JP4443740B2 - アントラサイクリン抗生物質 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物が生産する新規なアントラサイクリン抗生物質に関する。
【０００２】
【発明の背景】
放線菌によって生産されるアントラサイクリン抗生物質は、４員環キノン構造を基本骨格とするアグリコン部分（発色団）と、アミノ糖を主体とした糖類から構成される色素配糖体（グリコシド）である。広域の抗がんスペクトラムをもつが、蓄積性心毒作用が難点とされている制がん性抗生物質である。この中には現在もっとも多用されている制がん剤であるドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ：Ａｃｒａｍｏｎｅ，Ｆ．Ｇ． ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ． １１，１１０１〜１１１０（１９６９））やダウノルビシン（Ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ：Ｄｉｍａｒｃｏ，Ａ． ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２０１，７０６〜７０７（１９６４））、アクラルビシン（Ａｃｌａｒｕｂｉｃｉｎ：Ｏｋｉ，Ｔ． ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ． ２８，８３０〜８３４（１９７５））などが含まれ、これらの誘導体も臨床開発されている。
【０００３】
これらの抗生物質はＤＮＡと結合し、ラジカルを発生してＤＮＡ鎖を切断、あるいはトポイソメラーゼＩＩ（Ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ ＩＩ）を阻害する。トポイソメラーゼはＤＮａｓｅとｌｉｇａｓｅ作用を有し、ＤＮＡ鎖に一時的な切断と再結合を触媒するが、アントラサイクリン抗生物質を含むほとんどの抗がん剤はこの酵素（ＩＩ型）を阻害することによって、ＤＮＡ複製に障害を与え、制がん活性を発揮する。
【０００４】
一方、アントラサイクリン抗生物質の中でも早くに発見されたロドマイシン（Ｒｈｏｄｏｍｙｃｉｎ）群抗生物質は、β−ロドマイシノンをアグリコンにもつグリコシドであり、特に毒性が強いため制がん剤としては使用されていない。しかし、その後発見されたベタクラマイシンＡ（Ｂｅｔａｃｌａｍｙｃｉｎ Ａ：Ｏｋｉ，Ｔ． ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ． ３３，１３３１〜１３４０（１９８０））やオキサノマイシン（Ｏｘａｕｎｏｍｙｃｉｎ：Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ，Ａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ． ３９，９０２〜９０９（１９８６））といった抗生物質は実験腫瘍に著効を示しており、いずれもβ−ロドマイシノンをアグリコンに持つ化合物である。
【０００５】
制がん剤としてのアントラサイクリン抗生物質は、上述したとおり、各種の類縁化合物が提案されているが、毒性、抗がん作用双方について共に満足できるものはない。しかも、制がん剤は、試験管内試験、動物試験の結果が必ずしも直接人間の制がん作用として反映できないため、多角的な研究が要求される。そのため、制がん剤として一応の評価がされているアントラサイクリン抗生物質類について、さらに新たな部類に属する化合物の提案が望まれている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物が生産する新規なアントラサイクリン抗生物質、それらの製造方法および生産する微生物を提供するものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、より有用なアントラサイクリン抗生物質またはその合成中間体となりうる新規化合物を提案する目的で研究を重ねた結果、ロドマイシン生産菌の一株であるストレプトミセス・ビオラセウス（Ｓｔｏｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｏｌａｃｅｕｓ）Ａ２６２株の変異株が、新規なアントラサイクリン抗生物質を生産することを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
本発明により提供される新規アントラサイクリン抗生物質は、下記一般式（Ｉ）、
【化９】

（式中、Ｒ₁およびＲ₂は水素原子または水酸基を表わし、Ｙは、
【化１０】

、
【化１１】

または、
【化１２】

を表す）で示される化合物である。
【０００９】
本発明者らは、これらの化合物のうち、式（Ｉ―１）、
【化１３】

で示される化合物を抗生物質ＨＵ２−７０５Ａ、
式（Ｉ―２）、
【化１４】

で示される化合物を抗生物質ＨＵ２−７０５Ｂ、
式（Ｉ―３）、
【化１５】

で示される化合物を抗生物質ＨＵ２−７０５Ｃ、
式（Ｉ―４）、
【化１６】

で示される化合物を抗生物質ＨＵ２−７０５Ｅとそれぞれ命名した。以後、これらの化合物は、上記名称を用いて説明する。
【００１０】
本発明に使用される微生物は、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、本発明のアントラサイクリン抗生物質を生産する能力を有する菌株であれば、どのようなものでも使用できる。例えば、ロドマイシン系抗生物質およびその類縁化合物を生産する能力を有する土壌分離株または公知の菌株を、変異源として例えば紫外線あるいはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いる通常の変異処理に供することにより単離され、本発明のアントラサイクリン抗生物質を生産する菌株を挙げることができる。
【００１１】
これらの生産菌株のうち具体的なものとしては出願人が保存中のβ−ロドマイシン類生産菌ストレプトミセス・ビオラセウス（Ｓｔｏｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｏｌａｃｅｕｓ）Ａ２６２菌株をＮＴＧで変異処理して得られた変異株ＨＵ２−７０５菌株を挙げることができる。該菌株は、平成１２年８月４日付で工業技術院生命工学工業技術研究所に生命研菌寄第１７９８６号（ＦＥＲＭ Ｐ−１７９８６）として寄託されている。
【００１２】
以下に、ＨＵ２−７０５菌株の菌学的性状を示す。
１．形態
良く分岐した基中菌糸より、螺旋状の気中菌糸を形成し、輪生枝は認められない。成熟した胞子鎖は１０個〜５０個の胞子の連鎖を認める。胞子の表面はとげ状である。
【００１３】
２．各種培地における生育状態
培養はすべて２８℃で行った。結果を表１に示す。なお、色の記載について、（）内に示す標準はＨ．Ｄ．Ｔｒｅｓｎｅｒ ＆ Ｅ．ｊ．Ｂａｃｋｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｃｏｌｏｒ ｗｈｅｅｌｓ ｆｏｒ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅ ｔａｘｏｎｏｍｙ（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｅｌ．１１，３３５〜３３８（１９６３））を用い、補足的に日本色彩研究所出版の「色の標準」も用いた。
【００１４】
【表１】

【００１５】
３．生理的性質
（１）生育温度範囲：（イースト・麦芽・寒天培地を使用、ｐＨ６．０で、２０℃、２８℃、３０℃、３７℃、４２℃の各温度で実験）２０℃から３７℃までの各温度では生育が認められた。４２℃では生育しない。
（２）ゼラチンの液化：陽性（グルコース・ペプトン・ゼラチン培地を使用し、２０℃で培養）
（３）スターチの加水分解：陽性（スターチ・無機塩寒天培地）
（４）スキム・ミルクの凝固、ペプトン化：はじめはすべて陰性、培養を開始して１５日を過ぎる頃ペプトン化をはじめる。
（５）メラニン様色素の生成：（トリプトン・イースト・ブロス培地、ペプトン・イースト・鉄・寒天培地およびチロシン寒天培地使用）いずれの培地でも陽性
【００１６】
４．各種炭素源の利用性：（フリドハム・ゴドリープ寒天培地上）
Ｌ−アラビノース 陽性
Ｄ−キシロース 陽性
Ｄ−グルコース 陽性
Ｄ−フラクトース 陽性
シュークロース 陽性
イノシトール 陽性
Ｌ−ラムノース 陽性
ラフィノース 陽性
Ｄ−マンニット 陽性
【００１７】
本発明のアントラサイクリン抗生物質は上記菌株を栄養培地に接種し、好気的に培養することにより製造される。上記菌株の培養方法は、原則的には一般微生物の培養方法に準ずるが、通常は液体培養による振とう培養、通気撹拌培養などの好気的条件下で行うのが好適である。
【００１８】
培養に用いることのできる培地としては、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物が利用できる栄養源を含有する培地であればよく、各種の合成培地、半合成培地、天然培地などいずれも用いることができる。培地組成としては、例えば、炭素源として、グルコース、マルトース、シュークロース、水あめ、糖みつ、デキストリン、澱粉、グリセロール、動物油、植物油などを単独または組み合わせて使用することができ、また窒素源としては、大豆粉、小麦胚芽、コーンスティープリカー、綿実粕、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、魚粉、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、リン酸アンモニウム、などを単独または組み合わせて使用することができる。また必要に応じて、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、リン酸塩、金属塩などの無機塩を加えることができる。その他、上記菌株の生育あるいは本発明のアントラサイクリン抗生物質の生産を促進する有機物、例えば、ビタミン類、アミノ酸類を加えることができる。さらに必要に応じて、消泡剤、例えば、アデカノール（商品名：旭電化工業（株）製）、シリコーン（商品名：信越化学工業（株）製）などを添加することができる。
【００１９】
培養条件は、上記菌株が良好に生育して本発明のアントラサイクリン抗生物質を生産し得る範囲内で適宜選択すればよい。例えば、培地のｐＨは、５〜９程度、通常６〜７とすることが好ましい。培養温度は、微生物が良好に生育する温度、通常２０〜４０℃、好ましくは２５〜２８℃に保つのがよい。培養時間は、２〜８日間程度でよく、好ましくは４〜５日間である。もちろん上述した各種の培養条件は、使用微生物の種類や特性、外部条件などに応じて適宜変更でき、またそれに応じて上記範囲から最適条件を選択、調整できる。その際、培養液中の目的化合物の蓄積量が最大になったときに培養を停止して得た培養液を以下の精製工程に使用すればよい。
【００２０】
このようにして得た培養液中に蓄積された本発明のアントラサイクリン抗生物質は、培養後、濾過、遠心分離等の一般的固液分離手段によって菌体を分離し、濾液または上澄液から回収可能である。また分離した菌体からも回収可能である。濾液または上澄液から回収する場合、まず、ｐＨ７〜９において、クロロホルム、トルエン、酢酸エチルなどの有機溶媒で抽出し、さらにアンバーライトＸＡＤ（ローム・アンド・ハース社製）、ダイヤイオンＨＰ−２０（三菱化学（株）製）等のポリスチレン系吸着樹脂、シリカゲル、アルミナ、活性炭などの担体を用いるカラムクロマトグラフィーにより処理することができる。これらの担体から目的物質を溶出させる方法は、担体の種類、性質によって異なるが、一例として、ポリスチレン系吸着樹脂の場合には、溶出溶媒として、含水アルコール、含水アセトン等を用いることができる。
【００２１】
さらにセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ＬＨ−２０（ファルマシア社製）、バイオ・ゲルＰ−２（バイオ・ラッド社製）等によるゲル濾過、シリカゲル、アルミナ等による薄層クロマトグラフィー、順相あるいは逆相カラムを用いた分取用高速液体クロマトグラフィー（分取ＨＰＬＣ）等を用いることができ、これらの方法を単独または適宜組み合わせて、場合によっては反復使用することにより、分離、精製することができる。また、分離した菌体から回収する場合はアセトン、メタノール、エタノールまたはブタノール等の適当な有機溶媒を用いて抽出した後、クロロホルムで再抽出し、上記と同様に単離精製することができる。
【００２２】
以上のようにして得られる本発明のアントラサイクリン抗生物質は、以下に示す物理化学的性質を有する。
１．アントラサイクリン抗生物質ＨＵ２−７０５Ａの物理化学的性質
（１）色および形状：ピンク色、固体。
（２）分子式：Ｃ₂₈Ｈ₃₁ＮＯ₈
（３）マススペクトル
ＦＡＢ−ＭＳ：図１に示すとおりである。
ＨＲＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ ５１０．２０９５ ［Ｍ＋Ｈ］⁺
（４）¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ）：重クロロホルム中で測定した結果は図２に示すとおりである。また、主要なシグナルの化学シフト、多重度は表２に示すとおりである。
（５）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１２５ＭＨｚ）：重クロロホルム中で測定した結果は図３に示すとおりである。また、主要なシグナルの化学シフトは、表３に示すとおりである。
（６）薄層クロマトグラフィーのＲｆ値：シリカゲルプレート（Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ ７０Ｆ₂₅₄：和光純薬（株）製）にて、０．３７（クロロホルム：メタノール：水：酢酸＝１００：３０：５：１）
【００２３】
２．アントラサイクリン抗生物質ＨＵ２−７０５Ｂの物理化学的性質
（１）色および形状：赤色、粉末。
（２）分子式：Ｃ₂₉Ｈ₃₃ＮＯ₁₁
（３）マススペクトル
ＦＡＢ−ＭＳ：図４に示すとおりである。
ＨＲＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ ５７１．２１５６ ［Ｍ＋Ｈ］⁺
（４）¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ）：重メタノール中で測定した結果は図５に示すとおりである。また、主要なシグナルの化学シフト、多重度は表２に示すとおりである。
（５）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１２５ＭＨｚ）：重メタノール中で測定した結果は図６に示すとおりである。また、主要なシグナルの化学シフトは、表３に示すとおりである。
（６）薄層クロマトグラフィーのＲｆ値：シリカゲルプレート（Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ ７０Ｆ₂₅₄：和光純薬（株）製）にて、０．１８（クロロホルム：メタノール：水：酢酸＝１００：３０：５：１）
（７）比旋光度：［α］²⁵ _D ＋１４４°（ｃ ０．１，メタノール）
（８）紫外部吸収スペクトル：９０％メタノール中で測定した結果は図７に示すとおりである。また特徴的な吸収は次のとおりである。
ＵＶ λｍａｘ ｎｍ，（ε^1% _1cm）：２３３（５９７）、２５４（４５１）、２９１（１６２）、４９３（２２７）
【００２４】
３．アントラサイクリン抗生物質ＨＵ２−７０５Ｃの物理化学的性質
（１）色および形状：オレンジ色、粉末。
（２）分子式：Ｃ₂₉Ｈ₃₃ＮＯ₁₁
（３）マススペクトル
ＦＡＢ−ＭＳ：図８に示すとおりである。
ＨＲＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ ５７１．２１６４ ［Ｍ＋Ｈ］⁺
（４）¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ）：重メタノール中で測定した結果は図９に示すとおりである。また、主要なシグナルの化学シフト、多重度は表２に示すとおりである。
（５）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１２５ＭＨｚ）：重メタノール中で測定した結果は図１０に示すとおりである。また、主要なシグナルの化学シフトは、表３に示すとおりである。
（６）薄層クロマトグラフィーのＲｆ値：シリカゲルプレート（Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ ７０Ｆ₂₅₄：和光純薬（株）製）にて、０．１３（クロロホルム：メタノール：水：酢酸＝１００：３０：５：１）
（７）比旋光度：［α］²⁵ _D ＋３４°（ｃ ０．０７６，メタノール）
（８）紫外部吸収スペクトル：９０％メタノール中で測定した結果は図１１に示すとおりである。また特徴的な吸収は次のとおりである。
ＵＶ λｍａｘ ｎｍ，（ε^1% _1cm）：２０８（６８６）、２３５（ｓｈ５７０）、２５８（４１８）、２９０（ｓｈ２３０）、４９１（１２６）
【００２５】
４．アントラサイクリン抗生物質ＨＵ２−７０５Ｅの物理化学的性質
（１）色および形状：赤色、固体。
（２）分子式：Ｃ₂₈Ｈ₃₃ＮＯ₉
（３）マススペクトル
ＦＡＢ−ＭＳ：図１２に示すとおりである。
ＨＲＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ ５２８．２１８２ ［Ｍ＋Ｈ］⁺
（４）¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ）：重クロロホルム中で測定した結果は図１３に示すとおりである。また、主要なシグナルの化学シフト、多重度は表２に示すとおりである。
（５）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１２５ＭＨｚ）：重メタノール中で測定した結果は図１４に示すとおりである。また、主要なシグナルの化学シフトは、表３に示すとおりである。
（６）薄層クロマトグラフィーのＲｆ値：シリカゲルプレート（Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ ７０Ｆ₂₅₄：和光純薬（株）製）にて、０．２８（クロロホルム：メタノール：水：酢酸＝１００：３０：５：１）
【００２６】
【表２】

【００２７】
【表３】

【００２８】
本発明のアントラサイクリン抗生物質は、それぞれ培養白血病細胞Ｌ１２１０に対して増殖抑制作用を示し、それ自体制がん剤として有用である。
【００２９】
（マウス白血病Ｌ１２１０細胞に対する増殖および核酸合成阻害作用）
２０％仔牛血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ローズウェルバーグ研究所）へＬ１２１０細胞を５×１０⁴個／ｍｌ接種し、同様に本発明のアントラサイクリン抗生物質を各種濃度で添加し、３７℃にて炭酸ガス培養器中で培養し対照区に対する５０％増殖阻害濃度を求めた。さらに１０％仔牛血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地へ上記のＬ１２１０培養細胞を５×１０⁴個／ｍｌとなる様に懸濁し、３７℃にて炭酸ガス培養器中で１〜２時間培養を行ったのち、本物質を種々の濃度で添加し、１５分後にさらに¹⁴Ｃ−ウリジン（０．０５μＣｉ／ｍｌ）または¹⁴Ｃ−チミジン（０．０５μＣｉ／ｍｌ）を添加し、３７℃にて６０分間培養した。反応液へ冷１０％トリクロル酢酸を添加し、反応を中止すると同時に、酸不溶物を沈殿させ、冷５％トリクロル酢酸にてさらに２回洗浄したのち、ギ酸に溶解し、放射活性を測定し、無添加対照区に対する放射能の取り込み率から５０％取り込み阻害濃度（ＩＣ₅₀）を求めた。表４に結果を示す。
【００３０】
【表４】

【００３１】
以下、実施例を挙げ、本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
実施例１ 培養液の調製
ストレプトミセス・ビオラセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｏｌａｃｅｕｓ）ＨＵ２−７０５菌株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７９８６）のＹＧＳ（可溶性デンプン０．５％、酵母エキス０．３％、グルコース０．５％、寒天２．０％、ｐＨ７．２）斜面培養より一白金耳を採り、ＹＧＳ液体培地（可溶性デンプン０．５％、酵母エキス０．３％、グルコース０．５％、ｐＨ７．２）５ｍｌを分注、殺菌した試験管に接種し、２８℃、１３０ｒｐｍで５日間往復振とう培養し、種母を作成した。
【００３２】
次に生産培地（可溶性デンプン２．５％、大豆粉１．５％、酵母エキス０．２％、グルコース０．５％、塩化ナトリウム０．１％、ミネラル混液０．１％、炭酸カルシウム０．２％、１０％アデカノール０．１％、ｐＨ７．０：但し、ミネラル混液は、塩化亜鉛４０ｍｇ、塩化第一鉄・６水和物２００ｍｇ、塩化第一銅・２水和物１０ｍｇ、塩化マンガン・４水和物１０ｍｇ、ピロホウ酸ナトリウム・１０水和物１０ｍｇおよびモリブデン酸アンモニウム・４水和物１０ｍｇを蒸留水１０００ｍｌに溶解し、塩酸でｐＨ２．２に調整したものである。）５０ｍｌを分注、殺菌した５００ｍｌ容坂口フラスコに、前記種母を１．５ｍｌ接種し、２８℃、１３０ｒｐｍで４日間往復振とう培養した。これを、生産培地５０ｍｌを分注、殺菌した５００ｍｌ容坂口フラスコ２０本に１ｍｌずつ接種し、２８℃、１３０ｒｐｍで５日間往復振とう培養し、培養液１０００ｍｌを得た。
【００３３】
実施例２ アントラサイクリン抗生物質ＨＵ２−７０５ＢおよびＨＵ２−７０５Ｃの精製
実施例１に記載した方法で得た培養液１０００ｍｌをリン酸でｐＨ２．０に調製し、室温で１時間穏やかに攪拌した。３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄液と菌体を含む沈殿物に分離後、沈殿物にリン酸で、ｐＨ２．９に調製したアセトン３００ｍｌを添加し、激しく攪拌した。３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、アセトンを含む上澄液を濃縮し、先の上澄液と併せた。この酸性溶液を、リン酸でｐＨ調整した酸性水溶液（ｐＨ２．４）で洗浄したＨＰ−２０カラム（φ３０ｍｍ×２０５ｍｍ、１４５ｍｌ）に付した。酸性水（ｐＨ２．４）で洗浄後、ｐＨ２．４に調整した９０％アセトン溶液で溶出した。減圧濃縮後、１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液でｐＨ７．５に調整し、クロロホルム２００ｍｌを添加後、激しく攪拌し遠心分離を行った。同クロロホルム洗浄を二回行った後、水相を１Ｍ塩酸でｐＨ２．５に調整した。これに１−ブタノール３００ｍｌを加え攪拌抽出した後、遠心分離し、生成物を１−ブタノールに転溶した。この操作を二度繰り返し、得られたブタノール溶液を併せ、さらに少量の水を加えて５０℃で濃縮乾固し、粗抽出物１．１３ｇを回収した。
【００３４】
粗抽出物を混合溶媒（クロロホルム：メタノール：水：酢酸＝４００：１００：１０：１）５０ｍｌに溶解し、Ｗａｋｏｇｅｌ Ｃ−２００シリカゲルカラム（φ２５ｍｍ×２２０ｍｍ、１０８ｍｌ）に吸着させた。次いで、クロロホルム：メタノール：水：酢酸系の展開溶媒（４００：１００：１０：１、１０００ｍｌ→４００：２００：１０：１、２００ｍｌ）で溶出した。クロロホルム：メタノール：水：酢酸＝１００：３０：５：１を展開溶媒としてＴＬＣ分析（Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ ７０ Ｆ₂₅₄：和光純薬社製）を行い、各画分に含まれる成分を確認した。そのうちＲｆ値０．１８のスポットを示す生成物（赤色、アントラサイクリン抗生物質ＨＵ２−７０５Ｂ）と、Ｒｆ値０．１３のスポットを示す生成物（オレンジ色、アントラサイクリン抗生物質ＨＵ２−７０５Ｃ）をそれぞれ回収した。
【００３５】
アントラサイクリン抗生物質ＨＵ２−７０５Ｂは濃縮乾固後、１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．５）１００ｍｌに溶解し、１００ｍｌのクロロホルムを用いて洗浄した。残った水相を１Ｍ塩酸でｐＨ２．５に調整し、ブタノール抽出を行った。水相の色素が見えなくなるまでこの操作を繰り返し、回収したブタノール層を集め濃縮乾固した。これを混合溶媒（トルエン：メタノール＝５：１）に溶解し、濃縮乾固すると次々に赤色粉末が析出した。完全に乾固する直前に濃縮を止め、析出物質および溶液を試験管に移した後、遠心分離した。沈殿物を回収し、トルエン相は再度トルエン、メタノールを加え、濃縮し晶析を繰り返し粉末状のＨＵ２−７０５Ｂ結晶を１３６．４ｍｇ回収した。また、アントラサイクリン抗生物質ＨＵ２−７０５Ｃも、アントラサイクリン抗生物質ＨＵ２−７０５Ｂ同様トルエン：メタノール系混合溶媒で結晶化を行い、４８．６ｍｇ取得した。
【００３６】
実施例３ アントラサイクリン抗生物質ＨＵ２−７０５ＡおよびＨＵ２−７０５Ｅの精製
実施例１に記載した方法で得た培養液１０００ｍｌを３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その上清に０．１Ｍクエン酸緩衝液を加えｐＨ３．３に調整した。また同緩衝液（ｐＨ３．３）で緩衝化した吸着樹脂ＨＰ−２０カラム（三菱化学社製：φ２８ｍｍ×２５０ｍｍ、１５４ｍｌ）に、あらかじめ３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して得たｐＨ調整済の上清を付した。５０％アセトン溶液５００ｍｌ（ｐＨ６．５）で溶出を行い、減圧濃縮して、粗抽出物０．５ｇを回収した。
【００３７】
次に得られた粗抽出物を混合溶媒（クロロホルム：メタノール：水：酢酸＝２００：２０：１：１）３０ｍｌに溶解し、シリカゲルカラム（φ１０ｍｍ×１５０ｍｍ、１２ｍｌ）に付した。次いで、以下に示すクロロホルム：メタノール：水：酢酸系の混合溶媒を用いて順次溶出した。
（１）クロロホルム：メタノール：水：酢酸＝２００：２０：１：１
（２）クロロホルム：メタノール：水：酢酸＝２００：３０：２．５：１
（３）クロロホルム：メタノール：水：酢酸＝２００：４０：５：１．５
（４）クロロホルム：メタノール：水：酢酸＝１００：３０：５：１
【００３８】
各画分を、クロロホルム：メタノール：水：酢酸＝１００：３０：５：１を展開溶媒としてＴＬＣ分析（Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ ７０ Ｆ₂₅₄：和光純薬（株）製）を行い、Ｒｆ値０．３７を示す画分を集めて濃縮し、アントラサイクリン抗生物質ＨＵ２−７０５Ａを１７．７ｍｇ取得した。次にＨＵ２−７０５Ａ以外の画分を集め、濃縮し、分取用ＴＬＣ（シリカゲル２０ｃｍ×２０ｃｍ：Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ ７０ Ｆ₂₅₄：和光純薬（株）製）にて精製した。クロロホルム：メタノール：水：酢酸＝１００：３０：５：１を展開溶媒として用い、Ｒｆ値０．２８のオレンジ色のスポットをかき取り、切り落とし短くしたパスツールピペットに詰め、クロロホルム：メタノール＝１：１で溶出した。これを濃縮し、アントラサイクリン抗生物質ＨＵ２−７０５Ｅを８．５ｍｇ取得した。
【図面の簡単な説明】
【図１】 アントラサイクリン抗生物質ＨＵ２−７０５Ａのマススペクトルである。
【図２】 アントラサイクリン抗生物質ＨＵ２−７０５Ａの重クロロホルム中での¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ）である。
【図３】 アントラサイクリン抗生物質ＨＵ２−７０５Ａの重クロロホルム中での¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１２５ＭＨｚ）である。
【図４】 アントラサイクリン抗生物質ＨＵ２−７０５Ｂのマススペクトルである。
【図５】 アントラサイクリン抗生物質ＨＵ２−７０５Ｂの重メタノール溶液中での¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ）である。
【図６】 アントラサイクリン抗生物質ＨＵ２−７０５Ｂの重メタノール溶液中での¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１２５ＭＨｚ）である。
【図７】 アントラサイクリン抗生物質ＨＵ２−７０５Ｂの９０％メタノール中での紫外部吸収スペクトルである。
【図８】 アントラサイクリン抗生物質ＨＵ２−７０５Ｃのマススペクトルである。
【図９】 アントラサイクリン抗生物質ＨＵ２−７０５Ｃの重メタノール中での¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ）である。
【図１０】 アントラサイクリン抗生物質ＨＵ２−７０５Ｃの重メタノール中での¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１２５ＭＨｚ）である。
【図１１】 アントラサイクリン抗生物質ＨＵ２−７０５Ｃの９０％メタノール中での紫外部吸収スペクトルである。
【図１２】 アントラサイクリン抗生物質ＨＵ２−７０５Ｅのマススペクトルである。
【図１３】 アントラサイクリン抗生物質ＨＵ２−７０５Ｅの重クロロホルム中での¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ）である。
【図１４】 アントラサイクリン抗生物質ＨＵ２−７０５Ｅの重メタノール中での¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１２５ＭＨｚ）である。

Claims (7)

1. 下記式（Ｉ）で表されるアントラサイクリン抗生物質であって、
   

   

   R₁がH、R₂がOH、Yが
   

   

   で示されるアントラサイクリン抗生物質、
   R₁がH、R₂がOH、Yが
   

   

   で示されるアントラサイクリン抗生物質、
   R₁がOH、R₂がH、Yが
   

   

   で示されるアントラサイクリン抗生物質または、
   R₁がH、R₂がOH、Yが
   

   

   で示されるアントラサイクリン抗生物質。
2. 下記式（Ｉ−１）、
   

   

   で示されるアントラサイクリン抗生物質ＨＵ２−７０５Ａ。
3. 下記式（Ｉ−２）、
   

   

   で示されるアントラサイクリン抗生物質ＨＵ２−７０５Ｂ。
4. 下記式（Ｉ−３）、
   

   

   で示されるアントラサイクリン抗生物質ＨＵ２−７０５Ｃ。
5. 下記式（Ｉ−４）、
   

   

   で示されるアントラサイクリン抗生物質ＨＵ２−７０５Ｅ。
6. ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属し、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアントラサイクリン抗生物質を生産する能力を有する微生物を培養し、培養物から請求項１〜５のいずれか１項に記載のアントラサイクリン抗生物質を採取することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアントラサイクリン抗生物質の製造法。
7. 請求項１〜５のいずれか１項に記載のアントラサイクリン抗生物質を生産する能力を有するストレプトマイセス・ゼオラセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｏｌａｃｅｕｓ）ＨＵ２−７０５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１７９８６）。

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