JP4411931B2

JP4411931B2 - 物質間の相互作用検出方法

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Application number: JP2003363506A
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Inventors: 雄司瀬川; 啓由尾
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Publication date: 2010-02-10
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Description

本発明は、電界印加の手段や方法を用いる物質間の相互作用検出に係わる技術に関する。より詳しくは、高周波電界と低周波電界の物質へ及ぼす作用を有効に用いる物質間の相互作用検出方法に関する。

本発明に関する主たる背景技術を説明する。まず、第一の従来技術は、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、「ＤＮＡチップ」と総称。）と呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板に関する技術である。この技術は、現在、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されており、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、法医学その他の分野において広範囲に活用され始めている。

このＤＮＡチップは、ガラス基板やシリコン基板上に多種・多数のＤＮＡオリゴ鎖やｃＤＮＡ（complementary DNA）等が集積されていることから、ハイブリダイゼーション等の分子間相互反応の網羅的解析が可能となる点が特徴とされている。ＤＮＡチップによる解析手法の一例を簡潔に説明すれば、ガラス基板やシリコン基板上に固相化されたＤＮＡプローブに対して、細胞、組織等から抽出したｍＲＮＡを逆転写ＰＣＲ反応等によって蛍光プローブｄＮＴＰを組み込みながらＰＣＲ増幅し、前記基板上においてハイブリダイゼーションを行い、所定の検出器で蛍光測定を行うという手法である。

ここで、ＤＮＡチップは二つのタイプに分類できる。第１のタイプは、半導体露光技術を応用したフォトリソグラフィーの技術を用いて、所定の基板上に直接オリゴヌクレオチドを合成していくものであり、アフィメトリクス社（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）によるものが代表的である（例えば、特許文献１参照）。この種のチップは、集積度は高いが、基板上でのＤＮＡ合成には限界があって、数十塩基程度の長さである。

第２のタイプは、「スタンフォード方式」とも称されるもので、先割れピンを用いて、予め用意されたＤＮＡを基板上に分注・固相化していくことによって作製されるものである（例えば、特許文献２参照）。この種のチップは、集積度は前者に比べて低いが、１ｋｂ程度のＤＮＡ断片を固相化できるという利点がある。

第二の背景技術は、液相中において荷電して存在する物質に対する電界の作用に係わる技術である。具体的には、ヌクレオチド鎖（核酸分子）は、液相中において電界の作用を受けると伸長又は移動することが知られており、その原理は、ヌクレオチド鎖の骨格をなすリン酸イオン（陰電荷）とその周辺にある水がイオン化した水素原子（陽電荷）とによってイオン曇を作っていると考えられ、これらの陰電荷及び陽電荷により生じる分極ベクトル（双極子）が、高周波高電圧の印加により全体として一方向を向き、その結果としてヌクレオチド鎖が伸長し、加えて、電気力線が一部に集中する不均一電界が印加された場合、ヌクレオチド鎖は電気力線が集中する部位に向かって移動する（非特許文献１参照）。また、数十から数百μｍのギャップを持つ微細電極中にＤＮＡ溶液をおき、ここに１ＭＶ／ｍ、１ＭＨｚ程度の高周波電界を印加すると、ランダムコイル状で存在するＤＮＡに誘電分極が生じ、その結果、ＤＮＡ分子は電界と平行に直線状に引き伸ばされる。そして、この誘電泳動と呼ばれる電気力学的効果によって、分極したＤＮＡは自発的に電極端へと引き寄せられ、電極エッジにその一端を接した形で固定されることが知られている（非特許文献２参照）。
特表平４−５０５７６３号公報。特表平１０−５０３８４１号公報。 Seiichi Suzuki，Takeshi Yamanashi,Shin-ichi Tazawa,Osamu Kurosawa and Masao Washizu:"Quantitative analysis on electrostatic orientation of DNA in stationary AC electric field using fluorescence anisotropy",IEEE Transaction on Industrial Applications,Vol.34,No.1,P75-83(1998)。鷲津正夫、「見ながら行うＤＮＡハンドリング」、可視化情報Ｖｏｌ．２０Ｎｏ．７６（２０００年１月）。

上記したＤＮＡチップ技術は、一般に、液相中での物質間の相互作用の場を提供する反応領域を基板に予め設定しておき、この反応領域中にＤＮＡプローブ等の検出用核酸を固定（固相化）しておくことによって、この検出用核酸と相補的な標的核酸との間の相互作用であるハイブリダイゼーションを解析する技術である。

しかしながら、このような従来のＤＮＡチップ技術では、所定の表面処理が施された検出表面部位（スポット部位）に固定されたＤＮＡプローブ等の検出用核酸は、ランダムコイル状に絡まったり、丸まったりしているので、このような塩基が露出しない高次構造が原因してハイブリダイゼーションの際の立体障害が発生し、ハイブリダイゼーションが効率良く進行しないという問題があった。

また、検出表面部位に対する前記検出用核酸の集積密度の偏りや相補的でないヌクレオチド鎖の存在等が原因となって、偽陽性あるいは偽陰性を示し易いという問題があった。

このような問題などから、従来のＤＮＡチップは、ハイブリダイゼーションに長時間を要するので作業効率が悪く、また、検出精度も低いという技術的課題があった。

そこで、本発明は、作業効率が良く、かつ検出精度の高いバイオアッセイ装置並びにバイオアッセイ方法を提供することを主な目的とする。

まず、本発明では、物質間の相互作用の場となる反応領域と、少なくとも一対の対向電極と、該対向電極に対する電界印加を制御する電界制御手段と、を備え、前記電界制御手段の制御によって、前記反応領域中の反応相に対して「高周波電界」を形成する第一の手段と、前記反応領域に対して「低周波電界」を形成する第二の手段と、を少なくとも備える物質間の相互作用検出部を提供する。さらに、これらの手段に加えて、「直流電界」を形成する第三の手段を備える同検出部を提供する。即ち、本発明に係る検出部は、前記第一、第二の手段を組み合わせたり、あるいは、第一、第二、第三の手段を適宜組み合わせたりすることを特徴とする。

第二に、本発明では、（１）物質間の相互作用の場を提供する反応領域に高周波電界を形成して前記反応領域中に固定化された検出用物質を伸長させる第１手順、（２）前記第１手順終了後に、前記反応領域に対して低周波電界を形成し、前記検出用物質に誤相互作用した物質を検出用物質から解離させる第２手順、を少なくとも行う物質間の相互作用検出方法やこれらの手順を繰り返して行う同検出方法、さらには、前記第１手順と前記第２手順の間に電界を形成しない時間（印加電圧ゼロの時間）を設けて前記相互作用を進行させる同検出方法やいずれかの段階において直流電界を形成する手順を組み合わせる同検出方法を提供する。なお、電界を形成しない時間は、物質の自然なブラウン運動に委ねたハイブリダイゼーション等の相互作用を進行させることができる。

第三に、本発明では、（１）物質間の相互作用の場を提供する反応領域に高周波電界を形成して前記反応領域中に固定化された検出用物質を伸長させる第１手順、（２）前記第１手順終了後に、前記反応領域に対して低周波電界を形成し、前記反応領域中に存在している相互作用検出の障害となる物質をその付着表面（例えば、反応領域中の電極表面や反応領域を構成する底面や壁面など）から脱離させる第２手順、を少なくとも行う物質間の相互作用検出方法やこれらの手順を繰り返して行う同検出方法、さらには、前記第１手順と前記第２手順の間に電界を形成しない時間（印加電圧ゼロの時間）を設けて前記相互作用を進行させる同検出方法やいずれかの段階において直流電界を形成する手順を組み合わせる同検出方法を提供する。なお、本方法においても、電界を形成しない時間は、物質の自然なブラウン運動に委ねたハイブリダイゼーション等の相互作用を進行させることができる。

上記したいずれの方法でも、相互作用の検出には、蛍光物質、放射性物質、インターカレーターのいずれかを用いることができる。

第四に、本発明では、物質間の相互作用の場となる反応領域中の反応相に対して、高周波電界と低周波電界を印加可能な形態を少なくとも備えるバイオアッセイ用基板を提供する。このバイオアッセイ用基板にはＤＮＡチップを少なくとも含む。

ここで、本発明で用いる「高周波電界」は、反応領域中の溶液相やゲル相などの反応相に遊離等して存在する核酸等を電界に沿って、平行に整列させ、その高次構造をランダムコイル形状から伸長状態に変化させるという作用を発揮する。

加えて、電気力線が一部に集中する部位（例えば、電極エッジ部位）に不均一電界を形成し、誘電泳動と呼ばれる電気力学的効果によって、所定の核酸を電気力線が集中する部位に向かって移動（泳動）させるという作用を発揮する。さらには、この高周波電界の前記移動作用を用いることによって、所定の表面処理が施された電極表面に対して、ＤＮＡプローブ等の検出用物質を密度均一に、整列状態で固定化することも可能となる。

次に、本発明で用いる「低周波電界」は、反応領域中に存在する物質に振動（バイブレーション）を与える作用を発揮する。この作用を有効に利用して、正規のハイブリダイゼーション（相補結合）を示した二本鎖核酸の結合力よりも、ミスハイブリダイゼーション（以下、「ミスハイブリ」と略称。）している二本鎖核酸の結合力の方が弱いという事実に基づいて、例えば、１〜１００ＭＨｚ以下の低周波電界をハイブリダイゼーションの場である反応領域に形成することで、正規の相補結合をなす二本鎖核酸を解離させることなく、ミスハイブリ状態の二本鎖核酸のみを選択的に解離させることができる。なお、この解離させた一本鎖核酸は、前記高周波電界の作用を用いて、電極近傍の所望する領域に回収することも可能である。

また、「低周波電界」の前記作用によれば、検出部位（例えば、電極）の近傍に集積し、検出誤差の原因となる物質（例えば、検出用核酸と相補的でない一本鎖核酸、ハイブリダイゼーション未完了状態の検出用核酸と相補的な一本鎖核酸など）を反応領域へ拡散させることもできる。

本発明で用いる「直流電界」は、反応領域中に存在する物質を、電気泳動の作用によって電極側に引き寄せたり、引き離したりする作用、即ち電界に沿って物質を移動させる作用を発揮する。この直流電界の印加は、高周波電界印加の前後又は同時に行うことが可能であり、また、低周波電界印加の前後又は同時に行うことも可能である。

ここで、本発明に関連して使用する主たる技術用語の定義付けを行う。まず、本発明において用いられる「相互作用」は、物質間の非共有結合、共有結合、水素結合を含む化学的結合あるいは解離を広く意味し、例えば、核酸（ヌクレオチド鎖）間の相補結合であるハイブリダイゼーションを含む。

ここで、本願において「核酸」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖がグリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステルの重合体（ヌクレオチド鎖）を意味し、プローブＤＮＡを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチオドが重合したＤＮＡ（全長あるいはその断片）、逆転写により得られるｃＤＮＡ（ｃプローブＤＮＡ）、ＲＮＡ、ポリアミドヌクレオチド誘導体（ＰＮＡ）等を広く含む。

「ハイブリダイゼーション」は、相補的な塩基配列構造を備えるヌクレオチド鎖間の相補鎖（二本鎖）形成反応を意味する。「ミスハイブリダイゼーション」は、正規ではない前記相補鎖形成反応を意味し、「誤相互作用」の代表例であり、本発明では、しばしば「ミスハイブリ」と略称する。

「検出用物質」とは、反応領域中に予め添加等されて、該反応領域中に遊離して存在する物質、あるいは該反応領域の所定表面部位に固定化されて存在する物質であって、当該物質と特異的な相互作用を示す物質を捕捉するための物質であり、ＤＮＡプローブ等の検出用核酸を含む。

「標的物質」とは、前記検出用物質との間での相互作用の標的とされる物質を意味し、例えば、ＤＮＡプローブと相補的な塩基配列を有する核酸を含む。

「反応領域」は、ハイブリダイゼーションその他の相互作用の反応場を提供できる領域であり、例えば、液相やゲルなどの媒質を貯留又は保持できるウエル形状を有する反応場を挙げることができる。この反応領域で行われる相互作用は、本発明の目的や効果に沿う限りにおいて、狭く限定されない。例えば、一本鎖核酸間の相互反応、即ちハイブリダイゼーションに加え、検出用核酸から所望の二本鎖核酸を形成し、該二本鎖核酸とペプチド（又はタンパク質）の相互反応、酵素応答反応その他の分子間相互反応も行わせることも可能である。例えば、前記二本鎖核酸を用いる場合は、転写因子であるホルモンレセプター等のレセプター分子と応答配列ＤＮＡ部分の結合等を分析することができる。

「蛍光物質」は、所定の励起光により蛍光を発する物質を意味する。「インターカレーター」は、ＤＮＡ二重螺旋構造中では、塩基対の平面が螺旋軸とほぼ垂直に配向し、隣の塩基対はその上下に積み重なっており、この塩基対に挿入できる物質を意味し、蛍光性の物質（例えば、エチジュムブロマイド）や電気化学発光性の物質（例えば、ルテニウム錯体）などを例示できる。「放射性物資」は、放射線核種を持つ物質を意味し、例えば、ラジオアイソトープ（放射線同位体）を含む。

「立体障害（steric hindrance）」は、分子内の反応中心等の近傍に嵩高い置換基の存在や反応分子の姿勢や立体構造（高次構造）によって、反応相手の分子の接近が困難になることによって、所望の反応（例えば、ハイブリダイゼーション）が起こりにくくなる現象を意味する。

「誘電泳動」は、電界が一様でない場において、分子が電界の強い方へ駆動する現象であり、交流電圧をかけた場合も、かけた電圧の極性の反転につれて分極の極性も反転するので、直流の場合と同様に駆動効果が得られる（監修・林輝、「マイクロマシンと材料技術（シーエムシー発行）」、Ｐ３７〜Ｐ４６・第５章・細胞およびＤＮＡのマニピュレーション参照）。

「バイオアッセイ」は、生物化学的、あるいは分子生物的な分析や解析に係わる方法あるいは手順を広く意味する。

本発明によれば、ハイブリダイゼーション等の相互作用の場を提供する反応領域に存在する物質に関して、（１）立体障害の少ない高次構造への調整（伸長作用）、（２）電界に沿った移動、（３）検出用物質に対して誤相互作用（ミスハイブリ）した物質の解離及び除去、（４）検出用物質の所定表面部位への整列固定、（４）検出精度低下の原因物質の相互作用検出箇所から他領域への拡散及び除去、（６）相互作用の進行促進、などの効果を与えることができる。この結果、ＤＮＡチップ等の基板等に設けられた反応領域での相互作用の効率や精度が向上するので、アッセイ時間が短縮化を達成できるとともに、検出精度を向上させることができる。

以下、本発明を実施するための好適な形態について、添付図面を参照しながら説明する。まず、図１は、本発明に係る物質間の相互作用検出部（以下、「検出部」と略称。）として好適な第一実施形態の基本構成を説明する要部立体斜視図、図２は、高周波電界印加状態での前記第一実施形態の機能を説明するための断面図、図３は、低周波電界印加状態での前記第一実施形態の機能を説明するための断面図である。

図１〜図３中に示された符号１は、本発明に係る検出部の好適な第一実施形態を示している。検出部１には、溶液をゲルなどの媒質からなる反応相を貯留又は保持できるウエル形状（凹部形状）の反応領域２が形成されている。この反応領域２は、ハイブリダイゼーション等の物質間の相互作用の場を提供する領域又は空間として機能し（特に、図２、図３参照）、該反応領域２に貯留又は保持された媒質には、後述する対向電極によって、電圧が印加される。

また、検出部１は、前記反応領域２を挟むように対向配置された対向電極Ｅ_１とＥ_２とが設けられている。具体的には、電極Ｅ_１は、アルミニウムや金などの金属、あるいはＩＴＯ（インジウム−スズ−オキサイド）等の透明な導体で形成されており、前記反応領域２の底面２１の中央位置に配置されている。

この電極Ｅ_１の表面は、ＤＮＡプローブ等の検出用物質Ｄが固定化される検出表面として機能させる。具体的には、予めプローブＤＮＡ等の検出用物質Ｄの末端を固定化できる表面処理を施しておくようにする。その固定方法としては、電極Ｅ１の表面とプローブＤＮＡ（検出用物質Ｄの一例）の末端がカップリング反応等の反応によって固定されるようにしても良い。

例えば、ストレプトアビジンによって表面処理された電極表面の場合には、ビオチン化されたプローブＤＮＡ末端の固定に適している。あるいは、チオール（ＳＨ）基によって表面処理された電極表面の場合には、チオール基が末端に修飾されたプローブＤＮＡ等の検出用物質Ｄをジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−結合）により固定することに適している。

なお、図１〜図３中において、符号Ｄは、電極Ｅ１の表面に末端が固定されたＤＮＡプローブに代表される検出用物質を、符号Ｔは、検出用物質Ｄと特異的な相互作用を示す標的物質をそれぞれ模式的に示している。
また、図２、図３中に示す符号Ｄｓは、前記検出用物質Ｄと標的物質Ｔとの間の特異的な相互作用（例えば、ハイブリダイゼーション）によって形成された複合体（例、二本鎖核酸）を示しており、符号Ｍは、検出用物質Ｄとミスハイブリ等の誤相互作用を示した物質を模式的に示している。

続いて、この電極Ｅ_１に対向する一方の電極Ｅ_２は、記電極Ｅ_１と同様の材料で形成することが可能であって、この電極Ｅ_２と電極Ｅ_１の間では、スイッチＳのオン／オフ操作によって、交流電源等の電源Ｖで電圧が印加可能な構成となっている。

この電極Ｅ_２は、電極Ｅ_１との間に形成される電気力線を電極Ｅ_２に集中させて、該電極Ｅ_２表面に不均一電界を形成し易くするために、電極Ｅ_１よりも広い面積に形成している（図１〜図３参照）。

さらに、特に図示しないが、電極Ｅ_２の表面を、例えば、凹凸形状に粗面加工を施したり、島状になるようにパターニング形成したりすることによって、電気力線が、該電極表面の凸部位（山状部位）に集中し易くなるので、不均一電界が形成され易くなる。

なお、電極表面を粗面加工する方法は、例えば、公知のスパッタリング蒸着技術、エピキタシー蒸着技術やエッチング技術を用いて実施することができるが、該方法の特に限定されない。

電極の構造や配置構成に関しても、図１〜図３に限定されるものではなく、例えば、図４に示すような変形形態も採用可能である。具体的には、反応領域２に臨む基板３上などに、該反応領域２を挟むように左右に振り分けられて配置された対向電極Ｅ_３,Ｅ_４を設けておいて、例えば、面積より狭小の電極Ｅ_３のエッジｅ部分に特に電気力線を集中させて、ＤＮＡ等が集まるような構造あるいは配置構成でもよい。

なお、上記した電極Ｅ_１，Ｅ_２（あるいはＥ_３,Ｅ_４）各表面は、図２、図３に具体的に示されているように、ＳｉＯ_２、ＳｉＣ、ＳｉＮ、ＳｉＯＣ、ＳｉＯＦ、ＴｉＯ_２のいずれか一つから選択される材料によって形成した絶縁層６で覆うことが望ましい（後述する他形態の検出部でも同様。以下説明割愛）。反応領域２中に貯留される場合があるイオン溶液による電気化学的な反応を防止するためである。

図１や図２などに示した符号３、４は基板を示している。この基板３は、例えば、光学的に記録情報の読み取りが可能とされた基板であって、石英ガラスやシリコン、ポリカーボネート、ポリスチレンその他の合成樹脂によって形成されている。一方の符号４で示された基板も同様の基材で形成することができる。なお、図１などに示された符号５は、ＳｉＯ_２などや樹脂などの絶縁材で形成されたスペーサ部材である。なお、このスペーサ部材５は、基板３又は４と一体の部材としてもよい。

以下、図２、図３等の図面を用いて、本発明に係る検出部１の機能及び本発明に係る方法を説明する。以下の説明では、便宜上、検出用物質Ｄの代表例としてプローブＤＮＡを、相互作用の代表例としてハイブリダイゼーションを、それぞれ取り上げて説明するが、本発明は、これに限定する趣旨ではない。

まず、プローブＤＮＡが電極Ｅ_１の表面に、既述した方法あるいは構成に基づいて固定された状態で、検出用物質Ｔの代表例であるターゲットＤＮＡを含む溶液を、検出部１の反応領域２に滴下等して投入し、ハイブリダイゼーション反応を進行させる。

そのとき、図示されたスイッチＳをオンにし、電源Ｖによって対向電極Ｅ_１と電極Ｅ_２の間に「高周波電圧」を印加する。なお、好適な電界の条件は、約１×１０^６Ｖ／ｍ、約１００ｋＨｚ〜１００ＭＨｚである（例えば、Masao Washizu and Osamu Kurosawa：”Electrostatic Manipulation of DNA in Microfabricated Structures”，IEEE Transaction on Industrial Application Vol.26,No.26,p.1165-1172(1990)参照）。

図２に示すように、対向電極Ｅ_１とＥ_２との間に高周波電圧が印加されると、検出部１の反応領域２には、電極Ｅ_１表面付近で不均一電界が形成される。これは、本実施形態の場合において不均一電界が形成される主な理由は、電極Ｅ_１が電極Ｅ_２の面積よりも小さいためである。この不均一電界の作用によって、前記反応領域２中にランダムに分散して存在しているターゲットＤＮＡを、前記不均一電界に沿った方向に伸長させ、直鎖状とすることができる。

さらに、生じた前記不均一電界中で、前記ターゲットＤＮＡは、誘電泳動という電気力学的効果により、電界強度の強い電極Ｅ_１の方へ泳動する。その結果、プローブＤＮＡが予め固定された電極Ｅ_１表面上にターゲットＤＮＡが集まり、ハイブリダイゼーション反応が効率よく進行する。

即ち、前記誘電泳動によりターゲットＤＮＡを短時間で電極表面へ移動させ、濃度を高めることにより、プローブＤＮＡとのハイブリダイゼーション時間を短縮することが可能となる。さらに、ＤＮＡの電界による伸長整列効果により、立体障害によるハイブリダイゼーション反応の阻害及びミスハイブリダイゼーションを低減することが可能となる。

しかしながら、プローブＤＮＡと相補的ではないＤＮＡも電極Ｅ_１表面に集まったり、該電極Ｅ_１表面に付着したりするため、それらが正規のハイブリダイゼーション反応を阻害する場合もある。即ち、プローブＤＮＡと相補的ではないＤＮＡの存在は、相互作用検出の障害となる。

このため、プローブＤＮＡを電界による伸長整列効させ、これによって立体障害によるハイブリダイゼーション反応の阻害を防止したり、ミスハイブリダイゼーションを低減したりすることはできても、相互作用検出の障害の原因となるような、これらの問題を完全になくすことは困難である。

そこで、本実施形態においては、高周波電界を印加し、プローブＤＮＡ及びターゲットＤＮＡを整列伸長させ、ハイブリダイゼーション反応を起こさせた後に、「低周波電界」を印加するようにする。

前記低周波電界としては、ＤＮＡが印加された電界に電気泳動として追従できる周波数、例えば、１〜１００Ｈｚ程度を例示できる。ＤＮＡの電気泳動が、印加された低周波に追従することによって、電極Ｅ_１の表面上に集まっていたり、あるいは、該電極Ｅ_１の表面に付着していたり、反応領域２の底面や壁面などに付着していたりする、プローブＤＮＡと相補的ではないＤＮＡやまだハイブリダイゼーションが完了していない相補的なＤＮＡなどの相互作用検出の障害となり得る物質は、反応領域２内に拡散させることができる。

さらに、ミスハイブリしているＤＮＡ（符号Ｍ参照）もプローブＤＮＡから解離され、反応領域２に拡散する。その後、再度、電極Ｅ_１とＥ_２との間に「高周波電界」を印加し、ＤＮＡを電界伸長整列させ、まだハイブリしていない相補的なＤＮＡとプローブＤＮＡとの間では、ハイブリダイゼーションを進行させることができる。

さらにその後、「低周波電界」により、上記した相補的ではないＤＮＡ等の相互作用検出の障害となり得る物質を、反応領域２１内に拡散させる。以上のように、高周波電界と低周波電界の印加を繰り返すことにより、ハイブリダイゼーションの精度を高めていくことができる。

以下、図５〜図１２の波形図に基づいて、本発明に係る方法において好適に採用可能な電界印加例について説明する。なお、電界強度、周波数、印加時間は限定されるものではなく、ＤＮＡ等ヌクレオチドの種類、長さ等により、適正な電界強度、周波数、印加時間を選ぶことが望ましい。波形についても、サイン波に限定するものではなく、例えば、三角波等でもよい。

まず、図５は、符号Ｈで示す高周波電界を形成した直後に、符号Ｌで示す低周波電界を形成した場合の方法例を示している。続く図６は、前記図５における低周波電界Ｌ印加部分を、符号Ｒで示す低周波の直流電界とした方法例を示している。

次に、図７は、高周波電界Ｈを印加した後に電界を０とし（図中のＸ部分参照）、電極周辺に誘電泳動効果で集まったターゲットＤＮＡのブラウン運動による自然なハイブリダイゼーションを起こさせる時間を設けた後に、低周波電界Ｌを印加した方法例である。なお、図６の方法例においても、低周波の直流電界Ｒを印加前に、同様の電界０の時間Ｘを設けてもよい。

図８は、高周波電界Ｈを印加した後に、符号Ｐで示す直流（ＤＣ）電界を印加し、電気泳動によりターゲットＤＮＡを電極に引き寄せる効果を相乗させるようにし、その後に低周波電界Ｌを印加した方法例を示している。図９は、高周波電界Ｈを印加する前に、直流電界Ｐを印加しておいて、予め電気泳動によりターゲットＤＮＡを電極に引き寄せておき、前記高周波電界Ｈを印加したあとに、低周波電界Ｌを印加した方法例を示している。

図１０は、直流成分も同時に印加するようにした高周波電界ｈを印加しておくことで、電気泳動によりターゲットＤＮＡを電極に引き寄せる効果を相乗させるようにし、その後に低周波電界Ｌを印加した方法例を示している。

図１１は、高周波電界Ｈを印加した後に、直流成分も同時に印加された低周波電界ｌを印加するようにして、電気泳動により、余剰な相補的ではないターゲットＤＮＡやミスハイブリを起こしたＤＮＡ、立体障害が原因でハイブリが完全にできなかった相補的なＤＮＡを電極近傍から引き離す効果を相乗させるようにした方法例を示している。

図１２は、直流成分を同時に印加した高周波電界ｈによって、電気泳動によりターゲットＤＮＡを電極に引き寄せる効果を相乗させ、その後に、直流成分を同時に印加した低周波電界ｌを印加しておくことによって、電気泳動により余剰な相補的ではないターゲットＤＮＡやミスハイブリを起こしたＤＮＡ、立体障害が原因でハイブリが完全に出来なかった相補的なＤＮＡを電極近傍から引き離す効果を相乗させた方法例を示している。

なお、図示はしないが、図８〜図１２において、低周波電界Ｌ部分を低周波の直流電界Ｒとしてもよい。さらには、図８〜図１２において、低周波電界Ｌあるいは低周波の直流電界Ｒを印加する前に、電界を０の時間Ｘを設け、電極周辺に誘電泳動効果で集まったターゲットＤＮＡのブラウン運動による自然なハイブリダイゼーションを起こさせる時間を設けてもよい。

図１３は、本発明に係る検出部１ａ又は１ｂが配設されたバイオアッセイ用基板の一例を示す図である。この図１３に示すように、例えば、円盤状をなす基板７に多数の検出部１ａ又は１ｂをグループ分け可能に配設していくことができる。

なお、本発明に係る検出部１ａ又は１ｂの反応領域２中において進行した相互作用の検出は、標的物質等に標識されている蛍光物質(Ｃｙ−３やＣｙ−５など)やラジオアイソトープ（放射線同位体）などの放射性物質、あるいは相互作用を示した生成物である二本鎖核酸（Ｄｓ）に挿入結合する蛍光あるいは電気化学発光のインターカレーターに対して、所定波長の励起光を照射して光学的に検出したり、放射線を検出したり、あるいは電気的に検出したり等する、公知の検出手段によって、実施することができる。

本発明は、例えば、ＤＮＡチップを含むバイオアッセイ用の集積基板の検出技術として利用すれば、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等を作業効率良く、高い検出精度で実施できる。

本発明に係る物質間の相互作用検出部として好適な第一実施形態（１ａ）の基本構成を説明する要部立体斜視図である。高周波電界印加状態での同第一実施形態（１ａ）の機能を説明するための断面図である。低周波電界印加状態での同第一実施形態（１ａ）の機能を説明するための断面図である。本発明に係る物質間の相互作用検出部の変形形態（１ｂ）の基本構成を説明する要部立体斜視図である。本発明に係る方法において好適に採用可能な電界印加例を示す、高周波電界（Ｈ）を印加した直後に、低周波電界（Ｌ）を印加した場合の波形図である。同電界印加例を示す、高周波電界（Ｈ）を印加した直後に、低周波の直流電界（Ｒ（を印加した場合の波形図である。同電界印加例を示す、高周波電界（Ｈ）を印加した直後に、電界０の時間（Ｘ）を形成し、それに続いて低周波電界（Ｌ）を印加した場合の波形図である。同電界印加例を示す、高周波電界（Ｈ）を印加した直後に、直流電界（Ｐ）を印加し、その後に低周波電界（ｌ）を印加した場合の波形図である。同電界印加例を示す、直流電界（Ｐ）を印加した後に高周波電界（Ｈ）を印加し、続いて低周波電界（ｌ）を印加した場合の波形図である。同電界印加例を示す、直流成分も同時に印加するようにした高周波電界（ｈ）を印加した後に高周波電界（Ｈ）を印加し、続いて低周波電界（Ｌ）を印加した場合の波形図である。同電界印加例を示す、高周波電界（Ｈ）を印加した後に、直流成分も同時に印加された低周波電界（ｌ）を印加した場合の波形図である。同電界印加例を示す、直流成分を同時に印加した高周波電界（ｈ）を印加し、その後に直流成分を同時に印加した低周波電界（ｌ）を印加した場合の波形図である。本発明に係る検出部（１ａ又は１ｂ）が配設されたバイオアッセイ用基板（７）の一例を示す図である。

符号の説明

１ａ,１ｂ相互作用検出部（検出部）
２反応領域
７基板
Ｄ検出用物質
Ｔ標的物質
Ｅ_１電極
Ｅ_２電極
Ｈ高周波電界
Ｌ低周波電界

Claims

物質間の相互作用の場を提供する反応領域に、１００ｋＨｚ〜１００ＭＨｚの高周波電界を形成して、前記反応領域中に固定化された検出用物質を伸長させる第１手順と、
前記第１手順終了後に、前記反応領域に対して１〜１００Ｈｚの低周波電界を形成し、前記検出用物質に誤相互作用をした物質を該検出用物質から解離させる第２手順と、
を少なくとも有し、
前記反応領域において核酸のハイブリダイゼーションを行う物質間の相互作用検出方法。
物質間の相互作用の場を提供する反応領域に、１００ｋＨｚ〜１００ＭＨｚの高周波電界を形成して、前記反応領域中に固定化された検出用物質を伸長させる第１手順と、
前記第１手順終了後に、前記反応領域に対して１〜１００Ｈｚの低周波電界を形成し、前記反応領域中に存在している相互作用検出の障害となる物質をその付着表面から脱離させる第２手順と、
を少なくとも有し、
前記反応領域において核酸のハイブリダイゼーションを行う物質間の相互作用検出方法。
前記第１手順と前記第２手順を繰り返して行うことを特徴とする請求項１又は２記載の相互作用検出方法。
前記第１手順と前記第２手順の間に電界を形成しない時間を設けて前記相互作用を進行させることを特徴とする請求項３記載の相互作用検出方法。
いずれかの段階において直流電界を形成する第３手順を組み合わせることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項記載の相互作用検出方法。
相互作用の検出に、蛍光物質、放射性物質、インターカレーターのいずれかを用いる請求項１乃至５のいずれか１項記載の相互作用検出方法。