JP4505452B2

JP4505452B2 - 酵母におけるｈｐｖ３１ｌ１の最適化発現

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Publication number: JP4505452B2
Application number: JP2006507439A
Authority: JP
Inventors: ヤンセン，カトリーン・ウー; シユルツ，ローレン・デイ; ニーパー，マイケル・ピー; マルクス，ヘンリー・ゼツト
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 2003-03-24
Filing date: 2004-03-19
Publication date: 2010-07-21
Anticipated expiration: 2024-03-19
Also published as: CN100506999C; WO2004084831A2; EP1608767B1; IS2859B; ECSP056032A; RU2005132603A; ES2381964T3; HK1090953A1; BRPI0408639B1; EP1608767A2; FR15C0079I2; NL300772I1; AU2004224335A1; IL171067A; JP2006523099A; NZ542246A; BRPI0408639B8; US20060177817A1; EP1608767A4; NO341527B1

Description

本発明は、全般的には、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の治療に関する。より詳しくは、本発明は、ＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチド、ならびに該ポリヌクレオチドを含む組換えベクターおよび宿主に関する。本発明はまた、ＨＰＶ３１様ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ならびにＨＰＶの予防および治療のためのワクチンおよび医薬組成物におけるその使用に関する。

８０を超える型のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）が存在し、それらのうちの多くは良性増殖性疣贅から悪性癌に及ぶ多種多様な生物学的表現型に関連づけられている（概説としては、ＭｃＭｕｒｒａｙら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．８２（１）：１５−３３（２００１）を参照されたい）。ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１は、性器粘膜または呼吸器粘膜の良性疣贅、非悪性尖形コンジローマおよび／または低悪性異形成に最も一般的に関連している型である。ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８は、子宮頸部、膣、外陰部および肛門管の発生部位内非浸潤性（ｉｎｓｉｔｕ）および浸潤性癌に最も一般的に関連している高リスク型である。子宮頸癌の９０％以上はＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８またはより稀な発癌性型ＨＰＶ３１、３３、４５、５２および５８に関連している（Ｓｃｈｉｆｆｍａｎら，Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．８５（１２）：９５８−６４（１９９３））。ＨＰＶＤＮＡが子宮頸癌の９０〜１００％で検出されるという観察は、ＨＰＶが子宮頸癌を引き起こすという強力な疫学的証拠を提供している（Ｂｏｓｃｈら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．５５：２４４−２６５（２００２）を参照されたい）。

パピローマウイルスは、８個までの初期遺伝子および２個の後期遺伝子をコードする小型（５０〜６０ｎｍ）非外包性二十面体ＤＮＡウイルスである。そのウイルスゲノムのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）はＥ１〜Ｅ７ならびにＬ１およびＬ２と称され、この場合の「Ｅ」は初期を意味し、「Ｌ」は後期を意味する。Ｌ１およびＬ２はウイルスカプシドタンパク質をコードし、一方、Ｅ遺伝子は、ウイルス複製および細胞トランスフォーメーションのような機能に関連している。

Ｌ１タンパク質は主要カプシドタンパク質であり、５５〜６０ｋＤａの分子量を有する。Ｌ２タンパク質は副次的カプシドタンパク質である。免疫学的データは、Ｌ２タンパク質の大部分がＬ１タンパク質の内部に存在することを示唆している。Ｌ１タンパク質およびＬ２タンパク質は共に、種々のパピローマウイルス間で高度に保存されている。

酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞または細菌におけるＬ１タンパク質またはＬ１およびＬ２タンパク質の組合せ体の発現はウイルス様粒子（ＶＬＰ）の自己集合を引き起こす（概説としては、ＳｃｈｉｌｌｅｒおよびＲｏｄｅｎ，ｉｎＰａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓＲｅｖｉｅｗｓ：ＣｕｒｒｅｎｔＲｅｓｅａｒｃｈｏｎＰａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ；Ｌａｃｅｙ編，Ｌｅｅｄｓ，ＵＫ：ＬｅｅｄｓＭｅｄｉｃａｌＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｐｐ１０１−１２（１９９６）を参照されたい）。ＶＬＰは真正ビリオンに形態学的に類似しており、動物またはヒトに投与されると高力価の中和抗体を誘導しうる。ＶＬＰは、潜在的発癌性ウイルスゲノムを含有しないため、ＨＰＶワクチンの開発における生ウイルスの使用に代わる安全な手段となる（概説としては、ＳｃｈｉｌｌｅｒおよびＨｉｄｅｓｈｅｉｍ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９：６７−７４（２０００）を参照されたい）。この理由により、Ｌ１およびＬ２遺伝子はＨＰＶ感染および疾患に対する予防用および治療用ワクチンの免疫学的標的と目されている。

うまく形質転換された宿主生物における高い発現レベルのカプシドタンパク質を入手することは困難であり、これにより精製タンパク質の製造が制限されるため、ＨＰＶワクチンの開発および商業化は妨げられている。したがって、ＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質のようなＨＰＶＬ１タンパク質をコードする野生型ヌクレオチド配列が同定されているものの（Ｇｏｌｄｓｂｏｒｏｕｇｈら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７１（１）：３０６−３１１（１９８９））、意図される宿主細胞内での発現に関して最適化されたＨＰＶ３１Ｌ１コード化ヌクレオチド配列を利用する容易に再生可能な粗ＨＰＶタンパク質源を開発することが非常に望ましいであろう。また、ワクチン開発で使用する天然タンパク質の免疫付与特性を有する大量のＨＰＶ３１Ｌ１ＶＬＰを製造することが有用であろう。

発明の概要
本発明は、子宮頸癌に関連づけられているＨＰＶ３１Ｌ１遺伝子により発現されるタンパク質産物に対する免疫を惹起または増強するための組成物および方法に関する。特に、本発明は、酵母により認識される内部転写終結シグナルを含有しない、ＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。また、酵母細胞内での高レベル発現に関してコドン最適化された、ＨＰＶ３１Ｌ１をコードする合成ポリヌクレオチドも提供する。本発明は更に、ＨＰＶ３１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供し、ＨＰＶ疾患またはＨＰＶ関連癌の予防および／または治療用の免疫原性組成物およびワクチンにおける該ＶＬＰの使用を開示する。

本発明は、ＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質をコードする合成ＤＮＡ分子に関する。本発明の１つの態様においては、該合成分子のヌクレオチド配列は、酵母により認識される転写終結シグナルを除去するために改変されている。もう１つの態様においては、合成分子のコドンは、酵母細胞により好ましいコドンが利用されるよう設計される。該合成分子は、ＶＬＰに自己集合しうるＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質の源として使用することが可能である。該ＶＬＰは、ＶＬＰに基づくワクチンにおいて使用することが可能である。

本発明の特定の実施形態は、配列番号４に記載のＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質をコードする、配列番号２または配列番号３に記載のヌクレオチドの配列を含む合成核酸分子を含む。

前記のとおり、本発明においては、酵母により認識される転写終結シグナルを含有しないＨＰＶ３１Ｌ１遺伝子をコードする合成ポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、酵母細胞にとって好ましいコドンを含有するよう更に改変された、前記のＨＰＶ３１Ｌ１をコードする合成ポリヌクレオチドを提供する。

また、本明細書中の全体に開示されている核酸分子を含有する組換えベクターおよび組換え宿主細胞（原核細胞および真核細胞）を提供する。

本発明は、（ａ）ＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質をコードする核酸（該核酸分子は、酵母により認識される内部転写終結シグナルを含有しない）を含むベクターを酵母宿主細胞内に導入し、（ｂ）ＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質の発現を可能にする条件下、該酵母宿主細胞を培養することを含む、組換え宿主細胞内でＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質を発現させるための方法に関する。

本発明は、（ａ）ＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質をコードする核酸（該核酸分子は、酵母宿主細胞内での最適化発現に関してコドン最適化されている）を含むベクターを酵母宿主細胞内に導入し、（ｂ）ＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質の発現を可能にする条件下、該酵母宿主細胞を培養することを含む、組換え宿主細胞内でＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質を発現させるための方法に関する。

好ましい実施形態においては、該核酸は、配列番号２または配列番号３に記載のヌクレオチドの配列を含む。

本発明はまた、ＨＰＶ３１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ＨＰＶ３１ＶＬＰの製造方法、およびＨＰＶ３１ＶＬＰの使用方法に関する。

本発明の好ましい実施形態においては、ＨＰＶ３１ＶＬＰは酵母において製造される。もう１つの好ましい実施形態においては、酵母は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）、クリーベルミセス・フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｍｙｃｅｓｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ）およびシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）よりなる群から選ばれる。

本発明のもう１つの態様は、酵母により認識される転写終結シグナルを含有しないＨＰＶ３１Ｌ１遺伝子により産生されるＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質を含むＨＰＶ３１ＶＬＰである。

本発明の更にもう１つの態様は、コドン最適化ＨＰＶ３１Ｌ１遺伝子により産生されるＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質を含むＨＰＶ３１ＶＬＰである。本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、コドン最適化ＨＰＶ３１Ｌ１遺伝子は、配列番号２または配列番号３に記載のヌクレオチドの配列より実質的になる。

本発明はまた、ＨＰＶ３１ウイルス様粒子を動物に投与することを含んでなる、動物において免疫応答を誘導するための方法を提供する。好ましい実施形態においては、ＨＰＶ３１ＶＬＰはコドン最適化遺伝子により産生される。もう１つの好ましい実施形態においては、ＨＰＶ３１ＶＬＰは、酵母により認識される転写終結配列を含有しない遺伝子により製造される。

本発明の更にもう１つの態様は、ＨＰＶ３１ＶＬＰを含むワクチンを哺乳動物に投与することを含む、ＨＰＶ関連子宮頸癌の予防または治療方法である。本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、ＨＰＶ３１ＶＬＰは酵母において製造される。

本発明はまた、ＨＰＶ３１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含むワクチンに関する。

本発明のこの態様のもう１つの実施形態においては、該ワクチンは更に、少なくとも１つの追加的ＨＰＶ型のＶＬＰを含む。好ましい実施形態においては、その少なくとも１つの追加的ＨＰＶ型は、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９およびＨＰＶ６８よりなる群から選ばれる。

本発明はまた、ＨＰＶ３１ウイルス様粒子を含む医薬組成物に関する。さらに、本発明は、ＨＰＶ３１ＶＬＰと少なくとも１つの追加的ＨＰＶ型のＶＬＰとを含む医薬組成物に関する。好ましい実施形態においては、その少なくとも１つの追加的ＨＰＶ型は、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９およびＨＰＶ６８よりなる群から選ばれる。

本明細書中の全体において及び添付する特許請求の範囲において用いる単数表現は、文脈から例外であることが明らかである場合を除き、複数物に対する言及を含む。

本明細書中の全体において及び添付する特許請求の範囲においては、以下の定義および略語が適用される。

「プロモーター」なる語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合する、ＤＮＡ鎖上の認識部位を意味する。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼと共に開始複合体を形成して、転写活性を始動し駆動する。該複合体は、「エンハンサー」もしくは「上流活性化配列」と称される配列を活性化することにより又は「サイレンサー」と称される配列を抑制することにより修飾されうる。

「ベクター」なる語は、宿主生物または宿主組織内へのＤＮＡ断片の導入をもたらしうる何らかの手段を意味する。プラスミド、ウイルス（アデノウイルスを含む）、バクテリオファージおよびコスミドを含む種々のタイプのベクターが存在する。

「３１Ｌ１野生型配列」なる表現は、本明細書中に配列番号１として開示されているＨＰＶ３１Ｌ１配列を意味する。ＨＰＶ３１Ｌ１野生型配列は既に記載されているが、臨床分離体から得たＤＮＡ間に若干の配列変異を見出すことは珍しいことではない。したがって、代表的なＨＰＶ３１Ｌ１野生型配列を、ＨＰＶ３１ＤＮＡを含有することが既に示されている臨床サンプルから単離した（実施例１を参照されたい）。本明細書中に開示されているコドン最適化ＨＰＶ３１Ｌ１配列を比較するための参照配列として該３１Ｌ１野生型配列を使用した（図１を参照されたい）。

「３１Ｌ１部分改変体」は、酵母内での最適化発現のために酵母にとって好ましいコドンを含有するようＨＰＶ３１Ｌ１ヌクレオチド配列が部分的に改変された、本明細書中に開示されている構築物（配列番号２）を意味する。３１Ｌ１部分改変体は、ＨＰＶ３１Ｌ１野生型ヌクレオチド配列の中央部分（ヌクレオチド６９７−１２４９）における改変を含む。酵母にとって好ましいコドンを使用して、完全ＨＰＶ３１Ｌ１配列をも改変させ、それは本明細書中では「３１Ｌ１全改変体」（配列番号３）と称される。

「有効量」なる語は、免疫応答が生じるよう、適度なレベルの該ポリペプチドの産生に十分なワクチン組成物が導入されることを意味する。このレベルは様々なものとなりうると当業者に理解される。

「保存的アミノ酸置換」は、１つのアミノ酸残基が、化学的に類似した別のアミノ酸残基により置換されることを意味する。そのような保存的置換の例としては、疎水性残基同士（イソロイシン、ロイシン、バリンまたはメチオニン）の置換、同じ電荷の極性残基同士（例えば、アルギニンとリシン；グルタミン酸とアスパラギン酸）の置換が挙げられる。

「哺乳動物（哺乳類）」なる語は、ヒトを含む任意の哺乳動物を意味する。

「ＶＬＰ」はウイルス様粒子を意味する。

「合成」は、天然に存在する野生型ＨＰＶ３１Ｌ１遺伝子内に存在するヌクレオチド配列と同じではないヌクレオチド配列をＨＰＶ３１Ｌ１遺伝子が含有するよう、該遺伝子が修飾されていることを意味する。前記のとおり、本発明において、酵母により認識される転写終結シグナルを除去するよう改変されたヌクレオチドの配列を含む合成分子を提供する。また、本発明においては、酵母細胞による発現に好ましいコドンを含む合成分子も提供する。本発明で提供する合成分子は、野生型ＨＰＶ３１Ｌ１遺伝子と同じアミノ酸配列をコードしている。

発明の詳細な説明
ほとんどの子宮頸癌は、特定の発癌型のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の感染に関連している。本発明は、発癌性ＨＰＶ型の遺伝子により発現されるタンパク質産物に対する免疫を惹起または増強する組成物および方法に関する。特に、本発明は、ＨＰＶ３１Ｌ１およびＨＰＶ３１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）をコードする合成ポリヌクレオチドを提供し、ＨＰＶ関連癌の予防および／または治療用の免疫原性組成物およびワクチンにおける該ポリヌクレオチドおよびＶＬＰの使用を開示する。

野生型ＨＰＶ３１Ｌ１ヌクレオチド配列は既に報告されている（Ｇｏｌｄｓｂｏｒｏｕｇｈら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７１（１）：３０６−３１１（１９８９）；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｊ０４３５３）。本発明は、ＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質をコードする合成ＤＮＡ分子を提供する。本発明の合成分子はヌクレオチドの配列を含み、該ヌクレオチドのいくつかは、酵母により認識される転写終結シグナルを除去するよう改変されている。他の実施形態においては、該合成分子のコドンは、高レベル発現を行うのに酵母細胞にとって好ましいコドンを使用するよう設計される。該合成分子は、ＶＬＰへと自己集合するＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質の源として使用することが可能である。該ＶＬＰは、中和抗体および細胞性免疫によりパピローマウイルス感染に対する有効な免疫予防をもたらすために、ＶＬＰに基づくワクチンにおいて使用することが可能である。ＶＬＰに基づくそのようなワクチンは、既に確立したＨＰＶ感染の治療にも有用である。

酵母細胞におけるＨＰＶＶＬＰの発現は、費用効果的であり発酵槽内での大規模増殖に容易に適合するという利点をもたらす。しかし、ＨＰＶ３１Ｌ１を含む多数のＨＰＶＬ１タンパク質は（実施例４を参照されたい）、酵母細胞内では低レベルでしか発現されない。ＨＰＶ３１Ｌ１の低レベル発現は、酵母により認識される転写終結シグナルの存在により生じる、ｍＲＮＡ転写産物のトランケート化によるものであることが、本発明において確認された。酵母転写終結部位に類似した潜在的配列を除去するようＨＰＶ３１Ｌ１ＤＮＡを改変することにより、完全長ｍＲＮＡの転写を促進して、ＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質発現の増強をもたらすことが可能である。

したがって、本発明のいくつかの実施形態においては、酵母転写終結シグナルに類似した潜在的配列を除去するようＨＰＶ３１Ｌ１ＤＮＡに改変が施されている。これらの改変は、トランケート化転写産物ではなく完全長ＨＰＶ３１転写産物の発現を可能にして（実施例４を参照されたい）、発現収率を増強させる。

前記のとおり、本発明の合成ＤＮＡは、酵母により認識される転写終結部位を除去するように施された、野生型ＨＰＶ３１Ｌ１配列からの改変を含む。ＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質をコードするが酵母転写終結部位を含有しない追加的なＤＮＡ分子を構築することが可能であると当業者は認識するであろう。酵母転写終結配列を見出すための技術は当技術分野でよく知られている。酵母ｍＲＮＡの３’末端形成および転写終結は以下の３つのシグナルの存在を要する：（１）下流に位置する要素の配置の効率を増加させる、ＴＡＴＡＴＡまたは関連配列のような効率要素（ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｅｌｅｍｅｎｔ）、（２）ポリ（Ａ）部位の位置を決定する配置要素（ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇｅｌｅｍｅｎｔ）、および（３）ポリアデニル化部位（通常はＰｙ（Ａ）ｎ）。

科学文献には、酵母転写終結シグナルをコードする配列の記載が豊富に見出される。例えば、ＧｕｏおよびＳｈｅｒｍａｎ，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：４７７−４８１（１９８６）；ＧｕｏおよびＳｈｅｒｍａｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６（６）：２７７２−２７７６（１９９６）；Ｚａｒｅｔら，Ｃｅｌｌ２８：５６３−５７３（１９８２）；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら，Ｃｅｌｌ３３：６０７−６１４（１９８３）；Ｔｈａｌｅｎｆｅｌｄら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｒｎ．２５８（２３）：１４０６５−１４０６８（１９８３）；Ｚａｒｅｔら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７６：１０７−１３５（１９８４）；Ｈｅｉｄｍａｎｎら，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ１４：４６３３−４６４２（１９８４）；ならびにＲｕｓｓｏ，Ｙｅａｓｔ１１：４４７−４５３（１９８５）を参照されたい。したがって、本発明の完全長ｍＲＮＡ転写産物を産生する合成ＨＰＶ３１Ｌ１遺伝子を構築するためにはどの配列を避けるべきかを、当業者は何の困難もなく決定するであろう。また、該合成配列内に酵母転写終結配列が存在するかどうかを評価するためのアッセイおよび方法は当技術分野において十分に確立されており、したがって、当業者であれば、構築されたＨＰＶ３１ｌ１配列が、除去する必要のある終結配列を含むかどうかを判定しうるであろう。

前記のとおり、本発明は、酵母により認識される内部転写終結シグナルを含有しない、ＨＰＶ３１型Ｌ１タンパク質をコードする核酸分子に関する。本発明の典型的実施例においては、該合成核酸分子は、配列番号２または配列番号３に記載のヌクレオチドの配列を含む。

本発明の他の実施形態においては、酵母細胞環境中での高レベル発現に関してＨＰＶ３１Ｌ１遺伝子配列が「最適化」される。本発明により意図されるコドン最適化ＨＰＶ３１Ｌ１遺伝子は、酵母により認識される内部転写終結シグナルを含有しないＨＰＶ３１Ｌ１をコードする合成分子を含み、これは、酵母細胞内での高レベル発現に関してコドン最適化された少なくとも１つのコドンを更に含む。

４つの可能なヌクレオチド塩基の「トリプレット」コドンは、６０を超える変異形態で存在しうる。これらのコドンは僅か２０個の異なるアミノ酸（ならびに転写開始および終結）のメッセージを与えるに過ぎないため、いくつかのアミノ酸が２以上のコドンによりコードされうる（コドン縮重として公知の現象である）。完全には理解されていない理由により、異なる細胞型の内因性ＤＮＡ内には代替的コドンは一様には存在しない。実際、或る細胞型においては或るコドンに関する可変的天然階層または「優先性」が存在するようである。一例として、アミノ酸ロイシンは、ＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＣＴＴ、ＴＴＡおよびＴＴＧを含む６つのＤＮＡコドンのいずれかにより特定される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の内因性ＤＮＡは、最も一般的には、ロイシン特定コドンＣＴＧを含有し、一方、酵母および粘菌のＤＮＡは、最も一般的には、ロイシン特定コドンＴＴＡを含むことが、微生物についてのゲノムコドン出現頻度の詳細な分析から示されている。この階層を考慮すると、ロイシンに富むポリペプチドの高レベルの発現が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主により得られる可能性は、コドン使用頻度に或る程度は左右されると、一般に考えられる。例えば、ＴＴＡコドンに富む遺伝子は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内では発現されにくいと考えられ、一方、ＣＴＧに富む遺伝子は、おそらく、この宿主内で高度に発現されるであろう。同様に、ロイシンに富むポリペプチドの酵母宿主細胞内での発現に好ましいコドンはＴＴＡであろう。

組換えＤＮＡ技術へのコドン優先性現象の関与は明白であり、該現象は、成功裏に形質転換された宿主生物において外因性遺伝子の高い発現レベルがこれまで多くの場合に達成されていないことを説明するのに役立ちうる。すなわち、該挿入遺伝子内には、それほど「好まし」くないコドンが反復的に存在している可能性があり、発現用の宿主細胞装置が、それほど効率的には機能していない可能性があるのである。この現象は、意図される宿主細胞にとって好ましいコドンを含むように設計された合成遺伝子が、組換えＤＮＡ技術の実施のための好ましい形態の外来遺伝物質の最適形態を与えることを示唆している。したがって、本発明の１つの態様は、酵母細胞内での発現に関してコドン最適化されたＨＰＶ３１Ｌ１遺伝子である。本発明の好ましい実施形態において、同じタンパク質配列をコードする代替的コドンの使用は、酵母細胞によるＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質の発現に対する制約を除去しうることが判明した。

本発明においては、ＨＰＶ３１Ｌ１遺伝子セグメントを、同一の翻訳配列を有するが代替的コドン使用頻度を伴う配列に変換した（参照により本明細書に組み入れるＳｈａｒｐおよびＣｏｗｅ，ＳｙｎｏｎｙｍｏｕｓＣｏｄｏｎＵｓａｇｅｉｎＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｙｅａｓｔ７：６５７−６７８（１９９１）に記載されているとおり）。該方法は、一般には、高度に発現される酵母遺伝子に一般には関連していない野生型配列内のコドンを同定し、それらを、酵母細胞内での高発現のための最適コドンで置換することよりなる。ついでその新たな遺伝子配列を、これらのコドン置換により生じた望ましくない配列（例えば、「ＡＴＴＴＡ」配列、イントロンスプライス認識部位の非意図的生成、望ましくない制限酵素部位など）に関して調べる。望ましくない配列は、同一アミノ酸をコードする異なるコドンで既存コドンを置換することにより除去される。ついで該合成遺伝子セグメントを発現の改善に関して試験する。

前記の方法を用いてＨＰＶ３１Ｌ１の合成遺伝子セグメントを作製して、高レベル発現に関して最適化されたコドンを含む遺伝子を得た。前記方法は、ＨＰＶワクチンにおいて使用するコドン最適化遺伝子を設計するための本発明者らの方法の概要を説明するものであるが、該方法における若干の変更または該配列における若干の変更によっても、同様のワクチン効力または遺伝子発現の増強が達成されうると、当業者に理解される。

したがって、本発明は、ＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質またはＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質の生物学的に活性な断片もしくは突然変異体をコードするヌクレオチド配列を含む、酵母宿主内での発現に関して最適化されたコドンを含む合成ポリヌクレオチドに関する。ＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質の突然変異体は、保存的アミノ酸置換、アミノ末端トランケート化、カルボキシ末端トランケート化、欠失または付加を含むが、これらに限定されるものではない。任意のそのような生物学的に活性な断片および／または突然変異体は、配列番号４に記載のＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質の免疫学的特性を少なくとも実質的に模擬するタンパク質またはタンパク質断片をコードする。本発明の合成ポリヌクレオチドは、治療用または予防用ＨＰＶワクチンの開発において有用となるよう、機能的ＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質を発現するｍＲＮＡ分子をコードする。

本発明の１つの態様は、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含む、配列番号４に記載のＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸分子である。

本発明のもう１つの態様は、配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含む、配列番号４に記載のＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸分子である。

本発明はまた、本明細書中の全体に開示されている核酸分子を含有する組換えベクターおよび組換え宿主細胞（原核細胞および真核細胞の両方）に関する。

本明細書に記載の方法により構築した合成ＨＰＶ３１ＤＮＡまたはその断片を、適当なプロモーターと他の適当な転写調節要素とを含有する発現ベクター内への分子クローニングにより組換え的に発現させ、原核または真核宿主細胞内に導入して、組換えＨＰＶ３１Ｌ１を得ることが可能である。そのような操作のための技術は当技術分野において記載されている（ＳａｍｂｒｏｏｋらＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ；ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，（１９８９）；ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら，ＧｒｅｅｎＰｕｂ．ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓａｎｄＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８８）；ＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＣｏｕｒｓｅＭａｎｕａｌ，Ｒｏｓｅら，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，（１９９０）（それらの全体を参照により本明細書に組み入れることとする））。

したがって、本発明は更に、（ａ）ＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質をコードする核酸（該核酸分子は、酵母宿主細胞での最適化発現に関してコドン最適化されている）を含むベクターを酵母宿主細胞内に導入し、（ｂ）ＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質の発現を可能にする条件下、該酵母宿主細胞を培養することを含む、組換え宿主細胞内でＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質を発現させるための方法に関する。

したがって、本発明は更に、（ａ）ＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質をコードする核酸（該核酸分子は、酵母により認識される内部転写終結シグナルを含有しない）を含むベクターを酵母宿主細胞内に導入し、（ｂ）ＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質の発現を可能にする条件下、該酵母宿主細胞を培養することを含む、組換え宿主細胞内でＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質を発現させるための方法に関する。

本発明は更に、（ａ）配列番号２または配列番号３に記載の核酸を含むベクターを酵母宿主細胞内に導入し、（ｂ）ＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質の発現を可能にする条件下、該酵母宿主細胞を培養することを含む、組換え宿主細胞内でＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質を発現させるための方法に関する。

本発明の合成遺伝子は、宿主細胞内でのＨＰＶ５８Ｌ１タンパク質の効率的発現をもたらすように設計された配列を含む発現カセットに集合させることが可能である。該カセットは、好ましくは、合成遺伝子を、それに機能しうる形で連結された関連転写および翻訳制御配列（例えば、プロモーターおよび終結配列）と共に含有する。好ましい実施形態においては、プロモーターはエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＡＬ１プロモーターであるが、多数の他の公知酵母プロモーター、例えばＧＡＬ１０、ＧＡＬ７、ＡＤＨ１、ＴＤＨ３もしくはＰＧＫプロモーターまたは他の真核生物遺伝子プロモーターのいずれかを使用しうると当業者は認識するであろう。好ましい転写ターミネーターはエス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＤＨ１ターミネーターであるが、他の公知転写ターミネーターも使用することが可能である。ＧＡＬ１プロモーター−ＡＤＨ１ターミネーターの組合せが特に好ましい。

本発明のもう１つの態様はＨＰＶ３１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ＨＰＶ３１ＶＬＰの製造方法、およびＨＰＶ３１ＶＬＰの使用方法である。ヒトおよび動物パピローマウイルスの主要カプシドタンパク質であるＬ１が酵母、昆虫細胞、哺乳類細胞または細菌内で発現される場合には、ＶＬＰは自己集合しうる（概説としては、ＳｃｈｉｌｌｅｒおよびＲｏｄｅｎ，ｉｎＰａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓＲｅｖｉｅｗｓ：ＣｕｒｒｅｎｔＲｅｓｅａｒｃｈｏｎＰａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ；Ｌａｃｅｙ編，Ｌｅｅｄｓ，ＵＫ：ＬｅｅｄｓＭｅｄｉｃａｌＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｐｐ１０１−１２（１９９６））。Ｌ１およびＬ２カプシドタンパク質の組合せを発現させることにより、形態学的に異なるＨＰＶＶＬＰも製造されうる。ＶＬＰは、Ｔ＝７二十面体構造のＬ１の７２個の五量体から構成される（Ｂａｋｅｒら，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６０（６）：１４４５−５６（１９９１））。

ＶＬＰは真正ビリオンと形態学的に類似しており、動物に投与されると高力価の中和抗体を誘導しうる。ＶＬＰでのウサギ（Ｂｒｅｉｔｂｕｒｄら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９（６）：３９５９−６３（１９９５））およびイヌ（Ｓｕｚｉｃｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２（２５）：１１５５３−５７（１９９５））の免疫は中和抗体の誘導および実験パピローマウイルス感染に対する防御の両方をもたらすことが示された。しかし、ＶＬＰは、潜在的に発癌性のウイルスゲノムを含有せず、単一遺伝子から自己集合しうるため、それは、ＨＰＶワクチン開発における生ウイルスの使用に代わる安全な手段となる（概説としては、ＳｃｈｉｌｌｅｒおよびＨｉｄｅｓｈｅｉｍ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｖｉｒｏｌ．１９：６７−７４（２０００）を参照されたい）。

したがって、本発明は、ＨＰＶ３１の組換えＬ１タンパク質または組換えＬ１＋Ｌ２タンパク質から構成されるウイルス様粒子に関する。

本発明の好ましい実施形態においては、ＨＰＶ３１ＶＬＰは酵母において産生される。もう１つの好ましい実施形態においては、酵母は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）、クリーベルミセス・フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｍｙｃｅｓｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ）およびシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）よりなる群から選ばれる。

本発明の更にもう１つの態様は、（ａ）ＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質またはＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質またはＨＰＶ３１Ｌ１＋Ｌ２タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子で酵母を形質転換し、（ｂ）該組換えＤＮＡ分子の発現を可能にする条件下、該形質転換酵母を培養して組換えＨＰＶ３１タンパク質を得、（ｃ）該組換えＨＰＶ３１タンパク質を単離してＨＰＶ３１ＶＬＰを得ることを含む、ＨＰＶ３１ＶＬＰの製造方法である。

本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、酵母により認識される転写終結シグナルを含有しないＨＰＶ３１Ｌ１遺伝子で酵母を形質転換する。もう１つの好ましい実施形態においては、ＨＰＶ３１ＶＬＰを得るために、コドン最適化ＨＰＶ３１Ｌ１遺伝子で酵母を形質転換する。特に好ましい実施形態においては、コドン最適化ＨＰＶ３１Ｌ１遺伝子は、配列番号２または配列番号３に記載のヌクレオチド配列より実質的になる。

本発明はまた、ＨＰＶ３１ウイルス様粒子を動物に投与することを含んでなる、動物において免疫応答を誘導するための方法を提供する。好ましい実施形態においては、ＨＰＶ３１ＶＬＰは、酵母により認識される内部転写終結配列を含有しない遺伝子により製造される。もう１つの好ましい実施形態においては、ＨＰＶ３１ＶＬＰはコドン最適化遺伝子により製造される。

本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、該ワクチンは更に、ＨＰＶ１６ＶＬＰを含む。

本発明のもう１つの好ましい実施形態においては、該ワクチンは更に、ＨＰＶ１６ＶＬＰおよびＨＰＶ１８ＶＬＰを含む。

本発明の更にもう１つの好ましい実施形態においては、該ワクチンは更に、ＨＰＶ６ＶＬＰ、ＨＰＶ１１ＶＬＰ、ＨＰＶ１６ＶＬＰおよびＨＰＶ１８ＶＬＰを含む。

本発明のワクチン組成物は、潜在的毒性を最小限にする一方でＨＰＶ３１感染の最適な抑制を得るために通常の試験により定められる適当な量で単独で使用することが可能である。また、他の物質の共投与または連続的投与が望ましいかもしれない。

ワクチン被投与者に導入すべきウイルス様粒子の量は、発現される遺伝子産物の免疫原性に左右される。一般に、ＶＬＰ１０μｇ〜１００μｇ、好ましくは約２０μｇ〜６０μｇの免疫学的または予防的に有効な量を筋肉組織内に直接投与する。皮下注射、皮内導入、皮膚を介した圧入（ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）、および他の投与方法、たとえば、腹腔内、静脈内または吸入運搬も意図される。また、ブースターワクチン接種を行いうると意図される。本発明のワクチンの非経口導入と同時またはその後の、ミョウバンまたはメルク（Ｍｅｒｃｋ）ミョウバンアジュバントのようなアジュバントの非経口投与、例えば静脈内、筋肉内、皮下または他の手段での投与も有利である。

本発明に関連して用いられうる方法および材料を記載し開示する目的で、本明細書に記載のすべての刊行物を、参照により本明細書に組み入れることとする。ここで、本発明が先行発明としてそのような開示に先行するものではないと自認するものと解釈されるべきではない。

添付図面を参照して本発明の好ましい実施形態が記載されているが、本発明はそれらの実施形態そのものに限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲において定められる本発明の範囲または精神から逸脱することなく本発明には種々の変更および修飾が当業者によって施されうると理解されるべきである。

以下の実施例は本発明を例示するものであり、本発明を限定するものではない。

代表的ＨＰＶ３１Ｌ１配列の決定
ＨＰＶ３１Ｌ１野生型配列は既に記載されている（Ｇｏｌｄｓｂｏｒｏｕｇｈら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７１（１）：３０６−３１１（１９８９）；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｊ０４３５３）。しかし、臨床分離体から得たＤＮＡ間に若干の配列変異を見出すことは珍しいことではない。代表的なＨＰＶ３１Ｌ１野生型配列を単離するために、ＨＰＶ３１ＤＮＡを含有することが既に示されている３つの臨床サンプルからＤＮＡを単離した。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよび以下のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において、ＨＰＶ３１Ｌ１配列を増幅した：

増幅産物をアガロースゲル上で電気泳動し、臭化エチジウム染色により可視化した。〜１５００ｂｐのＬ１バンドを切り出し、ＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＤＮＡを精製した。ついで該ＤＮＡをＴＡクローニングベクターｐＣＲ−ＩＩ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に連結し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換し、アンピシリン＋ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌ（青／白コロニー選択用）を含有するＬＢ寒天上でプレーティングした。該プレートを反転させ、３７℃で１６時間インキュベートした。白色コロニーを、アンピシリンを含有するＬＢ培地内で３７℃で１６時間、振とうしながら培養し、ミニプレップを行って該プラスミドＤＮＡを抽出した。

該プラスミド中のＬ１遺伝子の存在を示すために、制限エンドヌクレアーゼ消化を行い、アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウム染色により可視化した。それらの３つの臨床分離体のそれぞれからのクローン化Ｌ１を含有するプラスミドに関してＤＮＡ配列決定を行った。ＤＮＡおよび翻訳アミノ酸配列をお互いと及びＧｅｎｂａｎｋＨＰＶ３１Ｌ１配列と比較した。それらの３つの臨床分離体の配列分析は、どの配列も該Ｇｅｎｂａｎｋ配列と同一ではないことを示した。代表的な３１Ｌ１配列としてｐＣＲ−ＩＩ−ＨＰＶ３１Ｌ１／８１クローンを選択した。これは本明細書中では「３１Ｌ１野生型配列」（配列番号１；図１を参照されたい）と称される。３１Ｌ１野生型として選択した配列はヌクレオチド１２６６の１つのサイレント置換、およびコード化アミノ酸をトレオニンからセリンに変化させるヌクレオチド１２９５のＣからＧへの変化を含有していた。３１Ｌ１部分および全改変体遺伝子（それぞれ配列番号２および３）も、この位置にセリンをコードしている（図１を参照されたい）。すべての場合において、アミノ酸配列は同一である。改変体構築物においては、酵母にとって好ましいコドン配列を使用してアミノ酸をコードし、潜在的転写終結シグナルを除去するよう、ヌクレオチドが変化している（実施例２を参照されたい）。

ＢｇｌＩＩ伸長を付加するために以下のプライマーを使用して、３１Ｌ１野生型配列を増幅した。

ＰＣＲは、、Ｖｅｎｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼを使用して行った。アガロースゲルの臭化エチジウム染色により、ＰＣＲ産物を可視化した。〜１５００ｂｐのバンドを切り出し、ＱＩＡＥＸＩＩゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡを精製した。ついでＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩで３７℃で２時間消化し、ＱＩＡクイックＰＣＲ精製キットを使用して精製した。ＢｇｌＩＩで消化された３１Ｌ１ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩで消化されたｐＧＡＬ１１０に連結し、ＤＨ５大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換した。正しい配向のＨＰＶ３１Ｌ１インサートに関して、ＰＣＲによりコロニーをスクリーニングした。ＤＮＡ配列決定により、配列および配向を確認した。選択したクローンをｐＧＡＬ１１０−ＨＰＶ３１Ｌ１＃２と命名した。

ついでマキシプレップ（Ｍａｘｉｐｒｅｐ）ＤＮＡを調製し、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）をコンピテントにし形質転換した。該酵母形質転換体をＬｅｕ⁻ ソルビトールプレート上のＬｅｕ⁻ ソルビトール上層寒天内でプレーティングし、反転させて３０℃で３〜５日間インキュベートした。コロニーを拾い、Ｌｅｕ⁻ ソルビトールプレート上での単離のためにストリークした。ついで、Ｌ１転写およびタンパク質発現を誘導するために、単離されたコロニーを、３０℃の回転チューブ培養において、１．６％グルコースおよび４％ガラクトースを含有する５ｍｌの５×Ｌｅｕ⁻Ａｄｅ⁻ソルビトール内で成長させた。

酵母コドン最適化
酵母にとって好ましいコドンは既に記載されている（ＳｈａｒｐおよびＣｏｗｅ，Ｙｅａｓｔ７：６５７−６７８（１９９１））。まず、ヌクレオチド６９７−１２４９に相当するＨＰＶ３１Ｌ１の中央部を、酵母にとって好ましいコドンを使用して改変した。改変に用いた方法は、同じアミノ酸配列を維持しながら酵母にとって好ましいコドン配列でヌクレオチドを置換する、改変すべき領域に及ぶ長い重複するセンスおよびアンチセンスオリゴマーを設計するものであった。該ＰＣＲ反応においては鋳型ＤＮＡの代わりにこれらのオリゴマーを使用した。追加的な増幅プライマーを設計し、それらを使用して、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）により鋳型オリゴマーから改変体配列を増幅した。増幅のための最適条件は部位特異的なものであったが、ほとんどの場合には、以下に類似した方法を用いた：９４℃で１時間の初期変性工程およびそれに続く、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３．５分間の伸長の１５〜２５サイクル、およびそれに続く７２℃で１０分間の最終伸長、および４℃での維持。

ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により検査した。適当なサイズのバンドを切り出し、ＤＮＡをゲル精製した。ついで該増幅断片を鋳型として使用して５５２ヌクレオチドの改変体ＨＰＶ３１中央部Ｌ１断片を作製した。ついでＰＣＲを使用して野生型ヌクレオチド１−７２５（５’末端）および１２２１−１５１５（３’末端）を増幅した。該５’末端、該３’末端および該改変体中央部を使用する最終ＰＣＲを行って、本明細書中では「３１Ｌ１部分改変体」と称される完全長３１Ｌ１部分改変体を作製した。

また、酵母にとって好ましいコドンを使用して、完全な３１Ｌ１配列も改変した。この構築物は本明細書中で「３１Ｌ１全改変体」と称される。９個の長い重複するオリゴマーを使用して、１−７５３の、酵母にとって好ましいコドンのヌクレオチド配列を作製し、４個の長い重複するオリゴマーを使用して、１２０７−１５１５の、酵母にとって好ましいコドンのヌクレオチド配列を作製した。増幅およびゲル精製の後、これらの断片を、前記の中央部改変体部分（ヌクレオチド６９７−１２４９）と共にＰＣＲ反応において使用して、完全長３１Ｌ１全改変体配列を作製した。この断片は、ＢａｍＨＩ伸長を伴って作製された。ゲル精製改変体３１Ｌ１ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、ＢａｍＨＩで消化されたｐＧＡＬ１１０発現ベクターに連結し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５細胞内に形質転換した。正しい配向のＨＰＶ３１Ｌ１インサートに関して、ＰＣＲによりコロニーをスクリーニングした。ＤＮＡ配列決定により、配列および配向を確認した。

プラスミドＤＮＡを調製した。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）をコンピテントにし、形質転換した。該酵母をＬｅｕ⁻ ソルビトールプレート上のＬｅｕ⁻ ソルビトール上層寒天内でプレーティングし、反転させて３〜５日間インキュベートした。コロニーを、Ｌｅｕ⁻ ソルビトールプレート上での単離のためにストリークした。ついで、Ｌ１転写およびタンパク質発現を誘導するために、単離されたコロニーを、３０℃の回転チューブ培養において、１．６％グルコースおよび４％ガラクトースを含有する５ｍｌの５×Ｌｅｕ⁻Ａｄｅ⁻ソルビトール内で成長させた。４８〜７２時間後、ＯＤ６００＝１０と等価な培養容量をペレット化し、上清を除去し、該ペレットを凍結し、−７０℃で保存した。

ＲＮＡ調製
ガラクトース誘導によりＨＰＶ３１Ｌ１を発現するよう誘導された、形質転換酵母の細胞ペレットを氷上で解凍し、１ｍｌの冷ＤＥＰＣ処理水に懸濁させた。細胞を遠心分離によりペレット化し、得られた上清を除去した。ついで細胞ペレットを４００μｌのＴＥＳ（１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．０，１０ｍＭＥＤＴＡおよび０．５％ＳＤＳ）に再懸濁させた。等容量のＡＥバッファー飽和フェノール（５０ｍＭＮａＯＡｃおよび１０ｍＭＥＤＴＡ）を加えた。該チューブを１０秒間ボルテックスし、１０分ごとに混合しながら６５℃で５０分間加熱した。ついで該チューブを氷上で５分間配置し、ついで４℃で５分間遠心分離した。上清を集め、無菌チューブに移した。追加的な４００μｌのフェノールを加え、該チューブをボルテックスし、氷上に５分間配置し、遠心分離した。上清を無菌チューブに移し、４００μｌのクロロホルムを加え、混合し、遠心分離した。上清を再び集め、無菌チューブに移し、１ｍｌの１００％ＥｔＯＨのほかに４０μｌの３Ｍ酢酸Ｎａ（ｐＨ５．２）を加えた。該チューブをドライアイス上に１時間配置し、ついでそれを高速で遠心分離してＲＮＡをペレット化した。該ＲＮＡを７０％ＥｔＯＨで１回洗浄し、風乾させた。ついで該ＲＮＡを１００μｌのＤＥＰＣ処理水に懸濁させ、６５℃に５分間加熱して溶解した。Ａ２６０／２８０が１．７〜２．０である場合にＡ２６０測定値１＝４０μｇ／ｍｌＲＮＡという仮定により、サンプル中のＲＮＡの濃度を測定するために分光光度測定を行った。

ノーザンブロット分析
３１Ｌ１野生型を発現する酵母の初期分析は、ＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質の発現収率が予想より相当低いことを示唆した。該低発現が、転写レベルの問題により生じたのか翻訳レベルの問題により生じたのかを判定するために、ＨＰＶ３１Ｌ１転写産物のノーザンブロット分析を行った。転写サイズを比較するために、同一ゲル上で、ＨＰＶ１６Ｌ１を発現する酵母からのＲＮＡが、ＨＰＶ３１Ｌ１を発現する酵母からのＲＮＡと共に移動したゲルから、ノーザンブロットを作製した。

１．２％アガロースホルムアルデヒドゲルを成型した。１０μｇのＲＮＡを変性バッファー（最終濃度：６％ホルムアルデヒド、４５％ホルムアミドおよび０．９×ＭＯＰＳ）と一緒にし、５５℃で１５分間加熱した。ゲルローディングバッファーの１０分の１の容量を加え、該サンプルを該ゲル上にローディングした。１×ＭＯＰＳバッファー中、６５ボルトで〜５時間、電気泳動を行った。該ゲルを無菌水中で１５分間ついで１０×ＳＳＣ中で２回（各５分間）洗浄した。該ＲＮＡを、１０×ＳＳＣ中、１６時間にわたり、毛管作用により、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロン膜（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）にトランスファーした。ついで該ＲＮＡを、７００単位のエネルギーに設定されたＡｍｅｒｓｈａｍ架橋剤を使用する架橋によりナイロン膜に固定した。固定後、該ナイロン膜を風乾させた。該膜を、３０ｍｌのＺｅｔａｐｒｏｂｅバッファー中、５５℃で２時間配置し、ついで３２Ｐ標識プローブを加え、５３〜６５℃で１６時間インキュベートした。ついで該膜を、５×ＳＳＣ中、室温で２０分間で３回、ついで０．４×ＳＳＣ中、室温で２０分間で２回、および６０℃で１０分間で１回洗浄した。ＨＰＶ３１Ｌ１配列に特異的なセンスおよびアンチセンスプライマーを使用するＰＣＲにより、プローブＤＮＡを作製した。ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）およびγ―３２ＡＴＰでの３７℃で１時間の処理により、該増幅ＤＮＡを標識した。該ブロットをサランラップで包み、ｘ線フィルムに１６時間露出させた。フィルムの現像後、プローブにハイブリダイズしたＲＮＡはオートラジオグラフ上で黒色バンドとして検出された。

前記のノーザンブロットの分析は、完全長ＨＰＶ３１Ｌ１野生型転写産物の大部分が完全長より相当に小さいことを示した（図４を参照されたい）。しかし、３１Ｌ１部分改変体の設計においては、酵母にとって好ましいコドンが該遺伝子の中央部に挿入されているのみならず、酵母転写終結部位に類似した潜在的配列が除去されている。ノーザンブロット分析は、改変後、３１Ｌ１遺伝子転写産物の長さが、完全長ＨＰＶ１６Ｌ１転写産物に対応するサイズまで有意に増加していたことを、明らかに示した（非表示）。したがって、未熟な転写終結が、３１Ｌ１野生型構築物からの低い発現収率のかなりの部分の原因になっていたらしい。

ＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質発現
ＯＤ６００＝１０と等価な、ガラクトースにより誘導された培養物の凍結酵母細胞ペレットを、氷上で解凍し、２ｍＭＰＭＳＦを含有する３００μｌのＰＣバッファー（１００ｍＭＮａ２ＨＰＯ４および０．５ＭＮａＣｌ，ｐＨ７．０）に懸濁させた。酸で洗浄した０．５ｍｍガラスビーズを加えた（〜０．５ｇ／チューブ）。該チューブを４℃で１５分間ボルテックスした。７．５μｌの２０％ＴｒｉｔｏｎＸ１００を加え、ボルテックスを４℃で５分間反復した。該チューブを氷上に１５分間配置し、ついで４℃で１５分間遠心分離した。上清を無菌微小遠心管に移し、−７０℃で保存した。

ウエスタンブロット分析
ガラクトース誘導後のＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質の発現を確認するために、各ＨＰＶ３１Ｌ１構築物についての２０〜４０個の単離された酵母コロニーからの全酵母タンパク質抽出物をウエスタンブロットにより分析した。

１０μｇの全酵母タンパク質抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファーと一緒にし、９５℃で１０分間加熱した。該タンパク質を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にローディングし、Ｔｒｉｓ−グリシンバッファー中で電気泳動した。タンパク質の分離後、該タンパク質を該ゲルからニトロセルロースにウエスタントランスファーし、該ブロットをＴＴＢＳ（Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＴｒｉｓ緩衝食塩水）中の１０％脱脂乾燥乳中で１６時間ブロッキングした。該ブロットをＴＴＢＳ中で３回洗浄した。ＨＰＶ３１Ｌ１と交差反応するポリクローナル血清であるヤギ抗ｔｒｐＥ−ＨＰＶ１６Ｌ１血清をＴＴＢＳ中の１：１０００の希釈度で室温で１時間適用した。該ブロットをＴＴＢＳ中で３回洗浄し、抗ヤギＨＲＰ結合抗体をＴＴＢＳ中の１：２５００の希釈度で１時間適用した。該ブロットを再び３回洗浄し、ＥＣＬ（商標）検出試薬を適用した（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）。ついでオートラジオグラフィーを行った。該抗血清により認識されたタンパク質は、オートラジオグラフ上で暗色バンドとして検出試薬により可視化された。

すべての場合において、ＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質は、オートラジオグラフ上で、約５５ｋＤに対応する別個のバンドとして検出された（データ非表示）。ゲル上で陽性対照として、ＨＰＶ１６Ｌ１タンパク質を含めた。

ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）
ＨＰＶ３１Ｌ１を発現する酵母細胞を種々の方法（回転チューブ培養、振とうフラスコおよび発酵槽など）により増殖させた。該酵母を細胞溶解し、タンパク質抽出物を調製して、全タンパク質１ｍｇ当たりで産生されたＨＰＶ３１Ｌ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の量を測定した。ＨＰＶ３１Ｌ１ＶＬＰ発現を示すために、各全酵母タンパク質抽出物の一部を捕捉ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により分析した。

ＨＰＶ型３１特異的でありＶＬＰコンホメーション特異的である検出用モノクローナル抗体Ｈ３１．Ａ６を使用して、ＲＩＡを行った。Ｈ３１．Ａ６は無傷ＨＰＶ３１Ｌ１ＶＬＰには結合することが判明しているが、変性したＨＰＶ３１ＶＬＰを認識しないため、Ｈ３１．Ａ６はＨＰＶ型３１Ｌ１に特異的である。ついで、このｍＡｂは、Ｉ１２５で放射能標識されたヤギ抗マウス抗体により検出されうる。したがって、毎分カウント（ｃｐｍ）値はＨＰＶ３１Ｌ１ＶＬＰ発現の相対レベルに対応する。

ポリスチレンビーズを、ＰＢＳ中で１：１０００で希釈されたヤギ抗ｔｒｐＥ−ＨＰＶ３１Ｌ１ポリクローナル血清で一晩コートした。ついで該ビーズを５容量の無菌蒸留水で洗浄し、風乾させた。ついで、単離された酵母コロニーからの全酵母タンパク質抽出物である抗原を、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｎｎ−２０および０．１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ中の希釈により該ビーズ上にローディングし、回転させながら１時間インキュベートした。洗浄後、該ビーズを２０ウェルポリスチレンプレートにおいて１個／ウェルで分配し、１：５０，０００で希釈されたＨ３１．Ａ６ｍＡｂと共に室温で１７〜２４時間インキュベートした。該ビーズを洗浄し、Ｉ１２５標識ヤギ抗マウスＩｇＧを２３０００〜２７０００ｃｐｍ／１０μｌの活性範囲で加えた。２時間後、該ビーズを洗浄し、放射能カウントをｃｐｍ／ｍｌ単位で記録した。ブランクウェルからのバックグラウンドカウントを全ｃｐｍ／ｍｌから差し引いて、ＲＩＡ−バックグラウンド値を得た。

２つの実験を行った。実験１においては、３１Ｌ１野生型および３１Ｌ１部分改変体からのタンパク質抽出物を比較し、実験２においては、３１Ｌ１部分改変体および３１Ｌ１全改変体からのタンパク質抽出物を比較した（図５を参照されたい）。結果は、３１Ｌ１部分改変体ＶＬＰの発現が３１Ｌ１野生型より６．９倍高いことを示している。３１Ｌ１全改変体は、３１Ｌ１部分改変体と比べて１．７倍増加した発現を示している。したがって、酵母にとって好ましいコドン配列を導入し潜在的転写終結シグナルを除去することにより、３１Ｌ１の発現レベルは＞７倍増加した。

透過型電子顕微鏡検査
ＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質が実際に自己集合して五量体Ｌ１カプソマー（これは今度は、ウイルス様粒子に自己集合する）を形成したことを示すために、部分的に精製された３１Ｌ１全改変体タンパク質抽出物を透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）に付した。酵母を小規模発酵で増殖させ、ペレット化した。該ペレットを精製処理に付した。Ｌ１タンパク質の発現および精製操作における保持を示すために、ペレットおよび清澄化酵母抽出物を免疫ブロットにより分析した。ついで清澄化酵母抽出物を４５％スクロースクッション上の遠心分離に付し、得られたペレットをＴＥＭ分析のためにバッファーに懸濁させた（図６を参照されたい）。この粗サンプル中の球状粒子の直径は３０〜６０ｎｍであり、いくつかの粒子はカプソマーの規則的配置を示していることを、結果は示している。

部分改変体（配列番号２）および全改変体（配列番号３）３１Ｌ１遺伝子における改変ヌクレオチドを示す配列アライメントである（実施例２を参照されたい）。参照配列は３１Ｌ１野生型配列（配列番号１；実施例１を参照されたい）である。参照配列と同一である３１Ｌ１部分および全改変体配列におけるヌクレオチドは点で示されている。改変されたヌクレオチドは、それらの対応位置に示されている。括弧内にはヌクレオチド番号が示されている。部分改変体（配列番号２）および全改変体（配列番号３）３１Ｌ１遺伝子における改変ヌクレオチドを示す配列アライメントである（実施例２を参照されたい）。参照配列は３１Ｌ１野生型配列（配列番号１；実施例１を参照されたい）である。参照配列と同一である３１Ｌ１部分および全改変体配列におけるヌクレオチドは点で示されている。改変されたヌクレオチドは、それらの対応位置に示されている。括弧内にはヌクレオチド番号が示されている。部分改変体（配列番号２）および全改変体（配列番号３）３１Ｌ１遺伝子における改変ヌクレオチドを示す配列アライメントである（実施例２を参照されたい）。参照配列は３１Ｌ１野生型配列（配列番号１；実施例１を参照されたい）である。参照配列と同一である３１Ｌ１部分および全改変体配列におけるヌクレオチドは点で示されている。改変されたヌクレオチドは、それらの対応位置に示されている。括弧内にはヌクレオチド番号が示されている。部分改変体（配列番号２）および全改変体（配列番号３）３１Ｌ１遺伝子における改変ヌクレオチドを示す配列アライメントである（実施例２を参照されたい）。参照配列は３１Ｌ１野生型配列（配列番号１；実施例１を参照されたい）である。参照配列と同一である３１Ｌ１部分および全改変体配列におけるヌクレオチドは点で示されている。改変されたヌクレオチドは、それらの対応位置に示されている。括弧内にはヌクレオチド番号が示されている。３１Ｌ１全改変ヌクレオチド（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示す。左側にヌクレオチド番号が示されている。３１Ｌ１全改変ヌクレオチド（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示す。左側にヌクレオチド番号が示されている。３１Ｌ１全改変ヌクレオチド（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示す。左側にヌクレオチド番号が示されている。左側に挙げられている３つのＨＰＶ３１Ｌ１配列構築物間の変化を要約する。第４列は、示されている構築物と３１Ｌ１野生型配列との間のヌクレオチド同一性（％）を示し、第５列はアミノ酸同一性を示す。最終列は、酵母に好ましいコドン配列へ改変されたヌクレオチドの数、および改変が施された領域を示す。高いストリンジェンシー下でＨＰＶ３１Ｌ１に特異的にプローブされたノーザンブロットを示す（実施例４を参照されたい）。左側の矢印は、ＨＰＶ３１Ｌ１完全長およびトランケート化転写産物の位置を示す。「３１ｗｔ」と示されたレーンは、３１Ｌ１野生型配列を含有する酵母の同じＲＮＡ調製物からのものである。「１６」と示されたレーンは、高いストリンジェンシー条件のためにＨＰＶ３１Ｌ１プローブによっては認識されない、ＨＰＶ１６からのＲＮＡを含有する。「Ｎｅｇ」と示されたレーンは、Ｌ１コード配列を含有しない酵母抽出物である。「３１Ｒ」と示されたレーンは、３１Ｌ１部分改変体配列を発現する２つの別々の単離コロニーのＲＮＡからのものである。毎分カウント（ｃｐｍ）／ｍｇ全タンパク質で表された、２つの捕捉ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）実験からのデータの一部を示す（実施例７を参照されたい）。該ＲＩＡで得たｃｐｍはＨＰＶ３１Ｌ１ＶＬＰの相対指標である。該ＲＩＡデータは、酵母にとって好ましいコドン改変体遺伝子配列からの酵母タンパク質抽出物における３１Ｌ１ＶＬＰ発現の増強を示している。透過型電子顕微鏡検査により可視化された、本明細書に記載の３１Ｌ１ＶＬＰの代表的サンプルを示す（実施例８を参照されたい）。棒線は１００ｎｍを表す。

Claims

ＨＰＶ３１Ｌ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸分子であって、該ヌクレオチド配列は配列番号２又は３で表されるヌクレオチド配列である核酸分子。
請求項１記載の核酸分子を含んでなるベクター。
請求項２記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
宿主細胞が、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）、クリーベルミセス・フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｍｙｃｅｓｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ）およびシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）よりなる群から選ばれる、請求項３記載の宿主細胞。
宿主細胞がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項４記載の宿主細胞。
ＨＰＶ３１の組換えＬ１タンパク質を含むＨＰＶ３１のウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、該Ｌ１タンパク質は請求項１に記載の核酸分子によってコードされるものであるウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
（ａ）請求項１に記載の核酸分子で酵母細胞を形質転換し、
（ｂ）該核酸分子の発現を可能にする条件下、該形質転換酵母細胞を培養して組換えパピローマウイルスタンパク質を得、
（ｃ）該組換えパピローマウイルスタンパク質を単離してＨＰＶ３１のＶＬＰを得ることを含んでなる、ＨＰＶ３１のＶＬＰの製造方法。
酵母細胞が、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）、クリーベルミセス・フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｍｙｃｅｓｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ）およびシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）よりなる群から選ばれる、請求項７記載の方法。
酵母細胞がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項８に記載の方法。