JP4347554B2

JP4347554B2 - 生体組織補填材を用いた感染検査の検体製造方法

Info

Publication number: JP4347554B2
Application number: JP2002293569A
Authority: JP
Inventors: 浩樹日比野; 裕児高宮
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2002-10-07
Filing date: 2002-10-07
Publication date: 2009-10-21
Anticipated expiration: 2022-10-07
Also published as: JP2004121732A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、例えば、骨欠損部などの生体組織欠損部を再生する際に使用される生体組織補填体の感染検査を行うのに最適な、生体組織補填材を用いた感染検査の検体製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、骨腫瘍摘出や外傷等により生じた骨欠損部等の生体組織欠損部に骨補填材等の生体組織補填材を補填することにより、骨等の生体組織を再生させて骨欠損部等を修復することが可能になってきている。
【０００３】
例えば、骨補填材としては、ハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）やリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）が知られているが、体内に異物を残さないとする考え方から、β−ＴＣＰのようなリン酸カルシウム多孔体からなる足場材が使用される。このβ−ＴＣＰを骨欠損部の骨細胞に接触させておくと、破骨細胞と骨芽細胞により、いわゆるリモデリングが行われ、骨欠損部に補填された骨補填材は、経時的に自家骨に置換されてゆく（例えば、非特許文献１参照。）。
【０００４】
一方、術後の骨欠損部の修復速度を高めるために、骨補填材をそのまま用いるのではなく、患者から採取した骨髄間葉系細胞を骨補填材を共に培養してから、骨欠損部に補填することが行われている。この場合、培養された骨補填体を骨欠損部に補填することになるが、補填するに先だって、例えば、ＨＩＶ（ヒトエイズウイルス）、ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）等の感染がないか否かを感染検査により確認する必要があり、ウイルスの感染がなかったことを確認してから骨補填体を補填することが望まれている。
【０００５】
【非特許文献１】
植村他２名，「生分解性β−ＴＣＰ多孔材料を用いた骨におけるティッシュエンジニアリング−生体内で強度を増す新しい材料オスフェリオン−」，メディカル朝日，朝日新聞社，２００１年１０月１日，第３０巻，第１０号，ｐ．４６−４９
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、このような感染検査を行う場合に、補填される骨補填体の培養液から浮遊微生物を取り出して検査を行うこともできるが、このようにすると検査の対象となる骨補填体に付着している付着細胞自体と、補填される骨補填体に付着している付着細胞とは異なることとなるため、沢山の培養液を検査する必要が有るため、コストアップになっていた。
【０００７】
また、補填前の骨補填体表面から細胞を採取することも考えられるが、採取の際の感染防止対策を施す必要があり、作業工数が増加するという問題がある。
そこで、この発明は、補填される生体組織補填体の細菌やウイルス等微生物の感染の有無を正確に検査することを可能とする生体組織補填材を用いた感染検査の検体製造方法を提供するものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するために、本発明の生体組織補填材を用いた感染検査の検体製造方法は、細胞含有液を付着させることにより細胞を付着させて生体組織補填体を製造する多孔質生体親和材料からなる生体組織補填材（例えば、実施形態における骨補填材１０）の表面に、他の生体組織補填材（例えば、実施形態における骨補填材１１）を載置し、これらに細胞を付着させて複数の生体組織補填体（例えば、実施形態における骨補填体１０Ａ，１１Ｂ）を製造して、少なくとも２つの生体組織補填体を分離し、分離された一方を感染検査用の検体とすることを特徴とする。
このように構成することで、他の生体組織補填体を検体として使用する場合には両者を分離させれば済むこととなる。
【００１４】
請求項２に記載した発明は、上記の生体組織補填材を用いた感染検査の検体製造方法において、前記生体組織補填材の一方が顆粒状の生体組織補填材（例えば、実施形態における骨補填材１１）であることを特徴とする。
このように構成することで、検査の後廃棄する生体組織補填体は顆粒状の小さなものとなる。
【００１５】
請求項３に記載した発明は、上記の生体組織補填材を用いた感染検査の検体製造方法において、前記生体組織補填材の双方がブロック状の生体組織補填材であることを特徴とする。
このように構成することで、各生体組織補填材の合わせ面が同一の形状の生体組織補填材体を用いることが可能となる。
【００１６】
請求項４に記載した発明は、上記の生体組織補填材を用いた感染検査の検体製造方法において、細胞含有液を付着させることにより細胞を付着させて生体組織補填体を製造する多孔質生体親和材料からなる少なくとも２つの生体組織補填材（例えば、実施形態における骨補填材１２，１３）を隣接させ、これら隣接する２つの生体組織補填材の一面（例えば、実施形態における一面Ｆ）を重合させた状態でクランプし、クランプされた状態の複数の生体組織補填材に細胞含有液を付着させることにより細胞を付着させて複数の生体組織補填体（例えば、実施形態における骨補填体１２Ａ，１３Ｂ）を製造し、クランプを解除することにより分離された一つの生体組織補填体（例えば、実施形態における骨補填体１３Ｂ）を感染検査用の検体とすることを特徴とする。
このように構成することで、生体組織補填体を製造する場合に、両者を一体である場合と同様の条件で製造できるため、分離した場合における両者の培養された細胞の同一性を最高度に高めることができる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、この発明の実施形態を図面と共に説明する。
先ず、骨補填材を用いて骨補填体を製造する工程について概略的に説明する。図３に示すように、患者の腸骨等から骨髄液を採取し、採取された骨髄液を遠心分離機にかけて、比重の重い骨髄細胞を抽出する。
【００１８】
抽出された骨髄細胞は、予め調製されている培地とともに培養容器内に投入され混合される。培地の一部は取り出されて感染検査に回される。
この後に、混合された骨髄液及び培地を所定の温度（例えば、３７±０．５℃）及びＣＯ_２濃度（例えば、５％）等の培養条件に維持し、所定時間にわたって一定培養条件下で細胞が一次培養される。細胞の培養途中の所定の交換時期には、培養容器内から培地が廃棄される。そして、再度培地を混合されて培養工程が繰り返し継続される。廃棄された培地の一部は感染検査に回される。
【００１９】
所定の培養期間が終了すると、培養容器内から培地が廃棄された後に、培養容器内にトリプシンのような蛋白質分解酵素が投入・混合される。これにより、培養容器の底面に付着して成長していた間葉系幹細胞が、主培養容器の底面から剥離され、この剥離された間葉系幹細胞は、遠心分離機にかけられることにより抽出される。
【００２０】
抽出された間葉系幹細胞は、細胞数調整が行われた後に、骨補填材と適当な培地が投入された培養容器内に混合される。実際には、間葉系幹細胞を骨補填材に付着させて培地内に投入する。そして、上記と同様にして、混合された間葉系幹細胞と培地を所定の温度（例えば、３７±０．５℃）及びＣＯ_２濃度（例えば５％）等の培養条件に維持することにより、所定時間にわたって一定培養条件下で細胞が二次培養される。
【００２１】
二次培養工程においても、一次培養工程と同様にして、定期的に培地の交換が行われ、投入される培地の一部及び廃棄される培地の一部がそれぞれ、感染検査に回される。そして、所定の培養期間が経過したところで、出荷用の品質検査と感染検査のための検体抽出が行われ、製造された骨補填体は密封されて製品として提供される。
【００２２】
ここで、培地としては、例えば、ＭＥＭ(Minimal Essential Medium：最小必須培地)、ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum：ウシ胎児血清）、抗生剤を所定の配合比率で混合したものを用いている。また、成長因子、例えば、サイトカイン、濃縮血小板、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦやこれらを複合させたもの等の成長に寄与する物質を混合することにしてもよい。更に、エストロゲン等のホルモン剤や、ビタミン等の栄養剤を混合することにしてもよい。ウシ胎児血清に代えてヒト血清を用いてもよい。
更に、抗生剤としては、ペニシリン系抗生物質の他、セフェム系、マクロライド系、テトラサイクリン系、ホスホマイシン系、アミノグリコシド系、ニューキノロン系等任意の抗生物質を採用することができる。
【００２３】
次に、この発明の参考例の生体組織補填材について説明する。
図１はこの発明の第１参考例の骨補填材を示す斜視図である。この骨補填材（生体組織補填材）１は特許第２５９７３５５号公報に示されている方法（メカノケミカル法）により製造されたものである。通常、骨補填材１は直方体、ペレット状、顆粒状に形成され、骨髄液が付与された後に骨欠損部に補填されるために用いられるものであるが、この実施形態では外力を印加した場合に少なくとも２つに容易に分割可能に構成されている。ここで、骨補填材１の主成分はβ−ＴＣＰ（多孔性生体親和材料であるベータリン酸三カルシウム）である。
尚、骨補填材１は、生体組織に親和性のある材料であれば任意のものでよく、生体吸収性の材料であれば更に好ましい。特に、生体適合性を有する多孔性のセラミックスや、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒアルロン酸、又はこれらの組合せを用いてもよい。また、チタンの様な金属であってもよい。
【００２４】
骨補填材１は図１に示すように一側が長い略直方体形状に形成され、その分割部分、つまり長手方向中央部に分割を容易にする切込部２が設けられたものである。
切込部２は直方体の骨補填材１の長手方向中央部分に断面三角形状の連結部３（ハッチングで示す）を残してほぼ全周に渡って形成されている。このように角断面形状のコーナー部分に面積の小さな前記連結部３を残していることから、外力を加えた場合に簡単に手間をかけずに折ることができ、また、連結部３の断面積が小さいため、切込部２を挟んで対面する部位の表面積を広く確保して間葉系幹細胞の付着面積を大きく確保できる。
【００２５】
ここで、上記切込部２は骨補填材１が外力により２つに分割することができれば、その形状は上述したものに限られない。例えば、図２に示す切込部２のように直方体形状の骨補填材１の長手方向中央部分に断面四角形状の連結部４（ハッチングで示す）を残して全周に渡って形成するようにしてもよい。
図２に示すように角断面形状の中央部分に面積の小さな断面四角形状の連結部４を残した場合には、骨補填材１が連結部４回りで対称形状となり２つに折る場合にも向きを選ばなくてもよく、また、培養の際の載置姿勢に方向性がなくなり作業が行い易い。
【００２６】
したがって、第１参考例によれば、前記二次培養工程において上記骨補填材１が用いられ、所定の培養期間が経過した後、外力を印加して上記骨補填材１を各切込部２を起点として連結部３あるいは連結部４で分割できる。これにより、同一条件で培養された２つの骨補填体１Ａ，１Ｂを得ることができる。
その結果、図４に示すように一方を欠損部５への補填用の骨補填体１Ａとし、他方を感染検査用の検体としての骨補填体１Ｂとして使用することが可能となる。よって、補填用の骨補填体１Ａと検体用の骨補填体１Ｂの細胞の条件を完全に一致させることができ、検体による検査結果がそのまま補填用として使用される一方の骨補填体１Ａの検査結果として信頼できる精度の高いものとなる。
【００２７】
また、補填用の骨補填体１Ａは補填される前に検査の必要がなくなるため、清潔性を損なうことがなくなり、骨補填体１Ａの信頼性を高めることができる。そして、感染検査が終了した一方の検体である骨補填体１Ｂはそのまま保存することで、補填された生体内の骨補填体１Ａの培養度合いを知る上でのサンプルとなり有用価値の高いものとなる。
【００２８】
図５はこの発明の第２参考例の骨補填材を示す斜視図である。
この参考例では、骨補填材１は骨補填材本体６とこの骨補填材本体６から突出する検査用片部７とで構成され、外力を印加した場合に少なくとも２つに分割可能に構成されているものである。
具体的には、直方体形状の骨補填材本体６の一側縁に断面台形状の検査用片部７が設けられ、この検査用片部７は基部に行く程断面積が小さくなり、ここがくびれ部８として形成されている。そのため、このくびれ部８において簡単に検査用片部７を折ることができる。
【００２９】
したがって、この参考例によれば、上記参考例の効果に加え、二次培養が終了した骨補填体１は検査用片部７を折ることで、簡単に補填用の骨補填体本体６Ａと検体用として使用される検査用片７Ｂを分割して得ることが可能となる。また、検査用片７Ｂは骨補填体本体６Ａに比較して小さいため検査の後廃棄する骨補填材１の無駄をできる限り少なくすることができる。
【００３０】
尚、検査用片部７の断面形状は断面台形状に限られず、図６に示すように断面四角形状として、補填用の骨補填材本体６’と検体用として用いられる検査用片部７’との接続部分に両側から凹部９、９を形成し、ここにくびれ部８を設け、このくびれ部８で両者を骨補填体本体６’Ａと検査用片７’Ｂとに分割できるようにしてもよい。
【００３１】
また、上述した特殊な形状の骨補填材１を用いて、検体用と補填用の骨補填体を製造する方法によれば、培養された間葉系幹細胞が付着した骨補填体１Ａあるいは骨補填体本体６Ａ，６’Ａの出荷と検体用として使用される分割された他方の骨補填体１Ｂあるいは検査用片７Ｂ、７’Ｂの細菌等の感染検査を同時に行い、検体の検査結果に基づいて、骨補填体１Ａあるいは骨補填体本体６Ａ，６’Ａの到着と同時に速やかに補填できるため、骨補填体の培養から補填までの一連の作業を速やかに行うことができる。
【００３２】
次に、図７，図８に基づいて骨補填材を用いた感染検査の検体製造方法について説明する。
前述した参考例の骨補填材を用いた感染検査の検体製造方法では、二次培養後の骨補填体を分割するために、外力を印加する工程が必要であるが、以下に示す骨補填体の製造方法では、より簡単に感染検査の検体を製造することができる。
【００３３】
図７に示すように、立方体形状の骨補填材１０の上面に、顆粒状の骨補填材１１を載置し、これらに二次培養によりに間葉系幹細胞を付着させて立方体形状の骨補填体１０Ａと顆粒状の骨補填体１１Ｂを製造し、顆粒状の骨補填体１１Ｂを分離し、分離された顆粒状の骨補填体１１Ｂを感染検査用の検体とするものである。したがって、二次培養が終了して立方体形状の骨補填体１０Ｂを補填用として使用し、顆粒状の骨補填体１１Ｂをそのまま取り出すことで感染検査の検体を得ることができるため、外力を加える等の作業が必要なくなり、無菌袋内などでの分離作業が行い易くなる。また、顆粒状の骨補填体１１Ｂを検体として用いることで検査の後廃棄する骨補填体１１Ｂは小さなものとなるため、無駄を最小限に抑えることができる。更に、顆粒状の骨補填材１１Ｂは接地部分がほぼ点となるため、取り出した載置場所に間葉系幹細胞の未付着部が残らない点で有利である。
【００３４】
また、図８に示すように、感染検査用の検体となる顆粒状の骨補填材１１，１１・・・を補填用の骨補填材１０の複数の表面に複数個つつ配置するようにしてもよい。このようにすることで、感染検査用の検体となる複数個の顆粒状の骨補填体１１Ｂ，１１Ｂ・・・を簡単に得ることができ、補填後の骨補填体１０Ａの培養状況等を確認するサンプルとして複数の顆粒状の骨補填体１１Ｂを例えば立方体形状の骨補填体１０Ａの各面毎に得ることができる等のメリットがある。
ここで、顆粒状の骨補填材１１に替えてブロック状の骨補填材を重ねるようにして載置して用いることもできる。このようにすれば、例えば同一形状の骨補填材１０を用いることができるメリットがある。
【００３５】
次に、図９、図１０に基づいて骨補填材を用いた感染検査の検体製造方法の他の実施形態について説明する。
この感染検査の検体製造方法に用いられる骨補填材は図９、図１０に示すように共にブロック状、具体的には直方体形状の骨補填材１２，１３である。各骨補填材１２，１３は互いにその一面Ｆを他の骨補填材と整合することができる形状のもので、この実施形態では各骨補填材が断面形状が同一の直方体で、骨補填材１２が骨補填材１３より大きいものとなっている。尚、両者とも同一形状の骨補填材としてもよい。
【００３６】
先ず、２つの骨補填材１２，１３を隣接させ、これら隣接する２つの骨補填材１２，１３の一面Ｆを重合させた状態で図示しないクランプ装置により加圧して両者をクランプする。そして、クランプされた状態のまま、前記二次培養工程において上記クランプされたままの両骨補填材１２，１３を用いて播種がなされ、所定の培養期間が経過したところで、クランプ装置によるクランプを解除し一つの骨補填体１３Ｂを感染検査用の検体として使用する。もう一方の骨補填体１２Ａは補填用として用いられる。その結果、両骨補填体１２Ａ，１３Ａを製造する場合に、両者を一体である場合と同様の条件で製造できるため、分離した場合における両者の培養された細胞の同一性を最高度に高めることができ、したがって、補填される骨補填体１２Ａと検体用の骨補填体１３Ｂとの同一性が確保され信頼性を高めることができる。
【００３７】
尚、この発明は上記実施形態に限られるものではなく、例えば、図１，図２に示す骨補填材１は２つに分割する構造のものであるが、３つ以上に分割できる構造のものであってもよい。
また、上記実施形態においては、生体組織として骨を例に挙げ、骨髄液から抽出して培養した間葉系幹細胞を培養する場合について説明したが、骨髄液のみならず末梢血や臍帯血から抽出することにしてもよい。
【００３８】
【発明の効果】
以上説明してきたように、本発明の生体組織補填材を用いた感染検査の検体製造方法によれば、他の生体組織補填体を検体として使用する場合には両者を分離させれば済むこととなるため、作業が行い易いという効果がある。
【００４５】
請求項２に記載した発明によれば、検査の後廃棄する生体組織補填材は顆粒状の小さなものとなるため、無駄を最小限に抑えることができる効果がある。
【００４６】
請求項３に記載した発明によれば、合わせ面が同一の形状の生体組織補填材を用いることが可能となるため、異なる形状のものを使用した場合に比較して両者を同一培養条件下に置くことができる効果がある。また、補填される生体組織補填体と検体とが同一形状である場合には、術後の経過を検体から知る際には補填されたものの状態を最も正確に再現できサンプルとしての価値が大きいという効果がある。
【００４７】
請求項４に記載した発明によれば、生体組織補填体を製造する場合に、両者を一体である場合と同様の条件で製造できるため、分離した場合における両者の培養された細胞の同一性を最高度に高めることができ、したがって、補填される生体組織補填体と検体との同一性が確保され信頼性を高めることができる効果がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の第１参考例の骨補填材を示す斜視図である。
【図２】図１の他の態様を示す骨補填材の斜視図である。
【図３】この発明の実施形態の培養工程の説明図である。
【図４】この発明の第１参考例の培養後の骨補填体が補填用と検体用に使用される状況を示す説明図である。
【図５】この発明の第２参考例の骨補填材を示す斜視図である。
【図６】図５の他の態様を示す側面図である。
【図７】この発明に係る生体組織補填材を用いた感染検査の検体製造方法に使用される骨補填材の斜視図である。
【図８】図７の他の態様を示す斜視図である。
【図９】この発明に係る生体組織補填材を用いた感染検査の検体製造方法に使用される骨補填体を示す説明図である。
【図１０】この発明に係る他の生体組織補填材を用いた感染検査の検体製造方法を示す説明図である。
【符号の説明】
１，１０，１１，１２，１３骨補填材（生体組織補填材）
２切込部
６，６’ 骨補填材本体
７，７’ 検査用片部
８くびれ部
１０Ａ，１１Ｂ骨補填体本体（生体組織補填体）
１２Ａ，１３Ｂ骨補填体（生体組織補填体）

Claims

細胞含有液を付着させることにより細胞を付着させて生体組織補填体を製造する多孔質生体親和材料からなる生体組織補填材の表面に、他の生体組織補填材を載置し、これらに細胞を付着させて複数の生体組織補填体を製造して、少なくとも２つの生体組織補填体を分離し、分離された一方を感染検査用の検体とすることを特徴とする生体組織補填材を用いた感染検査の検体製造方法。
前記生体組織補填材の一方が顆粒状の生体組織補填材であることを特徴とする請求項１に記載の生体組織補填材を用いた感染検査の検体製造方法。
前記生体組織補填材の双方がブロック状の生体組織補填材であることを特徴とする請求項１に記載の生体組織補填材を用いた感染検査の検体製造方法。
細胞含有液を付着させることにより細胞を付着させて生体組織補填体を製造する多孔質生体親和材料からなる少なくとも２つの生体組織補填材を隣接させ、これら隣接する２つの生体組織補填材の一面を重合させた状態でクランプし、クランプされた状態の複数の生体組織補填材に細胞含有液を付着させることにより細胞を付着させて複数の生体組織補填体を製造し、クランプを解除することにより分離された一つの生体組織補填体を感染検査用の検体とすることを特徴とする生体組織補填材を用いた感染検査の検体製造方法。