JP4676847B2 - 組換え微生物 - Google Patents

Description

本発明は、有用なタンパク質又はポリペプチドの生産に用いる組換え微生物、及びタンパク質又はポリペプチドの生産方法に関する。

微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬や、洗剤、化粧品等の日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。

こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われるようになっている。さらに、近年のゲノム解析技術の急速な発展を受けて、対象とする微生物のゲノム情報を解読し、これらを積極的に産業に応用しようとする試みもなされている。ゲノム情報の公開されている産業的に有用な宿主微生物としては、枯草菌Bacillus subtilis Marburg No.168（非特許文献１）、大腸菌Escherichia coli K-12 MG1655（非特許文献２）、コリネバクテリウムCorynebacterium glutamicum ATCC132032などが挙げられ、これらのゲノム情報を利用し、改良を加えた菌株が開発されている。しかしながら、上記のような取り組みにも関わらず、生産効率は必ずしも満足できるものではなかった。

Nature,390,249,1997 Science,277,1453,1997

本発明は、タンパク質又はポリペプチドの生産性がより向上された微生物、及び当該微生物を利用して、目的のタンパク質又はポリペプチドを製造する方法を提供することに関する。

本発明者らは、微生物ゲノム上にコードされる各種遺伝子において、有用なタンパク質又はポリペプチドの生産に影響を及ぼす遺伝子を探索したところ、特定の遺伝子をゲノム上から欠失又は不活性化した後、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した場合に、目的のタンパク質又はポリペプチドの生産性が、当該遺伝子の欠失又は不活性化前と比較して向上することを見出した。

すなわち本発明は、枯草菌の遺伝子ansR、degU、gltC、hpr、phoP、purR、pyrR、ykoZ、yobS、yocG、ysmB、yvoA、yvrH、yvzC、ywhA、bofA、ykyB及びyuxKのいずれか、又は当該遺伝子に相当する遺伝子のいずれか１以上の遺伝子が欠失又は不活性化された微生物株に、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物に関する。

また本発明は、当該組換え微生物を用いた目的のタンパク質又はポリペプチドの製造方法に関する。

本発明の組換え微生物を用いることにより、目的のタンパク質又はポリペプチドの生産性向上を図ることができる。

本発明においてアミノ酸配列および塩基配列の同一性はLipman-Pearson法 (Science, 227, 1435, (1985))によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出される。

本発明の微生物を構築するための親微生物としては、枯草菌の遺伝子ansR、degU、gltC、hpr、phoP、purR、pyrR、ykoZ、yobS、yocG、ysmB、yvoA、yvrH、yvzC、ywhA、bofA、ykyB若しくはyuxK、又は当該遺伝子に相当する遺伝子を有するものであればよく、これらは野生型のものでも変異を施したものでもよい。具体的には、バチルス（Bacillus）属細菌や、クロストリジウム(Clostridium)属細菌、或いは酵母等が挙げられ、中でもバチルス（Bacillus）属細菌が好ましい。更に、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点、またタンパク質を菌体外に分泌生産させる能力を有する点から特に枯草菌（Bacillus subtilis）が好ましい。

本発明において欠失又は不活性化の対象となる枯草菌の遺伝子は、ansR、degU、gltC、hpr、phoP、purR、pyrR、ykoZ、yobS、yocG、ysmB、yvoA、yvrH、yvzC、ywhA、bofA、ykyB及びyuxKのいずれか、又は当該遺伝子に相当する遺伝子のいずれか１以上の遺伝子である。
以下の表１に、ansR、degU、gltC、hpr、phoP、purR、pyrR、ykoZ、yobS、yocG、ysmB、yvoA、yvrH、yvzC、ywhA、bofA、ykyB及びyuxK遺伝子の名称、番号及び機能を示す。これらは、Kunstらによって報告され（Nature,390,249-256,1997）、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新)された枯草菌ゲノムデーターに基づいて記載している。

表１に示される枯草菌の各遺伝子と同じ機能を有する、及び／又は表１の各遺伝子と塩基配列において70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有する、他の微生物由来、好ましくはBacillus属細菌由来の遺伝子は、表１に記載の遺伝子に相当する遺伝子と考えられ、本発明において欠失、不活性化すべき遺伝子に含まれる。

欠失又は不活性化する遺伝子は１以上であればよく、上記以外の遺伝子群の欠失又は不活性化を組み合わせることも可能である。更には上記遺伝子群の欠失の他に、それ以外の遺伝子群（例えば、prsA遺伝子等）の発現強化及び機能強化を組み合わせることも可能であり、生産性向上に対してより大きな効果が期待される。
また、上記遺伝子の不活性化は、当該遺伝子中に他のDNA断片を挿入する、或いは当該遺伝子の転写・翻訳開始領域に変異を与える等の方法によって行うことができるが、好適には、標的遺伝子を物理的に欠失させる方がより望ましい。

本発明遺伝子の欠失又は不活性化の手順としては、ansR、degU、gltC、hpr、phoP、purR、pyrR、ykoZ、yobS、yocG、ysmB、yvoA、yvrH、yvzC、ywhA、bofA、ykyB及びyuxKのいずれか、又は当該遺伝子に相当する遺伝子（標的遺伝子）を計画的に欠失又は不活性化する方法のほか、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化変異を与えた後、適当な方法によりタンパク質生産性の評価及び遺伝子解析を行う方法が挙げられる。

標的遺伝子を欠失又は不活性化するには、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、標的遺伝子の一部を含むDNA断片を適当なプラスミドベクターにクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを親微生物細胞内に取り込ませ、標的遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによって親微生物ゲノム上の標的遺伝子を分断して不活性化することが可能である。或いは、塩基置換や塩基挿入等の変異によって不活性化した標的遺伝子、又は図１のように標的遺伝子の上流、下流領域を含むが標的遺伝子を含まない直鎖状のDNA断片等をPCR等の方法によって構築し、これを親微生物細胞内に取り込ませて親微生物ゲノムの標的遺伝子内の変異箇所の外側の２ヶ所、又は標的遺伝子上流側、下流側で２回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子を欠失或いは不活性化した遺伝子断片と置換することが可能である。

特に、本発明微生物を構築するための親微生物として枯草菌を用いる場合、相同組換えにより標的遺伝子を欠失又は不活性化する方法については、既にいくつかの報告例があり（Mol.Gen.Genet.,223,268,1990等)、こうした方法を繰り返すことによって、本発明の宿主微生物を得ることができる。

また、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化についてもランダムにクローニングしたDNA断片を用いて上述の方法と同様な相同組換えを起こさせる方法や、親微生物にγ線等を照射すること等によっても実施可能である。

以下に、より具体的にSOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989)によって調製される欠失用DNA断片を用いた二重交差法による欠失方法について説明するが、本発明に於ける遺伝子欠失方法は下記に限定されるものではない。

本方法で用いる欠失用DNA断片は、欠失対象遺伝子の上流に隣接する約1.0kb断片と、同じく下流に隣接する約1.0kb断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片を挿入した断片である。まず、1回目のPCRによって、欠失対象遺伝子の上流断片及び下流断片、並びに薬剤耐性マーカー遺伝子断片の3断片を調製するが、この際、例えば、上流断片の下流末端に薬剤耐性マーカー遺伝子の上流側10〜30塩基対配列、逆に下流断片の上流末端には薬剤耐性マーカー遺伝子の下流側10〜30塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図１）。

次いで、1回目に調製した3種類のPCR断片を鋳型とし、上流断片の上流側プライマーと下流断片の下流側プライマーを用いて2回目のPCRを行うことによって、上流断片の下流末端及び下流断片の上流末端に付加した薬剤耐性マーカー遺伝子配列に於いて、薬剤耐性マーカー遺伝子断片とのアニールが生じ、PCR増幅の結果、上流側断片と下流側断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子を挿入したDNA断片を得ることができる（図１）。

薬剤耐性マーカー遺伝子として、クロラムフェニコール耐性遺伝子を用いる場合、例えば表１に示したプライマーセットを用い、Pyrobest DNAポリメーラーゼ（宝酒造）などの一般のPCR用酵素キット等を用いて、成書（PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by B.A.White, Humana Press pp251 ,1993、Gene,77,61,1989)等に示される通常の条件によりSOE−PCRを行うことによって、各遺伝子の欠失用DNA断片が得られる。

かくして得られた遺伝子欠失用DNA断片を、コンピテント法等によって細胞内に導入すると、同一性のある欠失対象遺伝子の上流及び下流の相同領域おいて、細胞内での遺伝子組換えが生じ、標的遺伝子が薬剤耐性遺伝子と置換した細胞、或いは標的遺伝子内に薬剤耐性遺伝子が挿入された細胞が薬剤耐性マーカーによる選択によって分離できる（図１）。即ち、後記表２に示したプライマーセットを用いて調製した欠失用DNA断片を導入した場合、クロラムフェニコールを含む寒天培地上に生育するコロニーを分離し、ゲノムを鋳型としたPCR法などによってゲノム上の目的遺伝子がクロラムフェニコール耐性遺伝子と置換されていることを確認すれば良い。

本発明の組換え微生物を用いて生産される目的タンパク質又は目的ポリペプチドは、特に限定されず、例えば洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断など各種産業用酵素や、生理活性ペプチドなどが挙げられるが、産業用酵素が好ましい。また、産業用酵素は、機能別に、酸化還元酵素(Oxidoreductase)、転移酵素(Transferase)、加水分解酵素(Hydrolase)、脱離酵素 (Lyase)、異性化酵素(Isomerase)、合成酵素(Ligase/Synthetase)等が含まれ、好適には、セルラーゼ、α-アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素やクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ)等の転移酵素が挙げられる。

セルラーゼとしては、例えば、多糖加水分解酵素の分類（Biochem.J.,280,309,1991）中でファミリー５に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特にBacillus属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。より具体的な例として、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるBacillus属細菌KSM-S237株（FERM BP-7875）由来のアルカリセルラーゼ、または、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるBacillus属細菌KSM-64株（FERM BP-2886）由来のアルカリセルラーゼ、或いは、当該アミノ酸配列と70％、好ましくは80％、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼが挙げられる。
斯かるセルラーゼの生産においては、本発明の枯草菌遺伝子のうち、degU、pyrR、yobS、yocG、yvoA、yvrH、yvzC、bofA及びykyBのいずれか、又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化した微生物株を用いるのがより好ましい。

α−アミラーゼの具体例としては、微生物由来のα−アミラーゼが挙げられ、特にBacillus属細菌由来の液化型アミラーゼが好ましい。より具体的な例として、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるBacillus属細菌KSM-K38株（FERM BP-6946）由来のアルカリアミラーゼや、当該アミノ酸配列と70％、好ましくは80％、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミラーゼが挙げられる。
斯かるα−アミラーゼの生産においては、本発明の枯草菌遺伝子のうち、ansR、degU、gltC、hpr、phoP、purR、pyrR、ykoZ、yobS、yocG、ysmB、yvoA、ywhA、bofA及びykyBのいずれか、又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化した微生物株を用いるのがより好ましい。

プロテアーゼの具体例としては、微生物由来、特にBacillus属細菌由来のセリンプロテアーゼや金属プロテアーゼ等が挙げられる。より具体的な例として、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるバチルス クラウジ（Bacillus clausii）KSM-K16株(FERM BP-3376)由来のアルカリプロテアーゼや、当該アミノ酸配列と70％、好ましくは80％、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるプロテアーゼが挙げられる。
斯かるプロテアーゼの生産においては、本発明の枯草菌遺伝子のうち、degU、pyrR、ykoZ、yobS、ysmB、yvoA、yvrH、yvzC、ywhA、bofA、ykyB及びyuxKのいずれか、又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化した微生物株を用いるのがより好ましい。

クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ)は、アセチル-CoAのアセチル基をクロラムフェニコールの3位に転移する酵素である。具体的には、配列番号１００で示されるアミノ酸配列からなるStaphylococcus aureus由来のＣＡＴや、当該アミノ酸配列と70％、好ましくは80％、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有し、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
斯かるＣＡＴの生産においては、本発明の枯草菌遺伝子のうち、degU、pyrR、yobS、ysmB、yvrH、bofA及びykyBのいずれか、又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化した微生物株を用いるのがより好ましい。

本発明の微生物に導入される目的タンパク質又はポリペプチドの遺伝子は、その上流に当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始領域並びに分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域が適正な形で結合されていることが望ましい。特に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3領域が結合されていることが好ましく、更に分泌シグナルペプチド領域がバチルス（Bacillus）属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始領域及び翻訳開始領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1 kb領域であるものが、目的のタンパク質又はポリペプチド遺伝子と適正な形で結合されていることが望ましい。例えば、特開2000-210081号公報や特開平4-190793号公報等に記載されているバチルス（Bacillus）属細菌、すなわちKSM-S237株（FERM BP-7875）、KSM-64株（FERM BP-2886）由来のセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域が目的のタンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。より具体的には配列番号１で示される塩基配列の塩基番号1〜659の塩基配列、配列番号３で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜696の塩基配列、また当該塩基配列に対して70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、或いは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるDNA断片が、目的のタンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。尚、ここで、上記塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるDNA断片とは、上記塩基配列の一部を欠失しているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を保持しているDNA断片を意味する。

上記の目的のタンパク質又はポリペプチド遺伝子を含むDNA断片と適当なプラスミドベクターを結合させた組換えプラスミドを、一般的な形質転換法を用いて宿主微生物細胞に取り込ませることによって、本発明の組換え微生物を得ることができる。また、当該DNA断片に宿主微生物ゲノムとの適当な相同領域を結合したDNA断片を用い、宿主微生物ゲノムに直接組み込むことによっても本発明の組換え微生物を得ることができる。

本発明の組換え微生物を用いた目的のタンパク質又はポリペプチドの生産は、当該菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、タンパク質又はポリペプチドを採取・精製することにより行えばよい。そして、後記実施例に示すように、目的のタンパク質又はポリペプチドの生産性は、本発明の遺伝子を欠失又は不活性化していない微生物を用いた場合と比較して、その向上が達成されている。

以下に、本発明の組換え微生物の構築方法及び当該組換え微生物を用いたセルラーゼの生産方法について具体的に説明する。

実施例１
枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表に示したansR-AFとansR-A/CmR、及びansR-B/CmFとansR-BRの各プライマーセットを用いて、ゲノム上のansR遺伝子の上流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ａ）、及び下流に隣接する０．６ｋｂ断片（Ｂ）をそれぞれ調製した。一方、プラスミドpC194（J. Bacteriol. 150 (2), 815 (1982)）のクロラムフェニコール耐性遺伝子をプラスミドｐＵＣ１８のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ切断点に挿入した組換えプラスミドpCBB31を鋳型とし、表２に示したCmFとCmRプライマーセットを用いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含む１ｋｂ断片（Ｃ）を調製した。次に、得られた（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）３断片を混合して鋳型とし、表のプライマーansR-AFとansR-BRを用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、３断片を（Ａ）（Ｃ）（Ｂ）の順になる様に結合させ、２．２ｋｂのＤＮＡ断片を得た（図参照）。このＤＮＡ断片を用いてコンピテント法により枯草菌１６８株の形質転換を行い、クロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、ＰＣＲによってansR遺伝子が欠失され、クロラムフェニコール耐性遺伝子に置換していることを確認した。

実施例２
一方、実施例１と同様に、表に示した各遺伝子-AF、各遺伝子-A/CmR、各遺伝子-B/CmF、各遺伝子-BR、CmF、CmRのプライマーセットにより調製した欠失用ＤＮＡ断片を用いて、ゲノム上のdegU、gltC、hpr、phoP、purR、pyrR、ykoZ、yobS、yocG、ysmB、yvoA、yvrH、yvzC、ywhA又はbofA遺伝子が欠失され、クロラムフェニコール耐性遺伝子に置換した遺伝子欠失株をそれぞれ分離した。

実施例３
また、表に示した遺伝子-AF、遺伝子-A/Cm2R、遺伝子-B/Cm2F、遺伝子-BR、Cm2F、Cm2Rのプライマーセットにより、実施例２と同様に調製した欠失用ＤＮＡ断片を用いて、ゲノム上のykyB遺伝子が欠失され、クロラムフェニコール耐性遺伝子に置換した遺伝子欠失株を分離した。

実施例４
更に、表に示した遺伝子-AF、遺伝子-A/Cm4R、遺伝子-B/Cm4F、遺伝子-BR、遺伝子-A/Cm4F、遺伝子-B/Cm4Rのプライマーセットにより、実施例２と同様に調製した欠失用ＤＮＡ断片を用いて、ゲノム上のyuxK遺伝子が欠失され、クロラムフェニコール耐性遺伝子に置換した遺伝子欠失株をそれぞれ分離した。

実施例５
実施例１−４にて得られた各遺伝子欠失株、及び対照として枯草菌１６８株に、バチルス エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｓ２３７株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子（特開２０００-２１００８１号公報）をコードするＤＮＡ断片（３．１ｋｂ）がシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫのＢａｍＨＩ制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を、プロトプラスト形質転換法によって導入した。これによって得られた菌株を１０ｍＬのＬＢ培地で一夜３０℃で振盪培養を行い、更にこの培養液０．０５ｍＬを５０ｍＬの２×Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４−５水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン）に接種し、３０℃で３日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。この結果、表３に示した様に、宿主として各遺伝子欠失株を用いた場合、対照の１６８株（野生型）の場合と比較して高いアルカリセルラーゼの分泌生産が認められた。

実施例６
バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-K38株（FERM BP-6946）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表４に示されるK38matu-F2(ALAA)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリアミラーゼ（特開2000-184882号公報、Eur.J.Biochem.,268,2974,2001）をコードする配列番号５で示される塩基配列のうちアルカリアミラーゼ成熟酵素領域1.6kbのDNA断片（Ｄ）を増幅した。またバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表４に示されるS237ppp-F2(BamHI)とS237ppp-R2(ALAA)のプライマーセットを用いてPCRを行い、配列番号１で示されるアルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）のうち転写開始制御領域、翻訳開始制御プロモーター領域と、及び分泌シグナル配列をコードする領域を含む0.6kbのDNA断片（Ｅ）を増幅した。次いで、得られた（Ｄ）（Ｅ）の2断片を混合して鋳型とし、表Ｘに示されるS237ppp-F2(BamHI)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、アルカリセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御プロモーター領域と、及び分泌シグナル配列をコードする領域の下流にアルカリアミラーゼ遺伝子が連結した2.2 kbのDNA断片（Ｆ）を得た。得られた2.2kbのDNA断片（Ｆ）をシャトルベクターpHY300PLK（ヤクルト）のBamHI-XbaI制限酵素切断点に挿入し、アルカリアミラーゼ生産性評価用プラスミドpHYK38(S237ps)を構築した。

実施例１−４にて得られた各遺伝子欠失株、及び対照として枯草菌１６８株に、構築したアルカリアミラーゼ生産性評価用プラスミドpHYK38(S237ps)をプロトプラスト形質転換法によって導入した。これによって得られた菌株を１０ｍＬのＬＢ培地で一夜３０℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.05ｍＬを５０ｍＬの２×Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４−５水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン）に接種し、３０℃で5日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリアミラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリアミラーゼの量を求めた。この結果、表５に示した様に、各遺伝子欠失株を宿主として用いた場合、対照の１６８株（野生型）の場合と比較して高いアルカリアミラーゼの分泌生産が認められた。

実施例７
バチルス クラウジイ（Bacillus clausii）KSM-K16株（FERM BP-3376）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表６に示されるS237pKAPpp-FとKAPter-R(BglII)のプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリプロテアーゼ（特許第３０２６１１１、Kobayashi, T., Hakamada, Y., Adachi, S., Hitomi, J., Yoshimatsu, T., Koike, K., Kawai, S. and Ito, S. （1995） Purification and properties of an alkaline protease from alkalophilic Bacillus sp. KSM-K16. Appl Microbiol Biotechnol., 43 (3) : 473-81.）をコードする配列番号７で示される塩基配列のうちアルカリプロテアーゼのシグナル配列、プロ配列および成熟酵素領域を含む1.2kbのDNA断片（Ｇ）を増幅した。またバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表６に示されるS237ppp-F2(BamHI)とS237pKAPpp-Rのプライマーセットを用いてPCRを行い、配列番号１で示されるアルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）のうち転写開始制御領域、翻訳開始制御プロモーター領域をコードする0.6kbのDNA断片（Ｈ）を増幅した。次いで、得られた（Ｇ）（Ｈ）の2断片を混合して鋳型とし、表６に示されるS237ppp-F2(BamHI)とKAPter-R(BglII)のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、アルカリセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御プロモーター領域の下流に、アルカリプロテアーゼのシグナル配列、プロ配列および成熟酵素領域が連結した1.8kbのDNA断片（Ｉ）を得た。得られた1.8kbのDNA断片（Ｉ）をシャトルベクターpHY300PLK（ヤクルト）のBamHI-BglII制限酵素切断点に挿入し、アルカリプロテアーゼ生産性評価用プラスミドpHYKAP（S237p）を構築した。

実施例１−４にて得られた各遺伝子欠失株、及び対照として枯草菌１６８株に、構築したアルカリプロテアーゼ生産性評価用プラスミドpHYKAP（S237p）をプロトプラスト形質転換法によって導入した。これによって得られた菌株を１０ｍＬのＬＢ培地で一夜３０℃で振盪培養を行い、更にこの培養液０．０５ｍＬを５０ｍＬの２×Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４−５水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン）に接種し、３０℃で３日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリプロテアーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリプロテアーゼの量を求めた。この結果、表７に示した様に、各遺伝子欠失株を宿主として用いた場合、対照の１６８株（野生型）の場合と比較して高いアルカリプロテアーゼの分泌生産が認められた。

実施例８
プラスミドpC１９４を鋳型として、表８に示されるSP64sCATm-FとCATm-R(XbaI)のプライマーセットを用いてPCRを行い、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含む0.7kbのDNA断片（Ｊ）を増幅した。またバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表８に示されるS237ppp-F2(BamHI)とSP64sCATm-Rのプライマーセットを用いてPCRを行い、配列番号１で示されるアルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）のうち転写開始制御領域、翻訳開始制御プロモーター領域およびシグナル配列の一部をコードする0.6kbのDNA断片（Ｋ）を増幅した。次いで、得られた（Ｊ）（Ｋ）の2断片を混合して鋳型とし、表８に示されるS237ppp-F2(BamHI)とCATm-R(XbaI)のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、アルカリセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御プロモーター領域およびシグナル配列の一部をコードする領域の下流に、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ酵素領域が連結した1.3 kbのDNA断片（Ｌ）を得た。得られた1.3kbのDNA断片（Ｌ）をシャトルベクターpHY300PLK（ヤクルト）のBamHI-XbaI制限酵素切断点に挿入し、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ生産性評価用プラスミドpHYCAT（S237pSP64ｓ）を構築した。

実施例１−４にて得られた各遺伝子欠失株、及び対照として枯草菌１６８株に、構築したクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ生産性評価用プラスミドpHYCAT（S237pSP64ｓ）をプロトプラスト形質転換法によって導入した。これによって得られた菌株を１０ｍＬのＬＢ培地で一夜３０℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.05ｍＬを５０ｍＬの２×Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４−５水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン）に接種し、３０℃で３日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの量を求めた。この結果、表９に示した様に、各遺伝子欠失株を宿主として用いた場合、対照の１６８株（野生型）の場合と比較して高いクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ)の分泌生産が認められた。

SOE−PCRによる遺伝子欠失用DNA断片の調製、及び当該DNA断片を用いて標的遺伝子を欠失する（薬剤耐性遺伝子と置換）方法を模式的に示したものである。

Claims (8)

1. 遺伝子ansR、gltC、hpr、phoP、purR、pyrR、yobS、yocG、ysmB、ywhA、bofA及びykyBのいずれか１以上が欠失又は不活性化された枯草菌株に、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物であって、
   当該目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌用シグナル領域からなる３領域が結合されており、
   当該目的のタンパク質又はポリペプチドがアミラーゼである、
   組換え微生物。
2. 遺伝子degU、pyrR、yobS、ysmB、yvzC、bofA、ykyB及びyuxKのいずれか１以上が欠失又は不活性化された枯草菌株に、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物であって、
   当該目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌用シグナル領域からなる３領域が結合されており、
   当該目的のタンパク質又はポリペプチドがプロテアーゼである、
   組換え微生物。
3. 遺伝子yobS及びbofAのいずれか１以上が欠失又は不活性化された枯草菌株に、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物であって、
   当該目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の上流に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌用シグナル領域からなる３領域が結合されており、
   当該目的のタンパク質又はポリペプチドがセルラーゼである、
   組換え微生物。
4. 分泌シグナル領域がバチルス（Bacillus）属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流０．６〜１ｋｂ領域由来のものである請求項１〜３のいずれか１項記載の組換え微生物。
5. 転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が、配列番号１で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６５９の塩基配列、配列番号３で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６９６の塩基配列又は当該塩基配列のいずれかと９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片である請求項１〜４のいずれか１項記載の組換え微生物。
6. 請求項１記載の組換え微生物を用いるアミラーゼの製造方法。
7. 請求項２記載の組換え微生物を用いるプロテアーゼの製造方法。
8. 請求項３記載の組換え微生物を用いるセルラーゼの製造方法。