JP4744512B2 - ダイズの改良された形質転換法 - Google Patents
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Description
1.胚発生培養物の樹立及び胚発生の誘導のための未熟子葉を供給するために、温室で成長させた植物を継続的に供給する必要があること。
(a)ダイズ幼苗の第一節又は第二節以上の葉節点の腋生分裂組織を準備するステップ、
(b)該腋生分裂組織を、農学的に有用な形質についての少なくとも1つの植物発現カセットと任意により1以上の選択マーカー遺伝子を含むトランスジェニックT−DNAを含むアグロバクテリウムと共存培養するステップ、
(c)該共存培養した腋生分裂組織を、以下:
(i)該腋生分裂組織からの新たなシュート誘導を誘導するのに好適な濃度の少なくとも1つの植物成長因子、及び
(ii)任意により、ステップ(b)の選択マーカー遺伝子と組み合わせた場合に該選択マーカー遺伝子を含む植物細胞、組織若しくは植物体の同定及び/若しくは選択を可能にする1以上の選択化合物、及び/又は
(iii)任意により、アグロバクテリウム増殖を抑制するのに好適な1以上の抗生物質
を含むシュート誘導培地に移し、シュートが誘導され発育するまで上記共存培養した腋生分裂組織を培養し、該シュートを単離するステップ、並びに
(d)該単離したシュートを発根培地に移し、該シュートが根を形成するまで該発根培地で該シュートを栽培し、さらにそのようにして誘導された、農学的に有用な形質についての少なくとも1つの植物発現カセットと任意により少なくとも1つの選択マーカー遺伝子を含むT−DNAが挿入されたゲノムを有する小植物体を、成熟植物まで再生するステップ、
を含む方法に関する。
(a1)共存培養の前、その間又はその直後に外植片を傷つけるステップ、
(b1)ステップ(b)の後の共存培養した腋生分裂組織を、アグロバクテリウム増殖の抑制に好適な少なくとも1つの抗生物質及び任意により少なくとも1つの植物成長因子を含む培地に移すステップであって、該培地は、ステップ(b)の選択マーカー遺伝子と組み合わせた場合に該選択マーカー遺伝子を含む植物細胞、器官又は植物体の同定及び/又は選択を可能にする選択化合物を欠損することが好ましい、上記ステップ、
(b2)ステップ(b)及び任意によりステップ(b1)の後の腋生分裂組織を、少なくとも1つの植物成長因子を含むシュート誘導培地(SIM)においてさらにインキュベートするステップであって、該シュート誘導培地は、ステップ(b)の選択マーカー遺伝子と組み合わせた場合に該選択マーカー遺伝子を含む植物細胞、器官又は植物体の同定及び/又は選択を可能にする選択化合物を欠損することが好ましい、上記ステップ、
(c1)ステップ(c)の後のシュートを、以下:
(i)シュートが伸長するのに好適な濃度の少なくとも1つの植物成長因子、及び
(ii)任意により、ステップ(b)の選択マーカー遺伝子と組み合わせた場合に該選択マーカー遺伝子を含む植物細胞、組織又は植物体の同定及び/又は選択を可能にする1以上の選択化合物
を含むシュート伸長培地に移し、該移したシュートを、少なくとも約2cmの長さに伸長するまで該シュート伸長培地で栽培するステップ、
からなる群より選択される1以上の追加ステップを含むことが好ましい。
(i)幼苗全体、
(ii)根を取り除いた幼苗、
(iii)1又は両方の子葉を取り除いた幼苗、
(iv)根、及び1又は両方の子葉を取り除いた幼苗、並びに
(v)根、両方の子葉及び上胚軸の一部を取り除き、上胚軸の一部に付いている腋生分裂組織が残っている幼苗。
略語:
BAP:6−ベンジルアミノプリン;2,4−D:2,4−ジクロロフェノキシ酢酸;MS:ムラシゲ・スクーグ培地(Murashige T及びSkoog F(1962) Physiol. Plant. 15, 472-497);NAA:1−ナフタレン酢酸;MES:2−(N−モルホリノ−エタンスルホン酸;IAA:インドール酢酸;IBA:インドール酪酸;Kan:硫酸カナマイシン;GA3:ジベレリン酸;TimentinTM:チカルシリン二ナトリウム(ticarcillin disodium)/クラブラン酸カリウム)。
(a)ダイズ幼苗の第一節又は第二節以上の葉節点の腋生分裂組織を準備するステップ、
(b)該腋生分裂組織を、農学的に有用な形質についての少なくとも1つの植物発現カセットと任意により1以上の選択マーカー遺伝子を含むトランスジェニックT−DNAを含むアグロバクテリウムと共存培養するステップ、
(c)該共存培養した腋生分裂組織を、以下:
(i)該腋生分裂組織からの新たなシュート誘導を誘導するのに好適な濃度の少なくとも1つの植物成長因子、並びに
(ii)任意により、ステップ(b)の選択マーカー遺伝子と組み合わせた場合に該選択マーカー遺伝子を含む植物細胞、組織若しくは植物体の同定及び/若しくは選択を可能にする1以上の選択化合物、並びに/又は
(iii)任意により、アグロバクテリウム増殖を抑制するのに好適な1以上の抗生物質
を含むシュート誘導培地に移し、シュートが誘導され発育するまで上記共存培養した腋生分裂組織を培養し、該シュートを単離するステップ、
(d)該単離したシュートを発根培地に移し、該シュートが根を形成するまで該発根培地で該シュートを栽培し、さらにそのようにして誘導された、農学的に有用な形質についての少なくとも1つの植物発現カセットと任意により少なくとも1つの選択マーカー遺伝子を含むT−DNAが挿入されたゲノムを有する小植物体を、成熟植物まで再生するステップ、
を含む方法に関する。
(i)幼苗全体、
(ii)根を取り除いた幼苗、
(iii)1又は両方の子葉を取り除いた幼苗、
(iv)根、及び1又は両方の子葉を取り除いた幼苗、並びに
(v)根、両方の子葉及び上胚軸の一部を取り除き、上胚軸の一部に付いている腋生分裂組織が残っている幼苗。
(a1)共存培養の前、その間又はその直後に外植片を傷つけるステップ、
(b1)ステップ(b)の後の共存培養した腋生分裂組織を、アグロバクテリウム増殖の抑制に好適な少なくとも1つの抗生物質及び任意により少なくとも1つの植物成長因子を含む培地に移すステップであって、該培地は、ステップ(b)の選択マーカー遺伝子と組み合わせた場合に該選択マーカー遺伝子を含む植物細胞、器官又は植物体の同定及び/又は選択を可能にする選択化合物を欠損することが好ましい、上記ステップ、
(b2)ステップ(b)及び任意によりステップ(b1)の後の腋生分裂組織を、少なくとも1つの植物成長因子を含むシュート誘導培地(SIM)においてさらにインキュベートするステップであって、該シュート誘導培地は、ステップ(b)の選択マーカー遺伝子と組み合わせた場合に該選択マーカー遺伝子を含む植物細胞、器官又は植物体の同定及び/又は選択を可能にする選択化合物を欠損することが好ましい、上記ステップ、
(c1)ステップ(c)の後のシュートを、以下:
(i)シュートが伸長するのに好適な濃度の少なくとも1つの植物成長因子、及び
(ii)任意により、ステップ(b)の選択マーカー遺伝子と組み合わせた場合に該選択マーカー遺伝子を含む植物細胞、組織又は植物体の同定及び/又は選択を可能にする1以上の選択化合物
を含むシュート伸長培地に移し、該移したシュートを、少なくとも約2cmの長さに伸長するまで該シュート伸長培地で栽培するステップ。
(i)創傷は、アグロバクテリウム感染及び遺伝子導入効率を促進する、
(ii)創傷は、おそらく分裂組織接合を破壊し、外植片組織から発育するシュートの数を有意に増やすことにより、新たなシュート誘導の効率を促進する。
(a)方法A(幼苗腋生分裂組織):OD600=約0.5〜約3、好ましくはOD600=約1〜2
(b)方法B(葉腋分裂組織):OD600=約0.1〜約1、好ましくはOD600=約0.125〜0.5
(c)方法C(増殖させた腋生分裂組織):OD600=約0.2〜約1.5、好ましくはOD600=約0.5〜0.8。
(b1)ステップ(b)の後の共存培養した腋生分裂組織を、アグロバクテリウム増殖の抑制に好適な少なくとも1つの抗生物質及び任意により少なくとも1つの植物成長因子を含む培地に移すステップであって、該培地は、ステップ(b)の選択マーカー遺伝子と組み合わせた場合に該選択マーカー遺伝子を含む植物細胞、器官又は植物体の同定及び/又は選択を可能にする選択化合物を欠損することが好ましい、上記ステップ。
(b2)ステップ(b)及び任意によりステップ(b1)の後の腋生分裂組織を、少なくとも1つの植物成長因子を含むシュート誘導培地(SIM)においてさらにインキュベートするステップであって、該シュート誘導培地は、ステップ(b)の選択マーカー遺伝子と組み合わせた場合に該選択マーカー遺伝子を含む植物細胞、器官又は植物体の同定及び/又は選択を可能にする選択化合物を欠損することが好ましい、上記ステップ。
他のアグロバクテリウム媒介方法と同様に、ダイズゲノムに挿入される外来遺伝的構築物又は導入遺伝子は、組換えDNA操作の通常の技術によりin vitroで作製される。次いで、遺伝的構築物をアグロバクテリウム菌株に形質転換し、ダイズ細胞に送達する。アグロバクテリウムは非発癌性であり、このような菌株のいくつかは現在広く利用可能である。
「構成的」プロモーターは、植物発育の実質的な期間にわたり(好ましくは植物発育中常時)、多数の(好ましくは全ての)組織における発現を確実にするプロモーターを指す。植物プロモーター、又は植物ウイルスに由来するプロモーターが特に好ましく使用される。CaMV(カリフラワーモザイクウイルス)35S転写産物のプロモーター(Franckら(1980) Cell 21:285-294;Shewmakerら(1985) Virology 140:281-288;Gardnerら(1986) Plant Mol Biol 6:211-228;Odellら(1985) Nature 313:810-812)、又は19S CaMVプロモーター(米国特許第5,352,605号;WO84/02913号;Benfeyら(1989) EMBO J 8:2195-2202)が特に好ましい。別の好適な構成的プロモーターは、イネアクチンプロモーター(McElroyら(1990) Plant Cell 2:163-171)、ルビスコ小サブユニット(SSU)プロモーター(米国特許第4,962,028号)、レグミンBプロモーター(GenBankアクセッション番号X03677)、アグロバクテリウム由来ノパリンシンターゼプロモーター、TRデュアルプロモーター、アグロバクテリウム由来OCS(オクトピンシンターゼ)プロモーター、ユビキチンプロモーター(Holtorfら(1995) Plant Mol Biol 29:637-649)、ユビキチン1プロモーター(Christensenら(1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632;Christensenら(1992) Plant Mol Biol 18:675-689;Bruceら(1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:9692-9696)、Smasプロモーター、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼプロモーター(米国特許第5,683,439号)、液胞ATPアーゼサブユニットプロモーター、pEMUプロモーター(Last DIら(1991) Theor. Appl. Genet. 81, 581-588);MASプロモーター(Veltenら(1984) EMBO J. 3(12):2723-2730)、及びトウモロコシH3ヒストンプロモーター(Lepetitら(1992) Mol Gen Genet 231:276-285;Atanassovaら(1992) Plant J 2(3):291-300)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)ニトリラーゼ−1遺伝子プロモーター(GenBankアクセッション番号U38846、ヌクレオチド3862〜5325又は5342)、又はコムギ由来の高プロリンタンパク質のプロモーター(WO91/13991号)、植物において構成的発現される遺伝子のさらなるプロモーターである。
さらに好ましいのは、種子に対して特異性を有するプロモーターであり、例えば、ファセオリンプロモーター(米国特許第5,504,200号;Bustosら(1989) Plant Cell 1(9):839-53;Muraiら, Science 23:476-482(1983);Sengupta-Gopalanら(1985) Proc. Natl Acad. Sci. USA 82:3320-3324)、2Sアルブミン遺伝子プロモーター(Joseffsonら(1987) J Biol Chem 262:12196-12201)、レグミンプロモーター(Shirsatら(1989) Mol Gen Genet 215:326-331)、USP(未知種子タンパク質)プロモーター(Baumleinら(1991a) Mol Gen Genet 225(3):459-467)、ナピン遺伝子プロモーター(米国特許第5,608,152号;Stalbergら(1996) Planta 199:515-519)、スクロース結合タンパク質のプロモーター(WO00/26388号)、又はレグミンB4プロモーター(LeB4;Baumleinら(1991b) Mol Gen Genet 225:121-128;Beckerら(1992) Plant Mol. Biol. 20:49)、シロイヌナズナ(Arabidopsis)オレオシンプロモーター(WO98/45461号)、及びアブラナ(Brassica)Bce4プロモーター(WO91/13980号)等である。さらに好ましいのは、葉特異的及び光誘導性プロモーター、例えばcab又はルビスコ由来のもの等(Simpsonら(1985) EMBO J 4:2723-2729;Timkoら(1985) Nature 318:579-582);葯特異的プロモーター、例えばLAT52に由来するもの等(Twellら(1989b) Mol Gen Genet 217:240-245);花粉特異的プロモーター、例えばZml3に由来するもの等(Guerreroら(1993) Mol Gen Genet 224:161-168);及び小胞子選択的プロモーター、例えばapgに由来するもの等(Twellら(1983) Sex. Plant Reprod. 6:217-224)である。
発現カセットはまた、化学誘導性プロモーター(概要文献:Gatzら(1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48:89-108)を含んでもよく、これにより植物中の外因性遺伝子の発現が特定の時点に制御できる。例えば、PRP1プロモーター(Wardら(1993) Plant Mol Biol 22:361-366)、サリチル酸誘導性プロモーター(WO95/19443号)、ベンゼンスルホンアミド誘導性プロモーター(EP0 388 186)、テトラサイクリン誘導性プロモーター(Gatzら(1991) Mol Gen Genetics 227:229-237;Gatzら(1992) Plant J 2:397-404)、アブシジン酸誘導性プロモーター(EP0 335 528)、又はエタノール−シクロヘキサノン誘導性プロモーター(WO93/21334号)等のプロモーターも同様に使用できる。同じく適しているのは、グルタチオン−SトランスフェラーゼイソフォームII遺伝子のプロモーター(GST−II−27)であり、これは例えばN,N−ジアリル−2,2−ジクロロアセトアミド(WO93/01294号)等の外因的に適用される安全化剤により活性化することができ、単子葉及び双子葉の両方の多数の組織において作用可能である。本発明で利用可能な誘導性プロモーターの更なる例としては、銅に応答するACE1系に由来するもの(Mettら(1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:4567-4571);又はベンゼンスルホンアミド除草剤安全化剤に応答するトウモロコシ由来のIn2プロモーター(Hersheyら(1991) Mol Gen Genetics 227:229-237;Gatzら(1994) Mol Gen Genetics 243:32-38)が挙げられる。通常は植物が応答しない誘導剤に応答するプロモーターを利用することができる。誘導性プロモーターの例は、ステロイドホルモン遺伝子由来の誘導性プロモーターであり、この転写活性は糖質コルチコステロイドホルモンにより誘導される(Schenaら(1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:10421)。
選択マーカー遺伝子は、形質転換が成功した細胞又は相同組換え細胞を選択及び分離するのに有用である。本発明の方法においては、一方のマーカーを原核宿主における選択のために採用し、他方のマーカーを真核宿主(特に植物種宿主)における選択のために採用することが好ましい。マーカーは、抗生物質、毒素、重金属等の殺生物剤に対する防御であってもよいし、又は相補(complementation)により機能して、栄養要求性宿主に原栄養(prototrophy)を与えるものであってもよい。植物のための好ましい選択マーカー遺伝子としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない。
陰性選択マーカーは、代謝阻害剤(例えば、2−デオキシグルコース−6−リン酸、WO98/45456号)、抗生物質(例えば、カナマイシン、G418、ブレオマイシン、若しくはハイグロマイシン)、又は除草剤(例えば、ホスフィノトリシン若しくはグリホセート)等の殺生物性化合物に対する耐性を付与する。特に好ましい陰性選択マーカーは、除草剤に対する耐性を付与するものである。例示することができる例は以下のとおりである:
−ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ(PAT;BialophosTM耐性とも呼ばれる;bar;De Blockら(1987) Plant Physiol 91:694-701;EP 0 333 033;米国特許第4,975,374号)、
−グリホセートTM(N−(ホスホノメチル)グリシン)に対する耐性を付与する、5−エノールピルビルシキミ酸−3−リン酸シンターゼ(EPSPS;米国特許第5,633,435号)又はグリホセート酸化還元酵素遺伝子(米国特許第5,463,175号)(Shahら(1986) Science 233:478)、
−グリホセートTM分解酵素(グリホセートTM酸化還元酵素;gox)、
−DalaponTM不活性化脱ハロゲン酵素(deh)、
−スルホニル尿素及びイミダゾリノン不活性化アセト乳酸シンターゼ(例えば、S4及び/又はHra突然変異を有するALS突然変異体)、
−ブロモキシニルTM分解ニトリラーゼ(bxn)、
−例えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするカナマイシン又はG418耐性遺伝子(NPTII;NPTI)(Fraleyら(1983) Proc Natl Acad Sci USA 80:4803)(これらは、抗生物質カナマイシン、並びに関連抗生物質であるネオマイシン、パロモマイシン、ゲンタマイシン及びG418に対する耐性を付与する酵素を発現する)、
−2−デスオキシグルコースに対する耐性を付与する2−デオキシグルコース−6−リン酸ホスファターゼ(DOGR1遺伝子産物;WO98/45456号;EP0 807 836)(Randez-Gilら(1995)Yeast 11:1233-1240)、
−ハイグロマイシンに対する耐性を媒介するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(HPT)(Vanden Elzenら(1985) Plant Mol Biol. 5:299)、
−ジヒドロ葉酸還元酵素(Eichholtzら(1987)Somatic Cell and Molecular Genetics 13:67-76)。
陽性選択マーカーは、非形質転換のものと比べて、形質転換された植物に成長的利点を付与する。アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のイソペンテニルトランスフェラーゼ(株:PO22;GenBankアクセッション番号:AB025109)等の遺伝子は、サイトカイニン生合成の主要な酵素として、(例えば、サイトカイニンを含まない培地上での選択により)形質転換された植物の再生を促す。対応する選択方法は記載されている(Ebinumaら(2000) Proc Natl Acad Sci USA 94:2117-2121;Ebinumaら(2000) Selection of Marker-free transgenic plants using the oncogenes (ipt, rol A, B, C) of Agrobacterium as selectable markers, Molecular Biology of Woody Plant, Kluwer Academic Publishersに掲載)。非形質転換のものと比べて、形質転換された植物に成長的利点を付与する追加的な陽性選択マーカーは、例えばEP−A 0 601 092に記載されている。成長刺激選択マーカーとしては、βグルクロニダーゼ(例えば、サイトカイニングルクロニドとの組合せ)、マンノース−6−リン酸イソメラーゼ(マンノースとの組合せ)、UDP−ガラクトース−4−エピメラーゼ(例えば、ガラクトースとの組合せ)があり(ただし、これらに限定されない)、マンノース−6−リン酸イソメラーゼとマンノースとの組合せが特に好ましい。
対抗選択マーカーは、該マーカーを含む特定の欠失配列を有する生物を選択するのに特に適している(Koprekら(1999) Plant J 19:719-726)。陰性選択マーカーの例としては、チミジンキナーゼ(TK)、シトシンデアミナーゼ(Gleaveら(1999) Plant Mol Biol. 40(2):223-35;Pereraら(1993) Plant Mol. Biol 23:793-799;Stougaard(1993) Plant J 3:755-761)、シトクロムP450タンパク質(Koprekら(1999) Plant J 19:719-726)、ハロアルカン脱ハロゲン酵素(Naested(1999) Plant J 18:571-576)、iaaH遺伝子産物(Sundaresanら 1995)、シトシンデアミナーゼcodA(Schlaman及びHooykaas(1997) Plant J 11:1377-1385)、又はtms2遺伝子産物(Fedoroff及びSmith(1993)Plant J 3:273-289)が挙げられる。
さらに、選択マーカー遺伝子という用語は、形質転換された細胞又は生物の同定及び/又は選択を可能にする他の遺伝子、例えばそのような形質転換された細胞の可視的なスクリーニング及び同定を(植物毒性化合物を適用することなく)可能にするレポーター遺伝子などをさらに含み得る。上記レポーター遺伝子の一部は、同定のための基質の添加を必要としうるが(GUS遺伝子等)、その他はそのような基質がなくても機能する(GFP等)。
例示することができる例は、ORI(DNA複製起点)、pBR322 ori又はP15A oriである(Maniatis 1989)。大腸菌において機能的な複製系のさらなる例は、ColE1、pSC101、pACYC184等である。大腸菌複製系に加えて又はその代わりに、P−1不適合プラスミドの複製系(例えば、pRK290)等の宿主範囲の広い複製系が採用できる。これらのプラスミドは、T−DNAを植物種宿主に導入するための毒性(armed)及び安全化Ti−プラスミドで特に有効である。
特に明記しない限り、全ての化学物質はMallinckrodt Baker, Inc.(Phillipsburg, NJ, USA)、Phytotechnology Laboratories(Shawnee Mission, KS, USA)、EMD Chemicals, Inc.(Gibbstown, NJ, USA)、及びSigma(St. Louis, MO, USA)から入手した。
1.B5主要塩(major salts)
a. 0.25M KNO3(硝酸カリウム)
b. 0.01M CaCl2 *2H2O(塩化カルシウム)
c. 0.01M MgSO4 *7H2O(硫酸マグネシウム)
d. 0.01M(NH4)2SO4(硫酸アンモニウム)
e. 0.01M NaH2PO4 *H2O(リン酸ナトリウム)。
a. 5mM H3BO3(ホウ酸)
b. 10mM MnSO4 *H2O(硫酸マンガン)
c. 0.7mM ZnSO4 *7H2O(硫酸亜鉛)
d. 0.45mM Kl(ヨウ化カリウム)
e. 0.1mM Na2MoO4 *2H2O(モリブデン酸)
f. 0.01mM CuSO4 *5H2O(硫酸銅)
g. 0.01mM CoCl2 *6H2O(塩化コバルト)。
a. 0.055M Myo−イノシトール
b. 0.8mM ニコチン酸
c. 0.5mM ピリドキシン−HCl
d. 3mM チアミン−HCl。
a. 0.2M NH4NO3(硝酸アンモニウム)
b. 0.2M KNO3(硝酸カリウム)
c. 30mM CaCl2 *2H2O(塩化カルシウム)
d. 15mM MgSO4 *7H2O(硫酸マグネシウム)
e. 12.5mM KH2PO4(リン酸カリウム)。
a. 10mM H3BO3(ホウ酸)
b. 13mM MnSO4 *H2O(硫酸マンガン)
c. 3mM ZnSO4 *7H2O(硫酸亜鉛)
d. 0.5mM KI(ヨウ化カリウム)
e. 0.1mM Na2MoO4 *2H2O(モリブデン酸)
f. 0.01mM CuSO4 *5H2O(硫酸銅)
g. 0.01mM CoCl2 *6H2O(塩化コバルト)。
a. 10mM FeSO4 *7H2O(硫酸第一鉄)
b. 10mM C10H14O8Na2N2 *2H2O(NaEDTA)。
特に以下に明記しない限り、培地は、本発明の方法のための3つの好適な外植片組織全てに採用できる。3つの方法は以下の通り省略する:
a)方法A:幼苗腋生分裂組織−幼苗全体を用いる
b)方法B:葉腋分裂組織−腋生分裂組織が葉の葉柄に付いたままとなるように、第一葉又は第二葉以上の葉を切る
c)方法C:増殖させた腋生分裂組織(詳細については上記及び以下を参照)。
a.1×B5主要塩、
b.1×B5副次塩、
c.1×MSIII鉄、
d.2%スクロース、
e.1×B5ビタミン、
f.5uM BAP(任意)、
g.0.8%精製寒天(Sigma);
h.pH5.8。
a.10gLバクトペプトン(Difco; Becton Dickinson & Co., Cockeysville, MD, USA)、
b.5g/L 酵母抽出物(Difco)、
c.5g/L NaCl、
d.選択に適した抗生物質、
e.1.2%粒状寒天(Difco)固体のみ;
f.pH7.0。
a.1×MS主要塩、
b.1×MS副次塩、
c.1×MSIII鉄、
d.1×B5ビタミン、
e.3%スクロース、
f.0.22〜1.12mg/L(1μM〜5μM)BAP(好ましく約1μM)、
g.0.8%精製寒天(Sigma);
h.pH5.8。
a.1/10×B5主要塩、
b.1/10×B5副次塩、
c.1/10×MSIII鉄、
d.1×B5ビタミン、
e.3%スクロース、
f.20mM 2−[N−モルホリノ]エタンスルホン酸(MES;MW=213.26g/Mol)、
g.200μMアセトシリンゴン(AS)、
h.0.72μM〜1.44μM GA3(ジベレリン酸;MW=346.38g/Mol)、
i.BAP(6−ベンジルアミノプリン;MW=225.25g/mol):7.5μM、
j.方法Cのみ:400mg/L L−システイン(3.3mM)(Sigma);
k.pH5.4。
a.1/10×B5主要塩、
b.1/10×B5副次塩、
c.1/10×MSIII鉄、
d.1×B5ビタミン、
e.3%スクロース、
f.20mM 2−[N−モルホリノ]エタンスルホン酸(MES)、
g.200μMアセトシリンゴン(AS)、
h.0.72μM〜1.44μM GA3(ジベレリン酸;MW=346.38g/Mol)、
i.BAP(6−ベンジルアミノプリン;MW=225.25g/mol):7.5μM、
j.チオール化合物、
(i)100〜1000g/L L−システイン(MW=121.16g/Mol;Sigma);好ましくは:方法B及びC:400mg/L L−システイン(3.3mM);方法A:1g/l(8.25mM)L−システイン、
(ii)0〜1mM又は154.2mg/L DTT(Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA)、
(iii)0〜1mMチオ硫酸ナトリウム無水物(158.1mg/L)又はチオ硫酸ナトリウム五水和物245mg/L(Mallinckrodt, Paris, KY, USA)、方法A:1mMジチオトレイトール、1mMチオ硫酸ナトリウム、
k.0.5%精製寒天;
l.pH5.4。
a.1×B5主要塩、
b.1×B5副次塩、
c.1×MSIII鉄、
d.3%スクロース、
e.1×B5ビタミン、
f.30mM MES、
g.350mg/L TimentinTM;
h.pH5.6。
a.1×B5主要塩、
b.1×B5副次塩、
c.1×MSIII鉄、
d.1×B5ビタミン、
e.3%スクロース、
f.3mM MES、
g.2.5μM BAP(方法B)、1μM〜7.5μM(好ましくは1μM)BAP(方法A)、
h.5μMカイネチン(方法Bのみ)、
i.250mg/L TimentinTM、
j.0.8%精製寒天;
k.pH5.6。
a.1×B5主要塩、
b.1×B5副次塩、
c.1×MSIII鉄、
d.1×B5ビタミン、
e.3%スクロース、
f.3mM MES、
g.1μM〜7.5μM(好ましくは約1μM)BAP(方法A);2.5μM BAP(方法B)、5.0μM BAP(方法C)、
h.5μMカイネチン(方法A及びBのみ)、
i.250mg/L TimentinTM、
j.適切であれば選択化合物、
k.0.8%精製寒天;
l.pH5.6。
a.1×MS主要塩、
b.1×MS副次塩、
c.1×MSIII鉄、
d.1×B5ビタミン、
e.3%スクロース、
f.3mM MES、
g.50mg/L L−アスパラギン(0.378mM)、
h.100mg/L L−ピログルタミン酸(0.775mM)、
i.0.1mg/L IAA(0.57μM)、
j.0.5mg/L GA3(1.44μM)、
k.1mg/Lトランスゼアチンリボシド(2.85μM)、
l.250mg/L TimentinTM、
m.適切であれば選択化合物、
n.0.8%精製寒天;
o.pH5.6。
a.1/2×B5主要塩、
b.1/2×B5副次塩、
c.1×MSIII鉄、
d.2%スクロース、
e.3mM MES、
f.1mg/L(5μM)インドール−ブチル酸(IBA,MW=203.24g/Mol)(方法A及びB)、5μM〜12.5μM(好ましくは約5μM)IBA(方法C)、
g.0.8%精製寒天;方法Cのみ:250mg/L Timentin;
h.pH5.6。
本発明の方法においては、実質的にあらゆるダイズ変種のあらゆる種子を用いることができる。種々のダイズ品種(Jack、Williams82及びResnikを含む)がダイズ形質転換に好適である。ダイズ種子は、ぴったり閉まる蓋を有するデシケーター中で3.5mlの12N HClを100mlの漂白剤(5.25%次亜塩素酸ナトリウム)に滴下することにより発生する塩素ガスを用いてチャンバー内で滅菌した。チャンバー内で24〜48時間後、種子を取り出し、約18〜20の種子を25×100mmペトリ皿において5μM 6−ベンジル−アミノプリン(BAP)を含む又は含まない固形GM培地上に播く。BAPを用いない場合の幼苗はより長く伸長し、根が発達するが、特に二次根及び側根の形成が生じる。BAPは、低く頑丈な幼苗の形成により幼苗を強化する。
アグロバクテリウム培養液は、所望のバイナリーベクターを有するアグロバクテリウム(例えばA.ツメファシエンス又はA.リゾゲネス)を固形YEP成長培地(growth medium)上に画線し、コロニーが出現するまで(約2日間)25℃にてインキュベートすることにより調製する。Ti又はRiプラスミドに存在する選択マーカー遺伝子、バイナリーベクター及び細菌染色体に応じて、異なる選択化合物をYEP固形及び液体培地におけるA.ツメファシエンス及びリゾゲネス選択のために用いうる。種々のアグロバクテリウム菌株を形質転換法に用いることができる(上記及び下記実施例7参照)。
3.1 方法A:形質転換当日における外植片の調製
この時点の幼苗は、上胚軸が少なくとも0.5cm伸長しているが、一般的には0.5〜2cmである。長さが最大4cmまで伸長した上胚軸を用いることができる。続いて、外植片を、以下を用いて調製する:
(i)ある程度の根を有する又は有しない
(ii)部分的、一方又は両方の子葉を有する。既に形成された葉は頂端分裂組織を含めて全て取り除き、最初の葉群に位置する節を、鋭いメスを用いていくつか切り込みを入れて損傷させる(図5参照)。
4〜8日齢の幼苗から調製したダイズ上胚軸部分を再生及び形質転換のための外植片として用いた。ダイズ品種L00106CN、93−41131及びJackの種子を、サイトカイニンを含む又は含まない1/10MS塩又は同様の組成の培地において4〜8日かけて発芽させた。上胚軸外植片は、茎部から子葉節及び茎節を除去することにより調製した。上胚軸を2〜5の部分に切断した。腋生分裂組織を含む第一節又は第二節以上の節に付いた部分が特に好ましい。
葉外植片の調製の詳細を図8に示す。最初に、子葉を胚軸から取り出す。子葉をそれぞれ分離し、上胚軸を除去する。薄膜、葉柄及び托葉からなる第一葉を、腋生分裂組織が外植片に含まれるように托葉の基部で注意深く切断して上胚軸から取り出す。外植片を傷付け、かつ新たなシュート形成を刺激するために、予め形成されているシュートを全て取り除き、托葉の間の領域を鋭いメスで3〜5回切断する。
増殖腋生分裂組織外植片の調製は図3(B〜E)に詳細に示す。増殖させた3〜4週齢の小植物体を用いて、腋生分裂組織外植片を第一節から第四節まで調製しうる。各幼苗から平均3〜4の外植片が得られる。節間の腋生節より0.5〜1.0cm下を切断し、外植片から葉柄及び葉を取り除くことにより、小植物体から外植片を調製する。腋生分裂組織が存在する先端を外科用メスで切断することにより、新たなシュート成長(shoot growth)を誘導し、標的細胞がアグロバクテリウムへと接触可能なようにした。従って、0.5cmの外植片は茎と芽を含む。
25℃にて暗条件下で3〜5日間共存培養した後、外植片を液体SIM培地(過剰のアグロバクテリウムを除去するため)又はModwash培地(方法C)ですすぎ、滅菌ろ紙でぬぐって乾燥させた(特に薄膜への損傷を防ぐため)後、固形SIM培地に入れる。約5の外植片(方法A)又は10〜20の外植片(方法B及びC)を、標的組織が培地と直接接触するように配置した。最初の2週間では、外植片を選択培地を用いて又は用いないで培養することができる。好ましくは、外植片を1週間にわたり選択を行わないSIMに移す。
SIM培地(好ましくは選択あり)で2〜4週間(又はシュートの塊が形成されるまで)後、外植片を、シュート原基のシュート伸長を誘導しうるSEM培地に移す。この培地は、選択化合物を含んでもよいし又は含まなくてもよい。伸長するシュートの頻度及び長さは、SIM中のホルモンレベル、特にBAPによって影響を受ける(実施例9)。
種子及び外植片を上述のように調製した。合計17の異なる品種(Soygeneticsから9種及びDairylandから8種)を、5μMカイネチン及び2.5μM BAPを含むSIM上での2週間の後にシュート誘導及び再生についてスクリーニングした。GM上で8日の後、6種の異なる品種について20の葉外植片を調製した。1皿当たり10の外植片として外植片をすぐにSIM培地上に入れた。実験は3回反復実施した。外植片を、カルス/シュートパッドを形成した外植片の割合について3週間目に評価した。全ての品種が高い割合でカルス/シュートパッドを誘導した。それは、3週間後にシュートパッドを形成する全ての外植片の85%〜100%であった。これらの品種は、再生率が95%を超えた。このことは、葉外植片の葉柄でのカルス/シュートパッドの再生は、この実験に用いたダイズ品種について独立性が高いことを示している。全ての品種が、調製した外植片の85%を超えてカルス/シュートパッドを発育し、一部の品種は全ての反復実験において全ての外植片でカルス/シュートパッドを発育した。
ダイズのアグロバクテリウム感染への感受性は、強力なダイズ形質転換系の開発において最も重要なステップの1つである。外植片の切除及び調製時における遺伝子型、発育段階、ホルモンバランス及び環境条件は全て、アグロバクテリウムが特定のダイズ組織に感染する能力に影響を及ぼす。A.ツメファシエンスAGL1株を用いて、子葉節における腋生分裂組織細胞を標的とすることによりダイズ形質転換の成功が収められている(Olhoft及びSomers (2001) Plants Cell Reports 20:706-711)。A.リゾゲネスK599株は、毛状根形成の誘導に非常に有効であり、感染子葉の54〜95%が種々のダイズ品種から毛状根を発育したことが示されている(Choら(2000) Planta 210:195-204)。この研究には、新しい安全化形態のA.リゾゲネスK599株が使用されていた。本研究においては、A.ツメファシエンス及びリゾゲネスが葉外植片に感染する能力を、一過性GUS発現の分析によって評価した。
アグロバクテリウム媒介形質転換法において、共存培養条件の最適化はトランスジェニック植物取得の際の大きな要因である。好適なアグロバクテリウム増殖条件と植物の健常な成育条件のバランスが一致する必要がある。試験対象の一般的な条件としては、光条件、インキュベーションの長さ、温度、アグロバクテリウム細胞密度、及び培地成分が挙げられる。本研究では、光条件、チオール化合物のCCMへの添加(Olhoft及びSomers (2001) Plants Cell Reports 20:706-711)、インキュベーション日数、及び接種方法について全て検討する。
(1)5種のチオールの組み合わせの1つをCCMに添加する(チオールなし、100mg/L L−システイン(0.825mM)、400mg/L L−システイン(3.3mM)、1000mg/L L−システイン(8.25mM)、又は1mMチオ硫酸ナトリウム+1mM DTT+1000mg/L L−システイン(8.25mM))、
(2)25℃にて、3日、4日又は5日の共存培養、並びに
(3)暗条件、又は16時間明/8時間暗の光周期で100μE/m2s白色光下でインキュベーションする。
塩、ホルモン、及び光質を含む培養条件は全て植物における再生に対する植物の応答に影響を及ぼす。葉外植片におけるシュートの開始及び再生に対するシュート誘導の過程における無機塩及びホルモンの影響を比較する試験は、キマメ(pigeonpea)で行われている(Dayalら(2003) Plant Cell Rep. 21:1072-1079)。この一連の実験においては、無機塩MS及びB5、サイトカイニンであるBAP及びカイネチンのレベル、並びに種々の光質について、これらの要因が、葉外植片におけるシュート形成及び伸長にどのように影響を及ぼすかを観察するために試験した。
温室ドナー植物及びin vitro成育植物から得られる外植片材料の比較を、各外植片からのシュート再生を測定することにより行った。外植片材料は、第一節〜第四節からの基部節間組織が付いた増殖腋生分裂組織からなるものとした。
11.1.ダイズの腋生分裂組織の再生能に対する培養容器の種類の影響
異なる培養容器がin vitro小植物体から得られた腋生分裂組織外植片の再生に影響を及ぼすか否かを確認するために評価を行った。Wrightら(1987)は、同じ環境成育条件下でプラスチック製ペトリ皿又はガラス製培養管において培養したダイズ組織がシュート再生及び表現型発現に差異を生じることを示した。
理想的なドナー植物は、再生能が高い腋生分裂組織外植片を生成し、小植物体当たり多数の外植片を生じる能力を有している必要がある。種子をホルモン不含培地において成育させ、直接外植片材料に用いた場合には、腋生分裂組織外植片をほとんど調製することができないことが観察された。さらに、これらの容器における多数の根の成長のために小植物体形成のための部屋及び栄養物質が非常に限定された。従って、増殖ステップの付加、及び発芽培地へのBAPの添加後に根の成長を低減してシュートを再生する外植片の能力を試験した。BAPがシュートの再生能力に影響を及ぼすことも知られているため、発芽及び増殖を通じて複数の濃度のBAPに暴露した外植片の再生能を測定するための実験を設計した。
培養培地中の塩の組成は、ダイズ植物の健康及び発育に非常に重要である。発芽、増殖及びシュート誘導の過程でMS無機塩又はB5無機塩から構成される培地上で成長させた場合に、シュートを開始する外植片の能力の応答を比較するために実験を行った(比較については上記[A]の部分を参照)。3つの異なる品種、すなわちJack、Westag97及びL00106CNを再生試験に用いた。種子の滅菌、増殖及びシュート誘導は上述の通り実施した。無機塩に加えて、3つの培地全てに5μM BAPを添加した。2回反復実験を行った。シュート開始能に対する無機塩の影響は品種に依存的であった。無機塩をMSからB5に変更したところ、品種L00106CN及びJackについては外植片当たりのシュート数が増大した(表8)。品種Westag97を用いた場合には、MS又はB5塩で培養した外植片におけるシュート形成に有意な差は見い出されなかった。
種々のダイズ品種の再生能の評価は、強力なダイズ形質転換及び再生系の開発にとって重要な要素である。再生能が高い系統の同定によって、それらの起源に応じて形質の発達がよりフレキシブルとなる。2つの実験に用いた品種は、3のUS変種、6のカナダ変種、及び27のSoygenetics品種とした。この最初の評価に含まれる品種は、USダイズ公共系統からのJack、Resnik、Williams82と、University of Guelph OAC(Ontario Agricultural College)からのRCAT Staples、Westag97、RCAT Bobcat、OAC Prudence、OAC Woodstock、OAC9908であった。70%(v/v)エタノールに6分間暴露することにより種子の表面を滅菌した。続いて、種子を25%市販漂白剤(NaOCl)及び0.1%Tween20を含む溶液に浸漬し、200rpmで20分間振とうした。種子を滅菌再蒸留水で4回すすいだ。5〜7日間かけて暗条件下で発芽を行った。発芽後、根及び各子葉の半分を取り除き、残りの組織を5μM BAを含むMSB5培地で増殖させた。25℃にて40〜70μMm−2s−1の光強度で16/8時間(明/暗)の光周期の成育チャンバー条件に皿を置いた。3週間後、腋生分裂組織外植片を実施例3.3に記載のように調製し、次に最大濃度のMS塩、B5Gamborgビタミン及び5μM BAを含むシュート開始培地に求底性に配置した。4週間後に、増殖腋生分裂組織外植片当たりの0.3mmを超えるシュートの総数の評価を行った。
13.1 L−システイン効果
Olhoft及びSomers (2001)(Plants Cell Reports 20:706-711)は、共存培養培地へのチオール化合物(L−システイン、チオ硫酸ナトリウム及びジチオトレイトール(dithiolthreitol))の添加によって、アグロバクテリウム媒介子葉節形質転換法を用いた場合にダイズ品種Bertの一過性かつ安定な形質転換が増強されたことを示している(Olhoftら(2003) Planta 216:723-735も参照)。従って、固形共存培養培地へのL−システインの添加によって、増殖させた腋生分裂組織外植片へのT−DNA送達及び組込みが増大することが可能か否かを評価するための実験を設計した。
Jack変種の種子を、70%エタノールに6分間暴露し、続いて25%市販漂白剤(NaOCl)及び0.1%Tween20を含む溶液に浸漬し、200rpmで20分攪拌することにより表面滅菌した。種子を滅菌水で4回すすいだ。25℃にて暗条件下で7日間かけて発芽を行った。根及び両方の子葉の半分を7日齢幼苗から取り出し、150×20mmペトリ皿上の増殖培地に埋め込んだ。皿をParafilmTMで包埋し、25℃にて明条件で2〜5週間培養室に置いた。
バイナリーベクターpBPSMM192b[LB−pSuper−gusINT−NOSt::AtAhast−AtAhas−pAtAhas−RB](配列番号2)を有するA.ツメファシエンスAGL1株を用いた。単一のコロニーを適当な抗生物質を含む25〜30mlのLB培地への接種に用いた。フラスコを28℃にて24〜36時間にわたりオービットシェイカー(220rpm)で振とうしたところ、OD600が0.8〜1.0に達した。3500rpmにて8〜10分遠心することによりアグロバクテリウムをペレットにした。細菌細胞を200μMアセトシリンゴンを含む液体共存培養培地に再懸濁した。切断後すぐに増殖腋生分裂組織外植片をA.ツメファシエンス懸濁液に浸漬し、30分間放置した。続いて、感染した組織を真空チャンバー(25〜30mmHg)に5分間移すか、又は共存培養培地上に直接置いた。培養培地に移す前に、外植片を滅菌ろ紙でぬぐって乾燥させた。固形共存培養培地への0、400又は800mg/L L−システインの添加(それぞれ0、3.3又は6.6mM)の処理について試験した。25℃にて暗条件で3日間にわたり共存培養を実施した。減圧浸潤によって、システインを添加せずに行ったプロトコールにおける形質転換効率が増大したが、システインを添加して行ったプロトコールには有意な影響はなかった。
A.ツメファシエンスAGL1株を感染させた増殖腋生分裂組織外植片を3日後に共存培養培地から取り出し、37℃で一晩かけてGUSで染色した。残りの外植片は500mg/L TimentinTMを含有するシュート誘導培地に移した。GUS組織化学的アッセイはまた接種の10日及び45日後に実施した。
3日間の共存培養後、GUS+巣を有する外植片の頻度は、2.5%から、固形共存培養培地への800mg/L(6.6mM)又は400mg/L(3.3mM)L−システインの添加によりそれぞれ45%及び63%に増大した。L−システインに暴露した外植片は、L−システインに暴露していない外植片よりも褐変及び組織壊死が少なかった。GUS染色の増大はまた共存培養の10日及び45日後にも観察された(表10)。
効率的なT−DNA送達及び組込みを可能にするA.ツメファシエンス株とバイナリーベクターとの最良の組み合わせを見い出すことが望ましい。A.ツメファシエンスの3つの菌株を、2つのダイズ品種Jack及びL00106CNの増殖腋生分裂組織外植片に感染する能力について比較した。さらに、3つの異なるバイナリーベクターの1つを保持するA.ツメファシエンスAGL1株の感染能を試験する第2の実験を実施した。
強力なダイズ形質転換系には、組織培養に制限時間のある迅速な再生があり、それによりソマクローナル変異に関連する問題が低減する。
[LB−pNOS−bar−NOSt−::pPcUBI−gusINT−NOSt−RB]
配列番号2:ベクターpBPSMM192bをコードするヌクレオチド配列
[LB−pSuper−gusINT−NOSt::AtAhast−AtAhas−pAtAhas−RB]
配列番号3:ベクターpBPSLM003をコードするヌクレオチド配列
[LB−OCSt−bar−pMAS::pSuper−gusINT−NOSt−RB]。
Claims (12)
- トランスジェニックダイズ植物の作製方法であって、以下のステップ:
(a)ダイズ幼苗の第一節又は第二節以上の葉節点の腋生分裂組織を準備するステップ、
(b)該腋生分裂組織を、農学的に有用な形質についての少なくとも1つの植物発現カセットと任意により1以上の選択マーカー遺伝子を含むトランスジェニックT−DNAを含むアグロバクテリウムと共存培養するステップ、
(c)該共存培養した腋生分裂組織を、以下:
(i)該腋生分裂組織からの新たなシュート誘導を誘導するのに好適な濃度の少なくとも1つの植物成長因子、並びに
(ii)任意により、ステップ(b)の選択マーカー遺伝子と組み合わせた場合に該選択マーカー遺伝子を含む植物細胞、組織若しくは植物体の同定及び/若しくは選択を可能にする1以上の選択化合物、並びに/又は
(iii)任意により、アグロバクテリウム増殖を抑制するのに好適な1以上の抗生物質
を含むシュート誘導培地に移し、シュートが誘導され発育するまで上記共存培養した腋生分裂組織を培養し、該シュートを単離するステップ、並びに
(d)該単離したシュートを発根培地に移し、該シュートが根を形成するまで該発根培地で該シュートを栽培し、さらにそのようにして誘導された、農学的に有用な形質についての少なくとも1つの植物発現カセットと任意により少なくとも1つの選択マーカー遺伝子を含むT−DNAが挿入されたゲノムを有する小植物体を、成熟植物まで再生するステップ
を含み、前記腋生分裂組織を、前記共存培養の前又は共存培養の間に傷つける、上記方法。 - 以下のステップ:
(a1)共存培養の前、その間又はその直後に外植片を傷つけるステップ、
(b1)ステップ(b)の後の共存培養した腋生分裂組織を、アグロバクテリウム増殖の抑制に好適な少なくとも1つの抗生物質及び任意により少なくとも1つの植物成長因子を含む培地に移すステップであって、該培地は、ステップ(b)の選択マーカー遺伝子と組み合わせた場合に該選択マーカー遺伝子を含む植物細胞、器官又は植物体の同定及び/又は選択を可能にする選択化合物を欠損することが好ましい、上記ステップ、
(b2)ステップ(b)及び任意によりステップ(b1)の後の腋生分裂組織を、少なくとも1つの植物成長因子を含むシュート誘導培地(SIM)においてさらにインキュベートするステップであって、該シュート誘導培地は、ステップ(b)の選択マーカー遺伝子と組み合わせた場合に該選択マーカー遺伝子を含む植物細胞、器官又は植物体の同定及び/又は選択を可能にする選択化合物を欠損することが好ましい、上記ステップ、
(c1)ステップ(c)の後のシュートを、以下:
(i)シュートが伸長するのに好適な濃度の少なくとも1つの植物成長因子、及び
(ii)任意により、ステップ(b)の選択マーカー遺伝子と組み合わせた場合に該選択マーカー遺伝子を含む植物細胞、組織又は植物体の同定及び/又は選択を可能にする1以上の選択化合物
を含むシュート伸長培地に移し、該移したシュートを、少なくとも約2cmの長さに伸長するまで該シュート伸長培地で栽培するステップ
からなる群より選択される1以上の追加ステップをさらに含む、請求項1記載の方法。 - 第一節又は第二節以上の節の腋生分裂組織が、以下:
(a)実質的に幼苗全体として準備される幼苗腋生分裂組織、及び
(b)腋生分裂組織が葉の葉柄に付いて残るように、第一葉又は第二葉以上の葉を切開することにより準備される葉腋分裂組織、及び
(c)増殖させた腋生分裂組織
からなる群より選択される形態で準備される、請求項1又は2記載の方法。 - 実質的に幼苗全体が、以下:
(a)幼苗全体、
(b)根を取り除いた幼苗、
(c)1又は両方の子葉を取り除いた幼苗、
(d)根及び1又は両方の子葉を取り除いた幼苗、
(e)根、両方の子葉及び上胚軸の一部を取り除き、上胚軸の一部に付いている腋生分裂組織が残っている幼苗
からなる材料群より選択される、請求項3記載の方法。 - ダイズ幼苗を外植片作製の約4〜10日前に発芽させる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(b)、(b1)、(b2)及び/又は(c)の少なくとも1つのステップの培地がサイトカイニンを含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- サイトカイニンが、約1μM〜約10μMの濃度の6−ベンジルアミノプリンである、請求項6記載の方法。
- ステップ(b)、(b1)、(b2)、(c)及び/又は(c1)の少なくとも1つのステップの培地、好ましくは少なくともステップ(b)及び(c1)の培地が、約0.1μM〜約2μMジベレリン酸(GA3)を含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(b)、(b1)、(b2)及び(c)の少なくとも1つのステップの培地が少なくとも1つのチオール化合物を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- チオール化合物が、約1mM〜10mMの濃度のL−システイン、約0.1mM〜5mMの濃度のジチオトレイトール、及び/又は0.1mM〜5mMの濃度のチオ硫酸ナトリウム(sodium thiolsulfate)である、請求項9記載の方法。
- ステップ(c1)及び/又は(d)の少なくとも1つのステップの培地が、約0.01mg/l〜約1μM mg/lインドール酢酸(IAA)、及び/又は約0.1μM〜約4μMジベレリン酸(GA3)、及び/又は約0.5μM〜約6μMゼアチンリボシド酸を含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- アグロバクテリウムが、アグロバクテリウム・ツメファシエンス及びアグロバクテリウム・リゾゲネスの安全化菌株を含む群より選択される菌株である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
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