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CN112280793B - 人乳头瘤病毒基因,及载体,菌株,表达方法 - Google Patents

人乳头瘤病毒基因,及载体,菌株,表达方法 Download PDF

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CN112280793B CN202011023673.0A CN202011023673A CN112280793B CN 112280793 B CN112280793 B CN 112280793B CN 202011023673 A CN202011023673 A CN 202011023673A CN 112280793 B CN112280793 B CN 112280793B
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刘瑞峰
许丹
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Shanghai Zerun Biotech Co Ltd
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Shanghai Zerun Biotech Co Ltd
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Abstract

本发明涉及经毕赤酵母表达密码子优化的52,31和45型人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1的基因,含有这些基因的载体、菌株,其制备方法,以及表达方法。

Description

人乳头瘤病毒基因,及载体,菌株,表达方法
本申请是申请日为2013年9月29日,中国国家申请号为201310454513.5,发明名称为“人乳头瘤病毒基因,及载体,菌株,表达方法”的发明申请的分案申请。
技术领域
本领域涉及分子生物学领域,具体而言,本发明涉及经密码子优化而适于在毕赤酵母中表达的HPV52,HPV31,HPV45型人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1的基因,以及含有该基因的载体、菌株及表达该基因的方法。
背景技术
宫颈癌是仅次于乳腺癌的第二大妇科恶性肿瘤,全球每年有超过50万的妇女被诊断出患有宫颈癌,27万妇女死于此病,年龄标准化感染率达10.5%。早在80年代初,Haraldzur Hausen就发现人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)的感染与宫颈癌发病有关,后续的大量研究也已证明HPV与宫颈癌及其癌前病变有密切联系。到目前为止,已发现了百余种HPV基因型,其中约40种可以感染生殖道粘膜。其中高危型HPV型别为HPV16、18、31、33、45、52和58,90%以上的宫颈癌与它们有关。
根据2010年WHO的报告,HPV52是世界范围内宫颈癌中检测率占第7位的高危型别,主要与亚洲地区的宫颈癌相关,而在宫颈高度病变中检出率排在第3位。与HPV16和HPV18型不同的是HPV52的分布有一定的地理偏向性。亚洲HPV感染型别中,HPV52型检出率较高,我国进行的多项研究表明HPV52型也属比较常见的型别。
根据2010年WHO的报告,HPV31是世界范围内宫颈癌中检测率占第6位的高危型别,而在宫颈高度病变中检出率排在第2位。HPV31被认为是宫颈鳞状细胞癌中最普遍的4种高危型之一,在无症状的病人中广泛存在。具体来说HPV31型主要与宫颈上皮内异型增生病变和宫颈癌的形成相关。
HPV45在中国妇女中HPV感染亚型的发生率为2.3%,属于在中国发生率较高的HPV亚型(China Human Papillomavirus and Related Cancers,Fact Sheet 2010,WHO/ICOInformation Centre on HPV and Cervical Cancer,Sep 15,2010)。
HPV是无包膜二十面体对称病毒,其病毒基因组DNA为闭合环状,长度约7200-8000bp,由早期编码区(early region)、晚期编码区(late region)和位于两者之间的长调控区(long control region)组成。其中晚期编码区含两个开放阅读框(ORF),编码病毒衣壳蛋白L1和L2。L1蛋白分子量约55kDa,为主要衣壳蛋白,以72个五聚体的形式支撑整个病毒衣壳结构,在不同型别中氨基酸序列高度保守,能够刺激机体产生保护性抗体。L2蛋白分子量较小,多位于L1蛋白内部。
昆虫表达系统、酵母表达系统、原核表达系统和哺乳动物细胞等多种表达系统都可以通过单独表达主要衣壳蛋白L1或联合表达L1+L2的方式获得病毒样颗粒(VLP)。L1单独表达得到的VLP与天然病毒衣壳结构类似,可用于诱导与保护免受病毒侵袭有关的高效价病毒中和抗体应答。
因此,鉴于L1蛋白于不同基因型别内部高度保守,并且能够单独表达形成VLP,以L1蛋白作为HPV疫苗研发的目标蛋白具有较高的可行性。不过,以表达重组病毒蛋白得到的VLP作为HPV疫苗的商业化开发与生产需要解决许多技术问题,其中首先需要解决的技术问题就是如何提高重组病毒蛋白的表达水平。而L1蛋白在大肠杆菌、毕赤酵母、杆状病毒等表达系统中,往往受到这些生物体内氨基酸密码子使用频率的限制导致表达水平较低甚至无表达。如Merck公司的美国专利No.7,498,036中记载,野生型VLP蛋白在酿酒酵母中的表达量为35μg/mg(破菌上清液中的VLP/破菌上清液总蛋白)左右。
因此,本领域中需要一种高水平表达HPV52 L1,HPV31 L1,和HPV45 L1基因的方法,所述方法应该能够高水平地、操作简便和低成本地表达HPV52 L1,HPV31 L1,和HPV45L1基因。
发明内容
为了解决上述技术问题,根据本发明的第一方面,提供了一种能够在毕赤酵母中表达的HPV52,HPV31,HPV45基因,所述基因具有SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
利用毕赤酵母作为表达重组蛋白的表达系统,具有表达量高、操作简便、成本低等特点,并且相较于更高等的昆虫细胞与哺乳动物细胞而言更利于大规模工业化生产。由于不同物种间氨基酸密码子使用频率不一,在利用毕赤酵母表达重组蛋白的时候,往往根据目的蛋白的氨基酸序列经过密码子优化调整后得到更利于翻译的DNA序列。因此,本发明的经过密码子优化后的HPV52,HPV31,HPV45基因在毕赤酵母中可以获得较高的表达水平,更有利于针对HPV52,HPV31,HPV45的预防性疫苗的研发与生产。如本申请实施例所示,本发明的密码子优化过的HPV52,HPV31,HPV45基因在毕赤酵母中的表达量分别可最高达约140μg/mg,110μg/mg,150μg/mg(破菌上清液中的VLP/破菌上清液总蛋白)。
根据本发明的第二方面,提供了一种在毕赤酵母中表达HPV L1基因的方法,包括下述步骤:
(1)将本发明的HPV52,HPV31,HPV45 L1基因分别各自克隆入表达载体中;
(2)将步骤(1)所得的表达载体转化至毕赤酵母菌株中;
(3)使用抗生素对步骤(2)所得的转化菌株进行筛选,获得生长情况最好的一个或多个菌株;
(4)通过测试HPV52,HPV31,HPV45 L1基因的表达量对步骤(3)所得的菌株进行进一步筛选,获得表达量最高的一个或多个菌株;
(5)使用步骤(4)所得的菌株进行表达,分别获得HPV52,HPV31,HPV45 L1蛋白。
根据本发明的一个具体实施方案,所述步骤(1)中所述的表达载体为pPICZαB载体,并且所述步骤(3)中使用的抗生素为Zeocin。。
根据本发明的一个具体实施方案,所述步骤(2)中使用的毕赤酵母菌株为毕赤酵母X-33菌株。
根据本发明的一个具体实施方案,所述步骤(4)中测试HPV52,HPV31,HPV45 L1基因的表达量的操作是通过Western blot方法进行的。
根据本发明的一个具体实施方案,所述步骤(5)中的表达步骤为在发酵罐中进行的发酵步骤。
根据本发明的第三方面,提供了含有本发明的HPV52,HPV31,HPV45 L1基因的表达载体。
根据本发明的一个具体实施方案,所述含有本发明的HPV52,HPV31,HPV45 L1基因的表达载体来源于pPICZαB载体。
根据本发明的第四方面,提供了含有本发明的HPV52,HPV31,HPV45 L1基因或表达载体的毕赤酵母菌株,所述菌株能够高水平地表达生产HPV52,HPV31,HPV45 L1蛋白,更利于针对HPV52,HPV31,和HPV45的预防性疫苗的研发与生产。
附图说明
图1显示了HPV52 L1基因双酶切后琼脂糖电泳图。1:表达质粒(HindIII+KpnI双酶切);2:DNA Marker
图2显示了破菌后的HPV52 L1上清液Western-blot鉴定。1—8:重组表达菌株;9:PageRuler Prestained Protein Ladder;10:空宿主菌。
图3显示了HPV52 L1蛋白样品SDS-PAGE电泳图。1Marker;2HPV 52L1最终纯化后病毒样颗粒。
图4显示了HPV52 L1蛋白样品中呈现病毒样颗粒电镜照片。
图5显示了HPV31 L1-pPIC ZαB双酶切鉴定结果。1:DNA Marker;2,3,6,8:31L1-pPIC ZαB单克隆质粒;4,5,7,9:31L1-pPIC ZαB单克隆质粒双酶切(KpnI/BstBI)。
图6显示了HPV31 L1诱导表达情况Western-blot鉴定。1—8:重组表达菌株;9:阳性蛋白原液;10:PageRuler Prestained Protein Ladder。
图7显示了HPV31 L1纯化后病毒样颗粒SDS-PAGE电泳检定。1Marker;2纯化后HPV31L1
图8显示了HPV31 L1纯化后病毒样颗粒电镜照片
图9显示了HPV45 L10.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定双酶切结果。1:表达质粒(HindIII+KpnI双酶切);2:DNA Marker
图10显示了HPV45 L1 Western-blot鉴定45L1’诱导表达情况。1:空宿主菌;2—8,10:重组表达菌株;9:PageRuler Prestained Protein Ladder
图11显示了HPV45L1纯化后SDS-PAGE电泳检定。1HPV 45L1蛋白;2Marker
图12显示了HPV45 L1纯化后病毒样颗粒电镜照片
序列说明
SEQ ID NO:1为野生型HPV52 L1氨基酸序列。
SEQ ID NO:2为本发明的HPV52 L1基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO:3为野生型HPV31 L1氨基酸序列。
SEQ ID NO:4为本发明的HPV31 L1基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO:5为野生型HPV45 L1氨基酸序列。
SEQ ID NO:6为本发明的HPV45 L1基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO:7HPV52 L1基因的核苷酸序列正向引物。
SEQ ID NO:8HPV52 L1基因的核苷酸序列反向引物。
SEQ ID NO:9HPV45 L1基因的核苷酸序列正向引物。
SEQ ID NO:10HPV45 L1基因的核苷酸序列反向引物。
具体实施方式
通过以下实施例详细描述本发明,以便本领域普通技术人员能够更好地理解本发明。下述实施例仅仅出于示例性目的,并非意在限制本发明的范围。已经努力确保有关数字(如数量、温度等)的准确性,但应该考虑到会存在一些误差和偏差。除非另有说明,温度以℃为单位或者为环境温度,压力接近或等于大气压。除非另有说明,在下述各实施例中用到的限制性内切酶均购自New England Biolab公司。应当理解的是,除非另有说明,下述各实施例中所用到的仪器设备均为本领域的常规设备。除非另有说明,所使用的培养基均为市售可得的常规培养基,本领域技术人员均熟知其中的成分及含量。为了简便起见,在本文中有可能使用各种通用的缩写,本领域技术人员完全能够理解其含义。
实施例
实施例1:HPV52 L1密码子优化设计
根据野生型HPV52 L1氨基酸序列(GenBank:CAA52590.1,SEQ ID NO:1)和毕赤酵母偏爱性密码子,合成52L1序列。将野生型HPV 52L1 DNA序列进行改造,所有密码子均采用毕赤酵母中使用频率较高或最高的密码子,并考虑二级结构的形成以及酶切位点的选择,最终得到本发明的HPV52 L1基因的核苷酸序列SEQ ID NO:2。
实施例2:HPV52 L1重组表达载体构建
合成所得的52L1序列通过下列方法克隆入pPICZalphaB载体(Invitrogen)。以PCR的方式扩增得到两端分别带有BstBI和KpnI的52L1 DNA片段,PCR引物:正向引物:5’CAGGTGATCTTCGAAACGATGAGTGTTTGGAGAC3’(BstBI)(SEQ ID NO:7);反向引物:5’ATTGGTACCCTATTATCTTTTAACT 3’(KpnI)(SEQ ID NO:8)。PCR程序:94℃5分钟,94℃30秒、55℃30秒、72℃1分50秒循环30次,72℃10分钟,10℃10分钟,运行结束。PCR产物以琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收1500bp处条带(Qiagen gel extraction kit)。回收片段与pPICZalphaB以BstBI和KpnI(New England Biolab)联合酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定并分别回收约1500bp和3600bp片段。回收后52L1与pPICZalphaB以摩尔比为5:1的比例用T4连接酶(Takara)16℃过夜连接,第二天连接产物转化入E.coli DH5α,涂布于低盐LB平板(含25ug/mL Zeocin),37℃过夜培养。挑取部分转化后克隆抽提质粒,双酶切(HindIII+KpnI)鉴定,琼脂糖电泳检测(图1)。鉴定所得阳性重组克隆经DNA测序验证正确后保存,此重组载体命名为pPICZ52L1。
实施例3:HPV52 L1重组表达菌株构建与表达
以SacI线性化pPICZ52L1,酶切反应结束后酚:氯仿去除蛋白,再加入2.5倍体积无水乙醇,1/10体积3M NaAc(pH5.2)沉淀DNA,所得沉淀经75%乙醇洗涤、烘干后以少量无菌ddH2O溶解沉淀,电转毕赤酵母宿主菌(Invitrogen),涂布于YPDS平板(含180μg/mLZeocin),30℃培养3天,得数百克隆。从中挑取数十克隆接种于YPD平板(含1500μg/mLZeocin),筛选质粒高拷贝菌株,30℃培养2天。部分克隆生长较快,挑取生长情况最好的数个克隆接种于5mL YPD液体培养基,24小时后更换BMMY培养基,0.5%甲醇诱导48小时后收集菌体。菌体经玻璃珠破碎后,离心所得上清液以Western-blot鉴定(图2),所用一抗为自制兔多抗。取表达量最高的菌株冻存于-80℃,作为发酵罐培养工作种子。
实施例4:HPV52 L1重组蛋白的发酵罐培养
从工作种子库取1支菌种甘油冻存管,即实施例3所得的表达HPV52 L1的基因工程菌,融化后吸取100μL接入5mL YPD培养基,280转/分钟(rpm),30℃培养20小时。菌体密度达OD600约为1-2。镜检无杂菌污染。将检验合格的活化液1mL接入500mL YPD培养基,280rpm,30℃培养20小时。菌体密度达OD600约为2-6。镜检无杂菌污染。发酵用基础盐培养基BSM1(K2SO4273g,MgSO4 109g,CaSO4·2H2O 17.6g,H3PO4 400.5mL,KOH 62g,甘油600g,PTM160mL,泡敌1mL,去离子水加至15L),不含有抗生素,配制后在30L发酵罐(Bioengineering公司)中进行实罐灭菌。灭菌条件为121℃,30分钟,消后冷至30℃。将上述活化后种液以1:15接种于罐内。发酵温度为30.0±0.5℃,初始pH5.00±0.05,起始转速300rpm培养,通气量0.5vvm,DO(溶氧值)100%,添加PTM1(CuSO4·5H2O 6.0g,NaI 0.008g,MnSO4 3.0g,NaMoO4 0.2g,H3BO30.02g,ZnSO4 20.0g,CoCl2 0.5g,FeSO4·7H2O 65.0g,biotin 0.2g,H2SO4 5.0mL,去离子水加至1L)痕量盐类。初始增殖阶段大约24小时左右,维持溶氧值不低于20%,当碳源消耗完毕时,溶氧值迅速地上升,菌体湿重达到约100g/L。初始两小时以每小时200mL/h的速率补加体积百分比50%的甘油溶液(每升添加12mL PTM1)。补料两小时后改为300mL/h。通过调节搅拌转速、空气流量、罐压(<0.8bar)使溶氧水平维持在30%以上。补加约4小时,菌体湿重约200g/L时,停止补料,溶氧值上升。同时将pH值控制调为6.00±0.05,开始加入甲醇(每升添加12mL PTM1)诱导。最初甲醇加入量控制在30mL/h。缓慢增加甲醇的加入量,甲醇诱导4小时后将补料速度设定为90mL/h。维持溶氧值高于体积百分比20%,温度维持在30℃,pH值控制为6.00±0.05。诱导40小时发酵结束时放出发酵液。4℃离心收集菌体,菌体湿重达390g/L。
实施例5:HPV52 L1蛋白纯化
收集的菌体破菌(破菌缓冲液:200mM MOPS,pH7.0,0.7NaCl,0.05%Tween-80)离心后,取破菌后上清液经过层析方法纯化,得到自组装成病毒样颗粒的L1蛋白,具体步骤如下:将表达HPV52L1 VLP的毕赤酵母细胞,按1:5加入破菌缓冲液混合,充分混匀后,高压破碎以上细胞悬液,并重复操作,使90%的细胞破碎。将高压破碎的破菌液,于9000rpm,30min,10℃离心分离,收集离心后上清液。将经过离心澄清的破菌上清液通过POROS 50HS(Applied Biosystems公司层析柱进行初步纯化,洗脱方式为:100%缓冲液A(0.5M NaCl,50mM MOPS pH7.0,0.05%Tween-80)至100%的缓冲液B(1.5M NaCl,50mM MOPS pH7.0,0.05%Tween-80)的线性梯度洗脱,收集洗脱组分,并采用SDS-PAGE,Western-blot检测。
将含有HPV52L1蛋白的洗脱组分合并后,使用CHT(BIO-RAD TypeII)层析柱进一步纯化,洗脱方式为:100%缓冲液A(5mM PB,0.6M NaCl,50mM MOPSpH6.5,0.05%Tween-80)至100%的缓冲液B(200mM PB,0.6M NaCl,pH6.5,0.05%Tween-80)的线性梯度洗脱。收集洗脱组分,并采用SDS-PAGE和Western-blot检测,将含有HPV52L1 VLP的组分合并,即为最后的纯化样品。SDS-PAGE电泳检测L1蛋白纯度,扫描结果显示纯化的病毒样颗粒纯度大于90%(图3)。经过电镜(上海复旦大学化学系电镜室)观察纯化样品中呈现病毒样颗粒(图4),结果显示颗粒直径在60-100nm之间。
实施例6:本发明的HPV52 L1重组蛋白的表达量测定
本实施例根据Bradford法测得的发酵后菌体破菌上清液中总蛋白含量和Elisa夹心法测得的HPV52L1 VLP的表达量,计算得到HPV52L1 VLP在破菌后总蛋白中的含量。具体步骤如下:
1.使用Bradford法测定发酵菌体破菌上清液中总蛋白含量
使用上海博彩生物科技有限公司市售的K4000 Bradford protein quantitationreagent试剂盒进行测定。
在7支1.5ml EP管内一次加0μl,10μl,20μl,40μl,80μl,100μl BSA标准品(0.5mg/ml)和实施例4中获得的发酵菌体的破菌上清液40μl(稀释100倍),用水补足至总体积为100μl,混匀。每一浓度设3个平行样。每管加入900μl Bradford solution,立即混匀,室温放置10分钟后分别测定OD595光吸收值。根据6组BSA标准品作出蛋白浓度对吸光值标准曲线并计算得到线性方程式,再根据破菌上清液所得光吸收值与标准曲线线性方程式计算出发酵菌体破菌上清液的总蛋白含量。
2.用Elisa夹心法测定HPV52L1 VLP在发酵后菌体破菌上清液中的含量
使用纯化的HPV52L1 VLP做标准蛋白浓度曲线,诱导前的菌体作为阴性对照。
用包被液(1.6g Na2CO3,2.95g NaHCO3)将兔抗HPV52L1 VLP多抗稀释2000倍,然后向酶标板的各凹孔中各加入0.1ml稀释后的兔多抗,4℃过夜。移去包被液,用0.3ml PBST(PBS,pH7.0,0.05%Tween-20)洗涤凹孔,再用0.3ml封闭液(5%脱脂奶粉+PBST)于37℃保温2小时。
用稀释液(PBS,pH7.0)以连续二倍稀释的方式,将实施例5中获得的纯化HPV52L1VLP从浓度2μg/ml梯度稀释到0.0625μg/ml,以此作为标准样品。同时将实施例4中获得的发酵菌体的破菌上清液稀释200倍,然后分别向凹孔中加入0.1ml梯度稀释后的不同浓度的HPV52L1 VLP溶液或稀释后的破菌上清液,于37℃保温1小时后,移去抗原液,并用0.3mlPBST洗涤凹孔。然后用抗体稀释缓冲液(PBS,pH7.0,2%脱脂奶粉)将MAB885鼠抗HPV52L1VLP单抗(购自CHEMICON公司)1000倍稀释后加入到凹孔中,每孔加0.1ml,37℃保温1小时。移去单抗溶液,用0.3ml PBST洗涤凹孔。再向各凹孔中加入用抗体稀释缓冲液稀释5000倍的HRP标记的羊抗鼠IgG 0.1ml,37℃保温0.5小时。移去抗体溶液,并用0.3ml PBST洗涤凹孔,向凹孔中各加入0.1ml DAB显色液(购自Amresco公司),室温作用20分钟。向每个凹孔中加入0.05ml 2M H2SO4终止液以终止反应,并用酶标比色仪测定OD450吸光值。
利用梯度稀释的HPV52L1 VLP的OD450的检测结果,制作标准蛋白浓度曲线,再通过标准蛋白浓度曲线换算得HPV52L1蛋白的发酵表达量。
本实施例的结果示于表1。由表1可以看出,本发明的HPV52L1基因的表达量最高可达到140μg/mg(破菌上清液中的HPV52L1 VLP/破菌上清液总蛋白)。
表1:本发明的HPV52L1基因的表达量
Figure BDA0002701483320000061
实施例7:HPV52 L1疫苗制备
参考《中华人民共和国药典》(2005年版)中的方法,将实施例5中纯化获得的L1蛋白,吸附磷酸铝佐剂,制备获得具有免疫原性的HPV52L1疫苗。
实施例8:HPV52 L1基因表达产物免疫原性的测定
选取6~8周龄的SPF级BALB/c小鼠(上海西普尔必凯实验动物有限公司),分为4组,每组8只小鼠。第1~3组分别注射0.5mL浓度为2μg/mL、0.2μg/mL、0.02μg/mL的吸附铝佐剂的VLP(作为检测组),第4组小鼠用0.1mL含有铝佐剂的缓冲剂(0.32M氯化钠,0.01%吐温-80,0.01M组氨酸,pH6.5)进行免疫(作为阴性对照组)于0天腹部皮下五点注射免疫一次,免疫后28天采血。将采集得到的血液于37℃放置2h后,8000rpm离心5min,吸取上清,即得到鼠免疫血清,于-20℃存放,并检测鼠血清的阳转率,具体方法如下:用包被液稀释纯化的毕赤酵母表达的HPV52 L1至1μg/mL,包被96孔酶标板,每孔加0.1mL,4℃过夜。移去包被液,用0.3mLPBST清洗3次,然后用0.3mL封闭液(5%脱脂奶粉+PBST)于37℃保温2小时,清洗3次。每孔加入用稀释缓冲液(2%脱脂奶粉+PBST)以1:1000稀释被检血清,100μl/孔,双复孔加入酶标板,37℃孵育1小时。清洗6次,用稀释液1:5000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG,100μl/孔加入酶标板,37℃孵育0.5小时,清洗6次,然后加入100μl/孔TMB显色,37℃显色10分钟,加2M H2SO4 50μl终止反应。用酶标比色仪测定OD450读数,OD450值如表2所示。三个检测组的转阳率结果如表3所示。
Figure BDA0002701483320000071
表2HPV52L1免疫小鼠所得血清转阳率检测(OD450读数)
不同剂量分组 1μg组 0.1μg组 0.01μg组
阳转率 100% 100% 12.5%
表3HPV52L1转阳率结果
阴性平均值:0.007;Cutoff值:0.014
注:Cutoff值为佐剂组被检血清抗体的OD450值的平均值乘以2.1,OD450值大于Cutoff值的小鼠血清判定为阳性,OD450值小于Cutoff值的小鼠血清判定为阴性。
综上所述,本发明提供的52型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1基因是一种优化过的L1基因,具有以下优点:经过优化的基因更适合在酵母宿主中高效率表达目标蛋白,而且能够满足工业化生产的要求;同时,本发明提供的52型人乳头状瘤病毒疫苗,能够自组装形成VLPs结构,纯化的VLPs吸附佐剂后,通过血清转阳率的测定,说明该疫苗能在小鼠体内产生较强的免疫原性,而且由于采用毕赤酵母表达系统,因此该方法具有以下优点:成本低,产量高,产品性质更加均一稳定。
实施例9:1 HPV 31L1密码子优化设计
根据野生型HPV 31L1氨基酸序列(GenBank:AEI61021.1,SEQ ID NO:3)和毕赤酵母偏爱性密码子,合成31L1序列。将野生型HPV 31 L1 DNA序列进行改造,所有密码子均采用毕赤酵母中使用频率较高或最高的密码子,并考虑二级结构的形成以及酶切位点的选择,最终得到本发明的HPV31L1基因的核苷酸序列SEQ ID NO:4。
实施例10:HPV31L1重组表达载体构建
合成两端分别引入Kpn I(GGTACC)、Bst B I(TTCGAA)的31L1序列,装载于载体pGH。
以内切酶Kpn I、BstB I对质粒31L-pGH、载体pPIC ZαB进行双酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定并分别回收约1500bp和3600bp片段。回收后31L1与pPIC ZαB以摩尔比为3:1的比例以T4连接酶(Takara)室温连接2小时,连接产物转化入E.coli DH5α感受态细胞,涂布于低盐LB平板(含25ug/ml Zeocin),37℃过夜培养。挑取8个转化后单克隆菌落进行colonyPCR,琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物,扩增条带大小正确的克隆于LB低盐液体培养基中,37℃过夜培养。过夜培养菌液抽提质粒(Axygen),双酶切(BstB I+KpnI)鉴定,琼脂糖电泳检测(图5)。鉴定所得阳性重组克隆经DNA测序验证正确后保存,此重组载体命名为31L1-pPIC ZαB。
实施例11:HPV31 L1重组表达菌株构建与表达
以SacI线性化31L1-pPIC ZαB,酶切反应结束后酚:氯仿去除蛋白,再加入2.5倍体积无水乙醇,1/10体积3M NaAc(pH5.2)沉淀DNA,所得沉淀经75%乙醇洗涤、烘干后以少量无菌ddH2O溶解沉淀,电转毕赤酵母(Invitrogen),涂布于YPDS平板(含100μg/ml Zeocin),30℃培养3天,得数百克隆。从中挑取数十克隆接种于YPD平板(含1500μg/ml Zeocin),筛选质粒高拷贝菌株,30℃培养2天。部分克隆生长较快,挑取生长情况最好的数个克隆接种于5ml YPD液体培养基,24小时后更换BMMY培养基,1%甲醇诱导72小时后收集菌体。菌体经玻璃珠破碎后,离心所得上清液以Western-blot鉴定(图6),所用一抗为自制兔多抗。取表达量最高的菌株冻存于-80℃,作为发酵罐培养工作种子。
实施例12:HPV31 L1重组蛋白的发酵罐培养
从工作种子库取1支菌种甘油冻存管,即实施例11所得的表达HPV31 L1的基因工程菌,融化后吸取100μL接入5mL YPD培养基,280转/分钟(rpm),30℃培养20小时。菌体密度达OD600约为1-2。镜检无杂菌污染。将检验合格的活化液1mL接入500mL YPD培养基,280rpm,30℃培养20小时。菌体密度达OD600约为2-6。镜检无杂菌污染。发酵用基础盐培养基BSM1(K2SO4 273g,MgSO4 109g,CaSO4·2H 2O 17.6g,H3PO4 400.5mL,KOH 62g,甘油600g,PTM160mL,泡敌1mL,去离子水加至15L),不含有抗生素,配制后在30L发酵罐(Bioengineering公司)中进行实罐灭菌。灭菌条件为121℃,30分钟,消后冷至30℃。将上述活化后种液以1:15接种于罐内。发酵温度为30.0±0.5℃,初始pH5.00±0.05,起始转速300rpm培养,通气量0.5vvm,DO(溶氧值)100%,添加PTM1(CuSO4·5H2O 6.0g,NaI 0.008g,MnSO4 3.0g,NaMoO4 0.2g,H3BO3 0.02g,ZnSO4 20.0g,CoCl2 0.5g,FeSO4·7H2O 65.0g,biotin0.2g,H2SO45.0mL,去离子水加至1L)痕量盐类。初始增殖阶段大约24小时左右,维持溶氧值不低于20%,当碳源消耗完毕时,溶氧值迅速地上升,菌体湿重达到约100g/L。初始两小时以每小时200mL/h的速率补加体积百分比50%的甘油溶液(每升添加12mL PTM1)。补料两小时后改为300mL/h。通过调节搅拌转速、空气流量、罐压(<0.8bar)使溶氧水平维持在30%以上。补加约4小时,菌体湿重约200g/L时,停止补料,溶氧值上升。同时将pH值控制调为6.00±0.05,开始加入甲醇(每升添加12mL PTM1)诱导。最初甲醇加入量控制在30mL/h。缓慢增加甲醇的加入量,甲醇诱导4小时后将补料速度设定为90mL/h。维持溶氧值高于体积百分比20%,温度维持在30℃,pH值控制为6.00±0.05。诱导40小时发酵结束时放出发酵液。4℃离心收集菌体,菌体湿重达420g/L。
实施例13:HPV31 L1蛋白纯化
收集的菌体破菌(破菌缓冲液:200mM MOPS,pH7.0,0.7NaCl,0.05%Tween-80)离心后,取破菌后上清液经过层析方法纯化,得到自组装成病毒样颗粒的L1蛋白,具体步骤如下:
将表达HPV31L1 VLP的毕赤酵母细胞,按1:5加入破菌缓冲液混合,充分混匀后,高压破碎以上细胞悬液,并重复操作,使90%的细胞破碎。将高压破碎的破菌液,于9000rpm,30min,10℃离心分离,收集离心后上清液。
将经过离心澄清的破菌上清液通过POROS 50HS(Applied Biosystems公司)层析柱进行初步纯化,洗脱方式为:100%缓冲液A(0.5M NaCl,50mM MOPS pH7.0,0.05%Tween-80)至100%的缓冲液B(1.5M NaCl,50mM MOPS pH7.0,0.05%Tween-80)的线性梯度洗脱,收集洗脱组分,并采用SDS-PAGE,Western-blot检测。
将含有HPV31L1蛋白的洗脱组分合并后,使用CHT(BIO-RAD TypeII)层析柱进一步纯化,洗脱方式为:100%缓冲液A(5mM PB,0.6M NaCl,50mM MOPS pH6.5,0.05%Tween-80)至100%的缓冲液B(200mM PB,0.6M NaCl,pH6.5,0.05%Tween-80)的线性梯度洗脱。收集洗脱组分,并采用SDS-PAGE和Western-blot检测,将含有HPV31L1 VLP的组分合并,即为最后的纯化样品。SDS-PAGE电泳检测L1蛋白纯度,扫描结果显示纯化的病毒样颗粒纯度大于90%(图7。经过电镜(上海复旦大学化学系电镜室)观察纯化样品中呈现病毒样颗粒(图8),结果显示颗粒直径在30-60nm之间。
实施例14:本发明的HPV31 L1重组蛋白的表达量测定
本实施例根据Bradford法测得的发酵后菌体破菌上清液中总蛋白含量和Elisa夹心法测得的HPV31L1 VLP的表达量,计算得到HPV31L1 VLP在破菌后总蛋白中的含量。具体步骤如下:
1.使用Bradford法测定发酵菌体破菌上清液中总蛋白含量
使用上海博彩生物科技有限公司市售的K4000 Bradford protein quantitationreagent试剂盒进行测定。
在7支1.5ml EP管内一次加0μl,10μl,20μl,40μl,80μl,100μl BSA标准品(0.5mg/ml)和实施例12中获得的发酵菌体的破菌上清液40μl(稀释100倍),用水补足至总体积为100μl,混匀。每一浓度设3个平行样。每管加入900μl Bradford solution,立即混匀,室温放置10分钟后分别测定OD595光吸收值。根据6组BSA标准品作出蛋白浓度对吸光值标准曲线并计算得到线性方程式,再根据破菌上清液所得光吸收值与标准曲线线性方程式计算出发酵菌体破菌上清液的总蛋白含量。
2.用Elisa夹心法测定HPV31L1 VLP在发酵后菌体破菌上清液中的含量
使用纯化的HPV31L1 VLP做标准蛋白浓度曲线,诱导前的菌体作为阴性对照。
用包被液(1.6g Na2CO3,2.95g NaHCO3)将兔抗HPV31L1 VLP多抗稀释2000倍,然后向酶标板的各凹孔中各加入0.1ml稀释后的兔多抗,4℃过夜。移去包被液,用0.3ml PBST(PBS,pH7.0,0.05%Tween-20)洗涤凹孔,再用0.3ml封闭液(5%脱脂奶粉+PBST)于37℃保温2小时。
用稀释液(PBS,pH7.0)以连续二倍稀释的方式,将实施例13中获得的纯化HPV31L1VLP从浓度2μg/ml梯度稀释到0.0625μg/ml,以此作为标准样品。同时将实施例12中获得的发酵菌体的破菌上清液稀释200倍,然后分别向凹孔中加入0.1ml梯度稀释后的不同浓度的HPV31L1 VLP溶液或稀释后的破菌上清液,于37℃保温1小时后,移去抗原液,并用0.3mlPBST洗涤凹孔。然后用抗体稀释缓冲液(PBS,pH7.0,2%脱脂奶粉)将MAB885鼠抗HPV52L1VLP单抗(购自CHEMICON公司)1000倍稀释后加入到凹孔中,每孔加0.1ml,37℃保温1小时。移去单抗溶液,用0.3ml PBST洗涤凹孔。再向各凹孔中加入用抗体稀释缓冲液稀释5000倍的HRP标记的羊抗鼠IgG 0.1ml,37℃保温0.5小时。移去抗体溶液,并用0.3ml PBST洗涤凹孔,向凹孔中各加入0.1ml DAB显色液(购自Amresco公司),室温作用20分钟。向每个凹孔中加入0.05ml 2M H2SO4终止液以终止反应,并用酶标比色仪测定OD450吸光值。
利用梯度稀释的HPV31L1 VLP的OD450的检测结果,制作标准蛋白浓度曲线,再通过标准蛋白浓度曲线换算得HPV31L1蛋白的发酵表达量。
本实施例的结果示于表4。由表4可以看出,本发明的HPV31L1基因的表达量最高可达到110μg/mg(破菌上清液中的HPV31L1 VLP/破菌上清液总蛋白)。
表4:本发明的HPV31L1基因的表达量
Figure BDA0002701483320000091
实施例15:HPV31 L1疫苗制备
参考《中华人民共和国药典》(2005年版)中的方法,将实施例13中纯化获得的L1蛋白,吸附磷酸铝佐剂,制备获得具有免疫原性的HPV31L1疫苗。
实施例16:HPV31 L1基因表达产物免疫原性的测定
选取6~8周龄的SPF级BALB/c小鼠(上海西普尔必凯实验动物有限公司),分为4组,每组8只小鼠。第1~3组分别注射0.5mL浓度为2μg/mL、0.2μg/mL、0.02μg/mL的吸附铝佐剂的VLP(作为检测组),第4组小鼠用0.1mL含有铝佐剂的缓冲剂(0.32M氯化钠,0.01%吐温-80,0.01M组氨酸,pH6.5)进行免疫(作为阴性对照组)于0天腹部皮下五点注射免疫一次,免疫后28天采血。将采集得到的血液于37℃放置2h后,8000rpm离心5min,吸取上清,即得到鼠免疫血清,于-20℃存放,并检测鼠血清的阳转率,具体方法如下:用包被液稀释纯化的毕赤酵母表达的HPV31 L1至1μg/mL,包被96孔酶标板,每孔加0.1mL,4℃过夜。移去包被液,用0.3mLPBST清洗3次,然后用0.3mL封闭液(5%脱脂奶粉+PBST)于37℃保温2小时,清洗3次。每孔加入用稀释缓冲液(2%脱脂奶粉+PBST)以1:1000稀释被检血清,100μl/孔,双复孔加入酶标板,37℃孵育1小时。清洗6次,用稀释液1:5000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG,100μl/孔加入酶标板,37℃孵育0.5小时,清洗6次,然后加入100μl/孔TMB显色,37℃显色10分钟,加2M H2SO4 50μl终止反应。用酶标比色仪测定OD450读数,OD450值如表5所示。三个检测组的转阳率结果如表6所示。
Figure BDA0002701483320000101
表5HPV31L1免疫小鼠所得血清转阳率检测(OD450读数)
不同剂量分组 1μg组 0.1μg组 0.01μg组
阳转率 100% 100% 100%
表6HPV31L1转阳率结果
阴性平均值:0.005;Cutoff值:0.01
注:Cutoff值为佐剂组被检血清抗体的OD450值的平均值乘以2.1,OD450值大于Cutoff值的小鼠血清判定为阳性,OD450值小于Cutoff值的小鼠血清判定为阴性。
综上所述,本发明提供的HPV31型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1基因是一种优化过的L1基因,具有以下优点:经过优化的基因更适合在酵母宿主中高效率表达目标蛋白,而且能够满足工业化生产的要求;同时,本发明提供的HPV31型人乳头状瘤病毒疫苗,能够自组装形成VLPs结构,纯化的VLPs吸附佐剂后,通过血清转阳率的测定,说明该疫苗能在小鼠体内产生较强的免疫原性,而且由于采用毕赤酵母表达系统,因此该方法具有以下优点:成本低,产量高,产品性质更加均一稳定。
实施例17:HPV45 L1密码子优化设计
根据野生型HPV45 L1氨基酸序列(GenBank:ABP99831.1,SEQ ID NO:5)和毕赤酵母偏爱性密码子,合成45L1序列。将野生型HPV45 L1 DNA序列进行改造,所有密码子均采用毕赤酵母中使用频率较高或最高的密码子,并考虑二级结构的形成以及酶切位点的选择,最终得到本发明的HPV45 L1基因的核苷酸序列SEQ ID NO:6。
实施例18:HPV45 L1重组表达载体构建
合成所得的45L1序列通过下列方法克隆入pPICZalphaB载体(Invitrogen)。
以PCR的方式扩增得到两端分别带有BstBI和KpnI的45L1 DNA片段,PCR引物:正向引物:5’CAGGTGATCTTCGAAACGATGGCTTTGTGG 3’(BstBI)(SEQ ID NO:9);反向引物:5’CGGGGTACCCTATTACTTTTTGG 3’(KpnI)(SEQ ID NO:10)。PCR程序:94℃5分钟,94℃30秒、55℃30秒、72℃1分50秒循环30次,72℃10分钟,10℃10分钟,运行结束。PCR产物以琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收1500bp处条带(Qiagen gel extraction kit)。回收片段与pPICZalphaB以BstBI和KpnI(New England Biolab)联合酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定并分别回收约1500bp和3600bp片段。回收后45L1与pPICZalphaB以摩尔比为5:1的比例用T4连接酶(Takara)16℃过夜连接,第二天连接产物转化入E.coli DH5α,涂布于低盐LB平板(含25ug/mL Zeocin),37℃过夜培养。挑取部分转化后克隆抽提质粒,双酶切(HindIII+KpnI)鉴定,琼脂糖电泳检测(图9)。鉴定所得阳性重组克隆经DNA测序验证正确后保存,此重组载体命名为pPICZ45L1。
实施例19:HPV45 L1重组表达菌株构建与表达
以SacI线性化pPICZ45L1,酶切反应结束后酚:氯仿去除蛋白,再加入2.5倍体积无水乙醇,1/10体积3M NaAc(pH5.2)沉淀DNA,所得沉淀经75%乙醇洗涤、烘干后以少量无菌ddH2O溶解沉淀,电转毕赤酵母宿主菌(Invitrogen),涂布于YPDS平板(含180μg/mLZeocin),30℃培养3天,得数百克隆。从中挑取数十克隆接种于YPD平板(含1500μg/mLZeocin),筛选质粒高拷贝菌株,30℃培养2天。部分克隆生长较快,挑取生长情况最好的数个克隆接种于5mL YPD液体培养基,24小时后更换BMMY培养基,0.5%甲醇诱导48小时后收集菌体。菌体经玻璃珠破碎后,离心所得上清液以Western-blot鉴定(图10),所用一抗为自制兔多抗。取表达量最高的菌株冻存于-80℃,作为发酵罐培养工作种子。
实施例20:HPV45 L1重组蛋白的发酵罐培养
从工作种子库取1支菌种甘油冻存管,即实施例19所得的表达HPV45 L1的基因工程菌,融化后吸取100μL接入5mL YPD培养基,280转/分钟(rpm),30℃培养20小时。菌体密度达OD600约为1-2。镜检无杂菌污染。将检验合格的活化液1mL接入500mL YPD培养基,280rpm,30℃培养20小时。菌体密度达OD600约为2-6。镜检无杂菌污染。发酵用基础盐培养基BSM1(K2SO4 273g,MgSO4 109g,CaSO4·2H 2O 17.6g,H3PO4 400.5mL,KOH 62g,甘油600g,PTM160mL,泡敌1mL,去离子水加至15L),不含有抗生素,配制后在30L发酵罐(Bioengineering公司)中进行实罐灭菌。灭菌条件为121℃,30分钟,消后冷至30℃。将上述活化后种液以1:15接种于罐内。发酵温度为30.0±0.5℃,初始pH5.00±0.05,起始转速300rpm培养,通气量0.5vvm,DO(溶氧值)100%,添加PTM1(CuSO4·5H2O 6.0g,NaI 0.008g,MnSO4 3.0g,NaMoO4 0.2g,H3BO3 0.02g,ZnSO4 20.0g,CoCl2 0.5g,FeSO4·H2O 65.0g,biotin0.2g,H2SO4 5.0mL,去离子水加至1L)痕量盐类。初始增殖阶段大约24小时左右,维持溶氧值不低于20%,当碳源消耗完毕时,溶氧值迅速地上升,菌体湿重达到约100g/L。初始两小时以每小时200mL/h的速率补加体积百分比50%的甘油溶液(每升添加12mL PTM1)。补料两小时后改为300mL/h。通过调节搅拌转速、空气流量、罐压(<0.8bar)使溶氧水平维持在30%以上。补加约4小时,菌体湿重约230g/L时,停止补料,溶氧值上升。同时将pH值控制调为6.00±0.05,开始加入甲醇(每升添加12mL PTM1)诱导。最初甲醇加入量控制在30mL/h。缓慢增加甲醇的加入量,甲醇诱导4小时后将补料速度设定为90mL/h。维持溶氧值高于体积百分比20%,温度维持在30℃,pH值控制为6.00±0.05。诱导40小时发酵结束时放出发酵液。4℃离心收集菌体,菌体湿重达440g/L。
实施例21:HPV45 L1蛋白纯化
收集的菌体破菌(破菌缓冲液:200mM MOPS,pH7.0,0.7NaCl,0.05%Tween-80)离心后,取破菌后上清液经过层析方法纯化,得到自组装成病毒样颗粒的L1蛋白,具体步骤如下:
将表达HPV45L1 VLP的毕赤酵母细胞,按1:5加入破菌缓冲液混合,充分混匀后,高压破碎以上细胞悬液,并重复操作,使90%的细胞破碎。将高压破碎的破菌液,于9000rpm,30min,10℃离心分离,收集离心后上清液。
将经过离心澄清的破菌上清液通过POROS 50HS(Applied Biosystems公司)层析柱进行初步纯化,洗脱方式为:100%缓冲液A(0.5M NaCl,50mM MOPS pH7.0,0.05%Tween-80)至100%的缓冲液B(1.5M NaCl,50mM MOPS pH7.0,0.05%Tween-80)的线性梯度洗脱,收集洗脱组分,并采用SDS-PAGE,Western-blot检测。
将含有HPV45L1蛋白的洗脱组分合并后,使用CHT(BIO-RAD TypeII)层析柱进一步纯化,洗脱方式为:100%缓冲液A(5mM PB,0.6M NaCl,50mM MOPS pH6.5,0.05%Tween-80)至100%的缓冲液B(200mM PB,0.6M NaCl,pH6.5,0.05%Tween-80)的线性梯度洗脱。收集洗脱组分,并采用SDS-PAGE和Western-blot检测,将含有HPV45L1 VLP的组分合并,即为最后的纯化样品。SDS-PAGE电泳检测L1蛋白纯度,扫描结果显示纯化的病毒样颗粒纯度大于90%(图11)。经过电镜(上海华东师范大学电镜中心)观察纯化样品中呈现病毒样颗粒(图12),结果显示颗粒直径在60-100nm之间。
实施例22:本发明的HPV45 L1重组蛋白的表达量测定
本实施例根据Bradford法测得的发酵后菌体破菌上清液中总蛋白含量和Elisa夹心法测得的HPV45L1 VLP的表达量,计算得到HPV45L1 VLP在破菌后总蛋白中的含量。具体步骤如下:
1.使用Bradford法测定发酵菌体破菌上清液中总蛋白含量
使用上海博彩生物科技有限公司市售的K4000 Bradford protein quantitationreagent试剂盒进行测定。
在7支1.5ml EP管内一次加0μl,10μl,20μl,40μl,80μl,100μl BSA标准品(0.5mg/ml)和实施例20中获得的发酵菌体的破菌上清液40μl(稀释100倍),用水补足至总体积为100μl,混匀。每一浓度设3个平行样。每管加入900μl Bradford solution,立即混匀,室温放置10分钟后分别测定OD595光吸收值。根据6组BSA标准品作出蛋白浓度对吸光值标准曲线并计算得到线性方程式,再根据破菌上清液所得光吸收值与标准曲线线性方程式计算出发酵菌体破菌上清液的总蛋白含量。
2.用Elisa夹心法测定HPV45L1 VLP在发酵后菌体破菌上清液中的含量
使用纯化的HPV45L1 VLP做标准蛋白浓度曲线,诱导前的菌体作为阴性对照。
用包被液(1.6g Na2CO3,2.95g NaHCO3)将兔抗HPV45L1 VLP多抗稀释2000倍,然后向酶标板的各凹孔中各加入0.1ml稀释后的兔多抗,4℃过夜。移去包被液,用0.3ml PBST(PBS,pH7.0,0.05%Tween-20)洗涤凹孔,再用0.3ml封闭液(5%脱脂奶粉+PBST)于37℃保温2小时。
用稀释液(PBS,pH7.0)以连续二倍稀释的方式,将实施例21中获得的纯化HPV45L1VLP从浓度2μg/ml梯度稀释到0.0625μg/ml,以此作为标准样品。同时将实施例20中获得的发酵菌体的破菌上清液稀释200倍,然后分别向凹孔中加入0.1ml梯度稀释后的不同浓度的HPV45L1 VLP溶液或稀释后的破菌上清液,于37℃保温1小时后,移去抗原液,并用0.3mlPBST洗涤凹孔。然后用抗体稀释缓冲液(PBS,pH7.0,2%脱脂奶粉)将MAB885鼠抗HPV45L1VLP单抗(购自CHEMICON公司)1000倍稀释后加入到凹孔中,每孔加0.1ml,37℃保温1小时。移去单抗溶液,用0.3ml PBST洗涤凹孔。再向各凹孔中加入用抗体稀释缓冲液稀释5000倍的HRP标记的羊抗鼠IgG 0.1ml,37℃保温0.5小时。移去抗体溶液,并用0.3ml PBST洗涤凹孔,向凹孔中各加入0.1ml DAB显色液(购自Amresco公司),室温作用20分钟。向每个凹孔中加入0.05ml 2M H2SO4终止液以终止反应,并用酶标比色仪测定OD450吸光值。
利用梯度稀释的HPV45L1 VLP的OD450的检测结果,制作标准蛋白浓度曲线,再通过标准蛋白浓度曲线换算得HPV45L1蛋白的发酵表达量。
本实施例的结果示于表7。由表7可以看出,本发明的HPV45L1基因的表达量最高可达到150μg/mg(破菌上清液中的HPV45L1 VLP/破菌上清液总蛋白)。
表7:本发明的HPV45L1基因的表达量
Figure BDA0002701483320000131
实施例23:HPV45 L1疫苗制备
参考《中华人民共和国药典》(2005年版)中的方法,将实施例21中纯化获得的L1蛋白,吸附磷酸铝佐剂,制备获得具有免疫原性的HPV45L1疫苗。
实施例24:HPV45 L1基因表达产物免疫原性的测定
选取6~8周龄的SPF级BALB/c小鼠(上海西普尔必凯实验动物有限公司),分为4组,每组8只小鼠。第1~3组分别注射0.5mL浓度为2μg/mL、0.2μg/mL、0.02μg/mL的吸附铝佐剂的VLP(作为检测组),第4组小鼠用0.5mL含有铝佐剂的缓冲剂(0.32M氯化钠,0.01%吐温-80,0.01M组氨酸,pH6.5)进行免疫(作为阴性对照组)于0天腹腔注射免疫一次,免疫后28天采血。将采集得到的血液于37℃放置2h后,8000rpm离心5min,吸取上清,即得到鼠免疫血清,于-20℃存放,并检测鼠血清的阳转率,具体方法如下:用包被液稀释纯化的毕赤酵母表达的HPV45 L1至1μg/mL,包被96孔酶标板,每孔加0.1mL,4℃过夜。移去包被液,用0.3mLPBST清洗3次,然后用0.3mL封闭液(5%脱脂奶粉+PBST)于37℃保温2小时,清洗3次。每孔加入用稀释缓冲液(2%脱脂奶粉+PBST)以1:1000稀释被检血清,100μl/孔,双复孔加入酶标板,37℃孵育1小时。清洗6次,用稀释液1:5000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG,100μl/孔加入酶标板,37℃孵育0.5小时,清洗6次,然后加入100μl/孔TMB显色,37℃显色10分钟,加2M H2SO4 50μl终止反应。用酶标比色仪测定OD450读数,OD450值如表8所示。三个检测组的转阳率结果如表9所示。
Figure BDA0002701483320000141
表8 HPV45L1免疫小鼠所得血清转阳率检测(OD450读数)
不同剂量分组 1μg组 0.1μg组 0.01μg组
阳转率 100% 100% 75%
表9 HPV45L1转阳率结果
阴性平均值:0.005;Cutoff值:0.01111
注:Cutoff值为佐剂组被检血清抗体的OD450值的平均值乘以2.1,OD450值大于Cutoff值的小鼠血清判定为阳性,OD450值小于Cutoff值的小鼠血清判定为阴性。
综上所述,本发明提供的45型人乳头状瘤病毒主要衣壳蛋白L1基因是一种优化过的L1基因,具有以下优点:经过优化的基因更适合在酵母宿主中高效率表达目标蛋白,而且能够满足工业化生产的要求;同时,本发明提供的45型人乳头状瘤病毒疫苗,能够自组装形成VLPs结构,纯化的VLPs吸附佐剂后,通过血清转阳率的测定,说明该疫苗能在小鼠体内产生较强的免疫原性,而且由于采用毕赤酵母表达系统,因此该方法具有以下优点:成本低,产量高,产品性质更加均一稳定。
<110> 上海泽润生物科技有限公司
<120> 人乳头瘤病毒基因,及载体,菌株,表达方法
<130>
<160> 10
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<308> GenBank: CAA52590.1
<210> 2
<211> 1515
<212> DNA
<213> Artificial(人工序列)
<220>
<223> 适用毕赤酵母偏好密码子的HPV 52 L1蛋白基因的核苷酸序列
<400> 2
atgagtgttt ggagaccaag tgaagctaca gtgtatttgc ctccagttcc tgtgagtaaa 60
gtcgtgagta ctgacgagta cgtctccaga acttcaatct attactatgc tggatcttca 120
agattactaa ctgttggtca tccttacttt tccatcaaaa acactagttc tggaaacggt 180
aagaaagtcc ttgtgccaaa agtctctgga ttacaatata gagtttttag aatcaagttg 240
ccagacccta acaagtttgg atttcctgat acatcttttt acaatccaga gactcagaga 300
cttgtttggg catgtaccgg attagagata ggtagaggtc agccattagg agtcggtatt 360
tcaggtcatc cattacttaa taagttcgac gataccgaga catcaaacaa gtacgctggt 420
aagccaggta ttgacaatag agaatgcctt tctatggact ataaacagac tcagctttgt 480
atattaggat gcaaacctcc tataggagaa cattggggaa aaggaacccc atgcaataac 540
aattctggaa atcctggaga ttgccctcca cttcagctta ttaacagtgt tatacaagat 600
ggagatatgg ttgacactgg attcggatgt atggatttca acactctaca agccagtaag 660
tccgacgttc ctatagatat ttgcagttct gtttgtaagt accctgacta tctgcaaatg 720
gcaagtgagc cttatggtga ttccctattc tttttcctga gaagagagca aatgttcgtg 780
agacatttct ttaacagagc tggtactttg ggtgatccag ttccaggtga cttgtatatc 840
caaggatcta attcaggaaa caccgctacc gttcagtctt ctgctttctt tccaacccca 900
tcaggttcta tggtcacatc cgaaagtcag ctgttcaata agccttactg gttacaaaga 960
gcacagggtc ataataacgg aatatgctgg ggtaatcaac tatttgtgac agttgttgac 1020
actacaagaa gtactaatat gaccctttgt gccgaagtca agaaagagag tacatacaaa 1080
aatgaaaatt ttaaagaata ccttagacat ggtgaggaat tcgatctgca atttattttc 1140
cagctgtgta aaatcacttt gacagcagat gtgatgacat atatacataa gatggatgca 1200
accatcttag aagattggca gttcggtcta actcctccac ctagtgctag tctagaagat 1260
acttacagat tcgttacctc aacagctatc acttgtcaaa aaaacactcc accaaaggga 1320
aaggaggacc ctttgaaaga ctatatgttc tgggaggtgg accttaaaga aaagttcagt 1380
gccgaccttg atcaatttcc attgggaaga aagttcctgc ttcaagcagg tttgcaagcc 1440
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<213> Artificial(人工序列)
<220>
<223> 适用毕赤酵母偏好密码子的HPV 31 L1蛋白基因的核苷酸序列
<400> 4
atgtctttgt ggagaccatc agaagctact gtttacttac ctccagtccc tgtgtccaaa 60
gttgtctcaa cagatgagta tgtgaccaga actaacattt actatcatgc aggatctgcc 120
aggttgctta cagttggtca cccatactat tccatcccta aatcagataa tccaaagaaa 180
attgttgtcc ctaaggtgtc tggtttacaa tacagagttt tccgtgtcag gttgccagac 240
ccaaacaagt ttggtttccc tgatacttca ttttataatc cagaaacaca aagattggtg 300
tgggcttgtg ttggattaga ggtcggtaga ggccagccat tgggagtggg tatttctgga 360
catcctcttt taaacaaatt cgatgacacc gaaaattcca acagatatgc tggtggacca 420
ggcactgata atcgtgagtg tatctcaatg gactacaagc aaacacagtt gtgcttactt 480
ggatgtaaac ctccaattgg tgaacattgg ggaaaagggt ctccatgctc caataacgct 540
attactcctg gagattgtcc acctttggaa cttaaaaatt cagttatcca agacggtgat 600
atggttgaca ccggatttgg tgctatggac ttcactgccc ttcaagatac aaagtctaac 660
gttccattgg acatttgtaa ttccatctgc aaatatccag attacttaaa gatggtggca 720
gaaccttatg gagacacttt gttcttttac cttagaaggg agcaaatgtt tgttcgtcac 780
ttctttaata gatcaggaac cgtcggtgaa tccgttccta ctgatttgta tattaaagga 840
tctggttcaa cagctacctt ggcaaactcc acttactttc ctacaccatc aggatctatg 900
gtgacctccg atgctcaaat ctttaataag ccttattgga tgcagagagc ccaaggtcat 960
aataacggaa tttgttgggg taatcagtta ttcgttactg tggtcgatac aaccagatca 1020
actaacatgt ctgtttgtgc tgcaattgcc aattctgaca caacttttaa gtcctctaac 1080
ttcaaagaat acttgagaca cggagaggaa tttgaccttc aattcatttt tcagttgtgt 1140
aagatcactt tatcagctga tattatgaca tatatccatt ctatgaatcc agcaattctt 1200
gaagactgga actttggttt gacaacccct ccatctggat cattagagga tacatataga 1260
tttgttactt cccaagctat cacctgtcag aagacagcac ctcaaaaacc aaaggaagat 1320
cctttcaaag attacgtctt ttgggaggtt aatttgaagg aaaaattctc tgctgacctt 1380
gatcaatttc cattaggaag aaagtttttg cttcaggccg gttatagggc acgtcctaaa 1440
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aaaactaaga aataatag 1518
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<212> DNA
<213> Artificial(人工序列)
<220>
<223> 适用毕赤酵母偏好密码子的HPV 45 L1蛋白基因的核苷酸序列
<400> 6
atggccttgt ggcgtccatc tgactccacc gtttaccttc cacctccttc tgttgcccgt 60
gtcgtcaata ccgacgacta cgtttcccgt acttccatct tctaccacgc tggttcctcc 120
cgtttgctta ccgtcggaaa cccatacttc cgtgtcgtcc caaacggtgc cggaaacaag 180
caggctgttc ctaaggtctc tgcctaccag tatcgtgtct tccgtgtcgc ccttccagat 240
ccaaacaaat tcggattgcc agactccacc atctacaacc cagagactca acgtcttgtc 300
tgggcctgcg ttggtatgga gatcggaaga ggtcagcctt tgggtatcgg attgtccgga 360
cacccatttt ataacaagtt ggatgatact gagtccgctc acgctgctac cgctgttatc 420
acccaggacg tccgtgacaa cgtctccgtc gattacaagc agacccaatt gtgcattttg 480
ggttgcgtcc ctgccatcgg tgagcattgg gccaagggaa ccctttgtaa gcctgcccaa 540
cttcaaccag gagactgccc tccacttgag ttgaaaaaca ccattatcga ggatggagac 600
atggttgaca ccggatacgg tgccatggac ttctccactt tgcaggatac taaatgcgaa 660
gtccctttgg acatctgcca gtctatctgc aagtaccctg actatcttca aatgtccgcc 720
gacccatacg gagactccat gttcttctgc ttgcgtcgtg agcagctttt cgcccgtcac 780
ttctggaaca gagccggtgt catgggagac actgtcccaa ccgacttgta catcaaggga 840
acctccgcta atatgcgtga gactccaggt tcctgcgtct actctccatc cccttccggt 900
tctatcatta cctccgactc ccagttgttt aataagccat actggttgca caaggcccag 960
ggtcacaaca acggtatctg ctggcataac cagcttttcg tcaccgtcgt cgataccacc 1020
cgttccacca acttgactct ttgcgcctcc actcagaacc ctgtccctgg aacctatgac 1080
ccaaccaagt tcaagcagta ctcccgtcac gttgaggagt acgatttgca gttcattttc 1140
cagttgtgta ccatcacctt gactgctgag gtcatgtcct acattcactc catgaactct 1200
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agacctacca tcggacctcg taagagacct gctgcctcta cctccaccgc ttccagacca 1500
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<210> 7
<211> 34
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<220>
<223> 引物
<400> 7
caggtgatct tcgaaacgat gagtgtttgg agac 34
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
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<220>
<223> 引物
<400> 8
attggtaccc tattatcttt tact 24
<210> 9
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<220>
<223> 引物
<400> 9
caggtgatct tcgaaacgat ggctttgtgg 30
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial(人工序列)
<220>
<223> 引物
<400> 10
cggggtaccc tattactttt tgg 23

Claims (12)

1.一种人乳头瘤病毒(HPV)基因,所述基因为天然L1蛋白基因经毕赤酵母偏爱密码子优化,其特征在于,所述HPV基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 4所示。
2.一种表达载体,其含有权利要求1所述的基因。
3.根据权利要求2所述的表达载体,其中所述表达载体是毕赤酵母表达载体。
4.根据权利要求3所述的表达载体,其中所述表达载体是pPICZaB载体。
5.一种毕赤酵母菌株,其含有权利要求1所述的基因或权利要求2-4中任一项所述的表达载体。
6.根据权利要求5所述的毕赤酵母菌株,其中所述菌株选自毕赤酵母X-33、GS115、KM71和SMD1168菌株。
7.一种在毕赤酵母中表达HPV基因的方法,包括下述步骤:
A将权利要求1所述的HPV基因的核酸分子克隆至表达载体中;
B将步骤A中所得 的表达载体转化至毕赤酵母菌株中;
C培养和筛选转化体;
D使用步骤C获得的菌株表达重组的HPV蛋白。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述表达载体是毕赤酵母表达载体。
9.根据权利要求8所述的方法,其中所述表达载体是pPICZaB载体。
10.根据权利要求7所述的方法,其特征是,其中所述毕赤酵母菌株选自毕赤酵母X-33、GS115、KM71和SMD1168菌株。
11.一种制备抗HPV疫苗的方法,其特征是,包括采用权利要求7-10中任一项所述的方法,制备重组HPV L1蛋白病毒样颗粒,然后加入药学上可用的疫苗佐剂。
12.根据权利要求11所述的方法,其特征是,所述药学上可用的疫苗佐剂为铝佐剂。
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