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JP4480128B2 - マトリックスメタロプロテアーゼ−９の産生を阻害するための薬剤 - Google Patents

マトリックスメタロプロテアーゼ−９の産生を阻害するための薬剤 Download PDF

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Description

本発明は、マトリックスメタロプロテアーゼ−９の産生を阻害するための薬剤に関するものである。
下記式（Ｉ）：
で示されるレプトマイシンＢ（Ｌｅｐｔｏｍｙｃｉｎ Ｂ又はＬＭＢ）は、本来、抗カビ抗生物質として発見されたが、後に、該レプトマイシンＢの誘導体も同様の抗カビ活性があることが判明し、現在では、特に抗癌剤として注目されている。
特開平５−１３１３３号公報には、レプトマイシンＢを有効成分とし、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射などの非経口投与又は経口投与法により投与される抗腫瘍剤が記載されている。該抗腫瘍剤によれば、マウスに移植したＰ３８８細胞、ルイス・ランダ・カルチノーマ細胞、Ｂ１６メラノーマ細胞及びエーリッヒ・カルチノーマ細胞などに強い抗腫瘍作用を示すことができるが、レプトマイシンＢがいかにして腫瘍細胞に作用するのかが不明であるため、抗腫瘍剤以外の用途の開拓は行われていなかった。
マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）は、細胞外マトリックス蛋白を主要な基質とする一群の金属プロテアーゼの総称である。ＭＭＰｓは生体内組織代謝において重要な役割を果たしている。なかでもマトリックスメタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）はゼラチナーゼとしてゼラチン成分を分解するのみではなく、別名ＩＶ型コラゲナーゼとも言われるように、各種コラーゲン、エラスチン、ファイブロネクチンなど細胞外マトリックス成分を分解し、さらには腫瘍成長因子（ＴＧＦ−β）や腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）を活性化する可能性が示されてきた。
最近、人為的にＭＭＰ−９を欠如させたマウスについての検討、及びＭＭＰ−９の発現をモニターしたマウスについての検討から、特に周囲の炎症性細胞から浸潤したＭＭＰ−９が、癌の浸潤と転移を引き起こす要因であり、且つ水疱症に際して水疱形成を引き起こす要因であること、表皮由来のＭＭＰ−９が紫外線照射時のアポトーシスに関わっており、紫外線皮膚炎に関わっていることが明らかになっている。また、ＭＭＰ−９が創傷治癒の遅延をもたらすことも明らかにされている。さらには、ＭＭＰ−９が血管新生をもたらすことも明らかになっている。加えて、上記された水疱症、紫外線皮膚炎、及び創傷治癒の遅延は、皮膚の炎症性疾患であるため、これらの皮膚の炎症性疾患に関わるＭＭＰ−９は、湿疹皮膚炎に関わっていると考えられる。
表皮由来のＭＭＰ−９と表皮の角化との関係については、本発明者により、好中球由来ＭＭＰ−９の分離、精製を行い、ＭＭＰ−９に対する単クローン抗体を作成し、同抗体により皮膚組織におけるＭＭＰ−９の局在化について検討したところ、表皮角化組織にＭＭＰ−９が局在することを確認した。さらに、培養した表皮角化細胞を用いて、角化細胞への分化刺激を行った際に、ＭＭＰ−２と比較して、ＭＭＰ−９の方がより特異的に発現が亢進されることを確認した。この発現の亢進に関わる転写因子結合遺伝子領域として、従来から知られるＴＰＡ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔに加えて角化のマーカーであるｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎと共通な遺伝子プロモーター領域であるＫＲＥ−Ｍ９が、ＭＭＰ−９プロモーター中に存在することを発見したが、該発見は、角化細胞への分化刺激を行った際のＭＭＰ−９の特異的な発現の亢進を支持するものである。元来、角化は、表皮角化細胞のプログラムされた細胞死であり、アポトーシスの１種と考えられ、かかるアポトーシス、特に表皮細胞のアポトーシスに際して、炎症の一症状として、過角化すなわち角化異常症の臨床症状を呈することが多いが、本発明者の研究により角化細胞への分化刺激を行った際にＭＭＰ−９が特異的に発現亢進されることが判明したため、かかる表皮の角化におけるアポトーシスに際しての角化異常症についてもＭＭＰ−９が関与している可能性が示唆された。
このように、ＭＭＰ−９は、皮膚科領域においても、癌の浸潤と転移、水疱症における水疱形成、血管新生、創傷治癒の遅延、湿疹皮膚炎、紫外線皮膚炎、及び角化異常症等の皮膚の炎症性疾患に関わるものである。
よって、ＭＭＰ−９の産生を阻害することにより、癌の浸潤と転移、並びに水疱症、血管新生、創傷治癒の遅延、湿疹皮膚炎、及び紫外線皮膚炎、角化異常症等の種々の皮膚の炎症性疾患の改善が期待される。
特開平５−１３１３３号公報（請求項１、第１〜２頁、表１）
従って、本発明は、ＭＭＰ−９の産生を阻害する新規な薬剤を提供することをその課題とする。
かかる実情において、本発明者は鋭意検討を行なった結果、レプトマイシンＢが、培養表皮角化細胞に由来するＭＭＰ−９の産生を、ＭＭＰ−２と比較して、特異的に阻害できること、さらには、高濃度のカルシウムを添加することによる刺激又はＴＧＦ−βを添加することによる刺激などの分化刺激を行う条件下、及びＴＮＦ−αを添加することによる刺激又はＩＬ−１αを添加することによる刺激などの炎症惹起刺激を行う条件下においてもＭＭＰ−９の産生を阻害できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明（１）は、下記式（１）：


で示されるレプトマイシンＢを有効成分として含有し、マトリックスメタロプロテアーゼ−９関連の皮膚の炎症性疾患（皮膚の腫瘍性疾患を除く。）の予防薬又は治療薬（抗黄色ブドウ球菌剤を除く。）であり、該皮膚の炎症性疾患が、水疱症、血管新生、湿疹皮膚炎、紫外線皮膚炎、又は角化異常症であることを特徴とするマトリックスメタロプロテアーゼ−９の産生を阻害するための薬剤を提供するものである。かかる構成とすることにより、ＭＭＰ−９の産生を、ＭＭＰ−２と比較して、特異的に阻害でき、さらには、高濃度のカルシウムを添加することによる刺激又はＴＧＦ−βを添加することによる刺激などの分化刺激を行う条件下、及びＴＮＦ−αを添加することによる刺激又はＩＬ−１αを添加することによる刺激などの炎症惹起刺激を行う条件下においてもＭＭＰ−９の産生を阻害することができるという効果を奏するものである。
また、本発明（２）は、前記皮膚の炎症性疾患が、水疱症、血管新生、創傷治癒の遅延、湿疹皮膚炎、紫外線皮膚炎、又は角化異常症であることを特徴とする本発明（１）記載の薬剤を提供するものである。
また、本発明（３）は、前記予防薬又は治療薬が、その投与形態が皮膚外用剤である上記発明（２）記載の薬剤を提供するものである。かかる構成とすることにより、上記発明（２）の奏する効果に加えて、ＭＭＰ−９関連皮膚疾患の予防効果又は治療効果を一層向上させることができるという効果を奏する。
本発明のＭＭＰ−９の産生を阻害する薬剤は、ＭＭＰ−９の産生を、ＭＭＰ−２と比較して、特異的に阻害でき、さらには、高濃度のカルシウムを添加することによる刺激又はＴＧＦ−βを添加することによる刺激などの分化刺激を行う条件下、及びＴＮＦ−αを添加することによる刺激又はＩＬ−１αを添加することによる刺激などの炎症惹起刺激を行う条件下においてもＭＭＰ−９の産生を阻害することができる。
本発明のＭＭＰ−９を阻害するための薬剤は、ＬＭＢ又はその誘導体を有効成分として含有する。ＬＭＢは、放線菌に属するストレプトマイセス属に属するＬＭＢ生産菌が生産する抗生物質であり、〔ザ・ジャーナル・オブ・アンティビオテイツクス（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）、１９８３年、第３６巻、６３９〜６５０頁〕に記載される方法に従って、培養したＬＭＢ生産菌から分離精製して得ることができる。
また、ＬＭＢの誘導体については、下記式（２）；
で表されるレプトマイシンＡ、下記式（３）；
で表される物質Ｓ−５９９１７ａ、及び下記式（４）；
で表されるエラクトシンからなる群より選ばれるＬＭＢの誘導体を例示することができる。レプトマイシンＡは、上記したＬＭＢ生産菌が生産する抗生物質であり、〔ザ・ジャーナル・オブ・アンティビオテイツクス（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）、１９８３年、第３６巻、６３９〜６５０頁〕に記載される方法に従って、培養した前記ＬＭＢ生産菌から分離精製して得ることができ、また、物質Ｓ−５９９１７ａは、ストレプトマイセス属に属する物質Ｓ−５９９１７ａ生産菌が生産する抗生物質であり、特開平５−３９２８３号公報に記載されるように、培養したＳ−５９９１７ａ生産菌から分離精製して得ることができる。
本発明のＭＭＰ−９の産生を阻害するための薬剤は、ＭＭＰ−９関連皮膚疾患の予防薬又は治療薬（抗黄色ブドウ球菌剤を除く。）として用いることができるが、ＭＭＰ−９関連皮膚疾患としては、水疱症、血管新生、湿疹皮膚炎、紫外線皮膚炎、又は角化異常症等を挙げることができ、好ましくは、水疱症、血管新生、湿疹皮膚炎、紫外線皮膚炎、又は角化異常症を挙げることができ、特に好ましくは、水疱症、湿疹皮膚炎、紫外線皮膚炎、又は角化異常症を挙げることができる。また、本発明のＭＭＰ−９の産生を阻害するための薬剤は、ＭＭＰ−９の産生を抑制するものであるが、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１αなどのサイトカインにより細胞に炎症反応を惹起させ、ＭＭＰ−９産生を誘導する場合においても、ＭＭＰ−９の産生が阻害されると好ましく、この場合、水疱症、血管新生、湿疹皮膚炎などのＭＭＰ−９関連皮膚疾患の治療薬又は予防薬、あるいは水疱症、湿疹皮膚炎などのＭＭＰ−９関連皮膚疾患の治療薬又は予防薬として有効である。さらには、高濃度のカルシウム、ＴＧＦ−βを添加することにより分化刺激を行うことにより細胞に角化などの分化を誘導し、ＭＭＰ−９産生を誘導する場合においても、ＭＭＰ−９の産生が阻害されると好ましく、この場合、紫外線皮膚炎、角化異常症などのＭＭＰ−９関連皮膚疾患の治療薬又は予防薬として有効である。
本発明の薬剤を医薬品として使用する際には、予防又は治療上有効な量のレプトマイシンＢまたはその誘導体が、製薬学的に許容できる担体又は希釈剤とともに製剤化されるとよい。その他にも、結合剤、吸収促進剤、潤沢剤、乳化剤、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤、着色剤、香料、甘味料などを添加してもよい。医薬製剤の剤形としては、顆粒剤、細粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、軟膏、ゲル、ペースト、クリーム、噴霧剤、溶液剤、懸濁液剤などを挙げることができ、その投与形態としては、経口投与の他、注射、外用などの非経口投与など種々の投与形態を挙げることができる。
本発明の薬剤は、その投与形態が皮膚外用剤である治療薬又は予防薬であると好ましく、皮膚に塗布されて使用される皮膚外用剤であると特に好ましい。本発明の薬剤を皮膚外用剤とするには、ＬＭＢ又はその誘導体に加えて通常薬用外用剤又は化粧料に配合される成分、例えば紫外線吸収剤、油性成分、保湿剤、増粘剤、乳化剤、防腐剤、粉体、乳化安定剤、ｐＨ調整剤、香料、アルコール、水等が配合できる。ここで紫外線吸収剤としては、ジベンゾイルメタン誘導体、ケイ皮酸エステル誘導体、ベンゾフェノン誘導体、ｐ−アミノ安息香酸誘導体等の有機系紫外線吸収剤、及び亜鉛華、雲母、雲母チタン、酸化チタン、酸化マグネシウム、酸化ジルコニウム等の無機系紫外線吸収剤等が挙げられる。
また、油性成分としては、流動パラフィン、ワセリン、パラフィンワックス、スクワラン、ミツロウ、カルナバロウ、オリーブ油、ラノリン、高級アルコール、脂肪酸、高級アルコールと脂肪酸の合成エステル油、シリコーン油、フッ素系油剤等が挙げられる。
また、皮膚外用剤中へのレプトマイシンＢまたはその誘導体の配合量は、特に制限されないが、０．０００１〜５０重量％が好ましく、０．００１〜２０重量％が特に好ましい。本発明の皮膚外用剤は、軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、浴用剤等、皮膚外用剤として用いるものであればいずれでもよく、剤形は特に問わない。
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、これは単に例示であって、本発明を制限するものではない。
ＭＭＰ−９の産生が、ＬＭＢによって阻害されることを検証するために以下の実験を行った。
＜ヒト表皮角化細胞の培養＞
新生児の包皮を、４℃で、カゼイン分解活性が２５．０ ｃａｓｅｉｎｏｌｙｔｉｃ ｕｎｉｔｓ／ｍｌであるディスパーゼで１６時間処理した。鉗子を用いて、真皮から表皮をはぎとった後、表皮を０．０５％トリプシンで５分間処理した。分離させたヒト包皮角化細胞（ＨＦＫｓ）を、ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を有するプレートにて３７℃で温置して、３代にわたって継代培養した。次いで、ヒト包皮角化細胞（ＨＦＫｓ）を３代にわたって継代培養して得られた４つのプレートに、培地に対する濃度がそれぞれ０ｎＭ、０．４ｎＭ、２ｎＭ、１０ｎＭとなるようにＬＭＢを添加し、さらに３７℃で２４時間温置した。その後、該４つのプレートからｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ培地の４種のならし培地を収集して、以下のゼラチンザイモグラフィー法によるＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の検出において用いるまで、−３０℃で貯蔵しておいた。
＜ゼラチンザイモグラフィー法によるＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の検出＞
ゼラチンザイモグラフィー法によるＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の検出を行うのに先立ち、＜ヒト表皮角化細胞の培養＞において収集した４種のならし培地を全て３５℃で１時間温置した。次いで、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを０．０５Ｍ、ＣａＣｌ２を５ｍＭ、ＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ−ｓｕｌｆａｔｅ）を１％、ｇｌｙｃｅｒｏｌを５％それぞれ含有するｐＨ７．４の溶液に前記ならし培地を溶解させて、ゼラチンザイモグラフィー法に用いる試料とした。該試料を、０．５％のゼラチンを含んだポリアクリルアミドゲル７．５％を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によりＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９を分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分離の後、分離ゲルをＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を２．５％含有する溶液で１時間洗浄し、ＳＤＳを除去した。分離ゲルにおいて分離されたＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９に分離ゲル中のゼラチンを分解させるために、反応用緩衝液（標準条件 ０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）／０．１５Ｍ ＮａＣｌ／５ｍＭ ＣａＣｌ２／０．０２％ ＮａＮ３）中において３５℃で所定の時間分離ゲルを温置した。分離ゲルの染色は、Ａｍｉｄｅｂｌａｃｋ Ｂ−１０を０．１％含有する染色液を用いて行い、脱色は、酢酸１０体積％、及びメタノール３０体積％を含有する脱色液を用いて行った。４種のならし培地中のＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の検出結果を図１（Ａ）に示す。
ヒト表皮角化細胞の培養において、ヒト包皮角化細胞（ＨＦＫｓ）を３代にわたって継代培養して得られた４つのプレートに、培地に対する濃度がそれぞれ０ｎＭ、０．４ｎＭ、２ｎＭ、１０ｎＭとなるようにＬＭＢを添加する代わりに、ヒト包皮角化細胞（ＨＦＫｓ）を３代にわたって継代培養して得られた４つのプレートに、培地に対する濃度がそれぞれ０ｎＭ、０．４ｎＭ、２ｎＭ、１０ｎＭとなるようにＬＭＢを添加するとともに、Ｃａ＋の培地に対する濃度が４つ全て１．５ｍＭとなるように塩化カルシウム水溶液を添加した以外は、実施例１と同様の方法でヒト表皮角化細胞の培養、及びゼラチンザイモグラフィー法によるＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の検出を行った。結果を図１（Ｂ）に示す。
ヒト表皮角化細胞の培養において、ヒト包皮角化細胞（ＨＦＫｓ）を３代にわたって継代培養して得られた４つのプレートに、培地に対する濃度がそれぞれ０ｎＭ、０．４ｎＭ、２ｎＭ、１０ｎＭとなるようにＬＭＢを添加する代わりに、ヒト包皮角化細胞（ＨＦＫｓ）を３代にわたって継代培養して得られた４つのプレートに、培地に対する濃度がそれぞれ０ｎＭ、０．４ｎＭ、２ｎＭ、１０ｎＭとなるようにＬＭＢを添加するとともに、ＴＧＦ−βの培地に対する濃度が４つ全て１ｎｇ／ｍｌとなるようにＴＧＦ−βを添加した以外は、実施例１と同様の方法でヒト表皮角化細胞の培養、及びゼラチンザイモグラフィー法によるＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の検出を行った。結果を図１（Ｃ）に示す。
ヒト表皮角化細胞の培養において、ヒト包皮角化細胞（ＨＦＫｓ）を３代にわたって継代培養して得られた４つのプレートに、培地に対する濃度がそれぞれ０ｎＭ、０．４ｎＭ、２ｎＭ、１０ｎＭとなるようにＬＭＢを添加する代わりに、ヒト包皮角化細胞（ＨＦＫｓ）を３代にわたって継代培養して得られた４つのプレートに、培地に対する濃度がそれぞれ０ｎＭ、０．４ｎＭ、２ｎＭ、１０ｎＭとなるようにＬＭＢを添加するとともに、ＴＮＦ−αの培地に対する濃度が４つ全て１０ｎｇ／ｍｌとなるようにＴＮＦ−αを添加した以外は、実施例１と同様の方法でヒト表皮角化細胞の培養、及びゼラチンザイモグラフィー法によるＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の検出を行った。結果を図１（Ｄ）に示す。
ヒト表皮角化細胞の培養において、ヒト包皮角化細胞（ＨＦＫｓ）を３代にわたって継代培養して得られた４つのプレートに、培地に対する濃度がそれぞれ０ｎＭ、０．４ｎＭ、２ｎＭ、１０ｎＭとなるようにＬＭＢを添加する代わりに、ヒト包皮角化細胞（ＨＦＫｓ）を３代にわたって継代培養して得られた４つのプレートに、培地に対する濃度がそれぞれ０ｎＭ、０．４ｎＭ、２ｎＭ、１０ｎＭとなるようにＬＭＢを添加するとともに、ＩＬ−１αの培地に対する濃度が４つ全て１０−１０ＭとなるようにＩＬ−１αを添加した以外は、実施例１と同様の方法でヒト表皮角化細胞の培養、及びゼラチンザイモグラフィー法によるＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の検出を行った。結果を図１（Ｅ）に示す。
図１（Ａ）に示す実施例１の結果から、無刺激下においては、培地に対するＬＭＢの濃度が２ｎＭ以上となると、ＭＭＰ−９の産生が阻害されていることがわかる。また、図１（Ｂ）及び図１（Ｃ）に示す実施例２及び３の結果から、高濃度カルシウム又はＴＧＦ−βによる分化刺激を行いＭＭＰ−９の産生が促進される条件下でも、培地に対するＬＭＢの濃度が２ｎＭ以上となると、ＭＭＰ−９の産生が阻害されていることがわかる。さらに、図１（Ｄ）及び図１（Ｅ）に示す実施例４及び５の結果から、ＴＮＦ−α又はＩＬ−１αによる炎症惹起刺激を行いＭＭＰ−９の産生が促進される条件下でも、培地に対するＬＭＢの濃度が２ｎＭ以上となると、ＭＭＰ−９の産生が阻害されていることがわかる。図１の結果から、ＬＭＢは、ＭＭＰ−２と比較して、ＭＭＰ−９の産生をより特異的に阻害することがわかる。
ＬＭＢの作用により、ＭＭＰ−９のｍＲＮＡの産生が阻害されること、すなわち、ＭＭＰ−９の産生が阻害されることを検証するために以下の実験を行った。
＜ヒト表皮角化細胞の培養＞
新生児の包皮を、４℃で、カゼイン分解活性が２５．０ ｃａｓｅｉｎｏｌｙｔｉｃ ｕｎｉｔｓ／ｍｌであるディスパーゼで１６時間処理した。鉗子を用いて、真皮から表皮をはぎとった後、表皮を０．０５％トリプシンで５分間処理した。分離させたヒト包皮角化細胞（ＨＦＫｓ）を、ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を有するプレートにて３７℃で温置して、３代にわたって継代培養した。次いで、ヒト包皮角化細胞（ＨＦＫｓ）を３代にわたって継代培養して得られた２つのプレートに、培地に対する濃度がそれぞれ０ｎＭ、１０ｎＭとなるようにＬＭＢを添加し、さらに３７℃で２４時間温置した。
＜ＲＴ−ＰＣＲ法によるヒトＭＭＰ−９遺伝子のｍＲＮＡ及びヒトＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡの検出＞
培養したヒト包皮角化細胞（ＨＦＫｓ）からの全ＲＮＡの抽出は、Ｗａｃｈｉらの方法（Ｗａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３６８，２１５−２１９）に従って行い、抽出した全ＲＮＡは、１μｇ／ｍｌの濃度の溶液として−８０℃で貯蔵した。ＲＴ−ＰＣＲ法は、ＴａＫａＲａ ＲＮＡ ＰＣＲ ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて行った。ヒトＭＭＰ−９に対するｃＤＮＡの２７７塩基対を増幅するために、１１６〜１３６塩基対に位置する５’末端に対しては、センスプライマー（配列番号：１）を、３７２〜３９２塩基対に位置する３’末端に対してはアンチセンスプライマー（配列番号：２）を用いた。ヒトＧＡＰＤＨに対するｃＤＮＡの４７８塩基対を増幅するために、５４７〜５６６塩基対に位置する５’末端に対しては、センスプライマー（配列番号：３）を、１００５〜１０２４塩基対に位置する３’末端に対してはアンチセンスプライマー（配列番号：４）を用いた。ＲＮＡの逆転写は、４２℃で１時間温置することにより行った。逆転写して得られたｃＤＮＡのＰＣＲにおける温置は、以下の温度プロファイルに従って行った。すなわち、１サイクルごとに、ｃＤＮＡの変性を９４℃で２分間行い、プライマーのアニ−リングを６０℃で３０秒間行い、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鎖の合成を７２℃で１分間行った。３０サイクル行った後得られた溶液を分取して、臭化エチジウムを含有するアガロースゲルを用いて電気泳動を行い、得られたバンドを紫外線下で観察した。結果を図２に示す。図２中、Ｓａｍｐｌｅ１が、培地に対するＬＭＢ濃度が０ｎＭであった細胞を用いた結果を、Ｓａｍｐｌｅ２が、培地に対するＬＭＢ濃度が１０ｎＭであった細胞を用いた結果を示す。
ヒト表皮角化細胞の培養において、ヒト包皮角化細胞（ＨＦＫｓ）を３代にわたって継代培養して得られた２つのプレートに、培地に対する濃度がそれぞれ０ｎＭ、１０ｎＭとなるようにＬＭＢを添加する代わりに、ヒト包皮角化細胞（ＨＦＫｓ）を３代にわたって継代培養して得られた２つのプレートに、培地に対する濃度がそれぞれ０ｎＭ、１０ｎＭとなるようにＬＭＢを添加するとともに、Ｃａ＋の培地に対する濃度が２つ全て１．５ｍＭとなるように塩化カルシウム水溶液を添加した以外は、実施例６と同様の方法でヒト表皮角化細胞の培養、並びにＲＴ−ＰＣＲ法によるヒトＭＭＰ−９遺伝子のｍＲＮＡ及びヒトＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡの検出を行った。結果を図２に示す。図２中、Ｓａｍｐｌｅ３が、培地に対するＬＭＢ濃度が０ｎＭであった細胞を用いた結果を、Ｓａｍｐｌｅ４が、培地に対するＬＭＢ濃度が１０ｎＭであった細胞を用いた結果を示す。
ヒト表皮角化細胞の培養において、ヒト包皮角化細胞（ＨＦＫｓ）を３代にわたって継代培養して得られた２つのプレートに、培地に対する濃度がそれぞれ０ｎＭ、１０ｎＭとなるようにＬＭＢを添加する代わりに、ヒト包皮角化細胞（ＨＦＫｓ）を３代にわたって継代培養して得られた２つのプレートに、培地に対する濃度がそれぞれ０ｎＭ、１０ｎＭとなるようにＬＭＢを添加するとともに、ＴＧＦ−βが培地に対する濃度が２つ全て１ｎｇ／ｍｌとなるようにＴＧＦ−βを添加した以外は、実施例６と同様の方法でヒト表皮角化細胞の培養、並びにＲＴ−ＰＣＲ法によるヒトＭＭＰ−９遺伝子のｍＲＮＡ及びヒトＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡの検出を行った。結果を図２に示す。図２中、Ｓａｍｐｌｅ５が、培地に対するＬＭＢ濃度が０ｎＭであった細胞を用いた結果を、Ｓａｍｐｌｅ６が、培地に対するＬＭＢ濃度が１０ｎＭであった細胞を用いた結果を示す。
ヒト表皮角化細胞の培養において、ヒト包皮角化細胞（ＨＦＫｓ）を３代にわたって継代培養して得られた２つのプレートに、培地に対する濃度がそれぞれ０ｎＭ、１０ｎＭとなるようにＬＭＢを添加する代わりに、ヒト包皮角化細胞（ＨＦＫｓ）を３代にわたって継代培養して得られた２つのプレートに、培地に対する濃度がそれぞれ０ｎＭ、１０ｎＭとなるようにＬＭＢを添加するとともに、ＴＮＦ−αの培地に対する濃度が２つ全て１０ｎｇ／ｍｌとなるようにＴＮＦ−αを添加した以外は、実施例６と同様の方法でヒト表皮角化細胞の培養、並びにＲＴ−ＰＣＲ法によるヒトＭＭＰ−９遺伝子のｍＲＮＡ及びヒトＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡの検出を行った。結果を図２に示す。図２中、Ｓａｍｐｌｅ７が、培地に対するＬＭＢ濃度が０ｎＭであった細胞を用いた結果を、Ｓａｍｐｌｅ８が、培地に対するＬＭＢ濃度が１０ｎＭであった細胞を用いた結果を示す。
ヒト表皮角化細胞の培養において、ヒト包皮角化細胞（ＨＦＫｓ）を３代にわたって継代培養して得られた２つのプレートに、培地に対する濃度がそれぞれ０ｎＭ、１０ｎＭとなるようにＬＭＢを添加する代わりに、ヒト包皮角化細胞（ＨＦＫｓ）を３代にわたって継代培養して得られた２つのプレートに、培地に対する濃度がそれぞれ０ｎＭ、１０ｎＭとなるようにＬＭＢを添加するとともに、ＩＬ−１αの培地に対する濃度が２つ全て１０−１０ＭとなるようにＩＬ−１αを添加した以外は、実施例６と同様の方法でヒト表皮角化細胞の培養、並びにＲＴ−ＰＣＲ法によるヒトＭＭＰ−９遺伝子のｍＲＮＡ及びヒトＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡの検出を行った。結果を図２に示す。図２中、Ｓａｍｐｌｅ９が、培地に対するＬＭＢ濃度が０ｎＭであった細胞を用いた結果を、Ｓａｍｐｌｅ１０が、培地に対するＬＭＢ濃度が１０ｎＭであった細胞を用いた結果を示す。
図２のＳａｍｐｌｅ１及びＳａｍｐｌｅ２で示される実施例６の結果から、無刺激下においては、培地に対するＬＭＢの濃度が１０ｎＭである場合に、ＧＡＰＤＨと比較して、ＭＭＰ−９の産生が阻害されていることがわかる。図２のＳａｍｐｌｅ３及びＳａｍｐｌｅ４で示される実施例７の結果から、高カルシウム刺激下においても、培地に対するＬＭＢの濃度が１０ｎＭである場合に、ＧＡＰＤＨと比較して、ＭＭＰ−９の産生が阻害されていることがわかる。図２のＳａｍｐｌｅ５及びＳａｍｐｌｅ６で示される実施例８の結果から、ＴＧＦ−βによる刺激下においても、培地に対するＬＭＢの濃度が１０ｎＭである場合に、ＧＡＰＤＨと比較して、ＭＭＰ−９の産生が阻害されていることがわかる。図２のＳａｍｐｌｅ７及びＳａｍｐｌｅ８で示される実施例９の結果から、ＴＮＦ−αによる刺激下においても、培地に対するＬＭＢの濃度が１０ｎＭである場合に、ＧＡＰＤＨと比較して、ＭＭＰ−９の産生が阻害されていることがわかる。図２のＳａｍｐｌｅ９及びＳａｍｐｌｅ１０で示される実施例１０の結果から、ＩＬ−１αによる刺激下においても、培地に対するＬＭＢの濃度が１０ｎＭである場合に、ＧＡＰＤＨと比較して、ＭＭＰ−９の産生が阻害されていることがわかる。以上の結果から、ＬＭＢの添加が、ＧＡＰＤＨと比較して、ＭＭＰ−９の産生を阻害することが判明した。
ＬＭＢの作用によりＭＭＰ−９の産生が阻害されていることを検証するために、ＭＭＰ−９遺伝子のｐｒｏｍｏｔｅｒ配列のＫＲＥ−Ｍ９と、ＭＭＰ−９の産生と、ＬＭＢとの関係を調べることを目的として以下の実験を行った。
＜ヒト表皮角化細胞の培養＞
新生児の包皮を、４℃でカゼイン分解活性が２５．０ ｃａｓｅｉｎｏｌｙｔｉｃ ｕｎｉｔｓ／ｍｌであるディスパーゼで１６時間処理した。鉗子を用いて、真皮から表皮をはぎとった後、表皮を０．０５％トリプシンで５分間処理した。分離させたヒト包皮角化細胞（ＨＦＫｓ）を、０．０９ｍＭのＣａ＋を含有するｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を有する２４ｗｅｌｌのプレートにて３７℃で温置して、３代にわたって継代培養した。
＜ルシフェラーゼアッセイ測定用のベクター調製＞
Kobayashiらの方法（Kobayashi et al.（2001）EMBO Rep.2, 604-608）に従って、ＭＭＰ−９ ｐｒｏｍｏｔｅｒ配列のＫＲＥ−Ｍ９を含んだ−７３から＋１６までの塩基配列、およびＫＲＥ−Ｍ９を含まない−５６から＋１６までの塩基配列を、ルシフェラーゼ遺伝子を含有するルシフェラーゼ発現ベクターであるｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に、それぞれ挿入し、ベクター１及びベクター２を調製した。なお、ＫＲＥ−Ｍ９を含んだ−７３から＋１６までの塩基配列を含有する塩基配列を、図３（Ｃ）に示す。
＜遺伝子導入＞
ベクター１及びベクター２と遺伝子導入用試薬である Ｆｕｇｅｎｅ ６ （Ｒｏｃｈｅ社製）とを用いて、ＤＮＡ濃度３μｇ／１ｍｌのベクター１溶液及びベクター２溶液を調製した。次いで、＜ヒト表皮角化細胞の培養＞で得られた２４ｗｅｌｌのプレートのＨＦＫｓ培養液のうち、１２ｗｅｌｌのプレートに対してベクター溶液１を、残りの１２ｗｅｌｌのプレートに対してベクター溶液２を、いずれも３７℃で添加して遺伝子導入を行い、さらに、ベクター１溶液を添加して得られた１２ｗｅｌｌのプレートのうち、６ｗｅｌｌのプレートに対してＬＭＢ１０ｎＭ加え、６ｗｅｌｌのＬＭＢ添加プレート１とし、残りの６ｗｅｌｌのプレートに対してはＬＭＢを加えず、６ｗｅｌｌのＬＭＢ無添加プレート１とし、ベクター２溶液を添加して得られた１２ｗｅｌｌのプレートのうち、６ｗｅｌｌのプレートに対してＬＭＢ１０ｎＭ加え、６ｗｅｌｌのＬＭＢ添加プレート２とし、残りの６ｗｅｌｌのプレートに対してはＬＭＢを加えず、６ｗｅｌｌのＬＭＢ無添加プレート２とし、次いで３時間静置した。以上のようにルシフェラーゼ遺伝子の遺伝子導入を行うことにより、ＭＭＰ−９の産生とともにルシフェラーゼが産生することとなり、ルシフェラーゼによる発光反応における発光強度をマイクロプレスカウンターで測定することにより、ＭＭＰ−９の産生をモニターすることができる。
＜ルシフェラーゼアッセイによる転写活性の測定＞
ルシフェラーゼアッセイによる転写活性の測定を行った。ルシフェラーゼの活性は、ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ Ｐｒｏｍｅｇａ社製）によって測定した。マイクロプレスカウンターとして、Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）を用いた。測定は、６ｗｅｌｌのＬＭＢ添加プレート１、６ｗｅｌｌのＬＭＢ無添加プレート１、６ｗｅｌｌのＬＭＢ添加プレート２、及び６ｗｅｌｌのＬＭＢ無添加プレート２について、それぞれ６ｗｅｌｌのプレートのうち３ｗｅｌｌのプレートを用いて１２時間後の総転写活性を測定し、さらに、残りの３ｗｅｌｌのプレートを用いて２４時間後の総転写活性を測定する測定方法とした。結果を図３（Ａ）及び図３（Ｂ）に示す。図３（Ａ）及び図３（Ｂ）において、上部の数値がＫＲＥ−Ｍ９を含むベクター１をＨＦＫｓに遺伝子導入した場合の総転写活性を示し、下部の数値がＫＲＥ−Ｍ９を含まないベクター２をＨＦＫｓに遺伝子導入した場合の総転写活性を示し、上部及び下部の数値のうち、上段の数値はＬＭＢ１０ｎＭ添加した場合を示し、下段の数値はＬＭＢを添加しなかった場合を示し、数字はａｒｂｉｔａｒｙ ｕｎｉｔによるものであり、３ｗｅｌｌのプレートの平均値を示す。標準偏差をｅｒｒｏｒ ｂａｒで示す。
図３（Ａ）及び図３（Ｂ）の結果から、ＫＲＥ−Ｍ９を含むベクター１をＨＦＫｓに遺伝子導入した場合において、総転写活性が遺伝子導入後１２時間後、２４時間後と時間を追って、総転写活性が増強し、且つ総転写活性はＬＭＢを添加することによって、遺伝子導入後１２時間後、２４時間後ともに、Ｐｒｏｍｏｔｅｒ活性が、それぞれ、約５分の１、及び約７分の１に抑制された。また、ＫＲＥ−Ｍ９を含まないベクター２をＨＦＫｓに遺伝子導入した場合においては、転写活性が全く検出されなかった。以上のことから、ＫＲＥ−Ｍ９がＭＭＰ−９の転写活性を促進する上で重要であること、及びＫＲＥ−Ｍ９が、ＬＭＢが存在する場合において、ＭＭＰ−９の転写活性を阻害することを通じて、発現調節に働くことが示され、ＬＭＢがＭＭＰ−９の産生を阻害する薬剤として有効であることが支持された。
＜ヒト表皮角化細胞の培養＞は、実施例１１と同様に行った。また、ＭＭＰ−９ ｐｒｏｍｏｔｅｒ配列のＫＲＥ−Ｍ９を含んだ−７３から＋１６までの塩基配列、およびＫＲＥ−Ｍ９を含まない−５６から＋１６までの塩基配列の代わりに、ＭＭＰ−９ ｐｒｏｍｏｔｅｒ配列のＫＲＥ−Ｍ９及びＴＰＡ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ（以下ＴＲＥとも言う）を含んだ−８０から＋１６までの塩基配列１、および該塩基配列１においてＫＲＥ−Ｍ９配列が４塩基置換された塩基配列２、並びに−７１４から＋１６までの塩基配列３、該塩基配列３においてＫＲＥ−Ｍ９配列が４塩基置換された塩基配列４、該塩基配列４においてＴＲＥ配列が３塩基置換された塩基配列５、及び該塩基配列４においてＫＲＥ−Ｍ９配列が４塩基置換され、且つＴＲＥ配列が３塩基置換された塩基配列６を用いた以外は、実施例１１と同様に＜ルシフェラーゼアッセイ測定用のベクター調製＞を行った。ＫＲＥ−Ｍ９配列の４塩基置換配列及びＴＲＥ配列の３塩基置換配列を配列番号５及び６に示す。また、＜遺伝子導入＞及び＜ルシフェラーゼアッセイによる転写活性の測定＞も、総転写活性を遺伝子導入後２４時間後に測定した以外は、実施例１１と同様に行った。塩基配列１及び２を用いた場合の転写活性の測定結果、及び塩基配列３〜６を用いた場合の転写活性の測定結果をそれぞれ図４（Ａ）及び図４（Ｂ）に示す。図４（Ａ）の上部及び下部、並びに図４（Ｂ）の第１部〜第４部は、それぞれ塩基配列１及び塩基配列２、並びに塩基配列１〜４を用いた場合の総転写活性を示し、上部及び下部の数値のうち、上段の数値はＬＭＢ１０ｎＭ添加した場合を示し、下段の数値はＬＭＢを添加しなかった場合を示し、数字はａｒｂｉｔａｒｙ ｕｎｉｔによるものであり、３ｗｅｌｌのプレートの平均値を示す。標準偏差をｅｒｒｏｒ ｂａｒで示す。
また、ＫＲＥ−Ｍ９配列を用いて調製した２本鎖DNA1、配列番号５に示すＫＲＥ−Ｍ９配列の４塩基置換配列を用いて調製した２本鎖DNA2をコンペティター（competitor）として用い、32Pで標識したＫＲＥ−Ｍ９配列及びＫＲＥ−Ｍ９配列の４塩基置換配列をプローブとして用いて実験を行った以外は、Kobayashiらの方法（Kobayashi et al.（2001）EMBO Rep.2, 604-608）に従って、ヒトケラチノサイト核タンパク質を用いたゲルシフトアッセイを行った。結果を図４（Ｃ）に示す。図４（Ｃ）中で、右の三角矢印がプローブそのものが検出されたバンドを示し、左矢印がシフトしたバンドを示す。
図４（Ａ）の結果から、塩基配列１のみならず、ＫＲＥ−Ｍ９を４塩基置換した塩基配列２を用いた場合においても、ＬＭＢの添加によりＭＭＰ−９の転写活性が抑制されていることから、ＴＲＥ及びＫＲＥ−Ｍ９を含んだ遺伝子領域においては、ＫＲＥ−Ｍ９のみではなく、ＴＲＥもＭＭＰ−９の転写活性の抑制にとって重要であることが示された。また、図４（Ｂ）の結果から、ＫＲＥ−Ｍ９及びＴＲＥの双方を塩基置換して変異している塩基配列６を用いた場合においても、ＬＭＢの添加によりＭＭＰ−９の転写活性の抑制が起こっていることから、ＫＲＥ−Ｍ９及びＴＲＥ以外の遺伝子領域も、ＬＭＢの添加によりＭＭＰ−９の転写活性を抑制することが示された。
図４（Ｃ）の結果から、ＫＲＥ−Ｍ９プローブに対してヒトケラチノサイト核タンパク質が結合して得られた、シフトしたバンドが検出されている（図４（Ｃ）中左から第１段）。また、ＫＲＥ−Ｍ９プローブを用いて、且つコンペティター（competitor）としてＫＲＥ−Ｍ９配列を用いて調製した２本鎖DNA1を用いた場合には、競合阻害により、シフトしたバンドが検出されなくなった。（図４（Ｃ）中左から第２段）さらに、ＫＲＥ−Ｍ９プローブを用いて、且つコンペティター（competitor）としてＫＲＥ−Ｍ９配列の４塩基置換を用いて調製した２本鎖DNA2を用いた場合には、シフトしたバンドが検出されている（図４（Ｃ）中左から３段目）。加えて、配列番号５に示すＫＲＥ−Ｍ９配列の４塩基置換配列をプローブとして用いた場合には、シフトしたバンドは検出されていない。（図４（Ｃ）中右から２段）これらのことから、ヒトケラチノサイト核タンパク質は、ＫＲＥ−Ｍ９配列に結合することがわかる。
へアレスマウス（Ｈｏｓ：ＨＲ−１）の８週齢の雌１０匹を、一週間予備飼育した。５匹のマウス（マウスＡ１、マウスＢ１、マウスＣ１、マウスＤ１、マウスＥ１）に対して紫外線（ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ Ｂ（ＵＶＢ））を背部に３００ｍＪ（約３ＭＥＤ（ｍｉｎｉｍａｌ ｅｒｙｔｈｅｍａ ｄｏｓｅ、最小紅斑量））を照射し、５匹のマウス（マウスＡ２、マウスＢ２、マウスＣ２、マウスＤ２、マウスＥ２）に対しては紫外線を照射しなかった。紫外線照射直後と紫外線照射２４時間後に、７０％エタノールにレプトマイシンＢを溶解させた溶液として、マウスＢ１及びマウスＢ２に対して濃度１０μｇ／ｍｌ（２０μＭ）の溶液を、マウスＣ１及びマウスＣ２に対して濃度１μｇ／ｍｌ（２μＭ）の溶液を、マウスＤ１及びマウスＤ２に対して濃度１００ｎｇ／ｍｌ（２００ｎＭ）の溶液を、マウスＥ１、マウスＥ２に対して濃度１０ｎｇ／ｍｌ（２０ｎＭ）の溶液を、約０．１ｍｌずつ筆で外用塗布することによりレプトマイシンＢを投与した。また、マウスＡ１及びマウスＡ２に対して７０％エタノールを、約０．１ｍｌ筆で塗布した。ついで、照射４８時間後に紫外線照射したマウスＡ１〜マウスＥ１及び紫外線照射しなかったマウスＡ２〜マウスＥ２の皮膚を採取した。採取した皮膚をホルマリン固定して、パラフィン包埋処理をしたのち、切片をヘマトキシリン・エオジン染色した。マウスＡ１、マウスＢ１、マウスＣ１、マウスＤ１、及びマウスＥ１から採取し染色した皮膚の切片、並びにマウスＡ２、マウスＢ２、マウスＣ２、マウスＤ２、及びマウスＥ２から採取し染色した皮膚の切片をＥＣＬＩＰＳＥ Ｅ１０００Ｍ光学顕微鏡（ＮＩＫＯＮ社製）で観察した結果を図５に示す。図５においてＡ１〜Ｅ１は、それぞれ、マウスＡ１〜マウスＥ１から採取し染色した皮膚の切片に対応し、Ａ２〜Ｅ２は、それぞれ、マウスＡ２〜マウスＥ２から採取し染色した皮膚の切片に対応するものであり、バーの長さは１００μｍを示すものである。
図５の結果から、紫外線照射したマウスＡ１の皮膚では、表皮の角化異常、真皮および皮下組織の炎症性細胞湿潤を生じるのに対して、紫外線を照射するとともにレプトマイシンＢを外用投与したマウスＢ１、マウスＣ１、マウスＤ１、及びマウスＥ１の皮膚では、濃度依存的に、表皮では正常の角化を示すようになり、真皮および皮下組織の炎症性細胞湿潤も抑制されていくことを認めた。また、紫外線を照射しなかったマウスＢ２、マウスＣ２、マウスＤ２、及びマウスＥ２の皮膚にレプトマイシンＢを外用しても、有意な変化を認めなかった。このように、少なくとも、外用投与によって、皮膚の炎症を抑制することが確認され、種々の炎症性皮膚疾患、腫瘍にレプトマイシンＢが有用であることが示された。
（Ａ）は無刺激下における、（Ｂ）は高濃度カルシウム刺激下における、（Ｃ）はＴＧＦ−βによる刺激下における、（Ｄ）はＴＮＦ−αによる刺激下における、（Ｅ）はＩＬ−１αによる刺激下における、ヒト表皮角化細胞のＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の産生に及ぼすＬＭＢの影響を示す図である。 ヒト表皮角化細胞のＭＭＰ−９のｍＲＮＡ及びＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの産生に及ぼすＬＭＢの影響を示す図である。 （Ａ）及び（Ｂ）は、ＫＲＥ−Ｍ９を含むベクター１をＨＦＫｓに遺伝子導入した場合、及びＫＲＥ−Ｍ９を含まないベクター２をＨＦＫｓに遺伝子導入した場合のルシフェラーゼアッセイによるヒト表皮角化細胞のＭＭＰ−９の総転写活性の測定結果を示す図であり、（Ｃ）は、ＫＲＥ−Ｍ９配列及びＴＲＥ配列を含有する塩基配列を示す図である。 （Ａ）及び（Ｂ）は、塩基配列１及び２を用いた場合、並びに塩基配列３〜６を用いた場合のルシフェラーゼアッセイによるヒト表皮角化細胞のＭＭＰ−９の総転写活性の測定結果を示す図であり、（Ｃ）は、ＫＲＥ−Ｍ９配列及び配列番号５に示すＫＲＥ−Ｍ９配列の４塩基置換配列をプローブとして用いたヒトケラチノサイト核タンパク質によるゲルシフトアッセイの結果を示す図である。 マウスＡ１〜マウスＥ１から採取し染色した皮膚の切片、及びマウスＡ２〜マウスＥ２から採取し染色した皮膚の切片を光学顕微鏡で観察した結果を示す図である。
配列番号１〜４は、プライマーの配列を示し、配列番号５及び６は、ＫＲＥ−Ｍ９配列の４塩基置換配列及びＴＲＥ配列の置換配列を示すものである。

Claims (2)

  1. 下記式（１）：


    で示されるレプトマイシンＢを有効成分として含有し、マトリックスメタロプロテアーゼ−９関連の皮膚の炎症性疾患（皮膚の腫瘍性疾患を除く。）の予防薬又は治療薬（抗黄色ブドウ球菌剤を除く。）であり、該皮膚の炎症性疾患が、水疱症、血管新生、湿疹皮膚炎、紫外線皮膚炎、又は角化異常症であることを特徴とするマトリックスメタロプロテアーゼ−９の産生を阻害するための薬剤。
  2. 前記予防薬又は治療薬が、その投与形態が皮膚外用剤であることを特徴とする請求項１記載の薬剤。
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