JP2019512271A

JP2019512271A - Ｔ細胞疲弊状態特異的遺伝子発現調節因子およびその使用

Info

Publication number: JP2019512271A
Application number: JP2019500738A
Authority: JP
Inventors: ウィリアムニコラスヘイニング，; デバッタマセン，; イー．ジョンウェリー，; ニールヨセフ，; ジェイムズカミンスキー，; クリステンパウケン，
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2016-03-21
Filing date: 2017-03-21
Publication date: 2019-05-16
Also published as: EP3433365B1; KR20190080825A; EP3433365A4; AU2017238054A1; WO2017165412A2; AU2017238054B2; CN110753755A; EP3433365A2; US20210309965A1; CA3018332A1; WO2017165412A3; CN110753755B

Abstract

本発明は、Ｔ細胞疲弊の状態に特異的な遺伝子発現調節因子の特定、ならびにその使用に基づく。一態様では、ゲノム領域を含む哺乳動物の操作T細胞であって、ゲノム領域が、１）少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現を調節し、２）哺乳動物由来の疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞のゲノム内で選択的にクロマチン接近可能であり、ゲノム領域が遺伝子修飾されており、遺伝子修飾が少なくとも１つの遺伝子の発現を調整する、操作T細胞が提供され得る。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年３月２１日に出願された米国仮出願番号第６２／３１０，９０３号、および２０１６年９月２３日に出願された米国仮出願番号第６２／３９８，９４８号の利益を主張しており、前記仮出願の各々の全体の内容は、この参照によってそれらの全体が本明細書中に援用される。

権利の陳述
本発明は、国立衛生研究所によって授与された認可番号ＡＩ１１５７１２，ＡＩ０９１４９３，ＡＩ０８２６３０，ＭＨ１０５９７９，およびＨＧ００７９１０の下、政府支援でなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。

発明の背景
Ｔ細胞疲弊は、Ｔ細胞機能障害の獲得状態であり、がんおよび慢性ウイルス感染の特質である（Wherryら（２００７年）、Immunity、２７巻：６７０〜６８４頁；Zajacら（１９９８年）、J. Exp. Med.、１８８巻：２２０５〜２２１３頁）。近年、がんにおけるＴ細胞疲弊を逆転させるための処置は著しく有効であることが証明されている（Barberら（２００６年）、Nature、４３９巻：６８２〜６８７頁；Topalianら（２０１２年）、New Engl. J. Med.、３６６巻：２４４３〜２４５４頁）。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）−Ｔ細胞療法も血液悪性腫瘍に対して高度に有効であることが証明されている（Porterら（２０１１年）、New Engl. J. Med.、３６５巻：７２５〜７３３頁）が、固形腫瘍を処置するための操作T細胞の疲弊の発生は、依然としてそのより広範な使用に対する大きな障壁である（Longら（２０１５年）、Nat. Med.、２１巻：５８１〜５９０頁）。Ｔ細胞疲弊を調節する機構の特定は、がん免疫療法のための免疫チェックポイント遮断および養子Ｔ細胞療法の有効性を改善しうる（Barberら（２００６年）、Nature、４３９巻：６８２〜６８７頁；Topalianら（２０１２年）、New Engl. J. Med.、３６６巻：２４４３〜２４５４頁；Porterら（２０１１年）、New Engl. J. Med.、３６５巻：７２５〜７３３頁）。しかしながら、Ｔ細胞疲弊を調整するための現在の戦略は、免疫チェックポイントなどのエフェクター遺伝子発現産物の発現を直接調整することに依拠し、生理学的レベルのかかるエフェクター遺伝子発現産物は正常なＴ細胞機能に要求されることが多いため、このような調整は、望まれない副作用をもたらす。加えて、このような戦略は薬物抵抗性を生じやすく、免疫病理をもたらしうる。したがって、当技術分野では、エフェクター遺伝子発現産物を生理学的に関連性のあるレベルで保護する、Ｔ細胞またはＴ細胞に影響する細胞においてかかる遺伝子発現産物の発現を調整するために有用な組成物および方法を特定する必要性が高い。

herryら（２００７年）、Immunity、２７巻：６７０〜６８４頁 Zajacら（１９９８年）、J. Exp. Med.、１８８巻：２２０５〜２２１３頁 Barberら（２００６年）、Nature、４３９巻：６８２〜６８７頁 Topalianら（２０１２年）、New Engl. J. Med.、３６６巻：２４４３〜２４５４頁 Porterら（２０１１年）、New Engl. J. Med.、３６５巻：７２５〜７３３頁 Longら（２０１５年）、Nat. Med.、２１巻：５８１〜５９０頁） Barberら（２００６年）、Nature、４３９巻：６８２〜６８７頁 Topalianら（２０１２年）、New Engl. J. Med.、３６６巻：２４４３〜２４５４頁 Porterら（２０１１年）、New Engl. J. Med.、３６５巻：７２５〜７３３頁

発明の要旨
本発明は、がんおよび／または慢性感染から生じるものなどの疲弊T細胞が、阻害性受容体ＰＤ−１の持続性発現を含む遺伝子発現の独特のパターンを有するという発見に少なくとも部分的に基づく。例えば、このような遺伝子発現パターンに寄与する疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞のエピジェネティックな状況は、機能性メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞のものとは大いに異なる。感染中のＣＤ８^＋Ｔ細胞の分化は、接近可能なクロマチン領域が大きく再形成されてエンハンサーの機能的モジュールに組織化されると共に起こる。疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、機能性ＣＤ８^＋Ｔ細胞には見出されない特有のエンハンサーモジュール、および状態特異的な転写因子結合の広範囲にわたるネットワークを獲得する。例えば、Ｐｄｃｄ１遺伝子座から−２３ｋｂ離れた１つのエンハンサーは、疲弊T細胞およびＰＤ−１を持続的に発現する他のリンパ球にしか見出されない。本明細書に記述されるゲノム編集は、このエンハンサーがＰＤ−１の高発現に要求されることを明示する。このように、Ｔ細胞疲弊は、それらの機能障害に重要な遺伝子の状態特異的調節と共に起こる。こうした遺伝子発現の状態特異的ゲノム調節因子は、疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞またはＴ細胞機能に影響する細胞において優先的に遺伝子発現を変化させるための、例えばゲノム編集による調整のための標的である。エンハンサー、サプレッサー、およびプロモーターなどのＴ細胞疲弊特異的ゲノム調節エレメントを選択的にターゲティングすると、がんおよび／またはウイルス感染において起こるようなＴ細胞疲弊の発生を防止すると同時に、ＰＤ−１などの遺伝子の正常な生理学的調節を維持することができる。

一態様では、ゲノム領域を含む哺乳動物の操作T細胞であって、ゲノム領域が、１）少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現を調節し、２）哺乳動物由来の疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞のゲノム内で選択的にクロマチン接近可能であり、ゲノム領域が遺伝子修飾されており、遺伝子修飾が少なくとも１つの遺伝子の発現を調整する、操作T細胞が提供される。

本発明の任意の態様に適用することができ、かつ／または本明細書に記述される任意の他の実施形態と組み合わせることができる、多数の実施形態がさらに提供される。例えば、一実施形態では、ゲノム遺伝子の発現調節領域の活性は上方制御される（例えば、操作されたゲノム遺伝子の発現調節領域は、哺乳動物Ｔ細胞における少なくとも１つの遺伝子の発現を、操作されたゲノム遺伝子の発現調節領域を含まない哺乳動物由来の同じＴ細胞型における少なくとも１つの遺伝子の発現と比較して少なくとも５％上方制御する）。別の実施形態では、ゲノム遺伝子の発現調節領域の活性は下方制御される（例えば、操作されたゲノム遺伝子の発現調節領域は、哺乳動物Ｔ細胞における少なくとも１つの遺伝子の発現を、操作されたゲノム遺伝子の発現調節領域を含まない哺乳動物由来の同じＴ細胞型における少なくとも１つの遺伝子の発現と比較して少なくとも５％下方制御する）。さらに別の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子の発現は、少なくとも１つの遺伝子の転写または翻訳である。なおも別の実施形態では、ゲノム遺伝子の発現調節領域またはその一部分は欠失している。別の実施形態では、ゲノム遺伝子の発現調節領域またはその一部分はゲノム編集により欠失しており、任意選択で、ゲノム編集は構成的または誘導的に発現される（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ＲＮＡガイド操作ヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ：ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｎｕｃｌｅａｓｅ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、ホーミングメガヌクレアーゼ、および相同組換えからなる群から選択されるゲノム編集など）。さらに別の実施形態では、ゲノム遺伝子の発現調節領域は、表１Ａ〜１Ｋに示される調節領域からなる群から選択される。

なおも別の実施形態では、哺乳動物は免疫障害の動物モデルであり、任意選択で、免疫障害は慢性免疫障害である。別の実施形態では、動物モデルはマウスモデルである。なおも別の実施形態では、哺乳動物はヒトである。別の実施形態では、ヒトは免疫障害に罹患しており、任意選択で、免疫障害は慢性免疫障害である。

さらに別の実施形態では、慢性免疫障害は慢性感染またはがんである。なおも別の実施形態では、感染は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、単純ヘルペスウイルス１、単純ヘルペスウイルス２、ヒトヘルペスウイルス６、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオーマウイルスＢＫ、ポリオーマウイルスＪＣ、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、ＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａおよびＥｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎからなる群から選択される作用因子によって生じる。別の実施形態では、慢性感染は潜伏感染ではない。さらに別の実施形態では、がんは血液がんまたは固形がんである。なおも別の実施形態では、固形がんは、肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、皮膚がん、黒色腫、子宮頸がん、子宮がん、卵巣がん、乳がん、膵がん、胃がん、食道がん、結腸直腸がん、肝がん、前立腺がん、腎がん、膀胱がん、頭頸部がん、肉腫、リンパ腫、および脳がんからなる群から選択される。別の実施形態では、疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞は、チェックポイント阻害剤、ＰＤ−１（Ｐｄｃｄ１）、ＴＩＭ−３（Ｈａｖｃｒ２）、ＬＡＧ−３（Ｌａｇ３）、ＣＴＬＡ−４（Ｃｔｌａ４）、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＣＤ３９（Ｅｎｔｐｄ１）、ＣＤ１６０、エオメソデルミン（Ｅｏｍｅｓ）、Ｔ−ＢＥＴ（Ｔｂｘ２１）、ＢＡＴＦ、ＢＬＩＭＰ−１（Ｐｒｄｍ１）、ＮＦＡＴＣ１、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ−２（Ｐｏｕ２ｆ２）、Ｆｏｘｐ１、レチノイン酸受容体アルファ（Ｒａｒａ）、およびそれらの組合せからなる群から選択されるＴ細胞疲弊バイオマーカーを発現する。さらに別の実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。なおも別の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、非疲弊T細胞または疲弊T細胞である。別の実施形態では、非疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ナイーブ細胞、機能的エフェクター細胞、またはメモリー細胞である。別の実施形態では、疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞は、チェックポイント阻害剤、ＰＤ−１（Ｐｄｃｄ１）、ＴＩＭ−３（Ｈａｖｃｒ２）、ＬＡＧ−３（Ｌａｇ３）、ＣＴＬＡ−４（Ｃｔｌａ４）、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＣＤ３９（Ｅｎｔｐｄ１）、ＣＤ１６０、エオメソデルミン（Ｅｏｍｅｓ）、Ｔ−ＢＥＴ（Ｔｂｘ２１）、ＢＡＴＦ、ＢＬＩＭＰ−１（Ｐｒｄｍ１）、ＮＦＡＴＣ１、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ−２（Ｐｏｕ２ｆ２）、Ｆｏｘｐ１、レチノイン酸受容体アルファ（Ｒａｒａ）、およびそれらの組合せからなる群から選択されるＴ細胞疲弊バイオマーカーを発現する。さらに別の実施形態では、Ｔ細胞は、哺乳動物から単離され、操作され、哺乳動物にｅｘｖｉｖｏで戻された初代Ｔ細胞である。なおも別の実施形態では、Ｔ細胞は、哺乳動物内にｉｎｖｉｖｏで存在するか、またはｉｎｖｉｔｒｏで培養される。

別の態様では、哺乳動物Ｔ細胞を操作して哺乳動物Ｔ細胞における少なくとも１つの遺伝子の発現を調整する方法であって、遺伝子の遺伝子発現調節領域を遺伝子修飾することを含み、遺伝子発現調節領域が哺乳動物由来の疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞内で選択的にクロマチン接近可能であり、遺伝子修飾が少なくとも１つの遺伝子の発現を調整する、方法が提供される。

上述のように、本発明の任意の態様に適用することができ、かつ／または本明細書に記述される任意の他の実施形態と組み合わせることができる、多数の実施形態がさらに提供される。例えば、一実施形態では、ゲノム遺伝子の発現調節領域は上方制御される（例えば、操作されたゲノム遺伝子の発現調節領域は、哺乳動物Ｔ細胞における少なくとも１つの遺伝子の発現を、操作されたゲノム遺伝子の発現調節領域を含まない哺乳動物由来の同じＴ細胞型における少なくとも１つの遺伝子の発現と比較して少なくとも５％上方制御する）。別の実施形態では、ゲノム遺伝子の発現調節領域は下方制御される（例えば、操作されたゲノム遺伝子の発現調節領域は、哺乳動物Ｔ細胞における少なくとも１つの遺伝子の発現を、操作されたゲノム遺伝子の発現調節領域を含まない哺乳動物由来の同じＴ細胞型における少なくとも１つの遺伝子の発現と比較して少なくとも５％下方制御する）。さらに別の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子の発現は、少なくとも１つの遺伝子の転写または翻訳である。なおも別の実施形態では、ゲノム遺伝子の発現調節領域またはその一部分は欠失している。別の実施形態では、ゲノム遺伝子の発現調節領域またはその一部分はゲノム編集により欠失しており、任意選択で、ゲノム編集は構成的または誘導的に発現される。さらに別の実施形態では、ゲノム編集は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ＲＮＡガイド操作ヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、ホーミングメガヌクレアーゼ、および相同組換えからなる群から選択される。なおも別の実施形態では、ゲノム遺伝子の発現調節領域は、表１Ａ〜１Ｋに示される調節領域からなる群から選択される。別の実施形態では、哺乳動物は免疫障害の動物モデルであり、任意選択で、免疫障害は慢性免疫障害である。さらに別の実施形態では、動物モデルはマウスモデルである。なおも別の実施形態では、哺乳動物はマウスまたはヒトである。別の実施形態では、哺乳動物はヒトである。さらに別の実施形態では、ヒトは免疫障害に罹患しており、任意選択で、免疫障害は慢性免疫障害である。なおも別の実施形態では、慢性免疫障害は慢性感染またはがんである。別の実施形態では、感染は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、単純ヘルペスウイルス１、単純ヘルペスウイルス２、ヒトヘルペスウイルス６、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオーマウイルスＢＫ、ポリオーマウイルスＪＣ、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、ＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａおよびＥｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎからなる群から選択される作用因子によって生じる。さらに別の実施形態では、慢性感染は潜伏感染ではない。なおも別の実施形態では、がんは血液がんまたは固形がんである。別の実施形態では、固形がんは、肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、皮膚がん、黒色腫、子宮頸がん、子宮がん、卵巣がん、乳がん、膵がん、胃がん、食道がん、結腸直腸がん、肝がん、前立腺がん、腎がん、膀胱がん、頭頸部がん、肉腫、リンパ腫、および脳がんからなる群から選択される。さらに別の実施形態では、疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞は、チェックポイント阻害剤、ＰＤ−１（Ｐｄｃｄ１）、ＴＩＭ−３（Ｈａｖｃｒ２）、ＬＡＧ−３（Ｌａｇ３）、ＣＴＬＡ−４（Ｃｔｌａ４）、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＣＤ３９（Ｅｎｔｐｄ１）、ＣＤ１６０、エオメソデルミン（Ｅｏｍｅｓ）、Ｔ−ＢＥＴ（Ｔｂｘ２１）、ＢＡＴＦ、ＢＬＩＭＰ−１（Ｐｒｄｍ１）、ＮＦＡＴＣ１、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ−２（Ｐｏｕ２ｆ２）、Ｆｏｘｐ１、レチノイン酸受容体アルファ（Ｒａｒａ）、およびそれらの組合せからなる群から選択されるＴ細胞疲弊バイオマーカーを発現する。なおも別の実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。別の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、非疲弊T細胞または疲弊T細胞である。さらに別の実施形態では、非疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ナイーブ細胞、機能的エフェクター細胞、またはメモリー細胞である。なおも別の実施形態では、疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞は、チェックポイント阻害剤、ＰＤ−１（Ｐｄｃｄ１）、ＴＩＭ−３（Ｈａｖｃｒ２）、ＬＡＧ−３（Ｌａｇ３）、ＣＴＬＡ−４（Ｃｔｌａ４）、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＣＤ３９（Ｅｎｔｐｄ１）、ＣＤ１６０、エオメソデルミン（Ｅｏｍｅｓ）、Ｔ−ＢＥＴ（Ｔｂｘ２１）、ＢＡＴＦ、ＢＬＩＭＰ−１（Ｐｒｄｍ１）、ＮＦＡＴＣ１、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ−２（Ｐｏｕ２ｆ２）、Ｆｏｘｐ１、レチノイン酸受容体アルファ（Ｒａｒａ）、およびそれらの組合せからなる群から選択されるＴ細胞疲弊バイオマーカーを発現する。別の実施形態では、Ｔ細胞は、哺乳動物から単離された初代Ｔ細胞である。さらに別の実施形態では、Ｔ細胞は、哺乳動物内にｉｎｖｉｖｏで存在するか、またはｉｎｖｉｔｒｏで培養される。なおも別の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子は、少なくとも２つの遺伝子である。

さらに別の態様では、非疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞の疲弊を防止する方法であって、本明細書に記述される任意の方法に従って非疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞を操作することを含む、方法が提供される。一実施形態では、非疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ナイーブ細胞、機能的エフェクター細胞、またはメモリー細胞である。さらに別の実施形態では、本方法は、操作された非疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞を対象に投与することをさらに含む。

なおも別の態様では、疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞においてＣＤ８＋Ｔ細胞疲弊を逆転させる方法であって、本明細書に記述される任意の方法に従って疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞を操作することを含む、方法が提供される。一実施形態では、疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞は、チェックポイント阻害剤、ＰＤ−１（Ｐｄｃｄ１）、ＴＩＭ−３（Ｈａｖｃｒ２）、ＬＡＧ−３（Ｌａｇ３）、ＣＴＬＡ−４（Ｃｔｌａ４）、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＣＤ３９（Ｅｎｔｐｄ１）、ＣＤ１６０、エオメソデルミン（Ｅｏｍｅｓ）、Ｔ−ＢＥＴ（Ｔｂｘ２１）、ＢＡＴＦ、ＢＬＩＭＰ−１（Ｐｒｄｍ１）、ＮＦＡＴＣ１、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ−２（Ｐｏｕ２ｆ２）、Ｆｏｘｐ１、レチノイン酸受容体アルファ（Ｒａｒａ）、およびそれらの組合せからなる群から選択されるＴ細胞疲弊バイオマーカーを発現する。別の実施形態では、本方法は、操作された疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞を対象に投与することをさらに含む。

別の態様では、対象の免疫障害を処置する方法であって、本明細書に記述される操作T細胞を対象に投与することを含む、方法が提供される。一実施形態では、操作T細胞は、局部投与または全身投与される。別の実施形態では、全身投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内、または関節内である。さらに別の実施形態では、対象に投与される操作T細胞は、対象に対して自己、同系、同種、または異種である。なおも別の実施形態では、対象に投与される操作T細胞は、薬学的に許容される製剤において投与される。別の実施形態では、操作T細胞は、対象への投与後に、少なくとも１つの遺伝子の少なくとも５％調整された発現を維持する。さらに別の実施形態では、本方法は、１つまたは複数の抗免疫障害剤を含む治療有効量の医薬組成物を対象に投与することをさらに含む。なおも別の実施形態では、本方法は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ８＋Ｔ細胞疲弊を防止または逆転させる１つまたは複数の薬剤と接触させることをさらに含む。別の実施形態では、１つまたは複数の薬剤は、免疫チェックポイント阻害剤である。さらに別の実施形態では、免疫チェックポイントは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−１、ＣＴＬＡ−４、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、２Ｂ４、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ−Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−４、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰアルファ（ＣＤ４７）、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ−２、ＩＬＴ−４、ＴＩＧＩＴ、およびＡ２ａＲからなる群から選択される。なおも別の実施形態では、哺乳動物は免疫障害の動物モデルであり、任意選択で、免疫障害は慢性免疫障害である。別の実施形態では、動物モデルはマウスモデルである。さらに別の実施形態では、哺乳動物はマウスまたはヒトである。なおも別の実施形態では、哺乳動物はヒトである。別の実施形態では、ヒトは免疫障害に罹患しており、任意選択で、免疫障害は慢性免疫障害である。さらに別の実施形態では、慢性免疫障害は慢性感染またはがんである。なおも別の実施形態では、感染は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、単純ヘルペスウイルス１、単純ヘルペスウイルス２、ヒトヘルペスウイルス６、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオーマウイルスＢＫ、ポリオーマウイルスＪＣ、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、ＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａおよびＥｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎからなる群から選択される作用因子によって生じる。別の実施形態では、慢性感染は潜伏感染ではない。さらに別の実施形態では、がんは血液がんまたは固形がんである。なおも別の実施形態では、固形がんは、肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、皮膚がん、黒色腫、子宮頸がん、子宮がん、卵巣がん、乳がん、膵がん、胃がん、食道がん、結腸直腸がん、肝がん、前立腺がん、腎がん、膀胱がん、頭頸部がん、肉腫、リンパ腫、および脳がんからなる群から選択される。

図１は、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、およびＨと識別された８つのパネルを含み、これらは、ＣＤ８^＋Ｔ細胞疲弊が、接近可能なクロマチンの広範囲にわたる変化に関連することを示す。パネルＡは、実験の概略図を示す。パネルＢは、Ｃｃｒ７およびＩｆｎｇ遺伝子座における代表的なＡＴＡＣ−ｓｅｑトラックを示す。パネルＣは、定常および変化ありのクロマチン接近可能領域の割合を示す。パネルＤは、各時点における新たな領域の発達軌道を示す。パネルＥは、細胞状態間のクロマチン接近可能領域における重複を示す。パネルＦは、急性ＣＤ８^＋Ｔ細胞状態と慢性ＣＤ８^＋Ｔ細胞状態との間での非差次的な領域（左）および差次的な領域（右）の分布を示す。パネルＧは、非差次的な遺伝子間領域（明灰色）および差次的な遺伝子間領域（暗灰色）の全てにおける最も近いＴＳＳまでの距離を示す。パネルＨは、遺伝子発現によって測定される状態（左）とクロマチン接近可能性によって測定される状態（右）との間の類似性の相関ネットワークを示す。エッジ長は類似性（１−スピアマン係数）に対応する。図１は、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、およびＨと識別された８つのパネルを含み、これらは、ＣＤ８^＋Ｔ細胞疲弊が、接近可能なクロマチンの広範囲にわたる変化に関連することを示す。パネルＡは、実験の概略図を示す。パネルＢは、Ｃｃｒ７およびＩｆｎｇ遺伝子座における代表的なＡＴＡＣ−ｓｅｑトラックを示す。パネルＣは、定常および変化ありのクロマチン接近可能領域の割合を示す。パネルＤは、各時点における新たな領域の発達軌道を示す。パネルＥは、細胞状態間のクロマチン接近可能領域における重複を示す。パネルＦは、急性ＣＤ８^＋Ｔ細胞状態と慢性ＣＤ８^＋Ｔ細胞状態との間での非差次的な領域（左）および差次的な領域（右）の分布を示す。パネルＧは、非差次的な遺伝子間領域（明灰色）および差次的な遺伝子間領域（暗灰色）の全てにおける最も近いＴＳＳまでの距離を示す。パネルＨは、遺伝子発現によって測定される状態（左）とクロマチン接近可能性によって測定される状態（右）との間の類似性の相関ネットワークを示す。エッジ長は類似性（１−スピアマン係数）に対応する。

図２は、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、およびＩと識別された９つのパネルを含み、これらは、マウスＣＤ８＋Ｔ細胞由来のクロマチン接近可能領域の特徴を示す。パネルＡは、示されているように、条件毎のクロマチン接近可能領域の数を、重複する転写開始部位（ＴＳＳ）、エクソン、イントロン、および遺伝子間エリアに分割したものを示す。パネルＢは、ナイーブ、急性ｄ８、急性ｄ２７、慢性ｄ８、および慢性ｄ２７の状態についての生物学的複製物間のピーク強度の相関性を示す散布図である。パネルＣは、４３，１７１個全てのＣｈＡＲにおける、ナイーブ、急性ｄ８、急性ｄ２７、慢性ｄ８、および慢性ｄ２７の状態についての生物学的複製物の主成分分析を示す。パネルＤは、５つ全ての細胞状態からのＡＴＡＣ−ｓｅｑ断片サイズを示す。パネルＥは、５つ全ての細胞状態に関する、全ての遺伝子間クロマチン接近可能領域の最も近いＴＳＳまでの距離を（合計に対する百分率として）示す。パネルＦは、５つ全ての細胞状態に関する、ＡＴＡＣピーク内における、進化的保存、調節領域状態、およびヒストンマークについてアノテーションを行った領域のエンリッチメント倍率を示す。パネルＧは、全てのＴＳＳ（黒色）、Ｈ３Ｋ２７ａｃピーク（暗灰色）、およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３（明灰色）間のＡＴＡＣシグナルを組み合わせたものを示す。パネルＨは、ナイーブ（灰色の記号）、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、および急性感染後（白色の記号）または慢性感染後（黒色の記号）のものにおける、経時的なクロマチン接近可能領域によってカバーされるゲノムの割合を示す。パネルＩは、下に灰色／白色の記号で示されている組合せでの８日目および２７日目の急性感染および慢性感染のＣＤ８^＋Ｔ細胞における共通のクロマチン接近可能領域と差次的なクロマチン接近可能領域との数を示す（差次的領域ｑ＜０．０５）。図２は、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、およびＩと識別された９つのパネルを含み、これらは、マウスＣＤ８＋Ｔ細胞由来のクロマチン接近可能領域の特徴を示す。パネルＡは、示されているように、条件毎のクロマチン接近可能領域の数を、重複する転写開始部位（ＴＳＳ）、エクソン、イントロン、および遺伝子間エリアに分割したものを示す。パネルＢは、ナイーブ、急性ｄ８、急性ｄ２７、慢性ｄ８、および慢性ｄ２７の状態についての生物学的複製物間のピーク強度の相関性を示す散布図である。パネルＣは、４３，１７１個全てのＣｈＡＲにおける、ナイーブ、急性ｄ８、急性ｄ２７、慢性ｄ８、および慢性ｄ２７の状態についての生物学的複製物の主成分分析を示す。パネルＤは、５つ全ての細胞状態からのＡＴＡＣ−ｓｅｑ断片サイズを示す。パネルＥは、５つ全ての細胞状態に関する、全ての遺伝子間クロマチン接近可能領域の最も近いＴＳＳまでの距離を（合計に対する百分率として）示す。パネルＦは、５つ全ての細胞状態に関する、ＡＴＡＣピーク内における、進化的保存、調節領域状態、およびヒストンマークについてアノテーションを行った領域のエンリッチメント倍率を示す。パネルＧは、全てのＴＳＳ（黒色）、Ｈ３Ｋ２７ａｃピーク（暗灰色）、およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３（明灰色）間のＡＴＡＣシグナルを組み合わせたものを示す。パネルＨは、ナイーブ（灰色の記号）、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、および急性感染後（白色の記号）または慢性感染後（黒色の記号）のものにおける、経時的なクロマチン接近可能領域によってカバーされるゲノムの割合を示す。パネルＩは、下に灰色／白色の記号で示されている組合せでの８日目および２７日目の急性感染および慢性感染のＣＤ８^＋Ｔ細胞における共通のクロマチン接近可能領域と差次的なクロマチン接近可能領域との数を示す（差次的領域ｑ＜０．０５）。

図３は、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤと識別された４つのパネルを含み、これらは、ＣＤ８^＋Ｔ細胞内の状態特異的エンハンサーが、機能的に明確なクラスの遺伝子に対してマッピングするモジュールを形成することを示す。パネルＡは、細胞状態間の類似性（縦列）によってクラスタリングした、接近可能性に差がある全ての領域の強度（横列）を示す、ピークのヒートマップである。パネルＢは、各細胞状態でのパネルＡの各モジュールにおける近傍の遺伝子のｍＲＮＡ発現の横列を正規化した平均を示すヒートマップである。各モジュールの情報遺伝子が右側に示されている。パネルＣは、各細胞状態における各モジュールでの平均遺伝子発現と平均クロマチン接近可能性との間の相関性を示す。文字記号は、パネルＡ〜Ｂに示されたモジュールに対応する。パネルＤは、各モジュール（縦列）におけるＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙターム（横列）のエンリッチメントを示すヒートマップである。Ｐ値（二項検定）は、１−ｌｏｇ１０として提示されている。図３は、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤと識別された４つのパネルを含み、これらは、ＣＤ８^＋Ｔ細胞内の状態特異的エンハンサーが、機能的に明確なクラスの遺伝子に対してマッピングするモジュールを形成することを示す。パネルＡは、細胞状態間の類似性（縦列）によってクラスタリングした、接近可能性に差がある全ての領域の強度（横列）を示す、ピークのヒートマップである。パネルＢは、各細胞状態でのパネルＡの各モジュールにおける近傍の遺伝子のｍＲＮＡ発現の横列を正規化した平均を示すヒートマップである。各モジュールの情報遺伝子が右側に示されている。パネルＣは、各細胞状態における各モジュールでの平均遺伝子発現と平均クロマチン接近可能性との間の相関性を示す。文字記号は、パネルＡ〜Ｂに示されたモジュールに対応する。パネルＤは、各モジュール（縦列）におけるＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙターム（横列）のエンリッチメントを示すヒートマップである。Ｐ値（二項検定）は、１−ｌｏｇ１０として提示されている。

図４は、状態間で差次的な領域の比較を示す。グラフは、５つの細胞状態での差次的な領域全てのシグナル強度に適用した、所与の数のＫ平均クラスターを使用したギャップ統計を示す。

図５は、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、およびＩと識別された９つのパネルを含み、これらは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性エンハンサー編集の結果を示す。パネルＡは、ゲノム編集戦略の概略図を示す。パネルＢは、ＥＬ４細胞に使用したＣＲＩＳＰＲＰＤ−１をターゲティングするｓｇＲＮＡおよびターゲティングしないｓｇＲＮＡを示す。パネルＣは、ゲノム欠失のスクリーニングおよびＳａｎｇｅｒ配列決定のために使用したＰＣＲプライマーを示す。パネルＤは、対照（明灰色）または−２３．８ｋｂ領域をターゲティングする二重カットｓｇＲＮＡをトランスフェクトしたＥＬ４細胞におけるＰＤ−１発現のヒストグラムを示す。パネルＥは、対照ｓｇＲＮＡ、単一エンハンサーｓｇＲＮＡ、および二重エンハンサーｓｇＲＮＡを受けたＥＬ４細胞のゲノムＤＮＡを使用したＰＣＲスクリーニング結果を提供するゲルを示す。パネルＦは、二重エンハンサーをターゲティングするｓｇＲＮＡを受けた４５個のＥＬ４単一細胞クローンのゲノムＤＮＡを使用したＰＣＲスクリーニング結果を提供するゲルを示す。パネルＧは、ＷＴ（白色の棒）であるか、または−２３．８ｋｂエンハンサーが欠失（Ｄｅｌ）しているＥＬ４単一細胞クローンにおける、ＰＤ−１の発現を示す（ｐ＜０．０００２、ＰＤ−１発現のＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ順位和検定）。パネルＨは、代表的なＥＬ４単一細胞クローンのエンハンサーの配列を示す。クローン数はパネルＡのものと対応し、矢印はｓｇＲＮＡによる予想されるカット部位を示す。パネルＩは、ＷＴまたはＤｅｌクローンにおける相対的なｍＲＮＡ発現を示す（ｐ＜０．００５、Ｔ検定）。図５は、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、およびＩと識別された９つのパネルを含み、これらは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性エンハンサー編集の結果を示す。パネルＡは、ゲノム編集戦略の概略図を示す。パネルＢは、ＥＬ４細胞に使用したＣＲＩＳＰＲＰＤ−１をターゲティングするｓｇＲＮＡおよびターゲティングしないｓｇＲＮＡを示す。パネルＣは、ゲノム欠失のスクリーニングおよびＳａｎｇｅｒ配列決定のために使用したＰＣＲプライマーを示す。パネルＤは、対照（明灰色）または−２３．８ｋｂ領域をターゲティングする二重カットｓｇＲＮＡをトランスフェクトしたＥＬ４細胞におけるＰＤ−１発現のヒストグラムを示す。パネルＥは、対照ｓｇＲＮＡ、単一エンハンサーｓｇＲＮＡ、および二重エンハンサーｓｇＲＮＡを受けたＥＬ４細胞のゲノムＤＮＡを使用したＰＣＲスクリーニング結果を提供するゲルを示す。パネルＦは、二重エンハンサーをターゲティングするｓｇＲＮＡを受けた４５個のＥＬ４単一細胞クローンのゲノムＤＮＡを使用したＰＣＲスクリーニング結果を提供するゲルを示す。パネルＧは、ＷＴ（白色の棒）であるか、または−２３．８ｋｂエンハンサーが欠失（Ｄｅｌ）しているＥＬ４単一細胞クローンにおける、ＰＤ−１の発現を示す（ｐ＜０．０００２、ＰＤ−１発現のＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ順位和検定）。パネルＨは、代表的なＥＬ４単一細胞クローンのエンハンサーの配列を示す。クローン数はパネルＡのものと対応し、矢印はｓｇＲＮＡによる予想されるカット部位を示す。パネルＩは、ＷＴまたはＤｅｌクローンにおける相対的なｍＲＮＡ発現を示す（ｐ＜０．００５、Ｔ検定）。

図６は、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、およびＨと識別された８つのパネルを含み、これらは、疲弊特異的エンハンサーの高分解能機能的マッピングが、ＰＤ−１を調節する最小配列を特定することを示す。パネルＡは、示されているように、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＥＬ４細胞株、および造血性系列のＡＴＡＣ−ｓｅｑトラックを示す（Lara-Astiasoら（２０１４年）、Science、３４５巻：９４３〜９４９頁）。矢印は個々のＣｈＡＲを示す。パネルＡは、ＡおよびＡ’のサブパネルに分かれていることに留意されたい。パネルＢは、陰性対照ミニマルプロモーター（左）、ＣＭＶプロモーター構築物（中央）、およびＰｄｃｄ１−２３．８ｋｂエンハンサー構築物（右）を形質導入した、ＥＬ４（上）および活性化ＣＤ８^＋Ｔ細胞（下）におけるＧＦＰレポーター発現を示す。３〜４つの複製物の平均が棒グラフに示されている。パネルＣは、対照（左）または二重カットｓｇＲＮＡ（右）をトランスフェクトしたＥＬ４細胞における野生型（ＷＴ）または欠失（Ｄｅｌ）対立遺伝子の比率を示す、細胞分取ゲーティング（上パネル）および対応するＰＤ−１エンハンサー領域のゲノムＰＣＲ（下パネル）の結果を示す。パネルＤは、代表的なＥＬ４野生型（明灰色）またはエンハンサー欠失単一細胞クローンのＰＤ−１発現を示す。パネルＥは、ＰＤ−１ｈｉｇｈ集団およびｌｏｗ集団内の示されている位置におけるｓｇＲＮＡ（灰色の記号）の正規化されたエンリッチメントを示す。対照の非ターゲティングｓｇＲＮＡは、５ｂｐ間隔で仮マッピングされている（ｐｓｅｕｄｏ−ｍａｐｐｅｄ）。暗色の円形記号は、−２３．８ｋｂエンハンサーにおいて最大の効果を有した２１個のｓｇＲＮＡに対応し、これらの同質遺伝子系統を後に産生した。パネルＦは、−２３．８ｋｂエンハンサーにおけるスコアが上位であった２１個のｓｇＲＮＡに関する、パネルＥの正規化されたエンリッチメントスコアと、個別にトランスフェクトしたＥＬ４細胞のＰＤ−１のＭＦＩとの間の相関性を示す。パネルＧは、−２３．８ｋｂエンハンサー内のＴＦフットプリントおよびｓｇＲＮＡ活性の重複を示す。慢性ｄ２７において結合確率＞０．９のＴＦフットプリントが上に示されている。線は、上位スコアのｓｇＲＮＡのカット部位を表す。ＰＤ−１のＭＦＩの変化は、各ｓｇＲＮＡの対照ガイドをトランスフェクトした集団に対するものである（円形記号、左軸）。ｓｇＲＮＡ活性により引き起こされたＰＤ−１のＭＦＩ変化の１０ｂｐの移動平均が黒色で示されている（右軸）。パネルＨは、慢性ｄ２７に対する急性ｄ２７のＣＤ８^＋Ｔ細胞における差次的なＴＦフットプリントのボルケーノプロットである。図６は、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、およびＨと識別された８つのパネルを含み、これらは、疲弊特異的エンハンサーの高分解能機能的マッピングが、ＰＤ−１を調節する最小配列を特定することを示す。パネルＡは、示されているように、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＥＬ４細胞株、および造血性系列のＡＴＡＣ−ｓｅｑトラックを示す（Lara-Astiasoら（２０１４年）、Science、３４５巻：９４３〜９４９頁）。矢印は個々のＣｈＡＲを示す。パネルＡは、ＡおよびＡ’のサブパネルに分かれていることに留意されたい。パネルＢは、陰性対照ミニマルプロモーター（左）、ＣＭＶプロモーター構築物（中央）、およびＰｄｃｄ１−２３．８ｋｂエンハンサー構築物（右）を形質導入した、ＥＬ４（上）および活性化ＣＤ８^＋Ｔ細胞（下）におけるＧＦＰレポーター発現を示す。３〜４つの複製物の平均が棒グラフに示されている。パネルＣは、対照（左）または二重カットｓｇＲＮＡ（右）をトランスフェクトしたＥＬ４細胞における野生型（ＷＴ）または欠失（Ｄｅｌ）対立遺伝子の比率を示す、細胞分取ゲーティング（上パネル）および対応するＰＤ−１エンハンサー領域のゲノムＰＣＲ（下パネル）の結果を示す。パネルＤは、代表的なＥＬ４野生型（明灰色）またはエンハンサー欠失単一細胞クローンのＰＤ−１発現を示す。パネルＥは、ＰＤ−１ｈｉｇｈ集団およびｌｏｗ集団内の示されている位置におけるｓｇＲＮＡ（灰色の記号）の正規化されたエンリッチメントを示す。対照の非ターゲティングｓｇＲＮＡは、５ｂｐ間隔で仮マッピングされている（ｐｓｅｕｄｏ−ｍａｐｐｅｄ）。暗色の円形記号は、−２３．８ｋｂエンハンサーにおいて最大の効果を有した２１個のｓｇＲＮＡに対応し、これらの同質遺伝子系統を後に産生した。パネルＦは、−２３．８ｋｂエンハンサーにおけるスコアが上位であった２１個のｓｇＲＮＡに関する、パネルＥの正規化されたエンリッチメントスコアと、個別にトランスフェクトしたＥＬ４細胞のＰＤ−１のＭＦＩとの間の相関性を示す。パネルＧは、−２３．８ｋｂエンハンサー内のＴＦフットプリントおよびｓｇＲＮＡ活性の重複を示す。慢性ｄ２７において結合確率＞０．９のＴＦフットプリントが上に示されている。線は、上位スコアのｓｇＲＮＡのカット部位を表す。ＰＤ−１のＭＦＩの変化は、各ｓｇＲＮＡの対照ガイドをトランスフェクトした集団に対するものである（円形記号、左軸）。ｓｇＲＮＡ活性により引き起こされたＰＤ−１のＭＦＩ変化の１０ｂｐの移動平均が黒色で示されている（右軸）。パネルＨは、慢性ｄ２７に対する急性ｄ２７のＣＤ８^＋Ｔ細胞における差次的なＴＦフットプリントのボルケーノプロットである。図６は、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、およびＨと識別された８つのパネルを含み、これらは、疲弊特異的エンハンサーの高分解能機能的マッピングが、ＰＤ−１を調節する最小配列を特定することを示す。パネルＡは、示されているように、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＥＬ４細胞株、および造血性系列のＡＴＡＣ−ｓｅｑトラックを示す（Lara-Astiasoら（２０１４年）、Science、３４５巻：９４３〜９４９頁）。矢印は個々のＣｈＡＲを示す。パネルＡは、ＡおよびＡ’のサブパネルに分かれていることに留意されたい。パネルＢは、陰性対照ミニマルプロモーター（左）、ＣＭＶプロモーター構築物（中央）、およびＰｄｃｄ１−２３．８ｋｂエンハンサー構築物（右）を形質導入した、ＥＬ４（上）および活性化ＣＤ８^＋Ｔ細胞（下）におけるＧＦＰレポーター発現を示す。３〜４つの複製物の平均が棒グラフに示されている。パネルＣは、対照（左）または二重カットｓｇＲＮＡ（右）をトランスフェクトしたＥＬ４細胞における野生型（ＷＴ）または欠失（Ｄｅｌ）対立遺伝子の比率を示す、細胞分取ゲーティング（上パネル）および対応するＰＤ−１エンハンサー領域のゲノムＰＣＲ（下パネル）の結果を示す。パネルＤは、代表的なＥＬ４野生型（明灰色）またはエンハンサー欠失単一細胞クローンのＰＤ−１発現を示す。パネルＥは、ＰＤ−１ｈｉｇｈ集団およびｌｏｗ集団内の示されている位置におけるｓｇＲＮＡ（灰色の記号）の正規化されたエンリッチメントを示す。対照の非ターゲティングｓｇＲＮＡは、５ｂｐ間隔で仮マッピングされている（ｐｓｅｕｄｏ−ｍａｐｐｅｄ）。暗色の円形記号は、−２３．８ｋｂエンハンサーにおいて最大の効果を有した２１個のｓｇＲＮＡに対応し、これらの同質遺伝子系統を後に産生した。パネルＦは、−２３．８ｋｂエンハンサーにおけるスコアが上位であった２１個のｓｇＲＮＡに関する、パネルＥの正規化されたエンリッチメントスコアと、個別にトランスフェクトしたＥＬ４細胞のＰＤ−１のＭＦＩとの間の相関性を示す。パネルＧは、−２３．８ｋｂエンハンサー内のＴＦフットプリントおよびｓｇＲＮＡ活性の重複を示す。慢性ｄ２７において結合確率＞０．９のＴＦフットプリントが上に示されている。線は、上位スコアのｓｇＲＮＡのカット部位を表す。ＰＤ−１のＭＦＩの変化は、各ｓｇＲＮＡの対照ガイドをトランスフェクトした集団に対するものである（円形記号、左軸）。ｓｇＲＮＡ活性により引き起こされたＰＤ−１のＭＦＩ変化の１０ｂｐの移動平均が黒色で示されている（右軸）。パネルＨは、慢性ｄ２７に対する急性ｄ２７のＣＤ８^＋Ｔ細胞における差次的なＴＦフットプリントのボルケーノプロットである。図６は、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、およびＨと識別された８つのパネルを含み、これらは、疲弊特異的エンハンサーの高分解能機能的マッピングが、ＰＤ−１を調節する最小配列を特定することを示す。パネルＡは、示されているように、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＥＬ４細胞株、および造血性系列のＡＴＡＣ−ｓｅｑトラックを示す（Lara-Astiasoら（２０１４年）、Science、３４５巻：９４３〜９４９頁）。矢印は個々のＣｈＡＲを示す。パネルＡは、ＡおよびＡ’のサブパネルに分かれていることに留意されたい。パネルＢは、陰性対照ミニマルプロモーター（左）、ＣＭＶプロモーター構築物（中央）、およびＰｄｃｄ１−２３．８ｋｂエンハンサー構築物（右）を形質導入した、ＥＬ４（上）および活性化ＣＤ８^＋Ｔ細胞（下）におけるＧＦＰレポーター発現を示す。３〜４つの複製物の平均が棒グラフに示されている。パネルＣは、対照（左）または二重カットｓｇＲＮＡ（右）をトランスフェクトしたＥＬ４細胞における野生型（ＷＴ）または欠失（Ｄｅｌ）対立遺伝子の比率を示す、細胞分取ゲーティング（上パネル）および対応するＰＤ−１エンハンサー領域のゲノムＰＣＲ（下パネル）の結果を示す。パネルＤは、代表的なＥＬ４野生型（明灰色）またはエンハンサー欠失単一細胞クローンのＰＤ−１発現を示す。パネルＥは、ＰＤ−１ｈｉｇｈ集団およびｌｏｗ集団内の示されている位置におけるｓｇＲＮＡ（灰色の記号）の正規化されたエンリッチメントを示す。対照の非ターゲティングｓｇＲＮＡは、５ｂｐ間隔で仮マッピングされている（ｐｓｅｕｄｏ−ｍａｐｐｅｄ）。暗色の円形記号は、−２３．８ｋｂエンハンサーにおいて最大の効果を有した２１個のｓｇＲＮＡに対応し、これらの同質遺伝子系統を後に産生した。パネルＦは、−２３．８ｋｂエンハンサーにおけるスコアが上位であった２１個のｓｇＲＮＡに関する、パネルＥの正規化されたエンリッチメントスコアと、個別にトランスフェクトしたＥＬ４細胞のＰＤ−１のＭＦＩとの間の相関性を示す。パネルＧは、−２３．８ｋｂエンハンサー内のＴＦフットプリントおよびｓｇＲＮＡ活性の重複を示す。慢性ｄ２７において結合確率＞０．９のＴＦフットプリントが上に示されている。線は、上位スコアのｓｇＲＮＡのカット部位を表す。ＰＤ−１のＭＦＩの変化は、各ｓｇＲＮＡの対照ガイドをトランスフェクトした集団に対するものである（円形記号、左軸）。ｓｇＲＮＡ活性により引き起こされたＰＤ−１のＭＦＩ変化の１０ｂｐの移動平均が黒色で示されている（右軸）。パネルＨは、慢性ｄ２７に対する急性ｄ２７のＣＤ８^＋Ｔ細胞における差次的なＴＦフットプリントのボルケーノプロットである。図６は、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、およびＨと識別された８つのパネルを含み、これらは、疲弊特異的エンハンサーの高分解能機能的マッピングが、ＰＤ−１を調節する最小配列を特定することを示す。パネルＡは、示されているように、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、ＥＬ４細胞株、および造血性系列のＡＴＡＣ−ｓｅｑトラックを示す（Lara-Astiasoら（２０１４年）、Science、３４５巻：９４３〜９４９頁）。矢印は個々のＣｈＡＲを示す。パネルＡは、ＡおよびＡ’のサブパネルに分かれていることに留意されたい。パネルＢは、陰性対照ミニマルプロモーター（左）、ＣＭＶプロモーター構築物（中央）、およびＰｄｃｄ１−２３．８ｋｂエンハンサー構築物（右）を形質導入した、ＥＬ４（上）および活性化ＣＤ８^＋Ｔ細胞（下）におけるＧＦＰレポーター発現を示す。３〜４つの複製物の平均が棒グラフに示されている。パネルＣは、対照（左）または二重カットｓｇＲＮＡ（右）をトランスフェクトしたＥＬ４細胞における野生型（ＷＴ）または欠失（Ｄｅｌ）対立遺伝子の比率を示す、細胞分取ゲーティング（上パネル）および対応するＰＤ−１エンハンサー領域のゲノムＰＣＲ（下パネル）の結果を示す。パネルＤは、代表的なＥＬ４野生型（明灰色）またはエンハンサー欠失単一細胞クローンのＰＤ−１発現を示す。パネルＥは、ＰＤ−１ｈｉｇｈ集団およびｌｏｗ集団内の示されている位置におけるｓｇＲＮＡ（灰色の記号）の正規化されたエンリッチメントを示す。対照の非ターゲティングｓｇＲＮＡは、５ｂｐ間隔で仮マッピングされている（ｐｓｅｕｄｏ−ｍａｐｐｅｄ）。暗色の円形記号は、−２３．８ｋｂエンハンサーにおいて最大の効果を有した２１個のｓｇＲＮＡに対応し、これらの同質遺伝子系統を後に産生した。パネルＦは、−２３．８ｋｂエンハンサーにおけるスコアが上位であった２１個のｓｇＲＮＡに関する、パネルＥの正規化されたエンリッチメントスコアと、個別にトランスフェクトしたＥＬ４細胞のＰＤ−１のＭＦＩとの間の相関性を示す。パネルＧは、−２３．８ｋｂエンハンサー内のＴＦフットプリントおよびｓｇＲＮＡ活性の重複を示す。慢性ｄ２７において結合確率＞０．９のＴＦフットプリントが上に示されている。線は、上位スコアのｓｇＲＮＡのカット部位を表す。ＰＤ−１のＭＦＩの変化は、各ｓｇＲＮＡの対照ガイドをトランスフェクトした集団に対するものである（円形記号、左軸）。ｓｇＲＮＡ活性により引き起こされたＰＤ−１のＭＦＩ変化の１０ｂｐの移動平均が黒色で示されている（右軸）。パネルＨは、慢性ｄ２７に対する急性ｄ２７のＣＤ８^＋Ｔ細胞における差次的なＴＦフットプリントのボルケーノプロットである。

図７は、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧと識別された７パネルを含み、これらは、ＰＤ−１エンハンサーのｉｎｓｉｔｕ飽和変異誘発の結果を示す。パネルＡは、プールスクリーニングのライブラリーにおけるｓｇＲＮＡの組成を示す。パネルＢは、隣接するｓｇＲＮＡカット部位間のギャップの分布を示す。パネルＣは、対照を形質導入したＥＬ４（灰色）と比較した、プールｓｇＲＮＡを形質導入したＥＬ４におけるＰＤ−１分布（左）を示す。ゲートは、ＰＤ−１ｈｉｇｈおよびＰＤ−１ｌｏｗの分取画分を示す。ｈｉｇｈおよびｌｏｗの分取集団中のＰＤ−１の分取後分布が示されている（右）。パネルＤは、形質導入後のＥＬ４と対比したプラスミドプールにおけるｓｇＲＮＡ表現の相関性を示す。パネルＥは、３つの複製物間のＰＤ−１ｈｉｇｈ集団およびｌｏｗ集団におけるｓｇＲＮＡエンリッチメントスコアを示す。パネルＦは、ＰＤ−１ｈｉｇｈ集団およびｌｏｗ集団内の−２３．８ｋｂエンハンサーにおける全てのｓｇＲＮＡ（灰色の記号）の正規化されたエンリッチメントを示し、ｓｇＲＮＡエンリッチメントの１０ｂｐ移動平均が黒色で示されている。パネルＧは、個々に検証するために選択した、−２３．８ｋｂエンハンサー内のＰＤ−１ｌｏｗ画分に集中していた３２個のｓｇＲＮＡの配列を示す。−２３．８ｋｂエンハンサーの始点からの相対位置が左に示されている。図７は、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧと識別された７パネルを含み、これらは、ＰＤ−１エンハンサーのｉｎｓｉｔｕ飽和変異誘発の結果を示す。パネルＡは、プールスクリーニングのライブラリーにおけるｓｇＲＮＡの組成を示す。パネルＢは、隣接するｓｇＲＮＡカット部位間のギャップの分布を示す。パネルＣは、対照を形質導入したＥＬ４（灰色）と比較した、プールｓｇＲＮＡを形質導入したＥＬ４におけるＰＤ−１分布（左）を示す。ゲートは、ＰＤ−１ｈｉｇｈおよびＰＤ−１ｌｏｗの分取画分を示す。ｈｉｇｈおよびｌｏｗの分取集団中のＰＤ−１の分取後分布が示されている（右）。パネルＤは、形質導入後のＥＬ４と対比したプラスミドプールにおけるｓｇＲＮＡ表現の相関性を示す。パネルＥは、３つの複製物間のＰＤ−１ｈｉｇｈ集団およびｌｏｗ集団におけるｓｇＲＮＡエンリッチメントスコアを示す。パネルＦは、ＰＤ−１ｈｉｇｈ集団およびｌｏｗ集団内の−２３．８ｋｂエンハンサーにおける全てのｓｇＲＮＡ（灰色の記号）の正規化されたエンリッチメントを示し、ｓｇＲＮＡエンリッチメントの１０ｂｐ移動平均が黒色で示されている。パネルＧは、個々に検証するために選択した、−２３．８ｋｂエンハンサー内のＰＤ−１ｌｏｗ画分に集中していた３２個のｓｇＲＮＡの配列を示す。−２３．８ｋｂエンハンサーの始点からの相対位置が左に示されている。

図８は、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤと識別された４つのパネルを含み、これらは、ＣｈＩＰ−Ｓｅｑデータを用いた転写因子フットプリンティングの評価の結果を示す。パネルＡは、Ｇｚｍｂ遺伝子座における、ナイーブ、急性ｄ８、急性ｄ２７、慢性ｄ８および慢性ｄ２７の細胞状態でのＡＴＡＣ−ｓｅｑピークを示すＩＧＶトラック、ならびにｉｎｖｉｔｒｏ活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞のｃ−Ｊｕｎ、Ｂａｔｆ、およびＩＲＦ４のＣｈＩＰトラックを示す。パネルＢは、示されている転写因子（ＴＦ）の代表的なＴＦフットプリントを示す。パネルＣは、全ゲノムにわたる、ＢＡＴＦおよびＩＲＦ４に関する正規化されたＣｈＩＰ−ＳｅｑリードとＣｅｎｔｉｐｅｄｅ事後確率との相関性を示す。パネルＤは、ＩＲＦ４およびＢＡＴＦ結合の存在／非存在を呼び出すために使用したＣｅｎｔｉｐｅｄｅ事後確率の様々なカットオフのＲＯＣプロットを示す（ＣｈＩＰ−ＳｅｑピークはＴＦ結合を特定するための標準として使用した）。図８は、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤと識別された４つのパネルを含み、これらは、ＣｈＩＰ−Ｓｅｑデータを用いた転写因子フットプリンティングの評価の結果を示す。パネルＡは、Ｇｚｍｂ遺伝子座における、ナイーブ、急性ｄ８、急性ｄ２７、慢性ｄ８および慢性ｄ２７の細胞状態でのＡＴＡＣ−ｓｅｑピークを示すＩＧＶトラック、ならびにｉｎｖｉｔｒｏ活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞のｃ−Ｊｕｎ、Ｂａｔｆ、およびＩＲＦ４のＣｈＩＰトラックを示す。パネルＢは、示されている転写因子（ＴＦ）の代表的なＴＦフットプリントを示す。パネルＣは、全ゲノムにわたる、ＢＡＴＦおよびＩＲＦ４に関する正規化されたＣｈＩＰ−ＳｅｑリードとＣｅｎｔｉｐｅｄｅ事後確率との相関性を示す。パネルＤは、ＩＲＦ４およびＢＡＴＦ結合の存在／非存在を呼び出すために使用したＣｅｎｔｉｐｅｄｅ事後確率の様々なカットオフのＲＯＣプロットを示す（ＣｈＩＰ−ＳｅｑピークはＴＦ結合を特定するための標準として使用した）。

図９は、パネルＡおよびＢと識別された２つのパネルを含み、これらは、クロマチン接近可能領域における転写因子フットプリンティングを示す。パネルＡは、７つのＣｈＡＲモジュール（縦列）における１００個の転写因子（ＴＦ）の相対的なエンリッチメント倍率（横列）を示す。横列および縦列は階層的にクラスタリングされている。急性感染および慢性感染における差次的な遺伝子発現および推測される差次的なＴＦ結合による重み付けを行うことにより、ＴＦランクを決定した。パネルＢは、５つ全ての状態での推測されるＴＦ結合事象の合計数（上）、またはｄ８およびｄ２７における急性と慢性との間の差（下）を示す。図９は、パネルＡおよびＢと識別された２つのパネルを含み、これらは、クロマチン接近可能領域における転写因子フットプリンティングを示す。パネルＡは、７つのＣｈＡＲモジュール（縦列）における１００個の転写因子（ＴＦ）の相対的なエンリッチメント倍率（横列）を示す。横列および縦列は階層的にクラスタリングされている。急性感染および慢性感染における差次的な遺伝子発現および推測される差次的なＴＦ結合による重み付けを行うことにより、ＴＦランクを決定した。パネルＢは、５つ全ての状態での推測されるＴＦ結合事象の合計数（上）、またはｄ８およびｄ２７における急性と慢性との間の差（下）を示す。

図１０は、パネルＡ、Ｂ、およびＣと識別された３つのパネルを含み、これらは、クロマチン接近可能領域における転写因子フットプリンティングの結果を示す。パネルＡは、ＴＦモチーフにおける相対的な結合活性をナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞と急性ｄ８のＣＤ８^＋Ｔ細胞とで対比したボルケーノプロットである。パネルＢは、−２３．８ｋｂＰＤ−１エンハンサー内のフットプリントを有するＳｏｘ３、ＲＡＲ、およびＴＢＸ２１のモチーフを示す。パネルＣは、遺伝子に隣接する領域（四角形のノード）内のＴＦモチーフにおける推測される結合（円形のノード）を提供するネットワーク図を示す。遺伝子は、ｍＲＮＡ発現により、感染後７日目（上）および２７日目（下）において、急性感染と慢性感染との間で上方制御されたもの（左）、下方制御されたもの（右）、または未変化のもの（中央）に分割されている。ＴＦノードは、慢性感染（左）または急性感染（右）における状態特異的結合の偏りを示すために着色されている。エッジは、３クラスの遺伝子（急性感染において上方制御されたもの、慢性感染において上方制御されたもの、または未変化のもの）に対する状態特異的な結合事象の相対割合を示すようにグレーディングされている。慢性感染において最も優先的に特定された結合事象を表すエッジは最左にあり、急性感染において最も優先的に見られたものは最右にある。図１０は、パネルＡ、Ｂ、およびＣと識別された３つのパネルを含み、これらは、クロマチン接近可能領域における転写因子フットプリンティングの結果を示す。パネルＡは、ＴＦモチーフにおける相対的な結合活性をナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞と急性ｄ８のＣＤ８^＋Ｔ細胞とで対比したボルケーノプロットである。パネルＢは、−２３．８ｋｂＰＤ−１エンハンサー内のフットプリントを有するＳｏｘ３、ＲＡＲ、およびＴＢＸ２１のモチーフを示す。パネルＣは、遺伝子に隣接する領域（四角形のノード）内のＴＦモチーフにおける推測される結合（円形のノード）を提供するネットワーク図を示す。遺伝子は、ｍＲＮＡ発現により、感染後７日目（上）および２７日目（下）において、急性感染と慢性感染との間で上方制御されたもの（左）、下方制御されたもの（右）、または未変化のもの（中央）に分割されている。ＴＦノードは、慢性感染（左）または急性感染（右）における状態特異的結合の偏りを示すために着色されている。エッジは、３クラスの遺伝子（急性感染において上方制御されたもの、慢性感染において上方制御されたもの、または未変化のもの）に対する状態特異的な結合事象の相対割合を示すようにグレーディングされている。慢性感染において最も優先的に特定された結合事象を表すエッジは最左にあり、急性感染において最も優先的に見られたものは最右にある。

図１１は、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥと識別された５つのパネルを含み、これらは、ヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞のクロマチン接近可能領域およびマウスのオルソロガスな領域の特徴を示す。パネルＡは、代表的なヒト試料における四量体^＋集団、ナイーブ集団、およびエフェクターメモリー集団の細胞分取戦略を示す。パネルＢは、全てのヒト試料のＡＴＡＣピークにおける、公表されているヒト初代Ｔ細胞中のヒストンマークについてアノテーションされた領域のエンリッチメント倍率を示す。パネルＣは、全てのＮＨＧＲＩＧＷＡＳＳＮＰのエンリッチメントを示す。点線は、ｐ＝０．０５（超幾何分布検定）を示す。パネルＤは、免疫系疾患関連ＳＮＰのエンリッチメントを示す。パネルＥは、ランダムに選択された領域と比べたオルソロガスな調節領域における自己免疫疾患ＳＮＰのエンリッチメント倍率を示すヒートマップである。縦列は階層的にクラスタリングされている。図１１は、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥと識別された５つのパネルを含み、これらは、ヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞のクロマチン接近可能領域およびマウスのオルソロガスな領域の特徴を示す。パネルＡは、代表的なヒト試料における四量体^＋集団、ナイーブ集団、およびエフェクターメモリー集団の細胞分取戦略を示す。パネルＢは、全てのヒト試料のＡＴＡＣピークにおける、公表されているヒト初代Ｔ細胞中のヒストンマークについてアノテーションされた領域のエンリッチメント倍率を示す。パネルＣは、全てのＮＨＧＲＩＧＷＡＳＳＮＰのエンリッチメントを示す。点線は、ｐ＝０．０５（超幾何分布検定）を示す。パネルＤは、免疫系疾患関連ＳＮＰのエンリッチメントを示す。パネルＥは、ランダムに選択された領域と比べたオルソロガスな調節領域における自己免疫疾患ＳＮＰのエンリッチメント倍率を示すヒートマップである。縦列は階層的にクラスタリングされている。図１１は、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥと識別された５つのパネルを含み、これらは、ヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞のクロマチン接近可能領域およびマウスのオルソロガスな領域の特徴を示す。パネルＡは、代表的なヒト試料における四量体^＋集団、ナイーブ集団、およびエフェクターメモリー集団の細胞分取戦略を示す。パネルＢは、全てのヒト試料のＡＴＡＣピークにおける、公表されているヒト初代Ｔ細胞中のヒストンマークについてアノテーションされた領域のエンリッチメント倍率を示す。パネルＣは、全てのＮＨＧＲＩＧＷＡＳＳＮＰのエンリッチメントを示す。点線は、ｐ＝０．０５（超幾何分布検定）を示す。パネルＤは、免疫系疾患関連ＳＮＰのエンリッチメントを示す。パネルＥは、ランダムに選択された領域と比べたオルソロガスな調節領域における自己免疫疾患ＳＮＰのエンリッチメント倍率を示すヒートマップである。縦列は階層的にクラスタリングされている。

図１２は、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、およびＨと識別された８つのパネルを含み、これらは、マウスにおける疲弊特異的エピジェネティックプロファイルが、ＨＩＶ感染およびＨＣＶ感染における抗原特異的な疲弊ヒトＴ細胞で保存されていることを示す。パネルＡは、ナイーブ試料、ＨＩＶ四量体^＋試料、およびＣＭＶ四量体^＋試料のＩＦＮＧ遺伝子座における代表的なＡＴＡＣ−ｓｅｑトラックを示す（上）。ＩＦＮＧにおけるヒトゲノムに対するマウスのクロマチン接近可能領域のマッピングが示されている（ブロック、下）。このパネルはサブパネルＡおよびＡ’に分かれており、サブパネルＡ’はＴＢＸ２１遺伝子座におけるＡＴＡＣ−ｓｅｑトラックをさらに示すことに留意されたい。パネルＢは、ナイーブ、急性ｄ８、急性ｄ２７、慢性ｄ８、および慢性ｄ２７の状態に関して、ヒトゲノム（ｈｇ１９）に対して全体的／部分的にマッピングされた全てのピークの百分率を示す。パネルＣは、マウスのオルソロガスなＣｈＡＲにおけるＰＩＣＳＳＮＰのエンリッチメントを示す。点線は、ｐ＝０．０５（超幾何分布検定）を示す。パネルＤは、マウスおよびヒトの比較分析の概略図を示す。パネルＥは、示されているヒト試料中の、マウスのナイーブ、メモリー、および疲弊エンハンサーにオルソロガスな領域における平均クロマチン接近可能性を示すヒートマップである。パネルＦは、単一のＨＣＶ感染ドナーに由来する、ナイーブ、ＨＣＶＣ６３Ｂ四量体^＋、ＨＣＶ１７４Ｄ四量体^＋、ＦｌｕＭＰ四量体^＋、およびエフェクターメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞集団における、フローサイトメトリーにより測定したＰＤ−１およびＣＤ３９の発現を示す。パネルＧは、Ｃ６３Ｂおよび１７４Ｄエピトープをコードするウイルス配列を示す。パネルＨは、示されているように単一のＨＣＶ感染ドナーに由来するヒト試料中の、マウスのナイーブ、メモリー、および疲弊エンハンサーにオルソロガスな領域における平均クロマチン接近可能性を示すヒートマップである。図１２は、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、およびＨと識別された８つのパネルを含み、これらは、マウスにおける疲弊特異的エピジェネティックプロファイルが、ＨＩＶ感染およびＨＣＶ感染における抗原特異的な疲弊ヒトＴ細胞で保存されていることを示す。パネルＡは、ナイーブ試料、ＨＩＶ四量体^＋試料、およびＣＭＶ四量体^＋試料のＩＦＮＧ遺伝子座における代表的なＡＴＡＣ−ｓｅｑトラックを示す（上）。ＩＦＮＧにおけるヒトゲノムに対するマウスのクロマチン接近可能領域のマッピングが示されている（ブロック、下）。このパネルはサブパネルＡおよびＡ’に分かれており、サブパネルＡ’はＴＢＸ２１遺伝子座におけるＡＴＡＣ−ｓｅｑトラックをさらに示すことに留意されたい。パネルＢは、ナイーブ、急性ｄ８、急性ｄ２７、慢性ｄ８、および慢性ｄ２７の状態に関して、ヒトゲノム（ｈｇ１９）に対して全体的／部分的にマッピングされた全てのピークの百分率を示す。パネルＣは、マウスのオルソロガスなＣｈＡＲにおけるＰＩＣＳＳＮＰのエンリッチメントを示す。点線は、ｐ＝０．０５（超幾何分布検定）を示す。パネルＤは、マウスおよびヒトの比較分析の概略図を示す。パネルＥは、示されているヒト試料中の、マウスのナイーブ、メモリー、および疲弊エンハンサーにオルソロガスな領域における平均クロマチン接近可能性を示すヒートマップである。パネルＦは、単一のＨＣＶ感染ドナーに由来する、ナイーブ、ＨＣＶＣ６３Ｂ四量体^＋、ＨＣＶ１７４Ｄ四量体^＋、ＦｌｕＭＰ四量体^＋、およびエフェクターメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞集団における、フローサイトメトリーにより測定したＰＤ−１およびＣＤ３９の発現を示す。パネルＧは、Ｃ６３Ｂおよび１７４Ｄエピトープをコードするウイルス配列を示す。パネルＨは、示されているように単一のＨＣＶ感染ドナーに由来するヒト試料中の、マウスのナイーブ、メモリー、および疲弊エンハンサーにオルソロガスな領域における平均クロマチン接近可能性を示すヒートマップである。図１２は、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、およびＨと識別された８つのパネルを含み、これらは、マウスにおける疲弊特異的エピジェネティックプロファイルが、ＨＩＶ感染およびＨＣＶ感染における抗原特異的な疲弊ヒトＴ細胞で保存されていることを示す。パネルＡは、ナイーブ試料、ＨＩＶ四量体^＋試料、およびＣＭＶ四量体^＋試料のＩＦＮＧ遺伝子座における代表的なＡＴＡＣ−ｓｅｑトラックを示す（上）。ＩＦＮＧにおけるヒトゲノムに対するマウスのクロマチン接近可能領域のマッピングが示されている（ブロック、下）。このパネルはサブパネルＡおよびＡ’に分かれており、サブパネルＡ’はＴＢＸ２１遺伝子座におけるＡＴＡＣ−ｓｅｑトラックをさらに示すことに留意されたい。パネルＢは、ナイーブ、急性ｄ８、急性ｄ２７、慢性ｄ８、および慢性ｄ２７の状態に関して、ヒトゲノム（ｈｇ１９）に対して全体的／部分的にマッピングされた全てのピークの百分率を示す。パネルＣは、マウスのオルソロガスなＣｈＡＲにおけるＰＩＣＳＳＮＰのエンリッチメントを示す。点線は、ｐ＝０．０５（超幾何分布検定）を示す。パネルＤは、マウスおよびヒトの比較分析の概略図を示す。パネルＥは、示されているヒト試料中の、マウスのナイーブ、メモリー、および疲弊エンハンサーにオルソロガスな領域における平均クロマチン接近可能性を示すヒートマップである。パネルＦは、単一のＨＣＶ感染ドナーに由来する、ナイーブ、ＨＣＶＣ６３Ｂ四量体^＋、ＨＣＶ１７４Ｄ四量体^＋、ＦｌｕＭＰ四量体^＋、およびエフェクターメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞集団における、フローサイトメトリーにより測定したＰＤ−１およびＣＤ３９の発現を示す。パネルＧは、Ｃ６３Ｂおよび１７４Ｄエピトープをコードするウイルス配列を示す。パネルＨは、示されているように単一のＨＣＶ感染ドナーに由来するヒト試料中の、マウスのナイーブ、メモリー、および疲弊エンハンサーにオルソロガスな領域における平均クロマチン接近可能性を示すヒートマップである。図１２は、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、およびＨと識別された８つのパネルを含み、これらは、マウスにおける疲弊特異的エピジェネティックプロファイルが、ＨＩＶ感染およびＨＣＶ感染における抗原特異的な疲弊ヒトＴ細胞で保存されていることを示す。パネルＡは、ナイーブ試料、ＨＩＶ四量体^＋試料、およびＣＭＶ四量体^＋試料のＩＦＮＧ遺伝子座における代表的なＡＴＡＣ−ｓｅｑトラックを示す（上）。ＩＦＮＧにおけるヒトゲノムに対するマウスのクロマチン接近可能領域のマッピングが示されている（ブロック、下）。このパネルはサブパネルＡおよびＡ’に分かれており、サブパネルＡ’はＴＢＸ２１遺伝子座におけるＡＴＡＣ−ｓｅｑトラックをさらに示すことに留意されたい。パネルＢは、ナイーブ、急性ｄ８、急性ｄ２７、慢性ｄ８、および慢性ｄ２７の状態に関して、ヒトゲノム（ｈｇ１９）に対して全体的／部分的にマッピングされた全てのピークの百分率を示す。パネルＣは、マウスのオルソロガスなＣｈＡＲにおけるＰＩＣＳＳＮＰのエンリッチメントを示す。点線は、ｐ＝０．０５（超幾何分布検定）を示す。パネルＤは、マウスおよびヒトの比較分析の概略図を示す。パネルＥは、示されているヒト試料中の、マウスのナイーブ、メモリー、および疲弊エンハンサーにオルソロガスな領域における平均クロマチン接近可能性を示すヒートマップである。パネルＦは、単一のＨＣＶ感染ドナーに由来する、ナイーブ、ＨＣＶＣ６３Ｂ四量体^＋、ＨＣＶ１７４Ｄ四量体^＋、ＦｌｕＭＰ四量体^＋、およびエフェクターメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞集団における、フローサイトメトリーにより測定したＰＤ−１およびＣＤ３９の発現を示す。パネルＧは、Ｃ６３Ｂおよび１７４Ｄエピトープをコードするウイルス配列を示す。パネルＨは、示されているように単一のＨＣＶ感染ドナーに由来するヒト試料中の、マウスのナイーブ、メモリー、および疲弊エンハンサーにオルソロガスな領域における平均クロマチン接近可能性を示すヒートマップである。図１２は、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、およびＨと識別された８つのパネルを含み、これらは、マウスにおける疲弊特異的エピジェネティックプロファイルが、ＨＩＶ感染およびＨＣＶ感染における抗原特異的な疲弊ヒトＴ細胞で保存されていることを示す。パネルＡは、ナイーブ試料、ＨＩＶ四量体^＋試料、およびＣＭＶ四量体^＋試料のＩＦＮＧ遺伝子座における代表的なＡＴＡＣ−ｓｅｑトラックを示す（上）。ＩＦＮＧにおけるヒトゲノムに対するマウスのクロマチン接近可能領域のマッピングが示されている（ブロック、下）。このパネルはサブパネルＡおよびＡ’に分かれており、サブパネルＡ’はＴＢＸ２１遺伝子座におけるＡＴＡＣ−ｓｅｑトラックをさらに示すことに留意されたい。パネルＢは、ナイーブ、急性ｄ８、急性ｄ２７、慢性ｄ８、および慢性ｄ２７の状態に関して、ヒトゲノム（ｈｇ１９）に対して全体的／部分的にマッピングされた全てのピークの百分率を示す。パネルＣは、マウスのオルソロガスなＣｈＡＲにおけるＰＩＣＳＳＮＰのエンリッチメントを示す。点線は、ｐ＝０．０５（超幾何分布検定）を示す。パネルＤは、マウスおよびヒトの比較分析の概略図を示す。パネルＥは、示されているヒト試料中の、マウスのナイーブ、メモリー、および疲弊エンハンサーにオルソロガスな領域における平均クロマチン接近可能性を示すヒートマップである。パネルＦは、単一のＨＣＶ感染ドナーに由来する、ナイーブ、ＨＣＶＣ６３Ｂ四量体^＋、ＨＣＶ１７４Ｄ四量体^＋、ＦｌｕＭＰ四量体^＋、およびエフェクターメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞集団における、フローサイトメトリーにより測定したＰＤ−１およびＣＤ３９の発現を示す。パネルＧは、Ｃ６３Ｂおよび１７４Ｄエピトープをコードするウイルス配列を示す。パネルＨは、示されているように単一のＨＣＶ感染ドナーに由来するヒト試料中の、マウスのナイーブ、メモリー、および疲弊エンハンサーにオルソロガスな領域における平均クロマチン接近可能性を示すヒートマップである。

図１３は、パネルＡ、Ｂ、およびＣと識別された３つのパネルを含み、これらは、ＰＤ−１の上流にある−２３ｋｂエンハンサー配列の生殖系列欠失を有するマウスの特徴付けを示す。パネルＡは、ＰＣＲによるこのようなエンハンサー配列の生殖系列欠失の概略図を示す。パネルＢは、ゲノムに生殖系列欠失を導入するために使用されるマウスに対する微量注入および移植の方法を図示する。パネルＣは、生存した７体の子孫の間で、−２３ｋｂエンハンサー配列を含有するＣｈＡＲ領域をゲル電気泳動によって比較し、７体の子孫のうち２体（すなわち、ｍｓ４およびｍｓ６）においてエンハンサー配列が欠失していたことを明示する。

図１４は、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥと識別された５つのパネルを含み、これらは、−２３ｋｂＰＤ−１エンハンサーの生殖系列欠失を有するマウスの特徴を野生型マウスに対して比較する。パネルＡは、２つのミックスのマウスを生成するための養子細胞移入戦略の概略図を示す。パネルＢは、パネルＡで生成された２つのミックスのマウスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞の特徴付けと、フローサイトメトリーを使用してそれらの細胞集団ならびにトランスジェニックＴＣＲおよびＰＤ−１の発現レベルを比較した結果とを示す。パネルＣは、パネルＡで生成された２つのミックスのマウスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞の特徴付けと、ＭＦＩを使用してそれらのＰＤ−１の発現レベルを比較した結果とを示す。パネルＤは、ｄ８における２つのミックスのマウスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖速度（ｌｏｇ_２倍率変化として）を比較する。パネルＥは、ｄ１５における２つのミックスのマウスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖速度（ｌｏｇ_２倍率変化として）を比較する。図１４は、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥと識別された５つのパネルを含み、これらは、−２３ｋｂＰＤ−１エンハンサーの生殖系列欠失を有するマウスの特徴を野生型マウスに対して比較する。パネルＡは、２つのミックスのマウスを生成するための養子細胞移入戦略の概略図を示す。パネルＢは、パネルＡで生成された２つのミックスのマウスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞の特徴付けと、フローサイトメトリーを使用してそれらの細胞集団ならびにトランスジェニックＴＣＲおよびＰＤ−１の発現レベルを比較した結果とを示す。パネルＣは、パネルＡで生成された２つのミックスのマウスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞の特徴付けと、ＭＦＩを使用してそれらのＰＤ−１の発現レベルを比較した結果とを示す。パネルＤは、ｄ８における２つのミックスのマウスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖速度（ｌｏｇ_２倍率変化として）を比較する。パネルＥは、ｄ１５における２つのミックスのマウスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖速度（ｌｏｇ_２倍率変化として）を比較する。図１４は、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥと識別された５つのパネルを含み、これらは、−２３ｋｂＰＤ−１エンハンサーの生殖系列欠失を有するマウスの特徴を野生型マウスに対して比較する。パネルＡは、２つのミックスのマウスを生成するための養子細胞移入戦略の概略図を示す。パネルＢは、パネルＡで生成された２つのミックスのマウスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞の特徴付けと、フローサイトメトリーを使用してそれらの細胞集団ならびにトランスジェニックＴＣＲおよびＰＤ−１の発現レベルを比較した結果とを示す。パネルＣは、パネルＡで生成された２つのミックスのマウスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞の特徴付けと、ＭＦＩを使用してそれらのＰＤ−１の発現レベルを比較した結果とを示す。パネルＤは、ｄ８における２つのミックスのマウスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖速度（ｌｏｇ_２倍率変化として）を比較する。パネルＥは、ｄ１５における２つのミックスのマウスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖速度（ｌｏｇ_２倍率変化として）を比較する。

棒ヒストグラム、曲線、または凡例に関連付けられた他のデータを示すあらゆる図において、各指標に関して左から右に提示される棒、曲線、または他のデータは、凡例の四角の上から下に直接的かつ順番に対応する。

発明の詳細な説明
本発明は、がんおよび／または慢性ウイルス感染から生じるものなどの疲弊T細胞が、阻害性受容体ＰＤ−１の持続性発現を含む遺伝子発現の独特のパターンを有するという発見に少なくとも部分的に基づく。疲弊T細胞に対して状態特異的であり、機能的メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞のものとは大いに異なる、クロマチン接近可能なゲノム遺伝子調節領域（例えば、プロモーターに対して遠位側にあるかプロモーター自体の中にあるかを問わず、遺伝子発現エンハンサーまたは遺伝子発現サプレッサー）が特定された。これらの領域はクロマチン接近可能であるため、転写因子がこの領域に物理的に結合して、遺伝子発現の調節を媒介することができる。本明細書に記述されるように、このような疲弊T細胞における遺伝子の状態特異的調節はそれらの機能障害に重要であり、疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞またはＴ細胞機能に影響する細胞において優先的に遺伝子発現を変化させるための、例えばゲノム編集による調整の標的となる。慢性ウイルス感染のマウスモデルにおける疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、機能的モジュールに組織化されるエンハンサーの広範囲にわたる状態特異的パターンを獲得する。Ｐｄｃｄ１遺伝子座から−２３．８ｋｂ離れた１つのエンハンサーは、疲弊T細胞およびＰＤ−１を持続的に発現する他のリンパ球にしか見出されない。ゲノム編集は、それがＰＤ−１の高発現に要求されることを示した。エンハンサーのＣａｓ９媒介性ｉｎｓｉｔｕ飽和変異誘発は、疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＲＡＲ、Ｔ−ｂｅｔ、およびＳｏｘ３の結合した転写因子モチーフに対応する重要な最小配列を正確に示す。マウスの疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞で特定された状態特異的エンハンサープロファイルは、ＨＩＶおよびＨＣＶ感染に応答するヒトの疲弊した抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞において保存されている。Ｔ細胞疲弊の詳細な機能的エンハンサーのマップは、状態特異的な調節配列を明らかにし、疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞において優先的に遺伝子発現を変化させうるゲノム編集のための標的を提示する。

非疲弊T細胞においてＴ細胞疲弊を防止するため、および／または疲弊T細胞においてＴ細胞疲弊を逆転させるために、エンハンサー、サプレッサー、および／またはプロモーターなどのＴ細胞疲弊特異的でクロマチン接近可能なゲノム調節エレメントを選択的にターゲティングすると、がんおよび／またはウイルス感染などの慢性免疫障害において起こるようなＴ細胞疲弊を調整すると同時に、ＰＤ−１などの遺伝子の正常な生理学的調節を維持することができる。遺伝子の転写開始部位の近位側にあり単一の遺伝子を調節する遺伝子発現調整領域は、典型的には、プロモーター増強または抑制遺伝子発現調整領域と称され、遺伝子の転写開始部位の遠位側にあり単一よりも多くの遺伝子を調節しうる遺伝子発現調整領域は、典型的には、エンハンサーおよびサプレッサーと称される。

したがって本発明は、部分的には、少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現を調節するゲノム領域の遺伝子修飾により、哺乳動物Ｔ細胞（例えば、非疲弊T細胞または疲弊T細胞）における少なくとも１つの遺伝子の発現が調整されたＴ細胞を操作するための組成物および方法に関し、このゲノム領域は、疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞のゲノム内で選択的にクロマチン接近可能である。加えて、慢性免疫障害（例えば、がんおよび／または慢性ウイルス感染）に罹患した対象を処置するための方法が提供される。さらに、多数のさらなる予後判定方法、診断方法、および治療方法も本明細書に記述される。

Ｉ．定義
「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」という冠詞は、本明細書では、その冠詞の文法上の目的語の１つまたは１つより多く（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「１つの要素（ａｎｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または１つより多くの要素を意味する。

対象におけるマーカーの「量」、例えば、マーカーの発現もしくはコピー数、またはマーカーのタンパク質レベルは、マーカーの量が、量を査定するために用いられるアッセイの標準誤差よりも多い量だけ、好ましくはその量の少なくとも２倍、より好ましくは３倍、４倍、５倍、１０倍、またはそれよりも多い倍数だけ、正常なレベルよりもそれぞれ多いかまたは少ない場合に、マーカーの正常な量よりも「有意に」高いかまたは低い。代替的に、対象におけるマーカーの量は、その量が、マーカーの正常な量よりも少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約３倍、４倍、または５倍、それぞれ高いかまたは低い場合に、正常な量よりも「有意に」高いかまたは低いと考えることができる。

マーカーの「発現レベルの変化」という用語は、試験試料、例えば、がんを患う対象から得られた試料中のマーカーの発現レベルまたはコピー数で、発現またはコピー数を査定するために用いられるアッセイの標準誤差よりも多いかまたは少なく、対照試料（例えば、関連疾患を有しない健康な対象由来の試料）中のマーカーまたは染色体領域の発現レベルまたはコピー数、好ましくは、いくつかの対照試料中のマーカーまたは染色体領域の平均発現レベルまたはコピー数の、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは３倍、４倍、５倍、もしくは１０倍、またはそれよりも多い倍数であるものを指す。発現レベルの変化は、発現またはコピー数を査定するために用いられるアッセイの標準誤差よりも多いかまたは少なく、対照試料（例えば、関連疾患を有しない健康な対象由来の試料）中のマーカーの発現レベルまたはコピー数、好ましくは、いくつかの対照試料中のマーカーの平均発現レベルまたはコピー数の、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは３倍、４倍、５倍、もしくは１０倍、またはそれよりも多い倍数である。

マーカーの「変化した活性」という用語は、疾患状態において、例えば、腫瘍または自己免疫試料において、正常な対照試料中のマーカーの活性と比較して増加または減少した、マーカーの活性を指す。マーカーの変化した活性は、例えば、マーカーの発現の変化、マーカーのタンパク質レベルの変化、マーカーの構造の変化、または、例えば、マーカーと同じかもしくは異なる経路に関与する他のタンパク質との相互作用の変化、または、転写活性化因子もしくは阻害剤との相互作用の変化の結果でありうる。

バイオマーカーの「構造の変化」という用語は、正常または野生型の遺伝子またはタンパク質と比較して、バイオマーカー核酸もしくはタンパク質内の変異または対立遺伝子変異形、例えば、マーカー核酸もしくはタンパク質の発現または活性に影響する変異の存在を指す。例えば、変異としては、置換変異、欠失変異、または付加変異が挙げられるが、これらに限定されない。変異は、バイオマーカー核酸のコード領域に存在しても非コード領域に存在してもよい。

本明細書において特に明記されない限り、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙおよびａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、天然に存在する形態の抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ）および組換え抗体、例えば単鎖抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体、および多特異性抗体、ならびに前述のもの全ての断片および誘導体で、少なくとも１つの抗原性結合部位を有する断片および誘導体を広く包含する。抗体誘導体は、抗体にコンジュゲートされたタンパク質または化学部分を含みうる。抗体および抗体断片に関して本明細書に列挙される特性は、本明細書に記述されるＦｃ融合タンパク質にも適用される。

本明細書で使用される「抗体」という用語は、抗体の「抗原結合性部分」（または単純に「抗体部分」）も含む。本明細書で使用される「抗原結合性部分」という用語は、抗原（例えば、ＰＤ−１ポリペプチドまたはその断片）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって行われうることが示されている。抗体の「抗原結合性部分」という用語に包含される結合性断片の例としては、（ｉ）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Wardら（１９８９年）、Nature、３４１巻：５４４〜５４６頁）；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされるが、組換え法を使用して合成リンカーによりＶＬおよびＶＨを結合させることができ、この合成リンカーにより、ＶＬおよびＶＨは、ＶＬ領域およびＶＨ領域が対になって一価のポリペプチドを形成する単一のタンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えば、Birdら（１９８８年）、Science、２４２巻：４２３〜４２６頁；およびHustonら（１９８８年）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８５巻：５８７９〜５８８３頁；およびOsbournら（１９９８年）、Nat. Biotechnol.、１６巻：７７８頁を参照されたい）になることができる。このような単鎖抗体も、抗体の「抗原結合性部分」という用語に包含されるよう意図される。完全なＩｇＧポリペプチドまたは他のアイソタイプをコードする発現ベクターを生成するために、特定のｓｃＦｖの任意のＶＨおよびＶＬ配列をヒト免疫グロブリンの定常領域ｃＤＮＡまたはゲノム配列に連結させることができる。ＶＨおよびＶＬは、タンパク質化学または組換えＤＮＡ技術のいずれかを使用した、免疫グロブリンのＦａｂ、Ｆｖ、または他の断片の生成において使用することもできる。ダイアボディといった他の形態の単鎖抗体も包含される。ダイアボディとは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上で発現されるが、これら２つのドメインを同じ鎖上で対合させるには短すぎるリンカーを使用することにより、これらのドメインを別の鎖の相補性ドメインと強制的に対合させて２つの抗原結合部位を作出した、二価の二重特異性抗体である（例えば、Holliger, P.ら（１９９３年）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、９０巻：６４４４〜６４４８頁；Poljak, R. J.ら（１９９４年）、Structure、２巻：１１２１〜１１２３頁を参照されたい）。

なおもさらに、抗体またはその抗原結合性部分は、抗体または抗体部分と１つまたは複数の他のタンパク質またはペプチドとの共有結合または非共有結合による会合によって形成された、より大きなイムノアドヘシンポリペプチドの一部であってもよい。このようなイムノアドヘシンポリペプチドの例は、四量体ｓｃＦｖポリペプチドを作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Kipriyanov, S.M.ら（１９９５年）、Human Antibodies and Hybridomas、６巻：９３〜１０１頁）、ならびに二価のビオチン化ｓｃＦｖポリペプチドを作製するためのシステイン残基、マーカーペプチド、およびＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Kipriyanov, S.M.ら（１９９４年）、Mol. Immunol.、３１巻：１０４７〜１０５８頁）を含む。Ｆａｂ断片およびＦ（ａｂ’）２断片などの抗体部分は、それぞれ、全抗体のパパイン消化またはペプシン消化などの従来型技術を使用して、全抗体から調製することができる。さらに、抗体、抗体部分、およびイムノアドヘシンポリペプチドは、本明細書に記述されるように、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して得ることができる。

抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル；異種、同種、または同系；またはそれらの修飾形態（例えば、ヒト化抗体、キメラ抗体など）であってもよい。抗体は完全にヒトであってもよい。好ましくは、本発明の抗体は、ＰＤ−１ポリペプチドまたはその断片に、特異的に、または実質的に特異的に結合する。本発明の抗体はまた、このような抗原を他のＢ７ファミリーメンバーなどの密接に関係した抗原から区別することができるように、このような抗原に対して選択的であってもよい。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」および「モノクローナル抗体組成物」という用語は、抗原の特定のエピトープと免疫反応する能力がある１つの種の抗原結合部位だけを含有する抗体ポリペプチドの集団を指し、一方、「ポリクローナル抗体」および「ポリクローナル抗体組成物」という用語は、特定の抗原と相互作用する能力がある複数種の抗原結合部位を含有する抗体ポリペプチドの集団を指す。モノクローナル抗体組成物は、典型的には、それが免疫反応する特定の抗原に対して単一の結合親和性を提示する。

本明細書で使用される「遮断」剤または「アンタゴニスト」とは、それが結合する抗原の少なくとも１種の生物学的活性を阻害または低減するものである。例えば、抗ＰＤ−１抗体はＰＤ−１に結合し、１つまたは複数のリガンド、例えばＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２に結合するＰＤ−１の能力を阻害する。ある特定の実施形態では、本明細書に記述される遮断抗体またはアンタゴニスト抗体またはそれらの断片は、抗原の所与の生物学的活性を実質的にまたは完全に阻害する。ある特定の実施形態では、「インバースアゴニスト」という用語が、正常に対する相反作用を促進する薬剤を指すために使用される。例えば、ＰＤ−１インバースアゴニストは、免疫応答の共阻害とは対照的に共刺激を促進することができる。

「バイオマーカー」または「マーカー」という用語は、Ｔ細胞疲弊を示すものと決定された本発明の測定可能な実体を指す。例えば、本明細書に記述されるバイオマーカーは、Ｔ細胞における少なくとも１つの遺伝子の発現を調整するゲノム調節領域でありうる。別の実施形態では、本明細書に記述されるバイオマーカーは、Ｔ細胞により発現され、Ｔ細胞活性および／またはＴ細胞疲弊（例えば、疲弊T細胞における高い持続的なＰＤ−１の発現および／または活性）に関係する、エフェクター遺伝子またはその産物でありうる。バイオマーカーはまた、限定されないが、細胞型（例えば、操作T細胞）、細胞比（例えば、操作T細胞と疲弊T細胞の比）、核酸（例えば、ゲノム核酸および／または転写された核酸）、およびタンパク質、特に表１に提供されるものを含みうる。バイオマーカーは、本明細書にさらに記述される目的の免疫障害を処置するために不要な免疫反応を下方制御する免疫学的標的または薬剤をさらに含みうる。バイオマーカー活性の調整（例えば、増加または減少）は、任意の数の方法で（例えば、対照、比、ベースラインとの比較などの使用を含む、本明細書に記述される措置に従って）測定することができる。例えば、操作された疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞内で選択的にクロマチン接近可能であるゲノム調節領域は、少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現（例えば、遺伝子転写および／または翻訳）の、操作されたゲノム調節領域を含まない同じ生物由来の同じＴ細胞型における少なくとも１つの遺伝子の転写および／または翻訳と比較した低減によって測定して、少なくとも１つの遺伝子に対するエンハンサー活性を減少させることができる。遺伝子発現の調整は経時的に査定することができる。調整とは、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、５５０％、６００％、６５０％、７００％、７５０％、８００％、８５０％、９００％、９５０％、１０００％、またはそれを超える、または境界値を含むその間の任意の範囲（例えば、５％〜１００％）の変化を意味しうる。

本明細書に記述されるバイオマーカーは、任意の個別のかかるバイオマーカーまたはそれらの組合せに関して本明細書に記述される特色の任意の組合せを指すように使用されうることに留意されたい。例えば、本発明のバイオマーカー分子を記述するために、生物間のオルソログ、配列組成、同一性百分率、配列長、ドメイン構造、機能的活性、変異状態などの任意の組合せが使用されうる。

「遮断」抗体または抗体「アンタゴニスト」とは、それが結合する抗原の少なくとも１種の生物学的活性を阻害または低減するものである。ある特定の実施形態では、本明細書に記述される遮断抗体またはアンタゴニスト抗体またはそれらの断片は、抗原の所与の生物学的活性を実質的にまたは完全に阻害する。

「体液」という用語は、身体から排泄または分泌される流体のほか、通常は身体から排泄または分泌されない流体（例えば、羊水、房水、胆汁、血液および血漿、脳脊髄液、耳垢および耳滓、カウパー液または尿道球腺液、乳糜、粥状液、便、膣液（ｆｅｍａｌｅｅｊａｃｕｌａｔｅ）、間質液、細胞内液、リンパ液、月経液、母乳、粘液、胸水、膿汁、唾液、皮脂、精液、血清、汗、滑液、涙、尿、膣潤滑液、硝子体液、および嘔吐物）を指す。ある特定の実施形態では、Ｔリンパ球およびその亜集団などのリンパ球を含む体液が使用される。

「二重特異性抗体」または「多特異性抗体」という用語は、１つより多くのエピトープを認識した抗体を指す。このような抗体は、同じ薬剤を使用して異なるタンパク質をターゲティングするのに有用である。このような抗体の作製方法は、当技術分野で周知である（少なくとも、米国特許第５，７９８，２２９号；米国特許第５，９８９，８３０号；およびHolligerら（２００５年）、Nat. Biotech.、２３巻：１１２６〜１１３６頁を参照されたい）。

「がん」または「腫瘍」または「過剰増殖障害」という用語は、無制御の増殖、不死性、転移能、急速な増殖および増殖速度、ならびにある特定の特徴的な形態学的特色などの、発がん性細胞に典型的な特徴を保有する細胞の存在を指す。がん細胞は腫瘍の形態であることが多いが、このような細胞は動物内に単独で存在する場合もあれば、白血病細胞などの非腫瘍形成性がん細胞である場合もある。「がん」という用語は、悪性がんだけでなく前悪性がんも含む。本明細書に記述される「前悪性病変」という用語は、がん性ではないが、がん性になる潜在性を有する病変を指す。これには、「前悪性障害」または「潜在的に悪性の障害」という用語も含まれる。特にこれは、悪性形質転換のリスクが通常より高い良性の形態学的かつ／または組織学的に変化した組織、ならびに、局所的な組織の臨床的外見を必ずしも変化させるとは限らないが、その組織における前がん性病変またはがんの発生の通常より高いリスクに関連する疾患または患者の習慣（白板症、紅板症、紅白板症（ｅｒｙｔｒｏｌｅｕｋｏｐｌａｋｉａ）扁平苔癬（苔癬反応））、および組織学的検査が細胞の非定型性もしくは異形成を示した任意の病変またはエリアを指す。

がんとしては、Ｂ細胞がん、例えば、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、例えば、アルファ鎖病、ガンマ鎖病、およびミュー鎖病などの重鎖病、良性モノクローナル高ガンマグロブリン血症、および免疫細胞アミロイドーシス、黒色腫、乳がん、肺がん、気管支がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵がん、胃がん、卵巣がん、膀胱がん、脳または中枢神経系のがん、末梢神経系がん、食道がん、子宮頸がん、子宮がんまたは子宮内膜がん、口腔または咽頭のがん、肝がん、腎がん、精巣がん、胆道がん、小腸がんまたは虫垂がん、唾液腺がん、甲状腺がん、副腎がん、骨肉腫、軟骨肉腫、血液組織のがんなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明により包含される方法に適用可能ながん型の他の非限定的な例としては、ヒト肉腫および癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、結腸直腸がん、膵がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、肝がん、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、骨がん、脳腫瘍、精巣がん、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫；白血病、例えば、急性リンパ性白血病および急性骨髄性白血病（骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病および赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病）；ならびに真性多血症、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、および重鎖病が挙げられる。一部の実施形態では、がんは本質的に上皮性であり、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、婦人科がん、腎臓がん、喉頭がん、肺がん、口腔がん、頭頸部がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、または皮膚がんを含むが、これらに限定されない。他の実施形態では、がんは、乳がん、前立腺がん、肺がん、または結腸がんである。さらに他の実施形態では、上皮がんは、非小細胞肺がん、非乳頭状腎細胞癌、子宮頸癌、卵巣癌（例えば、漿液性卵巣癌）、または乳癌である。上皮がんは、漿液性、類内膜性、粘液性、明細胞、ブレンナー、または未分化を含むがこれらに限定されない、様々な他の方法で特徴付けられうる。

「コード領域」という用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指し、一方、「非コード領域」という用語は、アミノ酸に翻訳されないヌクレオチド配列の領域（例えば、５’および３’の非翻訳領域）を指す。

「相補的」という用語は、２つの核酸鎖の領域間、または同じ核酸鎖の２つの領域間の、配列相補性の広範な概念を指す。第１の核酸領域のアデニン残基は、第２の核酸領域の残基がチミンまたはウラシルであれば、第１の領域と逆平行である第２の核酸領域の残基と特異的な水素結合（「塩基対合」）を形成する能力をもつことが公知である。同様に、第１の核酸鎖のシトシン残基は、第２の核酸鎖の残基がグアニンであれば、第１の鎖と逆平行である第２の核酸鎖の残基と塩基対合する能力をもつことが公知である。２つの領域が逆平行に配されているとき、第１の領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基に第２の領域の残基と塩基対合する能力があれば、核酸の第１の領域は、同じまたは異なる核酸の第２の領域と相補的である。第１の領域は第１の部分を含み、第２の領域は第２の部分を含み、それにより、第１および第２の部分が逆平行に配されているとき、第１の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％に、第２の部分内のヌクレオチド残基と塩基対合する能力があることが好ましい。より好ましくは、第１の部分の全てのヌクレオチド残基は、第２の部分内のヌクレオチド残基と塩基対合する能力をもつ。

「対照」という用語は、試験試料中の調節性産物および／または発現産物との比較を提供するために好適な任意の参照基準を指す。効率のため、発現産物について記述するが、この記述は、発現産物を調節するエレメントに等しく適用される。一実施形態では、対照は、発現産物レベルが検出され、試験試料の発現産物レベルと比較される、「対照試料」を得ることを含む。このような対照試料は、転帰が既知である対照の免疫障害患者からの試料（保管された試料でも過去の試料測定値でもよい）；正常な患者もしくは免疫障害患者などの対象から単離された正常組織もしくは細胞、正常な患者もしくは免疫障害患者などの対象から単離された初代培養細胞／組織、免疫障害患者の同じ臓器もしくは身体における位置から得られた隣接する正常細胞／組織、正常な対象から単離された組織もしくは細胞試料、または保管所から得られた初代細胞／組織を含むがこれらに限定されない、任意の好適な試料を含みうる。別の好ましい実施形態では、対照は、ハウスキーピング遺伝子を含むがこれに限定されない任意の好適な源からの参照基準の発現産物レベル、正常な組織（または他の過去に分析された対照試料）からの発現産物レベル範囲、ある特定の転帰（例えば、１年、２年、３年、４年にわたる生存期間など）を有するかもしくはある特定の処置（例えば、標準ケア免疫障害療法）を受けている患者群または一組の患者からの試験試料における過去に決定された発現産物レベル範囲を含みうる。このような対照試料および参照基準の発現産物レベルが本発明の方法において対照として組み合わせて使用されうることは、当業者には理解されよう。一実施形態では、対照は、正常な、または非免疫障害の細胞／組織試料を含みうる。別の好ましい実施形態では、対照は、一組の患者、例えば一組の免疫障害患者、またはある特定の処置を受けている一組の免疫障害患者、または別の転帰に対して１種の転帰を有する一組の患者に関する発現レベルを含みうる。前者の場合では、各患者の特異的発現産物レベルは、パーセンタイルの発現レベルに割り当てられるか、または、参照基準発現レベルの平均（ｍｅａｎまたはａｖｅｒａｇｅ）より高いものまたは低いもののいずれかとして表されうる。別の好ましい実施形態では、対照は、正常細胞、併用化学療法で処置された患者の細胞、および目的の処置に応答した免疫障害を有する患者の細胞を含みうる。別の実施形態では、対照は、ある集団における特定の遺伝子の発現の測定値、例えば平均レベルを、同じ集団におけるハウスキーピング遺伝子の発現レベルと比較したものを含む場合もある。このような集団は、正常な対象、いかなる処置も受けたことのない（すなわち、処置ナイーブの）免疫障害患者、標準ケア療法を受けている免疫障害患者、または目的の処置に応答した免疫障害を有する患者を含みうる。別の好ましい実施形態では、対照は、試験試料中の２つの細胞型および／または遺伝子の発現産物レベルの比を決定し、参照基準中の同じ２つの細胞型および／または遺伝子の任意の好適な比と比較すること；試験試料中の２つまたはそれよりも多くの細胞型および／または遺伝子の発現産物レベルを決定し、任意の好適な対照における発現産物レベル間の差違を決定すること；ならびに、試験試料中の２つまたはそれよりも多くの細胞型および／または遺伝子の発現産物レベルを決定し、それらの発現を、試験試料中のハウスキーピング細胞型および／または遺伝子の発現に対して正規化し、任意の好適な対照と比較することを含むがこれらに限定されない、発現産物レベルの比の変換を含む。特に好ましい実施形態では、対照は、試験試料と同じ系列および／または種類である対照試料を含む。別の実施形態では、対照は、免疫障害を有する全ての患者といった一組の患者の試料における、またはそれに基づく、パーセンタイルとしてグループ分けされた発現産物レベルを含みうる。一実施形態では、対照発現産物レベルが確立され、ここで、例えば特定のパーセンタイルに対してより高いかまたはより低い発現産物のレベルが、転帰を予測するための基礎として使用される。別の好ましい実施形態では、転帰が既知である免疫障害対照患者からの発現産物レベルを使用して対照発現産物レベルが確立され、試験試料からの発現産物レベルが、転帰を予測するための基礎としての対照発現産物レベルと比較される。以下のデータにより明示されるように、本発明の方法は、試験試料中の発現産物のレベルを対照と比較するにあたって、特定のカットポイントの使用に限定されない。

バイオマーカー核酸の「コピー数」とは、細胞（例えば、生殖系列細胞および／または体細胞）における特定の遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列の数を指す。一般に、所与の遺伝子に関して、哺乳動物は各遺伝子の２つのコピーを有する。しかしながら、コピー数は、遺伝子増幅または複写によって増加することもあれば、欠失によって低減することもある。例えば、生殖系列コピー数変化は、１つまたは複数のゲノム遺伝子座における変化で、前記１つまたは複数のゲノム遺伝子座が、対照における生殖系列コピーの正常な補体のコピー数（例えば、特定の生殖系列ＤＮＡおよび対応するコピー数が決定されたものと同じ種の生殖系列ＤＮＡにおける正常なコピー数）によって構成されていないものを含む。体細胞コピー数変化は、１つまたは複数のゲノム遺伝子座における変化で、前記１つまたは複数のゲノム遺伝子座が、対照の生殖系列ＤＮＡにおけるコピー数（例えば、体細胞ＤＮＡおよび対応するコピー数が決定されたものと同じ対象の生殖系列ＤＮＡにおけるコピー数）によって構成されていないものを含む。

バイオマーカー核酸の「正常な」コピー数（例えば、生殖系列および／または体細胞）またはバイオマーカー核酸もしくはタンパク質の「正常な」発現レベルとは、免疫障害に罹患していない対象、例えばヒトに由来するか、または、免疫障害を有する同じ対象の対応する非免疫障害組織に由来する、生体試料、例えば、組織、全血、血清、血漿、口腔掻爬物（ｂｕｃｃａｌｓｃｒａｐｅ）、唾液、脳脊髄液、尿、便、および骨髄を含有する試料における、活性／発現レベルまたはコピー数である。

「対象に好適な処置レジメンを決定する」という用語は、本発明による分析の結果に基づいて、またはそれに本質的に基づいて、またはそれに少なくとも部分的に基づいて、開始、修正、および／または終了される、対象のための処置レジメン（すなわち、対象の免疫障害の防止および／もしくは処置のために使用される単一の療法または異なる療法の組合せ）の決定を意味するものとする。一例は、Ｔ細胞疲弊を防止するもしくは逆転させるため、および／または免疫障害を処置するために、操作T細胞を提供するかどうかを決定することである。この決定は、本発明による分析の結果に加えて、例えば、初期および／または投与時の操作T細胞集団において遺伝子発現または活性がいかに調整されているかに基づいて、処置される対象の個人的特徴に基づいてもよい。ほとんどの場合において、対象に好適な処置レジメンの実際の決定は、担当医または医師によって行われる。

「発現シグネチャー」または「シグネチャー」という用語は、２つまたはそれよりも多くの協調的に発現されたバイオマーカーの群を指す。例えば、このシグネチャーを構成する遺伝子、タンパク質などは、特異的な細胞系列、分化段階、または特定の生物学的応答中に発現される場合がある。バイオマーカーは、それらが発現される細胞型の生物学的態様を反映しうる。発現データおよび遺伝子発現レベルは、コンピュータ可読媒体、例えば、マイクロアレイまたはチップ読み取りデバイスと併せて使用されるコンピュータ可読媒体に格納することができる。このような発現データを操作して、発現シグネチャーを生成することができる。

分子または細胞は、かなりの割合の分子または細胞が基質から解離することなく基質を流体（例えば、標準的なクエン酸食塩水、ｐＨ７．４）で濯ぐことができるように、それが基質と共有結合または非共有結合で会合している場合に、基質に「固定」または「付着」している。

本明細書で使用される、細胞バイオマーカーの発現に関連した「高」、「低」、「中等度」、および「陰性」という用語は、１つまたは複数の参照細胞によるバイオマーカーの細胞発現に対する、発現されるバイオマーカーの量を指す。バイオマーカーの発現は、限定されないが、１つまたは複数のバイオマーカーゲノム核酸、リボ核酸、および／またはポリペプチドの、細胞レベル、活性、構造などの分析を含む、本明細書に記述される任意の方法に従って決定することができる。一実施形態では、これらの用語は、バイオマーカーを、それぞれ、最も高いレベル、中等度のレベル、または最も低いレベルで発現する細胞集団の、規定の百分率を指す。このような百分率は、バイオマーカーを高発現あるいは弱発現する細胞集団の上位０．１％、０．５％、１．０％、１．５％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、またはそれよりも多く、または境界値を含むその間の任意の範囲として定義することができる。バイオマーカーを検出可能なほど発現しない細胞は、バイオマーカー発現が「陰性」であるため、「低」という用語は、このような細胞を除外する。「中等度」という用語は、バイオマーカーを発現するが、それを「高」レベルで発現する集団よりも低いレベルで発現する細胞を含む。別の実施形態では、これらの用語は、定性的または統計的なプロット領域により特定されるバイオマーカー発現の細胞集団も指す場合もあれば、これを代替的に指す場合もある。例えば、フローサイトメトリーを使用して分取された細胞集団は、当技術分野で周知の方法に従い、検出可能な部分の分析に基づいて、例えば平均蛍光強度などに基づいて、明確なプロットを特定することにより、バイオマーカー発現レベルを基礎として判別することができる。このようなプロット領域は、目的のバイオマーカーに関して、当技術分野で周知の方法に基づき、数、形状、重複などによって精密化することができる。さらに別の実施形態では、これらの用語は、さらなるバイオマーカーの発現の存在または非存在によって決定される場合もある。

「相同性」という用語は、同じ核酸鎖の２つの領域間、または２つの異なる核酸鎖の領域間の、ヌクレオチド配列類似性を指す。両方の領域内のヌクレオチド残基位置が同じヌクレオチド残基で占有されている場合、これらの領域はその位置において相同である。各領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基位置が同じ残基で占有されていれば、第１の領域は第２の領域と相同である。２つの領域間の相同性は、２つの領域のうち同じヌクレオチド残基で占有されているヌクレオチド残基位置の割合という観点で表される。例として、ヌクレオチド配列５’−ＡＴＴＧＣＣ−３’を有する領域およびヌクレオチド配列５’−ＴＡＴＧＧＣ−３’を有する領域は、５０％の相同性を共有する。第１の領域は第１の部分を含み、第２の領域は第２の部分を含み、それにより、それぞれの部分のヌクレオチド残基位置の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％が同じヌクレオチド残基で占有されていることが好ましい。より好ましくは、それぞれの部分の全てのヌクレオチド残基位置が同じヌクレオチド残基で占有されている。

本明細書で使用される「免疫チェックポイント」という用語は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞表面における分子群を意味する。これらの分子は、抗腫瘍免疫応答を下方調整または阻害することにより、免疫応答を微調整する。免疫チェックポイントタンパク質は当技術分野で周知であり、限定されないが、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ−Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−３、ＴＩＭ−４、ＬＡＧ−３、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰアルファ（ＣＤ４７）、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ−２、ＩＬＴ−４、ＴＩＧＩＴ、およびＡ２ａＲを含む（例えば、ＷＯ２０１２／１７７６２４を参照されたい）。本発明の方法で有用な免疫チェックポイント阻害剤として機能しうる免疫療法剤としては、当技術分野で周知のある特定のクラスの抗体など、エフェクター機能を有するＦｃ融合タンパク質が挙げられるが、これに限定されない。

「抗免疫チェックポイント療法」という用語は、免疫チェックポイント核酸および／またはタンパク質を阻害する薬剤の使用を指す。１つまたは複数の免疫チェックポイントの阻害は、阻害シグナル伝達を遮断または別様に中和して、免疫調整を促進することができる。免疫チェックポイントを阻害するのに有用である例示的な薬剤としては、免疫チェックポイントタンパク質またはその断片に結合し、かつ／またはそれを不活性化もしくは阻害することのできる、抗体、小分子、ペプチド、ペプチド模倣薬、天然リガンド、および天然リガンドの誘導体のほか、免疫チェックポイント核酸またはその断片の発現および／もしくは活性を下方制御することのできる、ＲＮＡ干渉、アンチセンス、核酸アプタマーなどが挙げられる。免疫応答を上方制御するための例示的な薬剤としては、タンパク質およびその天然の受容体の間の相互作用を遮断する１つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質に対する抗体；１つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質の非活性化形態（例えば、ドミナントネガティブなポリペプチド）；１つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質とその天然の受容体との間の相互作用を遮断する小分子またはペプチド；天然の受容体に結合する融合タンパク質（例えば、抗体または免疫グロブリンのＦｃ部分に融合した免疫チェックポイント阻害タンパク質の細胞外部分）；免疫チェックポイント核酸の転写または翻訳を遮断する核酸分子などが挙げられる。このような薬剤は、１つまたは複数の免疫チェックポイントとその天然の受容体（例えば、抗体）との間の相互作用を直接的に遮断して、阻害シグナル伝達を防止し、免疫応答を上方制御することができる。代替的に、薬剤は、１つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質とその天然の受容体との間の相互作用を間接的に遮断して、阻害シグナル伝達を防止し、免疫応答を上方制御してもよい。例えば、安定化した細胞外ドメインなどの免疫チェックポイントタンパク質リガンドの可溶性バージョンは、その受容体に結合して、適切なリガンドに結合する受容体の有効濃度を間接的に低減することができる。一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、および／または抗ＰＤ−Ｌ２抗体は、単独にしても組合せにしても、免疫チェックポイントを阻害するために使用される。これらの実施形態は、ＰＤ−１経路などの特定の免疫チェックポイントに対する特異的療法（例えば、抗ＰＤ−１経路療法、ないしはＰＤ−１経路阻害剤療法としても公知）にも適用可能である。

「ＰＤ−１」とは、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２を公知のリガンドとして有する共阻害性受容体として機能する免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーを指す免疫チェックポイント阻害剤である。ＰＤ−１は過去に、アポトーシス細胞死に関与するタンパク質を選択するための減算クローニングに基づく手法を使用して特定された。ＰＤ−１は、ＰＤ−Ｌ１に結合するその能力に基づき、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４ファミリー分子のメンバーである。ＣＴＬＡ−４のように、ＰＤ−１は、抗ＣＤ３に応答してＴ細胞の表面で急速に誘導される（Agataら、２５（１９９６年）、Int. Immunol.、８巻：７６５頁）。しかしながら、ＣＴＬＡ−４とは対照的に、ＰＤ−１は、Ｂ細胞の表面でも（抗ＩｇＭに応答して）誘導される。ＰＤ−１はまた、胸腺細胞および骨髄系細胞のサブセットでも発現される（Agataら（１９９６年）上記；Nishimuraら（１９９６年）、Int. Immunol.、８巻：７７３頁）。

代表的なヒトＰＤ−１バイオマーカーの核酸およびアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースのＮＭ＿００５０１８．２およびＮＰ＿００５００９．２において公に利用可能である（Ishidaら（１９９２年）、20 EMBO J、１１巻：３８８７頁；Shinoharaら（１９９４年）、Genomics、２３巻：７０４頁；米国特許第５，６９８，５２０号も参照されたい）。ＰＤ−１は、免疫グロブリンスーパーファミリードメインと、膜貫通ドメインと、免疫受容体チロシンベース阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む細胞内領域とを含有する、細胞外領域を有する（Ishidaら（１９９２年）、EMBO J.、１１巻：３８８７頁；Shinoharaら（１９９４年）、Genomics、２３巻：７０４頁；および米国特許第５，６９８，５２０号）。これらの特色は、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ−Ｂ、およびキラー阻害性受容体（ＫＩＲ）も含む、免疫阻害性受容体と呼ばれるより大きなポリペプチドファミリーも定義する（VivierおよびDaeron（１９９７年）、Immunol. Today、１８巻：２８６頁）。多くの場合、これらの受容体のチロシルリン酸化ＩＴＩＭモチーフは、ＳＨ２−ドメイン含有ホスファターゼと相互作用し、阻害シグナルをもたらすと仮定される。これらの免疫阻害性受容体のサブセットは、ＭＨＣポリペプチド、例えばＫＩＲに結合し、ＣＴＬＡ４は、Ｂ７−１およびＢ７−２に結合する。ＭＨＣ遺伝子とＢ７遺伝子との間には系統的な関係があると提唱されている（Henryら（１９９９年）、Immunol. Today、２０巻（６号）：２８５〜８頁）。ヒト以外の生物におけるＰＤ−１オルソログの核酸およびポリペプチド配列は周知であり、例えば、マウスＰＤ−１（ＮＭ＿００８７９８．２およびＮＰ＿０３２８２４．１）、ラットＰＤ−１（ＮＭ＿００１１０６９２７．１およびＮＰ＿００１１００３９７．１）、イヌＰＤ−１（ＸＭ＿５４３３３８．３およびＸＰ＿５４３３３８．３）、ウシＰＤ−１（ＮＭ＿００１０８３５０６．１およびＮＰ＿００１０７６９７５．１）、およびニワトリＰＤ−１（ＸＭ＿４２２７２３．３およびＸＰ＿４２２７２３．２）を含む。

ＰＤ−１ポリペプチドとは、阻害シグナルを免疫細胞に伝達することにより免疫細胞エフェクター機能を阻害する能力、または例えば可溶性の単量体形態で存在する場合に免疫細胞の共刺激を（例えば、競合阻害により）促進する能力をもつ阻害性受容体である。好ましいＰＤ−１ファミリーメンバーは、ＰＤ−１と配列同一性を共有し、１つまたは複数のＢ７ファミリーメンバー、例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＰＤ−１リガンド、および／または抗原提示細胞上の他のポリペプチドに結合する。

「ＰＤ−１活性」という用語は、ＰＤ−１ポリペプチドが、例えば、抗原提示細胞上の天然ＰＤ−１リガンドとかみ合うことにより、活性化された免疫細胞において阻害シグナルを調整する能力を含む。ＰＤ−１は、ＣＴＬＡ４と同様の方式で阻害シグナルを免疫細胞に伝達する。免疫細胞における阻害シグナルの調整は、免疫細胞の増殖および／または免疫細胞によるサイトカイン分泌の調整をもたらす。したがって、「ＰＤ−１活性」という用語は、ＰＤ−１ポリペプチドがその天然のリガンドに結合する能力、免疫細胞の共刺激シグナルまたは阻害シグナルを調整する能力、および免疫応答を調整する能力を含む。ＰＤ−１活性を調整する薬剤は、当技術分野で周知である。代表的な例としては、限定されないが、ＭＤＸ−１１０６、Ｍｅｒｃｋ３４７５、およびＣＴ−０１１などの抗体が挙げられる。ＭＤＸ−１１０６は、ＭＤＸ−１１０６−０４、ＯＮＯ−４５３８、またはＢＭＳ−９３６５５８としても公知であり、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００６／１２１１６８および米国特許第８，００８８，４４９号に記述されている完全ヒトＩｇＧ４抗ＰＤ−１モノクローナル抗体である。Ｍｅｒｃｋ３４７５は、ＳＣＨ−９００４７５およびペンブロリズマブとしても公知であり、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００９／１１４３３５；米国特許第８，３５４，５０９号；およびHamidら（２０１３年）、New Engl. J. Med.、３６９巻：１３４〜１４４頁に記述されているヒト化ＩｇＧ４抗ＰＤ−１モノクローナル抗体である。ピディリズマブ（ＣＴ−０１１；ＣｕｒｅＴｅｃｈ）は、ＰＤ−１に結合するヒト化ＩｇＧｌモノクローナル抗体である。ピディリズマブおよび他のヒト化抗ＰＤ−１モノクローナル抗体は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００９／１０１６１１に開示されている。同様に、ＡＭＰ−２２４（Ｂ７−ＤＣＩｇ；Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ）は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用を遮断するＰＤ−Ｌ２Ｆｃ融合可溶性受容体であり、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１０／０２７８２７およびＷＯ２０１１／０６６３４２に開示されている。さらに、多くの他の抗ＰＤ−１Ｆｃ融合タンパク質が、米国特許第８，６０９，０８９号、米国特許公開第２０１０／０２８３３０号、米国特許公開第２０１２−０１１４６４９号、およびＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１４／０８９１１３に記述されているように、当技術分野で公知である。

「ＰＤ−１リガンド」という用語は、ＰＤ−１受容体の結合パートナーを指し、ＰＤ−Ｌ１（Freemanら（２０００年）、J. Exp. Med.、１９２巻：１０２７頁）およびＰＤ−Ｌ２（Latchmanら（２００１年）、Nat. Immunol.、２巻：２６１頁）の両方を含む。少なくとも２種類のヒトＰＤ−１リガンドポリペプチドが存在する。ＰＤ−１リガンドタンパク質は、シグナル配列、ならびにＩｇＶドメイン、ＩｇＣドメイン、膜貫通ドメイン、および短い細胞質側尾部を含む。ＰＤ−Ｌ１（配列データはFreemanら（２０００年）、J. Exp. Med.、１９２巻：１０２７頁を参照されたい）およびＰＤ−Ｌ２（配列データはLatchmanら（２００１年）、Nat. Immunol.、２巻：２６１頁を参照されたい）はいずれも、Ｂ７ポリペプチドファミリーのメンバーである。ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２はいずれも、胎盤、脾臓、リンパ節、胸腺、および心臓において発現される。膵臓、肺、および肝臓ではＰＤ−Ｌ２のみが発現され、一方で胎児肝ではＰＤ−Ｌ１のみが発現される。活性化された単球および樹状細胞では両方のＰＤ−１リガンドが上方制御されるが、ＰＤ−Ｌ１発現の方がより広範である。例えば、ＰＤ−Ｌ２は、ＤＣ、マクロファージ、および骨髄由来マスト細胞で誘導的に発現されるが、ＰＤ−Ｌ１は、マウスの造血細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、および骨髄由来マスト細胞）および非造血細胞（例えば、内皮細胞、上皮細胞、および筋細胞）で構成的に発現され、より高いレベルまで上方制御されることが公知である（Butteら（２００７年）、Immunity、２７巻：１１１号を参照されたい）。

ＰＤ−１リガンドは、ある特定の保存された構造的および機能的な特色を有するポリペプチドファミリーを含む。タンパク質または核酸分子を指すために使用される場合の「ファミリー」という用語は、本明細書で定義されるように、共通の構造的ドメインまたはモチーフを有し、十分なアミノ酸またはヌクレオチド配列相同性を有する、２つまたはそれよりも多くのタンパク質または核酸分子を意味するよう意図される。このようなファミリーメンバーは、天然に存在する場合も天然に存在しない場合もあり、同じ種に由来する場合も異なる種に由来する場合もある。例えば、ファミリーは、ヒト起源の第１のタンパク質ならびにヒト起源の他の明確なタンパク質を含有する場合もあれば、代替的に、非ヒト起源の相同体を含有する場合もある。ファミリーのメンバーはまた、共通の機能的特徴を有する場合もある。ＰＤ−１リガンドは、Ｂ７ポリペプチドファミリーのメンバーである。本明細書で使用される「Ｂ７ファミリー」または「Ｂ７ポリペプチド」という用語は、Ｂ７ポリペプチドとの、例えば、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ６、Ｂ７ｈ（Swallowら（１９９９年）、Immunity、１１巻：４２３頁）、および／またはＰＤ−１リガンド（例えば、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２）との配列相同性を共有する、共刺激性ポリペプチドを含む。例えば、ヒトＢ７−１およびＢ７−２は、デフォルトパラメータ（ギャップペナルティを存在（ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ）１１および伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）１に設定したＢｌｏｓｕｍ６２マトリックス（ＮＣＢＩのウェブサイトを参照されたい））を用い、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴプログラムを使用して比較したときにおよそ２６％のアミノ酸配列同一性を共有する。Ｂ７ファミリーという用語はまた、免疫細胞機能を調整する能力をもつ、これらのポリペプチドの変異形も含む。Ｂ７ファミリーの分子は、シグナルドメイン、ＩｇＶドメイン、およびＩｇＣドメインを含む、いくつかの保存された領域を共有する。ＩｇＶドメインおよびＩｇＣドメインは、当技術分野で認識されているＩｇスーパーファミリーメンバードメインである。これらのドメインは、Ｉｇフォールドと呼ばれる明確なフォールディングパターンを有する構造単位に対応する。Ｉｇフォールドは、それぞれが５〜１０アミノ酸の逆平行β鎖からなる２つのβシートのサンドイッチ構造から構成され、全てではないが大部分において２つのシート間には保存されたジスルフィド結合がある。Ｉｇ、ＴＣＲ、およびＭＨＣ分子のＩｇＣドメインは同じ種類の配列パターンを共有し、ＩｇスーパーファミリーにおいてＣ１セットと呼ばれている。他のＩｇＣドメインは、他のセットに含まれる。ＩｇＶドメインも配列パターンを共有し、Ｖセットドメインと呼ばれる。ＩｇＶドメインはＩｇＣドメインよりも長く、β鎖のさらなる対を含有する。

「免疫障害」という用語は、不要な免疫応答によって特徴付けられる状態を指す。一部の実施形態では、免疫障害は、所望の抗免疫障害応答が免疫応答を抑制するようなものである。本明細書にさらに記述されるように、こうした免疫応答の下方制御が所望される状態は当技術分野で周知であり、限定されないが、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、炎症、または自己免疫疾患、例えば全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、アレルギー、過敏性応答、ワクチン接種効率の改善が要求される障害、および調節性Ｔ細胞の産生または機能の増加が要求される障害における、組織、皮膚、および臓器移植の状況を含む。他の実施形態では、免疫障害は、所望の応答が、免疫応答の増加であるようなものである。こうした免疫応答の上方制御が所望される状態は当技術分野で周知であり、限定されないが、がん、感染（例えば、寄生虫感染、細菌感染、蠕虫感染、またはウイルス感染）などへの対抗といった、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の産生または機能の増加が要求される障害を含む。

「急性免疫障害」という用語は、がん、またはウイルス、細菌、寄生虫、マイコプラズマ、真菌などのような感染作用因子など、標的の抗原およびこのような標的の抗原を含む宿主を根絶する、適切な免疫応答によって解決されうる状態を指す。このような状態は比較的短期であり、数日から数週間ほど持続する。

対照的に、「慢性免疫障害」という用語は、宿主免疫応答の誘導により効果的に除去または排除されない状態を指す。慢性免疫障害では、感染作用因子またはがん細胞などの標的の抗原（および／または標的の抗原を含む宿主）および免疫応答が平衡に達し、その結果、対象は、症状の発現を必ずしも伴わずに、長期間（すなわち、数か月から数年の期間またはさらには一生涯）にわたり、標的の抗原または標的の抗原を含む宿主を維持する（例えば、感染状態またはがんに罹患した状態のままである）。慢性免疫障害は、宿主細胞の急速な殺傷またはさらには宿主細胞に過剰な損傷をもたらすことなく標的の抗原が維持される、無症状段階および増殖性段階の両方を伴いうる。標的の抗原または標的の抗原を含む宿主の検出は、当技術分野で周知であり、例えば米国特許第６，３６８，８３２号、同第６，５７９，８５４号、および同第６，８０８，７１０号、ならびに米国特許出願公開第２００４０１３７５７７号、同第２００３０２３２３２３号、同第２００３０１６６５３１号、同第２００３００６４３８０号、同第２００３００４４７６８号、同第２００３００３９６５３号、同第２００２０１６４６００号、同第２００２０１６００００号、同第２００２０１１０８３６号、同第２００２０１０７３６３号、および同第２００２０１０６７号に記述されている、多くの方法のうちの任意の１つに従って行うことができる。一部の実施形態では、慢性免疫障害は、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｔ細胞白血病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、麻疹、パポーバウイルス、プリオン、肝炎ウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、パピローマウイルス、プリオンなどを含むがこれらに限定されない、ウイルスへの感染などの感染の結果である。慢性免疫障害は、例えば、慢性状態および潜伏状態を含む。本明細書で使用される場合、慢性免疫障害は、慢性状態、潜伏状態、またはそれらの両方に限定されることがある。

「慢性状態」では、標的の抗原は、長期間であっても、疾患の徴候および症状が存在するか存在しないかにかかわらず、常に対象において検出されうる。感染から生じる慢性状態の非限定的な例としては、Ｂ型肝炎（Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）により生じる）およびＣ型肝炎（Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）により生じる）、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、単純ヘルペスウイルス１、単純ヘルペスウイルス２、ヒトヘルペスウイルス６、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオーマウイルスＢＫ、ポリオーマウイルスＪＣ、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ、およびヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩが挙げられる。寄生虫による持続感染は、例えば、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、ＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａおよびＥｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎによる感染の結果として生じうる。

感染を伴う慢性状態の特定の種類は、感染作用因子（例えばウイルス）が見たところ不活性で休眠状態であり、そのため対象が徴候または症状を常に呈するわけでない、「潜伏状態」として公知である。潜伏ウイルス感染において、ウイルスは、症状が再び現れるまで長期間にわたって宿主との平衡状態を保つ：しかしながら、疾患の再活性化が起こるまで実際のウイルスを検出することができないのが典型的である。感染の潜伏とは、ウイルスなどの病原性感染作用因子が細胞内で休眠状態のままでいる能力である。例えば、潜伏ウイルス感染は、ある特定のウイルスの生活環において初期感染後にウイルスの産生が終わる期間である。しかしながら、ウイルスゲノムは完全に根絶されるわけではない。この結果、宿主が新たなウイルスに感染することなく、ウイルスが再活性化し、多量のウイルス子孫を産生し始めることができる（ウイルスの生活環の溶解部分）。ウイルスは宿主の中に無期限に留まりうる。一実施形態では、ウイルス潜伏は、ウイルスがインキュベーション期間中であるが休眠状態ではない、臨床的潜伏と同一ではない。潜伏感染の非限定的な例としては、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）−１により生じる感染（単純疱疹（ｆｅｖｅｒｂｌｉｓｔｅｒｓ））、ＨＳＶ−２により生じる感染（性器ヘルペス）、および水痘帯状疱疹ウイルスＶＺＶにより生じる感染（水痘−帯状疱疹）が挙げられる。

本明細書で使用される「免疫療法剤」という用語は、宿主免疫系を刺激して対象の免疫調整を促進することができる任意の分子、ペプチド、抗体、または他の薬剤を含みうる。様々な免疫療法剤が、本明細書に記述される組成物および方法において有用である。

「誘導性」プロモーターとは、遺伝子産物をコードまたは特定化するポリヌクレオチドに作動可能に連結すると、実質的に化学物質、調節エレメントなどの誘導因子が細胞内に存在するときにのみ遺伝子産物を生細胞内で産生させる、ヌクレオチド配列である。

「阻害する」という用語は、例えば特定の作用、機能、または相互作用の減少、限定、または遮断を含む。一部の実施形態では、免疫障害は、免疫障害の少なくとも１つの症状が軽減、終結、減速、または防止された場合に「阻害される」。本明細書で使用される場合、免疫障害は、免疫障害の再発または伝播が低減、減速、遅延、または防止された場合にも「阻害される」。

「相互作用」という用語は、２つの分子間の相互作用に言及する場合、分子の互いとの物理的接触（例えば、結合）を指す。一般に、このような相互作用は、前記分子の一方または両方の活性をもたらす（これにより生物学的効果が生じる）。

「単離された抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことを意図する。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まない場合がある。

「単離されたタンパク質」とは、細胞から単離された場合もしくは組換えＤＮＡ技術によって産生された場合は他のタンパク質、細胞物質、分離媒体、および培養培地を実質的に含まないタンパク質、または化学的に合成された場合は化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないタンパク質を指す。「単離された」もしくは「精製された」タンパク質またはその生物学的に活性な部分は、抗体、ポリペプチド、ペプチド、または融合タンパク質が由来する細胞または組織源からの細胞物質または他の混入タンパク質を実質的に含まないか、あるいは、化学的に合成された場合は化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」という表現には、バイオマーカーポリペプチドまたはその断片で、それが単離または組換え産生された細胞の細胞成分からタンパク質が分離しているものの調製物が含まれる。一実施形態では、「細胞物質を実質的に含まない」という表現には、約３０％未満（乾燥重量基準）の非バイオマーカータンパク質（本明細書では「混入タンパク質」とも称される）、より好ましくは約２０％未満の非バイオマーカータンパク質、さらにより好ましくは約１０％未満の非バイオマーカータンパク質、最も好ましくは約５％未満の非バイオマーカータンパク質を有する、バイオマーカータンパク質またはその断片の調製物が含まれる。抗体、ポリペプチド、ペプチド、もしくは融合タンパク質、またはそれらの断片、例えば、それらの生物学的に活性な断片が、組換え産生される場合、それが培養培地を実質的に含まないこと、すなわち、培養培地がタンパク質調製物の体積の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満に相当することも好ましい。

本明細書で使用される、「Ｋ_Ｄ」という用語は、特定の抗体−抗原間の相互作用の解離平衡定数を指すことを意図する。開示される本発明の抗体の結合親和性は、標準的な抗体−抗原アッセイ、例えば、競合アッセイ、飽和アッセイ、またはＥＬＩＳＡもしくはＲＩＡなどの標準的なイムノアッセイによって測定または決定されうる。

「キット」とは、本発明のマーカーの発現を特異的に検出し、かつ／または治療学的に影響を及ぼすための、少なくとも１つの試薬、例えば、治療薬、プローブ、小分子などを含む、あらゆる製造品（例えば、パッケージまたは容器）である。キットは、本発明の方法を行うためのユニットとして宣伝されても、配布されても、または販売されてもよい。キットは、本発明の方法において有用な組成物を発現させるために必要な１つまたは複数の試薬を含みうる。ある特定の実施形態では、キットは、参照基準、例えば、免疫学的応答、細胞の増殖、分裂、遊走、生存、またはアポトーシスを制御するシグナル伝達経路に影響したりこのシグナル伝達経路を調節したりしないタンパク質をコードする核酸をさらに含みうる。当業者には、一般的な分子タグ（例えば、緑色蛍光タンパク質およびベータ−ガラクトシダーゼ）、ＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙの参照により細胞の増殖、分裂、遊走、生存、もしくはアポトーシスをもたらす経路のいずれにも分類されていないタンパク質、または遍在するハウスキーピングタンパク質を含むがこれらに限定されない、このような多くの対照タンパク質が想起されうる。キット内の試薬は、個別の容器において用意されても、単一の容器内の２つまたはそれよりも多くの試薬の混合物として用意されてもよい。加えて、キット内の組成物の使用について記述する説明資料が含まれてもよい。

「ネオアジュバント療法」という用語は、一次処置の前に与えられる処置を指す。ネオアジュバント療法の例としては、化学療法、放射線療法、およびホルモン療法を挙げることができる。例えば、乳がんの処置において、ネオアジュバント療法は、大きな乳がんを有する患者が乳房温存手術を受けることを可能にしうる。

バイオマーカーの「正常な」発現レベルとは、ゲノム遺伝子の発現調節領域を調整するように操作されていない細胞および／または免疫障害に罹患していない対象の細胞などの対照と比較した、対象、例えばヒト患者の細胞など、関連性のある細胞におけるバイオマーカーの発現レベルである。バイオマーカーの「過剰発現」または「有意に高い発現レベル」とは、発現を査定するために用いられるアッセイの標準誤差よりも高く、対照試料（例えば、バイオマーカー関連疾患を有しない健康な対象由来の試料）中のバイオマーカーの発現活性またはレベル、好ましくは、いくつかの対照試料中のバイオマーカーの平均発現レベルと比べて、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０倍、またはそれよりも高い、試験試料中の発現レベルを指す。バイオマーカーの「有意に低い発現レベル」とは、対照試料（例えば、バイオマーカー関連疾患を有しない健康な対象由来の試料）中のバイオマーカーの発現レベル、好ましくは、いくつかの対照試料中のバイオマーカーの平均発現レベルと比べて、少なくとも１０％、より好ましくは１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０倍、またはそれよりも低い、試験試料中の発現レベルを指す。このような「有意な」レベルは、例えば発現、阻害、細胞傷害、細胞増殖、細胞比などに関して本明細書に記述される、任意の他の測定パラメータにも適用される場合がある。

「所定の」バイオマーカーの量および／または活性の測定値という用語は、単なる例であるが、特定の処置のために選択されうる対象を評価するため、処置に対する応答を評価するため、かつ／または疾患状態を評価するために使用される、バイオマーカーの量および／または活性の測定値でありうる。所定のバイオマーカーの量および／または活性の測定値は、免疫障害の有無にかかわらず、細胞集団または患者集団において決定されうる。所定のバイオマーカーの量および／または活性の測定値は、あらゆる患者に等しく適用可能な単一の数である場合もあれば、所定のバイオマーカーの量および／または活性の測定値は、患者の特定の亜集団によって異なる場合もある。対象の年齢、体重、身長、および他の要因が、個体の所定のバイオマーカーの量および／または活性の測定値に影響する場合がある。さらに、所定のバイオマーカーの量および／または活性は、各細胞、細胞株、対象などに関して個別に決定されうる。一実施形態では、本明細書に記述される方法において決定および／または比較される量は、絶対測定値に基づく。別の実施形態では、本明細書に記述される方法において決定および／または比較される量は、比（例えば、ハウスキーピングないしは概して一定のバイオマーカーの発現に対して正規化された血清バイオマーカー）などの相対的測定値に基づく。所定のバイオマーカーの量および／または活性の測定値は、任意の好適な標準でありうる。例えば、所定のバイオマーカーの量および／または活性の測定値は、患者選択が査定されているヒトと同じものから得られても、それと異なるものから得られてもよい。一実施形態では、所定のバイオマーカーの量および／または活性の測定値は、同じ患者の過去の査定から得られる場合がある。このようにして、患者の選択の進行を経時的にモニタリングすることができる。加えて、対照は、対象がヒトである場合、別のヒトまたは複数のヒト、例えば、ヒトの選択群の査定から得られてもよい。このようにして、選択が査定されているヒトの選択の程度を、好適な他のヒト、例えば、目的のヒトと同様の状況にある他のヒト、例えば同様または同じ状態を患っており、かつ／または同じ民族群のものと比較することができる。

「予測的」という用語は、療法の前、その間、またはその後の、バイオマーカー核酸、タンパク質、および／または調節の状況、例えば、遺伝子発現調節の活性過剰または活性低下、ならびに腫瘍の出現、発現、増殖、寛解、再発、または抵抗性を、Ｔ細胞疲弊の防止、Ｔ細胞疲弊の逆転、免疫障害の処置に対する応答、例えば抗免疫チェックポイント阻害剤処置などのさらなる抗免疫障害療法ありまたはなしの操作T細胞療法に対する応答の見込みを決定するために使用することを含む。このようなバイオマーカーの予測的使用は、例えば、（１）コピー数の増加または減少（例えば、ＦＩＳＨ、ＦＩＳＨおよびＳＫＹ、単一分子配列決定、例えば、当技術分野において少なくともJ. Biotechnol.、８６巻：２８９〜３０１頁に記述されているもの、またはｑＰＣＲによる）、バイオマーカー核酸の過剰発現または過小発現（例えば、ＩＳＨ、ノーザンブロット、またはｑＰＣＲによる）、バイオマーカータンパク質および／もしくはバイオマーカー代謝物の増加または減少（例えば、ＩＨＣによる）、あるいは活性の増加または減少（例えば、アッセイした関連性のあるヒト慢性免疫障害の種類または試料のうち約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％超、またはそれよりも多くにおいて、例えば、バイオマーカーの調整によって決定されたもの）；（２）慢性免疫障害に罹患した対象、例えばヒトに由来する、生体試料、例えば、組織、全血、血清、血漿、口腔掻爬物、唾液、脳脊髄液、尿、便、または骨髄を含有する試料中の、その絶対的な存在もしくは非存在またはその相対的な調整；（３）免疫障害を有する患者の臨床サブセット（例えば、療法に応答しているもの、または療法への抵抗性を生じているもの）における、その絶対的な存在もしくは非存在またはその相対的な調整により、確認されうる。

「防止する」、「防止すること」、「防止」、「予防的処置」などの用語は、疾患、障害、または状態を有しないが、それらを発症するリスクがあるか、またはそれらを発症しやすい対象において、疾患、障害、または状態を発症する確率を低減させることを指す。

「プローブ」という用語は、具体的に意図される標的分子、例えば、バイオマーカー核酸によってコードされるか、またはバイオマーカー核酸に対応する、ヌクレオチド転写物またはタンパク質に、選択的に結合する能力のある、あらゆる分子を指す。プローブは、当業者によって合成することも、または適切な生物学的調製物から得ることもできる。本明細書に記述されるように、標的分子を検出する目的で、プローブは、標識されるように具体的に設計されていてもよい。プローブとして利用することのできる分子の例としては、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体、および有機分子が挙げられるが、これらに限定されない。

「予後判定」という用語は、可能性の高い免疫障害の経過および転帰または疾患からの回復の見込みの予測を含む。一部の実施形態では、統計的アルゴリズムの使用により、個体の免疫障害の予後判定が行われる。例えば、予後判定は、手術、ある臨床的サブタイプの免疫障害（例えば、がんまたは慢性感染）の発症、１つまたは複数の臨床的因子の発生、または疾患からの回復でありうる。

「抵抗性」という用語は、抗免疫障害療法に対する免疫障害試料または哺乳動物の獲得抵抗性または自然抵抗性（すなわち、治療的処置に対して非応答性であること、または治療的処置に対する応答が低減または限定されていること）、例えば、治療的処置への応答が、２５％またはそれを超えて、例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、またはそれを超えて、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍まで、またはそれを超えて低減されていることを指す。応答の低減は、抵抗性が獲得される前の同じ免疫障害試料または哺乳動物と比較することにより測定しても、治療的処置に対する抵抗性を有しないことが公知の異なる免疫障害試料もしくは哺乳動物と比較することにより測定してもよい。化学療法に対する典型的な獲得抵抗性は「多剤抵抗性」と呼ばれる。多剤抵抗性は、Ｐ糖タンパク質によって媒介される場合もあれば、他の機構によって媒介される場合もあり、哺乳動物が多剤抵抗性微生物または微生物の組合せに感染した際に生じる場合もある。治療的処置に対する抵抗性の決定は、当技術分野では日常的であり、通常の熟練した臨床医の技術の範囲内であり、例えば、「感作」として本明細書に記述される細胞増殖アッセイおよび細胞死アッセイにより測定することができる。一部の実施形態では、「抵抗性を逆転させる」という用語は、一次抗免疫障害療法（例えば、抗免疫チェックポイント阻害剤、化学療法薬、および／または放射線療法）と組み合わせて第２の薬剤を使用すると、一次療法単独では統計的に有意な減少をもたらすことができない状況での免疫障害組織と比較して、免疫障害組織を統計的有意なレベル（例えば、ｐ＜０．０５）で有意に減少させることが可能であることを意味する。例えば、これは一般に、無処置の腫瘍が対数的に増殖しているときに行われる腫瘍体積測定に適用される。

「療法に対する応答」という用語は、操作T細胞療法などの療法に対する免疫障害のあらゆる応答、好ましくは症状の変化、例えば、ネオアジュバントもしくはアジュバント化学療法の開始後の感染またはウイルス負荷、腫瘍質量および／または体積の低減などに関する。Ｔ細胞機能、例えばＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋エフェクター機能、ならびにその抗原特異的機能は、当技術分野で周知であり、かつ／または本明細書に記述される、多数のアッセイに従って査定することができる。過剰増殖障害応答は、例えば、有効性について、またはネオアジュバントもしくはアジュバントの状況下で査定することができ、ここでは、全身性介入後の腫瘍のサイズが、ＣＴ、ＰＥＴ、マンモグラム、超音波、または触診により測定した初期のサイズおよび寸法と比較されうる。応答は、生検または外科的切除後の腫瘍のキャリパー測定または病理学的検査によって査定することもできる。応答は、腫瘍体積の百分率変化のように定量的に記録される場合もあれば、「病理学的完全奏功」（ｐＣＲ：ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｏｍｐｌｅｔｅｒｅｓｐｏｎｓｅ）、「臨床的完全寛解」（ｃＣＲ：ｃｌｉｎｉｃａｌｃｏｍｐｌｅｔｅｒｅｍｉｓｓｉｏｎ）、「臨床的部分寛解」（ｃＰＲ：ｃｌｉｎｉｃａｌｐａｒｔｉａｌｒｅｍｉｓｓｉｏｎ）、「臨床的安定疾患」（ｃＳＤ：ｃｌｉｎｉｃａｌｓｔａｂｌｅｄｉｓｅａｓｅ）、「臨床的進行性疾患」（ｃＰＤ：ｃｌｉｎｉｃａｌｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｄｉｓｅａｓｅ）のように定性的に記録される場合もあれば、他の定性的基準で記録される場合もある。過剰増殖障害応答の査定は、ネオアジュバントまたはアジュバント療法の開始後早期、例えば、数時間後、数日後、数週間後、または好ましくは数か月後に行われうる。応答査定の典型的な終点は、ネオアジュバント化学療法の終結時または残留腫瘍細胞および／もしくは腫瘍母地の外科的除去時である。これは、ネオアジュバント療法の開始から３か月後が典型的である。一部の実施形態では、本明細書に記述される治療的処置の臨床的有効性は、臨床利益率（ＣＢＲ：ｃｌｉｎｉｃａｌｂｅｎｅｆｉｔｒａｔｅ）を測定することによって決定されうる。臨床利益率は、療法終了時から少なくとも６か月経った時点における、完全寛解（ＣＲ）している患者の百分率、部分寛解（ＰＲ）している患者の数、および安定疾患（ＳＤ）を有する患者の数の和を決定することにより測定される。この式の簡潔表現は、ＣＢＲ＝６か月にわたるＣＲ＋ＰＲ＋ＳＤである。一部の実施形態では、特定のがん治療レジメンのＣＢＲは、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％であるか、またはそれよりも多い。がん療法に対する応答を評価するためのさらなる基準は「生存期間」に関し、これには、次の全てが含まれる：全生存期間としても公知である、死亡までの生存期間（ここで前記死亡は、無関係の原因のものでも、腫瘍に関連するものでもよい）；「無再発生存期間」（ここで再発という用語は、局在化再発および遠隔再発の両方を含むものとする）；無転移生存期間；無疾患生存期間（ここで疾患という用語は、がんおよびがん関連疾患を含むものとする）。前記生存期間の長さは、規定の始点（例えば、診断時または処置開始時）および終点（例えば、死、再発、または転移）を参照することによって計算されうる。加えて、処置の有効性に関する基準は、化学療法への応答、生存確率、所与の期間中における転移の確率、および腫瘍再発の確率を含むように拡大されてもよい。例えば、適切な閾値を決定するためには、特定のがん治療レジメンを対象の集団に施し、その転帰を、任意のがん療法を施す前に決定されたバイオマーカー測定値と相関させることができる。転帰の測定値は、ネオアジュバント設定で与えられる療法に対する病理学的応答でありうる。代替的に、全生存期間および無疾患生存期間などの転帰の尺度は、バイオマーカー測定値が既知である対象のがん療法後の期間にわたってモニタリングしてもよい。ある特定の実施形態では、投与される用量は、がん治療剤について当技術分野で公知の標準的な用量である。対象がモニタリングされる期間は様々でありうる。例えば、対象は、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０か月にわたってモニタリングされてもよい。がん療法の転帰と相関するバイオマーカー測定閾値は、実施例の節に記述されるものなどの当技術分野で周知の方法を使用して決定することができる。

本明細書で使用される「ＲＮＡ干渉剤」は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって標的バイオマーカー遺伝子の発現に干渉するかまたはそれを阻害する、任意の薬剤として定義される。このようなＲＮＡ干渉剤としては、本発明の標的バイオマーカー遺伝子と相同であるＲＮＡ分子を含む核酸分子、またはその断片、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって標的バイオマーカー核酸の発現に干渉するかもしくはそれを阻害する小分子が挙げられるが、これらに限定されない。

「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）」は、標的バイオマーカー核酸と同一かまたはそれと高度に類似する配列のＲＮＡの発現または導入が、その標的の遺伝子から転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の配列特異的分解または特異的な転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）をもたらし（Coburn, G.およびCullen, B.（２００２年）、J. of Virology、７６巻（１８号）：９２２５頁を参照されたい）、それにより標的バイオマーカー核酸の発現が阻害される、進化的に保存されたプロセスである。一実施形態では、ＲＮＡは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。このプロセスは、植物、無脊椎動物、および哺乳動物の細胞において記述されている。自然界では、ＲＮＡｉは、長いｄｓＲＮＡのｓｉＲＮＡと呼ばれる二本鎖断片への前進的切断を促進するｄｓＲＮＡ特異的エンドヌクレアーゼのダイサーによって開始される。ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを認識し切断するタンパク質複合体に組み込まれる。ＲＮＡｉは、標的バイオマーカー核酸の発現を阻害またはサイレンシングするために、核酸分子、例えば、合成ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、または他のＲＮＡ干渉剤を導入することにより開始することもできる。本明細書で使用される、「標的バイオマーカー核酸発現の阻害」または「マーカー遺伝子発現の阻害」は、標的バイオマーカー核酸または標的バイオマーカー核酸によりコードされるタンパク質の発現またはタンパク質活性またはレベルのあらゆる減少を含む。減少は、ＲＮＡ干渉剤によりターゲティングされない標的バイオマーカー核酸の発現または標的バイオマーカー核酸によってコードされるタンパク質の活性もしくはレベルと比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％、またはそれよりも多くの減少でありうる。

少なくとも１つのバイオマーカーの存在またはレベルを検出または決定するために使用される「試料」という用語は、典型的には、全血、血漿、血清、唾液、尿、便（例えば、糞便）、涙、および任意の他の体液（例えば、「体液」の定義において上述したもの）、または小腸、結腸試料、もしくは外科的切除組織などの組織試料（例えば、生検）である。ある特定の事例では、本発明の方法は、試料中の少なくとも１つのマーカーの存在またはレベルを検出または決定する前に個体から試料を得ることをさらに含む。一部の実施形態では、Ｔリンパ球またはそのサブセットを含む任意の試料が、本発明に従って有用である。

「感作する」という用語は、療法（例えば、操作T細胞療法）による関連免疫障害のより有効な処置が可能になるような方法で、感染細胞またはがん細胞などの免疫障害細胞を変化させることを意味する。一部の実施形態では、正常細胞は、正常細胞がその療法によって過度に傷つけられるほどの影響は受けない。治療的処置に対する感受性の増加または感受性の低減は、細胞増殖アッセイ（Tanigawa N、Kern D H、Kikasa Y、Morton D L、Cancer Res、１９８２年；４２巻：２１５９〜２１６４頁）、細胞死アッセイ（Weisenthal L M、Shoemaker R H、Marsden J A、Dill P L、Baker J A、Moran E M、Cancer Res、１９８４年；９４巻：１６１〜１７３頁；Weisenthal L M、Lippman M E、Cancer Treat Rep、１９８５年；６９巻：６１５〜６３２頁；Weisenthal L M、In: Kaspers G J L、Pieters R、Twentyman P R、Weisenthal L M、Veerman A J P編、Drug Resistance in Leukemia and Lymphoma、Langhorne, P A: Harwood Academic Publishers、１９９３年：４１５〜４３２頁；Weisenthal L M、Contrib Gynecol Obstet、１９９４年；１９巻：８２〜９０頁）を含むがこれらに限定されない、本明細書に後述される特定の処置および方法について当技術分野で公知の方法に従って測定される。感受性または抵抗性は、動物において、ある期間、例えば、ヒトでは６か月間およびマウスでは４〜６週間にわたり、慢性免疫障害症状の低減を測定することによって測定することもできる。組成物または方法は、処置感受性の増加または抵抗性の低減が、かかる組成物または方法の非存在下の処置感受性または抵抗性と比較して、２５％またはそれよりも多く、例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、またはそれよりも多く、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍まで、またはそれよりも多い場合に、治療的処置に対する応答を感作する。治療的処置に対する感受性または抵抗性の決定は、当技術分野では日常的であり、通常の熟練した臨床医の技術の範囲内である。本明細書に記述される、がん療法の有効性を増強させるためのいかなる方法も、過剰増殖性細胞ないしはがん性細胞（例えば、抵抗性細胞）をがん療法に対して感作するための方法に等しく適用されうることを理解されたい。

「短干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）は、本明細書では「小分子干渉ＲＮＡ」とも称され、標的遺伝子の発現を例えばＲＮＡｉによって阻害するように機能する薬剤として定義される。ｓｉＲＮＡは、化学合成される場合もあれば、ｉｎｖｉｔｒｏ転写により産生される場合もあれば、宿主細胞内で産生される場合もある。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、約１５〜約４０ヌクレオチド長、好ましくは約１５〜約２８ヌクレオチド、より好ましくは約１９〜約２５ヌクレオチド長、より好ましくは約１９、２０、２１、または２２ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子であり、各鎖に約０、１、２、３、４、もしくは５ヌクレオチド長を有する３’および／または５’オーバーハングを含有する場合がある。オーバーハングの長さは２つの鎖同士の間で独立しており、すなわち、一方の鎖のオーバーハングの長さは、第２の鎖のオーバーハングの長さに依存しない。ｓｉＲＮＡには、標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の分解または特異的な転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）によってＲＮＡ干渉を促進する能力があることが好ましい。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、低分子ヘアピン（別称ステムループ）ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。一実施形態では、これらのｓｈＲＮＡは、短い（例えば、１９〜２５ヌクレオチドの）アンチセンス鎖、続いて５〜９ヌクレオチドのループ、および類似したセンス鎖から構成されている。代替的に、センス鎖がヌクレオチドループ構造に先行してもよく、アンチセンス鎖が続いてもよい。これらのｓｈＲＮＡは、プラスミド、レトロウイルス、およびレンチウイルス内に含有され、例えばｐｏｌＩＩＩＵ６プロモーター、または別のプロモーターから発現されてもよい（例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Stewartら（２００３年）、RNA Apr；９巻（４号）：４９３〜５０１頁を参照されたい）。ＲＮＡ干渉剤、例えばｓｉＲＮＡ分子は、本発明のマーカー遺伝子、例えば、免疫障害においてその発現または源を低減しなければならないマーカー遺伝子（例えば表１に列記されたマーカー）の発現を阻害することにより、対象の免疫障害を処置、防止、または阻害するために、免疫障害を有するかまたは免疫障害を有するリスクのある対象に投与されてもよい。

「小分子」という用語は、当技術分野の用語であり、約１０００分子量未満または約５００分子量未満の分子を含む。一実施形態では、小分子は、ペプチド結合のみを含むわけではない。別の実施形態では、小分子はオリゴマーではない。活性についてスクリーニングされうる例示的な小分子化合物としては、ペプチド、ペプチド模倣薬、核酸、炭水化物、有機小分子（例えば、ポリケタイド）（Caneら（１９９８年）、Science、２８２巻：６３頁）、および天然物抽出ライブラリーが挙げられるが、これらに限定されない。別の実施形態では、化合物は、小さな有機非ペプチド性化合物である。さらなる実施形態では、小分子は生合成物ではない。

「対象」という用語は、任意の健康な動物、哺乳動物、もしくはヒト、または免疫障害に罹患した任意の動物、哺乳動物、もしくはヒトを指す。「対象」という用語は「患者」と互換性がある。

「生存期間」という用語には、次の全てが含まれる：全生存期間としても公知である、死亡までの生存期間（ここで前記死亡は、無関係の原因のものでも、腫瘍に関連するものでもよい）；「無再発生存期間」（ここで再発という用語は、局在化再発および遠隔再発の両方を含むものとする）；無疾患生存期間（ここで疾患という用語は、免疫障害および免疫障害関連疾患を含むものとする）。前記生存期間の長さは、規定の始点（例えば、診断時または処置開始時）および終点（例えば、死、再発、または転移）を参照することによって計算されうる。加えて、処置の有効性に関する基準は、療法への応答、生存確率、所与の期間中における再発の確率などを含むように拡大されてもよい。

「相乗効果」という用語は、２つまたはそれよりも多くの抗免疫障害剤または療法の効果を組み合わせたもので、かかる各薬剤または療法単独の別々の効果の和よりも大きくなりうるものを指す。一部の実施形態では、相乗効果は、単独療法と同様の有効性を提供するが、単独療法と比べて、不要な副作用の低減といった他の予想外の改善を伴う場合がある。

「治療効果」という用語は、動物、特に哺乳動物、より特定するとヒトにおける、薬理学的に活性な物質により引き起こされる局所的または全身的な効果を指す。したがってこの用語は、動物もしくはヒトにおいて、疾患の診断、治癒、緩和、処置、もしくは防止、または望ましい身体的もしくは精神的発達および状態の増強において使用されるよう意図される、あらゆる物質を意味する。「治療有効量」という表現は、あらゆる処置に適用可能な合理的な利益／リスク比において何らかの所望される局所的または全身的な効果をもたらす、かかる療法または物質の量を意味する。ある特定の実施形態では、化合物の治療有効量は、その治療指数、可溶性などに依存する。例えば、本発明の方法により発見されたある特定の化合物は、かかる処置に適用可能な合理的な利益／リスク比をもたらすのに十分な量で投与されうる。

本明細書で使用される「治療有効量」および「有効量」という用語は、本発明の化合物を含む化合物、物質、または組成物の量で、動物の少なくとも細胞亜集団においてあらゆる医療処置に適用可能な合理的な利益／リスク比で何らかの所望される治療効果をもたらすのに有効な量を意味する。本化合物の毒性および治療有効性は、例えばＬＤ_５０およびＥＤ_５０を決定するための、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって、決定することができる。高い治療指数を呈する組成物が好ましい。一部の実施形態では、薬剤のＬＤ_５０（致死投与量）を測定することができ、これは例えば、薬剤の投与なしと比べて少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、またはそれよりも多く低減していることがある。同様に、薬剤のＥＤ_５０（すなわち、症状の最大半量の阻害を実現する濃度）を測定することができ、これは例えば、薬剤の投与なしと比べて少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、またはそれよりも多く増加していることがある。また同様に、薬剤のＩＣ_５０（すなわち、最大半量の効果、例えばがん細胞に対する細胞傷害効果もしくは細胞分裂停止効果、またはウイルス複製もしくは負荷の阻害を実現する濃度）を測定することができ、これは例えば、薬剤の投与なしと比べて少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、またはそれよりも多く増加していることがある。一部の実施形態では、アッセイにおける効果は、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはさらには１００％阻害されうる。別の実施形態では、悪性度またはウイルス負荷の少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはさらには１００％の減少が実現されうる。

「組織特異的」プロモーターとは、遺伝子産物をコードまたは特定化するポリヌクレオチドに作動可能に連結すると、実質的に細胞がプロモーターに対応する組織型の細胞である場合にのみ遺伝子産物をヒト生細胞内で産生させる、ヌクレオチド配列である。例えば、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ２５、または他のＴｒｅｇ選択的またはＴｒｅｇ特異的なプロモーターを使用して、Ｔｒｅｇ内で選択的または特異的にポリヌクレオチドを発現させることができる。

「転写されたポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド転写物」とは、バイオマーカー核酸の転写、および存在する場合はＲＮＡ転写物の通常の転写後プロセシング（例えば、スプライシング）、およびＲＮＡ転写物の逆転写によって作製された成熟ｍＲＮＡの全てまたは一部分に対して相補的または相同であるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはかかるＲＮＡもしくはｃＤＮＡの類似体）である。

本明細書で使用される「無応答性」または「耐性」という用語は、刺激、例えば、活性化受容体またはサイトカインによる刺激に対する、免疫細胞の不応性を含む。無応答性は、例えば、免疫抑制薬への曝露または高用量の抗原への曝露が原因で生じうる。本明細書で使用される「アネルギー」または「耐性」という用語は、活性化受容体を媒介した刺激への不応性を含む。このような不応性は一般に抗原特異的であり、寛容化抗原への曝露が終わった後も持続する。例えば、Ｔ細胞におけるアネルギーは（無応答性と対照的に）、サイトカイン産生、例えばＩＬ−２の欠如によって特徴付けられる。Ｔ細胞アネルギーは、Ｔ細胞が抗原に曝露され、第２のシグナル（例えば、共刺激シグナル）の非存在下で第１のシグナル（Ｔ細胞受容体またはＣＤ−３媒介性シグナル）を受けると生じる。これらの条件下では、細胞を同じ抗原に再曝露しても（再曝露が共刺激性ポリペプチドの存在下で起こったとしても）、サイトカインを産生することができず、したがって増殖することができない。しかしながら、アネルギー性Ｔ細胞は、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）と共に培養すると増殖する。例えば、Ｔ細胞アネルギーは、ＥＬＩＳＡまたは指標細胞株を使用した増殖アッセイにより測定される、Ｔリンパ球によるＩＬ−２産生の欠如によって観察される場合もある。代替的に、レポーター遺伝子構築物を使用してもよい。例えば、アネルギー性Ｔ細胞は、５’ＩＬ−２遺伝子エンハンサーの制御下の異種性プロモーターにより、またはエンハンサー内に見出されうるＡＰ１配列の多量体により誘導される、ＩＬ−２遺伝子転写を開始することができない（Kangら（１９９２年）、Science、２５７巻：１１３４頁）。

本明細書で使用される「ベクター」という用語は、連結した別の核酸を輸送する能力がある核酸を指す。ベクターの１つの種類は「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントがライゲーションされうる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターは、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲーションされうるウイルスベクターである。ある特定のベクターには、それらが導入された宿主細胞において自律複製を行う能力がある（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに統合されることにより宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある特定のベクターには、それらが作動可能に連結した遺伝子の発現を導く能力がある。このようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」または単純に「発現ベクター」と称される。概して、組換えＤＮＡ技術において役立つ発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。プラスミドはベクターの最も一般的に使用される形態であるため、本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」は互換的に使用される場合がある。しかしながら、本発明は、均等な機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）など、かかる他の形態の発現ベクターを含むよう意図される。

ＩＩ．Ｔ細胞クロマチン接近可能なゲノム遺伝子の発現調節領域
「クロマチン接近可能」ゲノム領域は、転写因子が結合し遺伝子発現の調節を媒介するための物理的空間をもたらすため、遺伝子発現調節領域を特定する。実施例にさらに後述するように、様々な種類のＴ細胞（例えば、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞、高機能エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞、および疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞）の様々なクロマチン接近可能調節領域セットを分析し、互いと比較した。多くのクロマチン接近可能なゲノム遺伝子の発現調節領域が、所与の目的のＴ細胞型に選択的または特異的に存在することが決定された。以下に提供する表１Ａ〜１Ｋは、疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞に対して選択的かつ／または特異的であり、本明細書に記述される本発明の実施形態に従って有用である、クロマチン接近可能なゲノム遺伝子の発現調節領域を記述する。これらの領域は、疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞において選択的かつ／または特異的に、転写因子が結合し、遺伝子発現の調節、例えばＰＤ−１の過剰発現を媒介するために利用可能である。

「特異的」という用語は、排他的な作用または機能を指す。一例において、疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞などの疲弊T細胞のゲノム内に特異的に存在するゲノム遺伝子の発現調節領域は、ナイーブＴ細胞、高機能エフェクターＴ細胞、またはメモリーＴ細胞のゲノム内に存在しない。別の例では、細胞における遺伝子の発現の特異的な調整とは、その細胞集団における遺伝子の発現および／または活性の調整のみを指し、他の細胞集団におけるものは指さない。さらに別の例では、所定の抗原に対する抗体の特異的結合とは、他の抗原に結合することなく目的の抗原に結合する抗体の能力を指す。典型的に、抗体は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）アッセイ機器において、分析物として目的の抗原を、リガンドとして抗体を使用し、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術により決定した場合に、およそ１×１０^−７Ｍ未満、例えばおよそ１０^−８Ｍ、１０^−９Ｍ、１０^−１０Ｍ、１０^−１１Ｍ未満、またはそれよりもさらに低い親和性（Ｋ_Ｄ）で結合し、所定の抗原または密接に関係した抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合に関するその親和性と比べて、少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、もしくは１０．０倍、またはそれよりも高い親和性で、所定の抗原に結合する。加えて、Ｋ_ＤはＫ_Ａの逆数である。「抗原を認識する抗体」および「抗原に対して特異的な抗体」という表現は、本明細書では「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と互換的に使用される。

対照的に、「選択的」という用語は、優先的な作用または機能を指す。選択的バイオマーカーは、本発明の目的では、別段の記載がない限り特異的なマーカーも包含する。例えば、疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞などの「疲弊T細胞のゲノム内に選択的に存在する」ゲノム遺伝子の発現調節領域は、ナイーブＴ細胞、多機能エフェクターＴ細胞、またはメモリーＴ細胞のうちの１つまたは複数のゲノム内に存在しない。別の例として、選択的結合とは、１つの抗原の結合を別のものと比べて優先的に判別する抗体の能力を指す相対的な用語である。二重特異性または多特異性抗体は、複数の抗原標的の局所的な有効濃度の増加に起因する、単一の位置において発現される複数の抗原標的に対する結合親和性の増加に基づいて、ある特定の抗原または細胞集団を選択的にターゲティングすることができる。「選択的」という用語は、他の標的と比べた特定の目的の標的における優先的な効果という観点で数量化することができる。例えば、測定変数（例えば、非操作T細胞におけるＰＤ−１発現と対比した操作T細胞におけるＰＤ−１発現）は、意図されないまたは望まれない標的と対比して、目的の標的において、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、もしくはそれよりも高く、または境界値を含むその間の任意の範囲（例えば、５０％〜１６倍）、異なる場合がある。同じ倍率分析を使用して、所与の組織、細胞集団、測定変数、測定効果など、例えば細胞比、過剰増殖性細胞の増殖速度または体積、Ｔ細胞機能または増殖の速度などにおける影響の規模を確認することができる。

一般に、「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子（すなわち、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（すなわち、ｍＲＮＡ）、ならびにヌクレオチド類似体を使用して生成されたＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を含むよう意図される。「ゲノム核酸」は、一般に、宿主ゲノムと同じ核酸の種類を有する（例えば、ヒトゲノムＤＮＡでは二本鎖ＤＮＡ、Ｃ型肝炎ウイルスゲノムＲＮＡでは一本鎖ＲＮＡなど）。核酸分子は一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。「単離された」核酸分子とは、核酸の天然源に存在する他の核酸分子から分離されたものである。好ましくは、「単離された」核酸は、その核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡにおいて天然に核酸の端部にある配列（すなわち、核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。例えば、様々な実施形態において、表１に列記されるか本明細書に記述される１つまたは複数のバイオマーカーに対応する単離された核酸分子は、その核酸が由来する細胞（すなわち、Ｔ細胞）のゲノムＤＮＡにおいて天然に核酸分子の端部にあるヌクレオチド配列を、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満含有する場合がある。さらに、「単離された」核酸分子は、他の細胞物質を、または組換え技術により産生された場合は培養培地を、または化学合成された場合は化学前駆体もしくは他の化学物質を、実質的に含まない場合がある。

上述のように、本発明は、表に示されるゲノム核酸領域に加えて、列記された領域を含むゲノム核酸配列、またはヒトを含むマウス以外の哺乳動物のゲノム内にあるそれらのオルソログを想定する。加えて、５’末端、３’末端、または５’末端および３’末端の両方に、約１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ、４ｂｐ、５ｂｐ、１０ｂｐ、１５ｂｐ、２０ｂｐ、２５ｂｐ、３０ｂｐ、３５ｂｐ、４０ｂｐ、４５ｂｐ、５０ｂｐ、５５ｂｐ、６０ｂｐ、６５ｂｐ、７０ｂｐ、７５ｂｐ、８０ｂｐ、８５ｂｐ、９０ｂｐ、９５ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１１００ｂｐ、１２００ｂｐ、１３００ｂｐ、１４００ｂｐ、１５００ｂｐ、１６００ｂｐ、１７００ｂｐ、１８００ｂｐ、１９００ｂｐ、２０００ｂｐ、２１００ｂｐ、２２００ｂｐ、２３００ｂｐ、２４００ｂｐ、２５００ｂｐ、２６００ｂｐ、２７００ｂｐ、２８００ｂｐ、２９００ｂｐ、もしくは３０００ｂｐ、または境界値を含むその間の任意の範囲（例えば、１ｂｐ〜２２２ｂｐ）をさらに含む、列記された領域、またはそれらのオルソログも含まれる。加えて、任意の部分またはその断片が想定される。さらに、全長にわたってかかる領域と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれよりも多くの同一性を有する核酸配列を含むあらゆるゲノム核酸配列、またはその部分／断片が想定される。記述される核酸分子は、列記された領域の核酸の機能を有しうる。

かかる領域は、標準的な分子生物学技術および本明細書において提供される配列情報を使用して単離することができる。例えば、ヒトｃＤＮＡは、ハイブリダイゼーションプローブとしての核酸分子の全てもしくは一部分またはその断片、および標準的なハイブリダイゼーション技術（すなわち、Sambrook, J.、Fritsh, E. F.、およびManiatis, T.、Molecular Cloning: A Laboratory Manual.、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、１９８９年に記述されているもの）を使用して、ヒト細胞株から単離することができる。さらに、本発明の核酸分子は、表１に列記された１つもしくは複数のバイオマーカーもしくはそれらの断片の配列、または相同ヌクレオチド配列に基づいて設計された、オリゴヌクレオチドプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応によって単離することができる。ＰＣＲ増幅のための合成オリゴヌクレオチドプライマーは、当技術分野で周知の方法に従って設計することができる。本発明の核酸は、鋳型としてのゲノムＤＮＡおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って増幅させることができる。そのように増幅された核酸は、適切なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列分析による特徴付けを行ってもよい。さらに、表１に列記された１つまたは複数のバイオマーカーのヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術により、すなわち、自動ＤＮＡ合成機を使用して、調製することができる。

表１に列記された１つまたは複数のバイオマーカーのヌクレオチド配列に基づくプローブは、同じもしくは相同のタンパク質をコードする所望の転写物またはゲノム配列を検出または確認するために使用することができる。好ましい実施形態では、プローブは、それに結合した標識群をさらに含み、すなわち、標識群は、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子でありうる。このようなプローブは、例えば、対象の細胞試料中の１つまたは複数のバイオマーカー核酸のレベルを測定すること、すなわち、表１に列記された１つまたは複数のバイオマーカーのｍＲＮＡレベルを検出することにより、表１に列記された１つまたは複数のバイオマーカーを発現する細胞または組織を特定するための診断試験キットの一部として使用されうる。

表１に列記された１つまたは複数のバイオマーカーのアミノ酸配列における変化をもたらすＤＮＡ配列多型が集団（例えば、哺乳動物集団および／またはヒト集団）内に存在しうることは、当業者には察知されよう。このような遺伝子多型は、天然の対立遺伝子のバリエーションに起因して集団内の個体間に存在しうる。本明細書で使用される「遺伝子」および「組換え遺伝子」という用語は、表１に列記された１つまたは複数のバイオマーカー、好ましくは哺乳動物の、例えば、ヒトのタンパク質をコードする、オープンリーディングフレームを含む核酸分子を指す。このような天然の対立遺伝子のバリエーションは、典型的に、表１に列記された１つまたは複数のバイオマーカーのヌクレオチド配列における１〜５％の分散をもたらしうる。あらゆるこのようなヌクレオチドのバリエーションと、天然の対立遺伝子のバリエーションの結果であり、表１に列記された１つまたは複数のバイオマーカーの機能的活性を変化させない、表１に列記された１つまたは複数のバイオマーカーにおいて結果として生じるアミノ酸多型とが、本発明の範囲内であるよう意図される。さらに、他の種に由来する表１に列記された１つまたは複数のバイオマーカーをコードする核酸分子である。

集団内に存在しうる、表１に列記された１つまたは複数のバイオマーカーの天然に存在する対立遺伝子変異形に加えて、変異によってヌクレオチド配列またはその断片に変化を導入することにより、表１に列記されたバイオマーカーの機能的能力を変化させることなく、表１に列記されたバイオマーカーの核酸配列における変化がもたらされうることが、当業者にはさらに察知されよう。

配列の比較および２つの配列間の相同パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成されうる。好ましくは、アライメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用して行われうる。マルチプルアライメントパラメータは、ＧＡＰＰｅｎａｌｔｙ＝１０、ＧａｐＬｅｎｇｔｈＰｅｎａｌｔｙ＝１０を含む。ＤＮＡアライメントでは、ペアワイズアライメントパラメータは、Ｈｔｕｐｌｅ＝２、Ｇａｐｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｗｉｎｄｏｗ＝４、およびＤｉａｇｏｎａｌｓａｖｅｄ＝４であってもよい。

最後に、本発明の遺伝子座およびバイオマーカー（例えば、表１に列記されたバイオマーカー）に関する核酸およびアミノ酸配列の情報は当技術分野で周知であり、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）などの公的に利用可能なデータベースにおいて、また実施例に記述されるように、容易に利用可能である。

ＩＩＩ．Ｔ細胞およびＴ細胞のゲノム遺伝子の発現調節領域の遺伝子修飾
本明細書で使用される「免疫細胞」という用語は、免疫応答においてある役割を果たす細胞を指す。免疫細胞は造血性起源であり、Ｂ細胞およびＴ細胞などのリンパ球；ナチュラルキラー細胞；単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、および顆粒球などの骨髄系細胞を含む。例えば、抗原反応性Ｔ細胞とは、目的の抗原に選択的に結合し、抗原の認識に基づいて免疫学的応答を調整するＴ細胞である。免疫細胞は、末梢血中に見出される場合がある。「末梢血細胞サブタイプ」という用語は、好酸球、好中球、Ｔ細胞、単球、ＮＫ細胞、顆粒球、およびＢ細胞を含むがこれらに限定されない、末梢血中に通常見出される細胞型を指す。一部の免疫細胞は「抗原提示細胞」であり、専門の抗原提示細胞（例えば、Ｂリンパ球、単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞）、ならびに他の抗原提示細胞（例えば、ケラチノサイト、内皮細胞、アストロサイト、線維芽細胞、およびオリゴデンドロサイト）を含む。

免疫細胞は免疫応答を媒介する。「免疫応答」という用語は、免疫系の細胞、例えばＢ細胞、Ｔ細胞（ＣＤ４またはＣＤ８）、調節性Ｔ細胞、抗原提示細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、好塩基球、好酸球、または好中球による、刺激への応答を指す。一実施形態では、この応答は特定の抗原に対して特異的（「抗原特異的応答」）であり、ＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、またはＢ細胞によるそれらの抗原特異的受容体を介した応答を指す。別の実施形態では、免疫応答は、ＣＤ４＋応答またはＣＤ８＋応答などのＴ細胞応答である。これらの細胞によるこのような応答は、例えば、細胞傷害、増殖、サイトカインもしくはケモカインの産生、トラフィッキング、または食作用を含むことがあり、応答を受けている免疫細胞の性質に依存しうる。さらに別の実施形態では、免疫応答は、細胞傷害性ＣＤ８＋細胞が抗原特異的応答をもたらすときに生じるようなエフェクターＴ細胞応答である。「免疫応答」という用語は、Ｔ細胞媒介性かつ／またはＢ細胞媒介性の免疫応答を含む。例示的な免疫応答としては、Ｔ細胞応答、例えば、サイトカイン産生および細胞性細胞傷害が挙げられる。加えて、免疫応答という用語は、Ｔ細胞活性化に間接的に影響される免疫応答、例えば、抗体産生（液性応答）、およびサイトカイン応答細胞、例えばマクロファージの活性化を含む。

Ｔ細胞は免疫細胞のクラスであり、一般に、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）および従来型Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ）の２つのサブクラスに分けられる。

Ｔｒｅｇとは、約５〜１０％の循環ＣＤ４＋Ｔ細胞集団を含み、自己反応性リンパ球を優位に抑制するよう作用し、自然免疫応答および適応免疫応答を制御する、天然に存在するＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋Ｔリンパ球である（PiccirilloおよびShevach（２００４年）、Semin. Immunol.、１６巻：８１〜８８頁；FehervariおよびSakaguchi（２００４年）、Curr. Opin. Immunol.、１６巻：２０３〜２０８頁；Azumaら（２００３年）、Cancer Res.、６３巻：４５１６〜４５２０頁；Cederbomら（２０００年）、Eur. J. Immunol.、３０巻：１５３８〜１５４３頁；Maloyら（２００３年）、J. Exp. Med.、１９７巻：１１１〜１１９頁；Serraら（２００３年）、Immunity、１９巻：８７７〜８８９頁；ThorntonおよびShevach（１９９８年）、J. Exp. Med.、１８８巻：２８７〜２９６頁；Janssensら（２００３年）、J. Immunol.、１７１巻：４６０４〜４６１２頁；Gasteigerら（２０１３年）、J. Exp. Med.、２１０巻：１１６７〜１１７８頁；Sitrinら（２０１３年）、J. Exp. Med.、２１０巻：１１５３〜１１６５頁；SchmittおよびWilliams（２０１３年）、Front. Immunol.、４巻：１〜１３頁）。天然のＴｒｅｇはまた、低量のＣＤ１２７を発現し、胸腺において発生し、ＧＩＴＲおよびＣＴＬＡ−４を発現する。誘導されたＴｒｅｇとは、胸腺の外側の末梢（例えば、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ））においてＣＤ２５発現を獲得し、低レベルのＣＤ４５ＲＢを発現し、Ｆｏｘｐ３またはＣＤ２５を自然には発現しないＣＤ４＋Ｔ細胞である。誘導されたＴｒｅｇは、末梢におけるＣＤ４＋ナイーブ従来型Ｔ細胞に対するＴＧＦベータの影響に基づいて、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ−４、およびＧＩＴＲ／ＡＩＴＲの発現を獲得する。Ｔｒｅｇは、少なくとも部分的には、従来型Ｔ細胞（Ｔｃｏｎ）の増殖、拡大、およびエフェクター活性を阻害することにより、この抑制を実現する。Ｔｒｅｇは、Ｔ細胞の助けおよび活性化を阻害することによる細胞間の接触、ＩＬ−１０もしくはＴＧＦ−βなどの免疫抑制性サイトカインの放出、グランザイムＢなどの細胞傷害性分子の産生、ＩＬ−２レベルの枯渇、または組織内の栄養素の変更のいずれかによって、エフェクターＴ細胞がその（自己）標的を破壊することを抑制する。Ｔｒｅｇの枯渇は、ＩＬ−２誘導性抗腫瘍免疫を増強させることが示された（Imaiら（２００７年）、Cancer Sci.、９８巻：４１６〜２３頁）。

対照的に、ＴｃｏｎｖまたはＴｅｆｆとしても公知である従来型Ｔ細胞は、１つまたは複数のＴ細胞受容体の発現のおかげで免疫応答を増加させるエフェクター機能（例えば、サイトカイン分泌、細胞傷害活性、抗自己認識など）を有する。ＴｃｏｎまたはＴｅｆｆは一般に、ＴｒｅｇではないあらゆるＴ細胞集団と定義され、例えば、ナイーブＴ細胞、活性化Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、休止Ｔｃｏｎ、または例えばＴｈ１もしくはＴｈ２系列に向かって分化したＴｃｏｎを含む。一部の実施形態では、Ｔｅｆｆは、非ＴｒｅｇＴ細胞のサブセットである。一部の実施形態では、Ｔｅｆｆは、ＣＤ４＋ＴｅｆｆまたはＣＤ８＋Ｔｅｆｆ、例えばＣＤ４＋ヘルパーＴリンパ球（例えば、Ｔｈ０、Ｔｈ１、Ｔｆｈ、またはＴｈ１７）およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球である。

「ナイーブＴｃｏｎ」とは、骨髄内で分化し、胸腺における中心的な正の選択および負の選択の過程を経るのに成功したが、未だ抗原への曝露によって活性化されてない、ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。ナイーブＴｃｏｎは、一般的に、Ｌ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）の表面発現、ＣＤ２５、ＣＤ４４、またはＣＤ６９などの活性化マーカーの非存在、およびＣＤ４５ＲＯなどのメモリーマーカーの非存在によって特徴付けられる。したがって、ナイーブＴｃｏｎは、不活発で非分裂性であり、恒常的な生存のためにインターロイキン−７（ＩＬ−７）およびインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）を要求すると考えられている（少なくともＷＯ２０１０／１０１８７０を参照されたい）。このような細胞の存在および活性は、免疫応答の抑制という文脈では望まれない。

Ｔｒｅｇとは異なり、「エフェクターＴｃｏｎ」はアネルギー性ではなく、抗原に基づくＴ細胞受容体の活性化に応答して増殖することができる（Lechlerら（２００１年）、Philos. Trans. R. Soc. Lond. Biol. Sci.、３５６巻：６２５〜６３７頁）。エフェクターＴｃｏｎは、ＣＤ４＋Ｔ細胞である場合もあれば、ＣＤ８＋Ｔ細胞である場合もある。これらはそれぞれ、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩの分子に関連する抗原を認識し、一般に、ＣＤ２５、ＣＤ４４、またはＣＤ６９などの活性化マーカーを発現するが、ＣＤ４５ＲＯなどのメモリーマーカーは発現しないのが一般的である。一般に、Ｔｒｅｇ数の増加、Ｔｒｅｇ活性の増加、および／またはＴｒｅｇ細胞死（例えば、アポトーシス）の減少は、ある範囲の免疫障害（例えば、ｃＧＶＨＤ）に関連する不要な免疫反応を抑制するために有用である。Ｔｒｅｇはまた、炎症の抑制においても重要である。進行中の炎症という文脈では、処置は、ＴｃｏｎまたはＧＶＨＤを悪化させうる他のエフェクターを活性化させることなく、Ｔｒｅｇを優先的に増強させうる。Ｔｒｅｇのｉｎｖｉｖｏでの有効な増大はまた、Ｔｒｅｇ機能障害がますます関与している、末梢耐性異常の他の障害（例えば、ＳＬＥ、Ｔ１Ｄ、ＭＳ、乾癬、ＲＡ、ＩＢＤ、血管炎などの自己免疫疾患）に直接関連性がある（Grinberg-Bleyerら（２０１０年）、J. Exp. Med.、２０７巻：１８７１〜１８７８頁；Buckner（２０１０年）、Nat. Rev. Immunol.、１０巻：８４９〜８５９頁；Humrichら（２０１０年）、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、１０７巻：２０４〜２０９頁；Carboneら（２０１４年）、Nat. Med.、２０巻：６９〜７４頁）。

「メモリーＴｃｏｎ」とは、少なくとも３つの明確なＴ細胞亜集団により代表される、抗原を経験したＴ細胞（すなわち、過去に抗原に曝露され、抗原に応答したことのあるＴ細胞）である。メモリーＴｃｏｎは、急速に繁殖し、抗原に再曝露されるとより強力な免疫応答を誘発しうる。メモリーＴｃｏｎ亜集団は、ケモカイン受容体、ＣＣＲ７、およびＬ−セレクチン（L-selection）（ＣＤ６２Ｌ）の差次的な発現に基づいて差別化されうる（Sallustoら（２０００年）、Curr. Top. Microbiol. Immunol.、２５１巻：１６７〜１７１頁）。例えば、ナイーブ細胞のようなステムメモリーＴ細胞（Ｔｓｃｍ）は、ＣＤ４５ＲＯ−、ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋（Ｌ−セレクチン）、ＣＤ２７＋、ＣＤ２８＋、およびＩＬ−７Ｒα＋であるが、これらはまた、多量のＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＸＣＲ３、およびＬＦＡ−１を発現し、メモリー細胞に独特な多数の機能的性状を示す（Gattinoniら（２０１１年）、Nat. Med.、１７巻：１２９０〜１２９７頁）。セントラルメモリー細胞（Ｔｃｍ）は、Ｌ−セレクチンおよびＣＣＲ７を発現し、ＩＬ−２を分泌するが、ＩＦＮγまたはＩＬ−４は分泌しない。エフェクターメモリー細胞（Ｔｅｍ）は、Ｌ−セレクチンまたはＣＣＲ７を発現しないが、ＩＦＮγおよびＩＬ−４などのエフェクターサイトカインを産生する。

「疲弊Ｔｃｏｎ」とは、Ｔ細胞機能を漸進的に喪失したＴ細胞である。「疲弊」または「無応答性」とは、細胞が通常の入力シグナルに応答してその通常の機能または活性を行わない状態を指し、活性化受容体またはサイトカインを介した刺激などの刺激に対する免疫細胞の不応性を含む。そのような機能または活性としては、増殖もしくは細胞分裂、細胞周期の開始、サイトカイン産生、細胞傷害、トラフィッキング、食作用活性、またはそれらの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。通常の入力シグナルとしては、受容体（例えば、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、共刺激受容体など）を介した刺激を挙げることができるが、これに限定されない。

疲弊免疫細胞は、細胞傷害活性、サイトカイン産生、増殖、トラフィッキング、食作用活性、またはそれらの任意の組合せが、対応する同じ種類の対照免疫細胞と比べて少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはそれよりも多く低減している場合がある。一実施形態では、疲弊している細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、抗原特異的なエフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞）である。ＣＤ８細胞は通常、ＩＬ−２などのサイトカインに応答するほか、Ｔ細胞受容体および／または共刺激受容体による刺激に応答して増殖する（例えば、クローン的に拡大する）。したがって、疲弊ＣＤ８Ｔ細胞とは、通常の入力シグナルに応答して増殖および／またはサイトカインの産生を行わないものである。エフェクター機能の疲弊は、いずれは末期疲弊または完全疲弊、そして最終的には欠失に至る、いくつかの段階に従って表現されうることが周知である（Yiら（２０１０年）、Immunol.、１２９巻：４７４〜４８１頁；WherryおよびAhmed（２００４年）、J. Virol.、７８巻：５５３５〜５５４５頁）。第１の段階では、機能的Ｔ細胞が、ＩＬ−２産生の喪失、ＴＮＦα産生の低減、ならびに増殖能および／またはｅｘｖｉｖｏ溶解能力の低減を含む、エフェクター機能のサブセットの喪失によって特徴付けられる「部分的疲弊Ｉ」期に入る。第２の段階では、部分的に疲弊したＴ細胞が「部分的疲弊ＩＩ」期に入り、抗原刺激後にＩＬ−２およびＴＮＦα両方の産生が終わり、ＩＦＮγ産生が低減する。「完全疲弊」または「末期疲弊」は、抗原刺激後に、ＩＬ−２、ＴＮＦα、およびＩＦＮγの産生の欠如、ならびにｅｘｖｉｖｏ溶解能力および増殖ポテンシャルの喪失を含め、ＣＤ８＋Ｔ細胞が全てのエフェクター機能を喪失すると起こる。完全に疲弊したＣＤ８＋Ｔ細胞とは、通常の入力シグナルに応答して、増殖、標的細胞の溶解（細胞傷害）、および／またはＩＬ−２、ＴＮＦα、もしくはＩＦＮγなどの適切なサイトカインの産生を行わないものである。このようなエフェクター機能の欠如は、抗原負荷が高く、かつ／またはＣＤ４の助けが少ないときに起こりうる。この階層的な機能喪失は、例えばＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３などの共阻害分子（ｃｏ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）免疫受容体の発現にも関連している（Dayら（２００６年）、Nature、４４３巻：３５０〜４頁；Trautmannら（２００６年）、Nat. Med.、１２巻：１１９８〜２０２頁；およびUrbaniら（２００６年）、J. Virol.、８０巻：１３９８〜１４０３頁）。末期疲弊T細胞のマーカーとしてのエオメソデルミン（ＥＯＭＥＳ）の高発現およびＴＢＥＴの低発現など、他の分子マーカーも免疫細胞疲弊の階層的段階を区別する（Paleyら（２０１２年）、Science、３３８巻：１２２０〜１２２５頁）。疲弊T細胞のさらなるマーカーには、Ｂｃｌ−ｂの低減およびＢＬＩＭＰ−１（Ｐｄｒｍ１）の産生増加などがある。

加えて、Ｔｒｅｇおよび／またはＴｅｆｆは、単一源または複数源（例えば、単一の対象または複数の対象）から得ることができる。複数とは、少なくとも２つ（例えば、１つより多く）を指す。さらに別の実施形態では、非ヒト哺乳動物はマウスである。目的の細胞型が得られる動物は、成体、新生児（例えば、生後４８時間未満）、発育中、または子宮内のものであってもよい。目的の細胞型は、初代細胞、幹細胞、樹立がん細胞株、不死化初代細胞などでありうる。

ある特定の実施形態では、目的のＴ細胞は、特定源から得ることができる。例えば、免疫障害の哺乳類動物モデルを目的のＴ細胞の源として使用してもよい。別の例では、宿主対象の免疫系を改変ないしは選出して、移植細胞と免疫学的適合性があるようにすることができる。例えば、一実施形態では、対象は、ヒト細胞と適合性になるように「ヒト化」されうる。「免疫系ヒト化」という用語は、ヒトのＨＳＣ系列細胞ならびにヒトの獲得免疫細胞および自然免疫細胞を含むマウスなどの動物が、宿主動物に拒絶されることなく生存することにより、ヒトの造血発生ならびに獲得免疫および自然免疫の両方が宿主動物において再構成可能になることを指す。獲得免疫細胞は、Ｔ細胞およびＢ細胞を含む。自然免疫細胞は、マクロファージ、顆粒球（好塩基球、好酸球、および好中球）、ＤＣ、ＮＫ細胞およびマスト細胞を含む。代表的な非限定的例としては、ＳＣＩＤ−ｈｕ、Ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤ、Ｈｕ−ＳＲＣ−ＳＣＩＤ、ＮＳＧ（ＮＯＤ−ＳＣＩＤＩＬ２ｒ−ガンマ（ヌル）は、自然免疫系、Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびサイトカインシグナル伝達を欠く）、ＮＯＧ（ＮＯＤ−ＳＣＩＤＩＬ２ｒ−ガンマ（短縮型））、ＢＲＧ（ＢＡＬＢ／ｃ−Ｒａｇ２（ヌル）ＩＬ２ｒ−ガンマ（ヌル））、およびＨ２ｄＲＧ（Ｓｔｏｃｋ−Ｈ２ｄ−Ｒａｇ２（ヌル）ＩＬ２ｒ−ガンマ（ヌル））マウス（例えば、Shultzら（２００７年）、Nat.Rev. Immunol.、７巻：１１８頁；Pearsonら（２００８年）、Curr. Protocol. Immunol.、１５巻：２１頁；Brehmら（２０１０年）、Clin. Immunol.、１３５巻：８４〜９８頁；McCuneら（１９８８年）、Science、２４１巻：１６３２〜１６３９頁、米国特許第７，９６０，１７５号、および米国特許公開第２００６／０１６１９９６号を参照されたい）、ならびにＲａｇ１（Ｂ細胞およびＴ細胞を欠く）、Ｒａｇ２（Ｂ細胞およびＴ細胞を欠く）、ＴＣＲアルファ（Ｔ細胞を欠く）、パーフォリン（ｃＤ８＋Ｔ細胞は細胞傷害機能を欠く）、ＦｏｘＰ３（機能的ＣＤ４＋調節性Ｔ細胞を欠く）、ＩＬ２ｒｇ、またはＰｒｆｌなどの免疫関連遺伝子の関連するヌル変異体、ならびにＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、Ｔｉｍ３、および／または２Ｂ４の変異体またはノックアウトが挙げられ、ヒト免疫細胞の効率的な生着を可能にし、かつ／またはマウスなどの免疫低下動物のコンパートメント特異的モデルを提供する（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１３／０６２１３４を参照されたい）。加えて、ＮＳＧ−ＣＤ３４＋（ＮＯＤ−ＳＣＩＤＩＬ２ｒ−ガンマ（ヌル）ＣＤ３４＋）ヒト化マウスは、マウスなどの動物モデルにおいてヒト遺伝子および腫瘍活性を研究するために有用である。

本明細書で使用される場合、生物学的物質源から「得られる」とは、生物学的物質の源をドナーから採取または分割する任意の従来型方法を意味する。例えば、生物学的物質は、固形腫瘍、血液試料、例えば末梢血または臍帯血試料から得られても、骨髄または羊水などの別の体液から採取されてもよい。このような試料を得るための方法は、当業者には周知である。本発明では、試料は新鮮である（すなわち、冷凍することなくドナーから得られる）場合がある。さらに、試料をさらに操作して、拡大前に外来性または不要な成分を除去してもよい。試料はまた、貯蔵されたストックから得られてもよい。例えば、細胞株または末梢血もしくは臍帯血などの流体の場合、かかる細胞株または流体の低温貯蔵バンクまたはその他の貯蔵バンクから試料が引き出されてもよい。このような試料は、任意の好適なドナーから得ることができる。

周知の免疫細胞の特徴を使用して、目的のＴ細胞を精製、濃縮、および／または単離することができる。「濃縮Ｔ細胞」とは、他の細胞および／またはＴ細胞に対して所望されるＴ細胞集団（例えば、本発明の操作T細胞）を、組成物中の所望されるＴ細胞の他の細胞に対する比が、少なくとも１：２、１：１．９、１：１．８、１：１．７、１：１．６、１：１．５、１：１．４、１：１．３、１：１．２、１：１．１、１：１、１：０．９、１：０．８、１：０．７、１：０．６、１：０．５、１：０．４、１：０．３、１：０．２、１：０．１、もしくはそれよりも高い、またはその間の任意の範囲もしくはその間の任意の値となるような割合で含む、組成物を指す。このような比は、Ｔ細胞を含む組成物を様々な方法論により精製することによって実現されうる。例えば、Ｔｒｅｇの精製は、ＣＤ８＋およびＣＤ１９＋の共枯渇（ｃｏ−ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）をＣＤ２５＋細胞の正の選択と組み合わせて使用して行うことができる。このような濃縮Ｔｒｅｇは、細胞マーカーおよび／または生存率という観点でさらに定義することができる。例えば、濃縮Ｔｒｅｇ細胞組成物は、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％超、またはそれよりも高い、またはその間の任意の範囲もしくはその間の任意の値の、全細胞生存率を有しうる。これは、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％超、またはそれよりも多く、またはその間の任意の範囲もしくはその間の任意の値の、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を含みうる。これは、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％超、またはそれよりも多く、またはその間の任意の範囲もしくはその間の任意の値の、ＦｏｘＰ３＋細胞を含みうる。Ｔｒｅｇは、本明細書に記述される任意の好適なルート、例えば注入によって投与されうる。Ｔｒｅｇはまた、他の免疫調整剤の前に、それと同時に、またはその後に投与されてもよい。このような方法論および測定基準は、当技術分野で周知の方法を使用して、いかなる目的のＴ細胞集団にも適応されうる。

一実施形態では、フローサイトメトリーとも称される蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用して、様々な細胞集団を分取および分析する。細胞性マーカーまたは他の目的の特異的マーカーを有する細胞を、その細胞性マーカーに結合する抗体または典型的には抗体の混合物でタグ付けする。異なるマーカーを指向する各抗体を、検出可能な分子、特に、他の抗体と共役した他の蛍光染料から区別されうる蛍光染料にコンジュゲートする。蛍光色素を励起する光源に一連のタグ付けまたは「染色された」細胞を通過させ、細胞からの発光スペクトルを検出して、特定の標識抗体の存在を決定する。当技術分野ではマルチカラー蛍光細胞分取とも称される、異なる蛍光色素の同時検出により、異なる一組の細胞マーカーを提示する細胞を特定し、集団内の他の細胞から単離することができる。限定としてではなく例として、側方散乱（ＳＳＣ）、前方散乱（ＦＳＣ）、および生体染料染色（例えば、ヨウ化プロピジウムによるもの）を含む他のＦＡＣＳパラメータは、サイズおよび生存率に基づく細胞の選択を可能にする。ＨＳＣおよび関連する系列細胞のＦＡＣＳ分取および分析は当技術分野で周知であり、例えば、米国特許第５，１３７，８０９号、同第５，７５０，３９７号、同第５，８４０，５８０号、同第６，４６５，２４９号；Manzら（２００２年）、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、９９巻：１１８７２〜１１８７７頁；およびAkashiら（２０００年）、Nature、４０４巻：１９３〜１９７頁に記述されている。蛍光標識細胞分取に関する一般的指針は、例えば、Shapiro（２００３年）、Practical Flow Cytometry、第４版、Wiley-Liss（２００３年）およびOrmerod（２０００年）、Flow Cytometry: A Practical Approach、第３版、Oxford University Pressに記述されている。

有用な細胞集団を単離する別の方法は、特異的な細胞表面マーカーと相互作用する抗体またはリガンドが結合する固体または不溶性の基質を用いる。免疫吸着技術では、抗体を含有する基質（例えば、ビーズのカラム、フラスコ、磁性粒子など）に細胞を接触させ、結合していない細胞を全て除去する。免疫吸着技術は、臨床的採取において多数の細胞を直接扱うようにスケールアップしてもよい。好適な基質は、限定としてではなく例として、プラスチック、セルロース、デキストラン、ポリアクリルアミド、アガロース、および当技術分野で公知の他のもの（例えば、ＰｈａｒｍａｃｉａＳｅｐｈａｒｏｓｅ６ＭＢマクロビーズ）を含む。磁性または常磁性のビーズを含む固体基質を使用した場合、ビーズに結合した細胞は、磁性分離器によって容易に単離されうる（例えば、KatoおよびRadbruch（１９９３年）、Cytometry、１４巻：３８４〜９２頁）。親和性クロマトグラフィー細胞分離は、表面に選択的リガンドが固定化された支持体に細胞の懸濁液を通すことを典型的に含む。リガンドは、細胞上のその特異的標的分子と相互作用し、マトリックス上に捕捉される。結合した細胞は、カラムの泳動緩衝液への溶出剤の添加によって遊離し、遊離細胞がカラムを通して洗い流され、均質な集団として採取される。当業者には明らかであるように、吸着技術は、特異的抗体を用いるものに限定されず、非特異的な吸着を使用する場合がある。例えば、シリカへの吸着は、細胞調製物から食細胞を除去するための単純な手順である。

ＦＡＣＳおよびほとんどのバッチ式免疫吸着技術は、正の選択および負の選択両方の手順に適応されうる（例えば、米国特許第５，８７７，２９９号を参照されたい）。正の選択では、所望の細胞を抗体で標識し、残りの未標識／不要な細胞から除去する。負の選択では、不要な細胞を標識して除去する。用いることのできる負の選択の別の種類は、不要な細胞を除去するための抗体／補体処置または免疫毒素の使用である。

細胞の精製または単離は、上述の方法の組合せも含むことを理解されたい。典型的な組合せは、不要な細胞および細胞物質の大部分を除去するのに有効な初期手順、例えば白血球除去を含みうる。第２のステップは、前駆細胞集団のうちの１つまたは複数に一般的なマーカーを発現する細胞の、基質に結合した抗体の免疫吸着による単離を含みうる。所望される細胞の実質的に純粋な集団を得るために、一組の特異的細胞性マーカーに対する抗体を用いたＦＡＣＳ分取など、異なる細胞型の分解能を上昇させるさらなるステップを使用してもよい。

目的の細胞は、本発明に従って遺伝子修飾することができ、ここで生物または細胞のゲノムは、本発明のバイオマーカーの発現および／または活性を修飾するように操作されうる。本発明による「操作T細胞」は、例えば、ゲノム領域を含むように遺伝子修飾された目的のＴ細胞であって、ゲノム領域が、１）少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現を調節し、２）哺乳動物由来の目的のＴ細胞（例えば、哺乳動物由来の疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞）のゲノム内で選択的にクロマチン接近可能であり、ゲノム領域が遺伝子修飾されており、遺伝子修飾が少なくとも１つの遺伝子の発現を調整する、目的のＴ細胞である。例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、実施例に記述される疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞において選択的にクロマチン接近可能である疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞選択的なＰＤ−１ゲノム遺伝子発現エンハンサー、または別の哺乳動物におけるそのオルソログを修飾する（例えば、欠失させる）ことにより、疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞により高レベルで発現されるＰＤ−１の発現および／または活性を調整するために、組換え技術を使用して遺伝子修飾されていてもよい。

一実施形態では、遺伝子修飾は、ゲノム遺伝子の発現調節領域の全てまたは一部分の欠失である。欠失は、それ自体における欠失であってもよいし、または遺伝子修飾前のゲノム遺伝子の発現調節領域内に存在しない配列を挿入することによる事実上の欠失であってもよい。実施例に記述されるように、転写因子はクロマチン接近可能なゲノム遺伝子の発現調節領域に結合することが公知であり、この領域またはその一部分の実際の欠失または推定的欠失は、転写因子が目的の遺伝子に結合し、その遺伝子発現調節を媒介する能力を妨害する。この領域のいかなる部分の欠失も、目的の遺伝子の遺伝子発現調節を調整すると考えられている。後述されるように、遺伝子修飾によりもたらされる遺伝子発現調整量を決定するためのアッセイは、当技術分野において日常的である。エンハンサーゲノム領域の欠失は目的の遺伝子の転写を低減させるが、サプレッサーゲノム領域の欠失は目的の遺伝子の転写を増加させる。同様に、エンハンサーゲノム領域を安定化させるゲノム修飾、例えば、転写因子結合モチーフの配列を最適化することによる転写因子との接触点の強化は、エンハンサーゲノム領域では目的の遺伝子の転写を低減させ、サプレッサーゲノム領域においては目的の遺伝子の転写を減少させる。

ゲノム編集方法は当技術分野で周知である。例えば、ターゲティングによる、またはターゲティングによらない遺伝子ノックアウト法を使用して、例えば、対象への注入の前に対象のＴｒｅｇをｅｘｖｉｖｏで組換え操作することができる。例えば、レトロウイルス挿入、人工染色体技術、遺伝子挿入、組織特異的プロモーターを用いたランダム挿入、遺伝子ターゲティング、転位エレメント、および／または外来ＤＮＡの導入もしくは修飾ＤＮＡ／修飾核ＤＮＡの産生のための任意の他の方法を使用して、欠失、挿入、および／または変異によってゲノム内の標的ＤＮＡを操作することができる。

他の修飾技術は、ゲノムからＤＮＡ配列を欠失させること、および／または核ＤＮＡ配列を変化させることを含む。例えば、相同組換えを使用した部位指向性変異誘発により、核ＤＮＡ配列を変化させてもよい。このような方法は一般に、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞を使用する。「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書では互換的に使用される。これらの用語は、特定の対象細胞のみならず、このような細胞の子孫または潜在的な子孫も指すものと理解される。ある特定の修飾は変異あるいは環境的影響に起因して後の世代で生じうるため、このような子孫は実際には親細胞と同一でない場合があるが、それでも、本明細書で使用されるこの用語の範囲内に含まれる。ベクターＤＮＡは、従来型の形質転換またはトランスフェクション技術により、原核細胞または真核細胞に導入することができる。

本明細書で使用される「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウム共沈もしくは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔を含む、宿主細胞に外来核酸を導入するための当技術分野で認識されている多様な技術を指すことを意図する。宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションを行うための好適な方法は、Sambrookら（上記）および他の実験室マニュアルに見出すことができる。哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションでは、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に応じて、小さな割合の細胞のみが外来ＤＮＡをそれらのゲノムに統合されうることが公知である。これらの統合体を特定し選択するためには一般に、選択可能マーカー（例えば、抗生物質への抵抗性に関するもの）をコードする遺伝子が目的の遺伝子と共に宿主細胞に導入される。好ましい選択可能マーカーとしては、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキサートなどの薬物に対する抵抗性を与えるものが挙げられる。導入された核酸が安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって特定することができる（例えば、選択可能マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存するが、その他の細胞は死亡する）。

同様に、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系がゲノム核酸の正確な編集のために（例えば、非機能的変異またはヌル変異を作出するために）使用されうる。このような実施形態では、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓ酵素が発現されうる。例えば、ガイドＲＮＡのみを含有するベクターを、Ｃａｓ９酵素に対してトランスジェニックな動物または細胞に投与してもよい。同様の戦略を使用してもよい（例えば、デザイナージンクフィンガー、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、またはホーミングメガヌクレアーゼ）。このような系は当技術分野で周知である（例えば、米国特許第８，６９７，３５９号；SanderおよびJoung（２０１４年）、Nat. Biotech.、３２巻：３４７〜３５５頁；Haleら（２００９年）、Cell、１３９巻：９４５〜９５６頁；KarginovおよびHannon（２０１０年）、Mol. Cell、３７巻：７頁；米国特許公開第２０１４／００８７４２６号および同第２０１２／０１７８１６９号；Bochら（２０１１年）、Nat. Biotech.、２９巻：１３５〜１３６頁；Bochら（２００９年）、Science、３２６巻：１５０９〜１５１２頁；MoscouおよびBogdanove（２００９年）、Science、３２６巻：１５０１頁；Weberら（２０１１年）、PLoS One 6：ｅ１９７２２頁；Liら（２０１１年）、Nucl. Acids Res.、３９巻：６３１５〜６３２５頁；Zhangら（２０１１年）、Nat. Biotech.、２９巻：１４９〜１５３頁；Millerら（２０１１年）、Nat. Biotech.、２９巻：１４３〜１４８頁；Linら（２０１４年）、Nucl. Acids Res.、４２巻：ｅ４７頁を参照されたい）。このような遺伝子戦略は、当技術分野で周知の方法に従い、構成的発現系を使用する場合もあれば、誘導性発現系を使用する場合もある。

得られた細胞集団は、直接使用しても、後日使用するために冷凍してもよい。凍結保存のための多様な媒体およびプロトコールが当技術分野では公知である。一般に、冷凍媒体は、約５〜１０％のＤＭＳＯ、１０〜９０％の血清アルブミン、および５０〜９０％の培養培地を含む。細胞を貯蔵するために有用な他の添加物は、限定としてではなく例として、トレハロースなどの二糖類（Scheinkonigら（２００４年）、Bone Marrow Transplant.、３４巻：５３１〜５３６頁）、またはヘタスターチ（すなわち、ヒドロキシエチルデンプン）などの血漿増量剤を含む。一部の実施形態では、リン酸緩衝食塩水などの等張緩衝液を使用してもよい。例示的な凍結保存用組成物は、４％のＨＳＡ、７．５％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、および２％のヘタスターチを含む細胞培養培地を有する。凍結保存のための他の組成物および方法は当技術分野で周知であり、記述されている（例えば、Broxmeyerら（２００３年）、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、１００巻：６４５〜６５０頁を参照されたい）。細胞は、約−１３５℃未満の最終温度で貯蔵される。

ＩＶ．遺伝子発現および操作T細胞の機能の分析
少なくとも１つの目的の遺伝子の遺伝子発現の調整、ならびにＴ細胞機能は、当技術分野で周知の方法に従い、また実施例に例示されるように決定することができる。例えば、Ｔ細胞活性、増殖、アポトーシス、サイトカイン産生レパートリー、細胞表面マーカー発現などが分析されうる。さらに、リンパ球サブセットの表現型分析、免疫応答の低減につながる免疫調整の機能的アッセイ、血漿サイトカインなどが、本明細書にさらに記述されるように分析されうる。特に、免疫応答、転移、疾患寛解、疾患再発、腫瘍再発、死、自己免疫、アレルギー（例えば、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、花粉アレルギー、食物アレルギーなど）、ワクチン接種応答、免疫耐性、免疫疲弊、免疫記憶、免疫学的エピトープ応答、サイトカイン応答、細胞の相対的表示、遺伝的摂動、および／または他の免疫効果の調整といった、本明細書に記述される方法の結果を決定するための方法は、当技術分野で周知であり、本明細書に記述されるとおりである。例えば、標的核酸遺伝子発現および／または目的の配列の決定は、当技術分野で公知の多様な配列決定方法を使用して行うことができる。好ましい実施形態では、特定の遺伝的摂動は、核酸またはその産物（例えば、ｍＲＮＡ）の測定によって特徴付けられる。マーカー発現は多様な方法でモニタリングすることができ、その方法にはｍＲＮＡレベル、タンパク質レベル、またはタンパク質活性を検出することが含まれ、これらはいずれも標準的な技術を使用して測定されうる（例えば、Ausubelら編、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、New York、１９８７〜１９９９年を参照されたい）。検出は、遺伝子発現レベル（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質、または酵素の活性）の数量化を含む場合もあれば、代替的に、遺伝子発現レベルの、特に対照レベルと比較した定性的査定である場合もある。検出されているレベルの種類は文脈から明らかであろう。様々な増幅法および検出法を使用してもよい。例えば、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した後にポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いること、または、米国特許第５，３２２，７７０号に記述されるように両方のステップに単一の酵素を使用すること、または、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した後に対称ギャップリガーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＡＧＬＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、リガーゼ連鎖反応（Barany、１９９１年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８８巻：１８９〜１９３頁）、自家持続配列複製（Guatelliら、１９９０年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８７巻：１８７４〜１８７８頁）、転写増幅系（Kwohら、１９８９年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８６巻：１１７３〜１１７７頁）、Ｑ−ベータレプリカーゼ（Lizardiら、１９８８年、Bio/Technology、６巻：１１９７頁）、ローリングサークル複製（Lizardiら、米国特許第５，８５４，０３３号）、標的媒介増幅、自家持続配列複製（ＳＳＲ）、転写増幅などを用いることは、本発明の範囲内である。当技術分野の現状において、遺伝子発現の絶対的レベルおよび相対的レベルを決定するための多くの技術が公知であり、本発明において使用するのに好適な一般的に使用される技術は、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション、マイクロアレイ、チップアレイ、遺伝子発現連続解析（ＳＡＧＥ）、ノーザン分析、ＲＮアーゼ保護アッセイ（ＲＰＡ）、マイクロアレイおよびＰＣＲに基づく技術、例えば定量的ＰＣＲおよびディファレンシャルディスプレイＰＣＲを含む。例えば、ノーザンブロッティングは、変性アガロースゲルでＲＮＡの調製物を泳動させ、活性化セルロース、ニトロセルロース、またはガラスもしくはナイロン膜などの好適な支持体にそれを移すことを含む。次いで、放射標識したｃＤＮＡまたはＲＮＡを調製物とハイブリダイズさせ、洗浄し、オートラジオグラフィによって分析する。

ある特定の実施形態では、核酸の検出は、ハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ：ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｂｙｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、ライゲーションによる配列決定（ＳＢＬ：ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｂｙｌｉｇａｔｉｏｎ）、定量的増分蛍光ヌクレオチド付加配列決定（ＱＩＦＮＡＳ：ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｄｄｉｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、段階的ライゲーションおよび切断、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、分子ビーコン、ＴａｑＭａｎ（登録商標）レポータープローブ消化、パイロシークエンシング、蛍光ｉｎｓｉｔｕ配列決定（ＦＩＳＳＥＱ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｉｎｓｉｔｕｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、ＦＩＳＳＥＱビーズ（米国特許第７，４２５，４３１号）、ゆらぎ配列決定（ｗｏｂｂｌｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＰＣＴ／ＵＳ０５／２７６９５）、マルチプレックス配列決定（２００８年２月６日出願の米国特許出願第１２／０２７，０３９号；Porrecaら（２００７年）、Nat. Methods、４巻：９３１頁）、重合コロニー（ＰＯＬＯＮＹ）配列決定（米国特許第６，４３２，３６０号、同第６，４８５，９４４号、および同第６，５１１，８０３号、ならびにＰＣＴ／ＵＳ０５／０６４２５）；ナノグリッドローリングサークル配列決定（ＲＯＬＯＮＹ）（２００８年５月１４日出願の米国特許出願第１２／１２０，５４１号）、対立遺伝子特異的オリゴライゲーションアッセイ（例えば、オリゴライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）、ライゲーションされた線形プローブおよびローリングサークル増幅（ＲＣＡ）の読み取りを使用した単一鋳型分子ＯＬＡ、ライゲーションされたパッドロックプローブ、ならびに／またはライゲーションされた環状パッドロックプローブおよびローリングサークル増幅（ＲＣＡ）の読み取りを使用した単一鋳型分子ＯＬＡ）などを含むがこれらに限定されない方法を使用して達成されうる。ハイスループット配列決定法、例えば、Ｒｏｃｈｅ４５４、ＩｌｌｕｍｉｎａＳｏｌｅｘａまたはＭｉＳｅｑもしくはＨｉＳｅｑ、ＡＢ−ＳＯＬｉＤ、Ｈｅｌｉｃｏｓ、Ｐｏｌｏｎａｔｏｒプラットフォームなどのプラットフォームを使用した環式アレイ配列決定でのハイスループット配列決定法も、利用することができる。ハイスループット配列決定法は、２００９年３月２４日出願の米国特許出願第６１／１６２，９１３号に記述されている。多様な光に基づく配列決定技術が当技術分野で公知である（Landegrenら（１９９８年）、Genome Res.、８巻：７６９〜７６頁；Kwok（２０００年）、Pharmocogenom.、１巻：９５〜１００頁；およびShi（２００１年）、Clin. Chem.、４７巻：１６４〜１７２頁）（例えば、米国特許公開第２０１３／０２７４１１７号、同第２０１３／０１３７５８７号、および同第２０１１／００３９３０４号を参照されたい）。

同様に、目的のポリペプチドおよび／または細胞は、フローサイトメトリー、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）、蛍光顕微鏡法、検出可能細胞バーコード技術（ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅｃｅｌｌｂａｒｃｏｄｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（米国特許公開第２０１１／０２６３４５７号）、免疫拡散法、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、ウェスタンブロッティング、結合剤−リガンドアッセイ、免疫組織化学技術、凝集、補体アッセイ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、超拡散（ｈｙｐｅｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィーなどを含むがこれらに限定されない、当技術分野で周知の多くの方法に従って区別することができる（例えば、参照により組み込まれている、「Basic and Clinical Immunology」、SitesおよびTerr編、Appleton and Lange、Norwalk、Conn.、２１７〜２６２頁、１９９１年）。抗体を１つのエピトープまたは複数のエピトープと反応させ、標識されたポリペプチドまたはその誘導体を競合的に転置することを含む、結合剤−リガンドイムノアッセイ法が好ましい。

加えて、操作T細胞のＴ細胞機能は、実施例にさらに記述されるように、当技術分野で周知の方法に従って査定することができる。例えば、操作T細胞は、活性化に関するＴ細胞活性、応答性、および／または能力もしくは受容性の増加につながる所与の処置または一組の状態を指す、「低減した疲弊」または「低減した無応答性」について査定されうる。Ｔ細胞活性は、Ｔ細胞とリコール抗原、共刺激の非存在下の抗ＣＤ３、および／またはイオノマイシンを接触させることによって測定することができる。また、Ｔ細胞の増殖は、例えば、^３Ｈ−チミジン組み込みアッセイまたは細胞数によりアッセイされた関連性のある抗原の存在下で測定されうる。関連性のある抗原への曝露後のＴ細胞活性化のマーカーはまた、例えば、Ｔ細胞活性化を示す細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ６９、ＣＤ３０、ＣＤ２５、およびＨＬＡ−ＤＲ）および／またはＴ細胞疲弊を示す細胞表面マーカーのフローサイトメトリー分析によってアッセイすることができる。一部の実施形態では、アッセイは、例えば免疫細胞をｉｎｖｉｖｏで抗原チャレンジすることによるｉｎｖｉｖｏアッセイでありうる。例えば、ＴＣＲトランスジェニックおよび他のトランスジェニックマウスのＴ細胞の均質集団を発現する動物モデル、例えば、Ｈ−Ｙ抗原ＴＣＲトランスジェニック；ハトチトクロムＣ抗原ＴＣＲトランスジェニック；またはヘマグルチニン（ＨＡ）ＴＣＲトランスジェニックは、移入されるＴ細胞によって認識される抗原を構成的に発現する宿主に移入されうる。このようなモデルでは、レシピエントマウスにより構成的または誘導的に発現される抗原に特異的なＴＣＲを発現するＴ細胞は、典型的には、即時拡大および増殖期に続いて無応答性期間に入るが、これは、抗原が除去されたとき、および／または抗原発現が阻害されたときに逆転する。したがって、Ｔ細胞がアッセイにおいて（例えば、免疫調整剤のさらなる処置ありまたはなしで）対照Ｔ細胞よりも著しく増殖または拡大したり、サイトカイン活性を示したりすれば、Ｔ細胞疲弊は低減している。このような増殖の測定は、抗原を発現するレシピエント動物に移入される前の増殖の追跡を可能にするＢｒＤＵ、ＣＦＳＥ、もしくは別の生体内染料で標識されたＴ細胞、またはサイトカインレポーターＴ細胞を使用してｉｎｖｉｖｏで行ってもよいし、あるいは、細胞増殖および／またはサイトカイン産生を分析するためのｅｘｖｉｖｏ法、例えばチミジン増殖アッセイ、ＥＬＩＳＡ、サイトカインビーズアッセイなどを使用して行ってもよい。さらに、免疫細胞疲弊の低減は、腫瘍浸潤リンパ球または確立した腫瘍から流れ出るリンパ節内のＴリンパ球の検査により査定することができる。このようなＴ細胞は、例えば、上述の免疫阻害性受容体などの細胞表面分子の発現および上述のものなどのサイトカインの分泌減少による疲弊の特色を呈する。したがって、例えば、１）（例えば、腫瘍関連ペプチドを含有する主要組織適合抗原クラスＩまたはクラスＩＩの四量体によって決定される）腫瘍関連抗原に対する抗原特異性を有するＴ細胞の分量および／または活性の増加が観察され、かつ／または２）高レベルの適切なサイトカインおよび細胞溶解性エフェクター分子、例えばグランザイムＢを分泌する能力があるＴ細胞の分量および／または活性の増加が観察されれば、Ｔ細胞疲弊は低減している。

Ｖ．対象のＴ細胞疲弊を調整し免疫障害を処置する治療法
本明細書では、１）少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現を調節し、かつ２）哺乳動物由来の疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞のゲノム内に存在するゲノム領域を含むように、Ｔ細胞を遺伝子操作することであって、ゲノム領域が遺伝子修飾されており、遺伝子修飾が少なくとも１つの遺伝子の発現を調整するように、遺伝子操作することが明示される。このようなＴ細胞疲弊状態特異的な遺伝子発現の調整は、Ｔ細胞疲弊を調整（例えば、防止または逆転）しうる。Ｔ細胞疲弊の調整は、対象の免疫障害を処置するために使用することができる。遺伝子操作T細胞は、単独で使用されても、あるいは抗体、小分子、ペプチド、ペプチド模倣薬、天然リガンド、低分子非コードＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ、プリｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ＊、抗ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ結合部位など、ＲＮＡ干渉、アンチセンス、核酸アプタマー、リボザイムなどを含む、本明細書に記述される他のＴ細胞疲弊および／または免疫障害調整剤と組み合わせて使用されてもよい。

ａ．対象
一実施形態では、対象は哺乳動物（例えば、マウス、ラット、霊長類、非ヒト哺乳動物、ならびにイヌ、ネコ、ウシ、およびウマなどの家畜）であり、好ましくはヒトである。成体の対象のほか、小児の対象も想定される。小児対象は、本明細書に記述されるように処置されるほか、最大で成体の対象に使用される用量の治療剤を使用して処置されてもよい。一部の実施形態では、対象は、免疫障害のマウスモデルなど、目的の障害の動物モデルを提示する哺乳動物である。

本発明の方法の別の実施形態では、対象は、抗免疫障害療法などの処置を受けたことがない。さらに別の実施形態では、対象は、このような処置を受けたことがある。なおも別の実施形態では、対象は、免疫適格性または免疫不適格性である。

「免疫適格性（応答性）」対象とは、抗原への曝露後に通常または所望の免疫応答を確立するのに要求される免疫細胞および免疫機能を含む対象である。一実施形態では、免疫適格性対象は、完全にインタクトな免疫系を有する野生型対象である。別の実施形態では、免疫適格性対象は、完全にインタクトであるが成熟中の免疫系を有する野生型対象（例えば、若年対象）である。さらに別の実施形態では、免疫適格性対象は、免疫系（例えば、獲得対自然および／または液性対細胞傷害性）の特異的なアームを使用して免疫応答を媒介するために要求されるインタクトな免疫系を有する。

「免疫不適格性」対象とは、１つもしくは複数の免疫細胞型を欠いているか、または抗原への曝露後に少なくとも１つの免疫応答の通常もしくは所望のレベルを確立するその免疫機能を欠いている対象である。免疫不適格性対象は、日和見感染、例えばウイルス、真菌、原虫、または細菌への感染、プリオン病、およびある特定の新生物の影響をより受けやすい。「免疫不全」対象とは、例えば重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスの場合にそうであるように、自然の宿主免疫応答をしかけることができない対象である。「免疫低下」対象は、免疫適格性対象と比べて少なくとも１つの免疫学的機能が実質的に低減している。いずれの場合においても、免疫学的機能および／もしくは細胞型の低減または非存在は、多くの異なる周知の方式から生じうる。例えば、全ての免疫細胞およびそれらのあらゆる突起を生み出す造血幹細胞（ＨＳＣ）は、発生、機能、分化、生存期間などにおいて悪影響を受ける場合がある。

免疫不適格性対象は、当技術分野で周知の多くの異なる方法において生成することができる。それらは、多数の組合せにおける様々なパラメータの機能および／または数を調整することから生じうる。例えば、所望の免疫不適格性をもたらすために、休止中、有糸分裂中、高分化型、有糸分裂後、未活性化型、活性化型などの免疫細胞集団が調整のためにターゲティングされうる。「休止」細胞とは、非複製状態にある非周期細胞を指す。休止細胞は活性化すると複製し分裂する能力を有しうるが、非周期細胞であるため不活発である。したがって、「休止」細胞は、分裂するよう刺激され、次いで不活発な非分裂期に戻るように操作された、単純に操作された免疫細胞ではない。休止細胞は「ナイーブ」である場合があり、これは、それらが骨髄で分化し、胸腺内で正の選択および負の選択を受けることに成功し、成熟しているが活性化されておらず、メモリー細胞ではない免疫細胞であることを意味する。ナイーブＴ細胞は一般的に、Ｌ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）の表面発現；活性化マーカー、ＣＤ２５、ＣＤ４４、またはＣＤ６９の非存在；およびメモリーＣＤ４５ＲＯアイソフォームの非存在によって特徴付けられる。それらはまた、ＩＬ−７受容体−αのＣＤ１２７、および共通γ鎖のＣＤ１３２のサブユニットからなる、機能的ＩＬ−７受容体を発現する。ナイーブ状態において、Ｔ細胞は、不活発で非分裂性であり、恒常的生存機構のために共通ガンマ鎖サイトカインであるＩＬ−７およびＩＬ−１５を要求すると考えられている。対照的に、活性化Ｔ細胞は、表面マーカーであるＣＤ２５、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ^ｌｏｗ、およびＣＤ６９を発現するか、またはそれらの発現を上方制御し、メモリーＴ細胞にさらに分化する場合がある。ナイーブＢ細胞は抗原に曝露されたことがないものであるが、これは、それらが抗体を分泌するメモリーＢ細胞または血漿細胞のいずれかになるためである。一実施形態では、休止細胞は繁殖状態または倍加状態に入るよう誘起されると「活性化」され、細胞周期、細胞分裂、または有糸分裂に入っている細胞を含みうる。別の実施形態では、休止細胞は、免疫応答を生成する高分化型の成熟免疫学的細胞の活性（例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞機能）を開始する抗原またはサイトカインなどの外部シグナルに出会うと「活性化」される場合もある。

一実施形態では、かかる対象は、規定または未確定の遺伝子修飾によって得られる。このような遺伝子修飾の代表的な非限定的例は、免疫低下動物に関して上述されている。さらに、「重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）」という用語は、Ｔ細胞の非存在およびＢ細胞機能の欠如によって特徴付けられる状態を指す。遺伝子修飾により引き起こされるＳＣＩＤの一般的形態としては、ＩＬ２ＲＧ遺伝子におけるガンマ鎖遺伝子変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（＋）ＮＫ（−）により特徴付けられるＸ連鎖ＳＣＩＤ；ならびにＪａｋ３遺伝子変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（＋）ＮＫ（−）、ＡＤＡ遺伝子変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（−）ＮＫ（−）、ＩＬ−７Ｒアルファ鎖変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（＋）ＮＫ（＋）、ＣＤ３デルタまたはイプシロン変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（＋）ＮＫ（＋）、ＲＡＧ１／ＲＡＧ２変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（−）ＮＫ（＋）、Ａｒｔｅｍｉｓ遺伝子変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（−）ＮＫ（＋）、ＣＤ４５遺伝子変異およびリンパ球表現型Ｔ（−）Ｂ（＋）ＮＫ（＋）により特徴付けられる常染色体劣性ＳＣＩＤが挙げられる。別の例では、免疫不全である遺伝子修飾された対象は、一般的にｓｃｉｄ変異と称される重症複合免疫不全症変異、Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄを有する（例えば、Bosmaら（１９８９年）、Immunogenet.、２９巻：５４〜５６頁を参照されたい）。ｓｃｉｄ変異に対してホモ接合性であるマウスは、機能的Ｔ細胞およびＢ細胞の非存在、リンパ球減少症、低グロブリン血症、および正常な造血性微小環境によって特徴付けられる。ｓｃｉｄ変異は、例えば、周知の方法を使用したｓｃｉｄ変異のマーカーの検出により、検出されうる。

別の実施形態では、かかる対象は、免疫細胞機能または数の非遺伝的減耗（ｎｏｎ−ｇｅｎｅｔｉｃａｂｌａｔｉｏｎ）によって得られる。他の薬剤を使用して、免疫細胞機能または数を減耗させてもよい。例えば、高周波電磁放射の致死量以下の照射または致死的な照射でそれらをコンディショニングしてもよい。放射線は、電離放射線でありうる。放射線療法は、ガンマ線、Ｘ線、またはプロトンビームであってもよい。放射線療法の例としては、外照射療法、放射性同位元素（Ｉ−１２５、パラジウム、イリジウム）の組織内移植、ストロンチウム−８９などの放射性同位元素、胸部放射線療法、腹腔内Ｐ−３２放射線療法、ならびに／または全腹部および骨盤放射線療法が挙げられるが、これらに限定されない。放射線療法の概説については、Hellman、Chapter 16: Principles of Cancer Management: Radiation Therapy、第６版、２００１年、DeVitaら編、J. B. Lippencott Company、Philadelphiaを参照されたい。放射線療法は、外照射として施すことも、放射線が遠隔源から向けられる遠隔療法として施すこともできる。放射線処置はまた、内科療法として施すことも、放射能源が体内でがん細胞もしくは腫瘍塊の近くに配置される近接照射療法として施すこともできる。光感作薬、例えばヘマトポルフィリンおよびその誘導体、Ｖｅｒｔｏｐｏｒｆｉｎ（ＢＰＤ−ＭＡ）、フタロシアニン、光感作薬Ｐｃ４、デメトキシ−ヒポクレリンＡ；ならびに２ＢＡ−２−ＤＭＨＡの投与を含む、光線力学的療法の使用も包含される。

同様に、免疫細胞機能または数の非遺伝的減耗は、ブスルファンまたはナイトロジェンマスタードなどの放射線様作用薬での処置によってもたらされうる。他の免疫細胞細胞減少薬としては、とりわけ、シクロホスファミド、イホスファミド、エトポシド、シトシンアラビノシド、カルボプラチン、および他の化学療法剤が挙げられる（Montilloら（２００４年）、Leukemia、１８巻：５７〜６２頁；Dasguptaら（１９９６年）、J. Infusional Chemother.、６巻：１２頁；およびWrightら（２００１年）、Blood、９７巻：２２７８〜２２８５頁）。他のクラスの細胞減少薬としては、次の化合物群：白金化合物、細胞傷害性抗生物質、代謝拮抗薬、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、ヒ素化合物、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤、タキサン、ヌクレオシド類似体、植物アルカロイド、および毒素の中から選択されるもの；ならびにそれらの合成誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な化合物としては、アルキル化剤：シスプラチン、トレオスルファン、およびトロホスファミド；植物アルカロイド：ビンブラスチン、パクリタキセル、ドセタキセル（docetaxol）；ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤：テニポシド、クリスナトール、およびマイトマイシン；葉酸代謝拮抗薬：メトトレキサート、ミコフェノール酸、およびヒドロキシ尿素；ピリミジン類似体：５−フルオロウラシル、ドキシフルリジン、およびシトシンアラビノシド；プリン類似体：メルカプトプリンおよびチオグアニン；ＤＮＡ代謝拮抗薬：２’−デオキシ−５−フルオロウリジン、アフィディコリングリシネート、およびピラゾロイミダゾール；および有糸分裂阻害剤：ハリコンドリン、コルヒチン、およびリゾキシンが挙げられるが、これらに限定されない。１つまたは複数の化学療法剤（例えば、ＦＬＡＧ、ＣＨＯＰ）を含む組成物も使用されうる。ＦＬＡＧは、フルダラビン、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）、およびＧ−ＣＳＦを含む。ＣＨＯＰは、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、およびプレドニゾンを含む。別の実施形態では、ＰＡＲＰ（例えば、ＰＡＲＰ−１および／またはＰＡＲＰ−２）阻害剤が使用され、このような阻害剤は当技術分野で周知である（例えば、オラパリブ、ＡＢＴ−８８８、ＢＳＩ−２０１、ＢＧＰ−１５（Ｎ−ＧｅｎｅＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）；ＩＮＯ−１００１（ＩｎｏｔｅｋＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＩｎｃ．）；ＰＪ３４（Sorianoら、２００１年；Pacherら、２００２年ｂ）；３−アミノベンズアミド（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）；４−アミノ−１，８−ナフタルイミド（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）；６（５Ｈ）−フェナントリジノン（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）；ベンズアミド（米国特許第Ｒｅ．３６，３９７号）；およびＮＵ１０２５（Bowmanら）。作用機構は一般に、ＰＡＲＰに結合しその活性を減少させるＰＡＲＰ阻害剤の能力に関連している。ＰＡＲＰは、ベータ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）のニコチンアミドおよびポリ−ＡＤＰ−リボース（ＰＡＲ）への変換を触媒する。ポリ（ＡＤＰ−リボース）およびＰＡＲＰはいずれも、転写、細胞増殖、ゲノム安定性、および発癌の調節に結びつけられている（Bouchard V. J.ら、Experimental Hematology、３１巻、６号、２００３年６月、４４６〜４５４頁（９段）；Herceg Z.、Wang Z.-Q.、Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis、４７７巻、１号、２００１年６月２日、９７〜１１０頁（１４段））。ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ１）は、ＤＮＡ一本鎖破壊（ＳＳＢ）の修復における重要な分子である（de Murcia J.ら、１９９７年、Proc Natl Acad Sci USA、９４巻：７３０３〜７３０７頁；Schreiber V、Dantzer F、Ame J C、de Murcia G（２００６年）、Nat Rev Mol Cell Biol、７巻：５１７〜５２８頁；Wang Z Qら（１９９７年）、Genes Dev、１１巻：２３４７〜２３５８頁）。ＰＡＲＰ１機能の阻害によるＳＳＢ修復のノックアウトは、相同指向（ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ＤＳＢ修復に欠陥があるがん細胞の合成致死を誘起しうるＤＮＡ二本鎖破壊（ＤＳＢ）を誘導する（Bryant H Eら（２００５年）、Nature、４３４巻：９１３〜９１７頁；Farmer Hら（２００５年）、Nature、４３４巻：９１７〜９２１頁）。

免疫細胞機能または数の非遺伝的減耗は、免疫系媒介細胞集団を枯渇させる抗体などの薬剤での処置、または免疫系媒介細胞集団を優先的に枯渇させる薬剤での処置によってもたらされうる（例えば、Hayakawaら（２００９年）、Stem Cells、２７巻：１７５〜１８２頁を参照されたい）。例えば、抗ＣＤ４抗体および抗ＣＤ８抗体を使用して、それぞれ、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を中和および／または枯渇させることができる。同様に、抗ＣＤ３抗体は全てのＴ細胞を枯渇させるために使用することができ、抗Ｂ２２０抗体および／または抗ＣＤ１９抗体は全てのＢ細胞を枯渇させるために使用することができ、抗ＣＤ１１ｂ抗体はマクロファージを枯渇させるために使用することができ、抗Ｌｙ−６Ｇ（Ｇｒ−１）抗体は単球および顆粒球を枯渇させるために使用することができ、抗ＮＫ１．１抗体はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を枯渇させるために使用することができる。

１つもしくは複数の免疫細胞型または機能の免疫不適格性を確認するためのアッセイもまた、当技術分野で周知である。細胞の分化能、ひいては免疫細胞集団の存在または非存在を決定することは、典型的には、様々な高分化型細胞への発達を許容する条件に細胞を曝露することにより実施される。これらの条件は一般に、骨髄またはリンパ系列の発達を許容する培養培地中のサイトカインと増殖因子の混合物を含む。コロニー形成培養アッセイは、限界希釈を介して細胞をｉｎｖｉｔｒｏで培養すること、およびそれらの継続的発達から生じる細胞の型を査定することに依拠する。この種類の一般的なアッセイは、サイトカインを補充したメチルセルロース培地に基づく（例えば、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ、ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＣａｎａｄａおよびKennedyら（１９９７年）、Nature、３８６巻：４８８〜４９３頁）。造血性経路における分化を許容するサイトカインおよび増殖因子の製剤は、Manzら（２００２年）、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、９９巻：１１８７２〜１１８７７頁；米国特許第６，４６５，２４９号；およびAkashiら、Nature、４０４巻：１９３〜１９７頁に記載されている。サイトカインは、ＳＣＦ、ＦＬＴ−３リガンド、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＴＰＯ、およびＥＰＯを含む。別のｉｎｖｉｔｒｏアッセイは、典型的には造血発生を支援するためにストロマ細胞を使用する長期培養開始細胞（ＬＴＣ−ＩＣ）アッセイである（例えば、Ploemacheら（１９８９年）、Blood、７４巻：２７５５〜２７６３頁およびSutherlandら（１９９５年）、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、８７巻：３７４５頁を参照されたい）。

対象の免疫不適格状態を決定するのに好適な別の種類のアッセイは、宿主動物への細胞のｉｎｖｉｖｏ投与、および造血系の再増殖の査定に依拠する。レシピエントは、拒絶を制限するように免疫低下または免疫不全であり、同種または異種の細胞移植の受け入れを許容する。この種類の有用な動物系は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ（Pflumioら（１９９６年）、Blood、８８巻：３７３１頁；Szilvassymら（２００２年）、Methods in Molecular Medicineの「Hematopoietic Stem Cell Protocol」、Humana Press；Greinerら（１９９８年）、Stem Cells、１６巻：１６６〜１７７頁；Piacibelloら（１９９９年）、Blood、９３巻：３７３６〜３７４９頁）またはＲａｇ２欠損マウス（Shinkaiら（１９９２年）、Cell、６８巻：８５５〜８６７頁）である。注入された細胞を起源とする細胞は、宿主動物の骨髄、脾臓、または血液から細胞を回収し、典型的にはＦＡＣＳ分析によって、特異的な細胞性マーカーを提示する細胞の存在を決定すること（すなわち、マーカー表現型決定）により査定される。移植細胞に特異的なマーカーの検出により、内在性細胞と移植細胞との区別ができるようになる。例えば、ヒト形態の細胞マーカー（例えば、ＨＬＡ抗原）に対して特異的な抗体は、好適な免疫不全マウスに移植されると、ヒト細胞を特定する。

本発明の方法は、Ｔ細胞疲弊を防止するもしくは逆転させるため、免疫障害を処置するため、および／または本明細書に記述される遺伝子操作T細胞の投与に対するその応答性を決定するために使用されうる。活性化された免疫細胞の機能は、免疫細胞応答を下方制御すること、免疫細胞における特異的アネルギーを誘導すること、またはそれらの両方によって阻害されうる。

例えば、本発明の方法は、抗原とかかる方法の治療用組成物を共投与することにより特異的な抗原に対する耐性を誘導するために使用することができる。耐性は、特異的なタンパク質に対して誘導されうる。一実施形態では、アレルゲン（例えば、食物アレルゲン）に対する免疫応答、または免疫応答が望まれない外来タンパク質に対する免疫応答が阻害されうる。例えば、第ＶＩＩＩ因子を頻繁に受ける患者は、この凝固因子に対する抗体を生成する。本発明の方法における組換え第ＶＩＩＩ因子の共投与により（または第ＶＩＩＩ因子への物理的連結、例えば、架橋により）、免疫応答の下方調整をもたらすことができる。同様の方式において、クローン除去の低減および／または疲弊（例えば、Ｔ細胞疲弊）の増加を誘導することができる。

免疫応答の下方制御は、限定されないが、造血幹細胞移植拒絶反応（例えば、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ））、自己免疫疾患、例えば全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、アレルギー、移植、過敏性応答、ＣＤ４＋Ｔ細胞産生または機能の増加が要求される障害、ワクチン接種効率の改善が要求される障害、および調節性Ｔ細胞産生または機能の増加が要求される障害における、組織、皮膚、および他の固形臓器移植（例えば、腎臓、肝臓、心臓、および血管柄付複合組織移植）の状況を含む、本発明によるいくつかの他の「免疫障害」を処置するために有用である。例えば、免疫細胞機能の遮断は、組織移植における組織破壊の低減をもたらす。典型的に、組織移植において、移植片の拒絶は、それが免疫細胞により異物として認識された後、移植片を破壊する免疫反応によって開始される。移植前または移植時における本明細書に記述される薬剤の投与は、阻害シグナルの生成を促進しうる。さらに、阻害は、免疫細胞をアネルギー化することにより、対象の耐性を誘導するために十分である場合もある。長期耐性の誘導により、これらの遮断試薬の度重なる投与の必要性が回避される。

免疫応答の下方調整は、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）および多発性硬化症などの自己免疫疾患の処置においても有用である。多くの自己免疫障害は、自己組織に対して反応性があり、疾患の病理に関与するサイトカインおよび自己抗体の産生を促進する、免疫細胞の不適切な活性化の結果である。自己反応性免疫細胞の活性化の防止は、疾患の症状を低減または排除しうる。本明細書に記述される薬剤の投与は、疾患のプロセスに関与しうる自己抗体またはサイトカインの生成を防止するのに有用である。さらに、本発明の方法は、自己反応性免疫細胞の抗原特異的耐性を誘導することができ、これは疾患の長期緩和をもたらしうる。自己免疫障害の防止または軽減における試薬の有効性は、ヒト自己免疫疾患の十分に特徴付けられたいくつかの動物モデルを使用して決定することができる。例としては、マウス実験的自己免疫性脳炎、ＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウスまたはＮＺＢハイブリッドマウスにおける全身性エリテマトーデス、マウス自己免疫コラーゲン関節炎、ＮＯＤマウスおよびＢＢラットにおける真性糖尿病、ならびにマウス実験的重症筋無力症が挙げられる（例えば、Paul編、Fundamental Immunology、Raven Press、New York、第３版、１９９３年、第３０章を参照されたい）。

免疫細胞活性化の阻害はまた、例えば、ＩｇＥ産生の阻害によるアレルギーおよびアレルギー反応の処置において治療的に有用である。アレルギー反応は、アレルゲンの進入ルートおよびマスト細胞または好塩基球に対するＩｇＥの沈着パターンに応じて、本質的に全身性である場合もあれば、局所的である場合もある。したがって、本発明の方法による、免疫細胞媒介性の（例えば、食物に対する）アレルギー応答の局所的または全身的な阻害。一実施形態では、アレルギーはアレルギー性喘息である。

免疫細胞活性化の阻害は、免疫細胞の寄生虫感染およびウイルス感染においても治療的に重要でありうる。例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）では、免疫細胞活性化によりウイルス複製が刺激される。これらの相互作用の調整は、ウイルス複製の阻害をもたらすことによりＡＩＤＳの経過を好転させうる。これらの相互作用の調整はまた、妊娠の維持を促進するのに有用でありうる。胚または胎児の免疫学的拒絶のために自然流産のリスクがある女性（例えば、自然流産を過去に経験した女性または妊娠困難の経験がある女性）を、これらの相互作用を調整する薬剤で処置してもよい。

本発明の方法による免疫応答の下方制御は、自己組織の自己免疫攻撃を処置するのに有用である場合もある。したがって、自己免疫障害などの自己免疫攻撃により増悪する状態、ならびに心疾患、心筋梗塞、および粥状動脈硬化などの状態を調整することは、本発明の範囲内である。

好ましい実施形態では、免疫障害は移植片対宿主病（例えば、慢性ＧＶＨＤ）である。多くの血液悪性腫瘍患者にとって、同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）が唯一の治癒の機会を提示する。残念ながら、大きな障壁が依然として存在し、中でも注目すべきは疾患再発およびＧＶＨＤである。ＨＳＣＴを受けている患者の４０％超が再発し、５０％超は、かなりの罹患率および死亡率に関連する多系統の免疫兆候を伴う衰弱性状態であるｃＧＶＨＤを発症する（Kahlら（２００７年）、Blood、１１０巻：２７４４〜２７４８頁；Perez-Simonら（２００８年）、Biol. Blood Marrow Transplant.、１４巻：１１６３〜１１７１頁）。小児集団における発生率はこれより低いが、ｃＧＶＨＤは、ＨＳＣＴ後１００日間を超えて生存する小児の２０〜５０％において生じ、依然として悪性疾患に関する同種ＨＳＣＴ後の非再発罹患率および死亡率の主因である（Bairdら（２０１０年）、Pediatr. Clin. North Am.、５７巻：２９７〜３２２頁）。ドナー細胞媒介性免疫応答はＧＶＬおよびＧＶＨＤ反応の一因である。新たに生着したドナー免疫系による残存腫瘍細胞の認識および破壊が不十分であれば、患者の悪性腫瘍が再発し、宿主抗原に対する反応が制御されなければ、ＧＶＨＤが生じる（Antin（１９９３年）、Blood、８２巻：２２７３〜２２７７頁；Ferraraら（２００９年）、Lancet、３７３巻：１５５０〜１５６１頁）。慢性ＧＶＨＤの病理発生には、同種（ドナー／レシピエント多型）抗原および自己（ドナー／レシピエント非多型）抗原に対する炎症性Ｔ細胞応答およびＢ細胞応答が関与し、これは依然として同種ＨＳＣＴ後の一般的な問題および主要な治療上の課題であり、長期生存者は生活の質の低下および死亡率の増加を経験することが多い（Subramaniamら（２００７年）、Leukemia、２１巻：８５３〜８５９頁）。ＨＣＴのための幹細胞源として骨髄ではなく動員末梢血前駆細胞がますます使用されることにより、ｃＧＶＨＤの発生率は明らかに増加した（Cutlerら（２００１年）、J. Clin. Oncol.、１９巻：３６８５〜３６９１頁；Leeら（２００７年）、Blood、１１０巻：４５７６〜４５８３頁）。鎌状赤血球貧血、免疫不全症、および先天性代謝疾患などの非悪性適応症のために同種ＨＳＣＴがますます行われていることから、小児患者におけるｃＧＶＨＤの発生率は上がると予想されている。成人および小児の両方において、ｃＧＶＨＤに関連する炎症性または線維性の変化は、最も一般的には皮膚、眼、口、肝臓、および気道に関与する。ＰＤ−１発現および／または阻害は、任意の養子細胞療法、例えば幹細胞療法、臓器移植などに先立って下方制御されうる。

対照的に、本発明は、例えばＴ細胞疲弊を防止または逆転させることにより免疫応答を増加させるための方法も提供する。免疫応答を上方制御する薬剤は、既存の免疫応答の増強または初期免疫応答の誘発という形態でありうる。したがって、本組成物および方法を使用して免疫応答を増強することは、がんを処置するために有用であるが、感染性疾患（例えば、細菌、ウイルス、または寄生虫）、寄生虫感染、および免疫抑制疾患の処置にも有用でありうる。

例示的な感染性障害としては、ヘルペスまたは帯状疱疹などのウイルス性皮膚疾患が挙げられ、この場合、かかる薬剤は皮膚に局所送達されうる。加えて、インフルエンザ、感冒、および脳炎などの全身性ウイルス疾患も、かかる薬剤の全身投与により軽減される場合がある。好ましい一実施形態では、本明細書に記述される免疫応答を上方制御する薬剤は、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｃｒｕｚｉ感染症中にこの寄生虫に対する防御免疫応答を容易にするために、アルギナーゼ／ｉＮＯＳのバランスを調整するのに有用である。

感染患者における免疫応答は、例えば、患者から免疫細胞を除去し、免疫細胞と本明細書に記述される薬剤をｉｎｖｉｔｒｏで接触させ、ｉｎｖｉｔｒｏで刺激された免疫細胞を患者に再導入することによるｅｘｖｉｖｏ手法によって、増強させることもできる。

ｂ．薬剤の投与
上述のように、本発明の調整方法は、Ｔ細胞を遺伝子操作して、ゲノム領域を調整することによりＴ細胞における少なくとも１つの遺伝子の発現を調整することを含み、ここでこのゲノム領域は、疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞のゲノム内で選択的にクロマチン接近可能であり、ゲノム領域は少なくとも１つの遺伝子を調節する。操作T細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏで分析される場合も、ｅｘｖｉｖｏで分析される（すなわち、対象から単離し、ｉｎｖｉｖｏの質を可能な限り保護するように設計された最低限の操作により対象の体外で操作することを、単独で、あるいは操作された細胞を対象に投与し戻すことと共に行う）場合もある。代替的に、操作T細胞は、Ｔ細胞疲弊を調整するため、および／または免疫障害を処置するために、上述の対象に投与されてもよい。

操作T細胞は対象宿主と免疫適合関係を有し、このような関係はいずれも、本発明による使用のために想定される。例えば、Ｔｒｅｇおよび／またはＴｅｆｆは同系でありうる。「同系」という用語は、特に抗原または免疫学的反応に関して遺伝学的に同一である同じ種に由来する状態、同じ種を起源とする状態、または同じ種のメンバーである状態を指す場合がある。これらは、マッチするＭＨＣ型を有する一卵性双生児を含む。したがって、「同系移植」とは、ドナーから、ドナーと遺伝学的に同一であるか、または望まれない有害な免疫原性応答（例えば、本明細書に記述される免疫学的スクリーン結果の解釈に反対するようなもの）を伴わずに移植を行うために十分な免疫学的適合性があるレシピエントへの、細胞の移入を指す。

移入細胞が同じ対象から得られ、同じ対象に移植される場合、同系移植片は「自己」でありうる。「自己移植」とは、対象自身の細胞または臓器の採取および再注入もしくは移植を指す。自己細胞の排他的または補足的な使用は、細胞を宿主に投与し戻すことの多くの有害作用、特に移植片対宿主反応を排除または低減しうる。

移入細胞が同じ種の異なるメンバーから得られ、同じ種の異なるメンバーに移植されるが、有害な免疫原性応答を回避するために十分にマッチする主要組織適合（ＭＨＣ）抗原を有する場合、同系移植片は、「マッチ同種」でありうる。ＭＨＣミスマッチ度の決定は、当技術分野で公知であり使用されている標準的試験に従って達成されうる。例えば、ヒトのＭＨＣ遺伝子には移植生物学において重要なものと特定される少なくとも６つの主要カテゴリーがある。ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−ＣはＨＬＡクラスＩタンパク質をコードし、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＰはＨＬＡクラスＩＩタンパク質をコードする。これらの群のそれぞれにおける遺伝子は、ヒト集団に見出される多数のＨＬＡ対立遺伝子または変異形に反映されるように高度に多型性があり、これらの群における個体間の差違は、移植細胞に対する免疫応答の強度に関連している。ＭＨＣマッチ度を決定するための標準的方法では、ＨＬＡ−Ｂ群およびＨＬＡ−ＤＲ群、またはＨＬＡ−Ａ群、ＨＬＡ−Ｂ群、およびＨＬＡ−ＤＲ群における対立遺伝子を検査する。したがって、それぞれ、２つまたは３つのＨＬＡ群における、少なくとも４つ、さらには５つまたは６つのＭＨＣ抗原について試験が行われる場合がある。血清学的ＭＨＣ試験では、各ＨＬＡ抗原型に対する抗体を１つの対象（例えば、ドナー）の細胞と反応させて、その抗体と反応するある特定のＭＨＣ抗原の存在または非存在を決定する。これを、他の対象（例えば、レシピエント）の反応性プロファイルと比較する。抗体とＭＨＣ抗原の反応は、典型的には、抗体を細胞と共にインキュベートし、次いで補体を添加して細胞溶解を誘導すること（すなわち、リンパ球毒性試験）によって決定される。この反応物を検査し、反応物中の溶解した細胞の量に従って段階分けする（例えば、MickelsonおよびPetersdorf（１９９９年）、Hematopoietic Cell Transplantation、Thomas, E. D.ら編、２８〜３７頁、Blackwell Scientific、Malden、Mass.を参照されたい）。他の細胞ベースのアッセイとしては、標識抗体を使用したフローサイトメトリーまたは酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）が挙げられる。ＭＨＣ型を決定するための分子法は周知であり、一般に、ＨＬＡタンパク質をコードする特異的遺伝子配列を検出するために合成プローブおよび／またはプライマーを用いる。特定のＨＬＡ型に関連する制限断片長多型を検出するためのハイブリダイゼーションプローブとして合成オリゴヌクレオチドを使用してもよい（Vaughn（２００２年）、Method. Mol. Biol. MHC Protocol、２１０巻：４５〜６０頁）。代替的に、プライマーをＨＬＡ配列の（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応またはライゲーション連鎖反応による）増幅のために使用してもよく、その産物は、直接ＤＮＡ配列決定、制限断片多型分析（ＲＦＬＰ）、または一連の配列特異的オリゴヌクレオチドプライマー（ＳＳＯＰ）を用いたハイブリダイゼーションによって、さらに検査してもよい（Petersdorfら（１９９８年）、Blood、９２巻：３５１５〜３５２０頁；Morishimaら（２００２年）、Blood、９９巻：４２００〜４２０６頁；および、MiddletonおよびWilliams（２００２年）、Method. Mol. Biol. MHC Protocol、２１０巻：６７〜１１２頁）。

典型的には近親交配により、移入細胞と対象の細胞とが、単一遺伝子座などの規定の遺伝子座において異なる場合、同系移植片は「類遺伝子性」でありうる。「類遺伝子性」という用語は、同じ種に由来すること、同じ種を起源とすること、または同じ種のメンバーであることを指し、ここで、このメンバーは、小さな遺伝子領域、典型的には単一遺伝子座（すなわち、単一の遺伝子）を除いては遺伝学的に同一である。「類遺伝子性移植」とは、ドナーからレシピエントへの細胞または臓器の移入で、レシピエントが単一遺伝子座を除いてはドナーと遺伝学的に同一であるものを指す。例えば、いくつかの対立遺伝子型のＣＤ４５が存在し、ＣＤ４５．１またはＣＤ４５．２の対立遺伝子バージョンが発現されるかどうかに関して異なる類遺伝子性マウス株が存在する。

対照的に、「ミスマッチ同種」とは、有害な免疫原性応答を誘発するのに十分な規定数のＭＨＣ抗原の血清学的分析または分子分析など、当技術分野で使用される標準的アッセイによって典型的に決定した場合に、非同一の主要組織適合（ＭＨＣ）抗原（すなわち、タンパク質）を有する、同じ種に由来すること、同じ種を起源とすること、または同じ種のメンバーであることを指す。「部分的ミスマッチ」とは、メンバー間、典型的にはドナーとレシピエントとの間の、試験されたＭＨＣ抗原の部分的なマッチを指す。例えば、「半ミスマッチ」とは、試験されたＭＨＣ抗原の５０％が２つのメンバー間で異なるＭＨＣ抗原型を示すことを指す。「完全（ｆｕｌｌまたはｃｏｍｐｌｅｔｅ）」ミスマッチとは、試験された全てのＭＨＣ抗原が２つのメンバー間で異なることを指す。

同様に、対照的に、「異種」とは、例えば、ヒトおよび齧歯類、ヒトおよびブタ、ヒトおよびチンパンジーなどの異なる種に由来すること、異なる種を起源とすること、または異なる種のメンバーであることを指す。「異種移植」とは、ドナーからレシピエントへの細胞または臓器の移入で、レシピエントがドナーの種とは異なる種であるものを指す。

細胞ベースの薬剤に関して、操作T細胞は、対象の体重１キログラム当たり、０．１×１０^６、０．２×１０^６、０．３×１０^６、０．４×１０^６、０．５×１０^６、０．６×１０^６、０．７×１０^６、０．８×１０^６、０．９×１０^６、１．０×１０^６、５．０×１０^６、１．０×１０^７、５．０×１０^７、１．０×１０^８、５．０×１０^８、またはそれよりも多く、またはその間の任意の範囲もしくはその間の任意の値の細胞を投与されうる。移植される細胞の数は、所与の期間中に所望される生着レベルに基づいて加減してよい。一般に、１×１０^５〜約１×１０^９個の細胞／体重１ｋｇ、約１×１０^６〜約１×１０^８個の細胞／体重１ｋｇ、または約１×１０^７個の細胞／体重１ｋｇ、または必要に応じてそれよりも多くの細胞が移植されうる。一部の実施形態では、平均サイズのマウスに対して、合計で少なくとも約０．１×１０^６、０．５×１０^６、１．０×１０^６、２．０×１０^６、３．０×１０^６、４．０×１０^６、または５．０×１０^６個の細胞の移植が有効である。

例えば、遺伝子操作T細胞、ならびに幹細胞、遺伝子操作T細胞、および通常のＴｒｅｇの養子細胞移入、遺伝子操作T細胞および細胞ベースのワクチン、ＣＡＲＴ細胞と組み合わせた遺伝子操作T細胞など、２つまたはそれよりも多くの細胞型を組み合わせ投与してもよい。例えば、養子細胞ベースの免疫療法を遺伝子操作T細胞と組み合わせてもよい。周知の養子細胞ベースの免疫療法様式は、限定されないが、自己または同種腫瘍細胞の照射、腫瘍溶解物またはアポトーシス性腫瘍細胞、抗原提示細胞ベースの免疫療法、樹状細胞ベースの免疫療法、養子Ｔ細胞移入、養子ＣＡＲＴ細胞療法、自己免疫増強療法（ＡＩＥＴ）、がんワクチン、および／または抗原提示細胞を含む。このような細胞ベースの免疫療法は、１つまたは複数の遺伝子産物を発現して、免疫応答、例えばＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインの発現をさらに調整するように、かつ／または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）抗原、例えばＭａｇｅ−１、ｇｐ−１００などを発現するように、さらに修正することができる。遺伝子操作T細胞の他の細胞型に対する比は１：１でありうるが、所望される任意の量で（例えば、１：１、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．４：１、１．５：１、２：１、２．５：１、３：１、３．５：１、４：１、４．５：１、５：１、５．５：１、６：１、６．５：１、７：１、７．５：１、８：１、８．５：１、９：１、９．５：１、１０：１、またはそれよりも高く）調整することができる。

移植細胞の生着は、例えば、限定されないが、腫瘍体積、サイトカインレベル、投与時間、移植後の１つまたは複数の時点で対象から得られた目的の細胞のフローサイトメトリー分析などの様々な方法のうちのいずれによって査定されてもよい。例えば、待機１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８日間の時間ベースの分析は、腫瘍採取の時間を示唆しうる。このような測定基準はいずれも、抗免疫障害療法への応答に対する変数の影響を決定するために周知のパラメータに従って加減することのできる変数である。加えて、移植細胞は、例えばサイトカイン、細胞外マトリックス、細胞培養支持体などの他の薬剤と共移植されてもよい。

加えて、本発明の免疫調整剤は、免疫細胞媒介性免疫応答を調整するために、医薬品の投与に好適な生物学的に適合性のある形態で対象に投与されるか、または別様に対象の身体外部に適用されてもよい。「ｉｎｖｉｖｏ投与に好適な生物学的に適合性のある形態」とは、治療効果がいかなる毒性効果をも上回る投与形態を意味する。「対象」という用語は、免疫応答が誘発されうる生きている生物、例えば、哺乳動物を含むよう意図される。対象の例としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種が挙げられる。本明細書に記述される薬剤の投与は、治療活性量の薬剤を単独でまたは薬学的に許容される担体と組み合わせて含む、任意の薬理学的形態であってよい。

本発明の治療用組成物の治療活性量での投与とは、所望の結果を実現するのに必要な投与量および期間で有効な量として定義される。例えば、薬剤の治療活性量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発するペプチドの能力などの要因によって異なりうる。投与量レジメンは、最適な治療応答をもたらすように加減することができる。例えば、いくつかの分割用量を毎日投与してもよいし、または、治療状況の緊急事態によって示されるように用量を比例的に低減させてもよい。

併用剤形または単一の薬剤の同時投与は、患者体内に所望される調整剤のそれぞれが有効量で同時に存在することをもたらしうる。

投与は、当技術分野で一般に公知の方法を使用して達成することができる。細胞を含む薬剤は、直接注射によって、または、血管内投与、脳内投与、非経口投与、腹腔内投与、静脈内投与、硬膜外投与、脊髄内投与、胸骨内投与、関節内投与、滑液嚢内投与、くも膜下腔内投与、動脈内投与、心臓内投与、もしくは筋肉内投与を含むがこれらに限定されない、当技術分野で使用される任意の他の手段によって所望の部位に導入されてもよい。例えば、目的の対象に、様々なルートによって移植細胞を生着させることができる。かかるルートとしては、静脈内投与、皮下投与、特定の組織への投与（例えば、局所移植）、大腿骨骨髄腔への注射、脾臓への注射、胎児肝の腎被膜下投与などが挙げられるが、これらに限定されない。細胞は、１回の注入で投与されても、または所望の効果をもたらすのに十分な規定の期間にわたる連続的注入によって投与されてもよい。移植細胞の移植、生着査定、およびマーカー表現型決定分析のための例示的な方法は、当技術分野で周知である（例えば、Pearsonら（２００８年）、Curr. Protoc. Immunol.、８１巻：１５．２１．１〜１５．２１．２１頁；Itoら（２００２年）、Blood、１００巻：３１７５〜３１８２頁；Traggiaiら（２００４年）、Science、３０４巻：１０４〜１０７頁；Ishikawaら、Blood（２００５年）１０６巻：１５６５〜１５７３頁；Shultzら（２００５年）、J. Immunol.、１７４巻：６４７７〜６４８９頁；およびHolyoakeら（１９９９年）、Exp. Hematol.、２７巻：１４１８〜１４２７頁を参照されたい）。

例えば、本明細書に記述される治療剤は、注射（皮下、静脈内など）、経口投与、吸入、経皮適用、または直腸投与などの簡便な方式で投与することができる。投与ルートに応じて、活性化合物は、酵素、酸、および化合物を不活性化しうる他の自然条件の作用から化合物を保護するための物質でコーティングされうる。例えば、非経口投与以外の薬剤の投与では、薬剤の不活性化を防止する物質で薬剤をコーティングすること、または薬剤をこの物質と共投与することが望ましい場合がある。

薬剤は、適切な担体、希釈剤、もしくはアジュバントにおいて個体に投与されても、酵素阻害剤と共投与されても、またはリポソームなどの適切な担体において投与されてもよい。薬学的に許容される希釈剤は、食塩水および緩衝水溶液を含む。アジュバントは、その最も広い意味で使用され、インターフェロンなどの任意の免疫刺激化合物を含む。本明細書において想定されるアジュバントは、レゾルシノール、非イオン性界面活性剤、例えばポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテルを含む。酵素阻害剤は、膵臓トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＥＥＰ）、およびトラジロールを含む。リポソームは、水中油中水型エマルションならびに従来型のリポソームを含む（Sternaら（１９８４年）、J. Neuroimmunol.、７巻：２７頁）。

薬剤はまた、非経口投与されても腹腔内投与されてもよい。グリセロール、脂質ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中の分散物、ならびに油中の分散物を調製することもできる。通常の保管および使用条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するための保存剤を含有しうる。

注射用途に好適な薬剤の医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散物、ならびに滅菌注射用溶液または分散物を即時調製するための滅菌粉末を含む。全ての場合において、組成物は無菌であることが好ましく、また、容易な注入性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性でなければならない。これは、製造および保管の条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の混入作用から保護されることが好ましい。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにそれらの好適な混合物を含有する、溶媒または分散媒とすることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤を使用することにより、分散物の場合は要求される粒径を維持することにより、また、界面活性剤を使用することにより、維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって実現することができる。多くの場合において、等張剤、例えば、糖、マンニトール（manitol）、ソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらすことができる。

滅菌注射用溶液は、必要に応じて上記に列挙した成分のうちの１つまたは組合せと共に、適切な溶媒中に必要量で遺伝子操作T細胞および／または他の本発明の薬剤（例えば、抗体、ペプチド、融合タンパク質、または小分子）を組み込んでから濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散物は、基本分散媒および上記に列挙したもののうち必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクルに、活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合では、好ましい調製方法は、事前に滅菌濾過されたその溶液から薬剤と任意のさらなる所望の成分の粉末をもたらす、真空乾燥および冷凍乾燥である。

上述のように、薬剤が好適に保護されている場合、タンパク質は、例えば、不活性希釈剤または吸収可能な食用担体と共に経口投与することができる。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」には、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などが含まれる。このような媒体および薬剤を薬学的に活性な物質に使用することは、当技術分野で周知である。いずれかの従来型の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除き、治療用組成物中にそれを使用することが想定される。補助的な活性化合物を組成物中に組み込むこともできる。

非経口組成物は、投与の容易さおよび投与量の均一性のために、単位剤形で製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される「単位剤形」とは、処置される哺乳動物対象のための投与量単位として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、要求される薬学的担体との関連で所望の治療効果をもたらすように計算された所定分量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形の仕様は、（ａ）活性化合物特有の特徴および実現すべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体の感受性の処置のためにかかる活性化合物の調剤を行う技術分野に固有の制限に左右され、それらに直接依存する。

一実施形態では、本発明の治療剤は抗体である。本明細書に定義されるように、抗体の治療有効量（すなわち、有効投与量）は、約０．００１〜３０ｍｇ／体重１ｋｇ、好ましくは約０．０１〜２５ｍｇ／体重１ｋｇ、より好ましくは約０．１〜２０ｍｇ／体重１ｋｇ、さらにより好ましくは約１〜１０ｍｇ／体重１ｋｇ、２〜９ｍｇ／ｋｇ、３〜８ｍｇ／ｋｇ、４〜７ｍｇ／ｋｇ、または５〜６ｍｇ／ｋｇの範囲である。当業者であれば、対象の疾患もしくは障害の重症度、過去の処置、全体的健康、および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むがこれらに限定されない、ある特定の要因が、対象を有効に処置するために要求される投与量に影響しうることを察知するであろう。さらに、治療有効量の抗体での対象の処置は、単一の処置を含む場合もあれば、好ましくは、一連の処置を含む場合もある。好ましい例において、対象は、約１〜１０週間、好ましくは２〜８週間、より好ましくは約３〜７週間、さらにより好ましくは約４、５、または６週間にわたり、１週間に１回、約０．１〜２０ｍｇ／体重１ｋｇの範囲の抗体で処置される。処置のために使用される抗体の有効投与量は特定の処置の過程において増加または減少しうることも察知されよう。投与量の変化は、診断アッセイの結果から生じてもよい。一部の実施形態では、処置の有効性が生じ、これは、投与開始後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日以内、またはそれよりも後に、直接的または間接的に測定することができる。

一部の実施形態では、バイオマーカー核酸分子が有用であり、これをベクターに挿入し、遺伝子療法ベクターとして使用してもよい。遺伝子療法ベクターは、例えば、静脈内注射、局所的投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照されたい）、または定位注射（例えば、Chenら（１９９４年）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、９１巻：３０５４〜３０５７頁を参照されたい）によって、対象に送達することができる。遺伝子療法ベクターの医薬品調製物は、許容される希釈剤中に遺伝子療法ベクターを含んでもよいし、遺伝子送達ビヒクルが包埋された徐放性マトリックスを含んでもよい。代替的に、完全な遺伝子送達ベクターが、組換え細胞からインタクトに産生されたもの、例えば、レトロウイルスベクターであり得る場合、医薬品調製物は、遺伝子送達系を産生する１つまたは複数の細胞を含んでもよい。

哺乳動物、ヒト、もしくは非ヒト、またはそれらの細胞にポリヌクレオチドを導入するための任意の手段は、本発明の様々な構築物を意図されるレシピエントに送達するために、本発明の実践に合わせて適応させてよい。本発明の一実施形態では、ＤＮＡ構築物は、トランスフェクションにより、すなわち、「裸の」ＤＮＡの送達により、またはコロイド状分散系との複合体において、細胞に送達される。コロイド系には、高分子複合体、ナノカプセル、微小球、ビーズ、ならびに水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、およびにリポソームを含む脂質ベースの系が含まれる。本発明の好ましいコロイド系は、脂質複合体化ＤＮＡまたはリポソーム製剤化ＤＮＡである。前者の手法では、ＤＮＡを例えば脂質と共に製剤化する前に、所望のＤＮＡ構築物を有する導入遺伝子を含有するプラスミドをまず発現について実験的に最適化してもよい（例えば、５’非翻訳領域におけるイントロンの包含および不必要な配列の排除（Felgnerら、Ann NY Acad Sci、１２６〜１３９頁、１９９５年）。次いで、公知の方法および材料を使用して、ＤＮＡを例えば様々な脂質またはリポソーム材料と共に製剤化することを行って、これをレシピエント哺乳動物に送達してもよい。例えば、Canonicoら、Am J Respir Cell Mol Biol、１０巻：２４〜２９頁、１９９４年；Tsanら、Am J Physiol、２６８巻；Altonら、Nat Genet.、５巻：１３５〜１４２頁、１９９３年、およびCarsonらによる米国特許第５，６７９，６４７号を参照されたい。

リポソームのターゲティングは、解剖学的要因および機構的要因に基づいて分類することができる。解剖学的分類は、例えば、臓器特異的、細胞特異的、および小器官特異的な選択性レベルに基づく。機構的ターゲティングは、それが受動的であるか能動的であるかに基づいて区別されうる。受動的ターゲティングは、洞様毛細血管を含有する臓器内の細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞に分布するリポソームの自然な傾向を利用する。その一方で、能動的ターゲティングは、モノクローナル抗体、糖、糖脂質、もしくはタンパク質などの特異的リガンドとリポソームを共役させることにより、または天然に存在する局在化部位以外の臓器および細胞型のターゲティングを実現するためにリポソームの組成もしくはサイズを変更することにより、リポソームを変化させることを含む。

ターゲティング送達系の表面は、多様な方法で修飾されうる。リポソームのターゲティング送達系の場合、ターゲティングリガンドをリポソーム二重層と安定に会合した状態に維持するために、脂質群をリポソームの脂質二重層に組み込んでもよい。脂質鎖をターゲティングリガンドに接続させるためには、様々な連結基を使用することができる。裸のＤＮＡ、または送達ビヒクル、例えばリポソームと会合したＤＮＡは、対象のいくつかの部位に投与されうる（以下参照）。

核酸は、任意の所望されるベクターで送達されうる。これらは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびプラスミドベクターをはじめとする、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを含む。例示的なウイルスの種類は、ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＢＩＶ（ウシ免疫不全ウイルス）、およびＭＬＶ（マウス白血病ウイルス）を含む。核酸は、ウイルス粒子中、リポソーム中、ナノ粒子中、およびポリマーとの複合をはじめとする、十分に効率的な送達レベルをもたらす任意の所望される形式で投与することができる。

目的のタンパク質または核酸をコードする核酸は、プラスミドもしくはウイルスベクター、または当技術分野で公知の他のベクター中にあってもよい。このようなベクターは周知であり、特定用途にいずれを選択してもよい。本発明の一実施形態では、遺伝子送達ビヒクルは、プロモーターおよびデメチラーゼコード配列を含む。好ましいプロモーターは、組織特異的プロモーター、ならびにチミジンキナーゼプロモーターおよびチミジル酸シンターゼプロモーターなどの細胞増殖により活性化されるプロモーターである。他の好ましいプロモーターとしては、ウイルスへの感染によって活性化可能なプロモーター、例えばα−インターフェロンプロモーターおよびβ−インターフェロンプロモーター、ならびにエストロゲンなどのホルモンによって活性化可能なプロモーターが挙げられる。使用することのできる他のプロモーターとしては、ＭｏｌｏｎｅｙウイルスＬＴＲ、ＣＭＶプロモーター、およびマウスアルブミンプロモーターが挙げられる。プロモーターは、構成的であっても誘導的であってもよい。

別の実施形態では、ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記述されているように、裸のポリヌクレオチド分子が、遺伝子送達ビヒクルとして使用される。このような遺伝子送達ビヒクルは、増殖因子ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれであってもよく、ある特定の実施形態では、殺傷されたアデノウイルスに結びつけられる。Curielら、Hum. Gene. Ther.、３巻：１４７〜１５４頁、１９９２年。任意選択で使用することのできる他のビヒクルとしては、ＤＮＡ−リガンド（Wuら、J. Biol. Chem.、２６４巻：１６９８５〜１６９８７頁、１９８９年）、脂質−ＤＮＡの組合せ（Felgnerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８４巻：７４１３〜７４１７頁、１９８９年）、リポソーム（Wangら、Proc. Natl. Acad. Sci.、８４巻：７８５１〜７８５５頁、１９８７年）、および微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅｓ）（Williamsら、Proc. Natl. Acad. Sci.、８８巻：２７２６〜２７３０頁、１９９１年）が挙げられる。

遺伝子送達ビヒクルは、ウイルス複製起点またはパッケージングシグナルなどのウイルス配列を任意選択で含みうる。これらのウイルス配列は、アストロウイルス、コロナウイルス、オルソミクソウイルス、パポーバウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、トガウイルス、またはアデノウイルスなどのウイルスから選択されうる。好ましい実施形態では、増殖因子遺伝子送達ビヒクルは、組換えレトロウイルスベクターである。組換えレトロウイルスおよびその様々な使用は、例えば、Mannら、Cell、３３巻：１５３頁、１９８３年、CaneおよびMulligan、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA、８１巻：６３４９頁、１９８４年、Millerら、Human Gene Therapy、１巻：５〜１４頁、１９９０年、米国特許第４，４０５，７１２号、同第４，８６１，７１９号、および同第４，９８０，２８９号、ならびにＰＣＴ出願番号ＷＯ８９／０２，４６８、ＷＯ８９／０５，３４９、およびＷＯ９０／０２，８０６を含む、多数の参考文献に記述されている。例えば、ＥＰ０，４１５，７３１；ＷＯ９０／０７９３６；ＷＯ９４／０３６２２；ＷＯ９３／２５６９８；ＷＯ９３／２５２３４；米国特許第５，２１９，７４０号；ＷＯ９３１１２３０；ＷＯ９３１０２１８；VileおよびHart、Cancer Res.、５３巻：３８６０〜３８６４頁、１９９３年；VileおよびHart、Cancer Res.、５３巻：９６２〜９６７頁、１９９３年；Ramら、Cancer Res.、５３巻：８３〜８８頁、１９９３年；Takamiyaら、J. Neurosci. Res.、３３巻：４９３〜５０３頁、１９９２年；Babaら、J. Neurosurg.、７９巻：７２９〜７３５頁、１９９３年（米国特許第４，７７７，１２７号、ＧＢ２２００６５１、ＥＰ０３４５２４２、およびＷＯ９１／０２８０５）に記述されているものを含め、多数のレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルが本発明において利用されうる。

本発明のポリヌクレオチドを送達するために使用することのできる他のウイルスベクター系は、ヘルペスウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルス（１９９７年５月２０日交付のWooらによる米国特許第５，６３１，２３６号、およびＮｅｕｒｏｖｅｘによるＷＯ００／０８１９１）、ワクシニアウイルス（Ridgeway（１９８８年）、Ridgeway、「Mammalian expression vectors」、In: Rodriguez R L、Denhardt D T編、Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Stoneham: Butterworth；BaichwalおよびSugden（１９８６年）、「Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes」、In: Kucherlapati R編、Gene transfer. New York: Plenum Press；Couparら（１９８８年）、Gene、６８巻：１〜１０頁）、およびいくつかのＲＮＡウイルスに由来する。好ましいウイルスとしては、アルファウイルス、ポックスウイルス、アレナウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルスなどが挙げられる。これらは、様々な哺乳動物細胞にとって、いくつかの魅力的な特色を提示する（Friedmann（１９８９年）、Science、２４４巻：１２７５〜１２８１頁；Ridgeway、１９８８年、上記；BaichwalおよびSugden、１９８６年、上記；Couparら、１９８８年；Horwichら（１９９０年）、J. Virol.、６４巻：６４２〜６５０頁）。

他の実施形態では、組換えバイオマーカーポリペプチドおよびその断片が対象に投与されうる。一部の実施形態では、増強した生物学的特性を有する融合タンパク質が構築され、投与されうる。加えて、バイオマーカーポリペプチドおよびその断片は、望ましい生物学的活性のさらなる増強、例えば生体利用能の増加、およびタンパク質分解の減少のために、当技術分野で周知の薬理学的方法（例えば、ペグ化、グリコシル化、オリゴマー化など）に従って修飾されてもよい。

バイオマーカー活性の刺激は、バイオマーカーが異常に下方制御されている状況および／またはバイオマーカー活性の増加が有益な効果を有する可能性が高い状況において望ましい。同様に、バイオマーカー活性の阻害は、バイオマーカーが異常に上方制御されている状況および／またはバイオマーカー活性の減少が有益な効果を有する可能性が高い状況において望ましい。

加えて、これらの調整剤は、例えば、化学療法剤、ホルモン、抗血管新生薬、放射標識、化合物との、または手術、寒冷療法、および／もしくは照射療法との併用療法において、投与することもできる。先行する処置法は、他の形態の従来型療法（例えば、当業者に周知の免疫障害のための標準治療処置）と併せて、従来型療法と連続的に、従来型療法の前に、従来型療法の後にのいずれで投与してもよい。例えば、これらの調整剤は、治療有効用量の免疫抑制剤または免疫抑制療法と共に投与してもよい。

別の実施形態では、免疫応答は、既存の耐性、クローン除去、および／または疲弊（例えば、Ｔ細胞疲弊）を維持するために、本明細書に記述される方法によって下方制御されうる。例えば、対象が有意な免疫応答をしかけることができない抗原、例えば自己抗原に対する、免疫応答が維持されうる。

一実施形態では、免疫細胞が対象から得られ、本明細書に記述される薬剤の存在下でｅｘｖｉｖｏ培養されて、Ｔｒｅｇが修飾され、かつ／または、免疫細胞の活性化を増強させる免疫細胞の集団が除去されるか、もしくはそれらがさらに除去される。さらなる実施形態では、濾過された免疫細胞が次いで対象に投与される。例えば、一次活性化シグナルおよび共刺激シグナルを免疫細胞に与えることにより、免疫細胞をｉｎｖｉｔｒｏで刺激することができるため、様々な薬剤を使用して、エフェクター免疫細胞の共刺激および増殖を低減させ、かつ／または阻害調節性（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）免疫細胞を促進することもできる。一実施形態では、免疫細胞は、ＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／２９４３６に記述されている方法に従ってｅｘｖｉｖｏで培養される。共刺激性ポリペプチドは、可溶性であっても、細胞膜に結合していても、またはビーズなどの固体表面に結合していてもよい。同様に、例えば架橋などの当技術分野で公知の技術を使用して、または組換えＤＮＡ技術により、免疫細胞の枯渇を促進するのに有用な薬剤を毒素にさらに連結させても、または作動可能に結合させてもよい。このような薬剤は、所望の細胞の細胞破壊をもたらしうる。一実施形態では、二重特異性抗体などの抗体に毒素をコンジュゲートしてもよい。このような抗体は、例えば、ある特定の型の細胞にしか見出されないマーカーを使用して、特異的な細胞集団をターゲティングするために有用である。免疫毒素の調製は、概して、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第４，３４０，５３５号およびＥＰ４４１６７を参照されたい）。毒素部分をポリペプチドとコンジュゲートするために首尾よく用いることのできる、多数の種類のジスルフィド結合含有リンカーが公知である。一実施形態では、立体的に「妨害」されたジスルフィド結合を含有するリンカーは、それらのｉｎｖｉｖｏ安定性がより高く、したがって作用部位において結合する前の毒素部分の放出が防止されることから好ましい。本発明のポリペプチドまたは抗体にコンジュゲートすることのできる多種多様な毒素が公知である。例としては、多数の有用な植物由来、真菌由来、またはさらには細菌由来の毒素が挙げられ、これらは、例として、様々なＡ鎖毒素、特にリシンＡ鎖、リボソーム不活性化タンパク質、例えばサポリンまたはゲロニン、α−サルシン、アスペルギリン、レストリクトシン、リボヌクレアーゼ、例えば胎盤リボヌクレアーゼ、血管新生薬、ジフテリア毒素、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素などを含む。本発明との関連で使用するのに好ましい毒素部分は、炭水化物残基を修飾または除去するよう処理された毒素Ａ鎖、脱グリコシル化Ａ鎖である。（米国特許第５，７７６，４２７号）。このような細胞傷害剤のうちの１つまたは組合せ（例えば、リシン融合物）の患者への注入は、免疫細胞の死をもたらしうる。

なおも別の実施形態では、本明細書に記述される薬剤の投与の前に、それと同時に、またはその後に、リンパ枯渇（ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）のステップを組み込むことにより、本明細書に記述される処置方法の有効性が増強しうる。例えば、記述される薬剤を投与することの治療利益は、このような投与をリンパ枯渇後またはそれと併せて行うことにより、相乗的に増強しうる。様々な形態および様々なレベルでリンパ枯渇を実現するための方法が、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第７，１３８，１４４号を参照されたい）。例えば、「一過的なリンパ枯渇」という用語は、通常は免疫療法前のリンパ球およびＴ細胞の破壊を指す。これは、投与が適用される対象集団の全てのメンバーに対して概して非致死的である１回用量または複数用量の放射線の投与を指す「致死量以下の照射」を含め、いくつかの方法で達成することができる。完全なリンパ枯渇の場合は骨髄破壊的であるが、一過的なリンパ枯渇は骨髄破壊的ではないことが一般的であり、そのため、対象の造血能または免疫能は、破壊されたリンパ球およびＴ細胞集団を再生させるのに十分にインタクトな状態を保つ。対照的に、「致死的な照射」は、投与が対象集団の一部のメンバーには概して致死的であるが全てのメンバーには致死的でないときに行われ、「致死量以上（ｓｕｐｒａｌｅｔｈａｌ）の照射」は、投与が対象集団の全てのメンバーに概して致死的であるときに行われる。

用途および目的に応じて、例えば、標準的なプロトコールに従った、照射、骨髄破壊剤での処置、および／または免疫抑制剤での処置の任意の組合せにより、一過的なリンパ枯渇または完全なリンパ枯渇がもたらされうる。例えば、生物学的方法は、免疫抑制細胞の投与、または、例えばＦａｓ−リガンドおよびＣＴＬＡ４−Ｉｇなどの免疫反応性を阻害する能力のある生物学的分子の投与によるものを含む。骨髄破壊剤の例としては、ブスルファン、ジメチルミレラン、メルファラン、およびチオテパが挙げられる。免疫抑制剤の例としては、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、アザチオプリン、シクロスポリンＡ、シクロホスファミド、フルダラビン、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、抗Ｔ細胞抗体などが挙げられる。

照射に関し、致死量以下の用量の照射は一般に、全身照射１〜７．５Ｇｙの範囲内であり、致死用量は一般に、全身照射７．５〜９．５Ｇｙの範囲内であり、致死量以上の用量は、全身照射９．５〜１６．５Ｇｙの範囲内である。

用途および目的に応じて、この照射用量は、単回用量として投与されても、分割用量として投与されてもよい。同様に、１回用量または複数用量の照射の投与は、本質的に身体部分またはその一部分のみで骨髄減少（ｍｙｅｌｏｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）または骨髄破壊が誘導されるように、本質的に身体部分またはその一部分のみに対して達成されてもよい。当技術分野では広く認識されているように、対象は、手足などの身体部分への超高レベルの選択的照射を致死量以下のコンディショニングとして耐えられる場合があるが、この超高レベルは、全身照射のために使用された場合は致死的または致死量以上のコンディショニングとなる（例えば、Breitz（２００２年）、Cancer Biother Radiopharm.、１７巻：１１９頁；Limit（１９９７年）、J. Nucl. Med.、３８巻：１３７４頁；および、DritschiloおよびSherman（１９８１年）、Environ. Health Perspect.、３９巻：５９頁を参照されたい）。このような身体部分またはその一部分の選択的照射は、免疫障害の処置において、特異的な組織または免疫細胞集団などの特定の血液コンパートメントをターゲティングするために有利に使用することができる。

ｃ．Ｔ細胞疲弊および／または免疫障害の調整に有用なさらなる薬剤および療法
本明細書に記述される遺伝子操作T細胞は、単独で使用することも、１つまたは複数のさらなる治療剤と組み合わせて使用することもできる。本明細書に記述される調整剤（例えば、抗体、小分子、ペプチド、融合タンパク質、または小核酸）は、医薬組成物に組み込み、対象にｉｎｖｉｖｏで投与することができる。組成物は、単一のかかる分子または薬剤を含有しても、本明細書に記述される薬剤の任意の組合せを含有してもよい。本明細書に記述される「単一活性剤」は、本明細書において提供される方法および組成物に従い、当技術分野で公知の他の薬理学的に活性な化合物（「第２の活性剤」）と組み合わせることができる。免疫応答の調整の恩恵を受ける状態の処置において、ある特定の組合せが相乗的に機能すると考えられる。第２の活性剤は、大分子（例えば、タンパク質）であっても小分子（例えば、合成無機分子、有機金属分子、または有機分子）であってもよい。例えば、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および抗ＴＩＭ−３抗体を、抗ＬＡＧ−３抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体など、またはそれらの組合せとさらに組み合わせてもよい。

ある特定の事例では、免疫応答をさらに増大させるために、免疫応答を上方制御する他の薬剤、例えば、共刺激性受容体を介してシグナルを伝達する他のＢ７ファミリーメンバーの形態をさらに投与することが望ましい場合がある。このようなさらなる薬剤および療法をさらに後述する。

免疫応答を上方制御する薬剤は、様々なポリペプチド（例えば、病原体由来のポリペプチド）に対するワクチンにおいて予防的に使用されうる。病原体（例えば、ウイルス）に対する免疫は、免疫応答を上方制御する薬剤と共にウイルスタンパク質を適切なアジュバントにおいてワクチン接種することにより誘導することができる。

別の実施形態では、本明細書に記述される免疫応答機能の上方制御または増強は、腫瘍免疫の誘導に有用である。

別の実施形態では、免疫応答は、既存の耐性、クローン除去、および／または疲弊（例えば、Ｔ細胞疲弊）が克服されるように、本明細書に記述される方法によって刺激されうる。例えば、対象が有意な免疫応答をしかけることができない抗原、例えば腫瘍特異的抗原などの自己抗原に対する免疫応答が、本明細書に記述される免疫応答を上方制御する適切な薬剤を投与することによって誘導されうる。一実施形態では、腫瘍特異的抗原などの自己抗原が共投与されてもよい。別の実施形態では、本薬剤は、能動免疫のプロセスにおいて外来抗原に対する応答を後押しするためのアジュバントとして使用されてもよい。

一実施形態では、免疫細胞が対象から得られ、本明細書に記述される薬剤の存在下でｅｘｖｉｖｏ培養されて、免疫細胞の集団が拡大し、かつ／または免疫細胞の活性化が増強される。さらなる実施形態では、免疫細胞が次いで対象に投与される。免疫細胞は、例えば、当技術分野で公知のように、免疫細胞に一次活性化シグナルおよび共刺激シグナルを与えることにより、ｉｎｖｉｔｒｏで刺激することができる。様々な薬剤を使用して免疫細胞の増殖を共刺激することもできる。一実施形態では、免疫細胞は、ＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／２９４３６に記述されている方法に従ってｅｘｖｉｖｏで培養される。共刺激性ポリペプチドは、可溶性であっても、細胞膜に結合していても、またはビーズなどの固体表面に結合していてもよい。

さらに別の実施形態では、例えば架橋などの当技術分野で公知の技術を使用して、または組換えＤＮＡ技術により、免疫応答を上方制御するのに有用な本明細書に記述される薬剤を毒素にさらに連結させても、または作動可能に結合させてもよい。このような薬剤は、所望の細胞の細胞破壊をもたらしうる。一実施形態では、二重特異性抗体などの抗体に毒素をコンジュゲートしてもよい。このような抗体は、例えば、ある特定の型の細胞にしか見出されないマーカーを使用して、特異的な細胞集団をターゲティングするために有用である。免疫毒素の調製は、概して、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第４，３４０，５３５号およびＥＰ４４１６７を参照されたい）。毒素部分をポリペプチドとコンジュゲートするために首尾よく用いることのできる、多数の種類のジスルフィド結合含有リンカーが公知である。一実施形態では、立体的に「妨害」されたジスルフィド結合を含有するリンカーは、それらのｉｎｖｉｖｏ安定性がより高く、したがって作用部位において結合する前の毒素部分の放出が防止されることから好ましい。本発明のポリペプチドまたは抗体にコンジュゲートすることのできる多種多様な毒素が公知である。例としては、多数の有用な植物由来、真菌由来、またはさらには細菌由来の毒素が挙げられ、これらは、例として、様々なＡ鎖毒素、特にリシンＡ鎖、リボソーム不活性化タンパク質、例えばサポリンまたはゲロニン、α−サルシン、アスペルギリン、レストリクトシン、リボヌクレアーゼ、例えば胎盤リボヌクレアーゼ、血管新生薬、ジフテリア毒素、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素などを含む。本発明との関連で使用するのに好ましい毒素部分は、炭水化物残基を修飾または除去するよう処理された毒素Ａ鎖、脱グリコシル化Ａ鎖である（米国特許第５，７７６，４２７号）。このような細胞傷害剤のうちの１つまたは組合せ（例えば、リシン融合物）の患者への注入は、免疫細胞の死をもたらしうる。

別の実施形態では、免疫応答の調整の恩恵を受ける状態の処置において、ある特定の組合せが相乗的に機能する。第２の活性剤は、大分子（例えば、タンパク質）であっても小分子（例えば、合成無機分子、有機金属分子、または有機分子）であってもよい。例えば、免疫チェックポイント阻害剤を、目的の状態の処置に有用な他の薬剤または療法とさらに組み合わせてもよい。

さらに、ある特定の免疫療法を使用して免疫応答を促進することができる。免疫療法は、がん抗原または疾患抗原に対する予め形成された抗体の投与（例えば、任意選択で化学療法剤または毒素に連結させたモノクローナル抗体の腫瘍抗原への投与）によって実現される、宿主の短期間の保護のための受動免疫を含みうる。免疫療法は、細胞傷害性リンパ球が認識するがん細胞株のエピトープを使用することに重点を置く場合もある。代替的に、腫瘍もしくはがんの開始、進行、および／または病理に結びつけられる生体分子を選択的に調整するために、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡ干渉分子、三重らせんポリヌクレオチドなどを使用してもよい。

一実施形態では、免疫療法は、養子細胞ベースの免疫療法を含む。周知の養子細胞ベースの免疫療法様式は、限定されないが、自己または同種腫瘍細胞の照射、腫瘍溶解物またはアポトーシス性腫瘍細胞、抗原提示細胞ベースの免疫療法、樹状細胞ベースの免疫療法、養子Ｔ細胞移入、養子ＣＡＲＴ細胞療法、自己免疫増強療法（ＡＩＥＴ）、がんワクチン、および／または抗原提示細胞を含む。このような細胞ベースの免疫療法は、１つまたは複数の遺伝子産物を発現して、免疫応答、例えばＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインの発現をさらに調整するように、かつ／または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）抗原、例えばＭａｇｅ−１、ｇｐ−１００、患者特異的ネオ抗原ワクチンなどを発現するように、さらに修正することができる。

別の実施形態では、免疫療法は、非細胞ベースの免疫療法を含む。大分子活性剤の例としては、造血性増殖因子、サイトカイン、ならびにモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が挙げられるが、これらに限定されない。典型的な大分子活性剤は、天然に存在するタンパク質または人工的に作製されたタンパク質などの生物学的分子である。本発明において特に有用なタンパク質としては、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏで造血前駆体細胞ならびに免疫学的に活性な形成細胞（ｐｏｉｅｔｉｃｃｅｌｌ）の生存および／または増殖を刺激するタンパク質が挙げられる。他のものは、細胞における委任（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）赤血球前駆細胞の分裂および分化をｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏで刺激する。特定のタンパク質としては、ＩＬ−２（組換えＩＬ−２（「ｒＩＬ２」）およびカナリアポックスＩＬ−２を含む）、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、およびＩＬ−１８などのインターロイキン；インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−ｎ１、インターフェロンアルファ−ｎ３、インターフェロンベータ−Ｉａ、およびインターフェロンガンマ−Ｉｂなどのインターフェロン；ＧＭ−ＣＦおよびＧＭ−ＣＳＦ；ならびにＥＰＯが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において提供される方法および組成物に使用することのできる特定のタンパク質としては、米国では商品名Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）（Ａｍｇｅｎ、ＴｈｏｕｓａｎｄＯａｋｓ、Ｃａｌｉｆ．）で販売されているフィルグラスチム；米国では商品名Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）（Ｉｍｍｕｎｅｘ、Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈ．）で販売されているサルグラモスチム；および米国では商品名Ｅｐｏｇｅｎ（登録商標）（Ａｍｇｅｎ、ＴｈｏｕｓａｎｄＯａｋｓ、Ｃａｌｉｆ．）で販売されている組換えＥＰＯが挙げられるが、これらに限定されない。組換え型および変異型のＧＭ−ＣＳＦは、全て参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，３９１，４８５号、同第５，３９３，８７０号、および同第５，２２９，４９６号に記述されているように調製することができる。組換え型および変異型のＧ−ＣＳＦは、全て参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，８１０，６４３号、同第４，９９９，２９１号、同第５，５２８，８２３号、および同第５，５８０，７５５号に記述されているように調製することができる。

一実施形態では、ワクチンを増強させるアジュバントありまたはなしで抗原を含む組成物が使用される。このような組成物は、例えばペプチド組成物、腫瘍溶解性ウイルス、融合タンパク質を含む組換え抗原などの多くの周知の形態で存在する。さらに別の実施形態では、例えばＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−２３などの免疫調整性インターロイキン、ならびにそれらの調整因子（例えば、遮断抗体またはより強力もしくは長時間持続性の形態）が使用される。別の実施形態では、例えばＣＣＬ３、ＣＣＬ２６、およびＣＸＣＬ７などの免疫調整性ケモカイン、ならびにそれらの調整因子（例えば、遮断抗体またはより強力もしくは長時間持続性の形態）が使用される。別の実施形態では、免疫抑制をターゲティングする免疫調整性分子、例えばＳＴＡＴ３シグナル伝達調整因子、ＮＦカッパＢシグナル伝達調整因子、および免疫チェックポイント調整因子が使用される。「免疫チェックポイント」および「抗免疫チェックポイント療法」という用語は上述されている。

さらに別の実施形態では、免疫調整薬、例えば免疫細胞分裂停止薬（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｓｔａｔｉｃｄｒｕｇ）、グルココルチコイド、細胞分裂停止薬、イムノフィリンおよびそれらの調整因子（例えば、ラパマイシン、カルシニューリン阻害剤、タクロリムス、シクロスポリン（ｃｉｃｌｏｓｐｏｒｉｎ）（シクロスポリン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ））、ピメクロリムス、アベチムス、グスペリムス、リダフォロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、ゾタロリムスなど）、ヒドロコルチゾン（コルチゾール）、酢酸コルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、トリアムシノロン、ベクロメタゾン、酢酸フルドロコルチゾン、酢酸デオキシコルチコステロン（ｄｏｃａ）アルドステロン、非グルココルチコイドステロイド、ピリミジン合成阻害剤、レフルノミド、テリフルノミド、葉酸類似体、メトトレキサート、抗胸腺細胞グロブリン、抗リンパ球グロブリン、サリドマイド、レナリドミド、ペントキシフィリン、ブプロピオン、クルクミン、カテキン、オピオイド、ＩＭＰＤＨ阻害剤、ミコフェノール酸、ミリオシン、フィンゴリモド、ＮＦ−ｘＢ阻害剤、ラロキシフェン、ドロトレコギンアルファ、デノスマブ、ＮＦ−ｘＢシグナル伝達カスケード阻害剤、ジスルフィラム、オルメサルタン、ジチオカルバメート、プロテアソーム阻害剤、ボルテゾミブ、ＭＧ１３２、Ｐｒｏｌ、ＮＰＩ−００５２、クルクミン、ゲニステイン、レスベラトロール、パルテノライド、サリドマイド、レナリドミド、フラボピリドール、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、三酸化ヒ素、デヒドロキシメチルエポキシキノマイシン（ＤＨＭＥＱ）、Ｉ３Ｃ（インドール−３−カルビノール）／ＤＩＭ（ジ−インドールメタン）（１３Ｃ／ＤＩＭ）、Ｂａｙ１１−７０８２、ルテオリン、細胞透過性ペプチドＳＮ−５０、ＩＫＢａスーパーリプレッサーの過剰発現、ＮＦＫＢデコイオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、またはこれらのいずれかの誘導体もしくは類似体が使用される。なおも別の実施形態では、免疫調整性の抗体またはタンパク質が使用される。例えば、ＣＤ４０、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、もしくは４−１ＢＢに結合する抗体、Ｔ細胞二重特異性抗体、抗ＩＬ−２受容体抗体、抗ＣＤ３抗体、ＯＫＴ３（ムロモナブ）、オテリキシズマブ、テプリズマブ、ビジリズマブ、抗ＣＤ４抗体、クレノリキシマブ、ケリキシマブ、ザノリムマブ、抗ＣＤ１１ａ抗体、エファリズマブ、抗ＣＤ１８抗体、エルリズマブ、ロベリズマブ、抗ＣＤ２０抗体、アフツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、パスコリズマブ、リツキシマブ、抗ＣＤ２３抗体、ルミリキシマブ、抗ＣＤ４０抗体、テネリキシマブ、トラリズマブ、抗ＣＤ４０Ｌ抗体、ルプリズマブ、抗ＣＤ６２Ｌ抗体、アセリズマブ、抗ＣＤ８０抗体、ガリキシマブ、抗ＣＤ１４７抗体、ガビリモマブ（ｇａｖｉｌｉｍｏｍａｂ）、Ｂリンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）阻害抗体、ベリムマブ、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ融合タンパク質、アバタセプト、ベラタセプト、抗ＣＴＬＡ４抗体、イピリムマブ、トレメリムマブ、抗エオタキシン１抗体、ベルチリムマブ、抗ａ４−インテグリン抗体、ナタリズマブ、抗ＩＬ−６Ｒ抗体、トシリズマブ、抗ＬＦＡ−１抗体、オデュリモマブ（ｏｄｕｌｉｍｏｍａｂ）、抗ＣＤ２５抗体、バシリキシマブ、ダクリズマブ、イノリモマブ、抗ＣＤ５抗体、ゾリモマブ、抗ＣＤ２抗体、シプリズマブ、ネレリモマブ、ファラリモマブ（ｆａｒａｌｉｍｏｍａｂ）、アトリズマブ、アトロリムマブ、セデリズマブ、ドルリモマブ・アリトクス（ｄｏｒｌｉｍｏｍａｂａｒｉｔｏｘ）、ドルリキシズマブ（ｄｏｒｌｉｘｉｚｕｍａｂ）、フォントリズマブ、ガンテネルマブ、ゴミリキシマブ、レブリリズマブ（ｌｅｂｒｉｌｉｚｕｍａｂ）、マスリモマブ（ｍａｓｌｉｍｏｍａｂ）、モロリムマブ（ｍｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）、パキセリズマブ、レスリズマブ、ロベリズマブ、タリズマブ、テリモマブ・アリトクス（ｔｅｌｉｍｏｍａｂａｒｉｔｏｘ）、バパリキシマブ（ｖａｐａｌｉｘｉｍａｂ）、ベパリモマブ、アフリベルセプト、アレファセプト、リロナセプト、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、アナキンラ、抗ＩＬ−５抗体、メポリズマブ、ＩｇＥ阻害剤、オマリズマブ、タリズマブ、ＩＬ１２阻害剤、ＩＬ２３阻害剤、ウステキヌマブなどである。

同様に、化学療法剤は当技術分野で周知である。例えば、化学療法剤としては、アルキル化剤、例えばチオテパおよびシクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（商標））；スルホン酸アルキル、例えばブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパ；アルトレタミン（alfretamine）、トリエミレンメラミン（ｔｒｉｅｍｙｌｅｎｅｍｅｌａｍｉｎｅ）、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、およびトリメミロロメラミン（ｔｒｉｍｅｍｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むエミレルミン（ｅｍｙｌｅｒｕｍｉｎｅｓ）およびメミラメラミン（ｍｅｍｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）；アセトゲニン（とりわけブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼルシンおよびビセレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９およびＣＢＩ−ＴＭＩを含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォレムスチン（ｆｏｒｅｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えばエンジイン抗生物質（例えば、カリチアマイシン、とりわけカリチアマイシンガンマ１Ｉおよびカリチアマイシンファイ１Ｉ）；ダイネマイシンＡを含むダイネマイシン；ビスホスホネート、例えばクロドロネート；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチンクロモフォアおよび関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（Ａｄｒａｍｙｃｉｎ（商標））（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、例えばメトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えばデモプテリン（ｄｅｍｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート；プリン類似体、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充剤、例えばフロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃａｃｉｄ）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ヘストラブシル（ｈｅｓｔｒａｂｕｃｉｌ）；ビスアントレン；エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン；デメコルチン；ジアジクオン；エルホルムチン（ｅｌｆｏｒｍｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；マイタンシノイド、例えばマイタンシンおよびアンサマイトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメト（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（商標）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエミラミン（２，２’，２’’−ｔｒｉｃＵｏｒｏｔｒｉｅｍｙｌａｍｉｎｅ）；トリコテセン（とりわけＴ−２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオペタ（ｔｈｉｏｐｅｔａ）；タキソイド、例えば、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（商標）、ＢｒｉｓｔｏｌＭｅｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂＯｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）およびドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅｔ（商標）、Ｒｈｏｎｅ−ＰｏｕｌｅｎｃＲｏｒｅｒ、Ａｎｔｏｎｙ、Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（商標））；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、例えばシスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトロキサントロン（ｍｉｔｒｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；バンクリスチン（ｖａｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）；ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（商標））；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ（xeoloda）；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えばレチノイン酸；カペシタビン；ならびに上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。「化学療法剤」の定義には、例えば、タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ（商標）を含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ（商標））を含む、抗エストロゲン薬および選択的エストロゲン受容体調整因子（ＳＥＲＭ）などの、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤；副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素であるアロマターゼの阻害剤、例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール（Ｍｅｇａｃｅ（商標））、エキセメスタン、ホルメスタン、ファドロゾール、ボロゾール（Ｒｉｖｉｓｏｒ（商標））、レトロゾール（Ｆｅｍａｒａ（商標））、およびアナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（商標））；ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリド（leuprohde）、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲン薬；ならびに上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体も含まれる。一部の実施形態では、阻害剤は、Ｒａｃ１の出力を下方制御する。化学療法剤および他の抗がん剤のさらなる例は、米国特許公開第２０１３／０２３９２３９号および同第２００９／００５３２２４号に記述されている。

免疫応答を増強する栄養補助剤、例えばビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣなどは、当技術分野で周知であり（例えば、米国特許第４，９８１，８４４号および同第５，２３０，９０２号ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ２００４／００４４８３を参照されたい）、本明細書に記述されている方法において使用することができる。

同様に、薬剤および免疫療法以外の療法またはそれらの組合せを使用して、免疫応答を刺激することにより、その恩恵を受ける状態を処置することができる。例えば、化学療法、放射線、エピジェネティック修飾因子（例えば、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）修飾因子、メチル化修飾因子、リン酸化修飾因子など）、ターゲティングによる療法などが当技術分野で周知である。

さらに別の実施形態では、「ターゲティングによる療法」という用語は、選択された生体分子と選択的に相互作用することによりがんを処置する薬剤の投与を指す。例えば、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））は、腫瘍増殖に付随する血管新生を阻害するように血管内皮増殖因子をターゲティングするヒト化モノクローナル抗体である（例えば、米国特許公開第２０１３／０１２１９９９号、ＷＯ２０１３／０８３４９９、およびPrestaら（１９９７年）、Cancer Res.、５７巻：４５９３〜４５９９頁を参照されたい）。一部の場合では、ターゲティングによる療法は、標的が免疫調整性機能を調節するかどうかに応じて、免疫療法の形態でありうる。

「ターゲティングによらない療法」という用語は、選択された生体分子と選択的に相互作用しなくともがんを処置する薬剤の投与を指す。ターゲティングによらない療法の代表的な例としては、限定されないが、化学療法、遺伝子療法、および放射線療法が挙げられる。

別の実施形態では、ホルモン療法が使用される。ホルモンによる治療的処置は、例えば、ホルモンアゴニスト、ホルモンアンタゴニスト（例えば、フルタミド、ビカルタミド、タモキシフェン、ラロキシフェン、リュープロリド酢酸塩（ＬＵＰＲＯＮ）、ＬＨ−ＲＨアンタゴニスト）、ホルモンの生合成およびプロセシングの阻害剤、ならびにステロイド（例えば、デキサメタゾン、レチノイド、デルトイド、ベタメタゾン、コルチゾール、コルチゾン、プレドニゾン、デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、ミネラルコルチコイド、エストロゲン、テストステロン、プロゲスチン）、ビタミンＡ誘導体（例えば、全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ））；ビタミンＤ３類似体；抗ゲスターゲン薬（ａｎｔｉｇｅｓｔａｇｅｎｓ）（例えば、ミフェプリストン、オナプリストン）、または抗アンドロゲン薬（例えば、酢酸シプロテロン）を含みうる。

さらに別の実施形態では、処置方法は、免疫応答をさらに下方調整するために、共刺激性経路の活性、例えばＢ７−１、Ｂ７−２、またはＢ７−３などの他のＢリンパ球抗原の活性を遮断する薬剤をさらに使用する場合がある。対象の免疫細胞媒介性免疫応答をより有効に下方制御するために、免疫応答を下方調整する２つの別々の薬剤が単一の組成物として組み合わせられる場合もあれば、別々に（同時または経時的に）投与される場合もある。さらに、免疫応答に影響を与えるために、本薬剤のうちの１つまたは複数の治療活性量を他の下方調整試薬と併せて使用してもよい。他の免疫調整試薬の例としては、限定されないが、共刺激シグナルを遮断する抗体（例えば、ＣＤ２８またはＩＣＯＳに対するもの）、ＣＴＬＡ４のアゴニストとして作用する抗体、および／または他の免疫細胞マーカーに対する抗体（例えば、ＣＤ４０に対するもの、ＣＤ４０リガンドに対するもの、またはサイトカインに対するもの）、融合タンパク質（例えば、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ）、ならびに免疫抑制薬（例えば、ラパマイシン、シクロスポリンＡ、またはＦＫ５０６）が挙げられる。

さらに、免疫チェックポイントタンパク質の活性を促進する薬剤が有用である。

「免疫チェックポイントタンパク質」という用語は、抗腫瘍免疫応答を下方調整または阻害することにより免疫応答を微調整する、ＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞表面上の分子の群を指す。免疫チェックポイントタンパク質は当技術分野で周知であり、限定されないが、上述のＣＴＬＡ−４、ならびにＰＤ−１、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ−Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−３、ＴＩＭ−４、ＬＡＧ−３、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰアルファ（ＣＤ４７）、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ−２、ＩＬＴ−４、ＴＩＧＩＴ、およびＡ２ａＲを含む（例えば、ＷＯ２０１２／１７７６２４を参照されたい）。免疫チェックポイントタンパク質のレベルおよび活性を促進するのに有用な薬剤は、当技術分野で周知である。

なおも別の実施形態では、任意の第１選択または第２選択の免疫障害処置を本発明の方法と組み合わせてもよい。代表的な例としては、ステロイド系、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、およびペントスタチンが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Buscaら（２０００年）、Bone Marrow Transplant、２５巻：１０６７〜１０７１頁；Bergerら（２００７年）、J. Pediatr. Hematol. Oncol.、２９巻：６７８〜６８７頁；Jacobsohnら（２００９年）、Blood、１１４巻：４３５４〜４３６０頁を参照されたい）。

本明細書では、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０個、またはそれよりも多くの小核酸もしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそれらの誘導体を含むか、あるいはそれらを発現する能力のある、１つまたは複数の核酸を含む組成物も提供され、ここで、細胞における前記小核酸もしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそれらの誘導体は、細胞条件下で細胞核酸（例えば、小さな非コードＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ、プリｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ＊、抗ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ結合部位、それらの変異形および／もしくは機能的変異形、細胞ｍＲＮＡまたはその断片）と特異的にハイブリダイズ（例えば、結合）する。一実施形態では、細胞における小核酸もしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそれらの誘導体の発現は、例えば、本発明の１つまたは複数のバイオマーカー、例えば、表１に列記された１つまたは複数のバイオマーカー、またはそれらの断片を含むものの転写、翻訳および／または小核酸プロセシングを阻害することにより、細胞核酸および／またはタンパク質の発現または生物学的活性を阻害することができる（Zengら（２００２年）、Mol. Cell、９巻：１３２７〜１３３３頁；Tuschl（２００２年）、Nat. Biotechnol.、２０巻：４４６〜４４８頁；Brummelkampら（２００２年）、Science、２９６巻：５５０〜５５３頁；Miyagishiら（２００２年）、Nat. Biotechnol.、２０巻：４９７〜５００頁；Paddisonら（２００２年）、Genes Dev.、１６巻：９４８〜９５８頁；Leeら（２００２年）、Nat. Biotechnol.、２０巻：５００〜５０５頁；およびPaulら（２００２年）、Nat. Biotechnol.、２０巻：５０５〜５０８頁；米国特許第５，１７６，９９６号、同第５，２６４，５６４号、および同第５，２５６，７７５号；van der Krolら（１９８８年）、BioTechniq.、６巻：９５８〜９７６頁；Steinら（１９８８年）、Cancer Res.、４８巻：２６５９〜２６６８頁；Wagner（１９９４年）、Nature、３７２巻：３３３頁；Letsingerら（１９８９年）、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、８６巻：６５５３〜６５５６頁；Lemaitreら（１９８７年）、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、８４巻：６４８〜６５２頁；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０およびＷＯ８９／１０１３４；Zon（１９８８年）、Pharm. Res.、５巻：５３９〜５４９頁）。

小核酸および／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、中性のペプチド様骨格を含有する場合もある。このような分子はペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーと呼ばれ、例えば、Perry-O’Keefeら（１９９６年）、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、９３巻：１４６７０頁；Eglomら（１９９３年）、Nature、３６５巻：５６６頁；Gautierら（１９８７年）、Nucl. Acids Res.、１５巻：６６２５〜６６４１頁；Inoueら（１９８７年）、Nucl. Acids Res.、１５巻：６１３１〜６１４８頁；Inoueら（１９８７年）、FEBS Lett.、２１５巻：３２７〜３３０頁；Sarinら（１９８８年）、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、８５巻：７４４８〜７４５１頁；Elbashirら（２００１年）、Nature、４１１巻：４９４〜４９８頁；McManusら（２００２年）、RNA、８巻：８４２頁；Xiaら（２００２年）、Nat. Biotechnol.、２０巻：１００６頁；およびBrummelkampら（２００２年）、Science、２９６巻：５５０頁に記述されている。

細胞ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断するように設計されたリボザイム分子を、細胞ｍＲＮＡの翻訳および細胞ポリペプチドの発現、またはそれらの両方を防止するために使用することもできる（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１１３６４；Sarverら（１９９０年）、Science、２４７巻：１２２２〜１２２５頁；および米国特許第５，０９３，２４６号；HaseloffおよびGerlach（１９８８年）、Nature、３３４巻：５８５〜５９１頁；Zaugら（１９８４年）、Science、２２４巻：５７４〜５７８頁；Zaugら（１９８６年）、Science、２３１巻：４７０〜４７５頁；Zaugら（１９８６年）、Nature、３２４巻：４２９〜４３３頁；ＷＯ８８／０４３００；およびBeenら（１９８６年）、Cell、４７巻：２０７〜２１６頁）。

細胞遺伝子の転写の阻害のために三重らせん形成において使用される核酸分子は、一本鎖であり、デオキシリボヌクレオチドから構成されていることが好ましい。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、相当な長さの一続きのプリンまたはピリミジンのいずれかが二重鎖のうちの１つの鎖に存在することを概して必要とするＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対合規則により、三重らせん形成を促進するべきである。ヌクレオチド配列はピリミジンに基づいてもよく、これにより、結果として生じる三重らせんの関連した３つの鎖を横切るＴＡＴおよびＣＧＣの三塩基がもたらされる。ピリミジンリッチな分子は、その鎖と平行な配向にある二重鎖のうちの単一の鎖のプリンリッチな領域との塩基相補性をもたらす。加えて、プリンリッチである、例えば、一続きのＧ残基を含有する核酸分子を選択してもよい。これらの分子は、ＧＣ対が豊富なＤＮＡ二重鎖と三重らせんを形成し、この三重らせんでは、標的の二重鎖のうちの単一の鎖にプリン残基の大部分が位置し、三重鎖の３つの鎖を横切るＣＧＣ三塩基がもたらされる。

代替的に、三重らせん形成のためにターゲティングされうる潜在的な配列は、いわゆる「スイッチバック」核酸分子を作出することにより増加させることができる。スイッチバック分子は、それらが二重鎖のうち一方の鎖とまず塩基対合し、次いで他方と塩基対合するように、交互になった５’−３’、３’−５’方式で合成され、相当な長さの一続きのプリンまたはピリミジンのいずれかが二重鎖のうちの１つの鎖に存在する必要性が排除される。

本明細書で提示される方法および組成物の小核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ、プレｍｉＲＮＡ、プリｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ＊、抗ｍｉＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡ結合部位、またはそれらの変異形）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、および三重らせん分子は、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の合成のための当技術分野で公知の任意の方法によって調製されうる。これらは、当技術分野で周知のオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学合成するための技術、例えば、固相ホスホラミダイト化学合成などを含む。代替的に、ＲＮＡ分子は、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏ転写によって生成されてもよい。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの好適なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込む多種多様なベクターに組み込まれてもよい。代替的に、使用されるプロモーターに応じて構成的または誘導的にアンチセンスＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物を細胞株に安定に導入してもよい。

さらに、細胞内安定性および半減期を増加させる手段として、核酸分子への様々な周知の修飾を導入してもよい。可能性のある修飾としては、分子の５’末端および／もしくは３’末端へのリボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列の付加、またはオリゴデオキシリボヌクレオチド骨格内におけるホスホジエステラーゼ結合の代わりのホスホロチオエートもしくは２’Ｏ−メチルの使用が挙げられるが、これらに限定されない。ポリペプチド、小核酸、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが、例えばタンパク質検出の手段として機能する別のペプチドまたはポリペプチド（例えば、異種性ペプチド）にさらに連結されうることは、当業者であれば容易に理解するであろう。本発明における検出に有用な標識ペプチドまたはポリペプチド部分の非限定的な例としては、限定されないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなどの好適な酵素；ＦＬＡＧタグ、ＭＹＣタグ、ＨＡタグ、またはＨＩＳタグなどのエピトープタグ；緑色蛍光タンパク質などのフルオロフォア；染料；放射性同位元素；ジゴキシゲニン；ビオチン；抗体；ポリマー；ならびに、当技術分野において、例えばPrinciples of Fluorescence Spectroscopy、Joseph R. Lakowicz（編者）、Plenum Pub Corp、第２版（１９９９年７月）において公知の他のものが挙げられる。

これらの薬剤は、対象に投与するのに好適な医薬組成物に組み込むことができる。このような組成物は典型的に、抗体、ペプチド、融合タンパク質、小分子など、および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」は、医薬品の投与と適合性のある、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを含むよう意図される。このような媒体および薬剤を薬学的に活性な物質に使用することは、当技術分野で周知である。いずれかの従来型の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除き、組成物中にそれを使用することが想定される。補助的な活性化合物を組成物中に組み込むこともできる。

本発明の医薬組成物は、その意図される投与ルートと適合性があるように製剤化される。投与ルートの例としては、非経口投与、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口投与（例えば、吸入）、経皮（局所）投与、経粘膜投与、および直腸投与が挙げられる。非経口適用、皮内適用、もしくは皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、次の成分を含みうる：滅菌希釈剤、例えば注射用水、食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの浸透圧加減のための薬剤。酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムでｐＨを加減してもよい。非経口調製物は、ガラスもしくはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または複数用量バイアルに封入してもよい。

注射用途に好適な医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散物、ならびに滅菌注射用溶液または分散物を即時調製するための滅菌粉末を含む。静脈内投与の場合、好適な担体は、生理食塩水、静菌水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。全ての場合において、組成物は無菌であるべきであり、容易な注入性が存在する程度に流動性であるべきである。これは、製造および保管の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の混入作用から保護されているべきである。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにそれらの好適な混合物を含有する、溶媒または分散媒とすることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤を使用することにより、分散物の場合は要求される粒径を維持することにより、また、界面活性剤を使用することにより、維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって実現することができる。多くの場合において、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらすことができる。

滅菌注射用溶液は、必要に応じて上記に列挙した成分のうちの１つまたは組合せと共に、適切な溶媒中に必要量で活性化合物を組み込んでから濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散物は、基本分散媒および上記に列挙したもののうち必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクルに、活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合では、好ましい調製方法は、事前に滅菌濾過されたその溶液から活性成分と任意のさらなる所望の成分の粉末をもたらす、真空乾燥および冷凍乾燥である。

経口組成物は一般に、不活性希釈剤または食用担体を含む。これらは、ゼラチンカプセルに封入される場合もあれば、錠剤に圧縮される場合もある。治療的経口投与の目的では、活性化合物は、賦形剤に組み込まれ、錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用されうる。経口組成物は、洗口剤として使用するための流動性担体を使用して調製することもでき、この流動性担体中の化合物は経口的に適用され、ゆすぎおよび吐出、または嚥下が行われる。薬学的に適合性のある結合剤および／またはアジュバント材料を組成物の一部として含めてもよい。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、次の成分または同様の性質の化合物のうちのいずれかを含有しうる：微結晶セルロース、トラガカントガム、もしくはゼラチンなどの結合剤；デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、もしくはトウモロコシデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅｓなどの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）；スクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ風味料などの風味剤。

吸入による投与の場合、化合物は、好適な推進剤、例えば二酸化炭素などのガスを含有する加圧容器もしくは分注器、またはネブライザから、エアロゾルスプレーの形態で送達される。

全身投与も、経粘膜手段または経皮手段によるものでありうる。経粘膜または経皮投与の場合、透過されるべきバリアに適切な浸透剤が製剤中に使用される。このような浸透剤は一般に当技術分野で公知であり、例えば、経粘膜投与の場合は、洗剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻腔スプレーまたは坐薬の使用によって達成されうる。経皮投与の場合、活性化合物は、当技術分野で一般に公知のように、軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに製剤化される。

化合物は、坐薬（例えば、カカオバターおよび他のグリセリドなどの従来型の坐薬ベースを用いて）または直腸送達のための停留かん腸の形態で調製される場合もある。

一実施形態では、調整剤は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤など、身体からの急速な排除から化合物を保護する担体と共に調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸など、生分解性、生体適合性のポリマーを使用してもよい。このような製剤の調製方法は当業者には明らかであろう。また材料は、ＡｌｚａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃから商業的に得ることができる。リポソーム懸濁液（モノクローナル抗体またはウイルス抗原を含む感染細胞にターゲティングされたリポソームを含む）を薬学的に許容される担体として使用することもできる。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記述されているように、当業者に公知の方法に従って調製することができる。

経口組成物または非経口組成物は、投与の容易さおよび投与量の均一性のために、単位剤形で製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される単位剤形とは、処置される対象のための投与量単位として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、要求される薬学的担体との関連で所望の治療効果をもたらすように計算された所定分量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形の仕様は、活性化合物特有の特徴、実現すべき特定の治療効果、および個体の処置のためにかかる活性化合物の調剤を行う技術分野に固有の制限に左右され、それらに直接依存する。

かかる化合物の毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比が治療指数であり、これは、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。高い治療指数を呈する化合物が好ましい。毒性の副作用を呈する化合物を使用してもよいが、非感染細胞に対する損傷の可能性を最小限に抑えることにより副作用を低減させるために、かかる化合物を患部組織の部位にターゲティングする送達系を設計するよう注意すべきである。

細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータは、ヒトに使用するための、ある範囲の投与量を処方するのに使用されうる。かかる化合物の投与量は、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む、ある範囲の循環濃度内であることが好ましい。投与量は、用いられる剤形および利用される投与ルートに応じて、この範囲内で異なってもよい。本発明の方法において使用されるいずれの化合物についても、治療有効用量は初めに細胞培養アッセイから推定されうる。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養下で決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量の阻害を実現する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を実現するように処方されうる。このような情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。

上述の調整剤は、前記薬剤をコードする発現可能な核酸の形態で投与されてもよい。このような核酸およびそれらが含有された組成物も、本発明により包含される。例えば、本発明の核酸分子をベクターに挿入し、遺伝子療法ベクターとして使用してもよい。遺伝子療法ベクターは、例えば、静脈内注射、局所的投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照されたい）、または定位注射（例えば、Chenら（１９９４年）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、９１巻：３０５４〜３０５７頁を参照されたい）によって、対象に送達することができる。遺伝子療法ベクターの医薬品調製物は、許容される希釈剤中に遺伝子療法ベクターを含んでもよいし、遺伝子送達ビヒクルが包埋された徐放性マトリックスを含んでもよい。代替的に、完全な遺伝子送達ベクターは、組換え細胞からインタクトに産生されたもの、例えば、レトロウイルスベクターであり得る場合、医薬品調製物は、遺伝子送達系を産生する１つまたは複数の細胞を含んでもよい。

医薬組成物は、投与に関する説明と一緒に容器、パック、または分注器に含まれていてもよい。

ｄ．臨床的有効性
臨床的有効性は、当技術分野で公知の任意の方法によって測定することができる。例えば、さらなる治療剤ありまたはなしの操作T細胞の投与などの療法への応答は、療法に対するＴ細胞疲弊および／または免疫障害、例えば腫瘍の応答の任意の調整、好ましくはネオアジュバントもしくはアジュバント化学療法の開始後の腫瘍質量および／または体積の変化に関する。

例えば、感染作用因子により生じる免疫障害の処置に関する臨床的有効性は、対象における感染性微生物（例えば、ウイルス、細菌、真菌、マイコプラズマ、または寄生虫）の負荷の低減を、無処置の対照におけるかかる負荷と比べて決定することを含みうる。均等な無処置の対照と比較した場合、そのような低減または防止の程度は、任意の標準的技術により測定して少なくとも５％、１０％、２０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、９５％、または１００％である。感染作用因子は、当技術分野で公知の任意の標準的方法によって検出した際に完全に除去されている場合がある。診断およびモニタリングは、例えば、生体試料（例えば、組織生検、血液検査、または尿検査）における微生物負荷のレベルを検出すること、生体試料中の感染作用因子のバイオマーカー代理マーカーのレベルを検出すること、慢性免疫障害に関連した症状を検出すること、または慢性免疫障害に典型的な免疫応答に関与する免疫細胞を検出すること（例えば、抗原特異的な疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞の検出）を含みうる。

がんに対する臨床的有効性を査定することもできる。腫瘍応答は、ネオアジュバントまたはアジュバントの状況下で査定することができ、ここでは、全身性介入後の腫瘍のサイズが、ＣＴ、ＰＥＴ、マンモグラム、超音波、または触診により測定した初期のサイズおよび寸法と比較される場合があり、腫瘍の細胞充実性が、組織学的に推定され、処置開始前に取られた腫瘍生検の細胞充実性と比較される場合がある。応答は、生検または外科的切除後の腫瘍のキャリパー測定または病理学的検査によって査定することもできる。応答は、腫瘍体積または細胞充実性の百分率変化のように定量的に記録される場合もあれば、残留がん負荷量（Symmansら、J. Clin. Oncol.（２００７年）、２５巻：４４１４〜４４２２頁）もしくはＭｉｌｌｅｒ−Ｐａｙｎｅスコア（Ogstonら（２００３年）、Breast（Edinburgh、Scotland）、１２巻：３２０〜３２７頁）などの半定量的スコアリングシステムを使用して、「病理学的完全奏功」（ｐＣＲ）、「臨床的完全寛解」（ｃＣＲ）、「臨床的部分寛解」（ｃＰＲ）、「臨床的安定疾患」（ｃＳＤ）、「臨床的進行性疾患」（ｃＰＤ）のように定性的に記録される場合もあれば、他の定性的基準で記録される場合もある。腫瘍応答の査定は、ネオアジュバントまたはアジュバント療法の開始後早期、例えば、数時間後、数日後、数週間後、または好ましくは数か月後に行われうる。応答査定の典型的な終点は、ネオアジュバント化学療法の終結時または残留腫瘍細胞および／もしくは腫瘍母地の外科的除去時である。

一部の実施形態では、本明細書に記述される治療的処置の臨床的有効性は、臨床利益率（ＣＢＲ）を測定することによって決定されうる。臨床利益率は、療法終了時から少なくとも６か月経った時点における、完全寛解（ＣＲ）している患者の百分率、部分寛解（ＰＲ）している患者の数、および安定疾患（ＳＤ）を有する患者の数の和を決定することにより測定される。この式の簡潔表現は、ＣＢＲ＝６か月にわたるＣＲ＋ＰＲ＋ＳＤである。一部の実施形態では、特定の抗免疫チェックポイント阻害剤治療レジメンのＣＢＲは、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％であるか、またはそれよりも多い。

療法に対する応答を評価するためのさらなる基準は「生存期間」に関し、これには、次の全てが含まれる：全生存期間としても公知である、死亡までの生存期間（ここで前記死亡は、無関係の原因のものでも、腫瘍に関連するものでもよい）；「無再発生存期間」（ここで再発という用語は、局在化再発および遠隔再発の両方を含むものとする）；無転移生存期間；無疾患生存期間（ここで疾患という用語は、がんおよびがん関連疾患を含むものとする）。前記生存期間の長さは、規定の始点（例えば、診断時または処置開始時）および終点（例えば、死、再発、または転移）を参照することによって計算されうる。加えて、処置の有効性に関する基準は、化学療法への応答、生存確率、所与の期間中における転移の確率、および腫瘍再発の確率を含むように拡大されてもよい。

例えば、適切な閾値を決定するためには、ある治療レジメンを対象の集団に施し、その転帰を、その療法または任意の療法を施す前に決定されたバイオマーカー測定値と相関させることができる。転帰の測定値は、ネオアジュバント設定で与えられる療法に対する病理学的応答でありうる。代替的に、全生存期間および無疾患生存期間などの転帰の尺度は、バイオマーカー測定値が既知である対象の抗免疫チェックポイント阻害剤療法後の期間にわたってモニタリングしてもよい。ある特定の実施形態では、同じ用量の治療剤が各対象に投与される。関連する実施形態では、投与される用量は、かかる薬剤について当技術分野で公知の標準的な用量である。対象がモニタリングされる期間は様々でありうる。例えば、対象は、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０か月にわたってモニタリングされてもよい。ある療法の転帰と相関するバイオマーカー測定閾値は、実施例の節に記述されるものなどの方法を使用して決定することができる。

ＶＩ．さらなる方法
記述される治療方法に関して上述のように、本発明は、操作T細胞を単独で、あるいはさらなる治療剤と組み合わせて投与することにより、対象におけるＴ細胞疲弊および／または免疫障害を防止する予防方法も提供する。不要なＴ細胞疲弊および／または不要な免疫障害のリスクがある対象は、例えば、当技術分野で公知の診断アッセイまたは予後判定アッセイのうちのいずれかまたはそれらの組合せによって特定することができる。予防用薬剤の投与は、不要な免疫応答に関連する症状の兆候の前に行われてもよい。処置に使用される適切な薬剤（例えば、抗体、ペプチド、融合タンパク質、または小分子）は、臨床適応症に基づいて決定することができ、当技術分野で周知の診断アッセイならびに本明細書に記述されるものを使用して特定することができる。

本発明はまた、さらに後述される診断方法も提供する。

診断方法、予後判定方法、治療方法、またはそれらの組合せなど、本明細書に記述されるいずれの方法においても、方法のステップは全て、単一の動作主体によって行われても、または代替的に、１つを超える動作主体によって行われてもよい。例えば、治療的処置を提供する動作主体によって直接的に診断が行われてもよい。代替的に、治療剤を提供する人物が診断アッセイの実行を要求してもよい。診断医および／または治療介入者が診断アッセイ結果を解釈して、治療戦略を決定してもよい。同様に、このような代替的プロセスは、予後判定アッセイなどの他のアッセイにも適用されうる。

本発明は、対象におけるｉｎｖｉｖｏ処置に制限されない。例えば、Ｔ細胞は、ｅｘｖｉｖｏ手順（例えば、体外での免疫細胞のプロセシングおよび細胞の身体への再投与）のために対象から単離されてもよい。同様に、Ｔ細胞およびその改変形態は、ｉｎｖｉｔｒｏで培養されてもよい。ＰＤ−１エンハンサーなどの本発明のバイオマーカーの発現および／または活性は、Ｔ細胞内においてｉｎｖｉｔｒｏで、ｅｘｖｉｖｏで、またはｉｎｖｉｖｏで選択的に調整することができ、細胞プロセス（例えば、細胞増殖、分化、死など）または免疫応答（例えば、細胞傷害、サイトカイン産生など）に対して結果として生じる効果は、ｉｎｖｉｔｒｏ、ｅｘｖｉｖｏ、またはｉｎｖｉｖｏで分析することができる。このように、操作T細胞は、Ｔ細胞疲弊生物学を単独で、あるいは調節性Ｔ細胞などの他の細胞型および／または試験化合物での処置などの操作と組み合わせてアッセイするために、ｉｎｖｉｔｒｏで使用されてもよい。さらに、かかる操作は組み合わせて行うことができる。例えば、Ｔ細胞を対象から単離し、組換え遺伝子操作に供し、対象に再投与し、次いで治療薬の全身投与をｉｎｖｉｖｏで提供してもよい。

一態様では、本発明は、診断アッセイ、予後判定アッセイ、および臨床治験のモニタリングを予後判定（予測的）目的で使用することにより個体を予防的に処置する、予測的医学の分野に関する。したがって、本発明の一態様は、生体試料（例えば、血液、血清、細胞、または組織）という文脈において、疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞のゲノム内に選択的に存在するゲノム領域の量および／または活性レベルを単独で、あるいはゲノム領域が発現を調節する少なくとも１つの遺伝子の発現との関連で決定することにより、疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在および／または免疫障害に罹患した個体の状態を特定するための診断アッセイに関する。かかるアッセイを予後判定または予測の目的のために使用することにより、バイオマーカーポリペプチド、核酸発現もしくは活性によって特徴付けられるかまたはそれらに関連する障害の開始前または再発後の個体を予防的に処置することができる。当業者であれば、いずれの方法も表１に列記されたバイオマーカーのうちの１つまたは複数（例えば、組合せ）を使用しうることを察知するであろう。

本発明の別の態様は、表１に列記されたバイオマーカーの発現または活性に対する薬剤（例えば、薬物、化合物、および小核酸ベースの分子）の影響をモニタリングすることに関する。例えば、一態様では、Ｔ細胞疲弊および／または免疫応答を調整する薬剤を特定するための方法は、操作T細胞のＴ細胞機能を促進または阻害する候補薬剤の能力がもたらされることを決定することを伴う。一実施形態では、アッセイは、操作T細胞の、他の細胞型、例えばＴｒｅｇ、Ｔｅｆｆ、細胞ベースのワクチンなどとの物理的および／または機能的相互作用を査定する。別の実施形態では、アッセイは、遺伝子修飾から生じる遺伝子発現調整の量を査定する。アッセイはまた、発現が遺伝子調整によって調整される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれよりも多くの遺伝子の分析を組み合わせてもよい。

アッセイは細胞ベースのアッセイであり、例えば、本明細書に記述されるように修飾されたＴ細胞を試験薬剤と接触させ、目的の免疫関連細胞同士の間の物理的および／または機能的相互作用を調整（例えば、刺激または阻害）する試験薬剤の能力を決定することを含みうる。ポリペプチドが互いに結合または互いと相互作用する能力を決定することは、例えば、直接結合を測定すること、または免疫細胞応答のパラメータを測定することによって達成されうる。

例えば、直接結合アッセイでは、複合体中の標識タンパク質を検出することにより免疫関連生体分子の結合が決定されうるように、ポリペプチドが放射性同位元素または酵素標識と共役されうる。例えば、ポリペプチドを直接的あるいは間接的に^１２５Ｉ、^３５Ｓ、^１４Ｃ、または^３Ｈで標識し、放射性同位元素を放射線放出の直接計数またはシンチレーション計数によって検出してもよい。代替的に、ポリペプチドを例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで酵素標識し、適切な基質の産物への変換を決定することにより酵素標識を検出してもよい。

相互作用物のうちのいずれも標識することなく、目的の免疫関連生体分子または細胞同士の間の相互作用を調整する化合物の能力を決定することも、本発明の範囲内である。例えば、マイクロフィジオメーターを使用すると、いずれのポリペプチドも標識することなく、免疫関連生体分子ポリペプチド同士の間の相互作用を検出することができる（McConnellら（１９９２年）、Science、２５７巻：１９０６〜１９１２頁）。本明細書で使用される「マイクロフィジオメーター」（例えば、Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ）とは、細胞がその環境を酸性化させる速度を光アドレス可能電位差測定センサ（ＬＡＰＳ：ｌｉｇｈｔ−ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃｓｅｎｓｏｒ）を使用して測定する分析機器である。この酸性化速度の変化は、化合物と受容体との間の相互作用の指標として使用されうる。

好ましい実施形態では、所与の一組の免疫関連生体分子または細胞同士の間の物理的および／または機能的相互作用をアンタゴナイズまたはアゴナイズする試験薬剤（例えば、核酸、ポリペプチド、抗体、融合タンパク質、ペプチド、または小分子）の能力を決定することは、一組の免疫関連生体分子ポリペプチドのうちの１つまたは複数のメンバーの活性を決定することによって達成されうる。例えば、ポリペプチドの活性は、細胞二次メッセンジャー（例えば、ＰＤ−１下流シグナル伝達活性）の誘導を検出すること、適切な基質の触媒／酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子（検出可能なマーカー、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする核酸に作動可能に連結した標的応答性調節エレメントを含むもの）の誘導を検出すること、またはポリペプチドにより調節される細胞応答、例えば様々な自己免疫応答、アレルギー応答（例えば、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、花粉アレルギー、食物アレルギーなど）、ワクチン接種応答、免疫寛容応答、がん免疫療法応答、免疫疲弊応答、免疫記憶応答、もしくは免疫学的エピトープ応答を検出することにより、決定されうる。前記ポリペプチドに結合またはこれと相互作用する試験薬剤の能力を決定することは、例えば、増殖アッセイにおいて免疫細胞の共刺激もしくは阻害を調整する化合物の能力を測定すること、または前記ポリペプチドがその一部分を認識する抗体に結合する能力に干渉することにより、達成されうる。

免疫応答を調整する試験薬剤は、それらがアッセイに加えられたときに免疫細胞増殖および／もしくはエフェクター機能を調整する能力、またはアネルギー、クローン除去、および／もしくは疲弊を調整する能力によって特定されうる。例えば、活性化受容体を介してシグナル伝達を刺激する薬剤の存在下で細胞が培養されうる。活性化薬剤の存在下での細胞増殖またはエフェクター機能（例えば、抗体産生、サイトカイン産生、食作用）を測定するために、細胞活性化のいくつかの認識された読み取り情報が用いられてもよい。この活性化を遮断する試験薬剤の能力は、測定されている増殖またはエフェクター機能の減少をもたらす薬剤の能力を、当技術分野で公知の技術を使用して測定することにより、容易に決定されうる。

例えば、本発明の薬剤は、共刺激および／もしくは共阻害を阻害または増強させる能力について、例えばFreemanら（２０００年）、J. Exp. Med.、１９２巻：１０２７頁、およびLatchmanら（２００１年）、Nat. Immunol.、２巻：２６１頁に記述されているようなＴ細胞アッセイにおいて試験することができる。目的の免疫細胞は、例えば抗ＣＤ３抗体で活性化させ、本明細書に記述される修飾されたＴ細胞を提示してもよい。Ｔ細胞の増殖は、^３Ｈチミジンの組み込みによって測定されうる。アッセイは、アッセイ中にＣＤ２８共刺激を用いて行っても、用いずに行ってもよい。

代替的に、本発明の薬剤は、免疫細胞によって産生されるサイトカインまたは免疫細胞におけるその産生が免疫応答調整に応答して増強もしくは阻害されるサイトカインの細胞産生を調整する能力について、試験されてもよい。例えば、目的の免疫細胞は、一次活性化シグナルによりｉｎｖｉｔｒｏで準最適に刺激されうる。例えば、ホルボールエステル、抗ＣＤ３抗体、または好ましくはＭＨＣクラスＩＩ分子と会合した抗原で操作T細胞が刺激され、例えば、刺激性形態のＢ７ファミリー抗原により、例えば、Ｂ７ポリペプチドをコードしその表面でペプチドを発現する核酸をトランスフェクトされた細胞により、または、可溶性の刺激性形態のペプチドにより、共刺激シグナルが与えられてもよい。培地に放出された公知のサイトカインは、ＥＬＩＳＡによって特定されてもよいし、抗体がサイトカインを遮断して、サイトカインにより誘導される免疫細胞の増殖もしくは他の細胞型の増殖を阻害する能力によって特定されてもよい。例えば、ＩＬ−４ＥＬＩＳＡキットが、ＩＬ−７遮断抗体と同様にＧｅｎｚｙｍｅ（ＣａｍｂｒｉｄｇｅＭＡ）から入手可能である。本明細書に記述されるように修飾され、アッセイに加えられたＴｒｅｇの作用を査定してもよい。免疫関連生体分子間の相互作用を刺激または遮断することがサイトカインプロファイルに及ぼす影響がこれにより決定されうる。

上述のアッセイ法の１つまたは複数の実施形態では、タンパク質の一方もしくは両方の非複合形態から複合形態を分離することを容易にするため、ならびにアッセイの自動化に対応するために、いずれかのポリペプチドを固定化することが望ましい場合がある。ポリペプチドに対する試験化合物の結合は、反応物質を含有するのに好適な任意の容器内で達成されうる。このような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管が挙げられる。一実施形態では、タンパク質のうちの一方または両方がマトリックスに結合できるようにするドメインを付加する融合タンパク質が提供されうる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／免疫関連ポリペプチド融合タンパク質、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質が、グルタチオンセファロースビーズ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸収されてもよく、これらは次いで試験化合物と組み合わされ、この混合物は、複合体形成を促す条件下で（例えば、塩およびｐＨに関して生理学的な条件で）インキュベートされる。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルが洗浄され、結合していない成分があれば除去され、ビーズの場合はマトリックスが固定化され、例えば上述のように、直接的あるいは間接的に、複合体が決定される。代替的に、複合体がマトリックスから解離され、標準的な技術を使用してポリペプチド結合または活性のレベルが決定されてもよい。

代替的な実施形態では、目的の免疫関連ポリペプチドの活性を調整する試験化合物の能力を決定することは、細胞ベースのアッセイに関して上述のように、例えばポリペプチドの下流で機能するポリペプチドの活性を調整する試験化合物の能力を決定することによって達成されうる。例えば、これまでに記述されているように、二次メッセンジャーのレベルを決定してもよいし、適切な標的に対する相互作用物質であるポリペプチドの活性を決定してもよいし、または適切な標的に対する相互作用物質の結合を決定してもよい。

一部の実施形態では、免疫に関連する目的の指標の調整に関する決定は、対照（この用語は上述されている）、および過剰発現、活性過剰、過小発現、活性低下など（これらの用語も上述されている）の決定と比較して行うことができる。

別の態様では、表１、図、および実施例に列記された１つもしくは複数のバイオマーカーまたはそれらの断片を含む、本発明の１つまたは複数のバイオマーカーの発現もしくは活性に対する薬剤の影響（例えば、Ｔ細胞疲弊および／または免疫障害の調整）のモニタリングは、基本的な薬物スクリーニングのみならず、臨床治験においても適用されうる。例えば、本明細書に記述されるスクリーニングアッセイにより決定された、表１、図、および実施例に列記された１つもしくは複数のバイオマーカー、またはそれらの断片を含む遺伝子発現を調整する薬剤の効力は、目的の遺伝子の発現調整および／またはその機能的帰結（例えば、Ｔ細胞疲弊および／または免疫障害の調整）を呈する対象の臨床治験においてモニタリングすることができる。このような臨床治験では、バイオマーカーの直接的な発現および／もしくは活性またはＴ細胞疲弊および／もしくは免疫障害の状態の調整の間接的な結果を、特定の細胞の表現型の「読み取り情報」またはマーカーとして使用することができる。

一部の実施形態では、本発明は、薬剤（例えば、操作T細胞、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣薬、ポリペプチド、ペプチド、核酸、小分子、または本明細書に記述されるスクリーニングアッセイにより特定された他の薬物候補）で対象を処置することの効力をモニタリングするための方法であって、（ｉ）薬剤の投与前に対象から投与前試料を得るステップと、（ｉｉ）投与前試料中の、表１、図、および実施例に列記された１つもしくは複数のバイオマーカーまたはそれらの断片を含む、本発明の１つまたは複数のバイオマーカーの発現レベルおよび／または活性を検出するステップと、（ｉｉｉ）対象から１つまたは複数の投与後試料を得るステップと、（ｉｖ）投与後試料中のバイオマーカーの発現レベルまたは活性を検出するステップと、（ｖ）投与前試料中のバイオマーカーまたはその断片の発現レベルもしくは活性を１つまたは複数の投与後試料中のバイオマーカーのものと比較するステップと、（ｖｉ）それに従って対象への薬剤の投与を変更するステップとを含む、方法を提供する。例えば、１つもしくは複数のバイオマーカーの発現または活性を、検出されたものよりも高いレベルまで増加させるため（例えば、薬剤の効力を増加させるため）に、薬剤の投与の増加が望ましい場合がある。代替的に、バイオマーカーの発現または活性を、検出されたものよりも低いレベルまで減少させるため（例えば、薬剤の効力を減少させるため）に、薬剤の投与の減少が望ましい場合がある。このような実施形態によれば、観察可能な表現型応答が存在しなくとも、バイオマーカーの発現または活性を薬剤の効力の指標として使用することができる。

ある特定の実施形態では、本発明の方法がコンピュータプログラムおよびコンピュータシステムを実施することも、当業者には察知されよう。例えば、コンピュータプログラムを使用して、本明細書に記述されるアルゴリズムを行うことができる。またコンピュータシステムは、本発明の方法を実施する際にコンピュータシステムにより使用されうる複数のバイオマーカーシグナル変化／プロファイルを含む、本発明の方法により生成されたデータを格納し操作することができる。ある特定の実施形態では、コンピュータシステムは、バイオマーカー発現データを受信し、（ｉｉ）データを格納し、（ｉｉｉ）本明細書に記述される任意の数の方法（例えば、適切な対照と比べた分析）でデータを比較して、がん性組織または前がん性組織における情報的バイオマーカーの状態を決定する。他の実施形態では、コンピュータシステムは、（ｉ）決定された発現バイオマーカーレベルを閾値と比較し、（ｉｉ）前記バイオマーカーレベルが閾値から有意に（例えば、上または下に）調整されているかどうかの指標、または前記指標に基づく表現型を出力する。

ある特定の実施形態では、このようなコンピュータシステムも本発明の一部と考えられる。多数の種類のコンピュータシステムを使用して、生物情報学および／またはコンピュータ技術分野の当業者が保有する知識に従って本発明の分析方法を実施することができる。かかるコンピュータシステムの動作中、いくつかのソフトウェアコンポーネントをメモリーにロードすることができる。ソフトウェアコンポーネントは、当技術分野で標準的なソフトウェアコンポーネントと、本発明に特別なコンポーネントとの両方（例えば、Linら（２００４年）、Bioinformatics、２０巻、１２３３〜１２４０頁に記述されているｄＣＨＩＰソフトウェア、当技術分野で公知の放射基底機械学習アルゴリズム（ＲＢＭ））を含みうる。

本発明の方法は、使用される特定のアルゴリズムを含む、式の記号入力および高レベルな処理仕様を可能にする数学的ソフトウェアパッケージにおいてプログラミングまたはモデリングすることもでき、これにより、ユーザーが個々の式およびアルゴリズムを手順どおりプログラミングする必要がなくなる。このようなパッケージとしては、例えば、Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ（Ｎａｔｉｃｋ、Ｍａｓｓ．）のＭａｔｌａｂ、ＷｏｌｆｒａｍＲｅｓｅａｒｃｈ（Ｃｈａｍｐａｉｇｎ、Ｉｌｌ．）のＭａｔｈｅｍａｔｉｃａ、またはＭａｔｈＳｏｆｔ（Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈ．）のＳ−Ｐｌｕｓが挙げられる。

ある特定の実施形態では、コンピュータは、バイオマーカーデータを格納するためのデータベースを含む。このような格納されたプロファイルは、後の時点で目的の比較を行うためにアクセスおよび使用されうる。例えば、対象の非がん性組織に由来する試料中のバイオマーカー発現プロファイルおよび／または同じ種の関連性のある集団における目的の遺伝子座情報の集団ベースの分布から生成されたプロファイルが格納され、対象のがん性組織または対象のがん性であると疑われる組織に由来する試料のものと後に比較されうる。

本明細書に記述される例示的なプログラム構造およびコンピュータシステムのほか、他の代替的なプログラム構造およびコンピュータシステムも、当業者には容易に明らかとなるであろう。かかる代替的システムは、上述のコンピュータシステムおよびプログラム構造から趣旨においても範囲においても逸脱しないものであり、したがって添付の特許請求の範囲内に包含されるよう意図される。

ＶＩＩ．キット
本発明は、キットも包含する。例えば、キットは、操作T細胞を単独あるいは他の免疫調整剤と組み合わせて含み、好適な容器内にパッケージングされ、かかる試薬の使用に関する説明をさらに含んでいてもよい。キットはまた、別々の容器にパッケージングされた投与ツールなどの他の構成要素を含有してもよい。

本発明の他の実施形態を以下の実施例に記述する。本発明を以下の実施例によってさらに解説するが、実施例はさらなる限定と解釈されてはならない。本出願全体ならびに図において引用される全ての参考文献、特許、および公開特許出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

（実施例１）
実施例２〜６の材料および方法
ａ．マウス
野生型Ｃ５７／ＢＬ／６Ｎ（ＣＤ４５．２＋）マウスおよび類遺伝子性Ｂ６．ＳＪＬ−ＰｔｐｒｃａＰｅｐｃｂ／ＢｏｙＪ（ＣＤ４５．１＋）マウスをＵＳＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅから得た。Ｃ５７ＢＬ／６ＮＰ１４マウス（ＬＣＭＶ特異的Ｔ細胞受容体トランスジェニック）はインハウスで飼育した。雄マウスは６〜１０週齢で使用した。全ての動物実験は、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａのＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓに従って行った。

ｂ．リンパ球の感染および単離
Lara-Astiasoら（２０１４年）、Science、３４５巻：９４３〜９４９頁；Guptaら（２０１５年）、PLoS Pathogens、１１巻：ｅ１００５１７７頁；Kurachiら（２０１４年）、Nat. Immunol.、１５巻：３７３〜３８３頁；およびOdorizziら（２０１５年）、J. Exp. Med.、２１２巻：１１２５〜１１３７頁に記述されているように、ＬＣＭＶ株を産生し、力価測定した。ＬＣＭＶＡｒｍｓｔｒｏｎｇ（２×１０^５個のプラーク形成単位）の腹腔内注射またはＬＣＭＶクローン１３（４×１０^６個のプラーク形成単位）の静脈内注射により、２つのマウスコホートを感染させた。ドナーＰ１４細胞は全て、ＣＤ８ネガティブセレクション（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を使用してナイーブな脾臓から調製した。エフェクターＣＤ８^＋Ｔ細胞、メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞、および疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞を生成するために、およそ１〜２×１０^３個のＰ１４細胞をレシピエントマウスに移入してから、１日後にＬＣＭＶ感染を行った。標的エフェクター／メモリー／疲弊Ｐ１４細胞は、感染後（ｐ．ｉ．：ｐｏｓｔ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）８日目（ｄ８）または２７日目（ｄ２７）のレシピエント脾臓からのみ採取した。ＣＤ４５．２ＦＩＴＣＡｂおよび抗ＦＩＴＣ微生物（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用した濃縮の後、細胞を染色し、Ａｒｉａ（商標）ＩＩ（ＢＤ）により分取した。ナイーブおよびエフェクター／メモリー／疲弊ＣＤ８^＋Ｔ（Ｐ１４）細胞は、それぞれＣＤ８^＋ＴＣＲＶａ２^＋ＣＤ６２Ｌ^＋ＣＤ４４^ｌｏ集団およびＣＤ８^＋ＴＣＲＶａ２^＋ＣＤ４５．２^＋ＣＤ４５．１⁻集団に対するゲーティングによって分取した。フローサイトメトリーには、次のＢｉｏＬｅｇｅｎｄによる蛍光色素コンジュゲート抗体を使用した：抗ＴＣＲＶα２（Ｂ２０．１）、抗ＣＤ８α（５３−６．７）、抗ＣＤ４４（ＩＭ７）、抗ＣＤ４５．１（Ａ２０）、抗ＣＤ４５．２（１０４）、および抗ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ１４）。

ｃ．ＡＴＡＣ−ｓｅｑ
生物学的複製物（ナイーブ、急性ｄ８、急性ｄ２７、慢性ｄ８、慢性ｄ２７、およびＥＬ４）それぞれにつきおよそ４０〜５０，０００個の細胞を冷ＰＢＳ中で１回洗浄し、５０μＬの冷溶解緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭＮａＣｌ、３ｍＭＭｇＣｌ_２、０．１％ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ−６３０）に溶解した。溶解した核を、Buenrostroら（２０１３年）、Nature Methods、１０巻：１２１３〜１２１８頁およびLongら（２０１５年）、Nat. Med.、２１巻：５８１〜５９０頁に記述されているＴｎ５転位反応ミックス中でインキュベートし、ＭｉｎＥｌｕｔｅ（登録商標）ＲｅａｃｔｉｏｎＣｌｅａｎｕｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。ＰｉｐｐｉｎＰｒｅｐ（商標）２％ＡｇａｒｏｓｅＧｅｌＣａｓｓｅｔｔｅｓおよびＰｉｐｐｉｎＰｒｅｐ（商標）ＤＮＡＳｉｚｅＳｅｌｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＳａｇｅＳｃｉｅｎｃｅ）を使用して、急性ｄ８、急性ｄ２７、慢性ｄ８、および慢性ｄ２７の一組の複製物、ならびにナイーブ細胞およびＥＬ４細胞の両方の生物学的複製物から、ＡＴＡＣ−ｓｅｑ断片のうち、１１５〜６００塩基対（ｂｐ）のサイズの断片を選択した。サイズ選択後、ＡＴＡＣライブラリーを増幅させ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用してＮｅｘｔｅｒａ（商標）配列決定プライマーのライゲーションを行った。最後に、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ（登録商標）ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰビーズクリーンアップ（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ／Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）を使用してＰＣＲプライマーを除去し、ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ機を使用してライブラリー品質を検証した。ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ（商標）２０００配列決定システムを使用し、高品質の「マルチプレックスな」ＤＮＡライブラリーの配列決定を行った。

ｄ．ＡＴＡＣ−Ｓｅｑデータおよびゲノムとのアライメントの品質管理
ＦＡＳＴＱＣパイプライン（ＢａｂｒａｈａｍＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）をリードに使用し、ｂｏｗｔｉｅソフトウェアバージョン１．１．１（Langmeadら（２００９年）、Genome Biol.、１０巻：Ｒ２５頁）を用いて参照ゲノム（ｍｍ９）とのアライメントを行った。ゲノム内に特有な位置に対してマッピングされたリードのみを保持した［「−ｍ１」］。重複したリードは、ｂａｍファイルにおいてＰＩＣＡＲＤソフトウェアを使用してマーキングし、プライマー配列の混入について調べた。

ｅ．ＡＴＡＣ−Ｓｅｑデータにおけるピークの特定
リードを参照ゲノムに対してアライメントした後、プラス鎖と並んだリードを＋４塩基対（ｂｐ）移動させ、マイナス鎖と並んだリードは−５ｂｐ移動させた（Buenrostroら（２０１３年）、Nature Methods、１０巻：１２１３〜１２１８頁；Longら（２０１５年）、Nat. Med.、２１巻：５８１〜５９０頁）。５つの複製対のそれぞれにつき、ｓａｍｔｏｏｌｓソフトウェアを使用することにより２つの複製物をマージし、ｍａｃｓ２ソフトウェアバージョン２．１．０を使用してピークを呼び出し、ここでＦＤＲは０．００１に設定し、「ｎｏｍｏｄｅｌ」およびデフォルトのマウスゲノムサイズオプションを使用した。ピークの母集団を生成するために、重複する領域のマージと同時にこれらピークの全ての和集合を行った。

ｆ．ピーク内の活性の差の特定
シフトしたＡＴＡＣ−Ｓｅｑカット部位をデータから抽出し、各ピーク領域に該当した数を計数した。次いでＤＥＳｅｑ２ソフトウェアを使用して、ピーク間のカット部位の存在量の差を特定した。５つの条件のペアワイズ比較を全て行い、ＦＤＲが０．０５未満であったものを差次的とみなした。

ｇ．ＡＴＡＣ−Ｓｅｑピークにおけるゲノム特色のエンリッチメント
各試料につき、マウスゲノムにおけるカバー率と比べたゲノム特色のエンリッチメントについてＭＡＣＳ２ソフトウェアによって計算されたピークセットを調査した。各ゲノム特色に関して、エンリッチメント倍率を［ＡＴＡＣ−Ｓｅｑピーク領域とゲノム特色の重複／ピーク領域の全サイズ］／［マウスゲノムとゲノム特色の重複／マウスゲノムの有効サイズ］として計算した（ここで全てのサイズは塩基対で表される）。

マウスゲノムの有効サイズは、２，７１６，９６５，４８１ｂｐに設定した。二項検定を使用してＰ値を計算し、ここで、ｎ＝ピークの数、ｘ＝アノテーションにより重複したピークの数、ｐ＝（マウスゲノムとの重複／マウスゲノムの有効サイズ）であった。

使用したゲノム特色には、（ｉ）Ｅｎｓｅｍｂｌｅデータベース（Flicekら（２０１１年）、Nucl. Acids Res.、３９巻：６頁）の調節性特色アノテーション、（ｉｉ）ＯＲｅｇＡｎｎｏデータベース（Griffithら（２００８年）、Nucl. Acids Res.、３６巻：１３頁）により見出される調節性特色、（ｉｉｉ）ｍｕｌｔｉｚ３０ｗａｙアルゴリズムによってアノテーションされる保存領域（ここではｍｕｌｔｉｚ３０ｗａｙスコアが＞０．７の領域を検討する）、（ｉｖ）ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ（ワールドワイドウェブ上でrepeatmasker.orgにて利用可能）によってアノテーションされる反復領域、（ｖ）推定プロモーター領域（ＲｅｆＳｅｑにおいてアノテーションされた転写物の１０ｋｂ上流および１ｋｂ下流に位置）（Pruittら（２００７年）、Nucl. Acids Res.、３５巻：５頁）、（ｖｉ）ＲｅｆＳｅｑにおける遺伝子本体（ｇｅｎｅｂｏｄｙ）のアノテーション、（ｖｉｉ）３’近位領域（３’末端に対して１ｋｂ上流および５ｋｂ上流に位置）、（ｖｉｉｉ）ヒストンマーク、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ａｃ、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３、およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３（ポリコーム抑制）と共に、ＢＡＴＦ、ＩＲＦ４、ｃ−Ｊｕｎ、ＪｕｎＤ、およびＪｕｎＢの結合が集中した領域、ならびにＰｏｉｓｅｄＥｎｈａｎｃｅｒ、ＡｃｔｉｖｅＥｎｈａｎｃｅｒ、ＢｉｖａｌｅｎｔＰｒｏｍｏｔｅｒ、ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＥｎｈａｎｃｅｒ、およびＩｎｉｔソフトウェアを使用したさらなるアノテーションが含まれた。ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるプロモーターを使用した（Kurachiら（２０１４年）、Nat. Immunol.、１５巻：３７３〜３８３頁およびLara-Astiasoら（２０１４年）、Science、３４５巻：９４３〜９４９頁）。また、ＥＬ４細胞の２つの複製物に関してこの研究において得られたピークを加えた。

ｈ．クラスターおよび遺伝子オントロジー分析
ＧＥＮＥ−Ｅ（ＢｒｏａｄＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）ソフトウェアを使用して、５つ全ての細胞状態でのＣｈＡＲシグナル強度差にＫ平均クラスタリングを適用した。ＭＡＴＬＡＢのギャップ統計を使用してクラスターの最適な数を決定した。デフォルト設定のＧＲＥＡＴソフトウェア（ワールドワイドウェブ上でbejerano.stanford.edu/great/public/html/にて利用可能）を使用して、近傍の遺伝子とのＣｈＡＲの会合およびモジュール内のＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙタームのエンリッチメントを決定した。全ての有意なＧＯタームは表１に列挙されており、選択されたＧＯタームは図３Ｄにヒートマップとして提示されている。

ｉ．ＣＲＩＳＰＲ設計
ワールドワイドウェブ上でbroadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design-v1にて利用可能である公的に利用可能なツールに基づいてオンターゲット効率を最大化するために、ｓｇＲＮＡを特定化するオリゴ配列を選択した。Shalemら（２０１４年）、Science、３４３巻：８４〜８７頁およびGjoneskaら（２０１５年）、Nature、５１８巻：３６５〜３６９頁において過去に記述されているように、一本鎖ｓｇＲＮＡオリゴ（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をアニーリングし、ＰＸＰＲ００３にライゲーションした。レンチウイルスパッケージングまたはヌクレオフェクションを使用し、ｓｇＲＮＡプラスミドを細胞株に導入した。レンチウイルス産生では、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭに２９３Ｔ細胞を播種した。ＴｕｒｂｏＦｅｃｔ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用し、ｓｇＲＮＡプラスミドならびにパッケージングプラスミドのΔ８．９およびＶＳＶ−ｇを細胞にトランスフェクトした。ウイルス上清を７２時間後に収集した。ヌクレオフェクションでは、ＥＬ４細胞を１００μｌのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）溶液および２μｇのｓｇＲＮＡプラスミドと混合した。次いで、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）ＫｉｔＬ（Ｌｏｎｚａ）およびＡｍａｘａＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｉ機のＣ−０９プログラムを使用して、細胞のトランスフェクションを行った。

ｊ．細胞培養
１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳ、ＨＥＰＥＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、およびβ−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ（Ｒ１０培地）中で、ＥＬ４細胞（ＡＴＣＣ）を培養した。上述のようにレンチウイルスにパッケージングされたＰＬＸ３０４プラスミドを使用し、Ｃａｓ９発現細胞株を産生した。次いでＣａｓ９発現細胞にｓｇＲＮＡプラスミドを形質導入またはトランスフェクトし、ピューロマイシンを使用してプラスミドの存在について選択し、選択３〜５日後の後続実験の全てに使用した。限界希釈を使用し、バルクＥＬ４の単一細胞クローンを作製した。

ｋ．レポーターアッセイ
レンチウイルス構築物内のＧＦＰ発現を駆動するＴＡＴＡボックスミニマルプロモーターの上流に、−２３．８ｋｂＰＤ−１エンハンサーの７８１ｂｐのコアに対応するＤＮＡ配列（ｃｈｒ１：１１３９５９７１１１９〜９５９７１９００、ｍｍ９）、およびＣＭＶプロモーターをクローニングした。上述のようにプラスミドをレンチウイルスにパッケージングした。２０，０００ｘｇで２時間にわたる超遠心分離によってウイルス上清を１００倍に濃縮した。

ＣＤ８ネガティブセレクションＭＡＣＳ（登録商標）キット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を使用してナイーブ脾臓からＣＤ８^＋Ｔ細胞を単離し、Ｒ１０培地中で培養した。形質導入前にｉｎｖｉｔｒｏ活性化を行うため、組換えヒトＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）の存在下で２４時間にわたり、プレートに結合した抗ＣＤ３（４μｇ／ｍｌ；２Ｃ１１；ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および抗ＣＤ２８（４μｇ／ｍｌ；３７．５１；ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）でナイーブ細胞を刺激した。Ｉｎｖｉｔｒｏで活性化したＴ細胞およびＥＬ４細胞に、ポリブレン（５μｇ／ｍｌ）とのインキュベーションおよびスピンインフェクション（３７℃で４５分間にわたり２，０００ＲＰＭ）によって濃縮ウイルスを形質導入した。形質導入の４８〜７２時間後、フローサイトメトリーによってＧＦＰ発現を測定した。

ｌ．エンハンサーの欠失
Ｐｄｃｄ１のＴＳＳから−２３．８ｋｂの領域を、この領域の端部にある一対のｓｇＲＮＡターゲティング配列を使用して欠失させた。−２３．８ｋｂターゲティングｓｇＲＮＡまたは陰性対照ｓｇＲＮＡをトランスフェクトしたＥＬ４細胞（図８Ａおよび９Ａ）を異なるレベルのＰＤ−１発現に基づいて分取し、ゲノムＰＣＲを使用して、分取したＥＬ４における欠失を検出した。５０μｌのＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ溶液を使用して、ゲノムＤＮＡをバルクおよびクローン細胞株から単離し、製造元の説明に従ってインキュベートした。欠失スクリーニングプライマー対を使用して各試料からのゲノムＤＮＡにＰＣＲを行い（図８Ｂおよび９Ｂ）、ＥｔＢｒを含む１％アガロースゲル上で泳動させた。クローン株では、二対立遺伝子欠失クローンは欠失バンドのみのＰＣＲ増幅を有するものとして定義されたが、非欠失（ｎｏｎ−ｄｅｌｅｔｅｒ）クローンはＷＴバンドのみを増幅させた。ＰＣＲ増幅産物をＳａｎｇｅｒ配列決定に提出することにより欠失を検証した。

ｍ．ＲＴ−ｑＰＣＲ
クローン細胞株ならびに対照ｓｇＲＮＡを受けたバルク集団をＲＬＴ中に溶解させ、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ＰｌｕｓＭｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを抽出した。ＩｍＰｒｏｍ−ＩＩ（商標）ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してｃＤＮＡを生成し、ＶｉｉＡ（商標）７ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ機器でＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを使用して分析した。

ｎ．Ｉｎｓｉｔｕ飽和変異誘発
公的に利用可能なオンラインツール（ワールドワイドウェブ上でportals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-designにて利用可能）を使用し、９つ全てのＰＤ−１エンハンサーおよび全てのＰＤ−１エクソン内のＣａｓ９−ＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフの存在により拘束される、可能性のある全てのタイリングｓｇＲＮＡを設計した。非ターゲティングｓｇＲＮＡは、ＢｒｏａｄＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＧｅｎｏｍｉｃｓＰｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎＰｌａｔｆｏｒｍによって設計した。ｓｇＲＮＡオリゴは全て、Lara-Astiasoら（２０１４年）、Science、３４５巻：９４３〜９４９頁およびRaimondiら（２００６年）、J. Immunol.、１７６巻：２８０８〜２８１６頁において過去に記述されているように合成し、ｌｅｎｔｉＧｕｉｄｅ−Ｐｕｒｏベクター骨格にクローニングした。プラスミドライブラリーを上述のようにレンチウイルスにパッケージングし、ポリブレン（５μｇ／ｍｌ）とのインキュベーションおよびスピンインフェクション（３７℃で４５分間にわたり２，０００ＲＰＭ）によってＣａｓ９発現ＥＬ４に形質導入した。対照の形質導入は、およそ０．３の感染多重度で１，０００倍のライブラリーカバー率が確実となるように行った。ピューロマイシンを用いて７２時間にわたる形質導入細胞の選択を行い、選択後の試料を開始０日目（ｄ０）のライブラリー表現とした。実験の全体を通して、細胞の培養は、１，０００倍のライブラリーカバー率が常時確実となるように行った。

ライブラリー形質導入細胞を抗ＰＤ−１蛍光抗体で染色し、ＰＤ−１ｈｉｇｈ集団およびＰＤ−ｌｏｗ集団に分取した（図７Ｃ）。選択後ｄ２０からｄ５０の間に複製分取を行い、ＤＮｅａｓｙ（登録商標）ＢｌｏｏｄａｎｄＴｉｓｓｕｅＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、分取された集団からゲノムＤＮＡを単離した。選択後ｄ０のバルク細胞、インプットプラスミドプール、ならびに分取された集団を、Lara-Astiasoら（２０１４年）、Science、３４５巻：９４３〜９４９頁およびRaimondiら（２００６年）、J. Immunol.、１７６巻：２８０８〜２８１６頁において過去に記述されているように配列決定した。ライブラリー配列決定深度に対してリードを正規化することにより、各試料中のＳｇＲＮＡの存在量を数量化した。ＰＤ−１ｌｏｗ集団に対するＰＤ−１ｈｉｇｈ集団におけるＳｇＲＮＡエンリッチメントを次のように計算した：１）各試料中のｓｇＲＮＡ存在量を対数変換し；２）ｓｇＲＮＡ表現の初期変動を埋め合わせるために、ｄ０のｓｇＲＮＡ存在量をその各試料中の存在量から減算し；３）少なくとも１つの分取試料中で検出されなかったｓｇＲＮＡがあれば、細胞ドロップアウトとしてさらなる分析から除外し；４）各分取試料（ｈｉｇｈおよびｌｏｗは別々に分析した）に関し、対照ガイドの分布と相対的にｚスコアを計算して、エンハンサーをターゲティングするｓｇＲＮＡおよびエクソンをターゲティングするｓｇＲＮＡの存在量を正規化し；５）ＰＤ−１ｌｏｗコンパートメント内の各ｓｇＲＮＡについて正規化されたスコアをＰＤ−ｈｉｇｈコンパートメント内のスコアから減算して、各複製物の各ｓｇＲＮＡについて正規化されたエンリッチメントスコアを生成し；６）各ｓｇＲＮＡのエンリッチメントスコアを複製物間で平均した。エンハンサーをターゲティングするｓｇＲＮＡおよびエクソンをターゲティングするｓｇＲＮＡの切断部位はマウスゲノム（ｍｍ９）に対してマッピングし、一方、対照の非ターゲティングｓｇＲＮＡは５ｂｐ間隔で仮マッピングした。

ｏ．個々のｓｇＲＮＡの検証
−２３．８ｋｂエンハンサー内のＰＤ−１ｌｏｗ画分に集中していた３２個のｓｇＲＮＡを個々に検証するために選択した。各ｓｇＲＮＡを表すオリゴ（ＩＤＴ）をＣａｓ９およびｓｇＲＮＡの二重送達構築物に個別にクローニングした。次いで、過去に記述されているようにプラスミドをＥＬ４細胞にヌクレオフェクトし、３２個の同質遺伝子細胞株を産生した。ヌクレオフェクションの１８〜３６時間後、ピューロマイシン中で各細胞株の選択を行い、Ｒ１０培地中で培養した。ＰＤ−１発現または対応するアイソタイプ対照について細胞を染色した。各細胞株におけるＰＤ−１発現の幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、アイソタイプ対照による染色のＭＦＩに対して正規化した。

ｐ．ゲノム内のモチーフの特定
ワールドワイドウェブ上のmeme-suite.org/db/motifsにあるデータベースのリストにおいて利用可能な、Ｊｏｌｍａ２０１３（Jolmaら（２０１３年）、Cell、１５２巻：３２７〜３３９頁）、Ｃｈｅｎ２００８（Chenら（２００８年）、Cell、１３３巻：１１０６〜１１１７頁）、ＵｎｉＰＲＯＢＥ（マウス）（Humeら（２０１５年）、Nucl. Acids Res.、４３巻：２２頁）、およびＪＡＳＰＡＲ２０１４（主要な脊椎動物）（Mathelierら（２０１４年）、Nucl. Acids Res.、４２巻：７頁）のＰＷＭデータベースを使用した。次いで、ＦＩＭＯ（Grantら（２０１１年）、Bioinformatics、２７巻：１０１７〜１０１８頁）および１×１０^−５の閾値を使用して、マウスゲノムのバージョン９におけるモチーフを呼び出した。最初に合計１，４４６個のモチーフから始め、ヒットがゼロまたは１５０万超のものがあれば除去した。次に、各モチーフにつき、進化的保存およびＴＳＳまでの距離を加えた。各モチーフに見出される進化的保存の平均を求め、ｂｅｄｔｏｏｌｓソフトウェア（Quinlan（２０１０年）、Bioinformatics、２６巻：８４１〜８４２頁）の「ｃｌｏｓｅｓｔ」関数を使用して、各モチーフの最も近いＴＳＳを見出した。ＵＣＳＣゲノムブラウザからＴＳＳのファイルを作成した。

ｑ．ｃｅｎｔｉｐｅｄｅソフトウェアを使用した転写因子（ＴＦ）フットプリントの推測
Ｃｅｎｔｉｐｅｄｅプログラムを使用して、各モチーフインスタンスにおける転写因子（ＴＦ）結合の事後確率を推測した。各モチーフに関する進化的保存スコア、ＴＳＳまでの距離、およびＰＷＭスコアを、モチーフ周囲の２２０ｂｐのウィンドウ内のあらゆる位置に見出されるＡＴＡＣ−Ｓｅｑカットの数と併せて、別々に両方の鎖に伝えた。モデルの正確度を評価するために、保存なしの別個のＣｅｎｔｉｐｅｄｅインスタンスを実行し、進化的保存、ＴＳＳまでの距離、およびＰＷＭスコアの事後確率を回帰し、少なくとも１つの試料中で進化的保存と強い正の関連を有しなかったもの（係数検定の片側Ｚ値に対してＰ＜０．０５）は除去した。

ｒ．ＴＦと条件との関連の特定
所与のＴＦが条件に関連していたかどうかを試験するために、条件の全てのペアワイズの組合せに対する超幾何分布検定を実施した。ＴＦが、他の条件と対比して所与の条件において活性であったピーク内で偶然に予想されるよりも頻繁に見出された場合に、そのＴＦは、所与の条件において差次的に結合したものとしてマーキングした。

ｓ．ＴＦのランク付け
過去に公開されたデータセット（Doeringら（２０１２年）、Immunity、３７巻：１１３０〜１１４４頁；Buenrostroら（２０１３年）、Nat. Methods、１０巻：１２１３〜１２１８頁）から各ＴＦの正規化されたｍＲＮＡ発現を得て、急性感染と慢性感染との間の対数倍率変化の絶対値を７日目（ｄ７）および３０日目（ｄ３０）に計算した。次いで、ＴＦを超幾何学的Ｐ値に関連付け、ｄ８およびｄ２７（上記のとおり）の結合差を数量化した。次いで各ＴＦを、これら４つのアノテーションに関して最大の差を示すものから最小の差を示すものへとランク付けし、ｄ７〜８およびｄ２７〜３０における遺伝子発現およびＴＦ結合の変化を表した。各ＴＦの最終ランクは、４つの個々のスコアの平均として決定した。

ｔ．領域に対するＴＦ結合の分析
０．９０またはそれよりも高い事後確率カットオフを使用して、領域に対する転写因子の結合をＣｅｎｔｉｐｅｄｅから推測した。１０６個の転写因子モチーフのそれぞれについて、ゲノムワイドな結合を推測した。これらの転写因子モチーフは、それらのランク付け（上位１００、上記のとおり；表１）およびＣＤ８^＋Ｔ細胞生物学における公知の関連性（ＪＵＮＤ、ＲＵＮＸ３、ＪＵＮＢ、ＳＴＡＴ５Ａ−ＳＴＡＴ５Ｂ、ＦＯＸＰ１、およびＴＣＦ７）によって決定された。これら１０６個のＴＦをさらに、それらの結合差およびＣＤ８^＋Ｔ細胞転写調節における公知の役割に基づいて、５０個にフィルタリングした。次いで、急性状態および慢性状態における５０個のＴＦの各ＴＦモチーフインスタンスにおける結合を分析した。各結合事象を、急性のみに存在するもの、慢性のみに存在するもの、またはこれらの両方に存在するものとして分類した。こうした急性感染または慢性感染におけるモチーフ結合の比較は、ｄ８およびｄ２７の両方で行った。したがって、ｄ８およびｄ２７において、慢性感染に特有な、急性感染に特有な、または共通の、ＴＦモチーフ１つ当たりの結合事象の百分率の計算値を決定した。共通した結合とは対照的に、急性感染のみまたは慢性感染のみのいずれかにおけるＴＦ結合のこの偏りを、各時点における慢性感染に見られる全ての特有な結合事象の百分率として数量化した。さらに、ＧＲＥＡＴソフトウェアを使用して、少なくとも１つの結合モチーフを含有する各領域を、標的遺伝子に関連付けた。これで、全ての標的遺伝子を、ｄ７およびｄ３０における急性感染と慢性感染との間のｍＲＮＡ発現によって上方制御されたもの、下方制御されたもの、または未変化であったものとして定義することができた（Doeringら（２０１２年）、Immunity、３７巻：１１３０〜１１４４頁）。このように、ＴＦモチーフと近くの標的遺伝子との間の各結合事象（＞０．９５のよりストリンジェントな確率カットオフを使用して定義される）を、急性感染において上方制御された遺伝子をターゲティングしたもの、慢性感染において上方制御された遺伝子をターゲティングしたもの、または未変化の遺伝子をターゲティングしたものに分類した（表１）。

ｕ．対象
ＳｅａｔｔｌｅＮａｔｕｒａｌＰｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎのコホートからＨＩＶに感染した４名の参加者をこの研究のために選択した（Sunshineら（２０１４年）、J. Virol.、８８巻：１３５４〜１３６５頁）。発症者は、過去１年間に＞１０，０００ＲＮＡコピー／ｍｌのウイルス負荷中央値を有したものとして定義した。研究した全ての対象は慢性感染であり、抗レトロウイルス療法ナイーブであった。およそ４０００万〜６０００万個のＰＢＭＣを各対象から得た。関連性のある施設内倫理委員会が全てのヒト対象プロトコールを承認し、全ての対象が登録前に書面によるインフォームドコンセントを提供した。治験に登録した単一のＨＣＶ感染患者についてベースライン試料を得て、成功した抗ウイルス療法が、遺伝子型１ａのＣ型肝炎ウイルス感染（ＮＣＴ０２４７６６１７）に対する自然免疫応答および適応免疫応答に及ぼす効果を評価した。このＨＣＶ対象は、８２８，０００ＩＵ／ｍｌのＨＣＶウイルス負荷で慢性的に感染していた。発現したＨＬＡクラスＩ対立遺伝子に基づき、ＨＬＡクラスＩ多量体を使用して、ウイルス特異的なＣＤ８Ｔ細胞応答をスクリーニングした。ＨＣＶＡ＊０２：０１Ｃ６３ＢＣＩＮＧＶＣＷＴＶ、ＨＣＶＡ＊２４：０１１７４ＤＶＩＡＰＡＶＱＴＮＷ、およびインフルエンザＡ＊０２：０１ＭＰＧＩＬＧＦＶＦＴＬをターゲティングする応答を特定した。白血球除去を介して得られたＰＢＭＣから、ＦＡＣＳによって多量体結合ＣＤ８^＋Ｔ細胞を単離した。患者は、この施設内倫理委員会が承認した研究に同意していた。

正常なボランティアから密度遠心分離によりＰＢＭＣを得て、ＣＭＶ四量体^＋Ｔ細胞応答についてスクリーニングした。関連性のある施設内倫理委員会がこのヒト対象プロトコールを承認し、全ての対象が登録前に書面によるインフォームドコンセントを提供した。

ｖ．ＡＴＡＣ−ｓｅｑのためのヒトリンパ球集団の単離
１０％ＦＢＳを補充した温かいＲＰＭＩ中でＰＢＭＣを急速に解凍した。ＭＡＣＳ（登録商標）ＣＤ８ネガティブセレクションキット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を使用し、ＣＤ８^＋Ｔ細胞を濃縮した。濃縮後、細胞を染色し、ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）セルソーター（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分取した（細胞分取戦略については図１１Ａを参照されたい）。フローサイトメトリーには、次のＢｉｏｌｅｇｅｎｄによる蛍光色素コンジュゲート抗体を使用した：抗ＣＤ４５ＲＡ（ＨＩ１００）、抗ＣＣＲ７（Ｇ０４３Ｈ７）、抗２Ｂ４（Ｃ１．７）、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）、抗２７５ＣＤ３９（Ａ１）、抗ＰＤ−１（ＥＨ１２．２Ｈ７）、および抗ＣＤ８ａ（ＳＫ１）。フローサイトメトリーには、次の蛍光色素コンジュゲート多量体を使用した：ＨＩＶＡ＊０３：０１ＲＬＲＰＧＧＫＫＫ、ＨＩＶＡ＊０２：０１ＳＬＹＮＴＶＡＴＬ、ＨＩＶＢ＊０８：０１ＧＥＩＹＫＲＷＩＩ、ＣＭＶＡ＊０２：０１ｐｐ６５−ＮＬＶＮＬＶＰＭＶＡＴＶ、ＨＣＶＡ＊０２：０１Ｃ６３ＢＣＩＮＧＶＣＷＴＶ、ＨＣＶＡ＊２４：０１１７４ＤＶＩＡＰＡＶＱＴＮＷ、およびインフルエンザＡ＊０２：０１ＭＰＧＩＬＧＦＶＦＴＬ。１０％ＦＢＳを補充したＰＢＳ中で最大７０，０００個の細胞を分取し、過去に記述されているようにＡＴＡＣ−ｓｅｑライブラリーを生成した。出発材料が限られているため、ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ２０００シーケンサーでのマルチプレックスな配列決定前にＡＴＡＣライブラリーのサイズ選択は行わなかった。過去に記述されているように、配列決定後の品質管理、ヒトＡＴＡＣリードのヒトゲノム（ｈｇ１９）とのアライメント、ＭＡＣＳ２ピーク呼び出し、およびＤＥＳｅｑ２ピーク正規化を行った。

ｗ．ヒトゲノムに対するピークのマッピングおよびＳＮＰ分析
Gjoneskaら（２０１５年）、Nature、５１８巻：３６５〜３６９頁およびErnstら（２０１１年）、Nature、４７３巻：４３〜４９頁に記述されているように、オルソロガスなマウスＣｈＡＲ（ｍｍ１０）をヒトゲノム（ｈｇ１９）に対してマッピングした。マッピングアルゴリズムがｍｍ１０における入力領域を要求したため、ＵＣＳＣリフトオーバーツールをＣｈＡＲに適用して、それらをｍｍ９からｍｍ１０に移した。ＮＨＧＲＩカタログ（ワールドワイドウェブ上でebi.ac.uk/gwas/にて利用可能）の「免疫系疾患」としてアノテーションされたＧＷＡＳＳＮＰを、免疫関連のものとして定義した。超幾何分布検定を行い、マッピングされたエンハンサーの、全てのＧＷＡＳＳＮＰＳ、免疫関連ＳＮＰＳ、ならびにＰＩＣＳＳＮＰとの重複を数量化した。

ｘ．マウスおよびヒトのデータの比較分析
５つの細胞状態（ナイーブ、急性ｄ８、急性ｄ２７、慢性ｄ８、慢性ｄ２７）で特定された全てのマウスピークを、ＭＡＣＳ２で呼び出されたピークに基づく３つのカテゴリー：急性および慢性ｄ２７に対してナイーブ細胞において一意的に特定されたピーク（マウスナイーブのみ）、ナイーブおよび慢性ｄ２７に対して急性ｄ２７細胞において一意的に特定されたピーク（マウスメモリーのみ）、ならびにナイーブおよび急性ｄ２７に対して慢性ｄ２７細胞において一意的に特定されたピーク（マウス疲弊のみ）に分割した。これら３つのカテゴリーのうちの１つに分類されなかった全てのマウスピークは、さらなる分析から除外した。３つのカテゴリー（ナイーブ、メモリー、疲弊）におけるオルソロガスなマウスピークをヒトゲノムに対してマッピングし、全てのヒト試料中で独立して呼び出された少なくとも１つのＭＡＣＳ２ヒトピークとの重複についてフィルタリングした。次いで、各ヒト試料に関し、マウスのオルソロガスなピークの３つのカテゴリー（ナイーブ、メモリー、疲弊）の平均クロマチン接近可能性を別々に計算した。各カテゴリーにおける平均クロマチン接近可能性を正規化して、ピークの３つのクラス間に固有のクロマチン接近可能性の差を埋め合わせた。

ｙ．ＨＣＶエピトープの増幅および高深度配列決定
ＨＣＶエピトープの１７４ＤおよびＣ６３Ｂに関し、次の条件を使用して、これらのエピトープ周囲のアンプリコンを生成した。この反応は、０．４μＭの２ｘＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄＢｕｆｆｅｒ、センス（Ａ２Ｆ：ＡＡＣＧＴＴＧＣＧＡＴＣＴＧＧＡＡＧＡＣまたはＡ３Ｆ：ＧＣＴＣＴＣＡＴＧＡＣＣＧＧＣＴＴＴＡＣ）、およびアンチセンスプライマー（Ａ２Ｒ：ＧＧＡＡＧＣＧＴＧＧＴＴＧＴＣＴＣＡＡＴまたはＡ３Ｒ：ＡＧＡＧＡＴＣＴＣＣＣＧＣＴＣＡＴＣＣＴ）、ならびにＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩＲＴ／ＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からなり、次の条件：５０℃で３０分間にわたるｃＤＮＡ合成、続いて９４℃で２分間の熱変性を用い、ＰＣＲ増幅条件は、４０×（９４℃、１５秒；５５℃、３０秒；６８℃、１８０秒）、最終伸長は６８℃で５分間であった。ＮｅｘｔｅｒａＸＴＤＮＡＬｉｂｒａｒｙＰｒｅｐＫｉｔを製造元のプロトコールに従って使用し、ＰＣＲアンプリコンの断片化およびバーコード化を行った。２×２５０ｂｐＶ２試薬キットを使用し、ＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑプラットフォームで試料のプーリングおよび配列決定を行った。ＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑ配列決定から得られたペアエンドリードを、ＶＩＣＵＮＡｄｅｎｏｖｏアセンブラーソフトウェア（Yangら（２０１２年）、BMC Genomics、１３巻：４７５頁）を使用してＨＣＶコンセンサス配列にアセンブルし、Ｖ−ＦＡＴｖ１．０で終了した。Ｍｏｓａｉｋｖ２．１．７３ソフトウェアを使用してこのコンセンサスにリードをマッピングし直し、Ｖ−Ｐｈａｓｅｒｖ２．０ソフトウェア（Yangら（２０１３年）、BMC Genomics、１４巻：６７４頁；Hennら（２０１２年）、PLoS Pathogens、８巻：ｅ１００２５２９頁）を使用して宿主内変異形を呼び出した。全てのリードは、受託番号ＳＲＲ３９５１３４７でＮＣＢＩＳｅｑｕｅｎｃｅＲｅａｄＡｒｃｈｉｖｅに受託されている。

（実施例２）
ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞のクロマチン接近可能性は、分化中に大規模にリモデリングされる
疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞において、エンハンサーおよびプロモーターなどの調節領域を特定するために、ＡＴＡＣ−ｓｅｑ（Buenrostroら（２０１３年）、Nat. Methods、１０巻：１２１３〜１２１８頁）を使用して、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）感染に応答して分化する抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞における接近可能クロマチンの領域の境界を定めた（図１Ａ）。急性ＬＣＭＶ感染は、感染後（ｐ．ｉ．）８日目（ｄ８）に高度に機能的なエフェクターＣＤ８^＋Ｔ細胞を誘発し、これは感染後ｄ２７に防御的なメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞に分化する。対照的に、慢性ＬＣＭＶ感染は疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞を生じる（Wherryら（２００７年）、Immunity、２７巻：６７０〜６８４頁；Zajacら（１９９８年）、J. Exp. Med.、１８８巻：２２０５〜２２１３頁；Barberら（２００６年）、Nature、４３９巻：６８２〜６８７頁；Doeringら（２０１２年）、Immunity、３７巻：１１３０〜１１４４頁；Paleyら（２０１２年）、Science、３３８巻：１２２０〜１２２５頁）。ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞の初期分析および感染後ｄ８およびｄ２７における分析は、各状態において２２，６４６個から３１，９６９個の間のクロマチン接近可能領域（ＣｈＡＲ）を特定した（ＦＤＲ＜０．００１；図２Ａおよび表１）。生物学的複製物と予想される断片サイズ分布との高い相関性により、良好なデータ品質が確認された（Buenrostroら（２０１３年）、Nat. Methods、１０巻：１２１３〜１２１８頁）（図２Ｂ〜２Ｄ）。転写開始部位（ＴＳＳ）、エクソン、イントロン、および遺伝子間領域にまたがるＣｈＡＲの分布は、過去の報告（Thurmanら（２０１２年）、Nature、４８９巻：７５〜８２頁）と一致していた（図２Ａおよび２Ｅ）。予想されたとおり、各状態のＣｈＡＲは、高い進化的保存、調節性アノテーション、活性化プロモーターおよびエンハンサーヒストンマークの領域が強く集中していたが、ポリコーム抑制された領域は枯渇していた（Thurmanら（２０１２年）、Nature、４８９巻：７５〜８２頁；Ernstら（２０１１年）、Nature、４７３巻：４３〜４９頁）（図２Ｆおよび２Ｇ）。

ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞のクロマチン接近可能性は、分化中に（ＤＥ−ｓｅｑ２、ＦＤＲ＜０．０５）大規模にリモデリングされたことが見出された（図１Ｂ〜１Ｃ）。ＣｈＡＲの大部分（７１％、図１Ｃ）は、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞が分化を経るにつれ、出現したか（例えば、Ｉｆｎｇ遺伝子座におけるもの）（図１Ｂ）、あるいは消滅した（例えば、Ｃｃｒ７）（図１Ｂ）。ＣｈＡＲの増加および損失は不均衡であった；感染後ｄ８で一過的に検出されたもの（ｄ８のみ；急性１４．９％、慢性１９．６％）（図１Ｄ）あるいはナイーブ細胞から損失したもの（ナイーブのみ；全領域に対して急性１１．３％；慢性１２．６％）（図１Ｄ）よりも大幅に高い割合の領域が、感染後ｄ８に出現して持続したか（ｄ８およびｄ２７；急性３１．６％、慢性３８．８％）（図１Ｄ）、またはｄ２７にのみ出現した（ｄ２７のみ；急性１４．３％、慢性１６．９％）（図１Ｄ）。したがって、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞状態からの分化は、クロマチン接近可能性の減少よりもむしろ、純増加に関連している（図２Ｈ）。

（実施例３）
機能的エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞またはメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞と比べた疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞における状態特異的ゲノム調節領域
疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞のＣｈＡＲを、機能的エフェクターＣＤ８^＋Ｔ細胞またはメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞において見出されたものと比較したところ、調節領域のパターンに顕著な大域的差が見出された。感染後ｄ８および／またはｄ２７において慢性感染に応答するＣＤ８^＋Ｔ細胞には存在したが、急性感染では存在しなかった、合計７，３６８個のＣｈＡＲが特定された（図１Ｅおよび２Ｉ）。加えて、感染後ｄ８および／またはｄ２７において急性感染では存在したが、疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞においては欠如していた、４，３９５個の領域が特定された。急性感染と慢性感染との間で差次的な調節領域は、エンハンサーの特色を示した：差次的な調節領域は、ＴＳＳが枯渇しており（非差次的な領域における１４％に対して５％）、遺伝子間およびイントロン領域が集中しており（３７％対２９％および４５％対３１％）（図１Ｆ）、遺伝子プロモーターに対して遠位である（図１Ｇ）という傾向があった。疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞と機能的ＣＤ８^＋Ｔ細胞との間での調節領域のプロファイルの差の規模は、遺伝子発現に見られたものよりも大きかった。全てのＣｈＡＲの４４．４８％が、差次的に発現した遺伝子の９．７５％のみと比較して、各時点における機能的細胞と疲弊細胞との間に差次的に存在したことが見出された（両方の値はＦＤＲ＜０．０５で推定した）。この所見と一致して、遺伝子発現による各Ｔ細胞状態間のランクの相関性は、調節領域のレベルにおけるものよりも大幅に高かった（図１Ｈ）。これらの結果は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞分化中の状態変化には、遺伝子発現の検査によって明らかであるものよりも大きな接近可能クロマチン再編成が付随することを示す。

教師なしクラスタリングにより、同様の活性パターンを有する差次的なＣｈＡＲの「モジュール」を特定した（図４および５Ａ）。高度に状態特異的な活性パターンを表す調節領域の７つのモジュールが特定された。モジュールａ〜ｅは、それぞれ、ナイーブ、急性感染後ｄ８、急性感染後ｄ２７、慢性感染後ｄ８、および慢性感染後ｄ２７のＣＤ８^＋Ｔ細胞において主に活性なＣｈＡＲに対応した。モジュールｆは、ナイーブＴ細胞と急性感染後ｄ２７との間で共通した一組のＣｈＡＲを特定し、モジュールｇは、ナイーブと慢性感染後ｄ８との間で共通したＣｈＡＲを含有した（図３Ｂ）。各モジュール内のＣｈＡＲの平均ピーク強度と隣接遺伝子の平均遺伝子発現との間に、高度に有意な正の相関（ｐ＜０．００１）が見出された（図３Ｂ〜３Ｃ）。これらの結果は、平均して、各モジュールに含有されたＣｈＡＲが、対応する遺伝子の抑制よりもむしろ活性化に関連する傾向があったことを示す。

それぞれの状態特異的モジュールにおける遺伝子は、対応するＴ細胞状態において公知の機能を有する多くのものを含んだ。例えば、ナイーブＴ細胞において最も活性の高いモジュールａは、Ｃｃｒ７およびＬｅｆ１に隣接するＣｈＡＲを含有した（図３Ｄ）。慢性感染後ｄ８およびｄ２７において活性なモジュールｄは、阻害性受容体Ｐｄｃｄ１およびＨａｖｃｒ２（これはＴｉｍ３をコードする）ならびに転写因子Ｂａｔｆに隣接するＣｈＡＲを含有した。これらの遺伝子は全て、疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞において上方制御される（Wherryら（２００７年）、Immunity、２７巻：６７０〜６８４頁；Doeringら（２０１２年）、Immunity、３７巻：１１３０〜１１４４頁）。活性調節領域のモジュラー構造は明確な調節プログラムに関連付けられるという仮説を立て、各モジュール内のＣｈＡＲに隣接する遺伝子の機能を調査した。実際、各モジュールにおける遺伝子の機能的クラスは、ＧｅｎｅＯｎｔｏｌｏｇｙタームのエンリッチメントによって測定すると明確であった（図３Ｄおよび表１）。例えば、ナイーブ関連モジュールａは、ヒストンリシンメチル化、ＩＬ−２産生の調節、および幹細胞分裂に関与する遺伝子と関連付けられた。対照的に、主に急性感染後ｄ８の細胞において活性であったモジュールｂは、細胞走化性およびＣＤ８^＋α−β Ｔ細胞分化の調節に関与する遺伝子に関連付けられた。疲弊に関連付けられたモジュールｅは、サイトカイン産生の負の調節、ＬＰＳ媒介性シグナル伝達の負の調節、Ｔ細胞活性化の負の調節、およびＩＬ−１０産生の調節に関与する遺伝子が集中していた。このように、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞、エフェクターＣＤ８^＋Ｔ細胞、メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞、および疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞を区別するＣｈＡＲは、機能的に明確な遺伝子のプログラムを正に調節する状態特異的モジュールに組織化される。

（実施例４）
疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞における状態特異的ゲノム調節領域は疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞で差次的に発現される遺伝子を調節する
次に、疲弊細胞に特異的な調節領域が、疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞で差次的に発現される遺伝子を調節しうるかどうかを試験しようと試みた。ＰＤ−１の持続的発現は疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞の中核的特色であるが、ＰＤ−１は、急性ＬＣＭＶ感染中にエフェクターＣＤ８^＋Ｔ細胞によっても一過的に発現される（Barberら（２００６年）、Nature、４３９巻：６８２〜６８７頁；Doeringら（２０１２年）、Immunity、３７巻：１１３０〜１１４４頁）。公知の調節領域における持続的脱メチル化がヒトの疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞（Youngbloodら（２０１３年）、J. Immunol.、１９１巻：５４０〜５４４頁）およびマウスモデル（Youngbloodら（２０１１年）、Immunity、３５巻：４００〜４１２頁）で観察されているものの、疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＰＤ−１発現が、機能的ＣＤ８^＋細胞に存在しない疲弊特異的調節領域によって調節されるかどうかは、不明なままである。９個のＣｈＡＲがＰｄｃｄ１遺伝子座の４５ｋｂ内で特定され（図６Ａ）、また、過去に記述されている、エンハンサー活性のある領域（−１．５ｋｂおよび−３．７ｋｂ）に対応するもの数個が見出された（図６Ａ）（Austinら（２０１４年）、J. Immunol.、１９２巻：４８７６〜４８８６頁）；これらは、急性感染および慢性感染の両方で存在した。Ｐｄｃｄ１ＴＳＳのおよそ−２３．８ｋｂ上流にあるさらなる領域で、慢性感染の感染後ｄ８およびｄ２７において疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞でのみ認識できるクロマチン接近可能性を示し、また急性感染のナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞、エフェクターＣＤ８^＋Ｔ細胞、またはメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞ではこれを示さなかったものが特定された（図６Ａ）。

このＣｈＡＲは、疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞における持続的な高レベルの発現に要求されるＰＤ−１のエンハンサーとして機能しうるという仮説を立てた。この考えと一致して、この領域は、上位ランクの疲弊関連ＴＦのうちの２つ：Ｒｕｎｘ２（Bestら（２０１３年）、Nat. Immunol.、１４巻：４０４〜４１２頁）およびレチノイン酸受容体アルファ（Ｒａｒａ）（Allieら（２０１３年）、J. Immunol.、１９０巻：２１７８〜２１８７頁；Guoら（２０１４年）、J. Immunol.、１９２巻：３３３６〜３３４４頁）のフットプリントを含む。これにより、マウスＥＬ４Ｔ細胞株のこの領域、および過去に公開されたＤＨＳ（Vierstraら（２０１４年）、Science、３４６巻：１００７〜１０１２頁）またはＡＴＡＣ−ｓｅｑデータ（Lara-Astiasoら（２０１４年）、Science、３４５巻：９４３〜９４９頁）における、クロマチン接近可能性の調査が促された。クロマチン接近可能性は、顆粒球、単球、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞などの高分化型細胞型を含むＬｉｎ⁻Ｓｃａ^＋Ｋｉｔ^＋細胞からの造血細胞の分化の間中、いかなる有意なレベルでも検出されなかったことが見出された（図６Ａ）。しかしながら、いずれも高レベルのＰＤ−１を構成的に発現することができる（Austinら（２０１４年）、J. Immunol.、１９２巻：４８７６〜４８８６頁；Raimondiら（２００６年）、J. Immunol.、１７６巻：２８０８〜２８１６頁）、ＥＬ４細胞および調節性Ｔ細胞の同じ領域において、ＣｈＡＲが特定された。Ｔ細胞エンハンサーとしての−２３．８ｋｂＣｈＡＲの機能を試験するため、この領域に対応する７８１ｂｐの断片（すなわち、ｍｍ９ｂｕｉｌｄのｃｈｒ１：１１３９５，９７１，１１８〜９５，９７１，８９９）をレポーター構築物にクローニングしたところ、以下の配列を有した（これは、この参照により表１に完全に組み込まれるものとする）：

この断片は、ミニマルプロモーターのみをコードするベクターと比べて、ＥＬ４細胞およびｉｎｖｉｔｒｏ活性化ＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるレポーター遺伝子発現の１０〜１２倍の増加を誘導するのに十分であった（図６Ｂ）。これは、−２３．８ｋｂにおけるＣｈＡＲがエンハンサーとして機能しうることを示唆する。

次いで、−２３．８ｋｂエンハンサーが高レベルのＰＤ−１発現に必要であったかどうかを試験した。このエンハンサー部位で持続的な高レベルのＰＤ−１発現およびオープンクロマチンの両方を有するＥＬ４細胞において、その位置における１．２ｋｂの断片を欠失させるために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼを使用した（Shalemら（２０１４年）、Science、３４３巻：８４〜８７頁；Canverら（２０１５年）、Nature、５２７巻：１９２〜１９７頁）（図５Ａ〜５Ｅ）。次いで、いくつかの手法を使用し、−２３．８ｋｂ領域の損失がＰＤ−１発現に影響したかどうかを試験した。第１に、この領域が高レベルのＰＤ−１発現に要求されたことが決定された。エンハンサーの端部にある一対のｓｇＲＮＡまたは対照ガイドをＣａｓ９発現ＥＬ４細胞にトランスフェクトし、これらの細胞をＰＤ−１発現が異なった亜集団に分取し、これらの細胞の各亜集団におけるエンハンサー欠失または野生型対立遺伝子の相対的な存在量をゲノムＰＣＲによって試験した（図６Ｃ）。−２３．８ｋｂをターゲティングする一対のｓｇＲＮＡをトランスフェクトしたＥＬ４細胞では、ＰＤ−１発現が最も低い細胞が、エンハンサー欠失バンドの最も高い存在量、および野生型バンドの最も低い存在量を有した。

第２に、−２３．８ｋｂｓｇＲＮＡ対をトランスフェクトしたＰＤ−１^ｌｏＥＬ４細胞から多数の単一細胞クローンを生成した。スクリーニングした４５個のクローン中９個（２０％）（図５Ｆ〜５Ｇ）が−２３．８ｋｂ領域の欠失を有するものと特定され、欠失クローンの幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）は非欠失クローンよりも有意に低かった（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定Ｐ＜０．００２）ことがさらに見出された（図５Ｇ）。−２３．８ｋｂＣｈＡＲの欠失は、Ｓａｎｇｅｒ配列決定（図５Ｈ）を使用して確認され、９個全てのクローンが、標的ＣｈＡＲの二対立遺伝子欠失を示したＰＣＲ欠失バンドを有することが見出された。図５Ｈに示される配列は次のとおりである：

この領域の欠失はＰＤ−１発現を６３．２％減少させたが、発現を完全に損失させたわけではなく、ＥＬ４細胞内のさらなる調節領域もＰＤ−１発現の調節に関与していたことを示唆している（図６Ｄ）。

第３に、発現が検出可能でありＰｄｃｄ１遺伝子座の１．５Ｍｂ以内にある全ての遺伝子の発現を数量化することにより、−２３．８ｋｂＣｈＡＲの欠失がＰＤ−１発現を特異的に減少させたかどうかを査定した。ＰＤ−１ｍＲＮＡの発現のみが、−２３．８ｋｂＣｈＡＲの欠失によって有意に減少した（図５Ｉ）。この結果は、疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞に存在するが機能的ＣＤ８^＋Ｔ細胞には存在しない−２３．８ｋｂＣｈＡＲが、高レベルのＰＤ−１発現を維持するのに要求されるエンハンサーとして機能することを示す。

次に、−２３．８ｋｂエンハンサー内の特異的配列によるＰＤ−１発現の調節への機能的寄与を特定しようと試みた。Ｃａｓ９媒介性ｉｎｓｉｔｕ飽和変異誘発を使用した。プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）（Canverら（２０１５年）、Nature、５２７巻：１９２〜１９７頁；Vierstraら（２０１５年）、Nat. Methods、１２巻：９２７〜９３０頁）により拘束される、このエンハンサー内の可能性のある全てのｓｇＲＮＡを設計した。Ｐｄｃｄ１遺伝子座に隣接する他の調節エレメントを含む−２３．８ｋｂエンハンサーの変異誘発を行うことの影響を比較するために、ＡＴＡＣ−ｓｅｑ分析により定義された他の８つのＰＤ−１調節配列をターゲティングする同様のタイリングされた一組のｓｇＲＮＡも設計した（図６Ａ）。Ｃａｓ９発現ＥＬ４細胞に、エンハンサーをターゲティングする１，７５４個のｓｇＲＮＡ、陽性対照としてＰｄｃｄ１エクソンをターゲティングする１１７個のｓｇＲＮＡ、および陰性対照として２００個の非ターゲティングｓｇＲＮＡのプールを形質導入した（図７Ａ）。隣接するｓｇＲＮＡ同士の間の距離中央値は５ｂｐであり、ｓｇＲＮＡの９０％が互いから１８ｂｐ以内に含まれたため、ＰＤ−１発現を妨害するゲノム切断部位を高分解能で特定することができた（図７Ｂ）。

形質導入されたＥＬ４は、ＰＤ−１を高発現するか低発現するかに基づいて集団に形質導入し、抽出されたゲノムＤＮＡの配列決定を使用して、２つの画分内の個々のｓｇＲＮＡの存在量を数量化した（図７Ｃ）。ＰＤ−１ｈｉｇｈ画分とｌｏｗ画分との間で均等に分布していた非ターゲティングｓｇＲＮＡと比較して、Ｐｄｃｄ１エクソンをターゲティングするｓｇＲＮＡは、予想されたとおり、ＰＤ−１ｌｏｗ画分に高度に集中していた（図６Ｅおよび７Ｄ〜７Ｅ）。９つの調節領域中８つをターゲティングするｓｇＲＮＡもまた、ＰＤ−１ｌｏｗ画分において様々な程度（ｐ＜０．００００１〜ｐ＜０．０１）に有意に集中していたことが見出され、８つの調節領域のそれぞれにおいてＰＤ−１発現に影響する重要な配列の密な表現が示された。しかしながら、−３５．６ｋｂＣｈＡＲにおけるｓｇＲＮＡは、ＣＴＣＦにより媒介されるＰｄｃｄ１遺伝子座の境界の外側にこの領域が位置するという以前の観察（Austinら（２０１４年）、J. Immunol.、１９２巻：４８７６〜４８８６頁）と一致して、ＰＤ−１発現には有意な影響を及ぼさなかった。

ＰＤ−１ｌｏｗ画分に集中していたエンハンサー内のｓｇＲＮＡのうちの１つをそれぞれトランスフェクトした、同質遺伝子系統のＣａｓ９発現ＥＬ４細胞３２個を生成することにより、−２３．８ｋｂエンハンサー内のｓｇＲＮＡに注目した。ＰＤ−１陰性画分（ＰＤ−１ｈｉｇｈ：ｌｏｗ比は平均を＞１ＳＤ下回る）に最も強く集中していたｓｇＲＮＡのプール設定において予測された活性と、個々の細胞株におけるＰＤ−１のＭＦＩに対するそれらの影響との間には、強い相関性（ｐ＝０．００４１）（図６Ｆ）が見出された。この結果は、プールスクリーニングにより、エンハンサーの重要な配列を高い特異性で妨害するｓｇＲＮＡが特定されたことを示す。予測された切断部位の位置を調べると、エンハンサーの中で切断がＰＤ−１発現に顕著な影響を与えた３つの重要な領域が明らかになった（図６Ｇ、灰色の網掛け）。

次に、−２３．８ｋｂエンハンサーにおけるこれらの重要な領域が、ｉｎｖｉｖｏの疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞における転写因子（ＴＦ）結合の明確なパターンに関連していたかどうかが問われた。ＴＦＣｈＩＰ実験は、疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞の希少集団では実行可能ではないため、ｄ２７の疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞のＡＴＡＣ−ｓｅｑトラックを分析して、公知のＴＦモチーフと比較したトランスポサーゼによるカット部位の減衰に基づいてＴＦ結合を推測した（すなわち、ＴＦフットプリンティング）（Pique-Regiら（２０１１年）、Genome Res.、２１巻：４４７〜４５５頁）（図８Ａ〜８Ｂおよび表１）。このデータにおけるＴＦフットプリンティングを検証するために、この手法によりＴＦ結合のＣｈＩＰ−ｓｅｑデータが再現可能であることをまず確認した。ＴＦフットプリンティングをｉｎｖｉｔｒｏ活性化ＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＢＡＴＦおよびＩＲＦ４の既存のＴＦＣｈＩＰデータと比較したところ、高レベルの感受性および特異性（ＡＵＣ＝０．７７および０．８４）が見出された（図８Ｃ〜８Ｄ）。ナイーブ細胞および急性感染後ｄ８の細胞における差次的なＴＦフットプリント（結合部位を呼び出す事後確率＞０．９０）（図８Ａ〜８Ｄ）も特定された。この分析により、ＡＰ−１ファミリーＴＦのＢａｔｆ、Ｊｕｎ、およびＦｏｓ、ならびにナイーブＴ細胞調節因子のＬｅｆ１（KaechおよびCui（２０１２年）、Nat. Rev. Immunol.、１２巻：７４９〜７６１頁；Kurachiら（２０１４年）、Nat. Immunol.、１５巻：３７３〜３８３頁）を含む、エフェクター機能の公知の調節因子に関連するモチーフが回収された（図１０Ａ）。

ＡＴＡＣ−ｓｅｑデータのＴＦフットプリンティング分析を検証したところ、慢性ｄ２７疲弊T細胞の−２３．８ｋｂＰＤ−１エンハンサー内にＴＦフットプリントが特定された。ＥＬ４細胞におけるＰＤ−１発現を低減させたｓｇＲＮＡの切断部位は、ｉｎｖｉｖｏで疲弊ＣＤ８^＋細胞において見出されるＴＦ結合モチーフ内に有意に集中していた（Ｐ＝８．６３×１０^４、超幾何分布検定）ことが見出された。妨害に対する最大の感受性を有する３つのＴＦフットプリントは、ｉｎｖｉｖｏの疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるＳｏｘ３、Ｔ−ｂｅｔ（Ｔｂｘ２１によりコードされる）、およびレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）のモチーフに対応した（図６Ｇおよび１０Ｂ）。これらのデータに基づき、−２３．８ｋｂエンハンサーにおけるこれらのモチーフに対するＴＦ結合は、疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞内のＰＤ−１の調節において重要な役割を果たすと考えられる。

これらのモチーフにおけるＴＦ結合の増加がＴ細胞疲弊のより一般的な特色であるかどうかを決定するため、ゲノムワイドなＴＦフットプリンティングをｄ２７の慢性感染と急性感染との間で比較し、推測される結合の有意な差を示した１３５個のＴＦモチーフを特定した（図６Ｈおよび表１）。上位ランクのＴＦは活性調節領域の複数のモジュールで優先的結合の明確なパターンを示すことが見出されたという事実を含め、いくつかの特色により、これらのＴＦモチーフにおける結合がＴ細胞疲弊の調節における役割を果たす可能性が高いことが示された（図９Ａ）。第１に、結合モチーフは、感染後ｄ２７に急性感染に対して慢性感染のＣＤ８^＋Ｔ細胞間で差次的に発現された遺伝子において、差次的に発現されなかった遺伝子と比べてより頻繁に観察された（超幾何学的Ｐ＝９．８５×１０^−３、差次的な遺伝子発現ＦＤＲ＜０．０５）（図１０Ａ）。第２に、分析から回収された多くの結合モチーフは、Ｔ−ｂｅｔ（Ｔｂｘ２１；Paleyら（２０１２年）、Science、３３８巻：１２２０〜１２２５頁）、Ｅｏｍｅｓ（Paleyら（２０１２年）、Science、３３８巻：１２２０〜１２２５頁）、Ｂａｔｆ（Quigleyら（２０１０年）、Nat. Med.、１６巻：１１４７〜１１５１頁）、Ｂｌｉｍｐ１（Shinら（２００９年）、Immunity、３１巻：３０９〜３２０頁）、Ｎｆａｔｃ１（Martinezら（２０１５年）、Immunity、４２巻：２６５〜２７８頁）、Ｎｒ４ａ２（Giordanoら（２０１５年）、EMBO J.、３４巻：２０４２〜２０５８頁）、およびＭａｆｂ（Giordanoら（２０１５年）、EMBO J.、３４巻：２０４２〜２０５８頁）を含め、疲弊における役割が公知であるＴＦに対応した（図６Ｈおよび１０Ｃ）。第３に、他の差次的なＴＦフットプリントは、ＡＰ−１ファミリーＴＦと相互作用する（de Graziaら（１９９４年）、J. Exp. Med.、１８０巻：１４８５〜１４９７頁）Ｐｏｕ２ｆ２（Ｏｃｔ−２としても公知）、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞の不活発性を調節する（Fengら（２０１１年）、Nature Immunol.、１２巻：５４４〜５５０頁）Ｆｏｘｐ１、および腫瘍微小環境においてＣＤ８^＋Ｔ細胞機能を促進する（Guoら（２０１４年）、J. Immunol.、１９２巻：３３３６〜３３４４頁）一方でＣＤ８^＋Ｔ細胞記憶発達を負に調節する（Allieら（２０１３年）、J. Immunol.、１９０巻：２１７８〜２１８７頁）レチノイン酸受容体アルファ（Ｒａｒａ）などの、Ｔ細胞疲弊調節因子としてもっともらしく新規の候補を示唆する。注目すべきことに、レチノイン酸受容体アルファモチーフ（Ｒａｒａ）におけるＴＦフットプリントは疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞に有意に集中していた（ＦＤＲ＝３．１４×１０^−１３）ことが見出され、このＴＦファミリーの疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞における役割がＰＤ−１を超えてより大きな転写プログラムの調節まで及ぶことが示された。

疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞における新たなＴＦ結合事象の獲得によって主に特徴付けられた慢性感染における、経時的なＴＦ結合の広範囲にわたる変化も見出された。上述のように、例えば、Ｔｂｘ２１およびＥｏｍｅｓは、感染後ｄ８では慢性感染と比べて急性感染においてより多くの領域に結合したが、感染後ｄ２７までには両方のＴＦが、末期疲弊におけるそれらの公知の役割（Paleyら（２０１２年）、Science、３３８巻：１２２０〜１２２５頁）と一致して、疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞内で多数の新たな結合部位を獲得していた（図１０Ｃおよび９Ｂ）。より一般的には、感染後ｄ８からｄ２７にかけてのＴＦの結合パターンが感染後ｄ２７までには慢性感染における新たな部位での優先的な結合に向かう顕著なシフトが観察された（図１０Ｃ）。これに対応して、疲弊における差次的なＴＦ結合事象の数がメモリーと比べて増加した（図９Ｂ）。このように、Ｔ細胞疲弊は、経時的なＴＦ結合の広範囲にわたるリプログラミングと共に発展する。

（実施例５）
疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞の状態特異的ゲノム調節領域はヒト疾患との関連性がある
ＬＣＭＶ感染のマウスモデルの分析は、Ｔ細胞疲弊が明確なエピジェネティック状態に関連することを示唆する。マウスモデルにおける疲弊特異的エンハンサープロファイルもまたヒト疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞の特色であったかどうかを試験するために、治療を受けていない慢性進行性ＨＩＶを有する４名の対象のＨＩＶ特異的な四量体^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞におけるクロマチン接近可能性の大域的パターンを分析した（図１１Ａおよび表１）。これらのパターンを、健康なドナーのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞において見出されるものと比較した。各ドナーのナイーブ（ＣＣＲ７^＋ＣＤ４５ＲＡ^＋）およびエフェクターメモリー（ＣＣＲ７⁻ＣＤ４５ＲＡ⁻）のバルク集団を対照として用いた。各ドナーのＣｈＡＲは、活性化クロマチンマークに関連する領域が高度に集中しており、抑制的なマークを含有する領域が枯渇していたことが見出され、良好なデータ品質が確認された（図１１Ｂ）。

マウスモデルにおいて特定されたＣｈＡＲをそれらとオルソロガスなヒト領域に対してマッピングし、全てのマウスＣｈＡＲの８０〜８５％とのアライメントに成功した（Gjoneskaら（２０１５年）、Nature、５１８巻：３６５〜３６９頁；Villarら（２０１５年）、Cell、１６０巻：５５４〜５６６頁）（図１２Ａ〜１２Ｂ）。５つ全てのマウスＣＤ８^＋Ｔ細胞状態からマッピングされた領域は、疾患関連ＳＮＰ（ＰＩＣＳＳＮＰ、Ｐ＜２．７７×１０^−８；超幾何分布検定）（Farhら（２０１５年）、Nature、５１８巻：３３７〜３４３頁）（図１２Ｃ）、特に免疫関連ＮＨＧＲＩＧＷＡＳＳＮＰ（Ｐ＜３．７０×１０^−３０）が有意に集中しており（図１１Ｃ〜１１Ｅ）、マッピングされた領域が免疫系における重要な調節領域に対応したことを示唆している。しかしながら、ＰＤＣＤ１遺伝子座における領域は、過去に観察されたように（Austinら（２０１４年）、J. Immunol.、１９２巻：４８７６〜４８８６頁）、マウスモデルからマッピングされたものの中になく、マウスモデルで観察された−２３．８ｋｂエンハンサーのオルソログを検出する能力は限定されている。

ナイーブ細胞、メモリー細胞（急性ｄ２７）、または疲弊細胞（慢性ｄ２７）に特有の重複しない一組のＣｈＡＲをマウスにおいて特定し、各ヒト試料においてオルソロガスな領域内のクロマチン接近可能性について試験した（図１２Ｄ）。大部分のドナーのヒトナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞は、メモリー特異的領域または疲弊特異的領域よりも、マウスにおいて定義されたナイーブ特異的領域において有意に高いクロマチン接近可能性を示した。健康なドナーにおいて、ＣＭＶ特異的四量体^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびエフェクターメモリー細胞では、メモリー特異的領域が集中していた（ＭＷ検定、Ｐ＝０．０１〜Ｐ＜０．０００１）（図１２Ｅ）。対照的に、４名中３名の対象のＨＩＶ特異的四量体^＋細胞は、メモリー特異的領域よりも疲弊特異的領域において有意に高いクロマチン接近可能性を示した（ＭＷ検定、ｐ＝０．０５〜ｐ＜０．００１）。興味深いことに、ＨＩＶ感染対象のエフェクターメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞は、疲弊特異的領域においても高いクロマチン接近可能性を示したが、これはおそらく、そのコンパートメント内の、または異常分化したバイスタンダーＴ細胞による、未測定の疲弊ＨＩＶ特異的Ｔ細胞の結果と思われる（Stelekatiら（２０１４年）、Immunity、４０巻：８０１〜８１３頁）。

これらの所見は、同じドナーから得た複数の四量体^＋集団における疲弊特異的なエピジェネティックパターンを調査することにより、慢性ＨＣＶ感染を有する対象において確認された。２つの異なるＨＣＶエピトープに特異的な四量体^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞、およびインフルエンザ（Ｆｌｕ）に特異的なもの、ならびにバルクナイーブ細胞およびエフェクターメモリー細胞を単離した。予想されたとおり、フローサイトメトリーは、ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞が疲弊マーカーＰＤ−１およびＣＤ３９に対して一様に陰性であったことを明示した。ＨＣＶＣ６３Ｂエピトープに特異的な四量体^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の大部分は、慢性感染におけるＨＣＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞に関して過去に記述されているように、高レベルのＰＤ−１（Rutebemberwaら（２００８年）、J. Immunol.、１８１巻：８２１５〜８２２５頁；Kasprowiczら（２００８年）、J. Virol.、８２巻：３１５４〜３１６０頁）およびＣＤ３９（Guptaら（２０１５年）、PLoS Pathogens、１１巻：ｅ１００５１７７頁）を発現した（図１２Ｆ）。しかしながら、１７４Ｄエピトープに特異的なＨＣＶ四量体^＋細胞は、機能的Ｆｌｕ四量体^＋細胞の染色パターンと酷似して、ＰＤ−１およびＣｄ３９−ｌｏｗであった。この対象のＨＣＶゲノムの配列決定は、１７４ＤエピトープがＣ６３Ｂエピトープとは異なって広範囲にわたるウイルス回避を受けたことを明らかにし、野生型ウイルス配列は検出不可能であった。これは、１７４Ｄ四量体^＋Ｔ細胞が同族抗原に出会わなくなったことを示唆する（図１２Ｇ）。この観察と一致して、Ｃ６３ＢＴｅｔ^＋細胞が、疲弊特異的領域においてメモリー領域よりも有意に高いクロマチン接近可能性（ＭＷ検定、ｐ＝０．０１）を示したことが決定された。対照的に、１７４Ｄ四量体^＋細胞は、インフルエンザ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞と同様に、メモリー特異的領域において高いクロマチン接近可能性を示した（ＭＷ検定、ｐ＝０．０４）（図１２Ｈ）。このように、マウス疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞に見出されるクロマチン接近可能性の状態特異的パターンは、ヒト疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞において保存されている。

（実施例６）
疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞の状態特異的ゲノム調節領域はヒト疾患との関連性がある
疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞には存在するが機能的ＣＤ８＋Ｔ細胞には存在せず、ｉｎｖｉｔｒｏで高レベルのＰＤ−１発現を維持するのに要求されるエンハンサーとして機能する、ＰＤ−１の−２３ｋｂ上流にあるＣｈＡＲ領域の発見に加えて、このＣｈＡＲのｉｎｖｉｖｏでの役割の特徴付けを行った。この領域の生殖系列欠失を有するマウスを生成した（図１３Ａ）。簡潔に述べると、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ卵子にＣａｓ９ｍＲＮＡならびにｉｎｖｉｔｒｏ検証したｓｇＲＮＡを注射し、その後、偽妊娠の雌に移植した（図１３Ｂ）。生存した７体の子孫のうち２体のマウスが、ＣｈＡＲのヘテロ接合性欠失を有し（図１３Ｃ）、１体がその子孫に対立遺伝子を伝えることができた。これらのマウスをＰ１４ＴＣＲトランスジェニック株と交配して、ホモ接合性エンハンサー欠失動物ならびにＷＴ対照同腹仔を、それぞれＣＤ４５．１シングルポジティブなバックグラウンドおよびＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２ダブルポジティブなバックグラウンドで生成した。次いで、急性および慢性のＬＣＭＶ感染中にこの欠失がＣＤ８＋Ｔ細胞に及ぼす影響を養子細胞移入戦略の使用により査定した（図１４Ａ）。２つのミックスを作出した：一方は、ＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２（ＤＰ）を有する野生型（ＷＴ）細胞と対比してＣＤ４５．１のみ（ＳＰ）でマーキングされたエンハンサー欠失細胞を含有し、他方はＤＰバックグラウンドと対比してＳＰバックグラウンドのＷＴ細胞を含有した。各ミックスで同腹仔ドナーマウスを使用し、レシピエントマウスはＣＤ４５．２シングルポジティブＣ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドであった。さらなる分析において、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇおよびクローン１３感染動物のコホートからのデータを組み合わせ、統計学的検出力を求めた。

データは、類遺伝子でマーキングされたＷＴ対ＷＴ細胞集団がｉｎｖｉｖｏで均等に回収され、トランスジェニックＴＣＲおよび阻害性受容体ＰＤ−１の同様の発現を有することを示す（図１４Ｂ）。対照的に、エンハンサー欠失細胞集団は、競合的ミックスにおいてＷＴ細胞を打ち負かし、したがって、大幅に高い率で回収される（図１４Ｂ）。それらはまた、ＷＴ集団（ｐ＝０．３６、対応ｔ検定）と比較して、ＰＤ−１の発現がより低い（エンハンサー欠失に対してｐ＝０．０２、対応ｔ検定）（図１４Ｂ〜１４Ｃ）。ＷＴ対ＷＴミックスと比較して、ＷＴ細胞に対するエンハンサー欠失集団のエンリッチメントｌｏｇ２倍率は、ｄ８において（ｐ＜０．００１、ｔ検定）、またｄ１５において（ｐ＝０．００４４、ｔ検定）有意に高かった（図１４Ｄ〜１４Ｅ）。まとめると、これらのデータは、プロモーターの−２３ｋｂ上流にあるＰＤ−１エンハンサーの遺伝子欠失が、急性および慢性両方のウイルス感染におけるＰＤ−１の発現をｉｎｖｉｖｏで低下させ、Ｔ細胞増殖および／または生存期間を増加させることを示す。

前述の内容に基づき、マウスおよびヒトの疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞が、それらの機能的対応物とは明確に異なる調節領域の大域的なパターンを示すことが見出された。これらのデータは、本発明者らがＴ細胞疲弊を理解する上で重要な３つの意義を有する。

第１に、このデータは、エンハンサー接近可能性のリモデリングと新たなＴＦ結合の組合せと共に疲弊が生じることを示し、疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞が単純に「持続的エフェクター」ではなく、むしろ、それらの機能的対応物とは明確に異なる分化状態であるモデルを支持する。この状態の可塑性の特定、そしてこれを元に戻すことができるかどうか、またはいかに元に戻すことができるかは、重要な問題となる。回避されたエピトープを認識しなくなったＨＣＶ特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞において疲弊特異的なエピジェネティックプロファイルが存在しないことは、抗原負荷量の低減が疲弊を回復させる重要な要因でありうることを示すが、縦断的研究における確認が待たれる。Ｔ細胞疲弊のエピジェネティックプロファイルを元に戻すために慢性抗原曝露を止めることのないチェックポイント遮断は、がん免疫療法に重要な意義を有する。

第２に、ｉｎｖｉｖｏでのＴＦフットプリンティングと組み合わせたｉｎｖｉｔｒｏでのエンハンサーのｉｎｓｉｔｕ変異誘発が、エンハンサー機能の精細なマッピングに有用な手法であることが、本明細書で明示された。ＴＦＣｈＩＰ研究の実現可能性は、関連性のある細胞をわずかしか単離することのできない状況では限定されている。代替として、ＴＦフットプリンティングをｉｎｖｉｖｏで使用することで、疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞の状態特異的エンハンサーにおけるＴＦ結合が推測されるモチーフが特定され、Ｃａｓ９媒介性飽和変異誘発をｉｎｖｉｔｒｏで使用したこれらのＴＦフットプリンティングの機能が証明された。この手法はＴＦモチーフの縮重により限定される（例えば、Ｔ−ｂｅｔモチーフには、実際にはエオメソデルミンなどの他のＴ−ｂｏｘ因子が結合する場合がある）が、ＲＡＲファミリーのＴＦといった潜在的な新規のＴ細胞疲弊調節因子の役割を明らかにする能力を強調する。

第３に、疲弊T細胞における状態特異的エンハンサーのマッピングは、養子Ｔ細胞療法の治療有効性を改善する機会を提供すると考えられる。がんに対するキメラ抗原受容体を発現するように操作されたＴ細胞の注入は、操作T細胞産物におけるＴ細胞疲弊の発生を部分的な理由として、固形腫瘍においてはあまり成功していなかった（Longら（２０１５年）、Nat. Med.、２１巻：５８１〜５９０頁；Stromnesら（２０１５年）、Cancer Cell、２８巻：６３８〜６５２頁）。疲弊への抵抗性をもたせるための治療用Ｔ細胞のゲノム編集は魅力的な概念であり、ＰＤ−１遺伝子座の欠失を調査する最近の研究につながった（Hendelら（２０１５年）、Nat. Biotechnol.、３３巻：９８５〜９８９頁；Schumannら（２０１５年）、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、１１２巻：１０４３７〜１０４４２頁）。しかしながら、ＰＤ−１の不可逆的な欠失は、慢性感染においてＴ細胞の過剰な活性化を防止するその重要な調節性役割を考えれば望ましくない場合がある（Odorizziら（２０１５年）、J. Exp. Med.、２１２巻：１１２５〜１１３７頁）。対照的に、疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞の機能を損なう遺伝子を調節する疲弊特異的エンハンサーの編集（Canverら（２０１５年）、Nature、５２７巻：１９２〜１９７頁）は、エクソンをターゲティングするよりも「微調整可能（ｔｕｎａｂｌｅ）」状態特異的であるＴ細胞機能調整のさらなる手法を提供すると考えられる。例えばこれは、Ｔ細胞の阻害には寄与するがＰＤ−１の生理学的調節は保つ、過剰発現の防止のための手法を提供する。ヒトの疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞に対して特異的なエンハンサーの詳細な機能的マップの作成は、治療用途のためのＴ細胞の理にかなった改変に向けた重要なステップとなると考えられる。

参照による組み込み
本明細書において言及される公開文献、特許、および特許出願は全て、あたかも各個別の公開文献、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが明確に個別に示されているかのように、その全体において参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、本明細書におけるあらゆる定義を含め、本出願が優先する。

また、ワールドワイドウェブ上でＴｈｅＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＧｅｎｏｍｉｃＲｅｓｅａｒｃｈ（ＴＩＧＲ）により運営されているもの、および／またはワールドワイドウェブ上でＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）により運営されているものといった、公開データベースにおけるエントリーに相関する受託番号を参照する、あらゆるポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列も、その全体において参照により組み込まれる。

均等物
当業者であれば、日常的な実験を使用するだけで、本明細書に記述される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識するか、または確かめることができるであろう。かかる均等物は、続く特許請求の範囲に包含されるよう意図される。
表１
要旨および凡例
表１Ａは、８日目または２７日目における急性状態と慢性状態との間で差次的な領域を示す。
表１Ｂは、２７日目における急性状態と慢性状態との間で差次的な領域を示す。
表１Ｃは、８日目＆２７日目における急性状態と慢性状態との間で差次的な領域を示す。
表１Ｄは、２７日目に現れ、そして活性である領域を示す。
表１Ｅは、８日目および２７日目に現れ、そして活性である領域を示す。
表１Ｆは、８日目および２７日目における急性状態と慢性状態との間でのみ差次的な領域を示す。
表１Ｇは、２７日目における急性状態と慢性状態との間でのみ差次的な領域を示す。
表１Ｈは、バルクナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞およびエフェクターメモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞において、ならびにＣＭＶ、インフルエンザ、ＨＩＶ、またはＨＣＶに応答する抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞において特定された、ヒトのクロマチン接近可能領域の全てを示す。
表１Ｉは、表１Ｈのヒトのクロマチン接近可能領域のうち、マウスのナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞、メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞、および疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞に由来するマウスのオルソロガスな領域に関連しうるもののみを示す。
表１Ｊは、表１Ｉのヒトのクロマチン接近可能領域のうち、マウスの疲弊ＣＤ８^＋Ｔ細胞に対して特異的なマウスのオルソロガスな領域に関連するもののみを示す。
表１Ｋは、分析した高分解能のＰｄｃｄ１エンハンサー配列全てのｓｇＲＮＡ配列およびゲノム位置のアノテーションを示す。

表１Ａ〜１Ｋにおいて略語で標識された縦列は以下に対応する。

表１Ａ〜１Ｋに示される以下の遺伝子発現用語は以下に対応する。

加えて、表１Ａ〜１Ｋに示される領域は、ＮＣＢＩＭｏｕｓｅＡｓｓｅｍｂｌｙＭＧＳＣｖ３７（２０１０年９月２３日）（ＧｅｎＢａｎｋアセンブリ受託番号ＧＣＡ＿０００００００５５．１６およびＲｅｆＳｅｑアセンブリ受託番号ＧＣＦ＿０００００１６３５．１８にてアクセス可能）に対応付けられ、「ｂｕｉｌｄｍｍ９」またはＧｅｎｏｍｅＲｅｆｅｒｅｎｃｅＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍＨｕｍａｎＡｓｓｅｍｂｌｙＧＲＣｈ３７（２００９年３月３日）（ＧｅｎＢａｎｋアセンブリ受託番号ＧＣＡ＿０００００１４０５．１およびＲｅｆＳｅｑアセンブリ受託番号ＧＣＦ＿０００００１４０５．１３にてアクセス可能）として公知であり、また「ｂｕｉｌｄｈｇ１９」として公知である。

＊表１には、列記された領域を含むゲノム核酸配列、またはヒトを含むマウス以外の哺乳動物のゲノム内にあるそのオルソログも含まれる。加えて、５’末端、３’末端、または５’末端および３’末端の両方に、約１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ、４ｂｐ、５ｂｐ、１０ｂｐ、１５ｂｐ、２０ｂｐ、２５ｂｐ、３０ｂｐ、３５ｂｐ、４０ｂｐ、４５ｂｐ、５０ｂｐ、５５ｂｐ、６０ｂｐ、６５ｂｐ、７０ｂｐ、７５ｂｐ、８０ｂｐ、８５ｂｐ、９０ｂｐ、９５ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１１００ｂｐ、１２００ｂｐ、１３００ｂｐ、１４００ｂｐ、１５００ｂｐ、１６００ｂｐ、１７００ｂｐ、１８００ｂｐ、１９００ｂｐ、２０００ｂｐ、２１００ｂｐ、２２００ｂｐ、２３００ｂｐ、２４００ｂｐ、２５００ｂｐ、２６００ｂｐ、２７００ｂｐ、２８００ｂｐ、２９００ｂｐ、もしくは３０００ｂｐ、または境界値を含むその間の任意の範囲（例えば、１ｂｐ〜２２２ｂｐ）をさらに含む、列記された領域、またはそれらのオルソログも含まれる。加えて、任意の部分またはその断片が想定される。さらに、全長にわたってかかる領域と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれよりも多くの同一性を有する核酸配列を含むあらゆるゲノム核酸配列、またはその部分／断片が想定される。記述される核酸分子は、列記された領域の核酸の機能を有しうる。

Claims

ゲノム領域を含む哺乳動物の操作T細胞であって、前記ゲノム領域が、１）少なくとも１つの遺伝子の遺伝子発現を調節し、２）前記哺乳動物由来の疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞のゲノム内で選択的にクロマチン接近可能であり、前記ゲノム領域が遺伝子修飾されており、前記遺伝子修飾が前記少なくとも１つの遺伝子の発現を調整する、操作T細胞。
ゲノム遺伝子の発現調節領域の活性が上方制御される、請求項１に記載の操作T細胞。
操作された前記ゲノム遺伝子の発現調節領域が、前記哺乳動物Ｔ細胞における前記少なくとも１つの遺伝子の発現を、操作された前記ゲノム遺伝子の発現調節領域を含まない前記哺乳動物由来の同じＴ細胞型における前記少なくとも１つの遺伝子の発現と比較して少なくとも５％上方制御する、請求項２に記載の操作T細胞。
前記ゲノム遺伝子の発現調節領域の活性が下方制御される、請求項１に記載の操作T細胞。
操作された前記ゲノム遺伝子の発現調節領域が、前記哺乳動物Ｔ細胞における前記少なくとも１つの遺伝子の発現を、操作された前記ゲノム遺伝子の発現調節領域を含まない前記哺乳動物由来の同じＴ細胞型における前記少なくとも１つの遺伝子の発現と比較して少なくとも５％下方制御する、請求項４に記載の操作T細胞。
前記少なくとも１つの遺伝子の発現が、前記少なくとも１つの遺伝子の転写または翻訳である、請求項１から５のいずれか一項に記載の操作T細胞。
前記ゲノム遺伝子の発現調節領域またはその一部分が欠失している、請求項１から６のいずれか一項に記載の操作T細胞。
前記ゲノム遺伝子の発現調節領域またはその前記一部分がゲノム編集により欠失しており、任意選択で、前記ゲノム編集が構成的または誘導的に発現される、請求項７に記載の操作T細胞。
前記ゲノム編集が、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ＲＮＡガイド操作ヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、ホーミングメガヌクレアーゼ、および相同組換えからなる群から選択される、請求項８に記載の操作T細胞。
前記ゲノム遺伝子の発現調節領域が、表１Ａ〜１Ｋに示される調節領域からなる群から選択される、請求項１に記載の操作T細胞。
前記哺乳動物が免疫障害の動物モデルであり、任意選択で、前記免疫障害が慢性免疫障害である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の操作T細胞。
前記動物モデルがマウスモデルである、請求項１１に記載の操作T細胞。
前記哺乳動物がマウスまたはヒトである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の操作T細胞。
前記哺乳動物がヒトである、請求項１３に記載の操作T細胞。
前記ヒトが免疫障害に罹患しており、任意選択で、前記免疫障害が慢性免疫障害である、請求項１４に記載の操作T細胞。
前記慢性免疫障害が慢性感染またはがんである、請求項１１または１５に記載の操作T細胞。
前記感染が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、単純ヘルペスウイルス１、単純ヘルペスウイルス２、ヒトヘルペスウイルス６、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオーマウイルスＢＫ、ポリオーマウイルスＪＣ、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、ＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａおよびＥｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎからなる群から選択される作用因子によって生じる、請求項１６に記載の操作T細胞。
前記慢性感染が潜伏感染ではない、請求項１６または１７に記載の操作T細胞。
前記がんが血液がんまたは固形がんである、請求項１８に記載の操作T細胞。
前記固形がんが、肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、皮膚がん、黒色腫、子宮頸がん、子宮がん、卵巣がん、乳がん、膵がん、胃がん、食道がん、結腸直腸がん、肝がん、前立腺がん、腎がん、膀胱がん、頭頸部がん、肉腫、リンパ腫、および脳がんからなる群から選択される、請求項１９に記載の操作T細胞。
前記疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞が、チェックポイント阻害剤、ＰＤ−１（Ｐｄｃｄ１）、ＴＩＭ−３（Ｈａｖｃｒ２）、ＬＡＧ−３（Ｌａｇ３）、ＣＴＬＡ−４（Ｃｔｌａ４）、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＣＤ３９（Ｅｎｔｐｄ１）、ＣＤ１６０、エオメソデルミン（Ｅｏｍｅｓ）、Ｔ−ＢＥＴ（Ｔｂｘ２１）、ＢＡＴＦ、ＢＬＩＭＰ−１（Ｐｒｄｍ１）、ＮＦＡＴＣ１、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ−２（Ｐｏｕ２ｆ２）、Ｆｏｘｐ１、レチノイン酸受容体アルファ（Ｒａｒａ）、およびそれらの組合せからなる群から選択されるＴ細胞疲弊バイオマーカーを発現する、請求項１から２０のいずれか一項に記載の操作T細胞。
前記Ｔ細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項１から２１のいずれか一項に記載の操作T細胞。
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞が、非疲弊T細胞または疲弊T細胞である、請求項２２に記載の操作T細胞。
非疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ナイーブ細胞、機能的エフェクター細胞、またはメモリー細胞である、請求項２３に記載の操作T細胞。
疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞が、チェックポイント阻害剤、ＰＤ−１（Ｐｄｃｄ１）、ＴＩＭ−３（Ｈａｖｃｒ２）、ＬＡＧ−３（Ｌａｇ３）、ＣＴＬＡ−４（Ｃｔｌａ４）、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＣＤ３９（Ｅｎｔｐｄ１）、ＣＤ１６０、エオメソデルミン（Ｅｏｍｅｓ）、Ｔ−ＢＥＴ（Ｔｂｘ２１）、ＢＡＴＦ、ＢＬＩＭＰ−１（Ｐｒｄｍ１）、ＮＦＡＴＣ１、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ−２（Ｐｏｕ２ｆ２）、Ｆｏｘｐ１、レチノイン酸受容体アルファ（Ｒａｒａ）、およびそれらの組合せからなる群から選択されるＴ細胞疲弊バイオマーカーを発現する、請求項２３に記載の操作T細胞。
前記Ｔ細胞が、前記哺乳動物から単離され、操作され、前記哺乳動物にｅｘｖｉｖｏで戻された初代Ｔ細胞である、請求項１から２５のいずれか一項に記載の操作T細胞。
前記Ｔ細胞が、前記哺乳動物内にｉｎｖｉｖｏで存在するか、またはｉｎｖｉｔｒｏで培養される、請求項１から２５のいずれか一項に記載の操作T細胞。
哺乳動物Ｔ細胞を操作して前記哺乳動物Ｔ細胞における少なくとも１つの遺伝子の発現を調整する方法であって、前記遺伝子の遺伝子発現調節領域を遺伝子修飾することを含み、前記遺伝子発現調節領域が前記哺乳動物由来の疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞内で選択的にクロマチン接近可能であり、前記遺伝子修飾が前記少なくとも１つの遺伝子の発現を調整する、方法。
ゲノム遺伝子の発現調節領域が上方制御される、請求項２７に記載の方法。
操作された前記ゲノム遺伝子の発現調節領域が、前記哺乳動物Ｔ細胞における前記少なくとも１つの遺伝子の発現を、操作された前記ゲノム遺伝子の発現調節領域を含まない前記哺乳動物由来の同じＴ細胞型における前記少なくとも１つの遺伝子の発現と比較して少なくとも５％上方制御する、請求項２９に記載の方法。
ゲノム遺伝子の発現調節領域が下方制御される、請求項２８に記載の方法。
操作された前記ゲノム遺伝子の発現調節領域が、前記哺乳動物Ｔ細胞における前記少なくとも１つの遺伝子の発現を、操作された前記ゲノム遺伝子の発現調節領域を含まない前記哺乳動物由来の同じＴ細胞型における前記少なくとも１つの遺伝子の発現と比較して少なくとも５％下方制御する、請求項３１に記載の方法。
前記少なくとも１つの遺伝子の発現が、前記少なくとも１つの遺伝子の転写または翻訳である、請求項２８から３２のいずれか一項に記載の方法。
前記ゲノム遺伝子の発現調節領域またはその一部分が欠失している、請求項２８から３３のいずれか一項に記載の方法。
前記ゲノム遺伝子の発現調節領域またはその前記一部分がゲノム編集により欠失しており、任意選択で、前記ゲノム編集が構成的または誘導的に発現される、請求項３４に記載の方法。
前記ゲノム編集が、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ＲＮＡガイド操作ヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、ホーミングメガヌクレアーゼ、および相同組換えからなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
前記ゲノム遺伝子の発現調節領域が、表１Ａ〜１Ｋに示される調節領域からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
前記哺乳動物が免疫障害の動物モデルであり、任意選択で、前記免疫障害が慢性免疫障害である、請求項２８から３７のいずれか一項に記載の方法。
前記動物モデルがマウスモデルである、請求項３８に記載の方法。
前記哺乳動物がマウスまたはヒトである、請求項２８から３７のいずれか一項に記載の方法。
前記哺乳動物がヒトである、請求項４０に記載の方法。
前記ヒトが免疫障害に罹患しており、任意選択で、前記免疫障害が慢性免疫障害である、請求項４１に記載の方法。
前記慢性免疫障害が慢性感染またはがんである、請求項３８または４２に記載の方法。
前記感染が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、単純ヘルペスウイルス１、単純ヘルペスウイルス２、ヒトヘルペスウイルス６、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオーマウイルスＢＫ、ポリオーマウイルスＪＣ、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、ＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａおよびＥｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎからなる群から選択される作用因子によって生じる、請求項４３に記載の方法。
前記慢性感染が潜伏感染ではない、請求項４３または４４に記載の方法。
前記がんが血液がんまたは固形がんである、請求項４５に記載の方法。
前記固形がんが、肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、皮膚がん、黒色腫、子宮頸がん、子宮がん、卵巣がん、乳がん、膵がん、胃がん、食道がん、結腸直腸がん、肝がん、前立腺がん、腎がん、膀胱がん、頭頸部がん、肉腫、リンパ腫、および脳がんからなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
前記疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞が、チェックポイント阻害剤、ＰＤ−１（Ｐｄｃｄ１）、ＴＩＭ−３（Ｈａｖｃｒ２）、ＬＡＧ−３（Ｌａｇ３）、ＣＴＬＡ−４（Ｃｔｌａ４）、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＣＤ３９（Ｅｎｔｐｄ１）、ＣＤ１６０、エオメソデルミン（Ｅｏｍｅｓ）、Ｔ−ＢＥＴ（Ｔｂｘ２１）、ＢＡＴＦ、ＢＬＩＭＰ−１（Ｐｒｄｍ１）、ＮＦＡＴＣ１、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ−２（Ｐｏｕ２ｆ２）、Ｆｏｘｐ１、レチノイン酸受容体アルファ（Ｒａｒａ）、およびそれらの組合せからなる群から選択されるＴ細胞疲弊バイオマーカーを発現する、請求項２８から４７のいずれか一項に記載の方法。
前記Ｔ細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項２８から４８のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞が、非疲弊T細胞または疲弊T細胞である、請求項４９に記載の方法。
非疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ナイーブ細胞、機能的エフェクター細胞、またはメモリー細胞である、請求項５０に記載の方法。
疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞が、チェックポイント阻害剤、ＰＤ−１（Ｐｄｃｄ１）、ＴＩＭ−３（Ｈａｖｃｒ２）、ＬＡＧ−３（Ｌａｇ３）、ＣＴＬＡ−４（Ｃｔｌａ４）、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＣＤ３９（Ｅｎｔｐｄ１）、ＣＤ１６０、エオメソデルミン（Ｅｏｍｅｓ）、Ｔ−ＢＥＴ（Ｔｂｘ２１）、ＢＡＴＦ、ＢＬＩＭＰ−１（Ｐｒｄｍ１）、ＮＦＡＴＣ１、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ−２（Ｐｏｕ２ｆ２）、Ｆｏｘｐ１、レチノイン酸受容体アルファ（Ｒａｒａ）、およびそれらの組合せからなる群から選択されるＴ細胞疲弊バイオマーカーを発現する、請求項５０に記載の方法。
前記Ｔ細胞が、前記哺乳動物から単離された初代Ｔ細胞である、請求項２８から５２のいずれか一項に記載の操作T細胞。
前記Ｔ細胞が、前記哺乳動物内にｉｎｖｉｖｏで存在するか、またはｉｎｖｉｔｒｏで培養される、請求項２８から５２のいずれか一項に記載の操作T細胞。
前記少なくとも１つの遺伝子が、少なくとも２つの遺伝子である、請求項２８から５４のいずれか一項に記載の操作T細胞。
非疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞の疲弊を防止する方法であって、請求項２８から５５のいずれか一項に記載の方法に従って前記非疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞を操作することを含む、方法。
前記非疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ナイーブ細胞、機能的エフェクター細胞、またはメモリー細胞である、請求項５６に記載の方法。
操作された前記非疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞を対象に投与することをさらに含む、請求項５６または５７に記載の方法。
疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞においてＣＤ８＋Ｔ細胞疲弊を逆転させる方法であって、請求項２８から５５のいずれか一項に記載の方法に従って前記疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞を操作することを含む、方法。
前記疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞が、チェックポイント阻害剤、ＰＤ−１（Ｐｄｃｄ１）、ＴＩＭ−３（Ｈａｖｃｒ２）、ＬＡＧ−３（Ｌａｇ３）、ＣＴＬＡ−４（Ｃｔｌａ４）、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＣＤ３９（Ｅｎｔｐｄ１）、ＣＤ１６０、エオメソデルミン（Ｅｏｍｅｓ）、Ｔ−ＢＥＴ（Ｔｂｘ２１）、ＢＡＴＦ、ＢＬＩＭＰ−１（Ｐｒｄｍ１）、ＮＦＡＴＣ１、ＮＲ４Ａ２、ＭＡＦＢ、ＯＣＴ−２（Ｐｏｕ２ｆ２）、Ｆｏｘｐ１、レチノイン酸受容体アルファ（Ｒａｒａ）、およびそれらの組合せからなる群から選択されるＴ細胞疲弊バイオマーカーを発現する、請求項５８に記載の方法。
操作された前記疲弊ＣＤ８＋Ｔ細胞を対象に投与することをさらに含む、請求項５９または６０に記載の方法。
対象の免疫障害を処置する方法であって、請求項１から２７のいずれか一項に記載の操作T細胞を前記対象に投与することを含む、方法。
前記操作T細胞が、局部投与または全身投与される、請求項６２に記載の方法。
前記全身投与が、静脈内、筋肉内、腹腔内、または関節内である、請求項６２または６３に記載の方法。
前記対象に投与される前記操作T細胞が、前記対象に対して自己、同系、同種、または異種である、請求項６２から６４のいずれか一項に記載の方法。
前記対象に投与される前記操作T細胞が、薬学的に許容される製剤において投与される、請求項６２から６５のいずれか一項に記載の方法。
前記操作T細胞が、前記対象への投与後に、前記少なくとも１つの遺伝子の前記少なくとも５％調整された発現を維持する、請求項６２から６６のいずれか一項に記載の方法。
１つまたは複数の抗免疫障害剤を含む治療有効量の医薬組成物を前記対象に投与することをさらに含む、請求項６２から６７のいずれか一項に記載の方法。
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞をＣＤ８＋Ｔ細胞疲弊を防止または逆転させる１つまたは複数の薬剤と接触させることをさらに含む、請求項６２から６８のいずれか一項に記載の方法。
前記１つまたは複数の薬剤が、免疫チェックポイント阻害剤である、請求項６９に記載の方法。
前記免疫チェックポイントが、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−１、ＣＴＬＡ−４、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、２Ｂ４、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ−Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−４、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰアルファ（ＣＤ４７）、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ−２、ＩＬＴ−４、ＴＩＧＩＴ、およびＡ２ａＲからなる群から選択される、請求項６９または７０に記載の方法。
前記哺乳動物が免疫障害の動物モデルであり、任意選択で、前記免疫障害が慢性免疫障害である、請求項６２から７１のいずれか一項に記載の方法。
前記動物モデルがマウスモデルである、請求項７２に記載の方法。
前記哺乳動物がマウスまたはヒトである、請求項６２から７１のいずれか一項に記載の方法。
前記哺乳動物がヒトである、請求項７４に記載の方法。
前記ヒトが免疫障害に罹患しており、任意選択で、前記免疫障害が慢性免疫障害である、請求項７５に記載の方法。
前記慢性免疫障害が慢性感染またはがんである、請求項７２または７５に記載の方法。
前記感染が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、単純ヘルペスウイルス１、単純ヘルペスウイルス２、ヒトヘルペスウイルス６、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、パピローマウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオーマウイルスＢＫ、ポリオーマウイルスＪＣ、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ、ＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａおよびＥｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎからなる群から選択される作用因子によって生じる、請求項７７に記載の方法。
前記慢性感染が潜伏感染ではない、請求項７７または７８に記載の方法。
前記がんが血液がんまたは固形がんである、請求項７９に記載の方法。
前記固形がんが、肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、皮膚がん、黒色腫、子宮頸がん、子宮がん、卵巣がん、乳がん、膵がん、胃がん、食道がん、結腸直腸がん、肝がん、前立腺がん、腎がん、膀胱がん、頭頸部がん、肉腫、リンパ腫、および脳がんからなる群から選択される、請求項８０に記載の方法。