップ(a)のエピトープと同一なまたはオーバーラップされたエピトープを認識する検出抗体に、前記捕獲された単量体型、多量体型、または単量体型及び多量体型を接触させるステップと、(c)多量体型検出抗体複合体を検出するステップと、を含む生試料の多量体形成ポリペプチドの単量体型から多量体型を分別検出する方法を提供する。
本発明の他の様態によると、本発明は、(a)多量体形成ポリペプチド上のエピトープを認識する捕獲抗体、及び(b)前記捕獲抗体が認識する前記エピトープと同一なまたはオーバーラップされたエピトープを認識する検出抗体を含む、生試料の多量体形成ポリペプチドの単量体型から多量体型を分別検出するためのキットを提供する。
本発明は、抗原−抗体反応に係わる免疫分析法を用いて、生試料内の多量体形成ポリペプチドの多量体型を単量体型から分別検出する方法に関するものである。本発明の方法は、“多量体検出方法(MDS)”と命名する。
本明細書において、用語“多量体形成ポリペプチド”は、凝集型を形成できるポリペプチドを意味する。特に、下記構造的変化は、多様な疾患を誘発する。例えば、アルツハイマー疾患、クロイツフェルト・ヤコブ病、海綿状脳症 (Spongiform encephalopathies)、パーキンソン疾患、ハンチントン疾患、筋萎縮性側索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis)、セルピン欠乏症(Serpin deficiency)、肺気腫(emphysema)、硬変症(cirrhosis)、第II型糖尿病、一次全身性アミロイド症、二次全身性アミロイド症、フロント一時的痴呆(Fronto-temporal dementias)、老人全身性アミロイド症、家族性アミロイドポリニューロパチー(familial amyloid polyneuropathy)、遺伝性大脳アミロイドアンギオパチー(hereditary cerebral amyloid angiopathy)、及び血透析関連アミロイド症を含む。したがって、用語“多量体形成ポリペプチド”は、用語“凝集体形成ポリペプチド”に変えて使用できる。
一般に、前記多量体形成ポリペプチドの単量体型(即ち、非凝集型)は、正常であり、多量体型(即ち、凝集型)は、疾患、特にアルツハイマー疾患及びクロイツフェルト・ヤコブ病のような神経退行性疾患を誘発する。
本発明の好ましい具現例によると、前記多量体形成ポリペプチドは、アルツハイマー疾患に関与するＡβペプチドとｔａｕ蛋白質、クロイツフェルト・ヤコブ病及び海綿状脳症に関与するプリオン、パーキンソン疾患に関与するα−シヌクレイン、一次全身性アミロイド症に関与するＩｇ軽鎖、二次全身性アミロイド症に関与する血清アミロイドＡ、フロント一時的痴呆に関与するｔａｕ蛋白質、老人全身性アミロイド症に関与するトランスチレチン、家族性アミロイドポリニューロパチーに関与するトランスチレチン、遺伝性大脳アミロイドアンギオパチーに関与するシスタチンＣ、血透析関連アミロイド症に関与するβ2−マイクログロブリン、ハンチントン疾患に関与するハンチンチン、筋萎縮性側索硬化症に関与するスーパーオキサイドディスムターゼ、セルピン欠乏症、肺気腫及び硬変症に関与するセルピン、及び第II型糖尿病に関与するアミリンを含む。より好ましくは、前記多量体形成ポリペプチドは、クロイツフェルト・ヤコブ病及び海綿状脳症を誘発するプリオン蛋白質である。本発明の方法をプリオン蛋白質(PrP)に適用する場合、単量体型ＰｒＰC(プリオンの細胞または正常型)であり、多量体型は、ＰｒＰSc(プリオンのスクレイピーまたは感染型)である。
本発明の方法は、二種類の抗体、即ち、捕獲抗体及び検出抗体を利用する。本明細書において、用語“捕獲抗体”は、生試料から検出しようとする多量体形成ポリペプチドに結合できる抗体を意味する。用語“検出抗体”は、前記捕獲抗体により捕獲された多量体形成ポリペプチドに結合できる抗体を意味する。“抗体”は、抗原に結合できる免疫グロブリン蛋白質を意味する。本明細書に利用された抗体は、検出しようとするエピトープ、抗原または抗原断片に結合できる全体抗体だけではなく、抗体断片(例えば、Ｆ(ｐａｂ’)２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ)を含む。
本発明の最も大きい特徴は、多量体形成ポリペプチド上のエピトープを特異的に認識する一組の捕獲抗体及び検出抗体を利用することであって、前記捕獲抗体及び検出抗体が特異的に認識する前記エピトープは、お互い同一またはオーバーラップされている。
捕獲抗体及び検出抗体に対するエピトープを言及する時に使用される用語“オーバーラップ”は、完全にまたは部分的にオーバーラップされたアミノ酸配列を含むエピトープを包括する。例えば、実施例から確認できるように、３０８及び３Ｆ４抗体に対するエピトープは、ヒトプリオン配列のそれぞれ、アミノ酸１０６−１２６及び１０９−１１２からなるアミノ酸配列を有する。このようなエピトープは、完全にオーバーラップされたエピトープとして説明できる。
本発明の具体的且つ好ましい具現例によると、ヒトプリオン配列を言及しながら表現する場合、前記エピトープは、アミノ酸１０９−１１２、１０６−１２６、１３２−１４７、１３５−１４０、１４６−１５１、１４４−１５３、１４３−１５１、１２９−１４９、または１１２−１２５からなるアミノ酸配列を有し、より好ましくは、アミノ酸１０９−１１２、１０６−１２６、１３２−１４７、１３５−１４０、１４６−１５１、または１４３−１５１、そして最も好ましくは、アミノ酸１０９−１１２、１０６−１２６、１３２−１４７、または１３５−１４０である。米国特許第４，８０６，６２７号に記載のように、ＰｒＰ109-112と反応する最も好ましい抗体は、３Ｆ４(Sigma)である。Hisako Furukawa, et al., J. Biol. Chem., 279: 23661-23667(2004)に記載のように、ＰｒＰ106-126と反応する最も好ましい抗体は、３０８である。
本発明の好ましい具現例によると、前記捕獲抗体が特異的に認識するエピトープは、多量体形成ポリペプチドにおいて反復されない配列である。好ましくは、前記検出抗体が特異的に認識するエピトープは、多量体形成ポリペプチドにおいて反復されない配列である。本発明の方法によると、捕獲抗体に結合された多量体形成ポリペプチドは、検出抗体とそれ以上結合できないが、これは、検出抗体が認識する追加的なエピトープが存在しないからである。
前記捕獲及び/または検出抗体を製造するために利用されるエピトープは、多量体形成ポリペプチド上で一度しか発見できない配列を選択することが好ましい。例えば、ｇｌｙ−反復配列は、プリオンの数ヶ所に存在する。したがって、前記配列は、本発明のエピトープとして不適である。好ましくは、配列番号１で記載されたヒトプリオン配列を言及しながら表現する場合、前記エピトープをアミノ酸９５−１８０から選択する。より好ましくは、前記エピトープをアミノ酸１００−１６０から選択し、最も好ましくは、１０９−１５３である。
本発明の具体的で且つ好ましい具現例によると、ヒトプリオン配列に関するものである場合、前記エピトープは、アミノ酸１０９−１１２、１０６−１２６、１３２−１４７、１３５−１４０、１４６−１５１、１４４−１５３、１４３−１５１、１２９−１４９、または１１２−１２５からなるアミノ酸配列を有し、より好ましくは、アミノ酸１０９−１１２、１０６−１２６、１３２−１４７、１３５−１４０、１４６−１５１、１４３−１５１、そして最も好ましくは、アミノ酸１０９−１１２、１０６−１２６、１３２−１４７、または１３５−１４０である。米国特許第４，８０６，６２７号に記載のように、ＰｒＰ109-112と反応する最も好ましい抗体は、３Ｆ４(Sigma)である。Hisako Furukawa, et al., J. Biol. Chem., 279: 23661-23667(2004)に記載のように、ＰｒＰ106-126と反応する最も好ましい抗体は、３０８(Cayman Chemical)である。ＰｒＰ132-147と反応する抗体として、Yoichi Matsunaga et al., Proteins, 44:110(2001)に記載されたＭＡ１−７５０(Affinity BioReagents, Inc)が最も好ましい。Hiroko Hayashi, et al., J. Vet. Med. Sci., 66(6):515(2004)に記載されたＴ２が、ＰｒＰ135-140と反応する最も好ましい抗体である。最も好ましくは、ＰｒＰ146-151、ＰｒＰ144-153、ＰｒＰ143-151、ＰｒＰ129-149、及びＰｒＰ112-125を特異的に認識する抗体は、それぞれ１Ｆ５、ＳＡＦ抗体(Cayman Chemical)、６Ｈ４(Prionics AG)、１Ｅ５/Ｇ６(Novus Biologicals)、及び７Ｂ６/Ｄ２(Novus Biologicals)である。
本発明の方法を牛生試料に適用する場合、アミノ酸１３５−１４０(牛プリオン配列を言及しながら表現する場合、配列番号２のアミノ酸１４５−１５０)(例えば、Ｔ２抗体)または１３２−１４７(牛プリオン配列を言及しながら表現する場合、配列番号２のアミノ酸１４２−１５７)(例えば、ＭＡ１−７５０抗体)のエピトープを認識する抗体が最も好ましい。例えば、捕獲抗体及び検出抗体の一組として、ＭＡ１−７５０/ＭＡ１−７５０、ＭＡ１−７５０/Ｔ２、Ｔ２/Ｔ２、またはＴ２/ＭＡ１−７５０の抗体組が、牛試料に適用される本発明の方法に非常に有用である。
ヒトの生試料(特に、血漿)を分析するために、本発明の方法を利用する場合、アミノ酸１０９−１１２(例えば、３Ｆ４抗体)、１０６−１２６(例えば、３０８抗体)、１３５−１４０(例えば、Ｔ２抗体)、または１３２−１４７(例えば、ＭＡ１−７５０抗体)のエピトープに対する抗体を利用することが好ましく、より好ましくは、アミノ酸１０９−１１２(例えば、３Ｆ４抗体)、１０６−１２６(例えば、３０８抗体)、及び１３５−１４０(例えば、Ｔ２抗体)のエピトープに対する抗体、そして最も好ましくは、アミノ酸１０９−１１２(例えば、３Ｆ４抗体)及び１０６−１２６(例えば、３０８抗体)のエピトープに対する抗体である。例えば、捕獲抗体及び検出抗体の一組として、３Ｆ４/３Ｆ４、３Ｆ４/３０８、３０８/３Ｆ４、または３０８/３０８の抗体組が、ヒト試料、特に血漿に適用される本発明の方法に非常に有用である。
好ましくは、捕獲抗体及び検出抗体は、お互い同一である。即ち、捕獲抗体及び検出抗体に特異的に結合されるエピトープは、同一であることが好ましい。
本発明の好ましい具現例によると、前記捕獲抗体は、固体基質に結合される。このような形態の公知の物質は、ポリスチレン及びポリプロピレン、ガラス、金属、及びゲルのような炭化水素重合体を含む。前記固体基質は、ディップスチック、マイクロプレート(microtiter plate)、粒子(例えば、ビーズ)、親和性カラム及び免疫ブロットメンブレイン(例えば、フッ化ポリビニリデンメンブレイン)状などが挙げられる(参照、米国特許第５，１４３，８２５号、第５，３７４，５３０号、第４，９０８，３０５号、及び第５，４９８，５５１号)。最も好ましくは、前記固体基質は、マイクロプレート(microtiter plate)である。
本発明の好ましい具現例によると、前記検出抗体は、検出可能な信号を生成させる標識を有する。前記標識は、化合物標識(例えば、バイオチン)、酵素標識(例えば、アルカリンフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、及びβ-グルコシダーゼ)、放射能標識(例えば、I125及びC14)、蛍光標識(例えば、フルオレセイン)、発光標識、化学発光標識、及びＦＲＥＴ(蛍光共鳴エネルギー伝達; fluorescence resonance energy transfer)標識を含むが、これに限定されるものではない。抗体を標識するための多様な標識及び方法は、当業界に公知されている(Harlow and Lane, eds. Antibodies: A Laboratory Manual (1988) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)。最も好ましくは、前記検出抗体をバイオチンまたはホースラディッシュパーオキシダーゼで標識することである。
本発明において、多量体形成ポリペプチドに結合できる抗体を融合方法(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976))、組み換えＤＮＡ方法(米国特許第4,816,56号)、またはファージ抗体ライブラリー(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991);及びMarks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))のような従来技術により、免疫源として従前に記載されたエピトープを利用して用意できる。前記抗体製造のための一般的な方法は、Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1988; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984;及びColigan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991に記載されている。単一クローン抗体の製造のためのハイブリドーマ細胞株の用意は、不死性を獲得した細胞株(immortal cell line)及び抗体を生産するリンパ球の融合により施される。前記単一クローン抗体の製造は、当業界に公知の技術を利用して実施できる。多クローン抗体は、上述の抗原を適合した動物に注入して、抗体を含む抗血清を収集した後、公知の親和性技術により、抗体を分離する方法により製造できる。
“生試料(biosample)”は、分析しようとする有機体由来の試料を意味する。前記生試料は、生物源の細胞、組織、または生体液、または本発明により分析できる他のミディアム(medium)を意味し、これは、人間から採取した試料、動物から採取した試料、人間または動物のための食品から採取した試料を含む。好ましくは、試験する生試料は、血液、血清、血漿、リンパ液、牛乳、小便、糞便、涙液、唾液、精液、脳抽出物(例えば、脳均質液)、脊髄液(SCF)、虫垂、脾臓、及び扁桃組織抽出物を含む体内流体試料である。より好ましくは、前記生試料は、脳均質液または血漿、最も好ましくは、血漿である。
脳均質液を生試料として利用する場合、好ましくは、本発明の方法は、前記ステップ(a)の前に、トリプシンで前記生試料を処理するステップをさらに含む。前記脳均質液試料は、凝集体形成ポリペプチドが捕獲抗体及び/または検出抗体に結合することを抑制する他の蛋白質及び物質を含む。このようなマトリックス抑制は、トリプシン処理法により阻害される。前記トリプシン処理の利点は、下記の実施例IVにより立証される。ＰＫがＰｒＰScを分解することにより、偽陰性データ(false negative data)を発生させる可能性があるため、プリオン検出法に従来利用された蛋白質分解酵素Ｋ(ＰＫ)の処理は、好ましくない。ＰｒＰCからＰｒＰScを区別するために、従来利用していたＰＫを処理する必要がないという点は、本発明の方法の利点の一つである。本発明のＭＤＳ方法そのものは、ＰＫの処理無しに、十分ＰｒＰCからＰｒＰScを区別できる能力を有する。
生試料として血漿を利用する場合、実施例Xで立証されたように、蛋白質分解酵素処理の必要性を完全に排除でき、これは、本発明の大きな利点である。
本発明の好ましい具現例によると、本発明の方法は、前記ステップ(a)の前に、蛋白質変性剤で前記生試料を処理するステップをさらに含む。このような蛋白質変性剤は、凝集体形成ポリペプチドのエピトープを露出させるため、凝集体形成ポリペプチドに捕獲/検出抗体が結合することを大いに向上させる。
前記蛋白質変性剤は、当業界に公知の様々な蛋白質変性剤を含むが、例えば、尿素、テトラメチル尿素、 塩酸グアニジン、グアニジンチオシナイド、及びドデシル硫酸ナトリウムを含む。好ましくは、前記蛋白質変性剤は、尿素、塩酸グアニジン及びグアニジンチオシナイドであり、最も好ましくは、塩酸グアニジンである。前記蛋白質変性剤の濃度は、特に、塩酸グアニジンは、０．３〜４Ｍの範囲であり、好ましくは、０．３〜３Ｍ、より好ましくは、０．５〜２Ｍ、そして最も好ましくは、約１Ｍである。前記蛋白質変性剤の処理時間は、特に、塩酸グアニジンは、５〜６０分範囲であり、好ましくは、１０〜５０分、より好ましくは、１０〜４０分、最も好ましくは、１５〜２０分である。
本発明の好ましい具現例によると、本発明の方法は、前記ステップ(a)の前に、前記生試料を加熱するステップをさらに含む。脳均質液を生試料として利用する場合、前記加熱は、７０〜１００℃の温度で行われて、好ましくは、８０〜１００℃、より好ましくは、９０〜１００℃、最も好ましくは、約１００℃である。血漿を生試料として利用する場合、前記加熱は、４０〜１００℃の温度で行われて、好ましくは５０〜８０℃、より好ましくは、６０〜８０℃、最も好ましくは、約７０℃である。
好ましくは、前記生試料は、界面活性剤を含む。本発明の方法に有用な界面活性剤は、当業界に公知の様々な界面活性剤を含むが、好ましくは、サルコシル(Ｎ−ラウリルサルコシン)、トリトンＸ−１００(ポリオキシエチレンアルキルフェノール)のようなトリトン類、デオキシコール酸ナトリウム、zwittergent-16のような双性イオン性界面活性剤(zwitterionic surfactant)、及びこれらの組み合わせ、より好ましくは、サルコシル、トリトンＸ−１００、デオキシコール酸ナトリウム、zwittergent-16、及びこれらの組み合わせである。最も好ましくは、脳均質液を生試料として利用する場合、前記生試料に含まれた界面活性剤は、トリトンＸ−１００及びデオキシコール酸ナトリウムの組み合わせである。最も好ましくは、前記血漿試料に含まれた界面活性剤は、サルコシル、トリトンＸ−１００、デオキシコール酸ナトリウム、及びzwittergent-16の組み合わせである。前記界面活性剤の濃度は、少なくとも０．５重量％、好ましくは、０．５〜３重量％である。脳均質液を生試料として利用する場合、前記界面活性剤の濃度は、１．０〜３．５重量％、好ましくは、１．５〜３．０重量％、より好ましくは、２．０〜３．０重量％であり、最も好ましくは、約２．５重量％である。前記血漿試料は、脳均質液より低い濃度の界面活性剤を含むが、好ましくは、０．２〜２．５重量％、好ましくは、０．３〜２．０重量％、より好ましくは、０．５〜１．５重量％であり、最も好ましくは、約０．６〜１．０重量％である。血漿を生試料として利用する場合、前記サルコシル界面活性剤を使用すると利点があるが、それは、本発明の方法の最終信号発生に、サルコシル界面活性剤がある程度寄与するからである。
本発明の好ましい具現例によると、血漿を生試料として利用する場合、本発明の方法は、前記ステップ(a)の前に、プラスミノゲン抑制剤で前記生試料を処理するステップをさらに含む。本明細書において、用語“プラスミノゲン抑制剤”は、プラスミノゲンの活性を抑制する物質、例えば、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、または組織活性剤を意味する。前記抑制は、プラスミンとフィブリン単量体間の結合に係わるプラスミノゲン上に、リジン結合部位をブロッキングすることにより一般的になされる。より好ましくは、プラスミノゲン抑制剤は、オメガ−アミノカルボキシル酸[例えば、４−アミノブチル酸、５−アミノペンタン酸、６−アミノヘキサン酸(アミノカプロン酸、ＡＣＡ)、及び７−アミノヘプタン酸]、Ｌ−リジン及び誘導体(Ｎ−アセチル−Ｌ−リジン、Ｌ−リジン−メチルエステル、及びＮ−アセチル−Ｌ−リジン−メチルエステル)、双性イオン[例えば、トランス−(アミノメチル)シクロヘキサンカルボキシル酸(ＡＭＣＨＡ)、ｐ−ベンジルアミンスルホン酸、及び双性イオン性ガンマ−グアニジノブチル酸]、ベンジルアミン、ベンズアミジン、Ｌ−アルギニン及びこれの誘導体(Ｎアルファ−アセチル−Ｌ−アルギニン、Ｎアルファ−アセチル−Ｌ−アルギニンメチルエステル、及びＬ−アルギニンメチルエステル)を含む。より好ましくは、前記抑制剤は、アミノカプロン酸またはトランス−(アミノメチル)シクロヘキサンカルボキシル酸であり、最も好ましくは、トランス−(アミノメチル)シクロヘキサンカルボキシル酸である。プラスミノゲン抑制剤による試料の前処理は、単量体から多量体(特に、ＰｒＰSc)の分別検出を向上させる。
多量体型−検出抗体複合体の検出は、当業界に公知の多様な方法により実施できる。多量体型−検出抗体複合体の形成は、生試料に多量体型の存在を示す。前記段階は、従来の方法により、例えば、Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980及びHarlow and Lane, eds. Antibodies: A Laboratory Manual(1988) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Yに記載のように、様々な検出可能な標識/基質組を利用して、定量的にまたは定性的に実施できる。
前記検出抗体をアルカリンフォスファターゼで標識する場合は、ブロモクロロインドリルフォスフェート(BCIP)、ニトロブルーテトラゾリウム(NBT)及びＥＣＦを、発色反応のための基質として利用できる；ホースラディッシュパーオキシダーゼで標識する場合、基質としてクロロナフトール、アミノエチルカルバゾール、ジアミノベンジジン、Ｄ−ルシフェリン、ルシゲニン(ビス−Ｎ−メチルアクリジニウムニトレート)、レソルフィンベンジルエーテル、ルミノール、アンプレックスレッド試薬(１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン)、ＴＭＢ(３，３，５，５−テトラメチルベンジジン)及びＡＢＴＳ(２，２−アジン−ジ[３−エチルベンズチアゾリンスルホネート])などが利用される。他の標識/基質組は、バイオチン/ストレプトアビジン、及びルシフェラーゼ/ルシフェリンを含む。
もし、カクテルされた捕獲抗体が、検出抗体に対するエピトープと同一またはオーバーラップされたエピトープに結合する場合は、本発明は、捕獲抗体として多様な種類の抗体を同時に利用することを包括する。実施例XIに記載のように、カクテルされた捕獲抗体、例えば、３０８及び３Ｆ４を利用する本発明は、ＰｒＰCからＰｒＰScを検出することができる。
本発明の一具体例を示す図１を参照し、本発明の方法をより詳細に説明する。ＰｒＰC及びＰｒＰScのようなＰｒＰのイソフォームを含む生試料を、捕獲抗体がコーティングされたマイクロプレートに適用させる場合、ＰｒＰC及びＰｒＰScの両方とも捕獲抗体に結合する。前記捕獲抗体が特異的に認識するエピトープ(明るい(light)台形として表れる)は、プリオン蛋白質において反復しない配列である。その後、捕獲抗体に対するエピトープと同一またはオーバーラップされたエピトープを認識するＨＲＰ標識された検出抗体を、捕獲抗体により捕獲されたＰｒＰSc及びＰｒＰCと接触する。ＰｒＰC上のエピトープは、捕獲抗体と既に結合されているため、エピトープ配列を一つしか有していないＰｒＰCには、検出抗体が結合しない。その反面、ＰｒＰScには、エピトープが多数存在するため、検出抗体がＰｒＰSc上の空いているエピトープに結合するようになる。検出抗体の処理後、マイクロプレートを洗浄し、ＨＲＰの基質であるＴＭＢ(３，３，５，５−テトラメチルベンジジン)で反応させて、発色反応を誘導する。最終的に、４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＰｒＰSc−抗体複合体の形成有無を決定する。
また、本発明は、凝集反応(agglutination)に基づいた分析方法を実施するようにデザインすることもできる。上記の場合、本発明の方法は、次のステップを含む：(a)単量体型、多量体型、または単量体型及び多量体型を捕獲するために、多量体形成ポリペプチド上のエピトープを認識する捕獲抗体に生試料を接触させるステップであって、前記捕獲抗体は、固体担体に結合されており、(b)前記固体担体に結合された捕獲抗体と前記多量体形成ポリペプチドとの間の凝集反応の発生を検出するステップであって、前記凝集反応の発生は、前記生試料に多量体型が存在することを示す。
本凝集反応の方法は、上述の本ＭＤＳ方法の変形例であって、その共通する事項は、本明細書の複雑性を避けるために、その記載を省略する。例えば、多量体形成ポリペプチド、捕獲抗体及び生試料に対する事項は、これらの方法の共通事項である。
本発明の好ましい具現例によると、前記捕獲抗体に結合された固体基質は、ゼラチン、ラテックス、ポリスチレン、及びコロイドゴールドビーズのようなビーズであり、より好ましくは、ラテックスビーズである。前記担体の大きさは、直径０．３ｎｍ〜２０μｍであればよいが、最適の大きさは、凝集反応の評価方法により選択できる。例えば、凝集反応の巨視的評価のためには、巨視的判断がより容易な直径０．２〜３μｍの担体を利用することが好ましい。
本発明の一具体例を示した図２を参照し、本発明の凝集反応(agglutination)の方法をより詳細に説明する。固体基質としてビーズを、プリオン蛋白質上のエピトープ(好ましくは、非反復配列のエピトープ)に結合するようにするために、抗体でコーティングする。ビーズを、ＰｒＰSc及びＰｒＰCを含む生試料に接触させる場合、ＰｒＰSc及びＰｒＰCの両方とも、ビーズに結合された抗体に結合する。また、多数のエピトープを運搬するＰｒＰScは、ビーズ上の抗体に結合してＰｒＰSc/ビーズ複合体を形成して、これは、凝集反応を招来する。しかしながら、ＰｒＰCは、一つのエピトープしか有していないため、凝集反応を誘発しない。前記凝集反応の発生は、当業界に公知の従来方法により、容易に検出できる。
本発明の特徴及び利点を要約すると、以下のようである：
(i)本発明の方法は、多量体−特異的抗体を要求しない。例えば、前記方法は、ＰｒＰSc−特異的抗体に依存的ではない。ＰｒＰSc及びＰｒＰc間に交差反応性を有する抗体を、生試料内のＰｒＰScを分別検出するための本発明に成功的に適用できる。
(ii)本発明は、ＰｒＰSc検出のために、従来利用してきた蛋白質分解酵素Ｋ(ＰＫ)処理を必要としない。本発明のＭＤＳ方法そのものは、ＰＫを処理しなくても、十分ＰｒＰCからＰｒＰScを区別できる能力を有する。
(iii)本発明は、血漿試料内の凝集型(特に、ＰｒＰSc)を免疫分析方法により検出できるようにする。血漿内のＰｒＰScの成功的な検出に関して知られたことは、ほとんどない；及び、
(iv)本発明は、便利且つ迅速な方式により実施できて、これは、ＭＤＳの自動化を可能にする。
(i)本発明の方法は、多量体−特異的抗体を要求しない。例えば、前記方法は、ＰｒＰSc−特異的抗体に依存的ではない。ＰｒＰSc及びＰｒＰc間に交差反応性を有する抗体を、生試料内のＰｒＰScを分別検出するための本発明に成功的に適用できる。
(ii)本発明は、ＰｒＰSc検出のために、従来利用してきた蛋白質分解酵素Ｋ(ＰＫ)処理を必要としない。本発明のＭＤＳ方法そのものは、ＰＫを処理しなくても、十分ＰｒＰCからＰｒＰScを区別できる能力を有する。
(iii)本発明は、血漿試料内の凝集型(特に、ＰｒＰSc)を免疫分析方法により検出できるようにする。血漿内のＰｒＰScの成功的な検出に関して知られたことは、ほとんどない；及び、
(iv)本発明は、便利且つ迅速な方式により実施できて、これは、ＭＤＳの自動化を可能にする。
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
実験材料
３Ｆ４及び３Ｆ４−バイオチン抗体をそれぞれSigma(US)及びAbcam Ltd(UK) から購入した。３０８及びＭＡ１−７５０抗体をCayman Chemical Co.及びAffinity BioReagents Inc.(US)から購入した。Ｔ２−ＨＲＰ及び１Ｆ５抗体を動物衛生研究所(JP)から寄贈してもらった。牛及びハムスター組み換え(23−231)プリオン蛋白質をそれぞれPrionics AG.(スイス)及びAlicon AG(スイス)から購入した。マウス及びヒト組み換え(23-231)プリオン蛋白質をメリランド大学(US)及び動物衛生研究所(JP)から寄贈してもらった。同じ年齢の正常及びスクレイピーハムスターの脳均質液をそれぞれSLC, Inc.(JP)及びボルディモア研究/教育財団から購入した。ＨＲＰ接合抗マウスＩｇＧ及びエンハンス化学発光キットをAmersham Biosciences(UK)から購入した。ＰＶＤＦメンブレインをBio-Rad Inc.(US)から購入した。StartingblockをPierce Biotechnology Inc.（US）から購入した。Ｘ−ｒａｙフィルムをFuji Inc.(JP)から購入した。化学発光ＨＲＰ基質、スーパーシグナルウェストピコ(Supersignal West Pico)をPierce Biotechnology Inc.(US)から購入した。ＴＭＢをSigma(US)から購入した。脳均質液から精製されたマウスＰｒＰScを動物衛生研究所(JP)から寄贈したもらった。トリプシンをFluka(US)から購入した。蛋白質分解酵素阻害剤カクテルをSigma(US)から購入した。
３Ｆ４及び３Ｆ４−バイオチン抗体をそれぞれSigma(US)及びAbcam Ltd(UK) から購入した。３０８及びＭＡ１−７５０抗体をCayman Chemical Co.及びAffinity BioReagents Inc.(US)から購入した。Ｔ２−ＨＲＰ及び１Ｆ５抗体を動物衛生研究所(JP)から寄贈してもらった。牛及びハムスター組み換え(23−231)プリオン蛋白質をそれぞれPrionics AG.(スイス)及びAlicon AG(スイス)から購入した。マウス及びヒト組み換え(23-231)プリオン蛋白質をメリランド大学(US)及び動物衛生研究所(JP)から寄贈してもらった。同じ年齢の正常及びスクレイピーハムスターの脳均質液をそれぞれSLC, Inc.(JP)及びボルディモア研究/教育財団から購入した。ＨＲＰ接合抗マウスＩｇＧ及びエンハンス化学発光キットをAmersham Biosciences(UK)から購入した。ＰＶＤＦメンブレインをBio-Rad Inc.(US)から購入した。StartingblockをPierce Biotechnology Inc.（US）から購入した。Ｘ−ｒａｙフィルムをFuji Inc.(JP)から購入した。化学発光ＨＲＰ基質、スーパーシグナルウェストピコ(Supersignal West Pico)をPierce Biotechnology Inc.(US)から購入した。ＴＭＢをSigma(US)から購入した。脳均質液から精製されたマウスＰｒＰScを動物衛生研究所(JP)から寄贈したもらった。トリプシンをFluka(US)から購入した。蛋白質分解酵素阻害剤カクテルをSigma(US)から購入した。
実施例I：組み換えプリオン蛋白質のウェスタンブロット分析
組み換え牛プリオン蛋白質０．２ｎｇ(PrP23-231、メリランド大学から入手)を、変性剤を使用せずにnative gel(12.5% SDS-PAGE)にローディングして、４℃で１２時間以上電気泳動ゲルの蛋白質バンドをＰＶＤＦメンブレイン(Bio-Rad)に転移させた。前記ＰＶＤＦブロットをＴＢＳ緩衝液内５０％Startingblock(PIERCE)でブロッキングした。その後、６Ｈ４抗体(Prionics AG)を一次抗体として使用して、ＨＲＰ結合−抗マウスＩｇＧ(Amersham)を二次抗体として使用した。Ｘ−ｒａｙフィルム(Fuji)に露出させて前記ブロットを検出するために、エンハンス化学発光(ECL)法を利用した。二量体、三量体、及びより大きい高分子量のバンドとして表れるプリオン多量体を検出した。
組み換え牛プリオン蛋白質０．２ｎｇ(PrP23-231、メリランド大学から入手)を、変性剤を使用せずにnative gel(12.5% SDS-PAGE)にローディングして、４℃で１２時間以上電気泳動ゲルの蛋白質バンドをＰＶＤＦメンブレイン(Bio-Rad)に転移させた。前記ＰＶＤＦブロットをＴＢＳ緩衝液内５０％Startingblock(PIERCE)でブロッキングした。その後、６Ｈ４抗体(Prionics AG)を一次抗体として使用して、ＨＲＰ結合−抗マウスＩｇＧ(Amersham)を二次抗体として使用した。Ｘ−ｒａｙフィルム(Fuji)に露出させて前記ブロットを検出するために、エンハンス化学発光(ECL)法を利用した。二量体、三量体、及びより大きい高分子量のバンドとして表れるプリオン多量体を検出した。
図３から確認できるように、前記結果は、多数のプリオン多量体及び単量体が組み換え牛プリオン蛋白質試料に存在して、６Ｈ４抗プリオン抗体により検出できることを意味する。
実施例II：本発明の方法のＰｒＰＳ c 検出可能性の評価
ＭＡ１−７５０抗体でコーティングされたプレートを製造した。ＭＡ１−７５０抗体(抗プリオン蛋白質、Affinity bioreagents, Inc.)３０μｇを２００ｍＭ ＭＯＰＳ １０μｇに懸濁させて、この懸濁液の１００μｌ分画をImmuno module plates(Nunc-468667)の各ウェルに入れた後、４℃で一晩中反応した。前記プレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに溶かした卵白アルブミンにより室温で１時間ブロッキングした。
ＭＡ１−７５０抗体でコーティングされたプレートを製造した。ＭＡ１−７５０抗体(抗プリオン蛋白質、Affinity bioreagents, Inc.)３０μｇを２００ｍＭ ＭＯＰＳ １０μｇに懸濁させて、この懸濁液の１００μｌ分画をImmuno module plates(Nunc-468667)の各ウェルに入れた後、４℃で一晩中反応した。前記プレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳに溶かした卵白アルブミンにより室温で１時間ブロッキングした。
４％zwittergent(Anaphase Inc., US)内１０％牛脳均質液を４倍ずつ連続希釈して、ＭＡ１−７５０抗体がコーティングされたプレートに分株した後、３７℃で１時間反応した。ＭＡ１−７５０抗体は、ＰｒＰCのSer-Arg-Pro-Leu-Ile-His-Phe-Gly-Ser-Asp-Tyr-Glu-Asp-Argエピトープを認識うるものであって、前記エピトープ配列は、プリオンにおいて反復しない。前記プレートをＴＢＳＴ緩衝液で５回洗浄し、MA1-750-HRP(1:2000 in TBST)で３７℃１時間反応した。培養後、前記プレートをＰＢＳで洗浄して、前記ＨＲＰの活性をＨＲＰ基質である３，３，５，５−テトラメチルベンジジン(TMB, SIGMA Inc.)で３０分間反応させることにより定量した。発色信号は、SpectraMax Plus384(Moledular Device Inc.)を利用して、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
一方、比較例として、SPIbio社で販売しているＰｒＰC酵素免疫分析キット(#A05201)を利用して分析した。４％zwittergent(Anaphase Inc., US)内１０％牛脳均質液を４倍ずつ連続希釈して、ＭＡ１−７５０抗体がコーティングされたプレートに分株した後、３７℃で１時間反応した。 前記プレートをＴＢＳＴ緩衝液で５回洗浄して、SPIbio社のキットにある抗プリオントレーサー(PrPCのN-末端にあるocto-リピート部位を認識する)を添加した後、３７℃で１時間反応した。その後、前記プレートをSPIbio社の洗浄緩衝液で洗浄し、Ellman's試薬２００μｌ添加して３０分間発色反応した。発色信号は、SpectraMax Plus384(Moledular Device Inc.)を利用して、４００ｎｍにおける吸光度を測定した。
上記表１において、ＮＳＢ(非特異的結合)は、牛脳均質液を使わなかった実験群を示し、バックグラウンドは、抗体を使わずに、発色反応基質のみを添加した実験群を示す。
表１及び図４から確認できるように、本発明のＭＤＳは、最終発色信号において、ＰｒＰC関与を完全に排除したことが分かる。このような結果は、捕獲抗体及び検出抗体として、ＭＡ１−７５０抗体が二重的に利用されるためであって、これは、本発明の最も大きい特徴である。また、ＭＤＳのかかる分別能力を決定する部分的な要因は、ＭＡ１−７５０が認識したエピトープ配列がプリオン内で反復されないということである。その反面、SPIbio社で販売しているキットを利用した場合は、より高いＯＤ値が測定されたが、これは、最終発色信号結果にＰｒＰCが関与するということを示す。
結果的に、本発明のＭＤＳを利用すると、生試料内のＰｒＰScのみを特異的に検出できることが分かる。
実施例III：凝集反応によるプリオン蛋白質の多量体型検出
多量体型組み換え牛プリオン蛋白質を製造した。組み換え牛プリオン蛋白質３．１μｇをカップリング緩衝液(5mMリン酸カリウム、75mM NaCl、pH 6.5)７００μｌに溶解して、これをＥＤＣ(１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド、Sigma E6383)溶液と室温で２４時間反応した。
多量体型組み換え牛プリオン蛋白質を製造した。組み換え牛プリオン蛋白質３．１μｇをカップリング緩衝液(5mMリン酸カリウム、75mM NaCl、pH 6.5)７００μｌに溶解して、これをＥＤＣ(１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド、Sigma E6383)溶液と室温で２４時間反応した。
ＭＡ１−７５０抗体をラテックスビーズにコーティングした。ＭＡ１−７５０抗体７０μｌをカップリング緩衝液(5mMリン酸カリウム、75mM NaCl、pH 6.5)４ｍｌと混合し、遠心分離して濃縮した。７０μｌのラテックスビーズ(Carboxylate modified Latex beads, Sigma L5530)を遠心分離して沈殿させて、上澄み液を捨てた後、カップリング緩衝液を添加した。ＥＤＣ溶液にビーズ溶液７０μｌを混合して、濃縮されたＭＡ１−７５０抗体と反応させて、次いで室温で２４時間反応させた。コーティングされたビーズを遠心分離で沈殿させて、洗浄緩衝液(10 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1%卵白アルブミン, pH 7.5)で再懸濁させて、再沈殿させた。前記沈殿されたビーズをＰＢＳ ７０μｌに溶解させた。
その後、ＭＡ１−７５０コーティングされたラテックスビーズ１０μｌにＥＤＣを処理したあるいは処理しなかった１％牛脳均質液１０μｌ、または、ＥＤＣを処理したあるいは処理しなかった組み換え牛プリオン蛋白質４５ｎｇを混合した後、前記結果物を蛍光顕微鏡(x 400, Carl Zeiss Axiovert 100)で観察した。
実験結果、牛脳均質液では、ＥＤＣ処理有無に係わらず、ごく僅かな凝集反応を観察した。前記僅かな凝集反応は、牛脳均質液に存在する極微量のＰｒＰScにより形成された多量体型プリオンのために発生されたと判断される。その反面、組み換えプリオン蛋白質においては、ＥＤＣを処理した多量体プリオン試料でのみ凝集反応を観察した。
結果的に、本発明の凝集反応方法により、生試料内のＰｒＰScを分別検出できることが分かる。
実施例IV：ハムスター脳均質液内のＰｒＰ Sc 多量体検出
予め製造されたハムスタースクレイピー脳均質液(10重量%)を購入した。同じ年齢の正常脳均質液(10重量%)を、ＰＢＳ及び均質機を利用して製造した。前記脳均質液をトリプシン(5mg/ml)で３７℃で１時間分解して、前記トリプシン分解を蛋白質分解酵素阻害剤カクテルにより中止させた。前記試料を８Ｍ塩酸グアニジン(Sigma, Gdn-HCl)で処理し１．０Ｍにして、周囲温度で１５分間反応させた。その後、前記試料を０．２５Ｍ Ｇｄｎ−ＨＣｌにするために、ＴＢＳＴ、２％トリトンＸ−１００及び０．５％デオキシコール酸ナトリウムを添加して追加的に希釈した。前記試料を１００℃で５〜１０分間加熱した。前記試料が周囲温度に到達した後、前記試料をＭＤＳに適用した。前記ＭＤＳセットに対し、プレート上にコーティングされたＴ２を捕獲抗体として利用し、Ｔ２−ＨＲＰを検出抗体として利用した。
予め製造されたハムスタースクレイピー脳均質液(10重量%)を購入した。同じ年齢の正常脳均質液(10重量%)を、ＰＢＳ及び均質機を利用して製造した。前記脳均質液をトリプシン(5mg/ml)で３７℃で１時間分解して、前記トリプシン分解を蛋白質分解酵素阻害剤カクテルにより中止させた。前記試料を８Ｍ塩酸グアニジン(Sigma, Gdn-HCl)で処理し１．０Ｍにして、周囲温度で１５分間反応させた。その後、前記試料を０．２５Ｍ Ｇｄｎ−ＨＣｌにするために、ＴＢＳＴ、２％トリトンＸ−１００及び０．５％デオキシコール酸ナトリウムを添加して追加的に希釈した。前記試料を１００℃で５〜１０分間加熱した。前記試料が周囲温度に到達した後、前記試料をＭＤＳに適用した。前記ＭＤＳセットに対し、プレート上にコーティングされたＴ２を捕獲抗体として利用し、Ｔ２−ＨＲＰを検出抗体として利用した。
前記試料１００μｌをＴ２のコーティングされたプレートに適用し、シェーキングしながら１時間３７℃で反応させた。次いで、ＴＢＳＴで洗浄(４回)して、Ｔ２−ＨＲＰ(1μg/ml)１００μｌを、Ｔ２のコーティングされたプレート上に捕獲された多量体検出のために適用した。前記プレートを周囲温度で１時間反応させて、ＴＢＳＴで４回洗浄した。ＴＭＢ１００μｌを各ウェルに添加し、信号を示すようにするために、３０分間保管した。１Ｎ Ｈ2ＳＯ4 ５０μｌを添加して前記信号発生を中止させ、プレートスペクトロフォトメーターを利用して、４５０ｎｍでプレートの吸光度を測定した。
図５から分かるように、正常試料よりも遥かに高い信号をスクレイピーハムスター脳均質液から観察した。蛋白質分解酵素Ｋまたはトリプシンの処理は、結局正常ＰｒＰCを完全に分解した。正常及びスクレイピー試料間の信号の差異は、蛋白質分解酵素Ｋまたはトリプシン分解を利用してさらに大きくなった。スクレイピー試料が蛋白質分解酵素Ｋにより部分的に分解されることが観察されて、これは、従前の論文で論議されたように、蛋白質分解酵素Ｋ−関連プリオン分析方法の結果(false negative results)を招来する要因である。その反面、前記トリプシン処理は、スクレイピー型を分解しないことが究明され、これは結局、非常に向上されたＰｒＰScの検出を可能にする。ＰｒＰSc(多量体)がＭＤＳによりハムスタースクレイピー脳均質液から検出されて、正常ハムスター試料では検出されなかった。
実施例V：血漿の用意
血液試料を正常または散発性ＣＪＤ患者から採取し、クエン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、及びヘパリンチューブ、好ましくは、ヘパリンに入れた。血漿を得るために、一般的な血漿収集過程を利用した。前記チューブを１０〜１５分間１０００×ｇ及び/または２８００×ｇで遠心分離した。透明な上澄み液(血漿)を分離して、使用するまで−８０℃で保管した。同じ年齢の正常及びスクレイピー感染ハムスター血漿を５匹以上のプール(pool)から得て、クエン酸ナトリウムチューブに入れた。血漿を上述のように得た。ＭＤＳに適用される血漿試料処理のために、血漿を塩酸グアニジンと混合し(Sigma, Gdn-HCl)、最終濃度１〜２Ｍにして、１５〜６０分間室温または３７℃で反応させた。前記試料を界面活性剤、０，０２％サルコシル(Sigma)、０．５％トリトンＸ−１００(Samchun Chemical)、０．１２５％デオキシコール酸ナトリウム(sigma)、及び０．５％または１％zwittergent-16(Anaphase Inc.、米国)を含むＴＢＳまたはＰＢＳ緩衝液で希釈し、室温で１５分間、または１５〜６０分間３７℃で反応させ、変性剤の最終濃度を０．１２５〜０．５Ｍに調節した。その後、前記試料を１０〜１５分間７０℃で加熱し、室温に到達するように維持した。
血液試料を正常または散発性ＣＪＤ患者から採取し、クエン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、及びヘパリンチューブ、好ましくは、ヘパリンに入れた。血漿を得るために、一般的な血漿収集過程を利用した。前記チューブを１０〜１５分間１０００×ｇ及び/または２８００×ｇで遠心分離した。透明な上澄み液(血漿)を分離して、使用するまで−８０℃で保管した。同じ年齢の正常及びスクレイピー感染ハムスター血漿を５匹以上のプール(pool)から得て、クエン酸ナトリウムチューブに入れた。血漿を上述のように得た。ＭＤＳに適用される血漿試料処理のために、血漿を塩酸グアニジンと混合し(Sigma, Gdn-HCl)、最終濃度１〜２Ｍにして、１５〜６０分間室温または３７℃で反応させた。前記試料を界面活性剤、０，０２％サルコシル(Sigma)、０．５％トリトンＸ−１００(Samchun Chemical)、０．１２５％デオキシコール酸ナトリウム(sigma)、及び０．５％または１％zwittergent-16(Anaphase Inc.、米国)を含むＴＢＳまたはＰＢＳ緩衝液で希釈し、室温で１５分間、または１５〜６０分間３７℃で反応させ、変性剤の最終濃度を０．１２５〜０．５Ｍに調節した。その後、前記試料を１０〜１５分間７０℃で加熱し、室温に到達するように維持した。
実施例VI：コントロールＥＬＩＳＡを利用して、総ＰｒＰ濃度に対するＰｒＰ Sc 検出
抗体がコーティングされたプレートを下記従来の方法により用意した。３０８(Cayman)のエピトープは、KTNMKHMAGAAAAGAVVGGLG(106-126)、３Ｆ４(Sigma)のエピトープは、ＭＫＨＭ(109-112)であって、お互いオーバーラップされている。コントロールＥＬＩＳＡを利用して、ヒト血漿内の総プリオン蛋白質を検出するために、濃度１〜５μｌ/ｍｌのコーティング緩衝液(BupH Carbonate-Bicarbonate; PIERCE)を利用して、３０８、３Ｆ４、または３０８及び３Ｆ４の組み合わせを、９６−ウェルポリスチレンマイクロプレート(NUNC)上にコーティングした。前記プレートを４℃で一晩中保管し、次いで、室温で３０〜６０分間ＴＢＳまたはＰＢＳ(pH 7.4)内で、Startingblock(PIERCE)またはBlock Ace(Serotec)でブロッキングした。
抗体がコーティングされたプレートを下記従来の方法により用意した。３０８(Cayman)のエピトープは、KTNMKHMAGAAAAGAVVGGLG(106-126)、３Ｆ４(Sigma)のエピトープは、ＭＫＨＭ(109-112)であって、お互いオーバーラップされている。コントロールＥＬＩＳＡを利用して、ヒト血漿内の総プリオン蛋白質を検出するために、濃度１〜５μｌ/ｍｌのコーティング緩衝液(BupH Carbonate-Bicarbonate; PIERCE)を利用して、３０８、３Ｆ４、または３０８及び３Ｆ４の組み合わせを、９６−ウェルポリスチレンマイクロプレート(NUNC)上にコーティングした。前記プレートを４℃で一晩中保管し、次いで、室温で３０〜６０分間ＴＢＳまたはＰＢＳ(pH 7.4)内で、Startingblock(PIERCE)またはBlock Ace(Serotec)でブロッキングした。
コントロールＥＬＩＳＡでマウス及び牛血漿内の総プリオン蛋白質を検出するために、検出抗体としてＴ２−ＨＲＰ、捕獲抗体として１Ｆ５抗プリオン抗体を利用した。３Ｆ４及び３０８がマウスまたは牛のプリオン蛋白質に結合しないため、マウス及び牛プリオン蛋白質に結合できる１Ｆ５抗体を利用した。
前記血漿試料を、マウスプリオンを検出するために、野生型及びＰｒＰノック−アウトマウスから、そしてヒトプリオンを検出するために、正常ヒトから得た。前記血漿試料を抗体でコーティングされたプレート上に分株して、３７℃で６０分間またはそれ以上の時間反応した。その後、前記プレートを０．０５％Tween 20(Sigma)を含むＴＢＳで４回洗浄した。１〜５μｇ/ｍｌ濃度の検出抗体、Ｔ２−ＨＲＰまたは５Ｇ１２−バイオチン(225-228)を各ウェルに添加し、次いで３７℃で１時間反応した。前記プレートを再び洗浄し、総ＰｒＰをストレプトアビジン/バイオチン/ＨＲＰ検出システムで検出した。ＴＢＳＴに希釈されたストレプトアビジン(2μg/ml, Promega)１００μｌを、各ウェルに添加して、周囲温度で１時間反応した。その後、前記プレートを０．０５％ Tween 20(Sigma)を含むＴＢＳで４回洗浄した。ＴＢＳＴ(Sigma)を含む１０％Startingblock(PIERCE)を利用して、バイオチン−ＨＲＰ(Molecular Probes)を１μｇ/ｍｌまで希釈し、この希釈液１００μｌを各ウェルに添加した。周囲温度で１時間反応させた後、前記プレートを０．０５％Tween 20(Sigma)を含むＴＢＳで４回洗浄した。ＴＭＢ(100 μl, Sigma)を前記ウェルに添加して、３０分間反応し、信号を示すようにした。１Ｎ Ｈ2ＳＯ4 ５０μｌを添加して前記信号発生を中止させ、プレートスペクトロフォトメーターを利用して４５０ｎｍでプレートの吸光度を測定した。ＨＲＰを利用したため、多いＨＲＰ基質を利用し、光学密度、蛍光、化学発光、放射能同位元素、電気化学検出法を実施することができる。
図６ａから確認できるように、コントロールＥＬＩＳＡシステムは、野生型マウスから得た血漿試料から濃度依存的に信号を生成させるが、プリオン蛋白質のないＰｒＰノック−アウトマウスからは信号を生成させない。また、捕獲及び検出抗体としてそれぞれＭＡ１−７５０及びＴ２−ＨＲＰを利用する本発明のＭＤＳに対する実験において、野生型及びＰｒＰノック−アウトマウスの血漿試料に対する信号が観察されなかったが、これは、血漿試料が多量体型ＰｒＰScを含んでいないからである(図６ｂ)。また、前記コントロールＥＬＩＳＡシステムは、正常ヒト血漿から濃度依存的な信号を示す(図６ｃ)。
実施例VII：ＭＤＳによる組み換えプリオン蛋白質内のＰｒＰ Sc 検出
牛及びマウス組み換えプリオン蛋白質のＰｒＰScを検出するために、ＭＡ１−７５０抗体を捕獲抗体として利用し、Ｔ２−ＨＲＰを検出抗体として利用した。ヒト組み換えプリオン蛋白質内のＰｒＰScを検出するために、３０８及び３Ｆ４−バイオチン抗体を、それぞれ捕獲抗体及び検出抗体として利用した。
牛及びマウス組み換えプリオン蛋白質のＰｒＰScを検出するために、ＭＡ１−７５０抗体を捕獲抗体として利用し、Ｔ２−ＨＲＰを検出抗体として利用した。ヒト組み換えプリオン蛋白質内のＰｒＰScを検出するために、３０８及び３Ｆ４−バイオチン抗体を、それぞれ捕獲抗体及び検出抗体として利用した。
前記組み換えプリオン蛋白質試料を０．０５％Tween 20(Sigma)を含むＴＢＳで希釈して、３倍ずつ希釈した、２、０．６７、０．２２、０．０７、０．０２、０．０１、及び０μｇ/ｍｌの蛋白質試料を、捕獲抗体でコーティングされたプレートに分株した後、３７℃で６０分間またはそれ以上の時間反応した。その後、前記プレートを０．０５％Tween 20(Sigma)を含むＴＢＳで４回洗浄した。１〜５μｇ/ｍｌ濃度で前記検出抗体を各ウェルに添加し、次いで３７℃で１時間反応した。前記プレートを再び洗浄し、前記多量体をストレプトアビジン/バイオチン/ＨＲＰ検出システムを利用して検出した。ＴＢＳＴに希釈されたストレプトアビジン(2μg/ml, Promega)１００μｌを各ウェルに添加して、周囲温度で１時間反応した。その後、０．０５％ Tween 20(Sigma)を含むＴＢＳで４回洗浄した。ＴＢＳＴ(Sigma)を含む１０％Startingblock(PIERCE)を利用して、バイオチン−ＨＲＰ(Molecular Probes)を１μｇ/ｍｌまで希釈し、この希釈液１００μｌを各ウェルに添加した。周囲温度で１時間培養した後、前記プレートを０．０５％Tween 20(Sigma)を含むＴＢＳで４回洗浄した。ＴＭＢ(100 μl, Sigma)を各ウェルに添加して、信号を示すようにするために３０分間保管した。１Ｎ Ｈ2ＳＯ4 ５０μｌを添加して前記信号発生を中止させ、プレートスペクトロフォトメーターを利用して４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。ＨＲＰを利用したため、多いＨＲＰ基質を利用し、光学密度、蛍光、化学発光、放射能同位元素、電気化学検出法を実施することができる。ＨＲＰを利用したため、多いＨＲＰ基質を利用し、光学密度、蛍光、化学発光、放射能同位元素、電気化学検出法における変化を検出することができる。
図７ａ〜７ｃから分かるように、実施例１のウェスタンブロット結果と同様に、前記ＭＤＣ方法により、濃度依存的に、前記多量体を牛、マウス及びヒト組み換えプリオン蛋白質試料から検出した。
実施例VIII：牛血漿にスパイクされた、マウス脳から精製されたＰｒＰ Sc の検出
スクレイピーマウス脳から精製されたＰｒＰSc(プリオンの多量体型)を１００％牛血漿にスパイクして、前記ＭＤＳプロトコールによりＭＤＳを実施した。簡単に説明すると、１．２５、０．４２、０．１４、０．０５、０．０２、及び０％精製されたＰｒＰScを１００％牛血漿に添加して、約３．１２５、１．０４、０．３５、０．１２、０．０４、０．０１、及び０μｇ/ｍｌのＰｒＰScを得た。スパイクされた血漿１００μｌを、３７℃で１時間ＭＡ１−７５０のコーティングされたプレート上で反応させた。前記プレートをＴＢＳＴで４回洗浄した後、Ｔ２−ＨＲＰ検出抗体を添加し、次いで周囲温度で１時間反応させた。前記プレートをＴＢＳＴで４回洗浄し、信号を示すようにするためにＴＭＢを３０分間添加した。停止溶液(１Ｎ Ｈ2ＳＯ4の５０μl)を添加した後、前記プレートを４５０ｎｍで測定した。
スクレイピーマウス脳から精製されたＰｒＰSc(プリオンの多量体型)を１００％牛血漿にスパイクして、前記ＭＤＳプロトコールによりＭＤＳを実施した。簡単に説明すると、１．２５、０．４２、０．１４、０．０５、０．０２、及び０％精製されたＰｒＰScを１００％牛血漿に添加して、約３．１２５、１．０４、０．３５、０．１２、０．０４、０．０１、及び０μｇ/ｍｌのＰｒＰScを得た。スパイクされた血漿１００μｌを、３７℃で１時間ＭＡ１−７５０のコーティングされたプレート上で反応させた。前記プレートをＴＢＳＴで４回洗浄した後、Ｔ２−ＨＲＰ検出抗体を添加し、次いで周囲温度で１時間反応させた。前記プレートをＴＢＳＴで４回洗浄し、信号を示すようにするためにＴＭＢを３０分間添加した。停止溶液(１Ｎ Ｈ2ＳＯ4の５０μl)を添加した後、前記プレートを４５０ｎｍで測定した。
図８に示されたように、前記実験結果は、１００％牛血漿内の、スクレイピーマウス脳から精製されたＰｒＰSc(プリオンの多量体型)を、ＭＤＳにより濃度依存的に検出した。スクレイピーマウス脳から精製されたＰｒＰScがない牛血漿試料は、如何なる信号も示さなかった。
実施例IX：牛血漿の濃縮
本実験の目的は、濃縮後の牛血漿内のプリオン多量体を検出するためのものである。牛血漿をAmino遠心分離濃縮機を利用して、２００、４００、及び５００％まで濃縮した。前記濃縮された試料を、前記プロトコールにしたがってコントロールＥＬＩＳＡ及びＭＤＳにより分析した。ＭＡ１−７５０及びＴ２−ＨＲＰの一セットをＭＤＳのために利用して、１Ｆ５及びＴ２−ＨＲＰの一セットをコントロールＥＬＩＳＡのために利用した。
本実験の目的は、濃縮後の牛血漿内のプリオン多量体を検出するためのものである。牛血漿をAmino遠心分離濃縮機を利用して、２００、４００、及び５００％まで濃縮した。前記濃縮された試料を、前記プロトコールにしたがってコントロールＥＬＩＳＡ及びＭＤＳにより分析した。ＭＡ１−７５０及びＴ２−ＨＲＰの一セットをＭＤＳのために利用して、１Ｆ５及びＴ２−ＨＲＰの一セットをコントロールＥＬＩＳＡのために利用した。
図９に示されたように、牛血漿内のプリオンがコントロールＥＬＩＳＡにより検出されたが、ＭＤＳによっては、多様な血漿濃縮物から如何なる信号も観察されず、この結果は、正常牛血漿内のプリオン蛋白質が単量体型に存在することを示す。
実施例X：血漿におけるＰｒＰ Sc の検出
３０８抗体を捕獲抗体として、３Ｆ４−バイオチンを検出抗体として利用した。血漿試料を３０８(Cayman)でコーティングされたプレート上に分株して、３７℃で６０分間またはそれ以上の時間反応させた。その後、前記プレートを０．０５％ Tween 20(Sigma)を含むＴＢＳで４回洗浄した。検出抗体の３Ｆ４−バイオチンを１〜５μｇ/ｍｌ濃度で各ウェルに添加し、次いで３７℃で１時間反応した。前記プレートを再び洗浄し、上記のようにストレプトアビジン/バイオチン/ＨＲＰ検出システムを利用して多量体を検出した。ＨＲＰを利用したため、多いＨＲＰ基質を利用し、光学密度、蛍光、化学発光、放射能同位元素、電気化学検出法における変化を検出することができる。
３０８抗体を捕獲抗体として、３Ｆ４−バイオチンを検出抗体として利用した。血漿試料を３０８(Cayman)でコーティングされたプレート上に分株して、３７℃で６０分間またはそれ以上の時間反応させた。その後、前記プレートを０．０５％ Tween 20(Sigma)を含むＴＢＳで４回洗浄した。検出抗体の３Ｆ４−バイオチンを１〜５μｇ/ｍｌ濃度で各ウェルに添加し、次いで３７℃で１時間反応した。前記プレートを再び洗浄し、上記のようにストレプトアビジン/バイオチン/ＨＲＰ検出システムを利用して多量体を検出した。ＨＲＰを利用したため、多いＨＲＰ基質を利用し、光学密度、蛍光、化学発光、放射能同位元素、電気化学検出法における変化を検出することができる。
図１０ａ及び１０ｂに示したように、ハムスター及びヒトの血漿は、如何なる信号も示さなかったが、これは、プリオン多量体が存在しないことを意味する。一方、信号がスクレイピーハムスター及びヒトＣＪＤ患者の血漿から観察されたが、これは、プリオン多量体が存在することを意味する。本実施例において、血漿(収率２４％)２４μｌを利用した場合も、プリオン多量体型を成功的に検出することができるという結果に基づいて、本発明のＭＤＳの敏感度を５μｌ血漿まで低めることができることが分かる。図１０において、緩衝液１及び緩衝液２は、前記コーティングされたプレートを処理する、お互い異なるブロッキング緩衝液を示す。緩衝液１及び２は、それぞれBlock Ace(25%, Serotec)及び５０％Starting Block(Pierce Inc.)でブロッキングされたコーティングプレートを示す。正常ＰｒＰCからＰｒＰSc多量体を分別検出するために、捕獲抗体プレートを処理するに利用される、お互い異なるブロッキング緩衝液間には、大きい差がなかった。
実施例XI：カクテルされた捕獲抗体を利用したＰｒＰ Sc の検出
３μｇ/ｍｌまたは５μｇ/ｍｌ(１５０μｌ)の３０８抗体を利用して、３０８コーティングプレートを用意した。３μｇ/ｍｌ(１５０μｌ)の３Ｆ４抗体を利用して、３Ｆ４−コーティングプレートを作った。２．５μｇ/ｍｌの３０８及び１．５μｇ/ｍｌの３Ｆ４、または３μｇ/ｍｌの３０８及び１μｇ/ｍｌの３Ｆ４ １５０μｌを利用して、３０８/３Ｆ４カクテル−コーティングプレートを作った。全てのプレートを２５％Block Ace(Serotec)でブロッキングして、ＰＢＳ ３００μｌで洗浄した。
３μｇ/ｍｌまたは５μｇ/ｍｌ(１５０μｌ)の３０８抗体を利用して、３０８コーティングプレートを用意した。３μｇ/ｍｌ(１５０μｌ)の３Ｆ４抗体を利用して、３Ｆ４−コーティングプレートを作った。２．５μｇ/ｍｌの３０８及び１．５μｇ/ｍｌの３Ｆ４、または３μｇ/ｍｌの３０８及び１μｇ/ｍｌの３Ｆ４ １５０μｌを利用して、３０８/３Ｆ４カクテル−コーティングプレートを作った。全てのプレートを２５％Block Ace(Serotec)でブロッキングして、ＰＢＳ ３００μｌで洗浄した。
ヒト血漿試料(488.4μl)を２００μｇ/ｍｌのヒト組み換えＰｒＰ １１．４μｌ及び８Ｍ Ｇｄｎ−ＨＣｌ ７１．４μｌと混合して、前記混合物を周囲温度で１５分間反応させた。前記試料を１２％トリトンＸ−１００、６％デオキシコール酸ナトリウム、及び１％サルコシルを含むＰＢＳ２２８．５μｌで希釈し、次いで、追加的にＰＢＳ １４８５μｌで希釈した。前記試料を７０℃で１０分間加熱して、１５分間冷却した。前記試料を、加熱段階無しに、１０分間室温で維持した。前記前処理された試料は、２．２８μｇ ＰｒＰ、０．２５Ｍ Ｇｄｎ、１．２％トリトンＸ−１００、０．６％デオキシコール酸ナトリウム、及び０．１％サルコシルを含有する２１．４％血漿を含む。その後、試料２００μｌをＭＤＳに適用して、３７℃で１時間反応させた。ウェルに結合されなかった試料をＴＢＳＴ(Sigma)で４回洗浄した後、３Ｆ４−バイオチン(10% Startingblockを含有するTBS内2.5μg/ml)１５０μｌを添加し、３７℃で１時間反応させた。前記プレートをＴＢＳＴ(Sigma)３００μｌで４回洗浄し、KPL SA-HRP(10% Startingblockを含有するTBST内2μg/ml)１５０μｌを各ウェルに添加した後、周囲温度で１時間反応させた。前記プレートをＴＢＳＴ(Sigma)３００μｌで４回洗浄した。ＴＭＢ(150μl、Sigma)を各ウェルに添加して、信号が表れるように３０分間保管した。１Ｎ Ｈ2ＳＯ4 ５０μｌを添加して、前記信号発生を中止させ、前記信号を、プレートスペクトロフォトメーターを利用して４５０ｎｍで吸光度を測定した。
図１１に示されたように、前記実験結果は、３０８コーティングプレート及びカクテルされた３０８/３Ｆ４コーティングプレートから表れる信号において、大きい差がないことを示す。
実施例XII：プラスミノゲン阻害剤を利用したＰｒＰ Sc の検出
プラスミノゲンは、プリオン蛋白質、特にＰｒＰScに結合すると知られている。血漿は、プリオン蛋白質(2〜20ng/ml)と比較してみる時、相対的に高濃度のプラスミノゲン(300μg/ml)を含む。プリオンは、血漿または他の生試料において、プラスミノゲンと複合体として存在できる。ＰＭＣＡにプラスミノゲンの添加は、ＰｒＰScの増幅を抑制して、これは、プラスミノゲンが血漿のＰｒＰSc(多量体)検出を妨害できることを示す。したがって、ＭＤＳを、ヒト血漿にスパイクされたヒト組み換えプリオン蛋白質を利用して実施した。
プラスミノゲンは、プリオン蛋白質、特にＰｒＰScに結合すると知られている。血漿は、プリオン蛋白質(2〜20ng/ml)と比較してみる時、相対的に高濃度のプラスミノゲン(300μg/ml)を含む。プリオンは、血漿または他の生試料において、プラスミノゲンと複合体として存在できる。ＰＭＣＡにプラスミノゲンの添加は、ＰｒＰScの増幅を抑制して、これは、プラスミノゲンが血漿のＰｒＰSc(多量体)検出を妨害できることを示す。したがって、ＭＤＳを、ヒト血漿にスパイクされたヒト組み換えプリオン蛋白質を利用して実施した。
５μｇ/ｍｌ(１５０μｌ)の３０８抗体を利用して、３０８コーティングプレートを用意した。プレートを２５％Block Ace(Serotec)でブロッキングして、ＰＢＳ ３００μｌで洗浄した。
０、１、１０、及び１００ｍＭプラスミノゲン抑制剤、アミノカプロン酸またはトランス−(アミノメチル)シクロヘキサンカルボキシル酸と、８Ｍ Ｇｄｎ−ＨＣｌ ７１．４μｌの存在下で、ヒト血漿試料(488.4μl)を２００μｇ/ｍｌのヒト組み換えＰｒＰ １１．４μｌと混合するか、あるいは混合しなかった後、前記混合物を周囲温度で１５分間反応させた。前記試料を１２％トリトンＸ−１００、６％デオキシコール酸ナトリウム、及び１％サルコシルを含むＰＢＳ２２８．５μｌで希釈し、次いで、追加的にＰＢＳ １４８５μｌで希釈した。前記試料を７０℃で１０分間加熱して、１５分間冷却した。前記試料を、加熱段階無しに、１０分間室温で維持した。前記前処理された試料は、２．２８μｇ ＰｒＰ、０．２５Ｍ Ｇｄｎ、１．２％トリトンＸ−１００、０．６％デオキシコール酸ナトリウム、及び０．１％サルコシルを含有する２１．４％血漿を含む。その後、試料２００μｌをＭＤＳに適用して、３７℃で１時間反応させた。ウェルに結合されなかった試料をＴＢＳＴ(Sigma)で４回洗浄した後、３Ｆ４−バイオチン(10% Startingblockを含有するTBS内2.5μg/ml)１５０μｌを添加し、３７℃で１時間反応させた。前記プレートをＴＢＳＴ(Sigma)３００μｌで４回洗浄し、KPL SA-HRP(10% Startingblockを含有するTBST内2μg/ml)１５０μｌを各ウェルに添加した後、周囲温度で１時間反応させた。前記プレートをＴＢＳＴ(Sigma)３００μｌで４回洗浄した。ＴＭＢ(150μl、Sigma)を各ウェルに添加して、信号が表れるように３０分間保管した。１Ｎ Ｈ2ＳＯ4 ５０μｌを添加して、前記信号発生を中止させ、前記信号を、プレートスペクトロフォトメーターを利用して４５０ｎｍで吸光度を測定した。
前記実験は、プラスミノゲン抑制剤であるアミノカプロン酸(ACA)またはトランス−(アミノメチル)シクロヘキサンカルボキシル酸(AMCHA)を用いて実施された本発明の方法の分析的な結果を示し、これは、ヒト血漿にスパイクされたヒト組み換えプリオン蛋白質の多量体型(PrPSc)検出を強化するためのものである(表２)。表２の値は、４５０ｎｍにおける光学密度値である。試料準備緩衝液内にあるＡＣＡ及びＡＭＣＨＡの全ての濃度において、ヒト血漿にスパイクされたヒト組み換えプリオン蛋白質の検出が改善された。ＡＣＡとＡＭＣＨＡなどのようなプラスミノゲン抑制剤は、試料内のＰｒＰScからプラスミノゲンを置換することにより、生試料内のＰｒＰSc(多量体)検出を強化する。
＊＊は、固定された血漿及び血漿のみの試料の信号の比を示す。
実施例XIII：他の抗体セットを利用して、牛血漿にスパイクされたマウス脳からＰｒＰ Sc 検出
実施例VIIIに詳述したように、スクレイピーマウス脳から精製されたＰｒＰScを１００％牛血漿にスパイクして、前記ＭＤＳプロトコールにしたがってＭＤＳを実施した。簡単に説明すると、０．００８３、０．００２８、０．０００９、０．０００３、及び０％精製されたＰｒＰScを１００％牛血漿に添加し、約０．００３３、０．００１１、０．０００４、０．０００１、及び０μｇ/ｍｌのＰｒＰScを得た。スパイクされた血漿１００μｌを３７℃で１時間、４Ｅ１０コーティングプレート上で反応させた。４Ｅ１０抗体を動物衛生研究所(JP)から寄贈してもらった。ＴＢＳＴで前記プレートを４回洗浄した後、４Ｅ１０−ＨＲＰ検出抗体を添加して、次いで周囲温度で１時間反応させた。前記プレートをＴＢＳＴで４回洗浄し、化学発光基質(Femto, Pierce)を添加した。前記プレートをケミルミノメーター(chemiluminometer)で測定した。
実施例VIIIに詳述したように、スクレイピーマウス脳から精製されたＰｒＰScを１００％牛血漿にスパイクして、前記ＭＤＳプロトコールにしたがってＭＤＳを実施した。簡単に説明すると、０．００８３、０．００２８、０．０００９、０．０００３、及び０％精製されたＰｒＰScを１００％牛血漿に添加し、約０．００３３、０．００１１、０．０００４、０．０００１、及び０μｇ/ｍｌのＰｒＰScを得た。スパイクされた血漿１００μｌを３７℃で１時間、４Ｅ１０コーティングプレート上で反応させた。４Ｅ１０抗体を動物衛生研究所(JP)から寄贈してもらった。ＴＢＳＴで前記プレートを４回洗浄した後、４Ｅ１０−ＨＲＰ検出抗体を添加して、次いで周囲温度で１時間反応させた。前記プレートをＴＢＳＴで４回洗浄し、化学発光基質(Femto, Pierce)を添加した。前記プレートをケミルミノメーター(chemiluminometer)で測定した。
図１２に示されたように、前記実験結果は、ＭＤＳを利用して、１００％牛血漿内の、スクレイピーマウス脳から精製されたＰｒＰSc(プリオンの多量体型)を濃度依存的に検出した。スクレイピーマウスから精製されたＰｒＰScがない牛血漿試料は、如何なる信号も示さなかった。また、プリオンのアミノ酸１８７−１９７に対する４Ｅ１０抗体をＭＤＳに利用できるが、これは、ＭＤＳが、特別な配列及び領域を要求しないシステムであることを示す。
以上、本発明の望ましい具現例を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。
Claims (28)
- (a)単量体型、多量体型、または単量体型及び多量体型を捕獲する、多量体形成ポリペプチド上のエピトープを認識する捕獲抗体に生試料を接触させるステップであって、前記多量体形成ポリペプチドは、Ａβペプチド、β−アミロイド、ｔａｕ蛋白質、プリオン、α−シヌクレイン、Ｉｇ軽鎖、血清アミロイドＡ、トランスチレチン、シスタチンＣ、β 2 −マイクログロブリン、ハンチンチン、スーパーオキサイドディスムターゼ、セルピン、及びアミリンから構成された群から選択されたものであるステップと、
(b)前記ステップ(a)のエピトープと同一ではなく、オーバーラップされたエピトープを認識する検出抗体に、前記捕獲された単量体型、多量体型、または単量体型及び多量体型を接触させるステップであって、前記捕獲抗体及び検出抗体が認識するエピトープは、前記多量体形成ポリペプチドにおいて反復されない配列であるステップと、
(c)多量体型検出抗体複合体を検出するステップと、
を含む生試料の多量体形成ポリペプチドの単量体型から多量体型を分別検出する方法。 - 前記多量体形成ポリペプチドは、プリオン蛋白質であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記単量体型は、ＰｒＰCであり、多量体型は、ＰｒＰSCであることを特徴とする請求項２に記載の方法。
- 前記捕獲抗体は、固体基質に結合されたことを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記検出抗体は、検出可能な信号を生成させる標識を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記検出抗体に結合された標識は、化合物標識、酵素標識、放射能標識、蛍光標識、発光標識、化学発光標識及びＦＲＥＴ標識であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
- 前記生試料は、脳均質液または血漿であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記方法は、生試料として脳均質液を利用する場合、前記ステップ(a)の前にトリプシンで前記生試料を処理するステップをさらに含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
- 前記方法は、前記ステップ(a)の前に、蛋白質変性剤で前記生試料を処理するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記方法は、前記ステップ(a)の前に、前記生試料を加熱するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記方法は、生試料として血漿を利用する場合、前記生試料はサルコシル界面活性剤を含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
- 前記方法は、生試料として血漿を利用する場合、蛋白質分解酵素処理ステップを含まないことを特徴とする請求項７に記載の方法。
- 前記方法は、生試料として血漿を利用する場合、前記ステップ(a)の前に、プラスミノゲン抑制剤で前記生試料を処理するステップをさらに含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
- 前記プラスミノゲン抑制剤は、オメガ−アミノカルボキシル酸、Ｌ−リジン及びこれの誘導体、双性イオン(zwitterions)、ベンジルアミン、ベンズアミジン、Ｌ−アルギニン及びこれの誘導体から構成された群から選択されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
- 前記捕獲及び/または検出抗体は、ヒトプリオン配列で記載された配列番号１のアミノ酸１０９−１１２、１０６−１２６、１３２−１４７または１３５−１４０からなるアミノ酸配列を有するエピトープを認識することを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記生試料は、牛脳均質液であり、前記捕獲及び/または検出抗体は、牛プリオン配列で記載された配列番号２のアミノ酸１４５−１５０または１４２−１５７からなるアミノ酸配列を有するエピトープを認識することを特徴とする請求項１５に記載の方法。
- 前記生試料は、人間血漿であり、前記捕獲及び/または検出抗体は、ヒトプリオン配列で記載された配列番号１のアミノ酸１０９−１１２または１０６−１２６からなるアミノ酸配列を有するエピトープを認識することを特徴とする請求項１５に記載の方法。
- (a)Ａβペプチド、β−アミロイド、ｔａｕ蛋白質、プリオン、α−シヌクレイン、Ｉｇ軽鎖、血清アミロイドＡ、トランスチレチン、シスタチンＣ、β 2 −マイクログロブリン、ハンチンチン、スーパーオキサイドディスムターゼ、セルピン、及びアミリンから構成された群から選択された多量体形成ポリペプチド上のエピトープを認識する捕獲抗体、及び(b)前記捕獲抗体が認識する前記エピトープと同一ではなく、オーバーラップされたエピトープを認識する検出抗体を含み、前記捕獲抗体及び前記検出抗体が認識するエピトープは、前記多量体形成ポリペプチドにおいて反復されない配列である、請求項１乃至１７の何れか一つの項に記載の方法を実施するための、生試料の多量体形成ポリペプチドの単量体型から多量体型を分別検出するためのキット。
- 前記多量体形成ポリペプチドは、プリオン蛋白質であることを特徴とする請求項１８に記載のキット。
- 前記単量体型は、ＰｒＰCであり、多量体型は、ＰｒＰSCであることを特徴とする請求項１９に記載のキット。
- 前記捕獲抗体は、固体基質に結合されたことを特徴とする請求項１８に記載のキット。
- 前記検出抗体は、検出可能な信号を生成させる標識を有することを特徴とする請求項１８に記載のキット。
- 前記検出抗体に結合された標識は、化合物標識、酵素標識、放射能標識、蛍光標識、発光標識、化学発光標識及びＦＲＥＴ標識であることを特徴とする請求項２２に記載のキット。
- 前記生試料は、脳均質液または血漿であることを特徴とする請求項１８に記載のキット。
- 前記キットは、トリプシン、蛋白質変性剤、界面活性剤またはこれらの組み合わせをさらに含むことを特徴とする、請求項１８に記載のキット。
- 前記捕獲及び/または検出抗体は、ヒトプリオン配列で記載された配列番号１のアミノ酸１０９−１１２、１０６−１２６、１３２−１４７または１３５−１４０からなるアミノ酸配列を有するエピトープを認識することを特徴とする請求項１８に記載のキット。
- 前記生試料は、牛脳均質液であり、前記捕獲及び/または検出抗体は、牛プリオン配列で記載された配列番号２のアミノ酸１４５−１５０または１４２−１５７からなるアミノ酸配列を有するエピトープを認識することを特徴とする請求項２６に記載のキット。
- 前記生試料は、人間血漿であり、前記捕獲及び/または検出抗体は、ヒトプリオン配列で記載された配列番号１のアミノ酸１０９−１１２または１０６−１２６からなるアミノ酸配列を有するエピトープを認識することを特徴とする請求項２６に記載のキット。
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