JP4360652B2 - イムノクロマト法試薬用標識シリカナノ粒子、イムノクロマト法試薬、それを用いたイムノクロマト法用テストストリップ、及びイムノクロマト法用蛍光検出システム - Google Patents

Description

本発明は、標識物質を含有したシリカナノ粒子、それを用いることにより、同時多項目検出を可能にしたイムノクロマト法試薬に関する。さらに、前記イムノクロマト法試薬を用いてなるイムノクロマト法用テストストリップ、前記標識物質として蛍光物質を用いた場合の高感度検出を可能にしたイムノクロマト法用蛍光検出システムに関する。

イムノクロマト法とは、被検物質が毛細管現象により多孔質支持体内を移動し、標識粒子に捕捉され、更に多孔質支持体に局所的（例えば、ライン状）に固定化された捕捉物質と効率的に接触することによって前記被検物質が濃縮され、捕捉物質が固定化されたラインが発色することによって被検物質の有無を判定する免疫測定法をいう。
イムノクロマト法の特徴として下記の３点が挙げられる。
（１）判定までに要する時間が２０分以下であり迅速な検査が可能である。
（２）検体を滴下するだけで測定でき、操作が簡便であるため、複数の検体処理が可能である。
（３）特別な検出装置を必要とせず、判定が容易なため一般消費者が自身で検査できる。
これらの特徴を利用して、イムノクロマト法は妊娠検査薬やインフルエンザ検査薬に用いられており、新たなＰＯＣＴ（Ｐｏｉｎｔ Ｏｆ Ｃａｒｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ）の手法として注目を集めている（例えば、特許文献１参照）。
ここで、ＰＯＣＴとは、患者にできる限り近い場所で診断のための検査をいう。従来は採取した血液、尿、患部組織などの検体は、病院の中央検査室や専門の検査センターに送られデータを出すので、診断の確定までに時間がかかっていた（例えば、１日以上）。ＰＯＣＴによれば、瞬時に提供される検査情報をもとに迅速かつ的確な治療が可能となることから、病院での緊急検査や手術中の検査が可能になるので、最近、医療現場でニーズが高い。

現在イムノクロマト法では標識物質として金ナノ粒子が最もよく使用されている（例えば、特許文献２参照）。金ナノ粒子は吸光度が高いため視認性に優れるものの、色を一色しか出すことができないため、色の選択の余地がないことが問題であった。また大きい粒径の金粒子や凝集を起こした金粒子は色が黒ずんでしまうため、クリアな色が出せない場合があることが問題であった。
特開２００６−６７９７９公報 特開２００３−２６２６３８公報

本発明の目的は、上記の問題点に鑑みて、含有される標識物質を変えることで様々な色相、蛍光波長等を付与することができ、かつ凝集等によっても黒ずんだ色にならないイムノクロマト用標識シリカナノ粒子、及び、前記シリカナノ粒子を、検体を認識する物質で表面修飾してなるイムノクロマト法試薬を提供することにある。
また、本発明の目的は、前記イムノクロマト法試薬を用いてなるイムノクロマト法用テストストリップを提供することにある。
さらに、本発明の目的は、前記標識物質として蛍光物質を用いたイムノクロマト法試薬を用いたイムノクロマト法用蛍光検出システムを提供することにある。

本発明は下記手段により達成された。
すなわち本発明は、
（１） 蛍光物質または吸光物質からなる標識物質を含有してなる平均粒径２０〜６００ｎｍのシリカナノ粒子であって、検体を認識する物質で表面修飾され、かつポリエチレングリコール及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を結合してなることを特徴とするイムノクロマト法用標識試薬シリカナノ粒子、
（２） 前記検体を認識する物質、ポリエチレングリコール及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を順次吸着させることによって得られることを特徴とする（１）に記載のイムノクロマト法用標識試薬シリカナノ粒子、

（３） 標識物質を含有してなる平均粒径２０〜６００ｎｍのシリカナノ粒子であって、検体を認識する物質で表面修飾され、かつポリエチレングリコール及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を結合してなるイムノクロマト法用標識試薬シリカナノ粒子を含浸し、乾燥してなることを特徴とするイムノクロマト法用コンジュゲートパッド、
（４） 前記検体を認識する物質、ポリエチレングリコール及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を順次吸着させることによって得られるイムノクロマト法用標識試薬シリカナノ粒子を用いてなることを特徴とする（３）に記載のイムノクロマト法用コンジュゲートパッド、
（５） 前記イムノクロマト法用標識試薬シリカナノ粒子の含有量が、単位面積（ｃｍ^２）当たり５０μｇ〜２ｍｇであることを特徴とする（３）又は（４）に記載のイムノクロマト法用コンジュゲートパッド、
（６） 試料添加用部材、（３）〜（５）のいずれかに記載のイムノクロマト法用コンジュゲートパッド、抗体溶液を塗布、滴下ないしは噴霧後、乾燥して物理吸着により固定化した抗体固定化部を有するメンブレン及び吸収パッドがこの順に直列連結してなり、前記抗体固定化部の形状が幅０．５〜１．５ｍｍのライン形状であり、前記抗体固定化部における単位長さ（ｃｍ）当りの抗体固定化量が０．５μｇ〜５μｇであるイムノクロマト法用テストストリップ、及び
（７） 標識物質として蛍光物質を含有したイムノクロマト法用標識試薬シリカナノ粒子を用いてなるイムノクロマト法用テストストリップであって、前記蛍光が、青色蛍光、黄色蛍光、オレンジ色蛍光又は赤色蛍光であることを特徴とする（６）に記載のイムノクロマト法用テストストリップ、

を提供するものである。

本発明のイムノクロマト法用標識試薬シリカナノ粒子は、様々な吸光特性および蛍光特性を付与することができるので、各種イムノクロマト法に好適に用いられる。
本発明のイムノクロマト法試薬は、前記標識試薬シリカナノ粒子を用いてなり、さらに検体を認識する物質で表面修飾されてなるので、様々な吸光特性および蛍光特性を付与することができ、複数種の検体の同時分析に好適である。
本発明のイムノクロマト法用テストストリップは、前記イムノクロマト法試薬を用いてなるので、複数種の検体の同時検出、定量又は判定が可能であり、新たなＰＯＣＴの診断手法として好適である。
さらに、本発明のイムノクロマト法用蛍光検出システムは、前記イムノクロマト法試薬として蛍光物質を含有させてなるシリカナノ粒子を用いてなるので、蛍光検出による高感度検出ないしは定量が可能である。

まず、本発明のイムノクロマト法用標識試薬シリカナノ粒子について説明する。
本発明のイムノクロマト法用標識試薬シリカナノ粒子は、標識物質を含有してなるシリカナノ粒子からなる。
本発明において、前記標識試薬シリカナノ粒子の平均粒径は２０〜６００ｎｍであり、６０〜３００ｎｍであることがより好ましい。粒径が小さすぎると、検出感度が低下し、粒径が大きすぎると、イムノクロマト法に用いられる多孔質支持体（メンブレン）の目詰まりの原因となる。
本発明において、前記平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等の画像から無作為に選択した５０個のシリカナノ粒子の合計の投影面積からシリカナノ粒子の占有面積を画像処理装置によって求め、この合計の占有面積を、選択したシリカナノ粒子の個数（５０個）で割った値に相当する円の直径の平均値（平均円相当直径）を求めたものである。
粒度分布の変動係数いわゆるＣＶ値は特に制限はないが、１０％以下が好ましく、８％以下がより好ましい。
本明細書及び特許請求の範囲において、単分散とはＣＶ値１５％以下の粒子群をいう。
本発明において、用いるシリカ粒子は特に制限はなく、任意のいかなる調製方法によって得られたシリカ粒子であってもよい。例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｌｌｏｉｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １５９， １５０−１５７（１９９３）に記載のゾル−ゲル法で調製されるシリカ粒子等が挙げられる。
本発明者らは、蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子の調製方法について特許出願している（例えば、特願２００５−３７６４０１）。その方法に準じて得られた、標識物質を含有するシリカナノ粒子を用いることが特に好ましい。
具体的には、前記標識物質を含有するシリカナノ粒子は、前記標識物質とシラン化合物とを反応させ、共有結合、イオン結合その他の化学的に結合もしくは吸着させて得られた生成物に１又は２種以上のシラン化合物を重合させることにより調製することができる。
前記標識物質を含有するシリカナノ粒子の好ましい調製方法の態様としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基、マレイミド基、イソシアナート基、イソチオシアナート基、アルデヒド基、パラニトロフェニル基、ジエトキシメチル基、エポキシ基、シアノ基等の活性基を有する前記標識物質と、それら活性基と対応して反応する置換基（例えば、アミノ基、水酸基、チオール基）を有するシランカップリング剤とを反応させ、共有結合させて得られた生成物に１又は２種以上のシラン化合物を重合させることにより調製することができる。

前記活性基を有する前記標識物質の具体例として、５−（及び−６）−カルボキシテトラメチルローダミン・スクシンイミジルエステル（商品名、ｅｍｐ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ社製）等のＮＨＳエステル基を有する標識物質を挙げることができる。

前記置換基を有するシランカップリング剤の具体例として、γ-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、３−［２−（２−アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピル-トリエトキシシラン、Ｎ−２（アミノエチル）３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン等のアミノ基を有するシランカップリング剤を挙げることができる。中でも、ＡＰＳが好ましい。

前記重合させる前記シラン化合物としては、特に制限はされないが、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）、γ-メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）、γ-メルカプトプロピルトリエトキシシラン、γ-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、３−チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、３−グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、３−イソシアナトプロピルトリエトキシシラン、及び３−［２−（２−アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピル−トリエトキシシランを挙げることができる。中でも、ＴＥＯＳ、ＭＰＳ又はＡＰＳが好ましい。

上述のように調製すると、球状、もしくは、球状に近いシリカ粒子が製造できる。球状に近いシリカ粒子とは、具体的には長軸と短軸の比が２以下の形状である。
所望の平均粒径のシリカ粒子を得るためには、ＹＭ−１０、ＹＭ−１００（いずれも商品名、ミリポア社製）等の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行い、粒径が大きすぎたり小さすぎる粒子を除去するか、または適切な重力加速度で遠心分離を行い、上清または沈殿のみを回収することで可能である。

本発明において、前記標識物質は、前記標識試薬シリカナノ粒子中において固定化された状態にある。前記標識物質は蛍光物質または吸光物質の機能性物質である。蛍光物質または吸光物質に関して特に制限はなく、有機分子、無機化合物、半導体粒子等である。前記標識物質が蛍光物質または吸光物質の場合、前記標識試薬シリカナノ粒子に対する蛍光物質または吸光物質の濃度が２０ｍｍｏｌ／ｌ以上であることが好ましく、４０〜８０ｍｍｏｌ／ｌであることがより好ましい。
ここで、「前記標識試薬シリカナノ粒子に対する蛍光物質または吸光物質の濃度」とは、蛍光物質あるいは吸光物質のモル数を、前記標識試薬シリカナノ粒子の体積で割ったものである。蛍光物質あるいは吸光物質のモル数は、前記標識試薬シリカナノ粒子の吸光度もしくは蛍光強度から求めたものであり、また前記標識試薬シリカナノ粒子の体積は、前記標識試薬シリカナノ粒子分散液から前記標識試薬シリカナノ粒子を遠心分離または限外ろ過によって回収し、乾燥させ、質量を求め、シリカ粒子の密度を２．３ｇ／ｃｍ^３として求めたものである。

前記標識試薬シリカナノ粒子をイムノクロマト法に用いるためには、検体を認識する物質（例えば、抗体、抗原、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの生体分子）で表面修飾されている。
本明細書及び特許請求の範囲において、検体を含有する試料液体としては特に制限ないが、尿、血液などが挙げられる。
本明細書及び特許請求の範囲において、検出、定量、検査、診断、判定の対象としての検体は、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖、糖鎖、リガンド、受容体、ペプチド、化学物質等が挙げられる。より具体的には、妊娠の重要なマーカーとして、抗原である、尿中のヒトゴナドトロピン（ｈＣＧ）・ペプチドホルモンを検体として妊娠の有無を判定もしくは診断することが挙げられる。
前記標識試薬シリカナノ粒子と前記検体を認識する物質を結合させる方法としては特に制限は無く、静電的引力、ファンデルワールス力、疎水性相互作用等によって前記検体を認識する物質を前記標識試薬シリカナノ粒子に吸着させてなる。
また、前記標識試薬シリカナノ粒子表面の生体分子（例えば、抗体、抗原、ＤＮＡ、ＲＮＡ）などの前記検体を認識する物質を結合したときに粒子が凝集するので、予め、前記標識試薬シリカナノ粒子表面に交互吸着法によって表面処理を施しておいても良い。交互吸着法とは、電荷を有する基板や粒子の表面に電荷を持った高分子を静電的引力で吸着させることで、基板や粒子の表面に高分子の薄膜を形成する手法である。前記標識試薬シリカナノ粒子の表面に交互吸着処理を行うことにより粒子表面に電荷を付与できるため、粒子間に静電的反発力が生じ、分散性が向上する。また、粒子に結合した高分子は排除体積を持つことから、立体反発力の効果によっても分散性が向上する。

次に、本発明のイムノクロマト法試薬について説明する。
本発明のイムノクロマト法試薬は、前記標識試薬シリカナノ粒子からなり、前述のように検体を認識する物質で表面修飾されている。

本発明のイムノクロマト法試薬として、前述のように前記標識物質として吸光物質又は蛍光物質を含有してなるシリカナノ粒子からなることが好ましい。
前記吸光物質としては、前記任意の光源による光を吸光する物質であれば特に制限はなく、プレートリーダー等の汎用の検出器（例えば、Ｖｍａｘ（商品名、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）、マイクロプレートリーダーＭＰＲ−Ａ４ｉ（商品名、東ソー社製））による検出およびデータの互換性の観点から、吸光スペクトルにおける吸光最大波長が２００〜８００ｎｍの範囲内にある吸光物質が好ましく、吸光スペクトルにおける吸光最大波長が４００〜７００ｎｍの範囲にある吸光物質がより好ましい。
ここで、「吸光最大波長」とは、吸光スペクトルにおいて、吸収ピークが複数存在する場合において、前記吸収ピークの中で、吸光度が最大であるものの波長をいう。
吸光スペクトルにおける吸光最大波長が２００〜８００ｎｍの範囲内に存在する吸光物質である限り、任意の吸光性色素を用いることができるが、下記式で表されるＤＹＱ−６６０（商品名、Ｄｙｏｍｉｃｓ ＧｍｂＨ社製）のＮＨＳエステル等が好ましい。

前記吸光物質を含有させてなるシリカナノ粒子は、５×１０^７Ｍ^−１ｃｍ^−１以上のモル吸光係数εとすることができ、εが２×１０^８Ｍ^−１ｃｍ^−１〜１×１０^１１Ｍ^−１ｃｍ^−１であることが好ましい。
前記吸光物質を含有させてなるシリカナノ粒子の吸光度、吸光スペクトル及びεは、任意の吸光光度計ないしはプレートリーダーを用いて、水分散液、エタノール分散液、Ｎ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド分散液等の分散液として測定できる。
「前記吸光物質を含有させてなるシリカナノ粒子のモル吸光係数ε」とは、前記吸光物質を含有させてなるシリカナノ粒子の分散液について吸光度を測定し、ランベルト−ベールの式に適用することにより得られた、前記分散液中における前記吸光物質を含有させてなるシリカナノ粒子のモル吸光係数εをいう。

本発明のイムノクロマト法試薬において、前記標識物質として蛍光物質を含有してなるシリカナノ粒子であって、検体を認識する物質で表面修飾されたシリカナノ粒子を用いる場合には、前記シリカナノ粒子が発する蛍光を検出することにより高感度検出ないしは定量が可能である。
前記蛍光物質は特に制限はないが、汎用の検出器（例えば、ＡＥ−６９３１ＦＸＣＦ プリントグラフ（商品名、ＡＴＴＯ社製））による検出およびデータの互換性の観点から、青色蛍光（４４０〜４９０ｎｍ）、黄色蛍光（５４０〜５９０ｎｍ）、オレンジ色蛍光（５９０〜６２０ｎｍ）又は赤色蛍光（６２０〜７４０ｎｍ）である蛍光物質が好ましい。

次に、本発明のイムノクロマト法用テストストリップについて説明する。
本発明のイムノクロマト法用テストストリップは、
（１）試料添加用部材（サンプルパッド）と前記標識シリカ粒子を含浸させてなる部材（コンジュゲートパッド）とが、
（２）前記コンジュゲートパッドと抗体固定化部を有するメンブレン（抗体固定化メンブレン）とが、並びに
（３）前記抗体固定化メンブレンと吸収パッドとが
相互に毛細管現象が生じるように直列連結していることがより好ましい。

図１ａ及びｂを参照して、本発明のイムノクロマト法用テストストリップの好ましい１つの実施態様について説明する。
図１ａは本発明のイムノクロマト法用テストストリップの平面図を示し、図１ｂは、ａで示されたイムノクロマト法用テストストリップの平面図の縦断面図を示す図である。
本発明のイムノクロマト法用テストストリップ１は、試料添加用部材（サンプルパッド）２、標識シリカナノ粒子含浸部材（コンジュゲートパッド）３、抗体固定化メンブレン４、吸収パッド５からなることが好ましい。上記各構成部材は粘着剤付きバッキングシート６により裏打ちされていることがより好ましい。
前記メンブレン４における抗体固定化部としては、検体の有無を判定、すなわち陽性陰性を判定するための捕捉用抗体が固定化されたテストライン４１、および標識シリカ粒子により標識された全ての検体を捕捉する抗体が固定化されたコントロールライン４２を含むことが好ましい。

次に、上記各部材について説明する。
１）試料添加用部材（サンプルパッド）２
サンプルパッド２は検体を含むサンプルを滴下する構成部材である。
２）標識シリカナノ粒子含浸部材（コンジュゲートパッド）３
コンジュゲートパッド３は標識シリカナノ粒子が含浸された構成部材であり、サンプルパッド２から毛細管現象により移動してきた試料液体に含まれる検体が抗原抗体反応等の分子認識反応で、前記標識シリカ粒子によって捕捉され、標識される部分である。
コンジュゲートパッド３における単位面積（ｃｍ^２）当たりの前記標識シリカナノ粒子の含有量は特に制限ないが５０μｇ〜２ｍｇが好ましい。含浸方法としては、前記標識シリカ粒子の分散液を塗布、滴下ないしは噴霧後、乾燥する方法等が挙げられる。
３）抗体固定化メンブレン４
メンブレン４は前記シリカナノ粒子により標識された検体が毛細管現象によって移動する構成部材であり、固定化抗体―検体―標識シリカナノ粒子からなるサンドイッチ型免疫複合体形成反応が行われる抗体固定化部（判定部）を有する。
前記メンブレンにおける前記抗体固定化部（判定部）の形状としては局所的に捕捉用抗体が固定化されている限り特に制限はなく、ライン状、円状、帯状等が挙げられるが、ライン状であることが好ましく、幅０．５〜１．５ｍｍのライン状であることがより好ましい。
固定化抗体―検体―標識シリカナノ粒子からなるサンドイッチ型免疫複合体形成反応により抗体固定化部（判定部）に、前記シリカ粒子により標識された検体が捕捉され、形成された前記複合体中の前記シリカナノ粒子に由来する発色又は蛍光の程度により検体の有無を判定、すなわち陽性陰性を判定することができる。すなわち、前記抗体固定化部（判定部）に標識シリカ粒子が濃縮され、着色シグナルとして目視的に、又は検出機器を用いて検出、判定できる。
前記サンドイッチ型免疫複合体形成反応を充分に完了させるため、あるいは液体試料中の着色物質による測定への影響や検体と結合していない標識シリカナノ粒子による測定への影響を回避するため、メンブレンにおける判定部は、前記コンジュゲートパッドとの連結端及び前記吸収パッドとの連結端からある程度離れた位置（例えば、前記メンブレンの中程など）に設けておくことが好ましい。

前記抗体固定化部（判定部）における抗体固定化量は特に制限ないが、形状がライン状の場合、単位長さ（ｃｍ）当たりの０．５μｇ〜５μｇが好ましい。固定化方法としては、抗体溶液を塗布、滴下ないしは噴霧後、乾燥して物理吸着により固定化する方法等が挙げられる。
前述の抗体固定化後に、非特異的吸着による測定への影響を防止するために前記メンブレン全体をいわゆるブロッキング処理を施しておくことが好ましい。例えば、アルブミン、カゼイン、ポリビニルアルコール等のブロッキング剤を含有する緩衝液中に適当な時間浸漬した後乾燥する方法等が挙げられる。市販の前記ブロッキング剤としては、例えば、スキムミルク（ＤＩＦＣＯ社製）、４％ブロックエース（明治乳業社製）などが挙げられる。
４）吸収パッド５
吸収パッド５は、毛細管現象でメンブレンを移動してきた試料液体および標識シリカ粒子を吸収し、常に一定の流れを生じさせるための構成部材である。

これら各構成部材の材料としては特に制限は無く、イムノクロマト法用テストストリップに用いられる部材が使用できるが、サンプルパッドおよびコンジュゲートパッドとしてはＧｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）等のガラスファイバーのパッドが好ましく、メンブレンとしてはＨｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ１２０メンブレン（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）等のニトロセルロースメンブレンが好ましく、吸収パッドとしてはＣｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｆｉｂｅｒ Ｓａｍｐｌｅ Ｐａｄ（商品名、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）等のセルロースメンブレンが好ましい。
前記粘着剤付きバッキングシートとしては、ＡＲ９０２０（商品名、Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）等が挙げられる。
前記テストストリップの作製法としては、試料添加用部材（サンプルパッド）、標識シリカ粒子含浸部材（コンジュゲートパッド）、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの並び順に、各部材間で毛管現象を生じさせ易くするために、それら各部材の両端を隣接する部材と１〜５ｍｍ程度重ね合わせて（好ましくはバッキングシート上に）貼付することで作製することができる。

発色の程度の判定は、目視以外に例えば、プレテスターＲＭ−４０５、プレテスターＲＭ−５０５（いずれも商品名、和光純薬工業社製）等の尿試験紙用のテスター、例えばデンシトメーター等を用いて行ってもよいことはいうまでもない。
前記テストストリップは、手技の習熟していない一般需要者でも操作し易くし、かつＰＯＣＴの観点から、テストストリップの検出ラインを目視にて観察する観察窓のプラスチック材料等でハウジング（ケーシング）されていることが好ましい。例えば、特開２０００−３５６６３８等に記載されているハウジング等が挙げられる。

本発明のイムノクロマト法試薬としての前記標識シリカナノ粒子は、異なる種類の前記標識物質を含有させることにより様々な色相、蛍光波長等を付与することができる。そのようにして得られた２種類以上の標識シリカナノ粒子を用いることによって、例えば、前記テストストリップにおいて、２種類以上の検体を１回の操作で同時に検出、定量、判定又は診断することが可能である。
このとき、前記２種類以上の標識シリカナノ粒子は、それぞれ、異なる検体に対して分子認識する表面修飾物質で修飾されていることが必要である。
具体例としては、Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質を認識するマウス抗Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体で表面修飾された赤色色素（例えば、ローダミン）含有シリカナノ粒子と、
Ｂ型インフルエンザウイルス核タンパク質を認識するマウス抗Ｂ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体で表面修飾された青色色素（例えば、ＤＹＱ−６６０（商品名、Ｄｙｏｍｉｃｓ社製））含有シリカナノ粒子とからなるイムノクロマト法試薬、及びそれを用いてなるテストストリップ等が挙げられる。

前述の２種類以上の標識シリカナノ粒子からなるイムノクロマト法試薬及びそれを用いてなる前記テストストリップにおいて、同一の抗体固定化部における発色の色相の違いまたは蛍光波長の違いによって２種類以上の検体を同時に検出、定量、判定又は診断することができる。前記同一の抗体固定化部は、ライン状であることが好ましい。
従来のナノ粒子（例えば、金ナノ粒子）は単色しか発色できなかったり、単波長の蛍光しか発光できないことが多く、色相、発光波長が非常に限定されていた。そのため、イムノクロマト法に使用する場合、２種類以上の検体の検出、判定等を行うのが実質的には困難であり、別種の抗体を固定した抗体固定化部（判定部）をメンブレン上の離別した箇所に設けることが必要であった。近接した箇所に複数の抗体固定化部を設けると、単色発色のため又は限られた発光波長のため、いずれの検体に基づく発色ないしは発光シグナルか混同を生じることが多かった。
これに対し、前記標識シリカナノ粒子は、異なる種類の前記標識物質を含有させることにより様々な色相、蛍光波長等を付与することができるので、本発明のテストストリップにおいては、同一の抗体固定化部に複数種の抗体を固定して、複数種の検体を同時に検出、定量、判定又は診断することができる。
具体的には、例えば、検体Ａ及びＢを測定する場合、検体Ａを認識する抗体またはそのフラグメントで表面修飾された青色色素（例えば、ＤＹＱ−６６０（商品名、Ｄｙｏｍｉｃｓ社製））含有シリカナノ粒子と、検体Ｂに対する抗体またはそのフラグメントで表面修飾された黄色色素（例えば、フルオレセイン）含有シリカナノ粒子とを用いて、同一の抗体固定化部に検体Ａ及びＢに対する抗体を混在させて固定化したテストストリップとする。そのテストストリップのサンプルパッドに検体Ａ、Ｂを含有しえる未知の試料液体を滴下し、前記抗体固定化部を観察することによって検体の存否を判定することができる。上記の具体例では、反応ラインの色相が青であれば物質Ａが大半であり、逆に黄色であれば物質Ｂが大半であることを示し、ＡとＢがほぼ同量であれば緑の反応ラインが出現することになる。このように、物質ＡとＢの存在比によって、出現する反応ラインの色相が変化することを利用して、その色相を、目視又は検出機器により検出ないし定量することにより検体のお互いの存在比を測定することができる。
発色の程度が特定の色調より薄ければ陰性、濃ければ陽性としておけば、検体の半定量も可能である。また、発色の程度の判定は、例えば、プレテスターＲＭ−４０５、プレテスターＲＭ−５０５（いずれも商品名、和光純薬工業社製）等の尿試験紙用のテスター、例えばデンシトメーター等を用いて行ってよいことはいうまでもない。
ここで、「半定量」とは、定量分析を実施する場合には必ず定性分析が先行していなくてはならないが、定性分析を実施する場合にこれをやや定量的に行なって、量的概念をも付け加えて行う場合をいう。

次に、本発明のイムノクロマト法用蛍光検出システムについて説明する。
本発明のイムノクロマト法用蛍光検出システムは、前記標識物質として蛍光物質を含有してなるシリカナノ粒子をイムノクロマト法試薬として用いた場合、具体的には前述のようなテストストリップに用いた場合に使用することができる。
すなわち、本発明の蛍光検出システムは、少なくとも下記（１）及び（２）の構成からなる。
（１）サンプルパッド、蛍光物質を含有してなるシリカナノ粒子を含浸した部材（コンジュゲートパッド）、抗体固定化メンブレン及び吸収パッドからなるテストストリップ、及び
（２）励起光源。
前記テストストリップはバッキングシートにより裏打ちされていることが好ましい。
本発明の蛍光検出システムにおいて、前記シリカナノ粒子の部分が発する蛍光を目視等によって検出する観点から、前記励起光源が、波長２００ｎｍ〜４００ｎｍの励起光を発する。前記励起光源としては、水銀ランプ、ハロゲンランプ又はキセノンランプが挙げられる。
また、本発明の蛍光検出システムは、前記励起光源から特定の波長の光のみを透過するためのフィルタを備えており、さらに、蛍光のみを目視等で検出する観点から、前記励起光を除去し蛍光のみを透過するフィルタを備えている。
本発明の蛍光検出システムは、前記蛍光を受光する光電子倍増管又はＣＣＤ検出器を備えることが特に好ましく、これにより目視では確認できない強度ないしは波長の蛍光も検出でき、さらにはその蛍光強度を測定できることから検体の定量もでき、高感度検出及び定量が可能となる。

以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
参考例１（本発明に用いる標識シリカナノ粒子の調製）
５−（及び−６）−カルボキシテトラメチルローダミン・スクシンイミジルエステル（商品名、ｅｍｐ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ社製）２．９ｍｇを１ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。ここに１．３μｌのＡＰＳを加え、室温（２３℃）で１時間反応を行った。
得られた反応液４００μｌにエタノール１２８ｍｌ、ＴＥＯＳ４００μｌ、蒸留水２８．８ｍｌ、２８質量％アンモニア水４００μｌを加え、室温で２４時間反応を行った。
反応液を１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿したシリカ粒子に蒸留水を４ｍｌ加え、粒子を分散させ、再度１８０００×ｇの重力加速度で３０分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに２回繰り返し、標識シリカナノ粒子分散液に含まれる未反応のＴＥＯＳやアンモニア等を除去し、平均粒径１０４ｎｍのシリカナノ粒子１００．８ｍｇを得た。収率約９４％。
図２は、得られた標識シリカナノ粒子のＳＥＭ写真像を示す図である。図中、白く見える球形状物質が、得られた標識シリカナノ粒子である。

実施例１（ｈＣＧの検出）
遠心管に５０ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ６．５）を１ｍＬと前記ローダミン含有シリカナノ粒子分散液（１０ｍｇ／ｍＬ）９ｍＬを加えて軽く撹拌した。遠心管に抗ｈＣＧ抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ ｃｌｏｎｅ ｃｏｄｅｓ／５００８， Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）１ｍＬ（６０μｇ／ｍＬ）を撹拌しながら加え、室温で１時間静置し、抗ｈＣＧ抗体を前記シリカナノ粒子に吸着させた。これに１％ＰＥＧ（ポリエチレングリコール、分子量２００００、和光純薬工業社製）を０．５５ｍＬ加え軽く撹拌し、更に１０％ＢＳＡを１．１ｍＬ加え軽く撹拌した。
混合液を１２０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を１ｍＬ程度残して取り除き、残した上清に沈殿を分散させた。この分散液に保存用バッファー（２０ｍM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．２）， ０．０５％ ＰＥＧ２０，０００， １５０ｍＭ ＮａＣｌ， １％ＢＳＡ， ０．１％ＮａＮ_３）を２０ｍＬ加え、再度遠心分離し、上清を１ｍＬ程度残して取り除き、残した上清に沈殿を分散させた。この分散液に蒸留水１ｍＬおよび塗布バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）， ０．０５％ＰＥＧ（分子量２０，０００）， １５０ｍＭ ＮａＣｌ， １％ＢＳＡ， ０．１％ＮａＮ_３）を２ｍＬ加え、軽く撹拌した。
得られた抗体を吸着させてなるシリカナノ粒子分散液をＧｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ（ＧＦＣＰ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）(８×１５０ｍｍ)１枚あたり、上記分散液０．８ｍＬを均等に塗布した。デシケーター内で室温下、一夜減圧乾燥し、参考例１で得られたシリカナノ粒子を含有してなるコンジュゲートパッドを作製した。

抗体固定化メンブレンの作製については、メンブレン（丈２５ｍｍ、商品名Ｈｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ１２０ メンブレン、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）の中央付近（端から約１２ｍｍ）に幅約１ｍｍのテストラインとして抗ｈＣＧ抗体（ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ＦＳＨ（ＬＨ）， ｃｌｏｎｅ ｃｏｄｅ／６６０１、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）が１ｍｇ／ｍＬ含まれる溶液（（５０ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４，ｐＨ７．０）＋５％スクロース）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した。
続いて、幅約１ｍｍのコントロールラインとして抗ＩｇＧ抗体（Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ、Ｄａｋｏ社製）が１ｍｇ／ｍＬ含まれる溶液（（５０ｍＭＫＨ_２ＰＯ_４，ｐＨ７．０）シュガー・フリー）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布し、５０℃で３０分乾燥させた。
次に、ブロッキング処理として前記メンブレン全体をブロッキングバッファー中に室温で３０分浸した。
メンブレン洗浄／安定バッファーに移し室温で３０分以上静置した。メンブレンを引き上げ、ペーパータオル上に置いて室温で一夜乾燥させて、抗体固定化メンブレンを作製した。
前記得られたメンブレン、前記得られたコンジュゲートパッド、サンプルパッド（Ｇｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ（ＧＦＣＰ）、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）、吸収パッド（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｆｉｂｅｒ Ｓａｍｐｌｅ Ｐａｄ（ＣＦＳＰ）（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）をバッキングシート（商品名ＡＲ９０２０，Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）上で組み立て、５ｍｍ幅、長さ６０ｍｍのストリップ状に切断し、図１ａ及びｂに示した構成のテストストリップを得た。図１ａ及びｂについては前述の通りである。
なお、各構成部材は、図１ａ及びｂに示しているように各々その両端を隣接する部材と２ｍｍ程度重ね合わせて貼付した（以下、同様である。）。
５０ＩＵ／ＬのリコンビナントｈＣＧ（ロート製薬社製）を前記ストリップのサンプルパッド部分に１００μＬ滴下し、一分間放置したところ、抗ｈＣＧ抗体（ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ＦＳＨ（ＬＨ）， ｃｌｏｎｅ ｃｏｄｅ／６６０１、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）を塗布したライン（テストライン）および、抗ＩｇＧ抗体を塗布したライン（コントロールライン）に赤色の発色が確認できた。

実施例２（同一ラインで複数の生体分子を検出）
参考例１の方法でローダミン含有シリカナノ粒子を調製した（平均粒径１０１ｎｍ、収率９０％）。またＤＹＱ−６６０−ＮＨＳ−Ｅｓｔｅｒ（Ｄｙｏｍｉｃｓ社製）を用いて、参考例１と同様の方法でＤＹＱ−６６０含有シリカナノ粒子を調製した。続いて、実施例１と同様の方法で、ローダミン含有シリカナノ粒子にはマウス抗Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体を吸着により表面修飾し、ＤＹＱ−６６０含有シリカナノ粒子にはマウス抗Ｂ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体で吸着により表面修飾した。
コンジュゲートパッド（Ｇｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ（ＧＦＣＰ）、８×１５０ｍｍ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）にマウス抗Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体で吸着により表面修飾されたローダミン含有シリカナノ粒子分散液０．８ｍＬを均等に塗布し、これをデシケーターに入れて一晩減圧乾燥した。続いて、同じコンジュゲートパッドにマウス抗Ｂ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体で吸着により表面修飾されたＤＹＱ−６６０含有シリカナノ粒子分散液０．８ｍＬを均等に塗布し、これをデシケーターに入れて一晩減圧乾燥した。これにより、ローダミンを含有したシリカナノ粒子及びＤＹＱ−６６０を含有したシリカナノ粒子を含浸してなるコンジュゲートパッドを作製した。
続いて、抗体固定化メンブレンの作製については、メンブレン（丈２５ｍｍ、商品名Ｈｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ１２０ ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）の中央付近（端から約１２ｍｍ）に幅約１ｍｍのテストラインとしてマウス抗A型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体とマウス抗Ｂ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体がそれぞれ１ｍｇ／ｍＬ含まれる溶液を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布し、５０℃で３０分乾燥させた。さらに、コントロールラインとして、抗マウス抗体ウサギポリクローナル抗体（１ｍｇ／ｍＬ）を０．７５μＬ／ｃｍの塗布量で塗布し５０℃で３０分乾燥させた。
前記得られたメンブレン、前記得られたコンジュゲートパッド、サンプルパッド（Ｇｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ（ＧＦＣＰ）、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）、吸収パッド（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｆｉｂｅｒ Ｓａｍｐｌｅ Ｐａｄ（ＣＦＳＰ）（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）をバッキングシート（商品名ＡＲ９０２０，Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）上で組み立て、５ｍｍ幅、長さ６０ｍｍのストリップ状に切断し、図１ａ及びｂに示した構成のテストストリップを得た。図１ａ及びｂについては前述の通りである。
前記テストストリップを２本用意し、一方のテストストリップにはＡ型インフルエンザウイルスを５×１０^２ＦＦＵ／ｍＬ含む液を滴下し、一分間静置した。もう一方のテストストリップにはＢ型インフルエンザウイルスを５×１０^２ＦＦＵ／ｍＬ含む液を滴下し、一分間静置した。Ａ型インフルエンザウイルスを含む液を滴下したテストストリップはラインが赤に発色し、Ｂ型インフルエンザウイルスを含む液を滴下したテストストリップはサンプルラインが青に発色した。

実施例３（蛍光高感度検出）
参考例１と同様の方法でフルオレセインを含有したシリカ粒子を調製し（平均粒径９３ｎｍ、収率８８％）、実施例１と同様の方法で抗ｈＣＧ抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ ｃｌｏｎｅ ｃｏｄｅｓ／５００８， Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）を用いて吸着により表面修飾した。実施例１と同様に、前記抗ｈＣＧ抗体で吸着により表面修飾したフルオレセイン含有シリカナノ粒子０．８ｍｌをＧｌａｓｓ Ｆｉｂｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｐａｄ（ＧＦＣＰ、８×１５０ｍｍ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）に塗布し、これをデシケーターに入れて一晩減圧乾燥させた。これにより、フルオレセインを含有したシリカナノ粒子を含有してなるコンジュゲートパッドを作製した。
実施例１と同様に、テストラインとして抗ｈＣＧ抗体（ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ＦＳＨ（ＬＨ）， ｃｌｏｎｅ ｃｏｄｅ／６６０１、Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）、コントロールラインとして抗ＩｇＧ抗体（Ａｎｔｉ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ、Ｄａｋｏ社製）が塗布されたメンブレン（Ｈｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ１２０ ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）、コンジュゲートパッド、吸収パッド（ＣＦＳＰ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）、サンプルパッド（ＧＦＣＰ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）をバッキングシート（商品名ＡＲ９０２０，Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）上で組み立て、５ｍｍ幅、長さ６０ｍｍのストリップ状に切断し、図１ａ及びｂに示した構成のテストストリップを得た。図１ａ及びｂについては前述の通りである。
前記テストストリップのサンプルパッドに０．５ＩＵ／ＬのリコンビナントｈＣＧ（ロート製薬社製）を１００μＬ滴下して、一分間静置した。
励起光源側のフィルタとしてＦＦ０１−４８２（商品名、Ｓｅｍｒｏｃｋ社製）、検出器側のフィルタとしてＦＦ０１−５３６（商品名、Ｓｅｍｒｏｃｋ社製）を用い、前記テストストリップを水銀ランプ（１０３Ｗ）で照射し、検出器としてＣＣＤ検出器（Ｃ２７４１−３５Ａ（商品名、浜松ホトニクス社製））を用いて画像化を行った。その結果テストラインおよびコントロールラインの蛍光発色を確認した。
上記実施例３の結果から実施例１の目視による検出の検体（コンビナントｈＣＧ）量の１００分の１の量でも検出され、蛍光による高感度検出が可能であることがわかる。

図１ａは本発明のイムノクロマト法用テストストリップの平面図を示し、図１ｂは、ａで示されたイムノクロマト法用テストストリップの平面図の縦断面図を示す図である。 図２は、得られた標識物質を含有するシリカナノ粒子のＴＥＭ写真像を示す図である。

符号の説明

１ テストストリップ
２ サンプルパッド
３ コンジュゲートパッド
４ 抗体固定化メンブレン
５ 吸収パッド
６ バッキングシート

Claims (7)

1. 蛍光物質または吸光物質からなる標識物質を含有してなる平均粒径２０〜６００ｎｍのシリカナノ粒子であって、検体を認識する物質で表面修飾され、かつポリエチレングリコール及びウシ血清アルブミンを結合してなることを特徴とするイムノクロマト法用標識試薬シリカナノ粒子。
2. 前記検体を認識する物質、前記ポリエチレングリコール及び前記ウシ血清アルブミンを順次吸着させることによって得られることを特徴とする、請求項１に記載のイムノクロマト法用標識試薬シリカナノ粒子。
3. 標識物質を含有してなる平均粒径２０〜６００ｎｍのシリカナノ粒子であって、検体を認識する物質で表面修飾され、かつポリエチレングリコール及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を結合してなるイムノクロマト法用標識試薬シリカナノ粒子を含浸し、乾燥してなることを特徴とするイムノクロマト法用コンジュゲートパッド。
4. 前記検体を認識する物質、前記ポリエチレングリコール及び前記ウシ血清アルブミンを順次吸着させることによって得られるイムノクロマト法用標識試薬シリカナノ粒子を用いてなることを特徴とする請求項３に記載のイムノクロマト法用コンジュゲートパッド。
5. 前記イムノクロマト法用標識試薬シリカナノ粒子の含有量が、単位面積（ｃｍ^２）当たり５０μｇ〜２ｍｇであることを特徴とする請求項３又は４に記載のイムノクロマト法用コンジュゲートパッド。
6. 試料添加用部材、請求項３〜５のいずれか１項に記載のイムノクロマト法用コンジュゲートパッド、抗体溶液を塗布、滴下ないしは噴霧後、乾燥して物理吸着により固定化した抗体固定化部を有するメンブレン及び吸収パッドがこの順に直列連結してなり、前記抗体固定化部の形状が幅０．５〜１．５ｍｍのライン形状であり、前記抗体固定化部における単位長さ（ｃｍ）当りの抗体固定化量が０．５μｇ〜５μｇであるイムノクロマト法用テストストリップ。
7. 標識物質として蛍光物質を含有したイムノクロマト法用標識試薬シリカナノ粒子を用いてなるイムノクロマト法用テストストリップであって、前記蛍光が、青色蛍光、黄色蛍光、オレンジ色蛍光又は赤色蛍光であることを特徴とする請求項６に記載のイムノクロマト法用テストストリップ。