JP4584536B2 - B7様分子およびその使用 - Google Patents
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Description
本出願は、2000年9月20日出願の米国仮特許出願第60/233,867号(その開示は、本明細書において参考として明白に援用されている)からの優先権の利益を主張する。
【0002】
(発明の分野)
本発明は、B7様(B7−L)ポリペプチドおよびこれをコードする核酸分子に関する。本発明はまた、B7−Lポリペプチドを産生するための、選択的結合因子、ベクター、宿主細胞および方法に関する。本発明はさらに、B7−Lポリペプチドと関連する疾患、障害、および状態の、診断、処置、改善、および/または予防のための薬学的組成物および方法に関する。
【0003】
(発明の背景)
核酸分子の同定、クローニング、発現、および操作における技術進歩ならびにヒトゲノムの解読によって、新規治療薬の発見が大いに加速された。現在、高速核酸配列決定技術は、前例のない速度で配列情報を作製し得、そしてコンピュータ分析と結合されて、ゲノムの一部および全体への重複配列の組み立てならびにポリペプチドコード領域の同定を可能にする。既知アミノ酸配列のデータベース編集物に対する推定アミノ酸配列の比較は、以前に同定された配列および/または構造の目印に対する相同性の程度を決定することを可能にする。核酸分子のポリペプチドコード領域のクローニングおよび発現は、構造分析および機能分析のためのポリペプチド産物を提供する。核酸分子およびコードされるポリペプチドの操作は、治療剤として使用される生成物に対して有利な特性を与え得る。
【0004】
過去10年間にわたるゲノム研究における有意な技術進歩にも関わらず、ヒトゲノムに基づく新規治療剤の開発に対する可能性は、未だ大部分理解されていない。潜在的に有利なポリペプチド治療剤をコードする多くの遺伝子またはこれらがコードするポリペプチド(これらは、治療分子に対して「標的」としてはたらき得る)は、未だ同定されていない。従って、診断的な利点または治療的な利点を有する、新規ポリペプチドおよびこれらをコードする核酸分子を同定することが、本発明の目的である。
【0005】
(発明の要旨)
新規なポリペプチド(これは、T細胞同時刺激経路におけるタンパク質に関する)が、同定されている。このポリペプチド(B7−様ポリペプチド(B7−L)と呼ばれる)は、CD80、CD86、B7RP−1、およびB7−H1に類似の構造を有し、そしてこれらと相同性を共有するB7関連ポリペプチドを表す。ヒトB7−Lポリペプチドは、B7ファミリーの他のメンバー(B7rp−1、20%;B7−1、12%)とよりも、ヒトB7−H1とより高いアミノ酸同一性(35%)を共有する。さらに、B7−LポリペプチドおよびB7−H1のマウスおよびヒトのオルソログは、B7−1、B7−2、またはB7rp−1のマウスおよびヒトのオルソログ(約40%)よりも、より高い程度のアミノ酸相同性を共有する(約70%)。さらに、B7−H1およびB7−Lの両方は、同じレセプター(PD−1)に結合する。
【0006】
本発明は、新規なB7−Lの核酸分子およびコードされるポリペプチドに関する。
【0007】
本発明は、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提供する:
(a)配列番号1に示されるヌクレオチド配列;
(b)ATCC寄託番号PTA2481におけるDNA挿入物のヌクレオチド配列;
(c)配列番号2に示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;
(d)少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、(a)〜(c)のいずれかのヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列;および
(e)(a)〜(c)のいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列。
【0008】
本発明はまた、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する:
(a)配列番号2に示されるポリペプチドに対して少なくとも約70%同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはATCC寄託番号PTA2481におけるDNA挿入物のヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされたポリペプチドは、配列番号2に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列;
(b)配列番号1に示されるヌクレオチド配列、ATCC寄託番号PTA2481におけるDNA挿入物のヌクレオチド配列、または(a)のヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体をコードするヌクレオチド配列;
(c)少なくとも約25アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号1のヌクレオチド配列、ATCC寄託番号PTA2481におけるDNA挿入物のヌクレオチド配列、または(a)もしくは(b)のヌクレオチド配列の領域であって、ここで、このポリペプチドフラグメントは、配列番号2に示されるポリペプチドの活性を有するか、または抗原性である、領域;
(d)少なくとも約16ヌクレオチドのフラグメントを含む、配列番号1のヌクレオチド配列、ATCC寄託番号PTA2481におけるDNA挿入物のヌクレオチド配列、または(c)もしくは(d)いずれかのヌクレオチド配列の領域;
(e)少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、(a)〜(d)のいずれかのヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列;ならびに
(f)(a)〜(d)のいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列。
【0009】
本発明はさらに、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する;
(a)少なくとも1つの保存的アミノ酸置換を有する配列番号2に示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされたポリペプチドは、配列番号2に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列;
(b)少なくとも1つのアミノ酸挿入を有する配列番号2に示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされたポリペプチドは、配列番号2に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列;
(c)少なくとも1つのアミノ酸欠失を有する配列番号2に示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされたポリペプチドは、配列番号2に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列;
(d)C末端短縮および/またはN末端短縮を有する配列番号2に示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされたポリペプチドは、配列番号2に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列;
(e)アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、C末端短縮、およびN末端短縮からなる群より選択される少なくとも1つの改変を有する配列番号2に示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされたポリペプチドは、配列番号2に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列;
(f)少なくとも約16ヌクレオチドのフラグメントを含む(a)〜(e)のいずれかのヌクレオチド配列;
(g)少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、(a)〜(f)のいずれかのヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズする、ヌクレオチド配列;ならびに
(h)(a)〜(e)のいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列。
【0010】
本発明は、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する;
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列;および
(b)ATCC寄託番号PTA2481のDNA挿入物によってコードされるアミノ酸配列。
【0011】
本発明はまた、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する:
(a)必要に応じてアミノ末端メチオニンをさらに含む、配列番号3に示されるアミノ酸配列;
(b)配列番号2のオルソログについてのアミノ酸配列;
(c)配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも約70%同一であるアミノ酸配列、またはATCC寄託番号PTA2481のDNA挿入物によってコードされるアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、配列番号2に示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列;
(d)少なくとも約25アミノ酸残基を含む、配列番号2に示されるアミノ酸配列またはATCC寄託番号PTA2481のDNA挿入物によってコードされるアミノ酸配列のフラグメントであって、ここで、このフラグメントは、配列番号2に示されるポリペプチドの活性を有するか、または抗原性である、フラグメント;ならびに
(e)配列番号2に示されるアミノ酸配列、ATCC寄託番号PTA2481のDNA挿入物によってコードされるアミノ酸配列、または(a)〜(c)のいずれかのアミノ酸配列の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体についてのアミノ酸配列。
【0012】
本発明は、さらに、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する:
(a)少なくとも1つの保存的アミノ酸置換を有する配列番号2に示されるアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、配列番号2に示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列;
(b)少なくとも1つのアミノ酸挿入を有する配列番号2に示されるアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、配列番号2に示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列;
(c)少なくとも1つのアミノ酸欠失を有する配列番号2に示されるアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、配列番号2に示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列;
(d)C末端短縮および/またはN末端短縮を有する配列番号2に示されるアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、配列番号2に示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列;ならびに
(e)アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、C末端短縮、およびN末端短縮からなる群より選択される少なくとも1つの改変を有する配列番号2に示されるアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、配列番号2に示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列。
【0013】
本発明はさらに、以下:位置4におけるバリン;位置6におけるイソロイシンまたはバリン;位置7におけるロイシンまたはバリン;位置8におけるメチオニンまたはバリン;位置10におけるイソロイシン;位置17におけるロイシンまたはバリン;位置19におけるグリシン;位置22におけるセリン;位置23におけるロイシン;位置28におけるアスパラギン酸;位置31におけるロイシンまたはバリン;位置32におけるバリン;位置40におけるイソロイシン;位置50におけるロイシン;位置52におけるバリン;位置55におけるバリン、ロイシン、またはメチオニン;位置61におけるアルギニン;位置62におけるメチオニン;位置70におけるリジン;位置74におけるセリン;位置75におけるイソロイシンまたはメチオニン;位置76におけるバリン;位置78におけるアスパラギン酸;位置80におけるメチオニンまたはイソロイシン;位置84におけるアルギニン;位置89におけるロイシン;位置91におけるアスパラギン;位置92におけるイソロイシンまたはロイシン;位置94におけるイソロイシンまたはロイシン;位置96におけるグルタミン酸;位置97におけるアスパラギン酸;位置100におけるフェニルアラニン;位置104におけるバリン;位置105におけるロイシン;位置107におけるアルギニン;位置110におけるチロシン;位置111におけるグルタミン酸;位置115におけるバリンまたはイソロイシン;位置116におけるセリン;位置117におけるバリン;位置121におけるグリシン;位置126におけるバリンまたはメチオニン;位置131におけるバリンまたはイソロイシン;位置139におけるイソロイシンまたはロイシン;位置141におけるイソロイシン;位置146におけるセリン;位置148におけるフェニルアラニン;位置153におけるイソロイシン、メチオニン、またはロイシン;位置160におけるイソロイシン;位置165におけるスレオニン;位置171におけるアスパラギン酸;位置174におけるフェニルアラニン;位置177におけるセリン;位置178におけるスレオニン;位置180におけるバリン;位置182におけるメチオニン、バリン、またはイソロイシン;位置183におけるアルギニン;位置188におけるリジン;位置193におけるイソロイシンまたはロイシン;位置200におけるリジン;位置202におけるバリン;位置204におけるイソロイシン;位置209におけるバリンまたはメチオニン;位置213におけるイソロイシン;位置222におけるイソロイシンまたはバリン;位置223におけるバリン;位置225におけるロイシン;位置227におけるバリンまたはロイシン;位置231におけるロイシンまたはバリン;位置232におけるロイシン;位置235におけるバリンまたはロイシン;位置240におけるメチオニンまたはイソロイシン;位置250におけるアルギニン;位置255におけるアルギニン;位置256におけるグルタミン酸;位置264におけるセリン;位置266におけるアルギニン;および位置268におけるロイシン;からなる群より選択される少なくとも1つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号2に示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド(ここでこのポリペプチドは、配列番号2に示されるポリペプチドの活性を有する)を提供する。
【0014】
B7−Lアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドもまた、提供される。
【0015】
本発明はまた、本明細書中に示されるような単離された核酸分子を含む発現ベクター、本明細書中に示されるような組換え核酸分子を含む組換え宿主細胞、およびB7−Lポリペプチドを産生する方法を提供し、この方法は、この宿主細胞を培養する工程、必要に応じてそのように産生されたポリペプチドを単離する工程を包含する。
【0016】
B7−Lポリペプチドをコードする核酸分子を含むトランスジェニック非ヒト動物もまた、本発明に含まれる。B7−L核酸分子は、B7−Lポリペプチドの発現およびB7−Lポリペプチドのレベルの増加(これは、増加した循環レベルを含み得る)を可能にする様式で、動物中に導入される。あるいは、B7−L核酸分子は、内因性B7−Lポリペプチドの発現を妨害する様式で動物に導入される(すなわち、B7−Lポリペプチド遺伝子ノックアウトを保有するトランスジェニック動物を作製する)。トランスジェニック非ヒト動物は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはげっ歯類(例えば、ラットまたはマウス)である。
【0017】
本発明のB7−Lポリペプチドの誘導体もまた、提供される。
【0018】
本発明のB7−Lポリペプチドに特異的に結合し得る選択的結合因子(例えば、抗体およびペプチド)が、さらに提供される。このような抗体およびペプチドは、アゴニスト性であってもアンタゴニスト性であってもよい。
【0019】
本発明のヌクレオチド、ポリペプチド、もしくは選択的結合因子ならびに1つ以上の薬学的に受容可能な処方剤を含む薬学的組成物もまた、本発明によって含まれる。薬学的組成物は、治療有効量の本発明のヌクレオチドまたはポリペプチドを提供するために使用される。本発明はまた、このポリペプチド、核酸分子、および選択的結合因子を使用する方法に関する。
【0020】
本発明のB7−LポリペプチドおよびB7−L核酸分子は、疾患および障害(本明細書中に列挙されるものを含む)を処置、予防、改善、および/または検出するために使用され得る。
【0021】
本発明はまた、B7−Lポリペプチドに結合する試験分子を同定するために、試験分子をアッセイする方法を提供する。この方法は、B7−Lポリペプチドを試験分子と接触させて、この試験分子のこのポリペプチドに対する結合の程度を決定する工程を包含する。この方法はさらに、このような試験分子が、B7−Lポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストであるか否かを決定する工程をさらに包含する。本発明はさらに、B7−Lポリペプチドの発現またはB7−Lポリペプチドの活性に対する分子の影響を試験する方法を提供する。
【0022】
B7−Lポリペプチドの発現を調節する方法およびB7−Lポリペプチドのレベルを調節する(すなわち、増加または減少させる)方法もまた、本発明によって包含される。1つの方法は、B7−Lポリペプチドをコードする核酸分子を動物に投与する工程を包含する。別の方法において、B7−Lポリペプチドの発現を調節または調整するエレメントを含む核酸分子が、投与され得る。これらの方法の例としては、本明細書中にさらに記載されるように、遺伝子治療、細胞治療、およびアンチセンス治療が挙げられる。
【0023】
本発明の別の局面において、B7−Lポリペプチドは、そのレセプター(「B7−Lポリペプチドレセプター」)を同定するために使用され得る。種々の形態の「発現クローニング」は、タンパク質リガンドに対するレセプターをクローニングするために広範囲に使用されている。例えば、SimonsenおよびLodish、1994、Trends Pharmacol.Sci.15:437−41ならびにTartagliaら、1995、Cell 83:1263−71を参照のこと。B7−Lポリペプチドレセプターの単離は、B7−Lポリペプチドシグナル伝達経路の新規アゴニストおよびアンタゴニストの同定または開発に有用である。このようなアゴニストおよびアンタゴニストとしては、可溶性B7−Lポリペプチドレセプター、抗B7−Lポリペプチドレセプター−選択的結合因子(例えば、抗体またはその誘導体)、低分子、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられ、これらのうちのいずれもが、1つ以上の疾患または障害(本明細書中に開示されるものを含む)の処置に使用され得る。
【0024】
(発明の詳細な説明)
本明細書中で使用される節の表題は、体系的な目的のみのためであり、そして、そこに記載される内容を限定するようには解釈されるべきではない。本出願において列挙される全ての参考文献は、明確に本明細書中に参考として援用される
(定義)
用語「B7−L遺伝子」または「B7−L核酸分子」あるいは「B7−Lポリヌクレオチド」とは、配列番号1に示されるヌクレオチド配列、配列番号2に示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ATCC寄託番号PTA2481におけるDNA挿入物のヌクレオチド配列、および本明細書中で定義される核酸分子を含むか、あるいはこれらからなる核酸分子をいう。
【0025】
用語「B7−Lポリペプチド対立遺伝子改変体」とは、生物体または生物体の集団の染色体の所定の遺伝子座を占める遺伝子の、天然に存在する可能ないくつかの代替的形態のうちの1つをいう。
【0026】
用語「B7−Lポリペプチドスプライス改変体」とは、配列番号2に示されるようなB7−Lポリペプチドのアミノ酸配列のRNA転写物中のイントロン配列の選択的プロセシングによって生成される、核酸分子(通常はRNA)をいう。
【0027】
用語「単離された核酸分子」とは、(1)総核酸が供給源細胞から単離される場合に、天然で一緒に見出されるタンパク質、脂質、炭水化物、または他の物質のうち少なくとも約50パーセントから分離された本発明の核酸分子、(2)「単離された核酸分子」が天然で連結しているポリヌクレオチドの全てまたは一部に連結していない本発明の核酸分子、(3)天然では連結しないポリヌクレオチドに作動可能に連結した本発明の核酸分子、あるいは(4)より大きなポリヌクレオチド配列の一部として、天然には存在しない本発明の核酸分子をいう。好ましくは、本発明の単離された核酸分子は、その天然の環境において見出される任意の他の夾雑核酸分子または他の夾雑物(これらは、ポリペプチド産生における使用、または治療的使用、診断的使用、予防的使用、または研究的使用を妨げる)を実質的に含まない。
【0028】
用語「核酸配列」または「核酸分子」は、DNA配列またはRNA配列をいう。この用語は、DNAおよびRNAの公知の塩基アナログのいずれかから形成される分子を含み、これは、例えば、以下であるがこれらに限定されない:4−アセチルシトシン、8−ヒドロキシ−N6−メチルアデノシン、アジリジニル−シトシン、プソイドイソシトシン(pseudoisocytosine)、5−(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、N6−イソ−ペンテニルアデニン、1−メチルアデニン、1−メチルプソイドウラシル、1−メチルグアニン、1−メチルイノシン、2,2−ジメチル−グアニン、2−メチルアデニン、2−メチルグアニン、3−メチルシトシン、5−メチルシトシン、N6−メチルアデニン、7−メチルグアニン、5−メチルアミノメチルウラシル、5−メトキシアミノ−メチル−2−チオウラシル、β−D−マンノシルキューオシン(β−D−mannosylqueosine)、5'−メトキシカルボニル−メチルウラシル、5−メトキシウラシル、2−メチルチオ−N6−イソペンテニルアデニン、ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−5−オキシ酢酸、オキシブトキソシン(oxybutoxosine)、プソイドウラシル、キューオシン、2−チオシトシン、5−メチル−2−チオウラシル、2−チオウラシル、4−チオウラシル、5−メチルウラシル、N−ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−5−オキシ酢酸、プソイドウラシル、キューオシン、2−チオシトシン、および2,6−ジアミノプリン。
【0029】
用語「ベクター」は、宿主細胞にコード情報を伝達するために使用される任意の分子(例えば、核酸、プラスミド、またはウイルス)をいうために使用される。
用語「発現ベクター」は、宿主細胞の形質転換使用に適切であり、そして挿入された異種核酸配列の発現を、指示および/または制御する核酸配列を含むベクターをいう。発現としては、転写、翻訳、およびRNAスプライシング(イントロンが存在する場合)のようなプロセスが挙げられるがこれらに限定されない。
【0030】
用語「作動可能に連結された」は、隣接配列の配置をいうために本明細書中で、使用され、ここで、このように記載される隣接配列は、その通常の機能を行うように構成または構築される。従って、コード配列に作動可能に連結した隣接配列は、このコード配列の複製、転写および/または翻訳に影響を及ぼし得る。例えば、コード配列は、プロモーターがコード配列の転写を指示し得る場合に、このプロモーターに作動可能に連結される。隣接配列は、これが正確に機能する限り、コード配列と隣接する必要はない。従って、例えば、介在する非翻訳性であるが転写される配列が、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、そしてこのプロモーター配列は、なおこのコード配列に「作動可能に連結」されているとみなされ得る。
【0031】
用語「宿主細胞」は、核酸配列で形質転換されたか、または形質転換され得、次いで目的の選択された遺伝子を発現し得る細胞をいうために使用される。この用語は、選択された遺伝子が存在する限り、子孫が形態学または遺伝子構造において本来の親と同一であろうとなかろうと、親細胞の子孫を含む。
【0032】
用語「B7−Lポリペプチド」とは、配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および関連ポリペプチドをいう。関連ポリペプチドとしては、B7−Lポリペプチドフラグメント、B7−Lポリペプチドオルソログ、B7−Lポリペプチド改変体、およびB7−Lポリペプチド誘導体が挙げられ、これは、配列番号2に示されるポリペプチドの少なくとも1つの活性を有する。B7−Lポリペプチドは、本明細書中で定義されるような成熟ポリペプチドであり得、そしてこれらが調製される方法に依存して、アミノ末端メチオニン残基を有しても有さなくてもよい。
【0033】
用語「B7−Lポリペプチドフラグメント」とは、配列番号2に示されるようなポリペプチドの、アミノ末端(リーダー配列を有するかもしくは有さない)での短縮および/またはカルボキシル末端での短縮を含むポリペプチドをいう。用語「B7−Lポリペプチドフラグメント」はまた、B7−Lポリペプチドオルソログ、B7−Lポリペプチド誘導体、もしくはB7−Lポリペプチド改変体の、アミノ末端での短縮および/もしくはカルボキシル末端での短縮をいうか、またはB7−Lポリペプチド対立遺伝子改変体もしくはB7−Lポリペプチドスプライス改変体によってコードされるポリペプチドのアミノ末端での短縮および/またはカルボキシル末端での短縮をいう。B7−Lポリペプチドフラグメントは、選択的RNAスプライシング、またはインビボプロテアーゼ活性から生じ得る。B7−Lポリペプチドの膜結合形態もまた、本発明によって意図される。好ましい実施形態において、短縮および/または欠失は、約10アミノ酸、または約20アミノ酸、または約50アミノ酸、または約75アミノ酸、または約100アミノ酸、または100より多いアミノ酸を含む。このように生成されるポリペプチドフラグメントは、約25個連続したアミノ酸、または約50アミノ酸、または約75アミノ酸、または約100アミノ酸、または約150アミノ酸または約200アミノ酸を含む。このようなB7−Lポリペプチドフラグメントは、必要に応じて、アミノ末端メチオニン残基を含み得る。このようなフラグメントは、例えば、B7−Lポリペプチドに対する抗体を作製するために使用され得ることが理解される。
【0034】
用語「B7−Lポリペプチドオルソログ」とは、配列番号2に示されるようなB7−Lポリペプチドのアミノ酸配列に対応する、別の種由来のポリペプチドをいう。例えば、マウスおよびヒトのB7−Lポリペプチドは、互いにオルソログであるとみなされる。
【0035】
用語「B7−Lポリペプチド改変体」とは、配列番号2(リーダー配列を有するかまたは有さない)に示されるB7−Lポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、1つ以上のアミノ酸配列の置換、欠失(例えば、内部欠失および/もしくはB7−Lポリペプチドフラグメント)、ならびに/または付加(例えば、内部付加および/もしくはB7−L融合ポリペプチド)を有するアミノ酸配列を含むB7−Lポリペプチドをいう。改変体は、天然に存在(例えば、B7−Lポリペプチド対立遺伝子改変体、B7−Lポリペプチドオルソログ、およびB7−Lポリペプチドスプライス改変体)し得るか、あるいは、人工的に構築され得る。このようなB7−Lポリペプチド改変体は、配列番号1に示されるようなDNA配列からそれに応じて変化するDNA配列を有する、対応する核酸分子から調製され得る。好ましい実施形態において、この改変体は、1〜3、または1〜5、または1〜10、または1〜15、または1〜20、または1〜25、または1〜50、または1〜75、または1〜100、または100より多くのアミノ酸の置換、挿入、付加、および/あるいは欠失を有し、ここで、この置換は、保存的、または非保存的、あるいはそのいずれかの組み合わせであり得る。
【0036】
用語「B7−Lポリペプチド誘導体」は、配列番号2に示されるようなポリペプチド、本明細書中で定義されるような、B7−Lポリペプチドフラグメント、B7−Lポリペプチドオルソログ、またはB7−Lポリペプチド改変体をいい、これらは、化学的に改変されている。用語「B7−Lポリペプチド誘導体」はまた、本明細書中で定義されるような、B7−Lポリペプチド対立遺伝子改変体またはB7−Lポリペプチドスプライス改変体によってコードされるポリペプチドをいい、これらは、化学的に改変されている。
【0037】
用語「成熟B7−Lポリペプチド」は、リーダー配列を欠失したB7−Lポリペプチドをいう。成熟B7−Lポリペプチドはまた、他の改変(例えば、アミノ末端(リーダー配列を有するかまたは有さない)および/またはカルボキシ末端のタンパク質分解性プロセシング、より大きな前駆体からのより小さなポリペプチドの切断、N結合型および/またはO結合型グリコシル化など)を含み得る。例示的な成熟B7−Lポリペプチドは、配列番号3のアミノ酸配列によって示される。
【0038】
用語「B7−L融合ポリペプチド」は、配列番号2に示されるようなポリペプチド、本明細書中で定義されるような、B7−Lポリペプチドフラグメント、B7−Lポリペプチドオルソログ、B7−Lポリペプチド改変体、またはB7−L誘導体のアミノ末端またはカルボキシ末端での、1つ以上のアミノ酸の融合(例えば、異種ペプチドまたはポリペプチド)をいう。用語「B7−L融合ポリペプチド」はまた、本明細書中で定義されるような、B7−Lポリペプチド対立遺伝子改変体またはB7−Lポリペプチドスプライス改変体によってコードされるポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端での、1つ以上のアミノ酸の融合をいう。
【0039】
用語「生物学的に活性なB7−Lポリペプチド」は、配列番号2のアミノ酸配列を含むB7−Lポリペプチドの少なくとも1つの活性特徴を有するB7−Lポリペプチドをいう。さらに、B7−Lポリペプチドは、免疫原として活性であり得る;すなわち、B7−Lポリペプチドは、それに対して抗体が惹起され得る少なくとも1つのエピトープを含む。
【0040】
用語「単離されたポリペプチド」とは、(1)細胞供給源から単離される場合に、天然で一緒に見出されるポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、または他の物質の少なくとも約50%から分離されている本発明のポリペプチド、(2)「単離されたポリペプチド」が天然で連結するポリペプチドの全てまたは一部に(共有結合的または非共有結合的相互作用によって)連結しない、本発明のポリペプチド、(3)天然には連結しないポリペプチドに(共有結合的または非共有結合的相互作用によって)作動可能に連結される、本発明のポリペプチド、あるいは(4)天然には存在しない本発明のポリペプチドをいう。好ましくは、この単離されたポリペプチドは、その天然の環境において見出される任意の他の夾雑ポリペプチドまたは他の夾雑物(これは、その治療的使用、診断的使用、予防的使用、または研究的使用を妨げる)を実質的に含まない。
【0041】
用語「同一性」とは、当該分野で公知のように、配列の比較によって決定される、2つ以上のポリペプチド分子または2つ以上の核酸分子の配列間の関係をいう。当該分野において、「同一性」はまた、場合に応じて、2つ以上のヌクレオチド配列または2つ以上のアミノ酸配列間の一致によって決定されるように、核酸分子またはポリペプチド間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」は、2つ以上の配列のうちのより小さなものと、特定の数理的モデルまたはコンピュータプログラム(すなわち、「アルゴリズム」)によって位置づけられたギャップアラインメント(存在する場合)との間の、同一の一致のパーセントを評価する。
【0042】
用語「類似性」は、「同一性」と同類の概念であるが、「同一性」とは対照的に「類似性」は、同一の一致および保存的置換の一致の両方を含む関係の測定をいう。2つのポリペプチド配列が、例えば10/20個同一のアミノ酸を有し、そして残りが全て非保存的置換である場合、同一性パーセントおよび類似性パーセントは、どちらも50%である。同じ例において、保存的置換が存在する位置がさらに5つ存在する場合、同一性パーセントは50%のままであるが、類似性パーセントは75%(15/20)である。従って、保存的置換が存在する場合、2つのポリペプチド間の類似性の程度は、これらの2つのポリペプチド間のパーセント同一性よりも高い。
【0043】
用語「天然に存在する」または「ネイティブの」は、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞などのような生物学的物質と関連して使用される場合、天然において見出され、そしてヒトによって操作されていない物質をいう。同様に、「天然に存在しない」または「ネイティブではない」は、本明細書中で使用される場合、天然で見出されないか、またはヒトによって構造的に改変もしくは合成されている物質をいう。
【0044】
用語「有効量」および「治療有効量」は、本明細書中に示されるようなB7−Lポリペプチドの1つ以上の生物学的活性の観察可能なレベルを支持するために使用されるB7−LポリペプチドまたはB7−L核酸分子の量をいう。
【0045】
用語「薬学的に受容可能なキャリア」または「生理学的に受容可能なキャリア」は、本明細書中で使用される場合、薬学的組成物としてのB7−Lポリペプチド、B7−L核酸分子、またはB7−L選択的結合因子の送達の達成または増強に適切な1つ以上の処方材料をいう。
【0046】
用語「抗原」とは、選択的結合因子(例えば、抗体)により結合され得、そしてさらに動物において使用されて、その抗原のエピトープに結合し得る抗体を産生し得る分子または分子の一部をいう。抗原は、1つ以上のエピトープを有し得る。
【0047】
用語「選択的結合因子」とは、B7−Lポリペプチドに特異性を有する分子をいう。本明細書中で使用される場合、用語「特異的」および「特異性」とは、選択的結合因子が、ヒトB7−Lポリペプチドに結合し、かつヒト非B7−Lポリペプチドに結合しない能力をいう。しかし、選択的結合因子がまた、配列番号2に示されるようなポリペプチドのオルソログ(すなわち、その種間のバージョン(例えば、マウスB7−LポリペプチドおよびラットB7−Lポリペプチド))に結合し得ることが、理解される。
【0048】
用語「形質導入」とは、通常はファージによる1つの細菌から別の細菌への遺伝子の伝達をいうために使用される。「形質導入」はまた、レトロウイルスによる真核生物細胞配列の獲得および伝達をいう。
【0049】
用語「トランスフェクション」は、細胞による外来DNAまたは外因性DNAの取り込みをいうために使用され、そして細胞は、外因性DNAが細胞膜内に導入された場合には「トランスフェクト」されている。多数のトランスフェクション技術は、当該分野で周知であり、そして本明細書中に開示される。例えば、Grahamら,1973 Virology 52:456;Sambrookら,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratories,1989);Davisら,Basic Methods in Molecular Biology(Elsevier,1986);およびChuら,1981、Gene 13:197を参照のこと。このような技術を使用して、1つ以上の外因性DNA部分を適切な宿主細胞に導入し得る。
【0050】
本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」とは、細胞の遺伝的特徴における変化をいい、そして細胞は、新しいDNAを含有するように改変された場合に形質転換されている。例えば、細胞は、それがそのネイティブな状態から遺伝的に改変される場合に形質転換される。トランスフェクションまたは形質導入に続いて、形質転換DNAは、物理的に細胞の染色体に組み込むことにより細胞のDNAと組換わり得るか、複製されることなしにエピソームエレメントとして一過的に保持され得るか、またはプラスミドとして独立的に複製し得る。DNAが細胞分裂と共に複製される場合に、細胞は、安定に形質転換されたとみなされる。
【0051】
(核酸分子および/またはポリペプチドの関連性)
関連した核酸分子が、配列番号1の核酸分子の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体を含むこと、および上記のヌクレオチド配列のいずれかに相補的である配列を含むことが理解される。関連した核酸分子はまた、配列番号2に示されるポリペプチドと比較して1以上のアミノ酸残基の置換、改変、付加および/または欠失を含むかまたは本質的にこれからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。このような関連したB7−Lポリペプチドは、例えば、1以上のN−連結もしくはO−連結グリコシル化部位の付加および/もしくは欠失、または1以上のシステイン残基の付加および/もしくは欠失を含み得る。
【0052】
関連した核酸分子はまた、配列番号2のB7−Lポリペプチドの少なくとも約25個連続したアミノ酸、または約50個のアミノ酸、または約75個のアミノ酸、または約100個のアミノ酸、または約150個のアミノ酸、または約200個のアミノ酸、または200個より多くのアミノ酸残基のポリペプチドをコードする、B7−L核酸分子のフラグメントを包含する。
【0053】
さらに、関連したB7−L核酸分子はまた、本明細書中で定義したとおりの中程度または高度にストリンジェントな条件下で、配列番号1のB7−L核酸分子、またはポリペプチド(このポリペプチドは、配列番号2、もしくは本明細書中に定義したとおりの核酸フラグメント、もしくは本明細書中に定義したとおりのポリペプチドをコードする核酸フラグメントに示されるアミノ酸配列を含む)をコードする分子の十分に相補的な配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む分子を包含する。ハイブリダイゼーションプローブは、本明細書中に提供されるB7−L配列を用いてcDNAライブラリー、ゲノムDNAライブラリーまたは合成DNAライブラリーを関連した配列についてスクリーニングするために調製され得る。B7−LポリペプチドのDNA配列および/またはアミノ酸配列のうちの、既知配列に対して顕著な同一性を示す領域は、本明細書中に記載されるとおりの配列アラインメントアルゴリズムを用いて容易に決定され、そしてこれらの領域を用いて、スクリーニングのためのプローブを設計し得る。
【0054】
用語「高度にストリンジェントな条件」とは、配列が非常に相補的であるDNA鎖のハイブリダイゼーションを許容し、かつ顕著に不一致のDNAのハイブリダイゼーションを排除するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、イオン強度および変性剤(例えば、ホルムアミド)の濃度によって主に決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄についての「高度にストリンジェントな条件」の例は、65〜68℃での0.015M塩化ナトリウム、0.0015Mクエン酸ナトリウムまたは42℃での0.015M塩化ナトリウム、0.0015Mクエン酸ナトリウムおよび50%ホルムアミドである。Sambrook,FritschおよびManiatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,1989);Andersonら,Nucleic Acid Hybridisation:A Practical Approach 第4章(IRL Press Limited)を参照のこと。
【0055】
よりストリンジェントな条件(例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミドまたは他の変性剤)もまた用いられ得るが、ハイブリダイゼーションの速度が影響される。他の薬剤は、非特異的ハイブリダイゼーションおよび/またはバックグラウンドハイブリダイゼーションを減少させる目的のために、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液中に含まれ得る。例は、0.1%ウシ血清アルブミン、0.1%ポリビニルピロリドン、0.1%ピロリン酸ナトリウム、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム、NaDodSO4、(SDS)、ficoll、デンハルト溶液、超音波処理サケ精子DNA(または別の非相補的DNA)および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた用いられ得る。これらの添加剤の濃度および種類は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は通常、pH6.8〜7.4で実施される;しかし、代表的なイオン強度の条件では、ハイブリダイゼーションの速度は、pHからほぼ独立する。Andersonら,Nucleic Acid Hybridisation:A Practical Approach 第4章(IRL Press Limited)を参照のこと。
【0056】
DNA二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基組成、長さおよび塩基対の不一致程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、これらの変動要因を適応させ、そして異なる配列関連性のDNAがハイブリッドを形成するのを可能にするために当業者によって調整され得る。完全に一致したDNA二重鎖の融解温度は、以下の方程式によって評価され得る:
Tm(℃)=81.5+16.6(log[Na+])+0.41(G+C%)−600/N−0.72(ホルムアミド%)
ここで、Nは、形成される二重鎖の長さであり、[Na+]は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、G+C%は、ハイブリッド中での(グアニン+シトシン)塩基の百分率である。不完全に一致したハイブリッドについては、融解温度は、1%の不一致毎に約1℃下げられる。
【0057】
用語「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するDNA二重鎖が形成され得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、50〜65℃での0.015M塩化ナトリウム、0.0015Mクエン酸ナトリウムまたは37〜50℃での0.015M塩化ナトリウム、0.0015Mクエン酸ナトリウムおよび20%ホルムアミドである。例示として、0.015Mナトリウムイオン中での50℃という「中程度にストリンジェントな条件」によって、約21%の不一致が可能になる。
【0058】
「高度にストリンジェントな条件」と「中程度にストリンジェントな条件」との間に絶対的な区別が存在しないことが当業者によって認識される。例えば、0.015Mナトリウムイオン(ホルムアミドなし)では、完全に一致した長さのDNAの融解温度は、約71℃である。65℃で(同じイオン強度で)の洗浄を用いると、約6%の不一致が可能になる。より関連性の遠い配列を捕獲するために、当業者は、単純に、温度を低くし得るかまたはイオン強度を高くし得る。
【0059】
約20ntまでのオリゴヌクレオチドプローブについての1M NaCl*中での融解温度の良好な評価は、以下によって与えられる:
Tm=A−T塩基対あたり2℃ + G−C塩基対あたり4℃
*6×塩クエン酸ナトリウム(SSC)中でのナトリウムイオン濃度は、1Mである。Suggsら,Developmental Biology Using Purified Genes 683(BrownおよびFox編,1981)を参照のこと。
【0060】
オリゴヌクレオチドについての高度ストリンジェンシー洗浄条件は通常、6×SSC、0.1% SDS中でのそのオリゴヌクレオチドのTmよりも0℃〜5℃低い温度においてである。
【0061】
別の実施形態において、関連する核酸分子は、配列番号1に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも約70パーセント同一であるヌクレオチド配列を含むか、またはこれからなる。好ましい実施形態において、このヌクレオチド配列は、配列番号1に示されるヌクレオチド配列に対して、約75パーセント、または約80パーセント、または約85パーセント、または約90パーセント、または約95パーセント、96パーセント、97パーセント、98パーセントまたは99パーセント同一である。関連する核酸分子は、配列番号2に示されるポリペプチドの少なくとも1つの活性を有するポリペプチドをコードする。
【0062】
核酸配列における差異は、配列番号2のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列の保存的改変および/または非保存的改変を生じ得る。
【0063】
配列番号2のアミノ酸配列に対する保存的改変(およびコードヌクレオチドに対する対応する改変)は、B7−Lポリペプチドに類似した機能的特徴および化学的特徴を有するポリペプチドを生成する。対照的に、B7−Lポリペプチドの機能的特徴および/または化学的特徴における実質的な改変は、配列番号2のアミノ酸配列において置換を選択することによって達成され得、これらの置換は、(a)置換領域における分子骨格の構造(例えば、シートコンフォメーションまたはらせんコンフォメーション)、(b)標的部位における分子の電荷または疎水性、あるいは(c)側鎖の大きさを、維持することに対するその影響において有意に異なる。
【0064】
例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置におけるアミノ酸残基の極性または電荷にほとんど影響がないかまたは全く影響がないような、ネイティブなアミノ酸残基の非ネイティブな残基による置換を含み得る。さらに、ポリペプチド中の任意のネイティブな残基はまた、「アラニンスキャニング変異誘発」に関して以前に記載されたように、アラニンで置換され得る。
【0065】
保存的アミノ酸置換はまた、天然に存在しないアミノ酸残基を含み、これらの残基は、生物系における合成によるよりむしろ化学的ペプチド合成によって代表的に組み込まれる。これらは、ペプチド模倣物、およびアミノ酸部分の他の逆転形態または反転形態を含む。
【0066】
天然に存在する残基は、共通の側鎖の特性に基づいて以下のクラスに分けられ得る:
1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
2)中性親水性:Cys、Ser、Thr;
3)酸性:Asp、Glu;
4)塩基性:Asn、Gln、His、Lys、Arg;
5)鎖の方向に影響を与える残基:Gly、Pro;および
6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
【0067】
例えば、非保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーを、別のクラス由来のメンバーへと交換することを含み得る。このような置換された残基は、非ヒトB7−Lポリペプチドと相同性であるヒトB7−Lポリペプチドの領域、またはこの分子の非相同性領域に、導入され得る。
【0068】
このような変更を作製する場合、アミノ酸のハイドロパシー指標(疎水性親水性指標)が、考慮され得る。各アミノ酸は、その疎水性特徴および荷電特徴に基づいてハイドロパシー指標が割り当てられている。これらのハイドロパシー指標は、イソロイシン(+4.5);バリン(+4.2);ロイシン(+3.8);フェニルアラニン(+2.8);システイン/シスチン(+2.5);メチオニン(+1.9);アラニン(+1.8);グリシン(−0.4);スレオニン(−0.7);セリン(−0.8);トリプトファン(−0.9);チロシン(−1.3);プロリン(−1.6);ヒスチジン(−3.2);グルタミン酸(−3.5);グルタミン(−3.5);アスパラギン酸(−3.5);アスパラギン(−3.5);リジン(−3.9)およびアルギニン(−4.5)である。
【0069】
タンパク質に対して相互作用的な生物学的機能を付与することにおけるハイドロパシーアミノ酸指標の重要性は、当該分野において一般的に理解されている(Kyteら、1982,J.Mol.Biol.157:105−31)。特定のアミノ酸が類似のハイドロパシー指標またはハイドロパシースコアを有する他のアミノ酸で置換され得、そして依然として類似の生物学的活性を維持し得ることが、公知である。ハイドロパシー指標に基づいて変化を起こす際に、ハイドロパシー指標が±2以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±1以内であるものが特に好ましく、そして±0.5以内であるものが、なおより特に好ましい。
【0070】
類似のアミノ酸の置換が親水性に基づいて効果的になされ得る(特に、これによって作製された生物学的機能的に等価なタンパク質またはペプチドが、この場合においてと同様に、免疫学的実施形態における使用に関して考慮される場合)こともまた、当該分野において理解されている。その隣接するアミノ酸の親水性によって支配される、タンパク質の最も大きな局所的平均親水性は、その免疫原性および抗原性に、すなわち、そのタンパク質の生物学的特性に、相関する。
【0071】
以下の親水性の値が、これらのアミノ酸残基に割り当てられている:アルギニン(+3.0);リジン(+3.0);アスパラギン酸(+3.0±1);グルタミン酸(+3.0±1);セリン(+0.3);アスパラギン(+0.2);グルタミン(+0.2);グリシン(0);スレオニン(−0.4);プロリン(−0.5±1);アラニン(−0.5);ヒスチジン(−0.5);システイン(−1.0);メチオニン(−1.3);バリン(−1.5);ロイシン(−1.8);イソロイシン(−1.8);チロシン(−2.3);フェニルアラニン(−2.5);およびトリプトファン(−3.4)。類似の親水性の値に基づいて変化を行う際に、親水性値が±2以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±l以内であるものが特に好ましく、そして±0.5以内であるものが、なおより特に好ましい。一次アミノ酸配列から、エピトープを、親水性に基づいて同定もし得る。これらの領域はまた、「エピトープコア領域」とも呼ばれる。
【0072】
所望のアミノ酸置換(保存的であれ非保存的であれ)は、当業者によって、そのような置換が所望される時点で決定され得る。例えば、アミノ酸置換を使用して、B7−Lポリペプチドの重要な残基を同定し得るし、または本明細書中に記載されるB7−Lポリペプチドの親和性を増加もしくは減少させ得る。例示的なアミノ酸置換は、表Iに記載される。
【0073】
【表1】
当業者は、配列番号2に記載のポリペプチドの適切な改変体を、周知の技術を使用して、決定し得る。生物学的活性を破壊することなく変化され得る分子の適切な領域を同定するために、当業者は、活性のために重要であるとは考えられない領域を標的し得る。例えば、同じ種由来かまたは他の種由来の、類似の活性を有する類似のポリペプチドが既知である場合には、当業者は、B7−Lポリペプチドのアミノ酸配列を、このような類似のポリペプチドと比較し得る。このような比較を用いて、類似のポリペプチド間で保存される分子の残基および部分を同定し得る。このような類似のポリペプチドに対して保存されていない、B7−L分子の領域における変化が、B7−Lポリペプチドの生物学的活性および/または構造に不利に影響を与える可能性はさほどないことが、理解される。当業者はまた、比較的保存された領域においてさえ、活性を維持しながら、天然に存在する残基を化学的に類似するアミノ酸に置換し得ることを知っている(保存的アミノ酸残基置換)。従って、生物学的活性または構造のために重要であり得る領域でさえ、生物学的活性を破壊することなく、またはポリペプチド構造に不利に影響を与えることなく、保存的アミノ酸置換に供され得る。
【0074】
さらに、当業者は、活性または構造のために重要である、類似のポリペプチドにおける残基を同定する、構造−機能研究を再調査し得る。このような比較を考慮して、類似のポリペプチドにおける活性または構造のために重要なアミノ酸残基に対応するB7−Lポリペプチドにおける、アミノ酸残基の重要性を推測し得る。当業者は、B7−Lポリペプチドのこのような推測された重要なアミノ酸残基に代わる化学的に類似するアミノ酸への置換を、選択し得る。
【0075】
当業者はまた、類似のポリペプチドにおける三次元構造、およびその構造に関連するアミノ酸配列を分析し得る。このような情報を考慮して、当業者は、B7−Lポリペプチドのアミノ酸残基のアライメントを、その三次元構造に関して推測し得る。当業者は、そのタンパク質の表面上に存在すると推測されるアミノ酸残基に対する急激な変化を起こさないように、選択し得る。なぜなら、このような残基は、他の分子との重要な相互作用に関与し得るからである。さらに、当業者は、単一のアミノ酸置換を各アミノ酸残基に含む、試験改変体を生成し得る。これらの改変体は、当業者に公知の活性アッセイを使用して、スクリーニングされ得る。このような改変体は、適切な改変体に関する情報を集めるために使用され得る。例えば、特定のアミノ酸残基に対する変化が、破壊された活性、望ましくなく減少した活性、または適切でない活性を生じたことを発見した場合には、このような変化を有する改変体は、回避される。換言すれば、このような慣用的な実験から集めた情報に基づいて、当業者は、さらなる置換が、単独でかまたは他の変異と組み合わせてかのいずれかで回避されるべきであるアミノ酸を、容易に決定し得る。
【0076】
多数の科学刊行物が、二次構造の推定に充てられてきた。Moult,1996,Curr.Opin.Biotechnol.7:422−27;Chouら、1974,Biochemistry 13:222−45;Chouら、1974,Biochemistry 113:211−22;Chouら、1978,Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.47:45−48;Chouら、1978,Ann.Rev.Biochem.47:251−276;およびChouら、1979,Biophys.J.26:367−84を参照のこと。さらに、コンピュータープログラムが、二次構造の推測を補助するために現在利用可能である。二次構造を推測する1つの方法は、相同性モデリングに基づく。例えば、30%よりも大きい配列同一性、または40%よりも大きい配列類似性を有する、2つのポリペプチドまたはタンパク質は、しばしば、類似した構造トポロジーを有する。タンパク質構造データベース(PDB)の近年の成長により、二次構造の推測可能性(ポリペプチド構造またはタンパク質構造内の潜在的な折り畳みの数を含む)の促進がもたらされた。Holmら、1999、Nucleic.Acids.Res.27:244−47を参照のこと。所定のポリペプチドもしくはタンパク質において限定された数の折り畳みが存在すること、および一旦臨界数の構造が決定されると、構造推測が劇的により正確になること、が示唆されている(Brennerら、1997、Curr.Opin.Struct.Biol.7:369−76)。
【0077】
二次構造を推定するさらなる方法としては、「スレッディング(threading)」(Jones,1997,Curr.Opin.Struct.Biol.7:377−87;Sipplら、1996,Structure 4:15−19)、「プロフィール分析」(Bowieら、1991,Science,253:164−70;Gribskovら、1990,Methods Enzymol.183:146−59;Gribskovら、1987,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.84:4355−58)、および「進化学的連鎖(evolutionary linkage)」(Holmら、前出、およびBrennerら、前出を参照のこと)が挙げられる。
【0078】
好ましいB7−Lポリペプチド改変体としては、グリコシル化部位の数および/または型が配列番号2に記載のアミノ酸配列と比較して変更している、グリコシル化改変体が挙げられる。1つの実施形態において、B7−Lポリペプチド改変体は、配列番号2に記載のアミノ酸配列より多いかまたはより少ない数のN結合グリコシル化部位を含む。N結合グリコシル化部位は、配列Asn−X−SerまたはAsn−X−Thrによって特徴付けられ、ここで、Xと印されるアミノ酸残基は、プロリン以外の任意のアミノ酸残基であり得る。この配列を作製するためのアミノ酸残基の置換は、N結合型糖鎖の付加のための潜在的な新たな部位を提供する。あるいは、この配列を排除する置換は、存在するN結合型糖鎖を除去する。1つ以上のN結合グリコシル化部位(代表的には、天然に存在するグリコシル化部位)が排除され、そして1つ以上の新たなN結合部位が作製される、N結合型糖鎖の再配列もまた、提供される。さらなる好ましいB7−L改変体としては、1つ以上のシステイン残基が、配列番号2に記載のアミノ酸配列と比較して欠失しているか、または別のアミノ酸(例えば、セリン)で置換されている、システイン改変体が挙げられる。システイン改変体は、B7−Lポリペプチドが、例えば不溶性の封入体の単離の後に、生物学的に活性な立体構造へとリフォールディングされなければならない場合に、有用である。システイン改変体は、一般に、ネイティブタンパク質より少ないシステイン残基を有し、そして代表的には偶数のシステイン残基を有し、対合していないシステインから生じる相互作用を最小にする。
【0079】
他の実施形態において、B7−Lポリペプチド改変体は、少なくとも1つのアミノ酸挿入を有する配列番号2に記載のアミノ酸配列(ここで、このポリペプチドは、配列番号2に記載のポリペプチドプチDNAの活性を有する)、または少なくとも1つのアミノ酸欠失を有する配列番号2に記載のアミノ酸配列(ここで、このポリペプチドは、配列番号2に記載のポリペプチドの活性を有する)を含む。B7−Lポリペプチド改変体はまた、配列番号2に記載のアミノ酸配列を含み、そしてここで、このポリペプチドは、カルボキシル末端短縮および/またはアミノ末端短縮を有し、そしてさらにここで、このポリペプチドは、配列番号2に記載のポリペプチドの活性を有する。B7−Lポリペプチド改変体はさらに、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、カルボキシル末端短縮、およびアミノ末端短縮からなる群より選択される少なくとも1つの改変を含む配列番号2に記載のアミノ酸配列を含み、そしてここで、このポリペプチドは、配列番号2に記載のポリペプチドの活性を有する。
【0080】
さらなる実施形態において、B7−Lポリペプチド改変体は、配列番号2に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも約70%同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態において、B7−Lポリペプチド改変体は、配列番号2に示されるアミノ酸配列に対して約75パーセント、または約80パーセント、または約85パーセント、または約90パーセント、または約95パーセント、96パーセント、97パーセント、98パーセントまたは99パーセント同一であるアミノ酸配列を含む。B7−Lポリペプチド改変体は、配列番号2に示されるポリペプチドの少なくとも1つの活性を有する。
【0081】
さらに、配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または他のB7−Lポリペプチドは、同種ポリペプチドに融合されてホモダイマーを形成し得るか、あるいは異種ポリペプチドに融合されてヘテロダイマーを形成し得る。異種のペプチドおよびポリペプチドとしては、以下が挙げられるが、それらに限定されない:B7−L融合ポリペプチドの検出および/または単離を可能にするエピトープ;膜貫通レセプタータンパク質またはその部分(例えば、細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン);膜貫通レセプタータンパク質に結合する、リガンドまたはその部分;触媒的に活性である、酵素またはその部分;オリゴマー化を促進するポリペプチドまたはペプチド(例えば、ロイシンジッパードメイン);安定性を増加させるポリペプチドまたはペプチド(例えば、免疫グロブリン定常領域);ならびに配列番号2に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドあるいは他のB7−Lポリペプチドとは異なる治療活性を有する、ポリペプチド。
【0082】
融合は、配列番号2に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは他のB7−Lポリペプチドの、アミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかにおいて、なされ得る。融合は、リンカー分子もアダプター分子も用いずに直接であっても、リンカー分子もしくはアダプター分子を介してであってもよい。リンカー分子またはアダプター分子は、1つ以上のアミノ酸残基であり得、代表的に、約20〜約50アミノ酸残基であり得る。リンカー分子またはアダプター分子はまた、融合した部分の分離を可能にするために、DNA制限エンドヌクレアーゼまたはプロテアーゼに対する切断部位を有して設計され得る。一旦構築されると、融合ポリペプチドは、本明細書中に記載の方法に従って誘導体化され得ることが、理解される。
【0083】
本発明のさらなる実施形態において、配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは他のB7−Lポリペプチドは、ヒトIgGのFc領域の1つ以上のドメインに融合される。抗体は、以下の2つの機能的に独立した部分を含む;抗原と結合する「Fab」として公知の可変ドメイン、ならびに補体活性化および食作用細胞による攻撃のようなエフェクター機能に関与する、「Fc」として公知の定常ドメイン。Fcは、長い血清半減期を有し、一方でFabは、短寿命である。Caponら、1989,Nature 337:525−31。治療タンパク質と一緒に構築される場合には、Fcドメインは、より長い半減期を提供し得るか、またはFcレセプター結合、プロテインA結合、補体結合のような機能、および恐らく、胎盤移入のような機能さえも、組み込み得る(同書)。表IIは、当該分野において公知の特定のFc融合物の使用を要約する。
【0084】
【表2】
一例において、ヒトIgGのヒンジ領域、CH2領域、およびCH3領域が、当業者に公知の方法を使用して、B7−Lポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかにおいて、融合され得る。別の例において、ヒトIgGのヒンジ領域、CH2領域、およびCH3領域は、B7−Lポリペプチドフラグメント(例えば、B7−Lポリペプチドの推定細胞外部分)のアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかにおいて、融合され得る。
【0085】
得られるB7−L融合ポリペプチドは、プロテインAアフィニティーカラムの使用によって、精製され得る。Fc領域に融合したペプチドおよびタンパク質は、融合していない対応物より実質的に長いインビボでの半減期を示すことが見出された。また、Fc領域への融合によって、融合ポリペプチドの二量体化/多量体化が可能になる。このFc領域は、天然に存在するFc領域であってもよいし、または治療品質、循環時間、もしくは減少した凝集のような、特定の品質を改善するよう変更されてもよい。
【0086】
関連する核酸分子およびポリペプチドの同一性および類似性は、公知の方法によって容易に計算され得る。このような方法としては、Computational Molecular Biology(A.M.Lesk編、Oxford University Press 1988);Biocomputing:Informatics and Genome Projects(D.W.Smith編、Academic Press 1993);Computer Analysis of Sequence Data(Part 1,A.M.GriffinおよびH.G.Griffin編、Humana Press 1994);G.von Heinle,Sequence Analysis in Molecular Biology(Academic Press 1987);Sequence Analysis Primer(M.GribskovおよびJ.Devereux編、M.Stockton Press 1991);ならびにCarilloら、1988,SIAM J.Applied Math.,48:1073に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【0087】
同一性および/または類似性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間での最大の適合を生じるように、設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公に利用可能なコンピュータープログラムにおいて記載されている。2つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータープログラム方法としては、GCGプログラムパッケージ(GAP(Devereuxら、1984,Nucleic Acids Res.12:387;Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,WI)、BLASTP、BLASTN、およびFASTA(Altschulら、1990,J.Mol.Biol.215:403−10)を含む)が挙げられるが、これらに限定されない。BLASTXプログラムは、National Center for Biotechnology Information(NCBI)および他の供給源(Altschulら、BLAST Manual(NCB NLM NIH,Bethesda,MD);Altschulら、1990、前出)から公に利用可能である。周知のSmith Watermanアルゴリズムもまた、同一性を決定するために使用され得る。
【0088】
2つのアミノ酸配列を整列させるための特定のアライメントスキームは、これら2つの配列の短い領域のみの適合を生じ得、そしてこの小さな整列領域は、その2つの全長配列間に有意な関連がない場合でさえも、非常に高い配列同一性を有し得る。従って、好ましい実施形態において、選択されたアライメント方法(GAPプログラム)は、本願ポリペプチドのうちの少なくとも50個連続するアミノ酸にわたる整列を生じる。
【0089】
例えば、コンピューターアルゴリズムGAP(Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,WI)を使用して、配列同一性の百分率が決定されるべき2つのポリペプチドが、それらのそれぞれのアミノ酸の最適な適合(このアルゴリズムによって決定される「適合したスパン」)のために、整列される。ギャップオープニングペナルティー(gap opening penalty)(これは、平均対角の3倍として計算される:「平均対角」とは、使用される比較行列(comparison matrix)の対角の平均である;「対角」とは、特定の比較行列によって各完全なアミノ酸適合に対して割り当てられたスコアまたは数である)およびギャップエクステンションペナルティー(gap extension penalty)(これは通常、キャップオープニングペナルティーの0.1倍である)、ならびにPAM 250またはBLOSUM 62のような比較行列が、このアルゴリズムと組み合わせて使用される。標準的な比較行列もまた、このアルゴリズムによって使用される(Dayhoffら、5 Atlas of Protein Sequence and Structure(補遺3 1978)(PAM250比較行列);Henikoffら、1992,Proc.Natl.Acad.Sci USA 89:10915−19(BLOSUM 62比較行列)を参照のこと)。
【0090】
ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメータとしては、以下が挙げられる:
アルゴリズム:NeedlemanおよびWunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443−53;
比較行列:BLOSUM 62(Henikoffら、前出);
ギャップペナルティー:12
ギャップ長さペナルティー(Gap Length Penalty):4
類似性の閾値(Threshold of Similarity):0
このGAPプログラムは、上記パラメータを用いて有用である。上記パラメータは、GAPアルゴリズムを用いるポリペプチド比較(末端ギャップに対してはペナルティーがないこととともに)のためのデフォルトパラメータである。
【0091】
核酸分子配列比較のための好ましいパラメータとしては、以下が挙げられる:
アルゴリズム:NeedlemanおよびWunsch,前出;
比較行列:適合=+10,非適合=0
ギャップペナルティー:50
ギャップ長さペナルティー:3
このGAPプログラムはまた、上記パラメータを用いて有用である。上記パラメータは、核酸分子比較のためのデフォルトパラメータである。
【0092】
Program Manual,Wisconsin Package,Version 9,September,1997に記載されるものを含む、他の例示的なアルゴリズム、ギャップオープニングペナルティー、ギャップエクステンションペナルティー、比較行列、および類似性の閾値が使用され得る。なされるべき特定の選択は、当業者に明らかであり、そしてなされるべき特定の比較(例えば、DNA対DNA、タンパク質対タンパク質、タンパク質対DNA);ならびにさらに、その比較が所定の配列対の間(この場合には、GAPまたはBestFitが一般的に好ましい)であるか、1つの配列と大きな配列データベースとの間(この場合には、FASTAまたはBLASTAが好ましい)であるかに、依存する。
【0093】
(核酸分子)
B7−Lポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子は、種々の様式(化学合成、cDNAもしくはゲノムのライブラリーのスクリーニング、発現ライブラリースクリーニング、および/またはcDNAのPCR増幅が挙げられるが、これらに限定されない)で容易に得られ得る。
【0094】
本明細書中において使用される組換えDNA法は、一般に、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)および/またはCurrent Protocols in Molecular Biology(Ausubelら編、Green Publishers Inc.and Wiley and Sons 1994)に記載されている方法である。本発明は、本明細書中に記載されているような核酸分子、およびこのような分子を得るための方法を提供する。
【0095】
B7−Lポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子が1つの種から同定された場合には、この遺伝子の全てまたは一部を、オルソログ(ortholog)または同じ種由来の関連遺伝子を同定するためのプローブとして使用し得る。このプローブまたはプライマーを使用して、B7−Lポリペプチドを発現すると考えられる種々の組織供給源由来のcDNAライブラリーをスクリーニングし得る。さらに、配列番号1に記載されるような配列を有する核酸分子の部分または全てを使用して、ゲノムライブラリーをスクリーニングし、B7−Lポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子を同定および単離し得る。代表的に、中程度または高度のストリンジェンシーの条件が、スクリーニングのために使用されて、このスクリーニングから得られる偽陽性の数を最少にする。
【0096】
B7−Lポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子はまた、発現されたタンパク質の特性に基づく陽性クローンの検出を使用する発現クローニングによって、同定され得る。代表的に、核酸ライブラリーは、抗体または他の結合パートナー(例えば、レセプターまたはリガンド)を、宿主細胞表面において発現および提示された、クローニングされたタンパク質に結合させることによって、スクリーニングされる。抗体または結合パートナーは、所望のクローンを発現する細胞を同定するために、検出可能な標識で改変される。
【0097】
以下に記載される説明に従い実施される組換え発現技術に従って、これらのポリヌクレオチドを産生し得、そしてコードされたポリペプチドを発現させ得る。例えば、B7−Lポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列を適切なベクターに挿入することによって、当業者は、多量の所望されるヌクレオチド配列を容易に生成し得る。次いで、これらの配列を使用して、検出プローブまたは増幅プライマーを生成し得る。あるいは、B7−Lポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、発現ベクターに挿入し得る。発現ベクターを適切な宿主に導入することによって、コードされたB7−Lポリペプチドが、多量に生成され得る。
【0098】
適切な核酸配列を得るための別の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)である。この方法において、cDNAは、酵素逆転写酵素を使用して、ポリ(A)+RNAまたは全RNAから調製される。次いで、2つのプライマー(代表的には、B7−Lポリペプチドのアミノ酸配列をコードするcDNAの2つの別個の領域に対して相補的である)が、TaqポリメラーゼのようなポリメラーゼとともにこのcDNAに添加され、そしてこのポリメラーゼが、これら2つのプライマー間のcDNA領域を増幅する。
【0099】
B7−Lポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を調製する別の手段は、Engelsら、1989,Angew.Chem.Intl.第28版:716−34によって記載されるような、当業者に周知の方法を使用する、化学合成である。これらの方法としては、とりわけ、核酸合成のためのホスホトリエステル、ホスホルアミダイト、およびH−ホスホネート方法が挙げられる。このような化学合成のために好ましい方法は、標準的なホスホルアミダイト化学を使用する、ポリマーにより支持される合成である。代表的に、B7−Lポリペプチドのアミノ酸配列をコードするDNAは、数百ヌクレオチド長である。約100ヌクレオチドより長い核酸は、これらの方法を使用して、いくつかのフラグメントとして合成され得る。次いで、これらのフラグメントが一緒に連結されて、B7−L遺伝子の全長ヌクレオチド配列を形成し得る。通常、このポリペプチドのアミノ末端をコードするDNAフラグメントは、ATG(これは、メチオニン残基をコードする)を有する。このメチオニンは、宿主細胞において産生されるポリペプチドがその細胞から分泌されるよう設計されているか否かに依存して、B7−Lポリペプチドの成熟形態で存在してもそうでなくてもよい。当業者に公知の他の方法が、同様に使用され得る。
【0100】
特定の実施形態において、核酸改変体は、所定の宿主細胞におけるB7−Lポリペプチドの最適な発現のために変更されたコドンを含む。特定のコドン変更は、発現のために選択されるB7−Lポリペプチドおよび宿主細胞に依存する。このような「コドン最適化」は、種々の方法によって(例えば、所定の宿主細胞において高度に発現される遺伝子において使用されるのに好ましいコドンを選択することによって)実行され得る。高度に発現された細菌遺伝子のコドン優先度(codon preference)についての「Eco_high.Cod」のようなコドン頻度表を組み込むコンピューターアルゴリズムが使用され得、そしてUniversity of Wisconsin Package Version 9.0(Genetics Computer Group,Madison,WI)によって提供される。他の有用なコドン頻度表としては、「Celegans_high.cod」、「Celegans_low.cod」、「Drosophila_high.cod」、「Human_high.cod」、「Maize_high.cod」、および「Yeast_high.cod.」が挙げられる。
【0101】
いくつかの場合において、B7−Lポリペプチド改変体をコードする核酸分子を調製することが所望され得る。改変体をコードする核酸分子は、プライマーが所望の点変異を有する部位特異的変異誘発、PCR増幅、または他の適切な方法を使用して生成され得る(変異誘発技術の説明に関しては、Sambrookら、前出、およびAusubelら、前出を参照のこと)。Engelsら、前出によって記載される方法を使用する化学合成もまた、このような改変体を調製するために使用され得る。当業者に公知の他の方法が、同様に使用され得る。
【0102】
(ベクターおよび宿主細胞)
B7−Lポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を、標準的な連結技術を使用して適切な発現ベクターに挿入する。ベクターは、代表的に、使用される特定の宿主細胞において機能的であるように選択される(すなわち、ベクターは、遺伝子の増幅および/または遺伝子の発現が生じ得るように、宿主細胞機構と適合性である)。B7−Lポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子は、原核生物宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫(バキュロウイルス系)宿主細胞および/または真核生物宿主細胞において増幅/発現され得る。宿主細胞の選択は、B7−Lポリペプチドが翻訳後修飾(例えば、グリコシル化および/またはリン酸化)されるか否かに一部依存する。その場合、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞、または哺乳動物宿主細胞が好ましい。発現ベクターの総説については、Meth.Enz.,第185巻(D.V.Goeddel編,Academic Press 1990)を参照のこと。
【0103】
代表的に、任意の宿主細胞に使用される発現ベクターは、プラスミド維持のための配列ならびに外来性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含む。このような配列(集合的に、「隣接配列」という)は、特定の実施形態において、代表的に、以下のヌクレオチド配列の1つ以上を含む:プロモーター、1つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナーおよびアクセプタースプライス部位を含む完全なイントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択可能マーカーエレメント。これらの配列のそれぞれが、以下に議論される。
【0104】
必要に応じて、ベクターは、「タグ」コード配列(すなわち、B7−Lポリペプチドコード配列の5’末端または3’末端に配置されるオリゴヌクレオチド分子)を含み得;このオリゴヌクレオチド配列は、ポリHis(例えば、ヘキサHis)、または別の「タグ」(例えば、FLAG、HA(赤血球凝集素インフルエンザウイルス)またはmyc(これに対して、市販の抗体が存在する)をコードする。このタグは、代表的には、ポリペプチドの発現の際にポリペプチドに融合され、そして宿主細胞からの、B7−Lポリペプチドのアフィニティー精製のための手段として役立ち得る。アフィニティー精製は、例えば、アフィニティーマトリクスとして、タグに対する抗体を使用するカラムクロマトグラフィーによって達成され得る。必要に応じて、タグは、引き続いて、切断のために特定のペプチダーゼを使用するような、種々の手段によって、精製されたB7−Lポリペプチドから除去され得る。
【0105】
隣接配列は、同種(すなわち、宿主細胞と同じ種および/または株由来)であり得るか、異種(すなわち、宿主細胞種または株以外の種由来)であり得るか、ハイブリッド(すなわち、1つより多くの供給源由来の隣接配列の組み合わせ)であり得るか、または合成であり得るか、あるいは隣接配列は、B7−Lポリペプチド発現を調節するために通常機能するネイティブな配列であり得る。従って、隣接配列の供給源は、任意の原核生物または真核生物、任意の脊椎生物または無脊椎生物、または任意の植物であり得るが、但し、これは、隣接配列が、この宿主細胞の機構において機能的であり、そしてこの宿主細胞の機構によって活性化され得る場合である。
【0106】
本発明のベクターに有用な隣接配列は、当該分野において周知である任意のいくつかの方法によって得られ得る。代表的には、B7−L遺伝子の隣接配列以外の、本発明で有用な隣接配列は、マッピングおよび/または制限エンドヌクレアーゼ消化によって以前に同定されており、従って、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して、適切な組織供給源から単離され得る。いくつかの場合において、隣接配列の全長ヌクレオチド配列は公知であり得る。ここで、隣接配列は、核酸合成またはクローニングのために本明細書中で記載される方法を使用して合成され得る。
【0107】
隣接配列の全てまたは一部のみが既知である場合、これは、PCRを使用して、ならびに/あるいは適切なオリゴヌクレオチドおよび/または同種もしくは別の種由来の隣接配列フラグメントを用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られ得る。隣接配列が公知ではない場合、隣接配列を含むDNAのフラグメントは、例えば、コード配列または別の遺伝子さえも含み得る大きなDNA片から単離され得る。単離は、適切なDNAフラグメントを生成するための制限エンドヌクレアーゼ消化、続くアガロースゲル精製を使用する単離、Qiagen(登録商標)カラムクロマトグラフィー(Chatsworth、CA)、または当業者に公知の他の方法によって達成され得る。この目的を達成するための適切な酵素の選択は、当業者に容易に明らかである。
【0108】
複製起点は、代表的に、市販の原核生物発現ベクターの一部であり、この起点は、宿主細胞におけるベクターの増幅を補助する。特定のコピー数までのベクターの増幅は、いくつかの場合において、B7−Lポリペプチドの最適な発現のために重要であり得る。選択されたベクターが複製起点部位を含まない場合、複製起点は、既知の配列に基づいて化学的に合成され得、そしてベクターに連結され得る。例えば、プラスミドpBR322(New England Biolabs,Beverly,MA)からの複製起点は、大部分のグラム陰性細菌に適切であり、そして種々の起源(例えば、SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス(VSV)、またはHPVもしくはBPVのようなパピローマウイルス)は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般的に、複製起点の成分は、哺乳動物発現ベクターには必要ない(例えば、SV40起源は、それが初期プロモーターを含むという理由のみによって、しばしば使用されている)。
【0109】
転写終結配列は、代表的にポリペプチドコード領域の3’ 末端に配置され、そして転写を終結させるのに役立つ。通常、原核生物細胞における転写終結配列は、G−Cリッチフラグメントと、それに続くポリT配列である。この配列はライブラリーから容易にクローン化されるか、またはさらにベクターの一部として市販されているが、これはまた、本明細書中に記載された核酸合成のための方法を使用して容易に合成され得る。
【0110】
選択マーカー遺伝子エレメントは、選択培養培地において増殖される宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。代表的な選択マーカー遺伝子は、(a)原核生物宿主細胞に対して、抗生物質または他の毒素(例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシン)に対する耐性を与えるか;(b)細胞の栄養要求性の欠損を補うか;あるいは、(c)複合培地から入手可能でない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。好ましい選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。ネオマイシン耐性遺伝子もまた、原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞における選択のために使用され得る。
【0111】
他の選択遺伝子は、発現される遺伝子を増幅するために使用され得る。増幅は、増殖に重要なタンパク質の産生のために大いに要求されている遺伝子が、組換え細胞の継続世代の染色体内でタンデムに反復されているプロセスである。哺乳動物細胞に対する適切な選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)およびチミジンキナーゼが挙げられる。哺乳動物細胞の形質転換体は、選択圧下に置かれ、ここで、形質転換体のみが固有に、ベクターに存在する選択遺伝子によって生存するように適応される。培地中の選択因子の濃度を連続的に変化させ、それによって選択遺伝子とB7−LポリペプチドをコードするDNAとの両方の増幅を導く条件下で、形質転換された細胞を培養することによって、選択圧を加える。結果として、増加した量のB7−Lポリペプチドが、増幅されたDNAから合成される。
【0112】
リボソーム結合部位は、通常、mRNAの翻訳開始に必要であり、そしてShine−Dalgarno配列(原核性物)またはKozak配列(真核生物)によって特徴付けられる。このエレメントは、代表的に、発現されるB7−Lポリペプチドのプロモーターに対して3’側およびコード配列に対して5’側に配置される。Shine−Dalgarno配列は、可変であるが、代表的には、ポリプリン(すなわち、高いA−G含有量を有する)である。多くのShine−Dalgarno配列は、同定されており、これらのそれぞれが、本明細書中に記載の方法を使用して、容易に合成され得、原核生物ベクターにおいて使用され得る。
【0113】
リーダー配列、またはシグナル配列は、宿主細胞の外にB7−Lポリペプチドを指向させるために使用され得る。代表的には、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、B7−L核酸分子のコード領域に位置するか、または直接B7−Lポリペプチドコード領域の5’側に位置する。多くのシグナル配列が同定されており、選択された宿主細胞において機能的である任意のシグナル配列が、B7−L核酸分子と組み合わせて使用され得る。従って、シグナル配列は、B7−L核酸分子に対して同種(天然に存在する)または異種であり得る。さらに、シグナル配列は、本明細書中に記載される方法を使用して化学的に合成され得る。大半の場合、シグナルペプチドの存在による宿主細胞からのB7−Lポリペプチドの分泌は、分泌されたB7−Lポリペプチドからのシグナルペプチドの除去を生じる。シグナル配列は、ベクターの成分であり得るか、またはベクターに挿入されたB7−L核酸分子の一部であり得る。
【0114】
B7−Lポリペプチドコード領域に結合されたネイティブなB7−Lポリペプチドシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、または、B7−Lポリペプチドコード領域に結合された異種シグナル配列をコードするヌクレオチド配列のいずれかの使用は本発明の範囲内に含まれる。選択された異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識され、プロセスされる(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものであるべきである。ネイティブなB7−Lポリペプチドシグナル配列を認識せず、そしてプロセスもしない原核生物宿主細胞について、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、または熱安定エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。酵母分泌のために、ネイティブなB7−Lポリペプチドシグナル配列は、酵母インベルターゼ、α因子、または酸ホスファターゼリーダーによって置換され得る。哺乳動物細胞発現において、ネイティブなシグナル配列で十分であるが、他の哺乳動物シグナル配列が適切であり得る。
【0115】
真核生物宿主細胞発現系においてグリコシル化が所望されるような、いくつかの場合において、グリコシル化または収量を改善するために種々のプレ配列(presequence)が操作され得る。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変更し得るかまたはプロ配列(pro−sequence)を加え得、これはまた、グリコシル化に影響し得る。最終タンパク質産物は、(成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対して)1位に、発現に付随する1つ以上のさらなるアミノ酸を有し得、これは、完全には除去されない可能性がある。例えば、最終のタンパク質産物は、アミノ末端に結合される、ペプチダーゼ切断部位において見出される1つまたは2つのアミノ酸残基を有し得る。あるいは、いくつかの酵素切断部位の使用は、酵素が成熟ポリペプチド内のこのような領域で切断する場合に所望のB7−Lポリペプチドのわずかに短縮された(truncate)形態を生じ得る。
【0116】
多くの場合において、核酸分子の転写は、ベクター内の1つ以上のイントロンの存在によって増加する;これは、ポリペプチドが真核生物宿主細胞(特に、哺乳動物宿主細胞)において産生される場合に特に当てはまる。使用されるイントロンは、特に使用される遺伝子が全長ゲノム配列またはそのフラグメントである場合にB7−L遺伝子内に天然に存在するものであり得る。イントロンが遺伝子内に天然に存在しない場合(大部分のcDNAについて)、イントロンは、別の供給源から得られ得る。隣接配列およびB7−L遺伝子に対してイントロンの位置は、イントロンが有効に転写されなければならないので、一般的に重要である。従って、B7−L cDNA分子が転写される場合、イントロンの好ましい位置は、転写開始部位に対して3’側であり、かつポリ−A転写終止配列に対して5’側である。好ましくは、イントロン(単数または複数)は、コード配列を妨害しないように、cDNAの1方の側または他方の側(すなわち、5’側または3’側)に配置される。任意の供給源(ウイルス、原核生物および真核生物(植物または動物)を含む)由来の任意のイントロンを使用して本発明を実行し得るが、但し、これは、このイントロンが、挿入される宿主細胞に適合性である場合である。合成イントロンもまたここに含まれる。必要に応じて、1つより多くのイントロンがベクター内で使用され得る。
【0117】
本発明の発現ベクターおよびクローニングベクターは、代表的には、宿主生物によって認識され、B7−Lポリペプチドをコードする分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する、構造遺伝子(一般的に、約100〜1000bp)の開始コドンに対して上流(すなわち、5’側)に配置される非転写配列である。プロモーターは、従来、2つのクラス(誘導プロモーターおよび構成プロモーター)のうち1つに分類される。誘導プロモーターは、培養条件におけるいくつかの変化(例えば、栄養の存在または非存在、あるいは温度の変化)に応じてそれらの制御下で、DNAからの増加したレベルの転写を開始する。他方、構成プロモーターは、連続的な遺伝子産物の産生を開始する;すなわち、遺伝子発現は、ほとんど制御されないかまたは全く制御されない。多数のプロモーター(種々の潜在的な宿主細胞によって認識される)が周知である。適切なプロモーターは、供給源のDNAからプロモーターを制限酵素消化によって除去し、そして所望のプロモーター配列をベクターに挿入することによって、B7−LポリペプチドをコードするDNAに作動可能に連結される。ネイティブなB7−Lプロモーター配列は、B7−L核酸分子の増幅および/または発現に指向させるために使用され得る。しかし、ネイティブなプロモーターと比較して高度に転写および発現されたタンパク質のより高い収量が可能である場合、および使用のために選択された宿主細胞系と適合性である場合、異種プロモーターが好ましい。
【0118】
原核生物宿主との使用に適切なプロモーターとしては、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系;アルカリホスファターゼ;トリプトファン(trp)プロモーター系;およびハイブリッドプロモーター(例えば、tacプロモーター)が挙げられる。他の公知の細菌プロモーターもまた、適切である。これらの配列は、公開されており、これにより、当業者は、任意の有用な制限部位を供給するのに必要とされる場合にリンカーまたはアダプターを使用して、所望のDNAにそれらの配列を連結し得る。
【0119】
酵母宿主との使用に適切なプロモーターはまた、当該分野において周知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターと共に有利に使用される。哺乳動物宿主細胞との使用に適切なプロモーターは周知であり、限定しないが、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス(例えば、Adenovirus 2)、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはシミアンウイルス40(SV40)のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーターが挙げられる。他の適切な哺乳動物プロモーターとしては、異種哺乳動物プロモーター(例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーター)が挙げられる。
【0120】
B7−L遺伝子発現を制御する際に重要であり得るさらなるプロモーターとしては、限定しないが、以下が挙げられる:SV40初期プロモータ領域(Bernoist and Chambon,1981,Nature 290:304−10);CMVプロモーター;ラウス肉腫ウイルスの3’側の長い末端反復に含まれるプロモーター(Yamamotoら,1980,Cell 22 :787−97);ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:1444−45);メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinsterら,1982,Nature 296:39−42);β−ラクタマーゼプロモーターのような原核生物発現ベクター(Villa−Kamaroffら,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,75:3727−31);またはtacプロモーター(DeBoerら,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,80:21−25)。組織特異性を示し、そしてトランスジェニック動物において利用されている、以下の動物転写制御領域もまた重要である:膵臓腺房細胞において活性なエラスターゼI遺伝子制御領域(Swiftら,1984,Cell 38:639−46;Ornitzら,1986,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50:399−409(1986);MacDonald,1987,Hepatology 7:425−515);膵臓β細胞において活性なインシュリン遺伝子制御領域(Hanahan,1985,Nature 315:115−22);リンパ系細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域(Grosschedlら,1984,Cell 38:647−58;Adamesら,1985,Nature 318:533−38;Alexanderら,1987,Mol.Cell.Biol.,7:1436−44);精巣、乳房、リンパ系細胞、および肥満細胞において活性なマウス乳房腫瘍ウイルス制御領域(Lederら,1986,Cell 45:485−95);肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域(Pinkertら,1987,Genes and Devel.1:268−76);肝臓において活性なα−フェトプロテイン遺伝子制御領域(Krumlaufら,1985,Mol.Cell.Biol.,5:1639−48;Hammerら,1987,Science 235:53−58);肝臓において活性なα1−抗トリプシン遺伝子制御領域(Kelseyら,1987,Genes and Devel.1:161−71);骨髄性細胞において活性なβ−グロビン遺伝子制御領域(Mogramら,1985,Nature 315:338−40;Kolliasら,1986,Cell 46:89−94);脳の稀突起神経膠細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域(Readheadら,1987,Cell 48:703−12);骨格筋において活性なミオシン軽鎖−2遺伝子制御領域(Sani,1985,Nature 314:283−86);ならびに視床下部において活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域(Masonら,1986,Science 234:1372−78)。
【0121】
エンハンサー配列は、より高等な真核生物によって本発明のB7−LポリペプチドをコードするDNAの転写を増加するように、ベクターに挿入され得る。エンハンサーは、転写を増加させるようにプロモーターに作用する、通常約10〜300bpの長さのDNAのシス作用エレメントである。エンハンサーは、相対的な方向および位置に依存しない。これらは、転写ユニットに対して5’側および3’側に見出される。哺乳動物遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が公知である(例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインシュリン)。しかし、代表的には、ウイルス由来のエンハンサーが、使用される。SV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーターの活性化についての代表的な増強エレメントである。エンハンサーは、B7−L核酸分子に対して5’位または3’位でベクターにスプライシングされ得るが、代表的には、プロモーターから5’位側に配置される。
【0122】
本発明の発現ベクターは、市販のベクターのような開始ベクターから構築され得る。このようなベクターは、全ての所望な隣接配列を含んでも良いし、含まなくても良い。本明細書中に記載される隣接配列の1つ以上がまだベクター内にない場合、これらは、個々に得られ得、ベクターに連結され得る。隣接配列のそれぞれを得るために使用される方法は、当業者に周知である。
【0123】
本発明を実施するために好ましいベクターは、細菌宿主細胞、昆虫宿主細胞、および哺乳動物宿主細胞と適合性のベクターである。このようなベクターとしては、特に、pCRII、pCR3、およびpcDNA3.1(Invitrogen、San Diego、CA)、pBSII(Stratagene、La Jolla、CA)、pET15(Novagen、Madison、WI)、pGEX(Pharmacia Biotech、Piscataway、NJ)、pEGFP−N2(Clontech、Palo Alto、CA)、pETL(BlueBacII、Invitrogen)、pDSR−α(国際公開番号WO 90/14363)ならびにpFastBacDual(Gibco−BRL、Grand Island、NY)が挙げられる。
【0124】
さらなる適切なベクターとしては、限定しないが、コスミド、プラスミド、または改変ウイルスが挙げられるが、これらのベクター系は、選択された宿主細胞と適合性でなければならないことが理解される。このようなベクターとしては、限定しないが、Bluescript(登録商標)プラスミド誘導体(高コピー数ColEl−ベースのファージミド、Stratagene Cloning Systems,La Jolla CA)、Taq増幅PCR産物をクローニングするために設計されたPCRクローニングプラスミド(例えば、TOPOTM TA Cloning(登録商標)Kit、およびPCR2.1(登録商標)プラスミド誘導体;Invitrogen)、ならびに哺乳動物ベクター、酵母ベクターまたはバキュロウイルス発現系のようなウイルスベクター(pBacPAKプラスミド誘導体、Clontech)が挙げられる。
【0125】
ベクターが構築され、そしてB7−Lポリペプチドをコードする核酸分子がベクターの適切な部位に挿入された後に、完全なベクターが増幅発現および/またはポリペプチド発現に適切な宿主細胞に挿入され得る。選択された宿主細胞への、B7−Lポリペプチドに対する発現ベクターの形質転換は、トランスフェクション、感染、塩化カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、DEAE−デキストラン法、または他の公知の技術のような方法を含む周知の方法によって達成され得る。選択される方法は、一部、使用される宿主細胞の種類と相関関係にある。これらの方法および他の適切な方法は、当業者に周知であり、例えば、Sambrookら(前出)に記載される。
【0126】
宿主細胞は、原核生物宿主細胞(例えば、E.coli)または真核生物宿主細胞(例えば、酵母細胞、昆虫細胞、または脊椎動物細胞)であり得る。宿主細胞は、適切な条件下で培養される場合、B7−Lポリペプチドを合成し、このポリペプチドは、続いて、培養培地から(宿主細胞がそのポリペプチドを培地に分泌する場合)収集され得るか、直接そのポリペプチドを産生する宿主細胞から収集される(そのポリペプチドが分泌されない場合)。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性に望ましいかまたは必要なポリペプチド修飾(例えば、グリコシル化またはリン酸化)、および生物学的に活性な分子に折り畳まれる容易さなどの種々の因子に依存する。
【0127】
多くの適切な宿主細胞が当該分野において公知であり、多くが、American Type Culture Collection(ATCC),Manassas,VAから入手可能である。例としては、限定しないが、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、CHO DHFR(−)細胞(Urlaubら,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:4216−20)、ヒト胚性腎臓(HEK)293または293T細胞、あるいは3T3細胞のような哺乳動物細胞が挙げられる。適切な哺乳動物宿主細胞の選択および形質転換、培養、増幅、スクリーニング、産物生成、および精製のための方法が当該分野において公知である。他の適切な哺乳動物細胞株は、サルCOS−1およびCOS−7細胞株、およびCV−1細胞株である。さらなる例示的な哺乳動物宿主細胞としては、霊長動物細胞株およびげっ歯類動物細胞株(形質転換細胞株を含む)が挙げられる。正常な二倍体細胞、初代組織のインビトロ培養物から誘導される細胞系統、ならびに初代外植片もまた適切である。候補細胞は、選択遺伝子を遺伝子型的に欠損し得るか、または優先的に作用する選択遺伝子を含み得る。他の適切な哺乳動物細胞株としては、限定しないが、マウス神経芽細胞腫N2A細胞、HeLa、マウスL−929細胞、Swissから誘導された3T3株、Balb−cまたはNIHマウス、BHKまたはHaKハムスター細胞株が挙げられる。これらの細胞株のそれぞれは、タンパク質発現の当業者に公知であり入手可能である。
【0128】
同様に、細菌細胞は、本発明に適切な宿主細胞として有用である。例えば、E.coliの種々の株(例えば、HB101、DH5α、DH10、およびMC1061)は、生物工学の分野において宿主細胞として周知である。B.subtilis、Pseudomonas spp.,他のBacillus spp.、Streptomyces spp.などの種々の系統もまた本方法において使用され得る。
【0129】
当業者に公知の酵母細胞の多くの株はまた、本発明のポリペプチドの発現のため宿主細胞として入手可能である。好ましい酵母細胞としては、例えば、Saccharomyces cerivisaeおよびPichia pastorisが挙げられる。
【0130】
さらに、望ましい場合、昆虫細胞系が、本発明の方法において利用され得る。このような系は、例えば、Kittsら,1993,Biotechniques,14:810−17;Lucklow,1993,Curr.Opin.Biotechnol.4:564−72;およびLucklowら,1993,J.Virol.,67:4566−79に記載される。好ましい昆虫細胞は、Sf−9およびHi5(Invitrogen)である。
【0131】
グリコシル化B7−Lポリペプチドを発現するためにトランスジェニック動物もまた使用し得る。例えば、トランスジェニック乳産生動物(例えば、雌ウシまたはヤギ)を使用し、本発明のグルコシル化ポリペプチドを動物の乳に得ることができる。B7−Lポリペプチドを産生するために植物もまた使用し得るが、しかし、一般的に、植物において生じるグリコシル化は、哺乳動物細胞において産生されるものとは異なり、ヒト治療用途に適切ではないグリコシル化産物を生じ得る。
【0132】
(ポリペプチド産生)
B7−Lポリペプチド発現ベクターを含む宿主細胞は、当業者に周知の標準的な培地を使用して培養され得る。この培地は、通常、細胞の増殖および生存に必要な全ての栄養分を含む。E.coli細胞を培養するための適切な培地としては、例えば、Luria Broth(LB)および/またはTerrific Broth(TB)が挙げられる。真核生物細胞を培養するための適切な培地としては、Roswell Park Memorial Institute medium 1640(RPMI 1640)、Minimal Essential Medium(MEM)および/またはDulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)が挙げられ、これらの全ては、培養される特定の細胞株に必要な血清および/または増殖因子を補充され得る。昆虫細胞についての適切な培地は、必要に応じて、イーストレート(yeastolate)、ラクトアルブミン加水分解産物、および/または胎仔ウシ血清を補充したグレース培地である。
【0133】
代表的に、トランスフェクトされた細胞または形質転換された細胞の選択的な増殖に有用な抗生物質または他の化合物が、培地に補充物質として加えられる。使用される化合物は、宿主細胞が形質転換されるプラスミドに存在する選択マーカーエレメントによって検出される。例えば、選択マーカーエレメントがカナマイシン耐性である場合、培養倍地に加えられる化合物は、カナマイシンである。選択的増殖のための他の化合物としては、アンピシリン、テトラサイクリン、およびネオマイシンが挙げられる。
【0134】
宿主細胞によって産生されるB7−Lポリペプチドの量は、当該分野において公知の標準的な方法を使用して評価され得る。このような方法としては、限定しないが、ウェスタンブロット分析、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分離、免疫沈降、および/またはDNA結合ゲルシフトアッセイのような活性アッセイが挙げられる。
【0135】
B7−Lポリペプチドが宿主細胞から分泌されるように設計された場合、ポリペプチドの大部分は、細胞培養培地中で見出され得る。しかし、B7−Lポリペプチドが宿主細胞から分泌されない場合、B7−Lポリペプチドは、細胞質および/または核(真核宿主細胞について)に存在するか、あるいは、細胞質ゾル(グラム陰性細菌宿主細胞について)に存在する。
【0136】
宿主細胞細胞質および/または核(真核生物宿主細胞について)に位置するかまたは細胞質ゾル(細菌宿主細胞について)に位置するB7−Lポリペプチドについて、細胞内物質(グラム陰性細菌についての封入体を含む)は、当業者に公知の任意の標準的な技術を使用して宿主細胞から抽出され得る。例えば、宿主細胞は、フレンチプレス、均質化、および/または超音波処理、続く遠心分離によって、ペリプラズム/細胞質の含有物を放出するように溶解され得る。
【0137】
B7−Lポリペプチドが細胞質ゾル内に封入体を形成した場合、この封入体は、しばしば、内部および/または外部細胞膜に結合し得、従って、主に、遠心分離後にペレット材料において見出される。次いで、ペレット材料は、pH極限値で処理され得るか、あるいはジチオトレイトールのような還元剤の存在下アルカリ性のpHで、またはトリスカルボキシエチルホスフィンの存在下酸性のpHで、界面活性剤、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素、または尿素誘導体のようなカオトロピック剤で処理されて、封入体を放出し、分断し、そして溶解し得る。次いで、溶解されたB7−Lポリペプチドは、ゲル電気泳動、免疫沈降などを使用して分析され得る。B7−Lポリペプチドを単離することが望ましい場合、単離は、本明細書中およびMarstonら,1990,Meth.Enz.,182:264−75に記載される方法のような標準的な方法を使用して達成され得る。
【0138】
いくつかの場合、B7−Lポリペプチドは、単離の際、生物学的に活性でなくても良い。「再折り畳みする」、つまり、ポリペプチドをその三次構造に変換し、ジスルフィド連結を生成するための種々の方法を使用して、生物学的活性を回複し得る。このような方法は、溶解されたポリペプチドをあるpH(通常7より上)および特定の濃度のカオトロピック剤(chaotrope)の存在下に曝露する工程を包含する。カオトロピック剤の選択は、封入体溶解に使用される選択肢に非常に類似するが、通常、カオトロピック剤は低い濃度で使用され、溶解に使用されるカオトロピック剤と必ずしも同一ではない。多くの場合、再折り畳み/酸化溶液はまた、還元剤、または特定の比の還元剤およびその酸化形態を含んで、タンパク質のシステイン架橋の形成を生じるジスルフィドシャフリングを可能にする特定の酸化還元電位を生じる。通常使用される酸化還元対のいくつかとしては、システイン/シスタミン、グルタチオン(GSH)/ジチオビスGSH、塩化銅(II)、ジチオトレイトール(DTT)/ジチアンDTT、および2,2−メルカプトエタノール(bME)/ジチオ−b(ME)が挙げられる。多くの場合において、共溶媒が使用され得るか、または再折り畳みの効率を増加するのに必要であり得、この目的のために使用されるより一般的な試薬としては、グリセロール、種々の分子量のポリエチレングリコール、アルギニンなどが挙げられる。
【0139】
封入体がB7−Lポリペプチドの発現において有意な程度まで形成されない場合、ポリペプチドは、主に、細胞ホモジネートの遠心分離後に上清中に見出される。ポリペプチドは、さらに、本明細書中に記載されるような方法を使用して上清から単離され得る。
【0140】
溶液からのB7−Lポリペプチドの精製は、種々の技術を使用して達成され得る。ポリペプチドが、ヘキサヒスチジン(B7−Lポリペプチド/hexaHis)のようなタグまたは他の小さなペプチド(例えば、FLAG(Eastman Kodak Co.,New Haven,CT)またはmyc(Invitrogen))をそのカルボキシ末端またはアミノ末端のいずれかにおいて含むように合成された場合、カラムマトリクスがタグについて高い親和性を有するアフィニティーカラムに溶液を通すことによって一工程で精製され得る。
【0141】
例えば、ポリヒスチジンは、ニッケルに対して大きな親和性および特異性で結合する。従って、ニッケルのアフィニティーカラム(例えば、Qiagen(登録商標)ニッケルカラム)は、B7−Lポリペプチド/ポリHisの精製のために使用され得る。例えば、Current Protocols in Molecular Biology § 10.11.8(Ausubelら編,Green Publishers Inc. and Wiley and Sons 1993)を参照のこと。
【0142】
さらに、B7−Lポリペプチドは、B7−Lポリペプチドを特異的に認識し得、そして結合し得るモノクローナル抗体の使用によって精製され得る。
【0143】
精製のための他の適切な手段はとしては、限定しないが、アフィニティークロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、HPLC、電気泳動(ネイティブゲル電気泳動を含む)、続くゲル溶出、および分取用等電集束法(「Isoprime」machine/technique,Hoefer Scientific,San Francisco,CA)が挙げられる。いくつかの場合において、2つ以上の精製技術が、増加した純度を達成するために組み合わせられ得る。
【0144】
B7−Lポリペプチドはまた、Merrifieldら,1963,J.Am.Chem.Soc.85:2149;Houghtenら,1985,Proc Natl Acad.Sci.USA 82:5132;およびStewart and Young,Solid Phase Peptide Synthesis(Pierce Chemical Co.1984)に記載されるような当該分野で公知の技術を使用する、化学合成法(例えば、固相ペプチド合成)によって調製され得る。このようなポリペプチドは、アミノ末端にメチオニンを有するかまたは有さないで合成され得る。化学的に合成されたB7−Lポリペプチドは、これらの参考文献に記載される方法を使用して酸化され得て、ジスルフィド架橋を形成し得る。化学的に合成されたB7−Lポリペプチドは、組換え的に産生されるかまたは天然の供給源から精製される対応するB7−Lポリペプチドに匹敵する生物学的活性を有すると期待され、従って、組換えまたは天然のB7−Lポリペプチドと相互交換可能に使用され得る。
【0145】
B7−Lポリペプチドを得る別の手段は、B7−Lポリペプチドが天然に見出される供給源の組織および/または流体のような生物学的サンプルからの精製による。このような精製は、本明細書中に記載されるようなタンパク質精製のための方法を使用して行われ得る。精製の間、B7−Lポリペプチドの存在が、例えば、組換え的に産生されたB7−Lポリペプチドまたはそのペプチドフラグメントに対して調製される抗体を使用してモニターされ得る。
【0146】
核酸およびポリペプチドを産生するための多くのさらなる方法は、当該分野において公知であり、この方法は、B7−Lポリペプチドに対して特異性を有するポリペプチドを産生するために使用され得る。例えば、Robertsら,1997,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:12297−303を参照のこと。これは、mRNAとそのコードされるペプチドとの間の融合タンパク質の産生を記載する。Roberts,1999,Curr.Opin.Chem.Biol 3:268−73もまた参照のこと。さらに、米国特許第5,824,469号は、特定の生物学的機能を実行し得るオリゴヌクレオチドを得るための方法を記載する。この手順は、異種プールのオリゴヌクレオチドを生成する工程を包含し、それぞれが、5’無作為化配列、中心予備選択配列、および3’無作為化配列を有する。得られる異種プールは、所望の生物学的活性を示さない細胞の集団に導入される。次いで、細胞の亜集団を、所定の生物学的機能を示すものについてスクリーニングする。その亜集団から、所望の生物学的機能を実行し得るオリゴヌクレオチドが単離される。
【0147】
米国特許第5,763,192号;同第5,814,476号;同第5,723,323号;および同第5,817,483号は、ペプチドまたはポリペプチドを産生するためのプロセスを記載する。これは、確率論的遺伝子またはそのフラグメントを産生し、次いで、確率論的遺伝子によってコードされた1以上のタンパク質を産生する宿主細胞にこれらの遺伝子を導入することによって達成される。次いで、この宿主細胞は、所望の活性を有するペプチドまたはポリペプチドを産生する、これらのクローンを同定するためにスクリーニングされる。
【0148】
ペプチドまたはポリペプチドを産生するための別の方法は、Athersys,Inc.によって出願された国際公開番号WO99/15650に記載される。(「Random Activation of Gene Expression for Gene Discovery」(RAGE−GD)として知られている、このプロセスは、インサイチュ組換え方法によって、内因性遺伝子の発現の活性化または遺伝子の過剰発現を含む。例えば、内因性遺伝子の発現は、非相同性組換えまたは異常な組換えによって、遺伝子の発現を活性化し得る標的細胞中に、調節配列を組み込むことによって、活性化または増加される。この標的DNAは、まず、放射線に供せられ、そして遺伝子プロモーターに挿入される。このプロモーターは、遺伝子の前方にブレイクを配置し、遺伝子の転写を開始する。これは、所望のペプチドまたはポリペプチドの発現を生じる。
【0149】
これらの方法はまた、包括的なB7−Lポリペプチド発現ライブラリーを作製するために使用され得、このライブラリーは、続いて、種々のアッセイ(例えば、生化学的アッセイ、細胞アッセイおよび生物全体のアッセイ(例えば、植物、マウスなど))において、ハイスループット表現型スクリーニングのために使用され得ることが理解される。
【0150】
(合成)
本明細書中に記載される核酸およびポリペプチド分子は、組換えおよび他の手段によって産生され得ることは、当業者によって理解される。
【0151】
(選択的結合アッセイ)
用語「選択的結合因子」は、1以上のB7−Lポリペプチドに対して特異性を有する分子をいう。適切な選択的結合因子としては、抗体およびその誘導体、ポリペプチド、ならびに低分子が挙げられるが、これらに限定されない。適切な選択的結合因子は、当該分野で公知の方法を使用して調製され得る。本発明の例示的なB7−Lポリペプチド選択的結合因子は、B7−Lポリペプチドの特定の部分を結合し得、これにより、このポリペプチドのB7−Lポリペプチドレセプターへの結合を阻害する。
【0152】
B7−Lポリペプチドと結合する抗体および抗体フラグメントのような選択的結合因子は、本発明の範囲内である。この抗体は、単一特異的なポリクローナルを含むポリクローナル;モノクローナル(MAb);組換え;キメラ;ヒト化(例えば、相補性決定領域(CDR)移植化);ヒト;単鎖;および/または二重特異的;ならびにそれらのフラグメント;改変体;または誘導体であり得る。抗体フラグメントは、B7−Lポリペプチド上のエピトープに結合する抗体のこれらの一部を含む。このようなフラグメントの例としては、全長抗体の酵素学的切断によって産生されたFabフラグメントおよびF(ab’)フラグメントが挙げられる。他の結合フラグメントとしては、組換えDNA技術(例えば、抗体可変領域をコードする核酸配列を含む、組換えプラスミドの発現)によって産生されたフラグメントが挙げられる。
【0153】
B7−Lポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体は、一般に、B7−Lポリペプチドおよびアジュバンドの複数回の皮下注射または腹腔内注射によって動物(例えば、ウサギまたはマウス)において産生される。B7−Lポリペプチドをキャリアタンパク質に結合させることは、有用であり得、このタンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、血清、アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビターのように、免疫化される種において免疫原性である。また、ミョウバンのような凝集剤は、免疫応答を増強させるために使用される。免疫化後、この動物は採血され、そして血清を、抗B7−Lポリペプチド抗体力価についてアッセイする。
【0154】
B7−Lポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体は、培地中の連続的細胞株による抗体分子の産生を提供する、任意の方法を使用して産生される。モノクローナル抗体を調製するために適切な方法の例は、Kohlerら、1975、Nature 256:495−97のハイブリドーマ法、およびヒトB細胞ハイブリドーマ法(Kozbor、1984、J.Immunol.133:3001;Brodeurら、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications 51−63(Marcel Dekker,Inc.,1987))が挙げられる。B7−Lポリペプチドと反応性の、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株がまた、本発明によって提供される。
【0155】
本発明のモノクローナル抗体は、治療剤として使用するために、改変され得る。1実施形態は、「キメラ」抗体であり、重鎖(H)および/または軽鎖(L)の一部が、特定の種から誘導されるか、または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスの属する抗体中の対応する配列と同一であるか、または相同性である一方で、この鎖(単数または複数)の残りは、別の種から誘導されるか、または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか、または相同性である。抗体のフラグメントが所望の生物学的活性を示す限り、これらの抗体のフラグメントも含まれる。米国特許第4,816,567号;Morrisonら、1985、Proc.Natl.Acad.Sci.81:6851−55を参照のこと。
【0156】
別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、「ヒト化」抗体である。非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野で周知である。米国特許第5,585,089号および5,693,762号を参照のこと。一般に、ヒト化した抗体は、非ヒトである供給源から導入された1以上のアミノ酸残基有する。ヒト化は、例えば、当該分野で記載される方法(Jonesら、1986、Nature 321:522−25;Riechmannら、1998、Nature 332:323−27;Verhoeyenら、1988、Science239:1534−36)を使用して、げっ歯動物相補性決定領域の少なくとも一部をヒトの抗体の対応する領域と置換することによって、実施され得る。
【0157】
B7−Lポリペプチドと結合するヒト抗体がまた、本発明によって包含される。内因性の免疫グロブリンの産物の非存在下で、ヒト抗体のレパートリーを産生し得る、トランスジェニック動物(例えば、マウス)を使用して、このような抗体は、B7−Lポリペプチド抗原(すなわち、少なくとも6個の連続アミノ酸を有する)を用いて免疫化することによって産生され、必要に応じて、キャリアに結合される。例えば、Jakobovitsら,1993,Proc.Natl.Acad Sci.90:2551−55;Jakobovitsら,1993,Nature 362:255−58;Bruggermannら,1993,Year in Immuno.7:33を参照のこと。1つの方法において、このようなトランスジェニック動物は、重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードする内因性遺伝子座を無能にし、そしてヒトの重鎖および軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座をそのゲノムに挿入することによって産生される。次いで、部分的に改変された動物(すなわち、この動物は、完全相補性より少ない低い改変を有する)は、所望の免疫系の改変の全てを有する動物を得るために交雑される。免疫原が投与される場合、これらのトランスジェニック動物が、ヒト(例えば、マウスではない)アミノ酸配列(これらの抗原に対して免疫特異性である可変領域を含む)を有する抗体を産生する。国際出願番号PCT/US96/05928およびPCT/US93/06926を参照のこと。さらなる方法は、米国特許第5,545,807号、国際出願番号PCT/US91/245およびPCT/GB89/01207、ならびに欧州特許第546073B1および546073A1に記載される。ヒト抗体はまた、宿主細胞中の組換えDNAの発現または本明細書中に記載されるようなハイブリドーマ細胞中での発現によって産生され得る。
【0158】
代替の実施形態において、ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリから産生され得る(Hoogenboomら,1991,J.Mol.Biol.227:381;Marksら,1991,J.Mol.Biol.222:581)。これらにより、糸状バクテリオファージの表面上の抗体レパートリーのディスプレイを介した模倣免疫選択、および選択した抗原への結合によるファージの続く選択を処理する。1つのこのような技術は、国際出願番号PCT/US98/17364に記載されており、これには、このようなアプローチを使用して、MPL−レポーターおよびmsk−レポーターについて、高い親和性および機能的なアゴニスト抗体の単離が記載される。
【0159】
キメラ、CDR移植化抗体、およびヒト化抗体は、代表的に組換え方法によって産生される。抗体をコードする核酸は、宿主細胞中に導入され、そして本明細書中に記載される物質および手順を使用して発現される。好ましい実施形態において、この抗体は、哺乳動物宿主細胞(例えば、CHO細胞)中で産生される。モノクローナル(例えば、ヒト)抗体は、本明細書中に記載されるように、宿主細胞中での組換えDNAの発現またはハイブリドーマ細胞中での発現によって産生され得る。
【0160】
本発明の抗B7−L抗体は、B7−Lポリペプチドの検出および定量のために、任意の公知のアッセイ方法(例えば、競合結合アッセイ、直接的および間接的サンドイッチアッセイ、および免疫沈降アッセイ)において使用され得る(Sola,Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques 147−158(CRC Press,Inc.,1987))。この抗体は、使用されるアッセイ方法に対して、適切である親和性でB7−Lポリペプチドと結合する。
【0161】
診断適用のために、特定の実施形態において、抗B7−L抗体は、検出可能な部分で標識され得る。この検出可能な部分は、直接的または間接的のいずれかで、検出可能なシグナルを産生し得る任意の部分であり得る。例えば、検出可能な部分は、放射性同位体(例えば、3H、14C、32P、35S、125I、99Tc、111In、または67Ga);蛍光化合物または化学発光化合物(フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、もしくはルシフェリン)、または酵素(例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼ)であり得る(Bayerら,1990,Meth.Enz.184:138−63)。
【0162】
競合結合アッセイは、標識した標準(例えば、B7−Lポリペプチド、またはその免疫学的に反応性な部分)の、限定された量の抗B7−L抗体との結合に関して試験サンプル検体(B7−Lペプチド)と競合する能力に依存する。試験サンプル中のB7−Lポリペプチドの量は、抗体と結合する標準の量と反比例する。結合する標準の量を決定するのを容易にするために、この抗体は、代表的には競合前または後に不溶化され、この抗体と結合する標準および検体は、結合しないままの標準および検体から好都合に分離され得る。
【0163】
サンドイッチアッセイは、2種の抗体の使用を代表的に包含し、各々の抗体は、検出および/または定量されるべきタンパク質の異なる免疫部分またはエピトープに結合し得る。サンドイッチアッセイにおいて、この試験サンプル検体は、固体支持体上に免疫化される第1抗体によって代表的に結合され、その後、第2抗体が、この検体に結合し、不溶の3部の複合体を形成する。例えば、米国特許第4,376,110を参照のこと。二次抗体自体は、検出可能な部分で標識されるか(直接的なサンドイッチアッセイ)、または検出可能な部分で標識される抗免疫グロブリン抗体を使用して測定され得る(間接的サンドイッチアッセイ)。例えば、サンドイッチアッセイの1つの型は、酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)(この場合、検出可能な部分は、酵素である)である。
【0164】
抗B7−L抗体を含む、選択的結合因子はまた、インビボ画像化のために有用である。検出可能な部分で標識した抗体は、動物に、好ましくは、血流中に投与され得、宿主中の標識した抗体の存在および位置がアッセイされる。この抗体は、核磁気共鳴、放射線学、または当該分野で公知の他の検出手段のいずれかによって、動物中で検出可能である任意の部分で標識され得る。
【0165】
抗体を含む、本発明の選択的結合因子は、治療剤として使用され得る。これらの治療剤は、一般に、アゴニストまたはアンタゴニストであり、これらは、B7−Lポリペプチドの少なくとも1つの生物学的活性を、それぞれ増強または減少させるかのいずれかである。1実施形態で、本発明のアンタゴニスト抗体は、B7−Lポリペプチドに特異的に結合し得、そしてインビボまたはインビトロでB7−Lポリペプチドの機能活性を阻害または排除し得る抗体またはその結合フラグメントである。好ましい実施形態において、選択的結合因子(例えば、アンタゴニスト抗体)は、少なくとも約50%、および好ましくは、少なくとも約80%、B7−Lポリペプチドの機能活性を阻害する。別の実施形態において、選択的結合因子は、B7−Lポリペプチド結合パートナー(リガンドまたはレセプター)と相互作用し得る抗B7−Lポリペプチドであり、これにより、インビトロまたはインビボにおいてB7−Lポリペプチド活性を阻害または排除する、抗B7−Lポリペプチド抗体であり得る。アゴニストおよびアンタゴニスト抗B7−Lポリペプチド抗体を含む、選択的結合因子は、当該分野で周知であるスクリーニングアッセイによって同定される。
【0166】
本発明はまた、B7−L選択的結合因子(例えば、抗体)を含むキットおよび生物学的サンプル中でB7−Lポリペプチドレベルを検出するために有用である他の薬剤に関する。このような薬剤は、検出可能な標識、ブロック血清、ポジティブおよびネガティブコントロールサンプル、ならびに検出薬剤を含み得る。
【0167】
(マイクロアレイ)
DNAマイクロアレイ技術は、本発明に従って利用され得ることが理解される。DNAマイクロアレイは、固体支持体(例えば、ガラス)上に配置された核酸の小型高密度アレイである。このアレイ内の各細胞またはエレメントは、相補的核酸配列(例えば、mRNA)とハイブリダイゼーションするための標識として作用する、単一の核酸種の複数のコピーを含む。DNAマイクロアレイ技術を使用する発現プロファイリングにおいて、mRNAは、最初に細胞または組織サンプルから抽出され、次いで、酵素で蛍光標識されたcDNAに変換される。この材料は、マイクロアレイにハイブリダイズされ、そして未結合のcDNAは、洗浄により除去される。次いで、このアレイ上に示された個々の遺伝子の発現は、各々核酸分子を標的するために特異的に結合される、標識されたcDNAの量を定量することによって視覚化される。この方法において、数千の遺伝子の発現が、生物学的材料の単一サンプルから、ハイスループットの並行様式で定量され得る。
【0168】
このハイスループット発現プロファイリングは、本発明のB7−L分子に関連して広範の適用を有し、これには、以下が挙げられるが、これに限定されない:治療のための標的としてのB7−L疾患関連遺伝子の同定および確認;関連するB7−L分子およびそのインヒビターの分子毒性;臨床試験のための代替標識の集団および産生の階層化;およびハイスループットスクリーニングにおいて、選択化合物の同定を援助することによって、関連するB7−Lポリペプチド低分子薬物の発見を増強すること。
【0169】
(化学的誘導体)
B7−Lポリペプチドの化学的に改変された誘導体は、本明細書中の記載を考慮して、当業者によって調製され得る。B7−Lポリペプチド誘導体は、このポリペプチドに天然で結合した分子の型または位置のいずれかで、異なる様式で改変される。誘導体は、1以上の天然で結合した化学基の欠失によって形成される分子を含み得る。配列番号2または他のB7−Lポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドは、1以上のポリマーの共有結合によって改変され得る。例えば、選択されたポリマーは、代表的に水溶性であり、その結果、結合するタンパク質は、水性環境(例えば、生理学的な環境)下で沈殿しない。ポリマーの混合物が、適切なポリマーの範囲内に含まれる。好ましくは、目的産物の調製の治療学的使用のために、このポリマーは、薬学的に受容可能である。
【0170】
このポリマーの各々は、任意の分子量であり得、そして分枝または非分枝であり得る。このポリマーの各々は、代表的に、約2kDaと約100kDaとの間の平均分子量を有する(この用語「約(およそ)」は、水溶性ポリマーの調製の際に、上記の分子量より多い、いくらか少ない分子量を有することを示す)。各ポリマーの平均分子量は、好ましくは、約5kDaと約50kDaの間、より好ましくは、約12kDaと約40kDaとの間、そして最も好ましくは、約20kDaと約35kDaとの間である。
【0171】
適切な水溶性ポリマーまたはその混合物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:N−連結またはO−連結炭水化物、糖、リン酸、ポリエチレングリコール(PEG)(これは、モノ−(C1−C10)ポリエチレングリコール、アルコキシ−ポリエチレングリコール、またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールを含む、タンパク質を誘導するために使用されたPEGの形態を含む)、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン(例えば、約6kDの低分子量デキストラン)、セルロース、または他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ(N−ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、およびポリビニルアルコール。共有結合したB7−Lポリペプチドマルチマーを調製するために使用され得る、二官能性架橋分子もまた、本発明に含まれる。
【0172】
一般に、化学的誘導は、活性化したポリマー分子とタンパク質を反応させるために使用される任意の適切な条件下で、実施され得る。ポリペプチドの化学的誘導体を調製するための方法は、概して以下の工程を包含する:(a)配列番号2または他のB7−Lポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドが、1以上のポリマー分子に結合する条件下で、活性化したポリマー分子(例えば、ポリマー分子の反応性エステル誘導体またはアルデヒド誘導体)とポリペプチドを反応させる工程、ならびに(b)反応生成物を得る工程。最適の反応条件は、既知のパラメータおよび所望の結果に基づいて決定される。例えば、ポリマー分子のタンパク質に対する比が大きくなるほど、結合したポリマー分子の割合も大きくなる。1実施形態において、B7−Lポリペプチド誘導体は、アミノ末端の単一ポリマー分子部分を有し得る。例えば、米国特許第5,234,784号を参照のこと。
【0173】
ポリペプチドのペグ化は、当該分野で公知の任意のペグ化反応を使用して特異的に実施され得る。このような反応は、例えば、以下の参考文献に記載されている:Francisら,1992,Focus on Growth Factors 3:4−10;欧州特許第0154316号および0401384号;ならびに米国特許第4,179,337号。例えば、ペグ化は、本明細書中に記載されるように、反応性ポリエチレングリコール分子(または、類似の反応性水溶性ポリマー)とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施され得る。アシル化反応のために、選択されたポリマーは、単一の反応性エステル基を有する。還元的アルキル化について、選択されたポリマーは、単一の反応性アルデヒド基を有する。反応性アルデヒドは、例えば、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド(これは、水に安定である)、またはモノC1−C10アルコキシもしくはそのアリールオキシ誘導体である(米国特許第5,252,714号を参照のこと)。
【0174】
別の実施形態において、B7−Lポリペプチドは、ビオチンに化学的に連結され得る。次いで、このビオチン/B7−Lポリペプチド分子は、アビジンに結合され得、その結果、4価のアビジン/ビオチン/B7−Lポリペプチド分子が得られる。B7−Lポリペプチドはまた、ジニトロフェノール(DNP)またはトリニトロフェノール(TNP)に共有結合され得、そして得られた結合体は、抗DNPまたは抗TNP−IgMと共に沈殿し、10価の十量体の結合体を形成する。
【0175】
一般に、本発明のB7−Lポリペプチド誘導体の投与によって、緩和または調節され得る条件は、B7−Lポリペプチドについて本明細書中に記載されたものを含む。しかし、本明細書中に開示されるB7−Lポリペプチド誘導体は、非誘導体化分子と比較した場合、さらなる活性、増強または減少した生物学的活性、または他の特性(例えば、増加または減少した半減期)を有し得る。
【0176】
(遺伝子操作した非ヒト動物)
マウス、ラット、または他のげっ歯類;ウサギ、ヤギ、ヒツジ、または他の家畜のような非ヒト動物が、さらに本発明の範囲内に含まれ、ここで、ネイティブB7−Lポリペプチドをコードする遺伝子は破壊(すなわち「ノックアウト」)され、B7−Lポリペプチドの発現レベルは、有意に減少するか、または完全に破壊される。このような動物は、米国特許第5,557,032号に記載されるような技術および方法を使用して調製され得る。
【0177】
本発明は、マウス、ラット、または他のげっ歯類;ウサギ、ヤギ、ヒツジ、または他の家畜のような非ヒト動物をさらに含み、この動物のB7−L遺伝子のネイティブの形態または異種B7−L遺伝子のいずれかが、この動物によって過剰発現され、これによって、「トランスジェニック」動物を作製する。このようなトランスジェニック動物は、米国特許第5,489,743号および国際公開番号WO94/28122号に記載されるような周知の方法を使用して調製され得る。
【0178】
本発明は、非ヒト動物をさらに含み、ここで、本発明の1以上のB7−Lポリペプチドのプロモーターは、(例えば、相同的な組換え方法を使用することによって)活性化されるか、または不活化され、1以上のネイティブB7−Lポリペプチドの発現のレベルを改変する。
【0179】
これらの非ヒト動物は、薬物候補物スクリーニングのために使用され得る。このようなスクリーニングにおいて、動物での薬物候補物の影響が測定され得る。例えば、薬物候補物は、B7−L遺伝子の発現を減少または増加させ得る。特定の実施形態において、産生されるB7−Lポリペプチドの量は、動物を薬物候補物に曝露した後に測定され得る。さらに、特定の実施形態において、動物に対する薬物候補物の実際の影響を検出し得る。例えば、特定の遺伝子の過剰発現は、疾患状態または病理学的状態を生じるか、または関連する。このような場合において、薬物候補物が遺伝子の発現を減少させる能力または病理学的状態を防止または阻害する能力を試験し得る。別の例において、ポリペプチドのフラグメントのような、特定の代謝産物の産生は、疾患状態または病理学的状態を生じ得るか、または関連し得る。このような場合において、薬物候補物がこのような代謝産物の産生を減少させる能力、または薬物候補物が病理学的状態を防止または阻害する能力を試験し得る。
【0180】
(B7−Lポリペプチド活性の他の修飾因子についてのアッセイ)
いくつかの状態において、B7−Lポリペプチドの活性の修飾因子である分子(すなわち、アゴニストまたはアンタゴニスト)を同定することが所望され得る。B7−Lポリペプチドを調節する天然または合成分子は、本明細書中に記載されるような、1以上のスクリーニングアッセイを使用して同定され得る。このような分子は、エキソビボ様式またはインビボ様式のいずれかで、注射、または経口送達、移植デバイスなどによって投与され得る。
【0181】
「試験分子」とは、B7−Lポリペプチドの活性を調節する(すなわち、増加または減少させる)能力について評価される分子を言う。最も一般的に、試験分子は、B7−Lポリペプチドと直接的に相互作用する。しかし、試験分子はまた、例えば、B7−L遺伝子発現に影響を与えることによって、またはB7−Lポリペプチド結合パートナー(例えば、レセプターまたはリガンド)に結合することによって、B7−Lポリペプチド活性を間接的に調節し得ることが企図される。1実施形態において、試験分子は、少なくとも約10−6M、好ましくは、約10−8M、より好ましくは、約10−9M、そしてさらにより好ましくは約10−10Mの親和性定数(affinity constant)でB7−Lポリペプチドと結合する。
【0182】
B7−Lポリペプチドと相互作用する化合物を同定するための方法は、本発明によって包含される。特定の実施形態において、B7−Lポリペプチドは、試験分子とB7−Lポリペプチドとの相互作用が可能な条件下で、試験分子と共にインキュベートされ、そして相互作用の程度が測定される。試験分子は、実質的に精製された形態または粗製の混合物でスクリーニングされ得る。
【0183】
特定の実施形態において、B7−Lポリペプチドアゴニストまたはアンタゴニストは、B7−Lポリペプチドと相互作用してその活性を調節するタンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、または低分子量の分子であり得る。B7−Lポリペプチドの発現を調節する分子として、B7−Lポリペプチドをコードする核酸と相補的であるか、またはB7−Lポリペプチドの発現を指向または制御する核酸配列に対して相補的である核酸、および発現のアンチセンスレギュレーターとして作用する核酸が挙げられる。
【0184】
一旦、試験分子が、B7−Lポリペプチドと相互作用すると同定されると、この分子は、B7−Lポリペプチド活性を増加または減少させる能力についてさらに評価され得る。試験分子とB7−Lポリペプチドとの相互作用の測定は、いくつかの形態(細胞ベースの結合アッセイ、膜結合アッセイ、溶液相アッセイ、および免疫アッセイが挙げられる)で実施され得る。一般的に、試験分子は、特定の期間、B7−Lポリペプチドと共にインキュベートされ、そしてB7−Lポリペプチド活性が、生物学的活性を測定するために1以上のアッセイによって決定される。
【0185】
試験分子とB7−Lポリペプチドとの相互作用はまた、免疫アッセイにおいてポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用して直接的にアッセイされ得る。あるいは、本明細書中に記載されるようなエピトープタグを含むB7−Lポリペプチドの改変形態は、溶液および免疫アッセイにおいて使用され得る。
【0186】
B7−Lポリペプチドが、結合パートナー(例えば、レセプターまたはリガンド)との相互作用を介して、生物学的活性を示す場合、種々のインビトロアッセイが、対応する結合パートナー(例えば、選択的結合因子、レセプター、またはリガンド)へのB7−Lポリペプチドの結合を測定するために使用され得る。これらのアッセイは、その結合パートナーに対するB7−Lポリペプチドの結合の速度および/または程度を増加または減少させる試験分子の能力について、試験分子をスクリーニングするために使用され得る。1つのアッセイにおいて、B7−Lポリペプチドは、マイクロタイタープレートのウェル中で固定される。次いで、放射標識したB7−Lポリペプチド結合パートナー(例えば、ヨウ素化B7−Lポリペプチド結合パートナー)および試験分子は、このウェルに、一度に一つずつか(いずれかの順序で)または同時にかのいずれかで添加され得る。インキュベーション後、このウェルを洗浄し、そしてシンチレーションカウンターを使用して、放射活性を計数し、結合パートナーがB7−Lポリペプチドに結合する範囲を決定する。代表的に、この分子は、濃度範囲にわたって試験され、そして試験アッセイのエレメントの1つ以上を欠く一連のコントロールウェルが、結果の評価の正確性のために使用され得る。この方法の代替は、タンパク質の「位置」を逆にすることを(すなわち、マイクロタイタープレートウェルに対してB7−Lポリペプチド結合パートナーを固定し、試験分子および放射標識したB7−Lポリペプチドをインキュベートし、そしてB7−Lポリペプチド結合の程度を決定する)を包含する。例えば、Current Protocols in Molecular Biology、第18章(Ausubelら編、Green Publishers Inc.およびWiley and Sons1995)を参照のこと。
【0187】
放射性標識に対する代替として、B7−Lポリペプチドまたはその結合パートナーは、ビオチンと結合体化され得、次いで、ビオチン化タンパク質の存在が、酵素(例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)またはアルカリホスファターゼ(AP))(これらは、比色定量的に検出され得る)に結合したストレプトアビジンを使用して検出され得るか、またはストレプトアビジンの蛍光タグ化によって検出され得る。B7−LポリペプチドまたはB7−Lポリペプチド結合パートナー(これらは、ビオチンに結合されている)に対する抗体はまた、APまたはHRPに連結した酵素連結ストレプトアビジンとの複合体のインキュベーションに続いて、検出の目的のために使用され得る。
【0188】
B7−LポリペプチドまたはB7−Lポリペプチド結合パートナーはまた、アガロースビーズ、アクリルビーズ、または他の型のこのような不活性な固体相基材への付着によって固定され得る。基材−タンパク質複合体は、相補タンパク質および試験化合物を含む溶液内に配置され得る。インキュベーション後、これらのビーズは、遠心分離によって沈澱され得、そしてB7−Lポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合の量が、本明細書中に記載の方法を使用して評価され得る。あるいは、基材−タンパク質複合体は、カラムを通過する、試験分子および相補タンパク質を用いてカラム内に固定化され得る。B7−Lポリペプチドトとその結合パートナーとの間の複合体の形成が、次いで、本明細書中に記載の技術(例えば、放射性標識または抗体結合)のいずれかを使用して評価され得る。
【0189】
B7−Lポリペプチド結合タンパク質とB7−Lポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少させる試験分子を同定するために有用な別のインビトロアッセイは、表面プラズモン共鳴検出システム(例えば、BIAcoreアッセイシステム(Pharmacia,Piscataway,NJ))である。BIAcoreシステムは、製造業者によって指定されるように利用される。このアッセイは、本質的に、B7−LポリペプチドまたはB7−Lポリペプチド結合パートナーのいずれかの、ディテクターに位置するデキストランコーティングされたセンサーチップへの共有結合に関する。次いで、試験化合物および他の相補性タンパク質が、同時にかまたは連続的にかのいずれかで、センサーチップを含むチャンバーに注入され得る。結合する相補性タンパク質の量は、センサーチップのデキストランコーティングされた側に物理的に結合する分子の質量の変化に基づいて評価され得、この分子の質量の変化は、ディテクターシステムによって測定される。
【0190】
いくつかの場合において、B7−LポリペプチドとB7−Lポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少させるそれらの能力について、2つ以上の試験化合物を一緒に評価することが所望され得る。これらの場合、本明細書中に記載のアッセイは、第一の試験化合物と同時にか、またはそれに続いてのいずれかで、このようなさらなる試験化合物を添加することによって容易に改変され得る。このアッセイにおける残りの工程は、本明細書中に記載される通りである。
【0191】
インビトロアッセイ(例えば、本明細書中に記載されるアッセイ)は、B7−LポリペプチドとB7−Lポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成に対する効果について、多数の化合物をスクリーニングするために、有利に使用され得る。これらのアッセイは、ファージディスプレイ、合成ペプチド、および化学合成ライブラリーにおいて生成された化合物をスクリーニングするために、自動化され得る。
【0192】
B7−LポリペプチドとB7−Lポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少する化合物はまた、B7−LポリペプチドまたはB7−Lポリペプチド結合パートナーのいずれかを発現する細胞および細胞株を使用して、細胞培養物においてスクリーニングされ得る。細胞および細胞株は、任意の哺乳動物から獲得され得るが、好ましくは、ヒト、または他の霊長類、イヌまたはげっ歯類の供給源由来である。B7−Lポリペプチドの、B7−Lポリペプチド結合パートナーを発現する細胞のその表面への結合は、試験分子の存在または非存在下で評価され、そして結合の程度が、例えば、B7−Lポリペプチド結合パートナーに対するビオチン化抗体を使用するフローサイトメトリーによって決定され得る。細胞培養アッセイは、本明細書中に記載されるタンパク質結合アッセイにおいて、陽性とスコア付けされる化合物をさらに評価するために有利に使用され得る。
【0193】
細胞培養物はまた、薬物候補の効果をスクリーニングするために使用され得る。例えば、薬物候補は、B7−L遺伝子の発現を減少または増加させ得る。特定の実施形態において、生成されるB7−LポリペプチドまたはB7−Lポリペプチドフラグメントの量は、細胞培養物の薬物候補への曝露の後に測定され得る。特定の実施形態において、細胞培養物への薬物候補の実際の効果が検出され得る。例えば、特定の遺伝子の過剰発現は、細胞培養物に対する特定の効果を有し得る。このような場合、遺伝子の発現を増加または減少させる薬物候補の能力、または細胞培養物に対する特定の効果を予防または阻害するその能力が試験され得る。他の例において、特定の代謝産物(例えば、ポリペプチドのフラグメント)の生成が、疾患または病的状態を生じ得るか、またはそれらと関連し得る。このような場合、細胞培養物におけるこのような代謝産物の生成を減少する薬物候補の能力が試験され得る。
【0194】
(内部移行タンパク質)
tatタンパク質配列(HIV由来)が、タンパク質を細胞内に内部移行させるために使用され得る。例えば、Falwellら、1994、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:664−68を参照のこと。例えば、HIV tatタンパク質の11アミノ酸の配列(Y−G−R−K−K−R−R−Q−R−R−R;配列番号24)(「タンパク質形質導入ドメイン」、またはTAT PDTと称される)は、細胞の細胞質膜および核膜を通じた送達を媒介することが記載されている。Schwarzeら,1999,Science 285:1569−72;およびNagaharaら,1998,Nat.Med.4:1449−52を参照のこと。これらの手順において、腹腔内投与後に組織に浸透するFITC構築物(FITC標識されたG−G−G−G−Y−G−R−K−K−R−R−Q−R−R−R;配列番号25)が調製され、そしてこのような構築物の細胞への結合が、蛍光活性化細胞分離(FACS)分析によって検出される。tat−β−gal融合タンパク質で処置された細胞は、β−gal活性を示す。注入後、このような構築物の発現が、多くの組織(肝臓、腎臓、肺、心臓および脳組織を含む)において検出され得る。このような構築物は、細胞に侵入するためにある程度のアンフォールディングを受け、そのため、細胞への移入後にリフォールディングを必要とし得ると考えられる。
【0195】
従って、tatタンパク質配列は、所望のポリペプチドを細胞に内部移入させるために使用され得ることが理解される。例えば、tatタンパク質配列を使用して、B7−Lアンタゴニスト(例えば、抗B7−L選択的結合因子、低分子、可溶性レセプター、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド)は、B7−L分子の活性を阻害するために、細胞内に投与され得る。本明細書中で使用される場合、用語「B7−L分子」は、本明細書中に規定されるような、B7−L核酸分子およびB7−Lポリペプチドの両方をいう。所望の場合、B7−Lタンパク質自体もまた、これらの手順を使用して、細胞に内部投与され得る。Straus,1999,Science 285:1466−67もまた参照のこと。
【0196】
(B7−Lポリペプチドを使用する細胞供給源の同定)
本発明の特定の実施形態に従って、B7−Lポリペプチドと関連する特定の細胞型の供給源を決定することを可能することが有用であり得る。例えば、適切な治療を選択する際の補助として疾患または病的状態の起源を決定することが有用であり得る。特定に実施形態において、B7−Lポリペプチドをコードする核酸は、プローブとして使用され、このようなプローブを用いて細胞の核酸をスクリーニングすることによって、本明細書中に記載の細胞を同定し得る。他の実施形態において、抗B7−Lポリペプチド抗体を使用して、細胞におけるB7−Lポリペプチドの存在について試験し得、それによって、このような細胞が、本明細書中に記載される型の細胞であるか否かを決定し得る。
【0197】
(B7−Lポリペプチド組成物および投与)
治療組成物は、本発明の範囲内である。このようなB7−Lポリペプチドの薬学的組成物は、投与の様式に適するように選択された薬学的または生理学的に受容可能な処方剤との混合物中に、治療有効量のB7−LポリペプチドまたはB7−L核酸分子を含み得る。薬学的組成物は、投与の様式に適するように選択された薬学的または生理学的に受容可能な処方剤との混合物中に、治療有効量の1つ以上のB7−Lポリペプチド選択的結合因子を含み得る。
【0198】
受容可能な処方物の材料は、好ましくは、使用される投薬量および濃度で、レシピエントに対して非毒性である。
【0199】
薬学的組成物は、例えば、組成物のpH、浸透性、粘度、清澄性、色、等張性、臭い、無菌性、安定性、分解または放出の速度、吸着、または浸透を改変、維持または保存するための処方物材料を含み得る。適切な処方物材料としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:アミノ酸(例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン)、抗菌剤、抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウム)、緩衝液(例えば、ホウ酸、重炭酸塩、Tris−HCl、クエン酸、リン酸、または他の有機酸)、バルキング剤(例えば、マンニトールまたはグリシン)、キレート化剤(例えば、エチレンジアミン四酢酸(EDTA))、複合体化剤(例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン)、充填剤、単糖類、二糖類、および他の炭水化物(例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン)、タンパク質(例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン)、着色剤、香味剤および希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー(例えば、ポリビニルピロリドン)、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン(例えば、ナトリウム)、防腐剤(例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン(chlorhexidine)、ソルビン酸、または過酸化水素)、溶媒(例えば、グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール)、糖アルコール(例えば、マンニトールまたはソルビトール)、懸濁剤、界面活性剤または湿潤剤(例えば、プルオニック(pluronic);PEG;ソルビタンエステル;ポリソルベート(例えば、ポリソルベート20またはポリソルベート80);トリトン;トロメタミン(tromethamine);レシチン;コレステロールまたはチロキサポール(tyloxapal))、安定性増強剤(例えば、スクロースまたはソルビトール)、張度増強剤(例えば、ハロゲン化アルカリ金属(好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム)、またはマンニトール、ソルビトール)、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および/または薬学的アジュバント。Remington’s Pharmaceutical Sciences(第18版,A.R.Gennaro編,Mack Publishing Company 1990を参照のこと。
【0200】
最適な薬学的組成物は、当業者によって、例えば、意図される投与経路、送達形式、および所望の投薬量に依存して決定される。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences,前出を参照のこと。このような組成物は、B7−L分子の、物理的な状態、安定性、インビボ放出の速度、およびインビボクリアランスの速度に影響し得る。
【0201】
薬学的組成物中の主要なビヒクルまたはキャリアは、本来水性であっても非水性であってもよい。例えば、注入のための適切なビヒクルまたはキャリアは、水、生理学的な生理食塩水溶液、または人工脳脊髄液であり得、おそらく非経口投与のための組成物において一般的な他の物質が補充される。中性の緩衝化生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。他の例示的な薬学的組成物は、約pH7.0〜8.5のTris緩衝液または約pH4.0〜5.5の酢酸塩緩衝液を含み、これらはさらに、ソルビトールまたは適切な置換物を含み得る。本発明の1つの実施形態において、B7−Lポリペプチド組成物は、所望の程度の純度を有する選択された組成物を、任意の処方薬剤(Remington’s Pharmaceutical Sciences,前出)と混合することによって、凍結乾燥ケークまたは水溶液の形態で、保存のために調製され得る。さらに、B7−Lポリペプチド産物は、スクロースのような適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として処方され得る。
【0202】
このB7−Lポリペプチドの薬学的組成物は、非経口送達のために選択され得る。あるいは、これらの組成物は、吸入または消化管を介する送達(例えば、経口送達)のために選択され得る。このような薬学的に受容可能な組成物の調製は、当該分野の技術内にある。
【0203】
処方成分は、投与の部位において受容可能な濃度で存在する。例えば、緩衝液は、生理学的pHまたはそれよりわずかに低いpH(代表的に、約5〜約8のpH範囲内)でこの組成物を維持するために使用される。
【0204】
非経口投与が意図される場合、本発明における使用のための治療組成物は、薬学的に受容可能なビヒクルに所望のB7−L分子を含む、発熱物質を含まない非経口的に受容可能な水溶液の形態であり得る。非経口注射のために特に適切なビヒクルは、滅菌蒸留水であり、この中で、B7−L分子が、滅菌性の等張溶液として処方され、適切に保存される。なお別の調製物は、生成物の制御されたまたは持続された放出を提供する薬剤(例えば、注入可能なミクロスフィア、生体侵食性(bio−erodible)粒子、ポリマー化合物(ポリ乳酸またはポリグリコール酸)、ビーズまたはリポソーム)と所望の分子との処方物を含み得、次いで、これは蓄積注射を介して送達され得る。ヒアルロン酸もまた使用され得、そしてこれは、循環中に保持される持続時間を促進する効果を有し得る。所望の分子の導入のための他の適切な手段は、移植可能な薬物送達デバイスを含む。
【0205】
1つの実施形態において、薬学的組成物は、吸入のために処方され得る。例えば、B7−Lポリペプチドは、吸入のための乾燥粉末として処方され得る。B7−Lポリペプチドまたは核酸分子の吸入溶液はまた、エアロゾル送達のための噴霧剤と共に処方され得る。なお別の実施形態において、溶液は噴霧され得る。肺投与がさらに、国際公開番号WO94/20069(化学的に改変されたタンパク質の肺送達が記載されている)に記載されている。
【0206】
特定の処方物が、経口投与され得ることがまた意図される。本発明の1つの実施形態において、この様式で投与されるB7−Lポリペプチドは、固体投薬形態(例えば、錠剤またはカプセル)の調合において慣用的に使用されるキャリアを伴うか、または伴わず処方され得る。例えば、カプセルは、バイオアベイラビリティーが最大化され、そして全身前分解(pre−systemic degradation)が最小化される場合、胃腸管内でのある場所で処方物の活性部分を放出するように設計され得る。さらなる薬剤が、B7−Lポリペプチドの吸収を促進するために含まれ得る。希釈剤、香味剤、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、および結合剤もまた、使用され得る。
【0207】
別の薬学的組成物は、錠剤の製造に適切な非毒性賦形剤との混合物中に、有効量のB7−Lポリペプチドを含み得る。錠剤を滅菌水または別の適切なビヒクルに溶解することによって、溶液が、単位用量形態で調製され得る。適切な賦形剤は以下を含むが、これらに限定されない:不活性な希釈剤(例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムまたは重炭酸ナトリウム、ラクトース、あるいはリン酸カルシウム);または結合剤(例えば、デンプン、ゼラチンまたはアラビアゴム);あるいは潤滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルク)。
【0208】
さらなるB7−Lポリペプチドの薬学的組成物は、当業者に明らかであり、持続送達または制御送達処方物中にB7−Lポリペプチドを含む処方物を含む。種々の他の持続送達または制御送達手段(例えば、リポソームキャリア、生体侵食性微粒子あるいは多孔性ビーズおよび蓄積注射)を処方するための技術はまた、当業者に公知である。例えば、国際出願番号PCT/US93/00829(これは、薬学的組成物の送達のための多孔性ポリマー性微粒子の制御放出を記載する)を参照のこと。
【0209】
徐放性調製物のさらなる例としては、成形品の形態(例えば、フィルム、またはマイクロカプセル)の半透過性ポリマーマトリックスを含む。徐放性マトリックスとしては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号および欧州特許第058481号)、L−グルタミン酸とγエチル−L−グルタメートとのコポリマー(Sidmanら,1983,Biopolymers 22:547−56)、ポリ(2−ヒドロキシエチル−メタクリレート)(Langerら,1981,J.Biomed.Mater.Res.15:167−277およびLanger,1982,Chem.Tech.12:98−105)、エチレンビニルアセテート(Langerら,前出)またはポリ−D(−)−3−ヒドロキシ酪酸(欧州特許第133988号)が挙げられ得る。徐放性組成物はまた、リポソームを含み得、これは、当該分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって調製され得る。例えば、Eppsteinら,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688−92;および欧州特許第036676号、同第088046号、および同第143949号を参照のこと。
【0210】
インビボ投与のために使用されるB7−L薬学的組成物は、代表的に無菌的でなければならない。このことは、滅菌濾過膜を通じた濾過によって達成され得る。組成物が凍結乾燥される場合、この方法を使用した滅菌は、凍結乾燥および再構成の前後のいずれかで実施され得る。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥形態または溶液中で保存され得る。さらに、非経口用組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器(例えば、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアル)内に配置される。
【0211】
一旦、薬学的組成物が処方されると、これは、滅菌バイアル中に、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体として、または脱水粉末または凍結乾燥粉末として保存され得る。このような処方物は、ready−to−use形態または投与前に再構成を必要とする形態(凍結乾燥形態)のいずれかで保存され得る。
【0212】
特定の実施形態において、本発明は、単一用量投与単位を作製するためのキットに関する。このキットは、各々、乾燥タンパク質を有する第一の容器および水性処方物を有する第二の容器の両方を含み得る。単一チャンバーおよび多チャンバーの予め充填されたシリンジ(例えば、液体シリンジおよび分散シリンジ(lyosyringe))を含むキットもまた、本発明の範囲に含まれる。
【0213】
治療に使用されるB7−L薬学的組成物の有効量は、例えば、治療の内容および目的に依存する。従って当業者は、処置に対する適切な投薬レベルが、送達される分子、B7−L分子が使用される指標、投与の経路、ならびに患者の大きさ(体重、体表面、または器官の大きさ)および状態(年齢および全体的な健康)に、部分的に依存して変化することを理解する。従って、臨床医は、最適な治療効果を得るために、投薬量を力価決定し(titer)、そして投与経路を改変し得る。代表的な投薬量は、上記の因子に依存して、約0.1μg/kg〜約100mg/kg以上までの範囲またはそれ以上であり得る。他の実施形態において、投薬量は、0.1μg/kg〜約100mg/kgまでの範囲;または1μg/kg〜約100mg/kgまでの範囲;または5μg/kg〜約100mg/kgまでの範囲であり得る。
【0214】
投薬の頻度は、使用される処方物におけるB7−L分子の薬物動態学のパラメーターに依存する。代表的に、臨床医は、所望の効果を達成する投薬量に達するまで組成物を投与する。組成物は、従って、組成物は、単一用量として、経時的な2以上の用量(これは、同一量の所望の分子を含んでも、含まなくてもよい)として、あるいは移植デバイスまたはカテーテルを通じた連続的な注入として、投与され得る。適切な投薬量のさらなる改良は、当業者によって慣用的になされ、そして彼らによって慣用的に実施される課題の範囲内である。適切な投薬量は、適切な用量−応答データの使用を通じて確認され得る。
【0215】
薬学的組成物の投与経路は、以下のような公知の方法と一致する:例えば、経口的方法;静脈内経路、腹腔内経路、脳内(実質内)経路、脳室内経路、筋肉内経路、眼内経路、動脈内経路、門脈内経路、または病巣内経路による注入を通じた方法;徐放性系による方法;または移植デバイスによる方法。所望される場合、これらの組成物は、ボーラス注射によって投与され得るか、または注入によって連続的に投与され得るか、あるいは移植デバイスによって投与され得る。
【0216】
あるいは、またはさらに、組成物は、所望の分子を吸収またはカプセル化する膜、スポンジ、または他の適切な材料の移植を通じて局所的に投与され得る。移植デバイスが使用される場合、このデバイスは、任意の適切な組織または器官に移植され得、そして所望の分子の送達は、拡散、時限的放出ボーラスまたは連続的な投与を介し得る。
【0217】
いくつかの場合において、エキソビボ様式でB7−Lポリペプチドの薬学的組成物を使用することが所望され得る。このような例において、患者から採集された細胞、組織、または器官は、B7−Lポリペプチド薬学的組成物に曝露され、その後、これらの細胞、組織、または器官は、患者に移植して戻される。
【0218】
他の場合において、B7−Lポリペプチドは、本明細書中に記載されるような方法を使用して遺伝子操作された特定の細胞を移植することによって送達され、B7−Lポリペプチドが発現および分泌され得る。このような細胞は、動物またはヒト細胞であり得、そして自己性、非相同性、または異種性であり得る。必要に応じて、この細胞は不死化され得る。免疫学的応答の機会を減少させるために、細胞はカプセル化されて、周囲の組織の浸潤を回避され得る。カプセル化材料は、代表的に、タンパク質産物の放出を可能にするが、患者の免疫系または周囲の組織からの他の有害な因子による細胞の破壊を防止する、生体適合性の半浸透性ポリマー性包囲体または膜である。
【0219】
本明細書中で議論されるように、単離された細胞集団(例えば、幹細胞、リンパ球、赤血球、軟骨細胞、ニューロンなど)を1つ以上のB7−Lポリペプチドで処理することが、望ましくあり得る。このことは、細胞膜に対して透過性の形態である場合、単離された細胞をこのポリペプチドに直接曝露することによって達成され得る。
【0220】
本発明のさらなる実施形態は、治療ポリペプチドのインビトロ産生、および遺伝子治療または細胞治療による治療ポリペプチドの産生および送達の両方のための、細胞および方法(例えば、相同組換えおよび/または他の組換え産生方法)に関する。相同組換えおよび他の組換えの方法を使用して、通常は転写的にサイレントなB7−L遺伝子(すなわち、過少発現される遺伝子)を含む細胞を改変し得、これによって、治療有効量のB7−Lポリペプチドを発現する細胞を生成し得る。
【0221】
相同組換えは、本来は、転写的に活性な遺伝子における変異を誘導または修正するように遺伝子を標的化するために開発された技術である。Kucherlapati,1989,Prog.in Nucl.Acid Res.& Mol.Biol.36:301。基本的な技術は、特定の変異を哺乳動物ゲノムの特定の領域に導入するため(Thomasら、1986,Cell 44:419−28;ThomasおよびCapecchi,1987,Cell 51:503−12;Doetschmanら、1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:8583−87)、または欠損遺伝子における特定の変異を修正するため(Doetschmanら、1987,Nature 330:576−78)の方法として、開発された。例示的な相同組換え技術は、米国特許第5,272,071号;欧州特許第9193051号および同第505500号;国際出願番号PCT/US90/07642、ならびに国際公開番号WO 91/09955)に記載されている。
【0222】
相同組換えを通して、ゲノムに挿入されるDNA配列は、それを標的化DNAに取り付けられることによって、目的の遺伝子の特定の領域に指向され得る。この標的化DNAは、ゲノムDNAの領域に相補的(相同)であるヌクレオチド配列である。ゲノムの特定の領域に相補的な標的DNAの小片は、DNA複製プロセスの間に、親鎖と接触される。これは、ハイブリダイズするために細胞に挿入されたDNAの一般的な特性であり、それによって、共有の相同領域を通して、内因性DNAの他の片と組み換わる。この相補鎖が、変異もしくは異なる配列またはさらなるヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに取り付けられる場合には、これはまた、この組換えの結果として新たに合成された鎖に組み込まれる。プルーフリーディング機能の結果として、DNAの新たな配列がテンプレートとして機能することが可能である。それによって、移入されたDNAは、ゲノムに組み込まれる。
【0223】
B7−Lポリペプチドと相互作用し得るかまたはその発現を制御し得るDNAの領域(例えば、隣接配列)が、標的DNAのこれらの片に取り付けられる。例えば、プロモーター/エンハンサーエレメント、サプレッサー、または外因性転写調節エレメントが、意図される宿主細胞のゲノムに、所望のB7−LポリペプチドをコードするDNAの転写に影響を与えるのに十分に近位および十分な方向で、挿入される。制御エレメントは、この宿主細胞ゲノムに存在するDNAの一部を制御する。従って、所望のB7−Lポリペプチドの発現は、B7−L遺伝子自体をコードするDNAのトランスフェクションによってではなく、B7−L遺伝子の転写のための認識可能なシグナルを有する内因性遺伝子配列を提供するDNA調節セグメントと結合した標的化DNA(目的の内因性遺伝子と相同な領域を含む)の使用によって、達成され得る。
【0224】
例示的な方法において、細胞における所望の標的遺伝子(すなわち、所望の内因性細胞遺伝子)の発現は、少なくとも調節配列、エキソン、およびスプライスドナー部位を含むDNAの導入によって、予め選択された部位における細胞ゲノムへの相同組換えを介して変更される。これらの構成成分は、新たな転写ユニットが実際に生成されるような様式で、染色体(ゲノム)DNAに導入される(ここで、DNA構築物に存在する調節配列、エキソン、およびスプライスドナー部位は、内因性遺伝子に作動可能に連結されている)。染色体DNAへのこれらの構成成分の導入の結果として、所望の内因性遺伝子の発現が変化する。
【0225】
本明細書中で記載されるように、変化した遺伝子発現は、獲得されたとき、細胞中で通常はサイレントな(発現されていない)遺伝子の活性化(または発現の誘発)、ならびに獲得されたとき、細胞中で生理学的に有意なレベルでは発現されない遺伝子の発現の増加を包含する。この実施形態はさらに、獲得されたときに、細胞において生じている調節または誘導のパターンと異なるように調節または誘導のパターンを変化させること、および獲得されたとき、細胞中で発現されている遺伝子の発現を減少(排除を含む)させることを包含する。
【0226】
細胞の内因性B7−L遺伝子からのB7−Lポリペプチドの産生を増加するかまたはこれを引き起こすために相同定組換えが使用され得る方法の1つは、最初に、相同性組換えを使用して、部位特異的組換え系由来の組換え配列(例えば、Cre/loxP、FLP/FRT)(Sauer,1994,Curr.Opin.Biotechnol.,5:521−27;Sauer,1993,Methods Enzymol.,225:890−900)を、細胞の内因性ゲノムB7−Lポリペプチドコード領域の上流(すなわち、5’側)に配置することを包含する。ゲノムB7−Lポリペプチドコード領域のすぐ上流に配置された部位に相同な組換え部位を含むプラスミドは、適切なリコンビナーゼ酵素と共に、改変された細胞株に導入される。このリコンビナーゼによって、プラスミドは、このプラスミドの組換え部位を介して、この細胞株のゲノムB7−Lポリペプチドコード領域のすぐ上流に位置する組換え部位に組込まれ得る(BaubonisおよびSauer、1993,Nucleic Acids Res.21:2025−29;O’Gormanら、1991,Science 251:1351−55)。転写を増加させることが公知の任意の隣接配列(例えば、エンハンサー/プロモーター、イントロン、翻訳エンハンサー)は、このプラスミド中に適切に配置される場合、細胞の内因性B7−L遺伝子からのデノボまたは増加したB7−Lポリペプチド産生を生じる新たなまたは改変された転写ユニットを生成するような様式で統合する。
【0227】
部位特異的組換え配列が細胞の内因性ゲノムB7−Lポリペプチドコード領域のすぐ上流に配置された細胞株を使用するさらなる方法は、細胞株のゲノムの他の位置に第2の組換え部位を導入するために相同性組換えを使用することである。次いで、適切なリコンビナーゼ酵素が、二組換え部位の細胞株に導入され、細胞の内因性B7−L遺伝子からのデノボまたは増加したB7−Lポリペプチド産生を生じる新たなまたは改変された転写ユニットを生成する組換え現象(欠失、転化、および転移)を生じる(Sauer,1994,Curr.Opin.Biotechnol.,5:521−27;Sauer,1993,Methods Enzymol.,225:890−900)。
【0228】
細胞の内因性B7−L遺伝子からのB7−Lポリペプチドの発現を増加するため、または引き起こすためのさらなるアプローチは、細胞の内因性B7−L遺伝子からのデノボまたは増加したB7−Lポリペプチドの産生を生じる様式で、遺伝子(単数または複数)の発現を増加するかもしくは引き起こす工程(例えば、転写因子)、および/または遺伝子(単数または複数)の発現を減少する工程(例えば、転写リプレッサー)を包含する。この方法は、天然に存在しないポリペプチド(例えば、転写因子ドメインに融合した部位特異的DNA結合ドメインを含むポリペプチド)の細胞への導入を包含し、それによって、細胞の内因性B7−L遺伝子からのデノボまたは増加したB7−Lポリペプチドの産生が生じる。
【0229】
本発明はさらに、標的遺伝子の発現を変化させる方法において有用なDNA構築物に関する。特定の実施形態において、例示的なDNA構築物は、以下を含む:(a)1つ以上の標的化配列、(b)調節配列、(c)エキソン、および(d)不対スプライスドナー部位。DNA構築物中の標的化配列は、エレメント(a)〜(d)の細胞中の標的遺伝子への組込みを指向し、その結果、これらのエレメント(b)〜(d)は、内因性標的遺伝子の配列に作動可能に連結される。別の実施形態において、DNA構築物は、以下を含む:(a)1つ以上の標的化配列、(b)調節配列、(c)エキソン、(d)スプライスドナー部位、(e)イントロン、および(f)スプライスアクセプター部位。ここで、標的化配列は、エレメント(a)〜(f)の組込みを指向し、その結果、これらのエレメント(b)〜(f)は、内因性遺伝子に作動可能に連結される。標的化配列は、相同性組換えが生じる細胞染色体DNAの予め選択された部位に対して相同である。この構築物において、エキソンは、一般的に、調節配列の3’側であり、そしてスプライスドナー部位は、このエキソンの3’側である。
【0230】
特定の遺伝子の配列(例えば、本明細書中で記載されるB7−Lポリペプチドの核酸配列)が既知である場合、遺伝子の選択された領域に相補的なDNAの片が、合成されるかまたはそうでなければ獲得される(例えば、目的の領域に結合しているネイティブのDNAの特定の認識部位における適切な制限によって)。この片は、細胞に挿入された際に、標的化配列として作用し、そしてそのゲノム内の相同領域にハイブリダイズする。このハイブリダイゼーションが、DNA複製の間に生じる場合、このDNAの片、およびそれに結合した任意のさらなる配列は、Okazakiフラグメントとして作用し、そしてDNAの新たに合成された娘鎖に組み込まれる。従って、本発明は、B7−Lポリペプチドをコードするヌクレオチドを含み、このヌクレオチドは、標的化配列として使用され得る。
【0231】
B7−Lポリペプチド細胞治療(例えば、B7−Lポリペプチドを産生する細胞の移植)もまた企図される。この実施形態は、生物学的に活性な形態のB7−Lポリペプチドを合成および分泌し得る細胞を移植する工程を包含する。このようなB7−Lポリペプチド産生細胞は、B7−Lポリペプチドの天然のプロデューサーである細胞であり得るか、またはB7−Lポリペプチドを産生する能力が、所望のB7−Lポリペプチドをコードする遺伝子またはB7−Lポリペプチドの発現を増大する遺伝子で形質転換することによって増大された組換え細胞であり得る。このような改変は、遺伝子の送達、ならびにその発現および分泌を促進するために適切なベクターによって達成され得る。B7−Lポリペプチドを投与された患者における潜在的な免疫学的反応(外来種のポリペプチドの投与により生じ得るような反応)を最小化するために、B7−Lポリペプチドを産生する天然の細胞が、ヒト起源であり、そしてヒトB7−Lポリペプチドを産生することが好ましい。同様に、B7−Lポリペプチドを産生する組換え細胞が、ヒトB7−Lポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベクターで形質転換されることが好ましい。
【0232】
移植細胞は、周辺組織の浸潤を回避するようにカプセル化され得る。ヒトまたは非ヒト動物細胞は、B7−Lポリペプチドの放出を可能にするが、患者の免疫系または周辺組織からの他の有害な因子による細胞の崩壊を防止する、生体適合性の半透性ポリマー封入体または膜において患者に移植され得る。あるいは、B7−Lポリペプチドをエキソビボで産生するように形質転換された患者自身の細胞が、このようにカプセル化することなく、患者に直接移植され得る。
【0233】
生存細胞をカプセル化するための技術は当該分野で公知であり、そしてカプセル化された細胞の調製およびそれらの患者への移植は、慣用的に達成され得る。例えば、Baetgeら(国際公開WO95/05452および国際出願番号PCT/US94/09299)は、生物学的に活性な分子の効果的な送達のために遺伝子操作された細胞を含む膜カプセルを記載する。このカプセルは、生体適合性であり、そして容易に取り戻し可能である。このカプセルは、哺乳動物宿主に移植された際に、インビボで下方制御に供されないプロモーターに作動可能に連結された、生物学的に活性な分子をコードするDNA配列を含む組換えDNA分子でトランスフェクトされた細胞をカプセル化する。このデバイスは、生存細胞由来の分子のレシピエント内の特定の部位への送達を提供する。さらに、米国特許第4,892,538号;同第5,011,472号;および同第5,106,627号を参照のこと。生存細胞をカプセル化するためのシステムは、国際公開WO91/10425(Aebischerら)に記載される。国際公開番号WO91/10470(Aebischerら);Winnら、1991,Exper.Neurol.113:322−29;Aebischerら、1991,Exper.Neurol.111:269−75;およびTrescoら、1992,ASAIO 38:17−23もまた参照のこと。
【0234】
B7−Lポリペプチドのインビボおよびインビトロの遺伝子治療送達もまた想定される。遺伝子治療技術の一例は、構成的または誘発性プロモーターに作動可能に連結され得るB7−LポリペプチドをコードするB7−L遺伝子(ゲノムDNA、cDNAおよび/または合成DNAのいずれか)を使用して、「遺伝子治療DNA構築物」を形成することである。このプロモーターは、構築物が挿入される細胞または組織型において活性である場合、内因性B7−L遺伝子に対して同種性であっても異種性であってもよい。遺伝子治療DNA構築物の他の成分は、必要に応じて、部位特異的組込みのために設計されたDNA分子(例えば、相同組換えのために有用な内因性配列)、組織特異的プロモーター、エンハンサーまたはサイレンサー、親細胞を越える選択的優位性を提供し得るDNA分子、形質転換された細胞を同定するための標識として有用なDNA分子、ネガティブ選択系、細胞特異的結合因子(例えば、細胞標的化のための)、細胞特異的内部移行因子、ベクターからの発現を増大する転写因子、およびベクターの産生を可能にする因子を含む。
【0235】
次いで、遺伝子治療DNA構築物は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを使用して(エキソビボまたはインビボノいずれかで)細胞に導入され得る。遺伝子治療DNA構築物を導入するための1つの手段は、本明細書中に記載されるようなウイルスベクターの使用による。特定のベクター(例えば、レトロウイルスベクター)は、DNA構築物を細胞の染色体DNAに送達し、そしてこの遺伝子は、染色体DNAに組み込まれ得る。他のベクターは、エピソームとして機能し、そして遺伝子治療DNA構築物は、細胞質で保持される。
【0236】
さらに他の実施形態において、調節エレメントが、標的細胞におけるB7−L遺伝子の制御された発現のために包含され得る。このようなエレメントは、適切なエフェクターに応答して刺激される。このようにして、治療的ポリペプチドは、所望される場合に発現され得る。1つの従来の制御手段は、低分子結合ドメインおよび生物学的プロセスを開始し得るドメインを含むキメラタンパク質(例えば、DNA結合タンパク質または転写活性タンパク質)を二量化する低分子二量化剤またはラパログ(rapalog)の使用を包含する(国際公開番号WO96/41865、WO97/31898およびWO97/31899を参照のこと)。タンパク質の二量化は、導入遺伝子の転写を開始するために使用され得る。
【0237】
代替の調節技術は、目的の遺伝子から発現されたタンパク質を、凝集体またはクラスターとして細胞内に貯蔵する方法を使用する。目的の遺伝子は、小胞体における凝集タンパク質の保持を生じる、条件的凝集ドメインを含む融合タンパク質として発現される。貯蔵されたタンパク質は安定であり、そして細胞内で不活性である。しかし、このタンパク質は、条件的凝集ドメインを除去する薬物(例えば、低分子リガンド)を投与することによって放出され得、それにより、凝集体またはクラスターを特異的に破壊し、その結果、このタンパク質は細胞から分泌され得る。Aridorら、2000,Science 287:816−17およびRiveraら、2000,Science 287:826−30を参照のこと。
【0238】
他の適切な制御手段または遺伝子スイッチとしては、本明細書中で記載されるシステムが挙げられるが、これらに限定されない。Mifepristone(RU486)は、プロゲステロンアンタゴニストとして使用される。改変されたプロゲステロンレセプターリガンド結合ドメインのプロゲステロンアンタゴニストへの結合は、2つの転写因子のダイマーを形成することによって、転写を活性化し、次いで、核に至り、DNAに結合する。このリガンド結合ドメインは、天然のリガンドに結合するレセプターの能力を排除するように改変される。改変されたステロイドホルモンレセプター系はさらに、米国特許第5,364,791号、ならびに国際公開番号WO96/40911およびWO97/10337に記載される。
【0239】
さらに別の制御系は、エクジソンレセプター(細胞質レセプター)に結合し、そしてこれを活性化するエクジソン(ショウジョウバエステロイドホルモン)を使用する。次いで、このレセプターは核に転座し、特定のDNA応答エレメント(エクジソン応答性遺伝子由来のプロモーター)に結合する。エクジソンレセプターは、転写を開始するためのトランス活性化ドメイン、DNA結合ドメイン、およびリガンド結合ドメインを含む。エクジソン系はさらに、米国特許第5,514,578号、および国際公開番号WO97/38117、WO96/37609、およびWO93/03162に記載される。
【0240】
別の制御手段は、陽性テトラサイクリン制御可能トランスアクチベーターを使用する。この系は、転写を活性化するポリペプチドに連結された変異tetレプレッサータンパク質DNA結合ドメイン(逆テトラサイクリン調節トランスアクチベータータンパク質(すなわち、これは、テトラサイクリンの存在下でtetオペレーターに結合する)を生じた変異tet R−4アミノ酸変化)を含む。このような系は、米国特許第5,464,758号、同第5,650,298号、および同第5,654,168号に記載される。
【0241】
さらなる発現制御系および核酸構築物は、Innovir Laboratories Inc.に対する米国特許第5,741,679号および同第5,834,186号に記載されている。
【0242】
インビボ遺伝子治療は、B7−Lポリペプチドをコードする遺伝子を、B7−L核酸分子の局所注射によって、または他の適切なウイルスもしくは非ウイルス送達ベクターによって、細胞に導入することにより達成され得る。Hefti,1994,Neurobiology 25:1418−35。例えば、B7−Lポリペプチドをコードする核酸分子は、標的細胞への送達のためのアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターに含まれ得る(例えば、Johnson,国際公開番号WO95/34670;国際出願番号PCT/US95/07178を参照のこと)。組換えAAVゲノムは、代表的に、機能的プロモーターに作動可能に連結したB7−LポリペプチドをコードするDNA配列およびポリアデニル化配列に隣接するAAV逆末端反復を含む。
【0243】
代替の適切なウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、肝炎ウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、およびパピローマウイルスベクターが挙げられるがこれらに限定されない。米国特許第5,672,344号は、組換え神経栄養性HSV−1ベクターを含むインビボウイルス媒介遺伝子転移系を記載する。米国特許第5,399,346号は、治療タンパク質をコードするDNAセグメントを挿入するためにインビトロで処置されたヒト細胞の送達によって、治療タンパク質を患者に提供するためのプロセスの例を提供する。遺伝子治療技術の実施のためのさらなる方法および材料は、米国特許第5,631,236号(アデノウイルスベクターに関する)、同第5,672,510号(レトロウイルスベクターに関する)、同第5,635,399号(サイトカインを発現するレトロウイルスベクターに関する)に記載される。
【0244】
非ウイルス送達法としては、リポソーム媒介移入、裸のDNA送達(直接注射)、レセプター媒介移入(リガンド−DNA複合体)、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、および微粒子ボンバードメント(例えば、遺伝子銃)が挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子治療の材料および方法はまた、誘導性プロモーター、組織特異的エンハンサー−プロモーター、部位特異的組込みのために設計されたDNA配列、親細胞を超える選択的優性を提供し得るDNA配列、形質転換された細胞を同定するための標識、ネガティブな選択系および発現制御系(安全性の指標)、細胞特異的結合因子(細胞標的化のため)、細胞特異的インターナリゼーション因子、およびベクターによる発現を増大する転写因子ならびにベクターの製造方法を含み得る。遺伝子治療技術の実施のためのこのようなさらなる方法および材料は、米国特許第4,970,154号(エレクトロポレーション技術に関する)、同第5,679,559号(遺伝子送達のためのリポタンパク質含有系を記載する)、同第5,676,954号(リポソームキャリアに関する)、同第5,593,875号(リン酸カルシウムトランスフェクションのための方法を記載する)、および同第4,945,050号(生物学的に活性な粒子が一定の速度で細胞に噴霧され、それによりこの粒子がこの細胞の表面に浸透し、そしてこの細胞の内側に組み込まれるプロセスを記載する)、および国際公開番号WO96/40958(核リガンドに関する)に記載される。
【0245】
B7−L遺伝子治療または細胞治療はさらに、同一または異なる細胞における1つ以上のさらなるポリペプチドの送達を含み得ることもまた企図される。このような細胞は、患者に別々に導入され得るか、またはこの細胞は、単一の移植可能デバイス(例えば、上記のカプセル化膜)に含められ得るか、あるいはこの細胞は、ウイルスベクターによって別々に改変され得る。
【0246】
遺伝子治療による細胞における内因性B7−Lポリペプチドの発現を増加する手段は、B7−Lポリペプチドプロモーターに1つ以上のエンハンサーエレメントを挿入することであり、ここでエンハンサーエレメントは、B7−L遺伝子の転写活性を増加させるように作用し得る。使用されるエンハンサーエレメントは、遺伝子を活性化することを所望する組織に基づいて選択される−その組織においてプロモーター活性化を与えることが知られているエンハンサーエレメントが選択される。例えば、B7−Lポリペプチドをコードする遺伝子がT細胞において「オンに変わる(turn on)」場合、lckプロモーターエンハンサーエレメントが使用され得る。ここで、付加される転写エレメントの機能的部分は、標準的なクローニング技術を使用して、B7−Lポリペプチドプロモーターを含むDNAのフラグメントに挿入され得る(そして必要に応じて、ベクターならびに/または5’隣接配列および/もしくは3’隣接配列に挿入される)。「相同組換え構築物」として公知のこの構築物は、次いで、エキソビボまたはインビボのいずれかで、所望の細胞に導入され得る。
【0247】
遺伝子治療はまた、内因性プロモーターのヌクレオチド配列を改変することによって、B7−Lポリペプチド発現を減少させるために使用され得る。このような改変は、典型的に、相同組換え方法によって達成される。例えば、不活性化のために選択されたB7−L遺伝子のプロモーターの全てまたは一部を含むDNA分子は、転写を調節するプロモーターの断片を除去および/または置換するように操作され得る。例えば、プロモーターの転写活性化因子のTATAボックスおよび/または結合部位は、標準的な分子生物学的技術を使用して欠失され得;このような欠失は、プロモーター活性を阻害し得、それによって、対応するB7−L遺伝子の転写を阻止し得る。プロモーターにおけるTATAボックスまたは転写活性化因子結合部位の欠失は、B7−Lポリペプチドプロモーター(調節されるB7−L遺伝子と同じかまたは関連の種由来)のすべてまたは関連の部分を含むDNA構築物を生成することによって達成され得、ここで、1つ以上のTATAボックスおよび/または転写活性化因子結合部位のヌクレオチドは、1つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、および/または挿入によって変異される。結果として、TATAボックスおよび/または活性化因子結合部位は、活性を減少するか、または完全に不活化される。この構築物(これはまた、典型的に、改変されたプロモーターセグメントに隣接したネイティブの(内因性)5’および3’DNA配列に対応する少なくとも約500塩基のDNAを含む)は、直接または本明細書中に記載されるようなウイルスベクターを介してのいずれかで、適切な細胞に(エキソビボまたはインビボのいずれかで)導入され得る。典型的に、細胞のゲノムDNAへのこの構築物の組込みは、相同組換えを介し、ここで、このプロモーター構築物の5’および3’DNA配列は、内因性染色体DNAへのハイブリダイゼーションによって、改変プロモーター領域を組み込むのを補助するように作用し得る。
【0248】
(治療的用途)
B7−L核酸分子、ポリペプチド、ならびにそれらのアゴニストおよびアンタゴニストは、多数の疾患、障害または状態(本明細書中で引用されるものを含む)を処置、診断、改善または予防するために使用され得る。
【0249】
B7−Lポリペプチドアゴニストおよびアンタゴニストは、B7−Lポリペプチド活性を調節し、B7−Lポリペプチドの成熟形態の少なくとも1つの活性を増加または減少する分子を含む。アゴニストまたはアンタゴニストは、B7−Lポリペプチドと相互作用し、それによりその活性を調節する補因子(例えば、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質または低分子量分子)であり得る。潜在的なポリペプチドアゴニストまたはアンタゴニストは、B7−Lポリペプチドのタンパク質の細胞外ドメインの一部または全てを含むB7−Lポリペプチドの可溶性形態または膜結合形態のいずれかと反応する抗体を含む。B7−Lポリペプチド発現を調節する分子は、典型的に、発現のアンチセンス制御因子としてはたらき得るB7−Lポリペプチドをコードする核酸を含む。
【0250】
B7ファミリーの関連するメンバーを発現するトランスジェニックマウスが、精嚢過形成を示すので(同時係属中の米国特許第09/729,264(2000年11月28日出願))、B7−Lポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストは、生殖障害および増殖障害の処置に有用であり得る。
【0251】
B7−Lポリペプチドの過剰発現は、精嚢過形成を引き起こすことによって癌細胞の増殖および維持に役割を果たし得る。従って、B7−Lポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストは、癌の診断または処置に有用であり得る。このような癌の例としては、精嚢癌、肺癌、脳癌、乳癌、造血系の癌、前立腺癌、卵巣癌、および精巣癌が挙げられるが、これらに限定されない。他の癌が、本発明の範囲内に含まれる。
【0252】
B7−Lポリペプチドの過剰発現は、精嚢過形成を引き起こすことによって細胞の不適切な増殖に役割を果たし得る。B7−Lポリペプチドは、精嚢過形成を引き起こすことによって過剰発現に基づく細胞の不適切な増殖に役割を果たし得る。従って、B7−Lポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストは、異常な細胞増殖と関連する疾患の診断または処置に有用であり得る。このような疾患の例としては、動脈硬化症および脈管再狭窄が挙げられるが、これらに限定されない。細胞の不適切な増殖によって影響を受ける他の疾患が、本発明の範囲内に含まれる。
【0253】
B7−Lポリペプチドの過剰発現は、精嚢過形成を引き起こすことによって生殖系において役割を果たし得る。従って、B7−Lポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストは、生殖系と関連する疾患の診断または処置に有用であり得る。このような疾患の例としては、不妊、流産、早産(pre−term labor and delivery)および子宮内膜症が挙げられるが、これらに限定されない。生殖系の他の疾患が、本発明の範囲内に含まれる。
【0254】
好ましくは、本発明のB7−L核酸分子、ポリペプチド、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストは、T細胞機能と関連する疾患を処置、診断、改善、または予防するために使用される(例えば、T細胞レセプターデコイとして機能する)。例えば、延長されたT細胞活性化または増強されたT細胞活性を引き起こすB7−Lポリペプチドの抗体、細胞外ドメインを含む可溶性タンパク質、または他の調節因子は、腫瘍に対する免疫応答を増加するために使用され得る。
【0255】
本発明のB7−L核酸分子、ポリペプチド、ならびにアゴニストおよびアンタゴニストは、自己免疫疾患、移植片生存、腫瘍細胞増殖を阻害するための免疫細胞活性化、T細胞依存性B細胞媒介疾患、および癌遺伝子免疫治療の処置において使用され得る。1つの実施形態において、B7−Lポリペプチド機能のアゴニスト、可溶性B7−Lポリペプチド、またはB7−Lポリペプチド誘導体は、慢性免疫細胞機能不全を伴う疾患における症状を緩和するのに有益であり得る。全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、変形性関節症、免疫血小板減少性紫斑病(ITP)、および乾癬のような自己免疫疾患は、B7−Lポリペプチド機能のアゴニスト、可溶性B7−Lポリペプチド、またはB7−Lポリペプチド誘導体を用いて処置され得る。さらに、炎症性腸疾患(クローン病および潰瘍性大腸炎)、グレーヴス病、橋本甲状腺炎、および糖尿病のような慢性炎症性疾患もまた、B7−Lポリペプチド機能のアゴニスト、可溶性B7−Lポリペプチド、またはB7−Lポリペプチド誘導体を用いて処置され得る。
【0256】
B7−Lポリペプチド機能のアゴニスト、可溶性B7−Lポリペプチド、またはB7−Lポリペプチド誘導体は、骨髄および器官の移植のための免疫抑制剤として使用され得、そして移植片生存を延長するために使用され得る。このようなB7−Lポリペプチド機能のアゴニスト、可溶性B7−Lポリペプチド、またはB7−Lポリペプチド誘導体は、既存の処置を超える有意な利点を提供し得る。骨髄および組織移植治療は、宿主による外来細胞または外来組織のT細胞媒介拒絶と闘わなければならない。T細胞媒介拒絶を阻害するための現在の治療レジメンは、薬物(シクロスポリンまたはFK506)を用いた処置を含む。薬物は有効であるが、患者は、重篤な副作用(肝毒性、腎毒性、および神経毒性を含む)を被る。シクロスポリン/FK506クラスの治療剤に対する標的は、カルシニューリン(遍在的に発現するホスファターゼ)である。B7−Lポリペプチド機能のアゴニスト、可溶性B7−Lポリペプチド、またはB7−Lポリペプチド誘導体は、現在の免疫治療剤の使用で観察される重篤な副作用を欠き得る。B7−Lポリペプチド機能のアゴニスト、可溶性B7−Lポリペプチド、またはB7−Lポリペプチド誘導体は、自己免疫障害(例えば、慢性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬、多発性硬化症、糖尿病、および全身性エリテマトーデス)に対する免疫抑制剤として使用され得る。B7−Lポリペプチド機能のアゴニスト、可溶性B7−Lポリペプチド、またはB7−Lポリペプチド誘導体はまた、トキシックショック症候群、炎症性腸疾患、輸血に起因する同種感作、T細胞依存性B細胞媒介疾患、および対宿主性移植片病の処置を緩和するために使用され得る。
【0257】
例えば、多くのワクチンは、有効かつ特異的な抗体応答を誘発することによって作用する。いくつかのワクチン(特に、腸の微生物(例えば、A型肝炎ウイルスおよびSalmonella)に対するワクチン)は、短期の抗体応答を誘発する。このワクチンの有効性を増大するために、この応答を増強および延長することが望ましい。従って、可溶性B7−Lポリペプチドは、ワクチンアジュバントとして役立ち得る。
【0258】
逆に、B7−Lは負の免疫調節機能を有し得るので、抗体、低分子、ペプチド、または他のB7−L機能のアンタゴニストを使用するB7−L活性の阻害は、免疫増強および抗腫瘍活性を生じ得る。
【0259】
抗ウイルス応答もまた、B7−Lポリペプチド経路の活性化因子またはアゴニストによって増強され得る。B7−Lポリペプチドアンタゴニストによる細胞性免疫機能の増強もまた、ウイルス感染細胞を除去するのに有益であり得る。補完的な様式において、B7−Lポリペプチドアンタゴニストはまた、抗体媒介応答を増強し得、かつ体からウイルスを排除するのを補助するように機能し得る体液性免疫機能に対して効果を有し得る。
【0260】
逆に、抗体酸性の阻害によって改善する多数の臨床状態が存在する。過敏症は、通常は有益な免疫応答であり、これが悪化または不適切にされ、そして炎症反応および組織傷害を導く。抗体媒介性の過敏症反応は、B7−Lポリペプチド活性のアゴニスト、可溶性B7−Lポリペプチド、またはB7−Lポリペプチド誘導体による拮抗作用を特に受け易くあり得る。アレルギー、枯草熱、喘息および急性水腫は、I型過敏症反応を引き起こし、そしてこれらの反応は、B7−Lポリペプチド機能のアゴニスト、可溶性B7−Lポリペプチド、またはB7−Lポリペプチド誘導体によって抑制され得る。
【0261】
抗体媒介性過敏症反応を引き起こす疾患(全身性エリテマトーデス、関節炎(慢性関節リウマチ、反応性関節炎、および乾癬関節炎)、ネフロパシー(糸球体腎炎、膜性、膜性増殖性、病巣部分的(focal segmental)、病巣壊死性、半月体性、および増殖性の細尿管症)、皮膚障害(天疱瘡、類天疱瘡および結節性紅斑)、内分泌障害(甲状腺炎、グレーヴス病、橋本病、インスリン依存性糖尿病)、種々の肺障害(特に、外因性肺胞炎(extrinsic alveolitis)、種々の脈管障害、腹腔疾患(IgAの異常な産生を伴う)、多くの貧血および血小板減少症、ギラン・バレー症候群、および重症筋無力症を含む)は、B7−Lポリペプチド機能のアゴニスト、可溶性B7−Lポリペプチド、またはB7−Lポリペプチド誘導体を用いて処置され得る。
【0262】
さらに、リンパ増殖性障害(例えば、多発性骨髄腫、Waldenstromマクログロブリン血症、およびクリオグロブリン血症(crioglobulinemias))は、B7−Lポリペプチド機能のアゴニスト、可溶性B7−Lポリペプチド、またはB7−Lポリペプチド誘導体によって阻害され得る。最後に、対宿主性移植片病(「人工」の免疫障害)は、B7−Lポリペプチド機能のアゴニスト、可溶性B7−Lポリペプチド、またはB7−Lポリペプチド誘導体による抗体産生の阻害から利益を受け得る。
【0263】
B7−Lポリペプチド機能のアゴニストまたはアンタゴニストは、処置される状態に適切である1つ以上のサイトカイン、増殖因子、抗生物質、抗炎症剤、および/または化学療法剤と組み合わせて(同時にかまたは連続的に)使用され得る。
【0264】
所望されないレベルのB7−Lポリペプチドによって引き起こされるかまたは媒介される他の疾患は、本発明の範囲内に含まれる。所望されないレベルとしては、B7−Lポリペプチドの過剰レベルおよびB7−Lポリペプチドの正常下レベルが挙げられる。
【0265】
B7−Lポリペプチドは、免疫応答のネガティブな調節因子(PD−1)のためのリガンドである(Nishimuraら、1999,Immunity 11:141−51)。従って、このB7−Lポリペプチド経路のアゴニストは、おそらく免疫応答を阻害し、そしてこの経路のアンタゴニストは、免疫応答を増強し得る。しかし、B7−Lポリペプチド機能のアゴニストまたはアンタゴニストは、未知の生物学的因子に起因する予想外の結果を生じ得る。
【0266】
(B7−L核酸およびB7−Lポリペプチドの使用)
本発明の核酸分子(それ自体は生物学的に活性なポリペプチドをコードしない核酸分子を含む)を使用して、B7−L遺伝子および関連遺伝子の染色体上の位置をマッピングし得る。マッピングは、当該分野で公知の技術(例えば、PCR増幅およびインサイチュハイブリダイゼーション)により行われ得る。
【0267】
B7−L核酸分子(それ自体は生物学的に活性なポリペプチドをコードしない核酸分子を含む)は、哺乳動物組織または体液サンプル中のB7−L核酸分子の存在について、定性的または定量的のいずれかで試験するための、診断アッセイにおけるハイブリダイゼーションプローブとして有用であり得る。
【0268】
他の方法はまた、1つ以上のB7−Lポリペプチドの活性を阻害することが所望される場合に使用され得る。このような阻害は、発現制御配列(三重らせん形成)またはB7−L mRNAに相補的でありかつ発現制御配列(三重らせん形成)またはB7−L mRNAにハイブリダイズする核酸分子によりもたらされ得る。例えば、アンチセンスDNAまたはRNA分子(これらは、B7−L遺伝子の少なくとも一部に相補的である配列を有する)は、細胞中に導入され得る。アンチセンスプローブは、本明細書中に開示されるB7−L遺伝子の配列を使用して、利用可能な技術により設計され得る。代表的には、このようなアンチセンス分子の各々は、選択された各B7−L遺伝子の開始部位(5’末端)に相補的である。このアンチセンス分子が次いで、対応するB7−L mRNAにハイブリダイズする場合、このmRNAの翻訳は、防止されるかまたは低減される。アンチセンスインヒビターは、細胞または生物におけるB7−Lポリペプチドの減少または欠如に関連する情報を提供する。
【0269】
あるいは、遺伝子治療を使用して、1つ以上のB7−Lポリペプチドのドミナントネガティブインヒビターを作製し得る。この状況において、各選択されたB7−Lポリペプチドの変異体ポリペプチドをコードするDNAが、調製され得、そして本明細書中に記載されるウイルスまたは非ウイルスの方法のいずれかを使用して患者の細胞中に導入され得る。このような変異体の各々は、代表的にはその生物学的役割において内因性ポリペプチドと競合するように設計される。
【0270】
さらに、B7−Lポリペプチド(生物学的に活性でも活性でなくても)免疫原として使用され得、すなわち、これらのポリペプチドは、抗体が誘発され得る少なくとも1つのエピトープを含有する。B7−Lポリペプチドに結合する選択的結合因子(本明細書中に記載されるような)は、インビボおよびインビトロでの診断目的のために使用され得、これらの目的としては、体液サンプルまたは細胞サンプル中のB7−Lポリペプチドの存在を検出するための標識された形態での使用を含むが、これに限定されない。これらの抗体をまた使用して、本明細書中に列挙される疾患および障害を含む多数の疾患および障害を、予防、処置、または診断し得る。これらの抗体は、B7−Lポリペプチドの少なくとも1つの活性特徴を低減するかもしくは遮断するように、B7−Lポリペプチドに結合し得るか、またはポリペプチドに結合してB7−Lポリペプチドの少なくとも1つの活性特徴を増加し得る(B7−Lポリペプチドの薬物動態を増加させることによるものを含む)。
【0271】
B7−Lポリペプチドは、「発現クローニング」ストラテジーを使用して、B7−Lリガンドをクローニングするために使用され得る。放射性標識(125ヨウ素)されたB7−Lポリペプチドまたは「アフィニティー/活性−タグ化された」B7−Lポリペプチド(例えば、Fc融合物またはアルカリホスファターゼ融合物)を、結合アッセイにおいて使用して、B7−Lリガンドを発現する細胞型、細胞株、または組織を同定し得る。次いで、このような細胞または組織から単離されたRNAは、cDNAに変換され得、哺乳動物発現ベクターにクローニングされ、そして哺乳動物細胞(例えば、COSまたは293)にトランスフェクトされて発現ライブラリーを生成する。放射性標識されるかまたはタグ化されたB7−Lポリペプチドは、次いで、親和性試薬として使用されて、このライブラリーにおいてB7−Lリガンドを発現する細胞のサブセットを同定および単離し得る。次いで、DNAが、これらの細胞から単離され得、そして哺乳動物細胞にトランスフェクトされて二次発現ライブラリー(ここで、B7−Lリガンドを発現する細胞の画分は、元のライブラリーよりも何倍も高い)を作製し得る。この富化プロセスは、B7−Lリガンドを含有する単一の組換えクローンが単離されるまで繰り返し反復され得る。B7−Lリガンドの単離は、B7−Lシグナル伝達経路の新規なアゴニストおよびアンタゴニストを同定または開発するために有用である。このようなアゴニストおよびアンタゴニストとしては、B7−Lリガンド、抗B7−Lリガンド抗体、低分子またはアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【0272】
ヒトB7−Lポリペプチドをコードし、pGEM−T−Easy(Promega,Madison,WI)へとサブクローニングされ、そして登録番号PTA2481を有するcDNAの寄託は、American Type Culture Collection,10801 University Boulevard,Manassas,VA 20110−2209に、2000年9月19日になされた。
【0273】
本発明のヒトB7−L核酸もまた、対応する染色体B7−Lポリペプチド遺伝子を単離するための手段として有用である。このヒトB7−LゲノムDNAは、遺伝的な組織変性疾患を同定するために使用され得る。
【0274】
以下の実施例は、例示目的のみのためであることが意図され、そして決して本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【0275】
(実施例1:ヒトB7−Lポリペプチド遺伝子のクローニング)
概して、Sambrookら(前出)に記載されるような材料および方法を、ヒトB7−LポリペプチドおよびマウスB7−Lポリペプチドをコードする遺伝子をクローニングおよび分析するために使用した。
【0276】
Genbank−EMBLデータベースの検索を、TBLASTXプログラム(http://blast.wustl.edu)および問い合わせ配列としてB7−H1を用いて実行した。ヒトゲノムクローン(Celera Genomics,Rockville,MD,GA_16817596)を、B7ファミリーの推定の新規メンバーをコードする核酸配列を含むとして同定した。部分的B7−L核酸配列を含むクローン(GenBank登録番号AK001872)を使用して、このB7ファミリーのこの推定の新規メンバーについての推定cDNA配列を構築した。
【0277】
種々のcDNAライブラリーおよびMarathon cDNAライブラリー(Clontech,Palo Alto,CA)由来のプラスミドDNAを、プライマー2515−27(5’−C−A−T−A−A−T−A−G−A−G−C−A−T−G−G−C−A−G−C−A−A−T−G−T−G−A−C−3’;配列番号26)および2524−63(5’−G−G−G−T−C−C−T−G−G−A−G−T−G−G−C−T−G−G−T−G−T−T−G−3’;配列番号27)を用いて実行するPCR増幅におけるテンプレートとして使用した。このPCRプライマーを、上記で同定したcDNA配列中の推定エキソン内の配列に対応するように設計した。PCR増幅を標準的な技術を用いて実行した。
【0278】
予想した400bpのPCRフラグメントを、ヒト胎児胃、胸腺、頭皮、頭蓋冠、大腿、腸間膜、脾臓、脊柱、気管、および胎盤から作製したcDNAライブラリーから獲得した。さらに、予想したフラグメントを、ヒト成人T細胞、橋/髄質、および中脳LVNから得た。さらに、予想したフラグメントを、リンパ系細胞株において、ならびに結腸、胸部、卵巣、および肺の腫瘍において得た。ヒト胎児の副腎、脳、腎臓、肝臓、肺、脾臓、および胸腺、ならびに成人の骨髄、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、胎盤、網膜、骨格筋、小腸、脾臓、精巣および胸腺についてのMarathon cDNAライブラリーもまた、推定フラグメントを生じた。この400bpのフラグメントをまた、ヒト混合組織cDNAのサブプール(E4)から得た(このサブプールは、約15,000個のクローンを含む)。このサブプールは、全長cDNAクローンについて最適化した、特別に合成したライブラリー(LTI−FL,Life Technologies Inc.,Rockville,MD)に由来した。
【0279】
ヒト混合組織cDNAのPCR増幅物において得られた400bpのフラグメントを、単離し、そしてpGEM−T−Easy(登録商標)ベクター(Promega,Madison,WI)へとクローニングした。選択したクローンのDNA配列を決定して、このクローンの配列が元々同定されたゲノム配列の配列と同一であったことを確認した。次いで、400bpのフラグメントを、このベクターから切り出し、そして32P−dCTPの取り込みによって標識した。標識したフラグメントを使用して、PCR増幅実験の前にポジティブであると試験したLTI−FL cDNAライブラリーの15,000個のクローンのサブプール由来の150,000個の細菌コロニーをスクリーニングした。コロニーを、LB/アンピシリンプレートからニトロセルロースフィルターに写し、6×SSC、0.5% SDS、1×デンハルト溶液および100μg/ml 変性サケ精子DNA中、60℃で3時間プレハイブリダイズさせた。1×106cpm/mlの32P標識プローブの添加後、ハイブリダイゼーションを同じ条件下で一晩実行した。フィルターを、2×SSCおよび0.1% SDS中、室温で30分間、2回洗浄し、次いで、0.1×SSCおよび0.1% SDS中、65℃で30分間、2回洗浄した。次いで、フィルターを、増感スクリーンを用いて−80℃で6時間、X線フィルムに露光させた。
【0280】
いくつかのポジティブコロニーを、この様式で同定し、そして、これらクローン由来のプラスミドDNAを、標準的な方法によって調製した。このコロニー由来のcDNA挿入物は、約2.2kb長であった。DNA配列分析によって、これらのクローンが、B7ファミリーの新しいメンバー(B7−L)の推定コード領域を含むこと、およびこれらのクローンにおいて同定した核酸配列が、ゲノムクローンGA_16817596において同定された核酸配列と同一であることを確認した。
【0281】
ヒトB7−Lポリペプチドの全長cDNAの配列分析によって、この遺伝子が、273アミノ酸のタンパク質をコードする819bpのオープンリーディングフレームを含むことが示された(図1)。HP G100 Protein Sequencerを使用して、成熟B7−Lポリペプチドのアミノ末端を配列決定し、そしてアミノ酸配列L−F−T−V−T−V−P−K−E−L−Y−I−I−E(配列番号28)を含むことが見出され、これにより、B7−Lポリペプチドが、そのアミノ末端に19アミノ酸長の単一ペプチドを有することを確証した(図1を参照のこと;推定の単一ペプチドは、下線で示される)。
【0282】
このクローンにおいて同定された核酸配列は、オープンリーディングフレーム全体を含むが、B7−L転写物の完全な5’未翻訳領域は含まなかった。この配列は、プライマー2515−24(5’−G−T−G−G−C−T−C−T−T−T−C−A−C−G−G−T−G−T−G−G−G−G−A−T−G−3’;配列番号29)および2538−68(5'−C−C−A−G−T−G−T−C−A−A−A−G−T−T−G−C−A−T−T−C−C−A−G−G−G−T−3’;配列番号30)、ならびに以下のテンプレートを使用する、連続回の5’RACEを使用して決定する:胎児の肝臓、脾臓、および胸腺、ならびに成人の骨髄、肺、および脾臓由来のMarathon cDNAライブラリー;リンパ腫細胞株および卵巣腫瘍由来のcDNAライブラリー;ならびに胎児の脾臓、胎盤ならびに成人のT細胞および脊柱由来のcDNAライブラリー。標準的なRACEプロトコルを使用した。リンパ腫細胞株、胎児の脾臓、胎盤および成人のT細胞のRACE増幅について、明瞭なバンドを得た。これらの産物を、pGEM−T−Easy(登録商標)ベクターへと連結した。このB7−L転写物の5’未翻訳領域の配列を、これらの形質転換反応物から選択したクローンを配列決定することによって決定した。
【0283】
B7−L遺伝子の推定タンパク質産物は、タンパク質のB7ファミリーに関連する。これらのタンパク質は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、そしてT細胞媒介免疫応答の調節因子として作用する。タンパク質のB7ファミリーのメンバーは、小細胞質ドメイン、ならびに免疫グロブリンV(可変)およびC(定常)ドメインを含む細胞外領域を有する、1型膜タンパク質である。B7ファミリーの既知メンバーとしては、CD80(B7−1)、CD86(B7−2)、B7−rp1、およびB7−H1が挙げられる。B7−1およびB7−2は、CD28およびCTLA−4と相互作用し、そしてこのB7−1およびB7−2は、T細胞同時刺激経路のメディエータである。B7−rp1は、別のレセプター(ICOS;誘導性同時刺激因子)に結合し、そしてまた、T細胞増殖の刺激因子である。B7−H1もまた、T細胞増殖を同時刺激するが、CD28、CTLA−4、またはICOSに結合しない。このファミリーのタンパク質配列は、ほとんど保存されておらず、そして結果的に、コンピュータによる方法を使用して他の関連分子から識別することが困難である(特に、全長コード領域配列の一部分のみを比較する場合)。このB7ファミリーに対して配列相同性を示す他のタンパク質としては、ブチロフィリンおよびPRO352が挙げられる。なおより関連性が遠いものは、ミエリン稀突起膠細胞タンパク質(MOG)である。図2A〜2Cは、ヒトタンパク質B7−Lポリペプチド(GA16817596)、CD80(B7−1)、CD86(B7−2)、B7−H1、B7rp−1、PRO352、ブチロフィリンBTF1、ブチロフィリンBTF2、ブチロフィリンBTF4、ブチロフィリンBTF3、およびブチロフィリンのアミノ酸配列の整列を示す。
【0284】
マウスB7−Lオルソログの全長配列を、1999年6月1日にGenBankに寄託した(登録番号AF142780)。このマウスB7−Lオルソログは、寄託の時点で、B7/ブチロフィリンファミリーに正確に配置された。B7−LポリペプチドのC末端部分から173アミノ酸をコードする部分的ヒトB7−L cDNA配列を、2000年2月23日にGenBankに寄託した(登録番号AK001872)。このクローンによってコードされる部分的ポリペプチドは、寄託の時点では、特定のタンパク質ファミリーに割当てられなかった。
【0285】
B7−L遺伝子についての部分的なイントロン−エキソン構造を、ゲノムクローンGA_43440610、GA_43068628、GA_43068627、およびGA_43440600(Celera Genomics)から誘導した。図3A〜3Eは、ヒトB7−Lポリペプチドのゲノムヌクレオチド配列(配列番号14)の一部分を示す。エキソン1の推定アミノ酸配列(配列番号19)の位置を、図3Cに示す。図3A〜3Eに示される配列は、未知サイズのギャップによって、図4に示されるゲノムヌクレオチド配列の部分(配列番号15)から分離されている。図4に示される配列は、約2400塩基のマスクされた配列によって、図5A〜5Fに示されるゲノムヌクレオチド配列(配列番号16)から分離されている。エキソン2の推定アミノ酸配列(配列番号20)の位置が、図5Dに示されている。図5A〜5Fに示される配列は、約9600塩基のギャップによって、図6A〜6Bに示されるゲノムヌクレオチド配列(配列番号17)から分離されている。エキソン3の推定アミノ酸配列(配列番号21)の位置は、図6Aに示されている。図6A〜6Bに示される配列は、約720塩基のマスクされた配列によって、図7A〜7Mに示されるゲノムヌクレオチド配列(配列番号18)から分離されている。エキソン4(配列番号22)、5(配列番号23)、および6の推定アミノ酸配列の位置は、それぞれ図7D〜7E、7H、および7Lに示されている。
【0286】
(実施例2:B7−L mRNA発現)
多重ヒト組織ノーザンブロット(Clontech)を、ヒトB7−L cDNA配列のヌクレオチド33〜906に対応する874bpのプローブにハイブリダイズさせた。このプローブを、製造者の指示に従ってPrime−It RmT Random Primer Labelingキット(Stratagene)を使用して放射性標識した。ノーザンブロットを、製造者の指示に従ってハイブリダイズおよび洗浄し、次いで、オートラジオグラフィーに曝露した。図8は、このノーザンブロット分析の結果を示す。
【0287】
B7−L mRNAの発現は、インサイチュハイブリダイゼーションによって局在化する。正常な胚組織および成体マウス組織のパネルを、4% パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン中に包理し、そして5μmに切片にする。切片化した組織を、0.2M HCl中で透過化処理し、プロテイナーゼKで消化し、そしてトリエタノールアミンおよび無水酢酸でアセチル化する。切片を、ハイブリダイゼーション溶液(300mM NaCl、20mM Tris−HCl、pH8.0、5mM EDTA、1×デンハルト溶液、0.2% SDS、10mM DTT、0.25mg/ml tRNA、25μg/ml ポリA、25μg/ml ポリCおよび50%ホルムアミド)中で1時間60℃でプレハイブリダイズし、次いで、10%デキストランおよび2×104cpm/μlの33P−標識アンチセンスリボプローブ(ヒトB7−L遺伝子に相補的)を含有する同じ溶液中で60℃で一晩ハイブリダイズさせる。標準的技術を用いて、ヒトB7−L cDNA配列を含有するクローンのインビトロ転写によって、このリボプローブを得る。
【0288】
ハイブリダイゼーション後、切片を、ハイブリダイゼーション溶液中でリンスし、RNaseAで処理してハイブリダイズしていないプローブを消化し、次いで0.1×SSC中で55℃で30分間洗浄する。次いで、切片をNTB−2エマルジョン(Kodak,Rochester,NY)に浸し、4℃に3週間曝し、発色させ、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで対比染色する。組織形態学およびハイブリダイゼーションシグナルを、脳(矢状切片1つおよび冠状切片2つ)、胃腸管(食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、近位結腸、および遠位結腸)、下垂体、肝臓、肺、心臓、脾臓、胸腺、リンパ節、腎臓、副腎、膀胱、膵臓、唾液腺、雄性および雌性生殖器(雌性の卵巣、卵管、および子宮;ならびに雄性の精巣、精巣上体、前立腺、精嚢および輸精管)、BATおよびWAT(皮下、腎臓周囲)、骨(大腿)、皮膚、乳房、および骨格筋についての暗視野照明法かつ標準照明法によって同時に分析する。
【0289】
(実施例3:B7−Lポリペプチドの産生)
(A.細菌におけるB7−Lポリペプチドの発現)
PCRを用いて、B7−LポリペプチドをコードするテンプレートDNA配列を増幅する。このPCRには、この配列の5’および3’末端に対応するプライマーを用いる。増幅したDNA産物を改変して、発現ベクター内への挿入を可能にするために制限酵素部位を含むようにし得る。PCR産物をゲル精製し、そして標準的組み換えDNA方法論を用いて発現ベクター中に挿入する。luxプロモーターおよびカナマイシン耐性をコードする遺伝子を含むpAMG21(ATCC番号98113)のような代表的なベクターを、挿入したDNAの方向性クローニングのために、BamHIおよびNdeIを用いて消化する。連結した混合物を、エレクトロポレーションによってE.coli宿主株中に形質転換し、そして形質転換体をカナマイシン耐性について選択する。選択したコロニー由来のプラスミドDNAを、単離し、そしてDNA配列決定に供してインサート(挿入物)の存在を確認する。
【0290】
形質転換した宿主細胞を、導入前に、30μg/mLカナマイシンを含有する2×YT培地中で30℃でインキュベートする。最終濃度30ng/mLへのN−(3−オキソヘキサノイル)−dl−ホモセリンラクトンの添加、それに続く30℃かまたは37℃での6時間のインキュベーションによって、遺伝子発現を誘導する。B7−Lポリペプチドの発現を、培養物の遠心分離、細菌ペレットの再懸濁および溶解、ならびに、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動による宿主細胞タンパク質の分析によって評価する。
【0291】
B7−Lポリペプチドを含有する封入体を、以下の通り精製する。細菌細胞を遠心分離によってペレット化し、そして水中に再懸濁する。この細胞懸濁液を超音波処理によって溶解し、そして195,000×gでの5〜10分間の遠心分離によってペレット化する。この上清を廃棄し、そしてペレットを洗浄してホモジナイザーに移す。このペレットを、均一に懸濁されるまで、5mLのPercoll溶液(75%液体Percollおよび0.15M NaCl)中でホモジナイズし、次いで希釈して21,600×gで30分間遠心分離する。封入体を含む勾配画分を回収してプールする。単離した封入体をSDS−PAGEによって分析する。
【0292】
E.coliが産生したB7−Lポリペプチドに相当する、SDSポリアクリルアミドゲル上の単一のバンドを、ゲルから切り出し、そしてN末端アミノ酸配列を、本質的にMatsudairaら、1987,J.Biol.Chem.262:10〜35に記載のように決定する。
【0293】
(B.哺乳動物細胞におけるB7−Lポリペプチドの発現)
PCRを用いて、B7−LポリペプチドをコードするテンプレートDNA配列を増幅する。このPCRには、この配列の5’および3’末端に対応するプライマーを用いる。増幅したDNA産物を改変して、発現ベクター内への挿入を可能にするために制限酵素部位を含むようにし得る。PCR産物をゲル精製し、そして標準的組み換えDNA方法論を用いて発現ベクター中に挿入する。エプスタイン−バーウイルス複製起点を含む代表的な発現ベクターであるpCEP4(Invitrogen,Carlsbad,CA)を、293−EBNA−1細胞におけるB7−Lポリペプチドの発現のために用い得る。増幅およびゲル精製したPCR産物を、pCEP4ベクターに連結し、そしてリポフェクチンによって293−EBNA細胞中に導入する。トランスフェクトした細胞を、100μg/mLのハイグロマイシン中で選択し、そして得られた薬物耐性培養物をコンフルエンスになるまで増殖する。次いで、この細胞を無血清培地中で72時間培養する。馴化培地を取り出し、B7−Lポリペプチド発現をSDS−PAGEによって分析する。
【0294】
B7−Lポリペプチド発現は、銀染色によって検出できる。あるいは、B7−Lポリペプチドを、ペプチドタグに対する抗体を用いてウエスタンブロット分析によって検出可能であり得る、エピトープタグ(例えば、IgG定常ドメインまたはFLAGエピトープ)を有する融合タンパク質として生成する。
【0295】
B7−Lポリペプチドを、SDS−ポリアクリルアミドゲルから切り出し得るか、またはB7−L融合タンパク質を、エピトープタグに対するアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、そして本明細書に記載のようにN末端アミノ酸配列分析に供する。
【0296】
(C.哺乳動物細胞におけるB7−Lポリペプチド/Fc融合タンパク質の発現)
B7−Lポリペプチドのアミノ末端に220アミノ酸をコードするB7−L cDNAの660bpフラグメント(これは、B7−Lポリペプチドのシグナルペプチドおよび細胞外ドメインを含む)を、適切なプライマーおよび標準的な技術を使用して、PCRによって増幅した。実施例1に記載される特別に合成したライブラリーから単離したプラスミドDNAを、PCR増幅におけるテンプレートとして使用した。
【0297】
次いで、この660bpのフラグメントを、発現ベクター(pCEP4/Fc、これは、ヒトFc(IgG−1)のカルボキシル末端の235アミノ酸をコードする核酸配列を含む)へとクローニングした。コロニーを、細菌細胞の形質転換後に選択し、そしてpCEP4−B7−L/FcプラスミドDNAを、標準的な技術を使用して単離した。
【0298】
単離したプラスミドDNAを用いて、製造者の指示に従ってFuGENE 6 Transfection Reagent(Roche Molecular Biochemicals,Indianapolis,IN)を使用して、293−EBNA−1細胞をトランスフェクトした。形質転換後、この細胞を、10%ウシ胎仔血清を補充したDMEM培地中、37℃で24時間培養し、次いでDMEM無血清培地に移し、そして37℃で5日間増殖させた。このB7−Lポリペプチド/Fc融合タンパク質を、製造者の指示に従ってHiTrap Protein A Column(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)上で順化培地から精製し、次いでこの融合タンパク質を、PBS中で透析した。この精製したタンパク質の濃度を、標準としてCoomassie(登録商標)Plus Protein Assay Reagent(Pierce,Rockford,IL)およびBSAを使用して、製造者の指示に従って測定した。
【0299】
(実施例4:新規PD−1リガンドとしてのB7−Lポリペプチドの同定)
既知のB7媒介同時刺激経路の1つにおいてB7−Lポリペプチドが機能するか否かを決定するために、B7−Lポリペプチド/Fc融合タンパク質での処理後に、CD28、CRP−1/ICOS、またはPD−1を発現するCHO D−細胞上でFACS分析を行った。
【0300】
マウスPD−1(mPD−1;Ishidaら、1992,EMBO J.11:3887−95)をコードし、そしてネイティブのPD−1シグナルペプチドを含む全長核酸配列を、Hind IIIおよびSal I制限エンドヌクレアーゼ部位を組み込むプライマーを使用する、マウス活性化脾臓リンパ球cDNAライブラリーのPCR増幅によって得た。得られたPCR産物を、Hind IIIおよびSal Iで消化し、次いでpDSRa−19ベクターに連結した。細菌細胞への形質転換後、クローンを選択し、そして配列決定した。全長mPD−1 cDNA配列を含むクローン(クローン1.5)を、制限エンドヌクレアーゼPvu Iを使用して直線化し、そしてこの直線化したプラスミドを使用して、リン酸カルシウム法によってCHO D−細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトしたCHO D−細胞を培養し、そして数週間後に、個々のコロニーを、リングクローンング(ring cloning)を介して単離した。高発現トランスフェクト体(クローン3.36)を、それがB7−H1/Fc融合タンパク質に特異的に結合する能力について同定した(Dongら,1999,Nat.Med.5:1365−69)。
【0301】
ベクター単独、mPD−1(クローン3.36)、ヒトCD28、またはmCRP1/ICOS(クローン1.41;Yoshinagaら,1999,Nature 402:827−32)を発現するCHO D−細胞を、5%dFBS、1×PSG、および1×NEAAを補充したDMEM中、T175フラスコで培養した。細胞を、Cell Dissociation Solution(Sigma,St.Louis,MO)を使用してこの培養フラスコから出し、洗浄緩衝液(0.5%BSA含有PBS)中で希釈し、次いで計測した。
【0302】
0.1mlの培地中の約3.0×105個の細胞を、1μgの精製したマウスCRP1/Fc、ヒトB7−Lポリペプチド/Fc、マウスB7rp−1/Fc、またはマウスB7−2/Fcと氷上で1時間反応させた。CHO D−細胞をまた、上記のように(この細胞を、mB7−H1/Fcを発現するCHO D−細胞から収集した無血清順化培地1ml中の10μgの融合タンパク質に曝露したことを除いて)、マウスB7−H1/Fcと共にインキュベートした。インキュベーション後、細胞を5mlの洗浄緩衝液で希釈し、遠心分離し、次いで5mlの洗浄緩衝液中で2回洗浄した。次いで、この細胞を、10μg/mlのヤギ抗ヒトIgG Fc特異的FITC結合体化検出抗体(Chemicon,Temecula CA)を含む100μlの洗浄緩衝液中に再懸濁した。この細胞を、氷上で30分間反応させ、次いで上記のように洗浄した。洗浄後、細胞を、最終容量1mlの洗浄緩衝液中に再懸濁させ、次いでFACS Star(Beckman Dickinson,Franklin Lakes,NJ)を使用して分析した。
【0303】
図9に示されるように、B7−Lポリペプチドは、PD−1レセプターに特異的に結合するが、CD28またはCRP−1/ICOSレセプターには結合しない。この融合タンパク質B7−2/FcおよびB7rp−1/Fcは、予期された通りに、CD28およびCRP−1/ICOSレセプターに結合した。B7−H1もまたPD−1レセプターに特異的に結合することが示されたので(図9B)、FACS分析は、B7−LポリペプチドおよびB7−H1の両方が、PD−1レセプターについてのリガンドであることを示す。PD−1は、T細胞増殖のネガティブな調節因子であるので(Nishimuraら,1999,Immunity 11:141−51)、可溶性B7−Lポリペプチドを介するこの経路の活性化は、免疫応答の減少を生じ得る。逆に、B7−Lポリペプチドに対するアンタゴニスト抗体は、免疫応答を増大し得る。
【0304】
(実施例5:B7−LポリペプチドによるT細胞増殖の阻害)
B7−Lポリペプチドが、T細胞増殖における役割を果たすか否かを決定するために、B7−Lポリペプチド/Fc融合タンパク質を使用してヒトT細胞増殖アッセイを行った。高度に精製されたヒトT細胞(>98% CD3+)を、Pan T細胞単離キット(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)を使用して、新鮮であるかまたは解凍した、接着性が劣化した末梢血単核細胞(PBMC)のネガティブ選択によって単離した。丸底96ウェル細胞培養プレートを、0.5または1.5μg/mlの抗CD3抗体(PharMingen,San Diego,CA)、10μg/mlの抗ヒトIgG Fc(Sigma)、およびPBS(容量0.1ml)で、4℃で一晩プレコーティングした。このプレコーティング溶液を除去し、このプレートをPBSで1回洗浄し、そして10%のFCS培地を補充したRPMI 1640または培地単独中、20μg/mlまで希釈した0.1mlのB7−Lポリペプチド/Fc、B7−2/FcまたはB7rp−1/Fc融合タンパク質を、このウェルに加えた。次いで、このプレートを、37℃で4時間インキュベートした。インキュベーション後、培地を除去し、そして0.2mlの精製T細胞(10×105個の細胞を含む)をプレコーティングした各ウェルに加えた。次いで、このプレートを、37℃で48時間インキュベートした。インキュベーション後、1μCi/ウェルの[3H]チミジンを各ウェルに加え、そしてこの培養物を37℃でさらに18時間インキュベートした。次いで、この細胞を収集し、そして1分当たりのカウント(CPM)を測定した。
【0305】
図10に示されるように、B7−Lポリペプチド/Fc融合タンパク質は、抗CD3抗体のいずれの濃度でも、抗CD3媒介性T細胞増殖を阻害し得た。逆に、B7rp−1/FcおよびB7−1/Fc融合タンパク質は、同じ条件下でT細胞増殖を同時刺激することが示された。これらの結果は、B7−LポリペプチドがT細胞増殖のネガティブな調節因子であることを示す。さらに、これらの結果は、B7−Lポリペプチド/Fc融合タンパク質、または他の可溶性B7−Lポリペプチド誘導体が、免疫機能を阻害するために使用され得、それによって好都合な治療結果を提供することを示唆する。インビトロアッセイ(例えば、本明細書中に記載されるアッセイ)もまた、B7−Lポリペプチド活性の抗体インヒビター、可溶性タンパク質インヒビター、または低分子インヒビターについてスクリーニングするために使用され得る。
【0306】
(実施例6:B7−Lポリペプチドレセプターは、ヒト末梢血単核細胞で発現される)
FACS分析を使用して、ヒトPBMCにおけるT細胞およびB細胞に対するB7−Lポリペプチドレセプターを同定した。Ficoll−Paque(Amersham Pharmacia Biotech)勾配遠心分離を使用して、健常なヒトのボランティアから得た血液からPBMCを精製し、そしてこの細胞を、10μg/mlのリポ多糖(LPS)中での3日間のインキュベーションによって刺激した。LPS処理後、0.2mlの容量中の5×105個の細胞を、氷上で10分間、100μg/mlのヒトIgG Fcでブロックした。次いで、この細胞を、10μg/mlの種々のビオチン化Fc融合タンパク質(または適切なコントロール)と共に、氷上で30分間インキュベートした。Fc融合タンパク質とのインキュベーション後、図11において示される細胞サンプルを、抗CD3抗体(PharMingen)または抗CD19抗体(Becton Dickinson)と共に氷上で30分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄緩衝液(0.5%BSA含有PBS)中で2回洗浄し、次いで氷上で30分間、FITCアビジン(1:100希釈)で染色した。この細胞を、1mlの洗浄緩衝液中に再懸濁し、そしてFACS Starで分析した。
【0307】
図11に示されるように、B7−Lポリペプチド/Fcタンパク質は、末梢血単核細胞(PBMC)の有意な集団に結合した。B7−Lポリペプチド/Fc融合タンパク質およびT細胞(CD3)マーカーまたはB細胞(CD19)マーカーを用いる二重染色によって、B7−Lポリペプチド/Fc融合タンパク質が結合する細胞の一部分が、T細胞およびB細胞であったことが示された。しかし、有意な数のB7−Lポリペプチドレセプター発現細胞はまた、T細胞またはB細胞ではないことが示された。従って、PMBC中の非リンパ球、ならびにリンパ球は、B7−Lポリペプチドによって調節され得る。この結合パターンは、PD−1発現のパターンと一致している(Ishidaら,1992,EMBO J.11:3887−95)。
【0308】
(実施例7:抗B7−Lポリペプチド抗体の産生)
B7−Lポリペプチドに対する抗体は、精製したタンパク質での免疫、または生物学的合成もしくは化学的合成によって生成したB7−Lペプチドでの免疫によって得られ得る。抗体を産生するための適切な手順としては、HudsonおよびBay,Practical Immunology(2nd ed.,Blackwell Scientific Publications)に記載される手順が挙げられる。
【0309】
抗体の産生のための1つの手順において、動物(代表的にはマウスまたはウサギ)は、B7−L抗原(例えば、B7−Lポリペプチド)を注射され、そしてELISAによって決定されるような有意な血清力価レベルを有する動物が、ハイブリドーマ産生のために選択される。免疫された動物の脾臓を収集し、そして単一細胞懸濁物として調製し、これから脾細胞を回収する。この脾細胞を、マウス骨髄腫細胞(例えば、Sp2/0−Ag14細胞)に融合し、200U/mLのペニシリン、200μg/mLの硫酸ストレプトマイシン、および4mMのグルタミンを含むMDEM中で最初にインキュベートし、次いでHAT選択培地(ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン)中でインキュベートする。選択後、この組織培養物の上清を各融合ウェルから採取し、そして抗B7−L抗体産生についてELISAで試験する。
【0310】
抗B7−L抗体を得るための代替的な手順もまた利用され得、例えば、ヒト抗体を産生するための、ヒトIg遺伝座を有するトランスジェニックマウスの免疫化、および合成抗体ライブラリー(例えば、抗体の可変ドメインの変異誘発によって作製されたライブラリー)のスクリーニングである。
【0311】
(実施例8:トランスジェニックマウスにおけるB7−Lポリペプチドの発現)
B7−Lポリペプチドの生物学的活性を評価するために、肝臓特異的ApoEプロモーターの制御下でB7−Lポリペプチド/Fc融合タンパク質をコードする構築物を調製する。この構築物の送達は、B7−Lポリペプチドの機能についての参考となる病理学的変化を引き起こすと予想される。同様に、βアクチンプロモーターの制御下で全長B7−Lポリペプチドを含む構築物を調製する。この構築物の送達は、遍在的な発現を生じると予想される。
【0312】
これらの構築物を作製するために、PCRを使用して、所望の配列の5’末端および3’末端に対応するプライマーを使用してB7−LポリペプチドをコードするテンプレートDNA配列(これは、発現ベクターへの増幅産物の挿入を可能にするために、制限酵素部位を組み込む)を増幅する。増幅後、PCR産物をゲル精製し、適切な制限酵素で消化し、そして標準的な組換えDNA技術を使用して発現ベクターへと連結する。例えば、増幅したB7−Lポリペプチド配列は、Grahamら,1997,Nature Genetics,17:272−74およびRayら,1991,Genes Dev.5:2265−73に記載されるように、ヒトβ−アクチンプロモーターの制御下で発現ベクターへとクローニングされ得る。
【0313】
連結後、反応混合物を使用して、E.coli宿主菌株をエレクトロポレーションによって形質転換し、そして形質転換体を、薬物耐性について選択した。選択したコロニー由来のプラスミドDNAを単離し、そして適切な挿入物の存在および変異の欠如を確認するためにDNA配列決定に供する。このB7−Lポリペプチド発現ベクターは、2回のCsCI密度勾配遠心分離を介して精製され、適切な制限酵素で切断され、そしてB7−Lポリペプチド導入遺伝子を含む直線化されたフラグメントが、ゲル電気泳動によって精製される。この精製されたフラグメントは、5mM Tris(pH7.4)および0.2mM EDTA中に、2mg/mLの濃度で再懸濁される。
【0314】
BDF1×BDF1交配マウス由来の単一細胞胚に、記載されるように(国際公開番号WO97/23614)注射する。胚を、CO2インキュベーター中で一晩培養し、そして15〜20の2細胞胚を、偽妊娠CD1雌マウスの卵管に移す。微量注入した胚の移植から得られた子孫を、以下のようにゲノムDNAサンプル中に組み込まれた導入遺伝子のPCR増幅によってスクリーニングする。耳片を、20mLの耳緩衝液(ear buffer)(20mM Tris(pH8.0)、10mM EDTA、0.5% SDS、および500mg/mL プロテイナーゼK)中、55℃で一晩消化する。次いで、このサンプルを200mLのTEで希釈し、そして2mLの耳サンプルを、適切なプライマーを使用して、PCR反応において使用する。
【0315】
8週齢で、トランスジェニック創始動物およびコントロール動物を、検死および病理学的分析のために屠殺する。脾臓のタンパク質を取り出し、そして総細胞RNAを、Total RNA Extraction Kit(Qiagen)を使用してこの脾臓から単離し、導入遺伝子の発現をRT−PCRによって決定する。脾臓から回収したRNAを、以下のようにSuperScriptTM Preamplification System(Gibco−BRL)を使用してcDNAに変換する。発現ベクター配列およびB7−Lポリペプチド導入遺伝子に対して3’側に位置する適切なプライマーを使用して、導入遺伝子転写物からのcDNA合成をプライムする。トランスジェニック創始動物およびコントロール由来の10mgの総脾臓RNAを、1mMのプライマーと共に70℃で10分間インキュベートし、そして氷上に置く。次いで、この反応物に、10mM Tris−HCl(pH8.3)、50mM KCl、2.5mM MgCl2、10mMの各dNTP、0.1mM DTT、および200UのSuperScript II逆転写酵素を補充する。42℃で50分のインキュベーション後、この反応を72℃で15分間加熱することによって停止させ、そして37℃で20分間、2UのRNase Hで消化する。次いで、サンプルを、B7−Lポリペプチドに特異的なプライマーを使用するPCRによって増幅する。
【0316】
(実施例9:トランスジェニックマウスにおけるB7−Lポリペプチドの生物学的活性)
安楽死の前に、トランスジェニック動物を秤量し、イソフルラン(isofluorane)によって麻酔し、そして心臓穿刺によって採血する。サンプルを、血液学および血清化学分析に供する。X線撮影を、最終的な放血後に行う。肉眼での解剖の際に、主な内臓器官を、重量分析に供する。
【0317】
肉眼での解剖後、組織(すなわち、肝臓、脾臓、膵臓、胃、胃腸管全体、腎臓、生殖器官、皮膚および乳腺、骨、脳、心臓、肺、胸腺、気管、食道、甲状腺、副腎、膀胱、リンパ節および骨格筋)を取出し、そして10%緩衝化Zn−ホルマリン中で組織学的検査のために固定する。固定後、組織をパラフィンブロック中で処理し、そして3mmの切片を得る。全ての切片を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、次いで組織学的分析に供する。
【0318】
トランスジェニックマウスおよびコントロールマウスの両方の脾臓、リンパ節およびパイアー斑を、以下の通りにB細胞特異的抗体およびT細胞特異的抗体についての免疫組織学的分析に供する。ホルマリンで固定したパラフィン包埋切片を脱パラフィン処理し、そして脱イオン水中で水和する。切片を3%過酸化水素でクエンチし、Protein Block(Lipshaw,Pittsburgh,PA)でブロックし、そしてラットモノクローナル抗マウスB220およびCD3(Harlan,Indianapolis,IN)中でインキュベートする。抗体結合を、色素原(chromagen)としてDAB(BioTek,Santa Barbara,CA)を用いて、ビオチン化ウサギ抗ラット免疫グロブリンおよびペルオキシダーゼ結合体化ストレプトアビジン(BioGenex,San Ramon,CA)によって検出する。切片を、ヘマトキシリンで対比染色する。
【0319】
剖検後、トランスジェニック動物およびコントロールの同腹仔由来の脾臓および胸腺のMLNおよび切片を取出す。シリンジの平らな末端を用いて100mmナイロン性細胞ストレーナー(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)の底に対してこの組織を穏やかに粉砕することによって単細胞懸濁物を調製する。細胞を2回洗浄し、計数し、次いで各組織由来の約1×106細胞を、20μL容量において0.5μg CD16/32(FcγIII/II)Fcブロックで10分間インキュベートする。次いで、サンプルを、FITCまたはPEに結合体化した、CD90.2(Thy−1.2)、CD45R(B220)、CD11b(Mac−1)、Gr−1、CD4またはCD8に対するモノクローナル抗体(PharMingen,San Diego,CA)の0.5μg抗体を有する、100μL容量のPBS(Ca+およびMg+を欠く)、0.1%ウシ血清アルブミンおよび0.01%アジ化ナトリウム中で2〜8℃で30分間染色する。抗体結合後、細胞を洗浄し、次いでFACScan(Becton Dickinson)でのフローサイトメトリーによって分析する。
【0320】
本発明を好ましい実施形態に関して記載してきたが、バリエーションおよび改変が当業者に思い浮かぶことが理解される。それゆえ、添付の特許請求の範囲が、本願発明の範囲内に入る全てのこのような均等なバリエーションを包含することが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1A〜1Bは、ヒトB7−L遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号1)、およびヒトB7−Lポリペプチドの推定アミノ酸配列(配列番号2)を示す。推定のシグナルペプチド(下線部)および膜貫通ドメイン(二重下線)を示す。
【図2】 図2A〜2Cは、以下のアミノ酸配列アラインメントを示す:ヒトB7−Lポリペプチド(GA16817596;配列番号2)、ヒトCD80またはB7−1(Cd80_Human;配列番号4;GenBank登録番号P33681)、ヒトCD86またはB7−2(Cd86_Human;配列番号5;GenBank登録番号U04343)、ヒトB7−H1(B7−H1_Human;配列番号6;GenBank登録番号AF177937)、ヒトB7rp−1(B7rp−1_Human;配列番号7;GenBank登録番号AF199028)、ヒトPRO352(Pro352_Human;配列番号8;GenBank登録番号Y41705)、ヒトブチロフィリンBTF1(Btf1_Human;配列番号9;GenBank登録番号U90543)、ヒトブチロフィリンBTF2(Btsf2a2_Hu;配列番号10;GenBank登録番号U90550)、ヒトブチロフィリンBTF4(Btf4_Human;配列番号11;GenBank登録番号U90546)、ヒトブチロフィリンBTF3(Btn3a3_Human;配列番号12;GenBank登録番号U90548)、およびブチロフィリン(Btn_Human;配列番号13;GenBank登録番号U39576)。
【図3】 図3A〜3Eは、ヒトB7−Lポリペプチドのゲノムヌクレオチド配列の一部(配列番号14)を示す。エキソン1の推定アミノ酸配列(配列番号19)の位置を示す。
【図4】 図4は、ヒトB7−Lポリペプチドのゲノムヌクレオチド配列の一部(配列番号15)を示す。
【図5】 図5A〜5Fは、ヒトB7−Lポリペプチドのゲノムヌクレオチド配列の一部(配列番号16)を示す。エキソン2の推定アミノ酸配列(配列番号20)の位置を示す。
【図6】 図6A〜6Bは、ヒトB7−Lポリペプチドのゲノムヌクレオチド配列の一部(配列番号17)を示す。エキソン3の推定アミノ酸配列(配列番号21)の位置を示す。
【図7】 図7A〜7Mは、ヒトB7−Lポリペプチドのゲノムヌクレオチド配列の一部(配列番号18)を示す。エキソン4(配列番号22)、エキソン5(配列番号23)、およびエキソン6の推定アミノ酸配列の位置を示す。
【図8】 図8は、ヒトB7−L mRNA発現のノーザンブロット分析の結果を示す。
【図9】 図9は、FITC単独と共に、または以下の融合タンパク質:CRP−1/Fc、B7−Lポリペプチド/Fc、B7rp−1/Fc、B7−H1/Fc、もしくはB7−2/Fcと共にのいずれかでインキュベートした、ベクター単独で(A)、またはPD−1(B)、CRP−1/ICOS(C)、もしくはCD28(D)をコードするベクターでトランスフェクトしたCHO D細胞の、蛍光標示式細胞分取装置(FACS)分析の結果を示す。
【図10】 図10は、B7−Lポリペプチド/Fc、B7RP−1/Fc、またはB7−1/Fcを使用する、抗CD3媒介T細胞増殖アッセイにおいて得られた結果を示す。
【図11】 図11は、FITC単独(A)、Fcコントロール(B)、B7rp−1/Fc(C)、B7−Lポリペプチド/Fc(D)、B7−Lポリペプチド/Fcおよび抗CD3(E)、またはB7−Lポリペプチド/Fcおよび抗CD19(F)を使用する、ヒト末梢血細胞のFACS分析の結果を示す。
【配列表】
Claims (14)
- T細胞増殖を阻害するための組成物であって、以下:
(a)配列番号1に示されるヌクレオチド配列;
(b)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;および
(c)少なくとも高度にストリンジェントな条件下で、(a)のヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドが抗CD3媒介性T細胞増殖の阻害活性を有する、ヌクレオチド配列;
からなる群より選択される配列に示される核酸分子を含む、組成物。 - T細胞増殖を阻害するための組成物であって、以下:
配列番号2に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一であるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に示される核酸分子、
を含み、ここで該ポリペプチドは抗CD3媒介性T細胞増殖の阻害活性を有する、組成物。 - 請求項1または2のいずれかに記載の核酸分子を含むベクターを含む、T細胞増殖を阻害するための、組成物。
- 請求項3に記載のベクターを含む宿主細胞を含む、T細胞増殖を阻害するための、組成物。
- 前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項4に記載の組成物。
- 前記宿主細胞が原核生物細胞である、請求項4に記載の組成物。
- T細胞増殖を阻害するための組成物であって、
配列番号2に示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを含む、組成物。 - T細胞増殖を阻害するための組成物であって、以下:
(a)必要に応じてアミノ末端メチオニンをさらに含む、配列番号3に示されるアミノ酸配列;
(b)配列番号2のアミノ酸配列に対して少なくとも90%同一であるアミノ酸配列;
(c)配列番号2に示されるアミノ酸配列、または(a)〜(b)のいずれかのアミノ酸配列、の対立遺伝子改変体についてのアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを含み、ここで、(a)〜(b)のポリペプチドは、抗CD3媒介性T細胞増殖の阻害活性を有する、組成物。 - T細胞増殖を阻害するための組成物であって、該組成物は、請求項1または2のいずれかに記載の核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチドを含み、ここで、該ポリペプチドは、抗CD3媒介性T細胞増殖の阻害活性を有する、組成物。
- 請求項1または2のいずれかに記載の核酸分子および薬学的に受容可能な処方剤を含む、T細胞増殖を阻害するための組成物。
- 前記核酸分子が、ウイルスベクター中に含まれる、請求項10に記載の組成物。
- 請求項1または2のいずれかに記載の核酸分子を含むウイルスベクターを含む、T細胞増殖を阻害するための組成物。
- 異種アミノ酸配列に融合された、請求項7、8、または、9のいずれかに記載のポリペプチドを含む融合ポリペプチドを含む、T細胞増殖を阻害するための組成物。
- 前記異種アミノ酸配列が、IgG定常ドメインまたはそのフラグメントである、請求項13に記載の組成物。
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