JP4342048B2

JP4342048B2 - 抗生物質ツベラクトマイシンｂ、ｄおよびｅとその製造法

Info

Publication number: JP4342048B2
Application number: JP22930699A
Authority: JP
Inventors: 富雄竹内; 雅之五十嵐; 博長縄; 雅浜田
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1999-08-13
Filing date: 1999-08-13
Publication date: 2009-10-14
Anticipated expiration: 2019-08-13
Also published as: JP2001055386A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は抗菌活性を有する新規な抗生物質であるツベラクトマイシンＢ、ツベラクトマイシンＤおよびツベラクトマイシンＥに関し、またこれらのツベラクトマイシンＢ、ＤおよびＥの製造法に関する。さらに本発明は、これらのツベラクトマイシンＢ、Ｄ、Ｅまたはその塩を有効成分とする抗菌剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細菌感染症の化学療法、特に抗酸性菌の感染症の化学療法においてリファンピシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、カプレオマイシン、サイクロセリン等の抗生物質が使用されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
細菌感染症の化学療法において、細菌が薬剤耐性になることは重大な問題である。特に抗酸性菌感染症の化学療法においてリファンピシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、カプレオマイシン、エンビロマイシン、サイクロセリン等に耐性な抗酸性菌が出現し社会的問題となっており、薬剤耐性抗酸性菌による感染症に有効な化学療法剤が強く望まれている。そのため、従来使用されている既知の抗生物質とは異なる化学構造を有し、且つ優れた抗菌活性と性質を示す新しい化合物の発見または創製が強く望まれている。本発明は、上記の要望に応える優れた抗菌活性を持つ新規な抗生物質を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
既に本発明者らは、ノカルディア・エスピーMK703-102F1株により生産されて抗酸性菌に対し強い抗菌力を示す抗生物質ツベラクトマイシン（特願平10-15388号、1998年１月28日出願）を見い出している。
【０００５】
ツベラクトマイシンは次式（Ａ）

で表される化合物である。
【０００６】
さらに、本発明者らは有用な抗生物質を発見すべく研究を行い、その結果、ノカルディア属に属するツベラクトマイシン生産菌により新しい構造骨格を有する３種の抗生物質が前記のツベラクトマイシンとは別個に生産されていることを今回、見い出した。これらの３種の新しい抗生物質が抗酸性菌並びにその薬剤耐性菌に抗菌活性を示すことを見い出した。さらに研究を続けてこれら３種の抗生物質を分析することにより、それらの化学構造を決定した。そしてそれら３つの抗生物質がツベラクトマイシンと共通な骨格を有するが新規な化合物であることを確認し、それぞれに後記の式（I）、（II）および（III）により表せることを知見し、ツベラクトマイシンＢ、ツベラクトマイシンＤおよびツベラクトマイシンＥと命名した。
【０００７】
本発明は、ノカルディア属に属する微生物を培養して得られ、本発明者らによりツベラクトマイシンＢ、ツベラクトマイシンＤおよびツベラクトマイシンＥとそれぞれ命名された新規物質を提供するものであり、またそれらの製造法について提供するものである。さらに、本発明は、ツベラクトマイシンＢ、ツベラクトマイシンＤおよびツベラクトマイシンＥまたはそれらの塩を有効成分とする抗菌剤を提供するものである。
【０００８】
すなわち、第１の本発明によると、次式（I）

で表される抗生物質ツベラクトマイシンＢが提供される。
【０００９】
本発明による式（Ｉ）のツベラクトマイシンＢの理化学的性状は、次の通りである。
（１）外観
無色粉末
（２）分子式
C₂₉H₄₄O₄
（３）高分解能質量分析（HRFABMS：陽イオンモード）
実験値 456.3242 (M)^＋
計算値 456.3240
（4）比旋光度
[α] _D ²⁵+85.4゜ (ｃ 0.63、MeOH)
（5）紫外線吸収スペクトル（メタノール中）
λmax nm (ε)：233 (21,500, sh), 240 (28,800), 248 (16,900, sh)添付図面の図1に示す。
（6）赤外線吸収スペクトル
添付図面の図2に示す通り。
（7）プロトン核磁気共鳴スペクトル
500MHzにおいて重アセトン中で室温にて測定したプロトンNMRスペクトルは、添付図面の図3に示す通りである。
【００１０】
（8）炭素13核磁気共鳴スペクトル
125MHzにおいて重クロロホルム中で室温にて測定した炭素13NMRスペクトルは、添付図面の図4に示す通り。
（9）溶解性
メタノール、アセトンに可溶で水に不溶である。
（10）TLC
シリカゲル60F₂₅₄（メルク社製）の薄層クロマトグラフィー上でクロロホルム：メタノール：酢酸（10：１：0.1）の溶媒で展開したときのRf値は0.67である。
【００１１】
また、第2の本発明によると、次式（II）

で表される抗生物質ツベラクトマイシンＤおよびその製薬学的に許容できる塩が提供される。
【００１２】
本発明のツベラクトマイシンＤは、酸性物質であり、その製薬学的に許容できる塩としては第４級アンモニウム塩などの有機塩基との塩、あるいは各種金属との塩、例えばナトリウムのようなアルカリ金属との塩がある。
【００１３】
本発明による式（II）のツベラクトマイシンＤの理化学的性状は、次の通りである。
（１）外観
無色粉末
（２）分子式
C₂₉H₄₂O₇
（３）高分解能質量分析（HRFABMS：陽イオンモード）
実験値 503.3020 (M+H)^＋
計算値 503.3009
（4）比旋光度
[α] _D ²⁵ +91.3゜ (ｃ 0.62、MeOH)
（5）紫外線吸収スペクトル（メタノール中）
λmax nm (ε)：234 (27,500, sh), 239 (28,700), 249 (19,500, sh)添付図面の図5に示す。
（6）赤外線吸収スペクトル
添付図面の図6に示す通り。
（7）プロトン核磁気共鳴スペクトル
500MHzにおいて重アセトン中で室温にて測定したプロトンNMRスペクトルは、添付図面の図7に示す通りである。
【００１４】
（8）炭素13核磁気共鳴スペクトル
125MHzにおいて重アセトン中で室温にて測定した炭素13NMRスペクトルは、添付図面の図8に示す通り。
（9）溶解性
メタノール、アセトンに可溶で水に不溶である。
（10）TLC
シリカゲル60F₂₅₄（メルク社製）の薄層クロマトグラフィー上でクロロホルム：メタノール：酢酸（10：１：0.1）の溶媒で展開したときのRf値は0.28である。
【００１５】
また、第3の本発明によると、次式（III）

で表される抗生物質ツベラクトマイシンＥおよびその製薬学的に許容できる塩が提供される。
【００１６】
本発明のツベラクトマイシンＥは、酸性物質であり、その製薬学的に許容できる塩としては第４級アンモニウム塩などの有機塩基との塩、あるいは各種金属との塩、例えばナトリウムのようなアルカリ金属との塩がある。
【００１７】
本発明による式（III）のツベラクトマイシンＥの理化学的性状は、次の通りである。
（１）外観
無色粉末
（２）分子式
C₂₉H₄₂O₇
（３）高分解能質量分析（HRFABMS：陽イオンモード）
実験値 503.2996 (M+H)^＋
計算値 503.3009
（4）比旋光度
[α] _D ²⁵ +94.5゜ (ｃ 0.53、MeOH)
（5）紫外線吸収スペクトル（メタノール中）
λmax nm (ε)：234 (29,000, sh), 239 (29,600), 249 (19,900, sh)添付図面の図9に示す。
（6）赤外線吸収スペクトル
添付図面の図10に示す通り。
（7）プロトン核磁気共鳴スペクトル
500MHzにおいて重アセトン中で室温にて測定したプロトンNMRスペクトルは、添付図面の図11に示す通りである。
【００１８】
（8）炭素13核磁気共鳴スペクトル
125MHzにおいて重アセトン中で室温にて測定した炭素13NMRスペクトルは、添付図面の図12に示す通り。
（9）溶解性
メタノール、アセトンに可溶で水に不溶である。
（10）TLC
シリカゲル60F₂₅₄（メルク社製）の薄層クロマトグラフィー上でクロロホルム：メタノール：酢酸（10：１：0.1）の溶媒で展開したときのRf値は0.36である。
【００１９】
本発明による抗生物質ツベラクトマイシンＢ、ＤおよびＥがそれぞれに前記の式(Ｉ)、(ＩＩ）および(III)で示される化学構造を有することは、プロトンNMR、炭素13NMRスペクトル等の分析を詳細に検討することにより前記の通り決定された。
【００２０】
本発明による式(Ｉ)、(ＩＩ)および(ＩＩＩ)で表されるツベラクトマイシンＢ、ＤおよびＥは後記の生物学的性質を有する。
すなわち、ツベラクトマイシンＢ、ツベラクトマイシンＤおよびツベラクトマイシンＥは、薬剤耐性菌を含む抗酸性菌に対して抗菌活性を示す。
【００２１】
試験例１
各種の微生物に対するツベラクトマイシンＢの抗菌スペクトルは日本化学療法学会標準法に基づき、１％グリセリン加普通寒天培地上で倍数希釈法によって測定した。その結果を表１に示す。

【００２２】
試験例２
各種の微生物に対するツベラクトマイシンＤの抗菌スペクトルは日本化学療法学会標準法に基づき、１％グリセリン加普通寒天培地上で倍数希釈法によって測定した。その結果を表２に示す。

【００２３】
試験例３
各種の微生物に対するツベラクトマイシンＥの抗菌スペクトルは日本化学療法学会標準法に基づき、１％グリセリン加普通寒天培地上で倍数希釈法によって測定した。その結果を表３に示す。

【００２４】
さらに、第４の本発明によると、ノカルディア属に属して前記の式(I)、(II)および(III)で表されるツベラクトマイシンＢ、ＤおよびＥの少くとも一つを生産する生産菌を培養し、その培養物から、これらツベラクトマイシンＢ、ＤおよびＥの少くとも一つを採取することを特徴とする、式 (I)、(II)および(III)の抗生物質ツベラクトマイシンＢ、Ｄおよび（または）Ｅの製造法が提供される。
【００２５】
第４の本発明の方法で使用する抗生物質ツベラクトマイシンＢ、Ｄ、Ｅの少くとも一つを生産する生産菌（以下、単にツベラクトマイシンＢ、Ｄ、Ｅ生産菌ということがある）は、前述した理化学的性質および生物学的性質を示す抗生物質を生産する能力を有するものであれば、その種を問わず使用でき広範な微生物から選ぶことができる。かかる微生物のうち、抗生物質ツベラクトマイシンＢ、Ｄ、Ｅ生産菌の具体的な好適の一例は、本発明者らにより平成９年２月、微生物化学研究所において、長野県諏訪市の土壌より分離された放線菌で、MK703-102F1の菌株番号が付された菌株である。
【００２６】
以下にMK703-102F1株の菌学的諸性質について記載する。
MK703-102F1株の菌学的性状
l．形態
基生菌糸はよく分枝し、分断が認められる。気菌糸は、直状あるいは不規則ならせん状に伸長し、円筒形〜長円形の胞子状に分断する。その表面は平滑で、大きさは約0.4〜0.6×0.8〜1.8ミクロンである。輪生枝、菌束糸、胞子のうおよび運動性胞子は認められない。
【００２７】
２．各種培地における生育状態
色の記載について［］内に示す標準は、コンティナー・コーポレーション・オブ・アメリカのカラー・ハーモニー・マニュアル（Container Corporation of Americaのcolor harmony manual）を用いた。
（１）シュクロース・硝酸塩寒天培地（２７℃培養）
無色の発育上に、白の気菌糸をうっすらと着生して、溶解性色素は認められない。
（２）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ISP−培地５、２７℃培養）
うす黄［2 ec, Sand］〜うす茶［3 ie, Camel］の発育上に、茶白［2 ba, Pearl］の気菌糸を着生し、溶解性色素は、かすかにうす赤紫を帯びる。
（３）スターチ・無機塩寒天培地（ISP−培地４、２７℃培養）
無色の発育上に、白の気菌糸をうっすらと着生し、溶解性色素は認められない。
【００２８】
（４）チロシン寒天培地（ISP−培地７、２７℃培養）
うす黄［2 ec, Sand］〜うす茶［3 ie, Camel］の発育上に、茶白［2 ba, Pearl］の気菌糸を着生し、溶解性色素は認められない。
（５）イースト・麦芽寒天培地（ISP−培地２、２７℃培養）
うす黄［2 ec, Sand］〜うす茶［3 ie, Camel］の発育上に、茶白［2 ba, Pearl］の気菌糸を着生し、溶解性色素は認められない。
（6）オートミール寒天培地（ISP−培地３、２７℃培養）
無色の発育上に、白の気菌糸をうっすらと着生し、溶解性色素は認められない。
【００２９】
３．生理的性質
（１）生育温度範囲
グルコース・アスパラギン寒天培地（グルコース 1.0％、Ｌ−アスパラギン 0.05％、リン酸水素二カリウム 0.05％、ひも寒天 2.5％、pH7.0）を用い、l０℃、２０℃、２４℃、２７℃、３０℃、３７℃、４５℃および５０℃の各温度で試験した結果、 l０℃、４５℃および５０℃での生育は認められず、２０℃〜３７℃の範囲で生育した。生育至適温度は３０℃付近である。
（２）スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天培地、ISP−培地４、２７℃培養）
スターチの加水分解は認められない。
（３）メラニン様色素の生成（トリプトン・イースト・ブロス、ISP−培地１；ペプトン・イースト・鉄寒天培地、ISP−培地６；チロシン寒天培地、ISP−培地７；いずれも２７℃培養）
いずれの培地においても陰性である。
【００３０】
（４）炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ寒天培地、ISP−培地９；２７℃培養）
Ｄ−グルコース、L−アラビノース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンニトールを利用して発育し、Ｄ−キシロース、シュクロース、イノシトール、ラムノース、ラフィノースは利用しない。
（５）硝酸塩の還元反応（0.1％硝酸カリウム含有ペプトン水、ISP−培地８；２７℃培養）
陽性である。
【００３１】
４．菌体成分
（１）細胞壁組成
メソ型の２、６−ジアミノピメリン酸を含有する。
（２）全菌体中の還元糖
アラビノース、ガラクトースを含み、A型である。
（３）イソプレノイド・キノン
主要なメナキノンとしてＭＫ−８(H4)および少量のＭＫ−８(H2)を含有する。（４）ミコール酸
含有する。
（５）脂肪酸
16:0（ヘキサデカン酸）を主成分とし、18:1（オクタデセン酸）、10-methyl-18:0（10―メチルオクタデカン酸）、16:1（ヘキサデセン酸）および18:0（オクタデカン酸）を含有する。
【００３２】
以上の性状を要約すると、MK703-102F1株は、その形態上、基生菌糸はよく分枝し、分断を認める。気菌糸は直状あるいは不規則ならせん状に伸長し、円筒形〜長円形の胞子状に分断する。輪生枝、菌束糸、胞子のうおよび運動性胞子は認められない。種々の培地で、無色〜うす黄〜うす茶の発育上に白〜茶白の気菌糸を着生する。溶解性色素は、一、二の培地でブドウ酒色の色素を認める。メラニン様色素は生成せず、スターチの水解性は認められない。
【００３３】
MK703-102F1株の菌体成分は、細胞壁にメソ型の２、６-ジアミノピメリン酸を含有し、全菌体中の還元糖はＡ型である。主要なメナキノンはＭＫ−８(Ｈ４)である。ミコール酸を含有する。脂肪酸は16:0、18:1、10-methyl-18:0、16:1および18:0を含有する。
【００３４】
以上の結果より、MK703-102F1株はノカルディア（Nocardia、文献、Bergey's Manual of Systematic Bacteriology、4巻、2350−2361頁、1989年）属に属するものと考えられる。そこで、MK703-102F1株をノカルディア・エスピー（Nocardia sp.）MK703-102F1とする。
なお、MK703-102F1株を工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託申請し、平成10年1月14日、FERM P-16580として受託された。
【００３５】
第４の本発明の方法においては、抗生物質ツベラクトマイシンＢ、ＤおよびＥの製造は次の通り行われる。
すなわち、抗生物質ツベラクトマイシンＢ、Ｄ、Ｅの製造は、抗生物質ツベラクトマイシンＢ、Ｄ、Ｅ生産菌を栄養培地中に接種して、27℃の温度で好気的に振とうしながら培養することによって行われ、抗生物質ツベラクトマイシンＢ、Ｄ、Ｅを含む培養物が得られる。このような目的に用いる栄養培地としては、放線菌の培養に使用しうるものが使用される。栄養源として、例えば市販されているペプトン、大豆粉、酵母エキス、肉エキス、コーン・スティープ・リカー、硫酸アンモニウム等の窒素源が使用でき、また、グリセリン、でん粉、グルコース、ガラクトース、デキストリン等の炭水化物あるいは脂肪などの炭素源が使用できる。さらに食塩、炭酸カルシウム等の無機塩を添加して使用できる。その他必要に応じて微量の金属塩を添加することができる。これらのものは、抗生物質ツベラクトマイシンＢ、Ｄ、Ｅ生産菌が利用し、抗生物質ツベラクトマイシンＢ、Ｄ、Ｅの生産に役に立つものであればよく、公知の放線菌の培養材料はすべて用いることができる。
【００３６】
本発明による抗生物質ツベラクトマイシンＢ、Ｄ、Ｅの生産には、ノカルディア属に属する抗生物質ツベラクトマイシンＢ、Ｄ、Ｅの生産能を有する微生物が使用される。具体的には、本発明者らの分離したノカルディア・エスピーMK703-102F1株が抗生物質ツベラクトマイシンならびにツベラクトマイシンＢ、ＤおよびＥを生産することが本発明者らによって明らかにされているが、その他の菌株については、抗生物質生産菌の単離の常法によって自然界より分離することが可能である。また、ノカルディア・エスピーMK703-102F1株を含めて、抗生物質ツベラクトマイシンＢ、Ｄ、Ｅの生産菌を放射線照射その他、変異処理に付して抗生物質ツベラクトマイシンＢ、Ｄ、Ｅの生産能を高める余地も残っている。さらに遺伝子工学的手法によって抗生物質ツベラクトマイシンＢ、Ｄ、Ｅの生産能を高めることも可能である。
【００３７】
本発明による抗生物質ツベラクトマイシンＢ、ＤおよびＥは、ノカルディア属に属する抗生物質ツベラクトマイシンＢ、Ｄ、Ｅ生産菌を適当な培地で好気的に培養し、その培養液から目的のものを採取することによって製造することができる。その生産菌の培養温度は、抗生物質ツベラクトマイシンＢ、Ｄ、Ｅの生産菌の発育が実質的に阻害されずに、これらの物質を生産しうる範囲であれば、特に制約されるものでなく、使用する生産菌に応じて選択できるが、好ましくは、25−30℃の範囲内の温度を挙げることができる。ツベラクトマイシンＢ、Ｄ、Ｅの生産のための種母培地としては、寒天培地上、MK703-102F1株の斜面培養から得た生育物を使用する。
【００３８】
このMK703-102F1株によるツベラクトマイシンＢ、Ｄ、Ｅの生産は通常では４ないし６日間で最高に達するが、一般に充分な抗菌活性が培地に付与されるまで続ける。この培養液中のツベラクトマイシンＢ、Ｄ、Ｅの力価の経時変化は、HPLC法またはマイコバクテリウム・スメグマティスあるいはマイコバクテリウム・バケを被検菌とする円筒平板法により測定できる。
【００３９】
第４の本発明の方法においては、上記のようにして得られた培養物からツベラクトマイシンＢ、Ｄ、Ｅを採取するが、採取法としては微生物の生産する代謝物を採取するのに用いられる手段を適宜利用することができる。例えば、水と混ざらない溶媒による抽出の手段、各種吸着剤に対する吸着親和性の差を利用する手段、ゲルろ過、向流分配を利用したクロマトグラフィー等を単独または組み合わせて利用しツベラクトマイシンＢ、Ｄ、Ｅを採取できる。また、分離した菌体からは、適当な有機溶媒を用いた溶媒抽出法や菌体破砕による溶出法により菌体からツベラクトマイシンＢ、Ｄ、Ｅを抽出し上記と同様に単離精製して採取することができる。かくして、前記した新規な抗生物質ツベラクトマイシンＢ、ＤおよびＥがそれぞれ単独に、または混合物として得られる。
【００４０】
さらに、第５の本発明では、式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）でそれぞれ表されるツベラクトマイシンＢ、ＤおよびＥの少くとも一つ、またはその製薬学的に許容できる塩を有効成分とする抗菌剤が提供される。
【００４１】
この抗菌剤においては、それの有効成分化合物を、製薬学的に許容できる常用の固体または液状担体、例えばエタノール、水、生理食塩水、でん粉等と混和して含有する組成物の形とすることができる。
【００４２】
【発明の実施の形態】
以下に実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
実施例１
抗生物質ツベラクトマイシンＤおよびツベラクトマイシンＥの製造と精製
まず、ガラクトース2.0％、デキストリン2.0％、グリセリン1.0%、バクトソイトン(ディフコ社製）1.0％、コーン・スティープ・リカー 0.5％、硫酸アンモニウム0.2％、炭酸カルシウム0.2 ％を含む組成の液体培地（pH7.4に調整）を三角フラスコ（500ml容）に110mlずつ分注し、常法により120℃20分滅菌した。次に寒天斜面培地に培養したノカルディア・エスピーMK703-102F1株（FERM P-16580）を上記液体培地に接種し、30℃で3日間回転振とう培養し、種母培養液とした。
【００４３】
生産培養のためには、澱粉2.0％、グルコース1.0％、酵母エキス0.5％、カザミノ酸0.5％、炭酸カルシウム0.4％を含む組成の液体培地（pH無調整）15リットルを、タンク培養槽（30リットル容）中で調製、滅菌し生産培地とした。この生産培地に、上記の種母培養液を2％量で接種し、27℃、通気量15リットル、撹拌器の回転200rpmの培養条件で６日間タンク培養した。
【００４４】
このようにして得られた培養液、計150リットルを遠心分離して培養ろ液と菌体に分離した。この培養ろ液を、1 M塩酸でpH 2に調整した後、ダイヤイオンHP-20（三菱化学株式会社製)5リットルのカラムに通過させて、ツベラクトマイシン類を吸着した。このカラムを50％メタノ−ル水15リットルおよび100％アセトン15リットルで順次溶出した。ツベラクトマイシンならびにツベラクトマイシンＤ、Ｅは、100％アセトンで溶出され、この溶出液から減圧下でアセトンを溜去し57.0gの暗褐色油状物を得た。これらツベラクトマイシン類を含む暗褐色油状物から極性の低い物質を除くため、ヘキサン：アセトニトリル（ 1：1）の溶媒、計1リットルに溶解し分配を行った。ツベラクトマイシン類は、アセトニトリル層（下層）に分配し、これを集め減圧下でアセトニトリルを溜去し30.0gのツベラクトマイシン類を含む暗褐色油状物を得た。
【００４５】
この暗褐色油状物をシリカゲルカラム（内径54mm×長さ220mm）にのせ、クロロホルム（1500ml）、クロロホルム：メタノール（ 9：1）（1500ml）、クロロホルム：メタノール：ギ酸（ 9：1：0.05）（1500ml）の溶媒で順次クロマトグラフィーを行った。フラクションコレクタ−で20gずつ分画すると、活性画分は二つに別れ、フラクション111〜133およびフラクション187〜211に溶出された。フラクション111〜133の画分には、ツベラクトマイシンおよびツベラクトマイシンＥが含有され、また、フラクション187〜211の画分には、ツベラクトマイシンＤが含有されていた。
【００４６】
ツベラクトマイシンおよびツベラクトマイシンＥを含む画分、フラクション111〜133を集め、減圧下で濃縮乾固すると15.4gの褐色油状物を得た。この褐色油状物をシリカゲルカラム（内径54mm×長さ220mm）にのせ、クロロホルム：濃アンモニア水（ 100：0.5）（1000ml）、クロロホルム：メタノール（ 9：1）（1000ml）、クロロホルム：メタノール：ギ酸（ 9：1：0.05）（1000ml）の溶媒で順次クロマトグラフィーを行った。フラクションコレクタ−で20gずつ分画するとツベラクトマイシンおよびツベラクトマイシンＥを含む画分は、フラクション160〜181に溶出され、これを集めて減圧下で濃縮乾固し、4.0gの褐色物を得た。この褐色物を酢酸エチル300mlに溶かし、希塩酸水で洗浄した後、酢酸エチル層を集め減圧下で濃縮乾固し1.0gのツベラクトマイシンおよびツベラクトマイシンＥを含む褐色油状物を得た。
【００４７】
ついでこの褐色油状物を、少量の酢酸エチルに溶かした後、遠心液液分配クロマトグラフィ−（カラム容量125ml）を酢酸エチル：10mＭリン酸1水素2ナトリウム水（ 1：1）の溶媒で固定層として上層、移動層として下層を用いて行った。フラクションコレクタ−で6mlずつ分画し、フラクション145本目より反転溶出したところ、ツベラクトマイシンＥは、フラクション84〜116に溶出され、また、ツベラクトマイシンはフラクション146〜151に溶出された。ツベラクトマイシンＥを含むフラクション84〜116を集め、減圧下で濃縮乾固すると50.4mgの淡褐色油状物を得た。また、ツベラクトマイシンのフラクション146〜151を集め、減圧下で濃縮乾固して無色粉末のツベラクトマイシンを531mg得た。
【００４８】
ツベラクトマイシンＥを含む淡褐色油状物は、さらにセファデックスLH-20（ファルマシア社）カラム（内径18mm×長さ200mm）を用いてクロマトグラフィーを行った。フラクションコレクタ−で2gずつ分画するとツベラクトマイシンＥは、フラクション7〜8にかけ溶出され、これを集めて、減圧下で濃縮乾固することにより無色粉末の純粋なツベラクトマイシンＥを31.8mg得た。
【００４９】
また他方、ツベラクトマイシンＤが含有されている画分、すなわち前述のフラクション187〜211は、減圧下で濃縮乾固し1.45gの暗褐色油状物を得た。これを少量の酢酸エチルに溶かした後、遠心液液分配クロマトグラフィ−（カラム容量125ml）を酢酸エチル：10mＭリン酸1水素2ナトリウム水（ 1：1）の溶媒系で、固定層として上層、移動層として下層を用いて行った。フラクションコレクタ−で6mlずつ分画し、フラクション50本目より反転溶出したところ、ツベラクトマイシンＤは、フラクション50〜53にかけ溶出した。ツベラクトマイシンＤを含む画分フラクション50〜53を集め、減圧下で濃縮乾固し113.4mgの赤褐色油状物を得た。この赤褐色油状物をシリカゲル薄層クロマト（シリカゲル60F₂₅₄、メルク社製）にかけ、展開溶媒としてクロロホルム：メタノール（ 4：1）の混合溶媒系で展開したところツベラクトマイシンＤのRf値は、0.52〜0.39であった。このRf 0.52〜0.39のバンドを集め、クロロホルム：エタノ−ル（ 1：1）で溶出し、減圧下で濃縮乾固し無色粉末のツベラクトマイシンＤを54.1mg得た。
【００５０】
さらに、このツベラクトマイシンＤをセファデックスLH-20（ファルマシア社）カラム（内径18mm×長さ200mm）でクロマトグラフィーを行い、フラクションコレクタ−で1gずつ分画したところ、ツベラクトマイシンＤは、フラクション12〜14にかけ溶出した。これを集め、減圧下で濃縮乾固することにより無色粉末の純粋なツベラクトマイシンＤを43.9mg得た。
【００５１】
実施例２
抗生物質ツベラクトマイシンＢの製造と精製
まず、ガラクトース2.0％、デキストリン2.0％、グリセリン1.0%、バクトソイトン（ディフコ社製）1.0％、コーン・スティープ・リカー 0.5％、硫酸アンモニウム0.2％、炭酸カルシウム0.2 ％を含む組成の液体培地（pH7.4に調整）を三角フラスコ（500ml容）に110mlずつ分注し、常法により120℃20分滅菌した。次に寒天斜面培地に培養したノカルディア・エスピーMK703-102F1株（FERM P-16580）を上記液体培地に接種し、30℃で３日間回転振とう培養し、種母培養液とした。
【００５２】
生産培養のためには、澱粉2.0％、グルコース1.0％、酵母エキス0.5％、カザミノ酸0.5％、炭酸カルシウム0.4％を含む組成の液体培地（pH無調整）15リットルをタンク培養槽（30リットル容）中で調製、滅菌し生産培地とした。この生産培地に、上記の種母培養液を２％量で接種し、27℃、通気量15リットル、撹拌器の回転200rpmの培養条件で６日間タンク培養した。
【００５３】
このようにして得られた培養液、計150リットルを遠心分離して培養ろ液と菌体に分離した。この菌体に5リットルのメタノ−ルを加え十分撹拌し菌体を除去してメタノ−ル抽出液を得た。このメタノ−ル抽出液に5リットルの水を加えた後、ダイヤイオンHP-20 (三菱化学株式会社製)500mlのカラムに通過させて、ツベラクトマイシンＢを吸着させた。このカラムを50％メタノ−ル水1.5リットルおよび100％アセトン1.5リットルで順次溶出させた。ツベラクトマイシンＢは、100％アセトンで溶出され、この溶出液を減圧下で濃縮し100mlにした。この濃縮液に、500mlの酢酸エチルを加え抽出した後、酢酸エチル層を集め減圧下で濃縮乾固して5.7gのツベラクトマイシンＢを含む褐色油状物を得た。
【００５４】
ついで、この褐色油状物をシリカゲルカラム（内径52mm×長さ200mm）にのせ、クロロホルム：ヘキサン（ 1：1）（1000ml）、クロロホルム（1000ml）、クロロホルム：メタノール（ 99：1）（1000ml）の溶媒で順次に１つのフラクションあたり20ｇで分画してクロマトグラフィーを行ったところ、ツベラクトマイシンＢは、フラクション135〜150にかけ溶出された。このフラクション135〜150を集め、減圧下で濃縮乾固してツベラクトマイシンＢを含む淡褐色油状物191mgを得た。
この淡褐色油状物をシリカゲル薄層クロマト（シリカゲル60F₂₅₄、メルク社製）にかけ、展開溶媒としてヘキサン：酢酸エチル（ 7：3）の混合溶媒で展開し、シリカゲル薄層を乾燥後、再度同じ溶媒系で展開したところツベラクトマイシンＢのRf値は、0.52〜0.48であった。このRf 0.52〜0.48のバンドを集め、クロロホルム：メタノ−ル（ 9：1）で溶出し、減圧下で濃縮乾固して無色粉末のツベラクトマイシンＢを39.0mg得た。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はツベラクトマイシンＢのメタノール溶液中の紫外線吸収スペクトルである。
【図２】図２はツベラクトマイシンＢのKBr錠剤法で測定した赤外線吸収スペクトルである。
【図３】図３はツベラクトマイシンＢの重アセトン溶液中にて室温で測定した500MHzにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルである。
【図４】図４はツベラクトマイシンＢの重アセトン溶液中にて室温で測定した125MHzにおける炭素13核磁気共鳴スペクトルである。
【図５】図５はツベラクトマイシンＤのメタノール溶液中の紫外線吸収スペクトルである。
【図６】図６はツベラクトマイシンＤのKBr錠剤法で測定した赤外線吸収スペクトルである。
【図７】図７はツベラクトマイシンＤの重アセトン溶液中にて室温で測定した500MHzにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルである。
【図８】図８はツベラクトマイシンＤの重アセトン溶液中にて室温で測定した125MHzにおける炭素13核磁気共鳴スペクトルである。
【図９】図９はツベラクトマイシンＥのメタノール溶液中の紫外線吸収スペクトルである。
【図１０】図10はツベラクトマイシンＥのKBr錠剤法で測定した赤外線吸収スペクトルである。
【図１１】図11はツベラクトマイシンＥの重アセトン溶液中にて室温で測定した500MHzにおけるプロトン核磁気共鳴スペクトルである。
【図１２】図12はツベラクトマイシンＥの重アセトン溶液中にて室温で測定した125MHzにおける炭素13核磁気共鳴スペクトルである。

Claims

次式（I）

で示される抗生物質ツベラクトマイシンＢ。
次式（II）

で示される抗生物質ツベラクトマイシンＤおよびその製薬学的に許容できる塩。
次式（III）

で示される抗生物質ツベラクトマイシンＥおよびその製薬学的に許容できる塩。
ノカルディア属に属する請求項１に記載の式（I）で示される抗生物質ツベラクトマイシンＢ、請求項２に記載の式（II）で示される抗生物質ツベラクトマイシンＤ、および請求項３に記載の式（III）で示される抗生物質ツベラクトマイシンＥの少くとも一つを生産する生産菌を培養し、その培養物から、これらツベラクトマイシンＢ、ＤおよびＥの少くとも一つを採取することを特徴とする、抗生物質ツベラクトマイシンＢ、Ｄおよび（または）Ｅの製造法。
請求項１に記載の式（I）で示される抗生物質ツベラクトマイシンＢ、請求項２に記載の式（II）で示される抗生物質ツベラクトマイシンＤ、および請求項３に記載の式（III）で示される抗生物質ツベラクトマイシンＥの少くとも一つ、またはその製薬学的に許容できる塩を有効成分とする抗菌剤。