JP4111950B2 - 自家骨髄の心筋内注射 - Google Patents
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Description
発明の分野
本出願は自家骨髄および骨髄細胞の注射のための方法を示す。より具体的には、本発明は、側副血管形成および組織潅流を増大させるために自家骨髄およびトランスフェクトした骨髄細胞の心筋内注射を示す。
本出願は自家骨髄および骨髄細胞の注射のための方法を示す。より具体的には、本発明は、側副血管形成および組織潅流を増大させるために自家骨髄およびトランスフェクトした骨髄細胞の心筋内注射を示す。
発明の背景
心筋の側副血管機能を高めるために組換え型遺伝子または成長因子を使用することは、心血管系疾患の治療に対する新しいアプローチである可能性がある。Kornowski, R.ら、"Delivery strategies for therapeutic myocardial angiogenesis," Circulation 2000; 101: 454-458。概念の証拠は心筋虚血の動物モデルにおいて実証されていて、臨床試験が進行中である。Unger, E. F.ら、"Basic fibroblast growth factor enhances myocardial collateral flow in a canine model," Am J Physiol 1994；266:H1588-1595；Banai, S.ら、"Angiogenic-induced enhancement of collateral blood flow to ischemic myocardium by vascular endothelial growth factor in dogs," Circulation 1994; 83-2189；Lazarous, D. F.ら、"Effect of chronic systemic administration of basic fibroblast growth factor on collateral development in the canine heart," Circulation 1995；91: 145-153；Lazarous, D. F.ら、"Comparative effects of basic development and the arterial response to injury," Circulation 1996; 94:1074-1082；Giordano, F. J.ら、"Intracoronary gene transfer of fibroblast growth factor-5 increases blood flow and contractile function in an ischemic region of the heart," Nature Med 1996; 2: 534-9。血管形成因子の経カテーテル送達における大半の方法は、遺伝子またはタンパク質の局限化が曖昧であり心臓以外の組織に全身性に送達されるために制限される可能性のある冠動脈内経路を採用している。従って、心臓全体ではなく心筋の正確に限定された領域に血管形成因子または遺伝子を直接送達する能力を持つこと、および全身性曝露の可能性を最小限に抑えることが望ましい。Guzman, R. J.ら、 "Efficient gene transfer into myocardium by direct injection of adenovirus vectors, " Circ Res 1993；73: 1202-7；Mack, C. A.ら、"Biologic bypass with the use of adenovirus-mediated gene transfer of the complementary deoxyribonucleic acid for VEGF-121, improves myocardial perfusion and function in the ischemic porcine heart," J Thorac Cardiovasc Surg 1998；115: 168-77。
心筋の側副血管機能を高めるために組換え型遺伝子または成長因子を使用することは、心血管系疾患の治療に対する新しいアプローチである可能性がある。Kornowski, R.ら、"Delivery strategies for therapeutic myocardial angiogenesis," Circulation 2000; 101: 454-458。概念の証拠は心筋虚血の動物モデルにおいて実証されていて、臨床試験が進行中である。Unger, E. F.ら、"Basic fibroblast growth factor enhances myocardial collateral flow in a canine model," Am J Physiol 1994；266:H1588-1595；Banai, S.ら、"Angiogenic-induced enhancement of collateral blood flow to ischemic myocardium by vascular endothelial growth factor in dogs," Circulation 1994; 83-2189；Lazarous, D. F.ら、"Effect of chronic systemic administration of basic fibroblast growth factor on collateral development in the canine heart," Circulation 1995；91: 145-153；Lazarous, D. F.ら、"Comparative effects of basic development and the arterial response to injury," Circulation 1996; 94:1074-1082；Giordano, F. J.ら、"Intracoronary gene transfer of fibroblast growth factor-5 increases blood flow and contractile function in an ischemic region of the heart," Nature Med 1996; 2: 534-9。血管形成因子の経カテーテル送達における大半の方法は、遺伝子またはタンパク質の局限化が曖昧であり心臓以外の組織に全身性に送達されるために制限される可能性のある冠動脈内経路を採用している。従って、心臓全体ではなく心筋の正確に限定された領域に血管形成因子または遺伝子を直接送達する能力を持つこと、および全身性曝露の可能性を最小限に抑えることが望ましい。Guzman, R. J.ら、 "Efficient gene transfer into myocardium by direct injection of adenovirus vectors, " Circ Res 1993；73: 1202-7；Mack, C. A.ら、"Biologic bypass with the use of adenovirus-mediated gene transfer of the complementary deoxyribonucleic acid for VEGF-121, improves myocardial perfusion and function in the ischemic porcine heart," J Thorac Cardiovasc Surg 1998；115: 168-77。
手術時における血管形成因子心筋内注射の側副機能に対する影響は、心筋虚血の動物モデルを用いて調べられている。開胸、血管形成ペプチドをコードする導入遺伝子を含むアデノウイルスベクターの経心外膜投与により、側副機能が高められた（Mackら、前記）。血管新生は、患者における直視下心臓手術中の血管形成ペプチドまたはプラスミドベクターの直接的心筋内注射によっても起こることが報告された。Schumacher, B.ら、"Induction of neoangiogenesis in ischemic myocardium by human growth factors. First clinical results of a new treatment of coronary heart disease," Circulation 1998；97: 645-650；Losordo, D. W.ら、"Gene therapy for myocardial angiogenesis: initial clinical results with direct myocardial injection of phVEGF165 as sole therapy for myocardial ischemia," Circulation 1998；98:2800。
治療的血管形成が冠動脈疾患患者の新しい治療法として将来有望であるにも関わらず、特定な方法が臨床的に問題となる治療的血管形成反応をもっとも適切に促進するかという点に関しては依然大きなギャップがある。さらに、多くの血管形成性成長因子の中のどの一つ（または複数）が有益な血管形成反応に関連する可能性があるかは不明である。さらに、最適な血管形成反応を促進するためにタンパク質、アデノウイルスまたは「裸の」DNAなどの異なる組織送達プラットホームを使用することは今後の課題である。
発明の概要
ごく最近試験が行われた治療アプローチは、虚血組織に送達される単一の血管形成性成長因子（例えば、VEGF、FGF、アンギオポエチン-1）に焦点が絞られている。これは、最終産物（例えば、タンパク質）の送達または様々なベクターを用いた遺伝子導入によって達成することができる。しかし、新しい血管形成の開始および持続には、複数の成長因子系の複雑な相互作用が必要である可能性があると考えられている。より具体的には、限局化された特殊な血管形成環境を誘発して、種々の血管新生サイトカインが連携して適時に相互作用し、新しい血管の形成および機能を開始および維持することが重要であると信じられている。
ごく最近試験が行われた治療アプローチは、虚血組織に送達される単一の血管形成性成長因子（例えば、VEGF、FGF、アンギオポエチン-1）に焦点が絞られている。これは、最終産物（例えば、タンパク質）の送達または様々なベクターを用いた遺伝子導入によって達成することができる。しかし、新しい血管形成の開始および持続には、複数の成長因子系の複雑な相互作用が必要である可能性があると考えられている。より具体的には、限局化された特殊な血管形成環境を誘発して、種々の血管新生サイトカインが連携して適時に相互作用し、新しい血管の形成および機能を開始および維持することが重要であると信じられている。
骨髄（BM）は血管形成プロセスの制御に関与する幅広いサイトカイン（例えば、成長因子）および細胞の天然の供給源である。従って、自家（A）BMまたはそれ由来の骨髄細胞の心筋内注射は、これらの細胞が多くの血管形成因子を適時に分泌するという天然の能力を利用することによって、虚血心筋における治療的側枝発達を達成するための最適の診療を提供する。
本発明の様々な態様に従って、自家骨髄またはそれ由来の細胞は、「独立した」治療物質として、または血管形成性成長因子の骨髄産生を高めて、さらに／または内皮細胞の増殖、移動および血管管腔形成を促進する何らかの薬剤、タンパク質もしくは遺伝子、またはその他の何らかの化合物もしくは診療と併用して注射される。「併用」血管形成物質は患者または標的組織に直接投与することもできれば、患者への骨髄の注射前にエキソビボにおいて骨髄とインキュベートすることもできる。これらの「併用」血管形成物質の非限定的な例として、顆粒球-単球コロニー刺激因子（GM-CSF）、単球化学誘導タンパク質1（MCP-1）、および低酸素症誘導性因子-1（HIF-1）が挙げられる。
本発明に基づく一つの態様において、ろ過した骨髄および／または骨髄細胞（血管形成因子をコードする遺伝子をトランスフェクトされるもの、またはトランスフェクトされないもの）を、RGTA（ReGeneraTing Agent）として知られる血管形成物質と共に虚血標的組織に直接投与する。RGTAはヘパリン結合成長因子（即ち、HBGF）に対して硫酸ヘパランに類似する特性を持ち、組織の修復および保護を刺激する一群の物質である。例えば、RGTAファミリーの1メンバーであるRGTA11は、過去に、急性骨格筋虚血に起因するほとんどの損傷を防止することが示されている（FASEB J. (1999) 13: 761-766）。さらに、ブタ梗塞モデルにおいて虚血心組織にRGTA11を注射すると、その部位の血管数が増加して、初期左室駆出分画の84％の回復が得られて、梗塞の範囲がほぼ50％減少することが示されている。
RGTAファミリーの化学的に限定されたメンバーであるRGTA11は、既報（M. MauzacおよびJ. Josefonvicz (1984) Biomaterials 5: 301-304）の通り、デキストランTのグルコース残基に対する制御された連続的置換によって得られるデキストラン誘導体である。RGTA11の置換率は、カルボキシメチル基、カルボキシメチルベンジルアミノ基、ならびにスルホン酸および硫酸カルボキシメチルベンジルアミド基において、それぞれ、69、2.5および36.5％であった。RGTA11の抗凝固活性は3.5IU/mgである（ヘパリンの場合は、通常、約170から180IU/mgである）。本発明の方法の実践において同時注射は不要であるが、好都合なことにRGTA11は新鮮自家骨髄細胞または本明細書に述べられる通りに処理された自家骨髄細胞と同時に筋虚血部位に注射して血管増生を促進することができる。
例えば、RGTA11は、細胞の注射前にろ過した骨髄細胞を含む担体液に加えることができる。RGTA11が骨髄を含む担体に加えられる場合、血液抗凝固剤としての活性をもつことから、もし加えられるのであれば、骨髄細胞と共に投与されるヘパリンの量はそれに従って減少させることができる。
血管形成因子の骨髄産生を高める本発明のもう一つの例は、エキソビボでの骨髄細胞の低酸素状態への曝露である。側副血管形成の発生を高めおよび／または促進し、従って虚血心筋または虚血四肢への側副血流を高めおよび／または促進するために、自家骨髄は単独でまたは「併用」血管形成物質と共に、虚血および／または非虚血心筋への、もしくは直接その他のいずれかの虚血臓器（四肢末梢を含む）への経心内膜または経心外膜アプローチのいずれかを経て、直接的に患者に送達することができる。このアプローチは、心筋発生のプロセスによって、新たに移植された脱分化および／または分化した心筋細胞の成長を促進するためにも用いることができる。
従って、一つの態様において、本発明は骨髄細胞におけるトランスフェクション効率を高めるための方法を提供する。この態様において、骨髄細胞は適切な培養条件下において容器内で、骨髄による初期付着細胞の産生を十分に促進し得る期間、培養される。初期付着細胞には、一つ以上の血管新生サイトカイン、成長因子または哺乳類血管形成促進因子をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いてトランスフェクトする。本発明の方法において、初期付着細胞がトランスフェクトされる効率は、ベクターを用いて新鮮骨髄または非付着性骨髄細胞をトランスフェクトする場合と比べて高まる。
もう一つの態様において、本発明は患者から自家骨髄を採取して、骨髄による初期付着細胞の産生を促進するために十分な期間にわたってその自家骨髄を適切な培養条件下において容器内で成長させて、その初期付着細胞に一つ以上の血管新生サイトカイン、成長因子、または哺乳類血管形成促進因子をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いてトランスフェクトすることによって、必要とする患者において側副血管形成を高めるための方法を提供する。一種類または複数の物質の発現を惹起して患者におけるその部位にて側副血管形成を増大させるために、トランスフェクトした細胞の有効量を患者の所望の位置に直接投与することができる。
さらにもう一つの態様において、本発明は、本明細書に述べられるように、一つまたは複数のサイトカイン、成長因子または哺乳類血管形成促進因子をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いてトランスフェクトされている自家骨髄由来の初期付着細胞を含む組成物を提供する。
発明の詳細な説明
骨髄は、血管形成および炎症プロセスの制御に関与する幅広いサイトカイン、成長因子および血管形成促進因子の天然の供給源である。発現する血管新生サイトカイン、成長因子および血管形成促進因子は、早期および後期造血の維持に関与することが知られている調節物質（IL-1αおよびIL-1β、IL-6、IL-7、IL-8、IL-11およびIL-13；コロニー刺激因子、トロンボポエチン、エリスロポエチン、幹細胞因子、fit3-リガンド、肝細胞成長因子、腫瘍壊死因子α、白血病阻害因子、トランスホーミング増殖因子β1およびβ3；ならびにマクロファージ炎症性タンパク質1α）、血管形成因子（線維芽細胞成長因子1および2、血管内皮成長因子）および結合組織形成細胞を通常の標的（および供給源）とする調節物質（血小板由来成長因子A、上皮成長因子、トランスホーミング成長因子αおよびβ2、オンコスタチンMおよびインスリン様成長因子-1）、または神経細胞（神経成長因子）を含む。Sensebe, L.ら、Stem Cells 1997; 15: 133-43。さらに、VEGFポリペプチドは血小板および巨核球に含まれて、βトロンボグロブリンの放出と共に活性化された血小板から放出されることが示されている。Wartiovaara, U.ら、Thromb Haemost 1998; 80: 171- 5; Mohle, R.,Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 663-8。
骨髄は、血管形成および炎症プロセスの制御に関与する幅広いサイトカイン、成長因子および血管形成促進因子の天然の供給源である。発現する血管新生サイトカイン、成長因子および血管形成促進因子は、早期および後期造血の維持に関与することが知られている調節物質（IL-1αおよびIL-1β、IL-6、IL-7、IL-8、IL-11およびIL-13；コロニー刺激因子、トロンボポエチン、エリスロポエチン、幹細胞因子、fit3-リガンド、肝細胞成長因子、腫瘍壊死因子α、白血病阻害因子、トランスホーミング増殖因子β1およびβ3；ならびにマクロファージ炎症性タンパク質1α）、血管形成因子（線維芽細胞成長因子1および2、血管内皮成長因子）および結合組織形成細胞を通常の標的（および供給源）とする調節物質（血小板由来成長因子A、上皮成長因子、トランスホーミング成長因子αおよびβ2、オンコスタチンMおよびインスリン様成長因子-1）、または神経細胞（神経成長因子）を含む。Sensebe, L.ら、Stem Cells 1997; 15: 133-43。さらに、VEGFポリペプチドは血小板および巨核球に含まれて、βトロンボグロブリンの放出と共に活性化された血小板から放出されることが示されている。Wartiovaara, U.ら、Thromb Haemost 1998; 80: 171- 5; Mohle, R.,Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 663-8。
骨髄機能の支持、および循環中に入って治癒途中の創傷および／または虚血部位を目標として最終的には新しい血管形成に寄与する幹細胞および始原細胞を含む造血細胞の発達の支持には血管形成が必要であるという概念を裏付ける指標もある。成人骨髄から単離される未分化の間葉始原細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体は発達中の微小血管系の細胞表面マーカーを認識することが示されていて、この証拠はこれらの細胞が胎児期の血管形成に関与する可能性があることを示唆している。Fleming, J. E., Jr., Dev Dyn 1998; 212: 119-32。
骨髄血管形成は、（多発性骨髄腫の場合のように）悪性細胞によって骨髄が活性化される病的状態において著しく高まる可能性があり、この場合、骨髄血管形成はヒト多発性骨髄腫細胞の発達に同調して増加することが示されている。Ribatti, D.ら、Br J Cancer 1999; 79: 451-5。さらに、血管内皮成長因子（VEGF）はパラクリンおよびオートクリンメカニズムのいずれかを介して、多発性骨髄腫のような造血器新生物の成長において役割を担うことが示されている。Bellamy, W. T., Cancer Res 1999; 59: 728-33; Fiedler, W., Blood 1997; 89: 1870-5）。その固有の先天的な体液性および細胞特性を持つ自家骨髄は様々な血管形成性化合物の強力な供給源である。驚くべきことに、「混合」血管新生サイトカインのこの天然の供給源は治療的血管形成および／または筋形成を誘発するための強力な双方向性成長因子の混合物としても利用することができる；そもそも、これらの細胞を利用することによって、これらの天然の血管形成物質のより持続的な供給源が提供される可能性がある。
虚血に反応して血管形成の開始に関与する可能性が極めて高い血管形成促進因子の一つはHIF-1であり、これは低酸素状態に対する反応に関与するいくつかの遺伝子のプロモーターに結合して刺激する強力な転写因子である。HIF-1の誘導および活性化は組織pO2によって厳重に制御される；pO2が低下するとHIF-1の発現が指数関数的に増加し、その結果、正のフィードバックループが起こり、それによってpO2の低下が低酸素環境に対する適応反応として機能する遺伝子産物の発現の増加を惹起する。例えば、HIF-1が活性化されると糖分解に関与する遺伝子であるエリスロポエチンの誘導およびVEGFの発現が起こる。これは、低pO2値に対する適応反応に関与するその他の多くの遺伝子の発現も調節する可能性がある。HIF-1が低酸素状態に対する反応に関与するタンパク質の量を調節するメカニズムは、低pO2対して反応する遺伝子の転写調節を介して行われる。従って、このような遺伝子はHIF-1結合部位を持つプロモーターまたはエンハンサー領域内に低酸素反応性エレメント（HRE）と呼ばれる短いDNA配列を持つ。HIF-1はヘリックス-ループ-ヘリックスの基本モチーフを持つ異質二量体であり、HIF-1αおよびHIF-1βのサブユニットから構成される。その量は転写および転写後の双方にpO2によって調節され、HIF-1の誘導は低酸素状態によって増大して、その半減期はpO2値が増大すると著しく短縮する。
（HeLa細胞において測定された通り）HIF-1の発現はpO2に指数関数的および逆比例的に相関し、曲線の変曲点は酸素飽和度5％の位置で起こり、0.5％において最大活性を示し、1.5から2.0％において1/2最大活性であることが重要である。これらは比較的低レベルの低酸素状態であり、このようなレベルが軽度の心筋虚血または下肢虚血の存在下、即ち、組織壊死が生じない状態（それぞれ、心筋梗塞および脚の潰瘍形成）で見られるレベルにおいて発生するか否かは不明である。このように、骨髄細胞は血管形成因子を分泌して、それによって側枝の発達を高めさせる能力を持つことができる。しかし、このような活性は、何らかの補足的刺激が存在しない限り、投与された特殊な組織環境内で発現しない可能性がある。従って、必要ならば、骨髄移植片をHIF-1と同時に投与することは本発明の好ましい局面である。HIF-1は骨髄移植片に含まれる多くの低酸素誘導性血管形成性遺伝子の至適発現を提供することが期待される。HIF-1はタンパク質または遺伝子として注射することができる。後者の場合、プラスミドもしくはウイルスベクターに組み込んで、または機能的に重要となるタンパク質レベルに達するその他の何らかの方法で注射することができる。但し、HIF-1は骨髄による血管形成性物質の産生を高めることのできる介入の一例として用いられることを強調しておく。本発明はその他の血管形成性物質の使用も網羅し、HIF-1活性の増大（即ち、その半減期の延長）によって、またはHIF-1に類似する産生効果によって骨髄が刺激されて、血管形成因子の発現が増加する。同様のアプローチでは、内皮PASドメインタンパク質1（EPAS1）への自家骨髄の曝露が行われる。EPAS1は構造的および機能的にHIF-1と高い相同性を持ち、HIF-2としても知られている。
本発明のもう一つの態様において、HIF-1によってVEGFプロモーターの活性を高めるために、骨髄細胞を培養中にエキソビボにおいて低酸素状態または例えば超音波、RF、もしくは電磁エネルギーのような他の形のエネルギーに曝露することができる。この介入によってVEGFおよびその他の遺伝子の発現が増加する。この効果により、骨髄の血管形成刺激能を増大させることができる可能性がある。従って、この態様において、本発明は、吸引された自家骨髄のHIF-1（またはHIF-1の影響を増大させる産物、もしくは骨髄に対してHIF-1とほぼ等しい作用を生じる産物）によるエキソビボでの刺激、または心臓および／または末梢の虚血組織における側枝依存性潅流を増大させるために骨髄の低酸素環境への直接曝露およびその後の活性化された骨髄細胞の虚血心筋または末梢臓器（例えば、虚血四肢）への送達を伴う。
現在のデータは、側枝機能の増強における単球由来サイトカインの重要性を示している。単球はインビボにおいて側枝の増殖時に活性化されて、単球走化性タンパク質-1（MCP-1）はインビトロにおいて剪断ストレスによってアップレギュレートされる。単球は側副血管成長（動脈形成）および毛管発芽（血管新生）時に血管壁に付着することが示されている。MCP-1は、ウサギ慢性的後肢虚血モデルにおいて大腿動脈の閉塞後に側枝増殖を増強することが示された（Itoら、Circ Res 1997; 80: 829-3）。単球の活性化は、側枝増殖および毛管発芽において重要な役割を担うと思われる。LPSによる単球補充の増加に伴って、実験的動脈閉塞後7日に毛管密度の増加ならびに側枝および末梢の伝導度の増大が見られる（Arms M.ら、J Clin Invest 1998;101:40-50）。
本発明のさらなる局面は、吸引された自家骨髄のMCP-1によるエキソビボにおける刺激、その後の心筋および／または末梢虚血組織における側枝依存潅流および筋機能を高めさせるための活性化された骨髄細胞の虚血心筋または末梢臓器（例えば、虚血四肢）への直接送達を伴う。骨髄の刺激は、タンパク質の形のMCP-1への骨髄の直接曝露によって行うことが可能であり、またはMCP-1遺伝子を持つベクターを用いて骨髄細胞にトランスフェクトすることができる。例えば、骨髄、または骨髄に由来する早期付着細胞はMCP-1導入遺伝子を持つプラスミドベクターまたはアデノウイルスベクターによってトランスフェクトすることができる。
顆粒球-単球コロニー刺激因子（GM-CSF）および顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）は単球成熟における刺激サイトカインであり、通常、癌患者において免疫抑制療法または化学療法に反応して生じる枯渇性白血球数（即ち、白血球減少症または顆粒球減少症もしくは単球減少症）のような様々な血液学的病理学に関する臨床業務において利用される多機能性造血増殖因子である。GM-CSFは、赤芽球バースト形成単位、好酸球コロニー形成単位（CSF）および多機能（CSF）、ならびに顆粒球-マクロファージCSF、および顆粒球CFUからのインビトロにおけるコロニー形成を誘発する多系統成長因子としても説明されている（Bot F. J., Exp Hemato 1989,17: 292-5）。GM-CSFへのエキソビボでの曝露は、CD-34+始原細胞の急速な増殖を誘発することが示されている（Egeland T.ら、Blood 1991; 78: 3192-g.）。これらの細胞は血管内皮細胞に分化する能力を持ち、本来、出生後の血管形成に関与する可能性がある。さらに、GM-CSFはマクロファージ／単球の増殖、分化、運動性および生存性（アポトーシス率の低下）に対して多くの刺激作用を持つ。骨髄由来内皮始原細胞および単球に対する複合した既知の影響に一致して、GM-CSFを虚血心血管系臓器における新規血管の形成および分化を誘発するための自家骨髄注射に対する補助的治療法として使用することは本発明のもう一つの局面である。さらに、GM-CSFは骨髄によって、骨髄の効果を増強することによって、またはインビボもしくはインビトロのいずれかにおいて投与された際にHIF-1、EPAS1、低酸素状態またはMCP-1のような物質によっても刺激される骨髄をさらに刺激することによって、治療的心筋血管形成をさらに高めさせることができる。
トランスフェクトされた細胞が本明細書に述べられるように治療部位に注射された際に細胞および／または患者において発現するために、例えば、患者から採取されたABM細胞をエキソビボにおいて、血管新生サイトカイン成長因子、またはHIF-1もしくはEPSA1導入遺伝子のような哺乳類血管形成促進因子導入遺伝子を持つプラスミドベクターまたはアデノウイルスベクターを用いてトランスフェクトすることができる。
しかし、溶液中の新鮮骨髄または骨髄細胞に本明細書で述べられる治療用サイトカイン、成長因子および血管形成促進因子をコードするベクターを用いてトランスフェクトするのは困難である。この問題点を克服するため、骨髄細胞由来の早期付着細胞を容器に付着させるための十分な期間、骨髄細胞を容器内で生育させてその初期付着細胞をトランスフェクションのために選択すると、導入遺伝子を持つベクターを用いてエキソビボ（即ち、培養中）において骨髄細胞にトランスフェクトすることのできる効率が大きく上昇することが発見されている。本明細書で用いられる用語の「初期付着細胞」は、骨髄を含む培養培地または容器に接種した骨髄細胞から得られる細胞であって、約8時間（例えば、一晩）ないし約24時間にわたって適切な培養条件において生育した後に洗い流されない細胞を意味する。初期付着細胞は主として単球、内皮前駆細胞、またはその他の造血系譜の細胞である。接種は、約3日から約28日までの期間にわたって細胞培養後、例えば約3日から約14日後、または約3日から約7日後に実施される。初期付着細胞は、当技術分野において既知の任意の方法によって、例えば、接種後に約2時間から約3日間のインビトロでの接触によって、一つまたは複数の血管新生サイトカイン、成長因子、および／または哺乳類細胞における血管形成を促進する因子をコードするベクターと共に接種することができる。用いられるベクターは当技術分野において既知の任意のベクターから選択することができ、本明細書で述べられるベクターなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。ベクター（例えば、ウイルス）は、一般に、接種後約2時間ないし約3日後に、患者への投与に備えて細胞を調製する前に洗浄される。
選択的に、ABMは、約300μから約200μよりも大きい粒子を除去するために、容器に入れる前にろ過することができる。骨髄細胞も容器内で増殖させて初期付着細胞を産生させるためにろ過したABMから分離することができる。適切な培養条件は当技術分野において周知であり、本明細書の実施例に述べられる条件などが挙げられる。
本発明に基づく骨髄由来初期付着細胞のトランスフェクションに適切な移入遺伝子は、HIF-1、EPAS1（別名、HIF-2）、MCP-1、CM-CSFなどのような血管形成促進物質をコードする遺伝子が含まれるが、それらに限定されるものではない。本明細書で述べられるように調製された骨髄由来のトランスフェクトされた初期付着細胞の有効量を患者の所望の部位に直接投与（即ち、注入）して、患者のその部位における側副血管形成を促進することができる。血管形成促進物質をトランスフェクトした細胞の投与における特に有効な部位には、心筋および／または末梢の虚血組織に側枝依存性の潅流を増大させるため、心筋または脚などの骨格筋が含まれる。
骨髄細胞の強化されたトランスフェクション効率を得るための本発明の方法に関する非限定的な例示として、上記にように調製した骨髄由来初期付着細胞にトランスフェクトするために、アデノウイルスベクターにおけるX-gal移入遺伝子を利用した試験が実施されている。これらの試験は、トランスフェクション後に適切な期間、トランスフェクトした細胞をX-galで染色すると、非付着性の骨髄細胞または新鮮骨髄に比べて、骨髄由来初期付着細胞のトランスフェクションに対する感受性が大幅に高まることを示している。
治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、細胞膜を介してコードした産物を「輸送」することのできるシグナル配列に「機能的に付随する」または「動作可能なように関連する」ことができる。このような様々なシグナル配列が知られていて、当業者は過度の実験を行わずに使用することができる。
このような目的を考慮された遺伝子伝達ベクター（「発現ベクター」とも呼ばれる）は、その発現および／または複製のために宿主細胞内に核酸を輸送するために用いられる組換え型核酸分子である。発現ベクターは環状または線状のいずれでも可能であり、様々な核酸構築物を内部に取り込むことができる。発現ベクターは一般にプラスミドの形で提供されて、適切な宿主細胞に導入されると、挿入された核酸を発現する。
遺伝子治療での使用に適切なウイルスベクターは、特定の宿主系、特に哺乳類の系での使用のために開発されていて、例えば、レトロウイルスベクター、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）に基づくようなその他のレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターなどが含まれる（それぞれ、参照として本明細書に組み入れられるMillerおよびRosman, BioTechniques 7: 980-990,1992；Andersonら、Nature 392: 25-30 Suppl., 1998；VermaおよびSomia, Nature 389 : 239-242,1997；Wilson, New Engl. J. Med. 334: 1185-1187 (1996)を参照されたい）。好ましい遺伝子導入ベクターは、進行性冠動脈閉塞患者に側副動脈を発生させるcDNAを持つ非増殖性アデノウイルスである（Barrら、"PCGT Catheter-Based Gene Transfer Into the Heart Using Replication-Deficient Recombinant Adenoviruses," Journal of Cellular Biochemistry, Supplement 17D, p. 195, Abstract P101 (Mar. 1993)；Barrら、"Efficient catheter-mediated gene transfer into the heart using replication-defective adenovirus," Gene Therapy, vol. 1:51-58 (1994)）。一般に、対象となる遺伝子は、インビボの心筋細胞（および骨格筋細胞）ならびにコードされるタンパク質の直接的構成的産生物を含む心臓（または骨格筋）に伝達されうる。
ヘルパー非依存、非増殖性ヒトアデノウイルス5の系を含めて、いくつかの異なる遺伝子導入アプローチが実施可能である。ヒトアデノウイルス5に基づく遺伝子組換え型アデノウイルスベクター（Virology 163: 614-617, 1988）はアデノウイルスゲノムに由来する必須の初期遺伝子（通常、ElA/E1B）を欠いていて、従って、イントランスにおいてこの欠失した遺伝子産物を提供する許容性細胞株中で生育しない限り、増殖することができない。欠失アデノウイルスゲノム配列の代わりに、対象とする導入遺伝子をクローニングして、非増殖性アデノウイルスを感染させた組織／細胞中で発現させることができる。アデノウイルスに基づく遺伝子導入は導入遺伝子の宿主ゲノムへの組込みを起こさず（アデノウイルスに介在されるトランスフェクションの0.1％未満が導入遺伝子の宿主DNAに組み込まれる）、従って、不安定であるが、アデノウイルスベクターは高力価で増殖して非増殖性細胞に十分にトランスフェクトすることができる。
宿主の個体、細胞または細胞系に導入される外因性核酸の量について、当業者は治療が行われる個人の必要性に応じて変更することができる。例えば、遺伝子伝達を実施するためにウイルスベクターが用いられる場合、トランスフェクトされる細胞に導入される核酸の量は、ウイルスベクターのプラーク形成単位（PFU）の量を変えることによって調節することができる。
本発明のもう一つの態様において、患者からABMを採取して、骨髄による初期付着細胞の産生を促進し得る十分な期間、そのABMを適切な培養条件下において容器内で増殖させて初期付着細胞を容器に付着させることによって、必要とする患者に側副血管形成を増大させるための方法を提供する。初期付着細胞は、上記のような培養中（即ち、インビトロ）において、血管新生サイトカイン、成長因子および哺乳類血管形成促進因子などから選択される一つ以上の物質をコードするポリヌクレオチドを含む本明細書に述べられるようなベクターを用いてトランスフェクトして、続いて、発現した物質を所望の部位に送達するために、加工された（即ち、トランスフェクトされた）初期付着細胞（および／またはトランスフェクション後にそれらの細胞が培養された培地）を患者の所望の部位に直接投与する。例えば、一つの態様において、血管形成促進物質はトランスフェクトした細胞が注射される患者体内で一時的に発現して、それによって治療用血管形成促進物質またはその組み合わせが虚血部位に送達されて患者体内の投与部位において側副血管形成を増大させることができる。
本明細書で用いられるように、「転写調節領域」という語句は、mRNA転写の開始を制御する核酸または遺伝子構築物の部分を示す。非哺乳類性の転写活性化物質の非存在下において、本明細書での使用を考慮された調節領域は、一般に、リガンド／レセプターペプチド複合体に反応性の調節エレメントと組み合わせて少なくとも最小プロモーターを含む。調節エレメントと組み合わせると、最小プロモーターは、リガンド／機能性ダイマー複合体に反応してmRNA転写を開始する。しかし、必要な誘導因子（そのリガンド）が存在しない限り、転写は起こらない。但し、本明細書で述べられるように、本発明のキメラタンパク質異種二量体の一部は、DNA結合ドメインのリガンドがない場合であってもmRNAの転写を活性化または抑制する。
本明細書で用いられるように、「動作可能なように関連する」という語句は、DNAと、プロモーター、エンハンサー、転写および翻訳終止部位、ならびにその他のシグナル配列のようなヌクレオチドの調節およびエフェクター配列との機能的関連性を示す。例えば、DNAのプロモーターに対する動作可能な連鎖は、DNAと、そのDNAを特異的に認識、結合および転写するRNAポリメラーゼによってそのようなDNAの転写を開始するプロモーターの間の物理的および機能的関係を示す。
好ましくは、転写調節領域は、ユビキタスな転写因子の結合部位をさらに含む。このような結合部位は、好ましくはプロモーターと調節エレメントの間に位置する。本明細書での使用に適切なユビキタスな転写因子は当技術分野において周知であり、例えば、Sp1が含まれる。
例示的真核発現ベクターには、pSV-2 gpt系（Mulliganら、(1979) Nature, 277: 108-114）、PBLUESKRIP（登録商標）ベクター（Stratagene, La Jolla, CA）、Genetics Instituteによって報告されている発現クローニングベクター（Science, (1985) 228: 810-815）などのような真核性構築物が含まれる。これらの各プラスミドベクターは、対象とするタンパク質の発現を促進することができる。
具体的態様において、本明細書で使用を考慮されている遺伝子導入ベクターは、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、単純性疱疹ウイルスによるベクター、遺伝子治療のための合成ベクターなどのようなウイルスベクターである（例えば、Suhrら、Arch. of Neurol. 50: 1252-1268, 1993を参照されたい）。例えば、本明細書で用いられる遺伝子導入ベクターはレトロウイルスベクターであってよい。本明細書で使用を考慮されているレトロウイルスベクターは、2つのレトロウイルス性LTRの間にある外因性核酸を含む発現構築物を持つ遺伝子導入プラスミドである。レトロウイルスベクターは、一般に、レトロウイルスベクター、またはそのレトロウイルスベクターを鋳型として転写されるRNAを適切なパッケージング細胞株中でウイルスビリオンにパッケージングできる適切なパッケージングシグナルを含む（例えば、米国特許第4,650,764号を参照されたい）。
本明細書での使用に関して適切なレトロウイルスベクターは、例えば、米国特許第5,399,346号および第5,252,479号、ならびに国際公開公報第92/07573号、国際公開公報第90/06997号、国際公開公報第89/05345号、国際公開公報第92/05266号、および国際公開公報第92/14829号に述べられていて、それぞれは参照として全体が本明細書に組み入れられる。これらの資料は、このようなレトロウイルスベクターを用いたヒト細胞への効率的な核酸導入のための方法に関する説明を提供する。その他のレトロウイルスベクターには、例えば、マウス乳腺腫瘍ウイルスベクター（例えば、Shacklefordら、(1988) PNAS, USA, 85: 9655-9659）、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Naldiniら、(1996) Science 272: 165-320）などが含まれる。
本質的に増殖ウイルスを含まないレトロウイルスベクター粒子を産生するヘルパー細胞を提供するための様々な手順も、当技術分野において周知である。例えば、米国特許第4,650,764号；Miller, Human Gene Therapy, 1: 5-14, 1990；Markowitzら、Journal of Virology, 61(4): 1120-1124, 1988；Watanabeら、Molecular and Cellular Biology, 3(12): 2241-2249,1983；Danosら、PNAS, 85: 6460-6464, 1988；およびBosselmanら、Molecular and Cellular Biology, 7(5): 1797-1806, 1987を参照されたい。これらには、増殖ウイルスを含むウイルスベクター産生の機会を最小限に抑えるウイルスベクターおよびヘルパー細胞産生のための手順を開示されている。
血管形成成長因子のような治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドとのプレパッケージングに適した遺伝子組換え型レトロウイルスは、周知のレトロウイルスビリオン産生方法を用いて産生される。例えば、米国特許第4,650,764号；Miller、前記、1990；Markowitzら、前記、1988；Watanabeら、前記、1983；Danosら、PNAS, 85: 6460-6464, 1988；およびBosselmanら、Molecular and Cellular Biology, 7(5): 1797-1806, 1987を参照されたい。
次の実施例では、本発明の局面に関する一部の試験を示す。これらの実施例は限定的なものではない。
実施例
実施例1
骨髄培養培地の内皮細胞増殖に対する影響
採取した吸引ブタ自家骨髄細胞が強力な血管形成因子であるVEGFおよび重要な血管形成補因子として最近同定されているMCP-1を分泌するか否かについて調べるための試験が実施された。骨髄は4週間、インビトロにおいて培養した。調整済みの培地を培養ブタ大動脈内皮細胞（PAEC）に加えて、4日後に増殖を調べた。調整済みの培地中のVEGFおよびMCP-1の値をELISAで測定した。4週間の培養期間中にBM細胞はVEGFおよびMCP-1を分泌して、それらの濃度は時間依存的に増加した。得られた調整済みの培地は、用量依存的に、PAECの増殖を高めさせた。これらの結果は、BM細胞がVEGFおよびMCP-1のような強力な血管新生サイトカインを分泌して血管内皮細胞の増殖を誘発できることを示している。
実施例1
骨髄培養培地の内皮細胞増殖に対する影響
採取した吸引ブタ自家骨髄細胞が強力な血管形成因子であるVEGFおよび重要な血管形成補因子として最近同定されているMCP-1を分泌するか否かについて調べるための試験が実施された。骨髄は4週間、インビトロにおいて培養した。調整済みの培地を培養ブタ大動脈内皮細胞（PAEC）に加えて、4日後に増殖を調べた。調整済みの培地中のVEGFおよびMCP-1の値をELISAで測定した。4週間の培養期間中にBM細胞はVEGFおよびMCP-1を分泌して、それらの濃度は時間依存的に増加した。得られた調整済みの培地は、用量依存的に、PAECの増殖を高めさせた。これらの結果は、BM細胞がVEGFおよびMCP-1のような強力な血管新生サイトカインを分泌して血管内皮細胞の増殖を誘発できることを示している。
ブタ骨髄培養
骨髄（BM）細胞は慢性心筋虚血のブタから防腐剤フリーのヘパリン（20単位/ml BM細胞）であって、無菌条件下で回収して、300μおよび200μのステンレススチール製メッシュフィルターを順次用いてろ過した。続いて、BM細胞をFicoll-Hypaque濃度勾配遠心分離法によって単離して、T-25培養フラスコ内で33℃、5％CO2において長期培養培地（LTCM）（Stem Cell Tech, Vancouver, British Columbia, Canada）で培養した。各培養におけるBMCの播種密度は7×106/mlであった。週1回、培地の半量を回収して、新鮮なLTCMと交換した。回収した培地をろ過処理（0.2μフィルター）して、後続の，酵素免疫測定法（ELISA）および細胞増殖アッセイに備えて−200℃にて保存した。
骨髄（BM）細胞は慢性心筋虚血のブタから防腐剤フリーのヘパリン（20単位/ml BM細胞）であって、無菌条件下で回収して、300μおよび200μのステンレススチール製メッシュフィルターを順次用いてろ過した。続いて、BM細胞をFicoll-Hypaque濃度勾配遠心分離法によって単離して、T-25培養フラスコ内で33℃、5％CO2において長期培養培地（LTCM）（Stem Cell Tech, Vancouver, British Columbia, Canada）で培養した。各培養におけるBMCの播種密度は7×106/mlであった。週1回、培地の半量を回収して、新鮮なLTCMと交換した。回収した培地をろ過処理（0.2μフィルター）して、後続の，酵素免疫測定法（ELISA）および細胞増殖アッセイに備えて−200℃にて保存した。
ブタ大動脈内皮細胞の単離および培養
新鮮なブタ大動脈内皮細胞（PAEC）は、通常の方法を用いて単離した。2％FBS、ヒドロコルチゾン、ヒトFGF、VEGF、ヒトEGF、IGF、ヘパリンおよび抗生物質を含む内皮細胞生育培地（EGM-2培地、Clonetics, San Diego, CA）、37℃、5％二酸化炭素。約7日で細胞が密集に達した時点で、2.5％トリプシンによって細胞を分離した後、10％FBSを加えた199培地で培養した。細胞の同一性は典型的な内皮細胞形態学および第VIII因子の免疫組織化学的染色によって確認した。増殖試験には、3から10回継代培養物を使用した。
新鮮なブタ大動脈内皮細胞（PAEC）は、通常の方法を用いて単離した。2％FBS、ヒドロコルチゾン、ヒトFGF、VEGF、ヒトEGF、IGF、ヘパリンおよび抗生物質を含む内皮細胞生育培地（EGM-2培地、Clonetics, San Diego, CA）、37℃、5％二酸化炭素。約7日で細胞が密集に達した時点で、2.5％トリプシンによって細胞を分離した後、10％FBSを加えた199培地で培養した。細胞の同一性は典型的な内皮細胞形態学および第VIII因子の免疫組織化学的染色によって確認した。増殖試験には、3から10回継代培養物を使用した。
調整済み培地の大動脈内皮細胞に対する影響
細胞増殖試験： トリプシン処理によって、PAEC（3から10回継代）を培養フラスコから回収した。分離した細胞を96穴培養プレートに移して、細胞5000個/ウェルの播種密度でプレートに播種した。増殖およびDNA合成実験で使用する前に、細胞を2から3日培養した。BM細胞培養の調整済み培地を4週の時点で回収して、7本の培養フラスコから得られた培地をプールしてバイオアッセイに使用した。プールした調整済み培地のアリコート（10μL、30μL、100μLまたは200μL）、またはLTCM（200μL、対照として）を三連にて96穴プレートの密集PAECに加えた。調整済み培地または対照培地を用いて4日間培養後、PAECをトリプシン処理して細胞カウンター（Coulter Counter Beckman Corporation, Miami FL）を用いてカウントした。
細胞増殖試験： トリプシン処理によって、PAEC（3から10回継代）を培養フラスコから回収した。分離した細胞を96穴培養プレートに移して、細胞5000個/ウェルの播種密度でプレートに播種した。増殖およびDNA合成実験で使用する前に、細胞を2から3日培養した。BM細胞培養の調整済み培地を4週の時点で回収して、7本の培養フラスコから得られた培地をプールしてバイオアッセイに使用した。プールした調整済み培地のアリコート（10μL、30μL、100μLまたは200μL）、またはLTCM（200μL、対照として）を三連にて96穴プレートの密集PAECに加えた。調整済み培地または対照培地を用いて4日間培養後、PAECをトリプシン処理して細胞カウンター（Coulter Counter Beckman Corporation, Miami FL）を用いてカウントした。
PAECのDNA合成に対する調整済み培地の影響
プールした試料から得られた調整済み培地の一部分（10μL、30μL、100μLまたは200μL）または対照培地（LTCM、200μL）を三連にて96穴プレートのPAEC（播種密度は上記と同一）に加えた。2日後に1μCiトリチウムチミジンを各ウェルに加えた。48時間後、細胞ハーベスター（Mach III M Tomtec, Hamden, CT）を用いてPAEC中のDNAを回収して、液体シンチレーション計測法（Multi-detector Liquid Scintillation Luminescence Counter EG & G Wallac, Turku, Finland）により放射能を測定した。
プールした試料から得られた調整済み培地の一部分（10μL、30μL、100μLまたは200μL）または対照培地（LTCM、200μL）を三連にて96穴プレートのPAEC（播種密度は上記と同一）に加えた。2日後に1μCiトリチウムチミジンを各ウェルに加えた。48時間後、細胞ハーベスター（Mach III M Tomtec, Hamden, CT）を用いてPAEC中のDNAを回収して、液体シンチレーション計測法（Multi-detector Liquid Scintillation Luminescence Counter EG & G Wallac, Turku, Finland）により放射能を測定した。
ELISA VEGFによる調整済み培地中のVEGFおよびMCP-1の定量
調整済み培地中のVEGFの濃度は、サンドイッチELISAキット（Chemicon International Inc., Temecula, CA）を用いて測定した。要約すると、調整済み培地中のVEGFまたは既知の濃度の遺伝子組換え型VEGを結合させるために、抗ヒトVEGF抗体で予めコーティングしたプレートを用いた。複合体は、捕捉されたVEGFに結合するビオチン化抗VEGF抗体によって検出した。代わって、ビオチン化VEGF抗体はストレプトアビジン-アルカリホスファターゼおよび発色液によって検出した。抗ヒトVEGF抗体は、ブタVEGFと交差反応する。
調整済み培地中のVEGFの濃度は、サンドイッチELISAキット（Chemicon International Inc., Temecula, CA）を用いて測定した。要約すると、調整済み培地中のVEGFまたは既知の濃度の遺伝子組換え型VEGを結合させるために、抗ヒトVEGF抗体で予めコーティングしたプレートを用いた。複合体は、捕捉されたVEGFに結合するビオチン化抗VEGF抗体によって検出した。代わって、ビオチン化VEGF抗体はストレプトアビジン-アルカリホスファターゼおよび発色液によって検出した。抗ヒトVEGF抗体は、ブタVEGFと交差反応する。
ELISAによる調整済み培地中のMCP-1の測定
調整済み培地中のMCP-1の濃度は、サンドイッチ酵素免疫アッセイキット（R & D Systems, Minneapolis, MN）によりアッセイした：抗ヒトMCP-1抗体で予めコーティングしたプレートを用いて、調整済み培地中のMCP-1または既知の濃度の組換え型タンパク質を結合させた。複合体は、捕捉されたMCP-1に結合するビオチン化抗MCP-1抗体により検出した。代わって、ビオチン化MCP-1抗体は、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼおよび発色液によって検出した。抗ヒトMCP-1抗体は、ブタMCP-1と交差反応する。
調整済み培地中のMCP-1の濃度は、サンドイッチ酵素免疫アッセイキット（R & D Systems, Minneapolis, MN）によりアッセイした：抗ヒトMCP-1抗体で予めコーティングしたプレートを用いて、調整済み培地中のMCP-1または既知の濃度の組換え型タンパク質を結合させた。複合体は、捕捉されたMCP-1に結合するビオチン化抗MCP-1抗体により検出した。代わって、ビオチン化MCP-1抗体は、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼおよび発色液によって検出した。抗ヒトMCP-1抗体は、ブタMCP-1と交差反応する。
結果
4週の時点で回収したBM調整済み培地は、PAECの増殖を用量依存的に増加させた（図1）。このことは、細胞数を直接カウントすることによって、またトリチウムチミジンの取り込みを測定することによって実証された（両測定とも、p＜0.001）。この用量関連性の反応は減少傾向を示した；200μL調整済み培地を加えた場合の増殖は、30μLおよび100μLに比べて減少した（両比較とも、P＝0.003）。同様の用量依存的な結果は、トリチウムチミジン取り込み試験において認められた（200μLに比べて、30μLおよび100μLにおいて、それぞれ、P＝0.03）。
4週の時点で回収したBM調整済み培地は、PAECの増殖を用量依存的に増加させた（図1）。このことは、細胞数を直接カウントすることによって、またトリチウムチミジンの取り込みを測定することによって実証された（両測定とも、p＜0.001）。この用量関連性の反応は減少傾向を示した；200μL調整済み培地を加えた場合の増殖は、30μLおよび100μLに比べて減少した（両比較とも、P＝0.003）。同様の用量依存的な結果は、トリチウムチミジン取り込み試験において認められた（200μLに比べて、30μLおよび100μLにおいて、それぞれ、P＝0.03）。
新たに吸引されたBM細胞の限定的な数（5±4％）が、第VIII因子に関して陽性に着色した。結果を図2に示す。これは4週間培養したBM細胞付着層の57±14％とは対照的であり、この内の60±23％は内皮様細胞であり、40±28％は巨核球であると思われた。
4週間の期間を通して、BM調整済み培地中のVEGFおよびMCP-1の濃度は、それぞれ、第1週の値の10倍および3倍まで徐々に増加した（両比較とも、P＜0.001）（図3）。これに対して、BMに曝露していない対照培養培地中のVEGFおよびMCP-1の値は、図4に示す通り、それぞれ、0および11±2pg/mlであった。
実施例2
培養ブタ骨髄細胞によるVEGF分泌に対する低酸素の影響
低酸素状態が培養骨髄内皮細胞によるVEGFの発現を著しく増加させることが実証されて、それらの結果は、エキソビボにおける低酸素状態への曝露は、低酸素症誘発性血管形成因子の発現増加によって、虚血筋組織に注射される骨髄細胞およびその調整済み培地の側枝増強効果をさらに高めることができることを示している。ブタ骨髄を回収して、300μおよび200μステンレススチール製メッシュフィルターを順次用いてろ過処理した。続いて、Ficoll-Hypaque密度勾配遠心分離法によってBMCを単離して、T-75培養フラスコを用いて33℃、5％CO2にて培養した。約7日で細胞が密集となった時点で、トリプシン処理によって細胞を1：3に分割した。4週間培養後、BMCを低酸素条件（1％酸素を含むチャンバーに収容）に24から120時間曝露するか、あるいは通常の条件下で維持した。得られた調整済み培地を回収して、VEGF、MCP-1をELISAによって分析した。
培養ブタ骨髄細胞によるVEGF分泌に対する低酸素の影響
低酸素状態が培養骨髄内皮細胞によるVEGFの発現を著しく増加させることが実証されて、それらの結果は、エキソビボにおける低酸素状態への曝露は、低酸素症誘発性血管形成因子の発現増加によって、虚血筋組織に注射される骨髄細胞およびその調整済み培地の側枝増強効果をさらに高めることができることを示している。ブタ骨髄を回収して、300μおよび200μステンレススチール製メッシュフィルターを順次用いてろ過処理した。続いて、Ficoll-Hypaque密度勾配遠心分離法によってBMCを単離して、T-75培養フラスコを用いて33℃、5％CO2にて培養した。約7日で細胞が密集となった時点で、トリプシン処理によって細胞を1：3に分割した。4週間培養後、BMCを低酸素条件（1％酸素を含むチャンバーに収容）に24から120時間曝露するか、あるいは通常の条件下で維持した。得られた調整済み培地を回収して、VEGF、MCP-1をELISAによって分析した。
低酸素状態への曝露は、VEGF分泌を著しく増加させた：24時間の時点におけるVEGF濃度は、正常酸素状態における106±13pg/mlから、低酸素状態における1,600±196pg/mlに増加した（p＝0.0002）；120時間後の同濃度は4,163±62から6,028±167pg/mlに増加した（p＜0.001）。新たに単離したBMCを用いた別の試験が実施されて、同一の傾向が認められた。低酸素状態は、BMCの増殖率も鈍化させた。MCP-1発現は低酸素状態によって増加しなかったが、プロモーターがHIF結合部位を持つことが知られていないので予想外の所見ではなかった。
実施例3
骨髄培養培地の内皮細胞管腔形成に対する影響
ブタ内皮細胞および血管平滑筋細胞の同時培養技術を用いて、骨髄細胞の調整済み培地がインビトロにおいて構造的血管形成を誘発することが実証された。骨髄調整済み培地に曝露されない場合、血管形成に対するこのような影響は認められなかった。これらの結果は、骨髄細胞およびそれらの分泌因子が前血管形成作用を示すことを示唆する。
骨髄培養培地の内皮細胞管腔形成に対する影響
ブタ内皮細胞および血管平滑筋細胞の同時培養技術を用いて、骨髄細胞の調整済み培地がインビトロにおいて構造的血管形成を誘発することが実証された。骨髄調整済み培地に曝露されない場合、血管形成に対するこのような影響は認められなかった。これらの結果は、骨髄細胞およびそれらの分泌因子が前血管形成作用を示すことを示唆する。
実施例4
慢性心筋虚血モデルにおける自家骨髄経心内膜送達の側枝潅流および局所機能に対する影響
慢性心筋虚血は、左冠動脈回旋枝にアメロイド圧迫器を装着することによって14頭のブタにおいて作られた。装着4週間後、7頭の動物に対して経心内膜注射カテーテルを用いて虚血域に新たに吸引したABMを経心内膜注射して（1頭当たり2.4mlを12箇所に注射）、7頭の対照動物にはヘパリン添加生理食塩液を注射した。ベースラインおよび4週間後に、局所収縮性（心筋肥厚％）を調べるために動物について安静時および歩行時の心エコー図を記録して、さらに安静時およびアデノシン注入時における側枝依存潅流を調べるためにミクロスフィア試験を実施した。ABM注射4週後、ABMを投与したブタでは側副血流（虚血域／正常域×100の割合として示す）が改善したが、対照動物では改善しなかった（ABM：安静時95±13対81±11、P＝0.017；アデノシン注入時85±19対72±10、P＝0.046；対照：安静時86±14対86±14、P＝NS；アデノシン注入時73±17対72±14、P＝0.63）。同様に、収縮率はABMを投与したブタにおいて増大したが、対照動物では増大しなかった（ABM：安静時83±21対60±32、P＝0.04；歩行時91±44対35±43、P＝0.056；対照：安静時69±48対64±46、P＝0.74；歩行時65±56対37±56、P＝0.23）。
慢性心筋虚血モデルにおける自家骨髄経心内膜送達の側枝潅流および局所機能に対する影響
慢性心筋虚血は、左冠動脈回旋枝にアメロイド圧迫器を装着することによって14頭のブタにおいて作られた。装着4週間後、7頭の動物に対して経心内膜注射カテーテルを用いて虚血域に新たに吸引したABMを経心内膜注射して（1頭当たり2.4mlを12箇所に注射）、7頭の対照動物にはヘパリン添加生理食塩液を注射した。ベースラインおよび4週間後に、局所収縮性（心筋肥厚％）を調べるために動物について安静時および歩行時の心エコー図を記録して、さらに安静時およびアデノシン注入時における側枝依存潅流を調べるためにミクロスフィア試験を実施した。ABM注射4週後、ABMを投与したブタでは側副血流（虚血域／正常域×100の割合として示す）が改善したが、対照動物では改善しなかった（ABM：安静時95±13対81±11、P＝0.017；アデノシン注入時85±19対72±10、P＝0.046；対照：安静時86±14対86±14、P＝NS；アデノシン注入時73±17対72±14、P＝0.63）。同様に、収縮率はABMを投与したブタにおいて増大したが、対照動物では増大しなかった（ABM：安静時83±21対60±32、P＝0.04；歩行時91±44対35±43、P＝0.056；対照：安静時69±48対64±46、P＝0.74；歩行時65±56対37±56、P＝0.23）。
これらの結果は、カテーテルによるABMの経心内膜的移植は虚血心筋における側副潅流および心筋機能を増大させることが可能であることを示していて、これらの所見はこのアプローチが最適な治療的血管形成を達成するための新しい治療方法である可能性があることを示唆している。
体重約70kgの14頭の特定病原体除去（SPF）ブタを麻酔して挿管し、全処理中、1から2％イソフルレン吸入に加えて補助O2を2L/分の割合で与えた。動脈アクセスは右大腿動脈分離および8 Frenchシースの付着点を経由して求められた。左冠動脈回旋枝は左側開胸を介して分離され、金属で覆ったアメロイド圧迫器をその動脈の近位部に装着した。アメロイド圧迫器の装着4週後にすべてのブタについて、（1）アメロイド閉塞の確認および側副血流の評価のための選択的左右冠動脈血管造影；（2）経胸壁心エコー試験；および（3）局所心筋血流評価を行った。
骨髄の穿刺および調製、ならびに経心内膜注射
ベースライン評価の完了後直ちに、すべての動物について標準的技術を用いて左大腿骨幹からBM穿刺を行った。BMは、防腐剤フリーのヘパリン添加ガラスシリンジ（ヘパリン20単位/1ml新鮮BM）を用いて穿刺した2箇所から得た（1箇所当たり3ml）。吸引した骨髄は直ちに300μおよび200μのステンレススチールフィルターを順次用いてマクロフィルターにかけた。続いて、虚血心筋領域およびその境界域に向けて、骨髄を経心内膜注入カテーテルを用いて心筋に12箇所、注入した（注入一箇所当たり0.2ml、合計2.4ml）。
ベースライン評価の完了後直ちに、すべての動物について標準的技術を用いて左大腿骨幹からBM穿刺を行った。BMは、防腐剤フリーのヘパリン添加ガラスシリンジ（ヘパリン20単位/1ml新鮮BM）を用いて穿刺した2箇所から得た（1箇所当たり3ml）。吸引した骨髄は直ちに300μおよび200μのステンレススチールフィルターを順次用いてマクロフィルターにかけた。続いて、虚血心筋領域およびその境界域に向けて、骨髄を経心内膜注入カテーテルを用いて心筋に12箇所、注入した（注入一箇所当たり0.2ml、合計2.4ml）。
心エコー検査調査
ベースラインおよびABM移植4週後のフォローアップ検査時に、ベースライン時および歩行中の動物について、乳頭筋中央部の単軸および長軸方向にて経胸壁心エコー図を記録した。短縮率は、壁肥厚％（収縮末期厚−拡張末期厚／拡張末期厚）×100を測定して求めた。これらの測定値は、虚血領域（体側領域）および遠隔領域（前中隔領域）から求めた。続いて、一時的ペースメーカー電極を右大腿静脈シースから挿入して、右心房に位置させた。動物を180/分にて2分間ゆっくり歩いて、同時にエコー心電図を記録した。
ベースラインおよびABM移植4週後のフォローアップ検査時に、ベースライン時および歩行中の動物について、乳頭筋中央部の単軸および長軸方向にて経胸壁心エコー図を記録した。短縮率は、壁肥厚％（収縮末期厚−拡張末期厚／拡張末期厚）×100を測定して求めた。これらの測定値は、虚血領域（体側領域）および遠隔領域（前中隔領域）から求めた。続いて、一時的ペースメーカー電極を右大腿静脈シースから挿入して、右心房に位置させた。動物を180/分にて2分間ゆっくり歩いて、同時にエコー心電図を記録した。
局所心筋血流量
局所心筋血流量の測定は、多くの蛍光発色ミクロスフィア（Interactive Medical Technologies, West Los Angeles, CA）を用いて安静時および最大冠動脈拡張時に行い、参照試料法（Heymann MAら、Prog Cardiovasc Dis 1977 ; 20: 55-79）により定量化した。蛍光ミクロスフィア（0.8ml、5×106ミクロスフィア/ml、直径 15μm、0.01％Tween 80の生食懸濁液）は6F Judkins左3.5診断用カテーテルを介して左心房に注入した。最大冠動脈拡張は、アデノシンを140μg/kg/分(Fujisawa USA, Deerfield, IL）の一定速度で左大腿静脈に6分間注入して、誘発した。注入終了前の2分間に、安静試験と同一の方法で、ミクロスフィアの注入および採血を行った。
局所心筋血流量の測定は、多くの蛍光発色ミクロスフィア（Interactive Medical Technologies, West Los Angeles, CA）を用いて安静時および最大冠動脈拡張時に行い、参照試料法（Heymann MAら、Prog Cardiovasc Dis 1977 ; 20: 55-79）により定量化した。蛍光ミクロスフィア（0.8ml、5×106ミクロスフィア/ml、直径 15μm、0.01％Tween 80の生食懸濁液）は6F Judkins左3.5診断用カテーテルを介して左心房に注入した。最大冠動脈拡張は、アデノシンを140μg/kg/分(Fujisawa USA, Deerfield, IL）の一定速度で左大腿静脈に6分間注入して、誘発した。注入終了前の2分間に、安静試験と同一の方法で、ミクロスフィアの注入および採血を行った。
潅流試験終了後、動物はペントバルビタールナトリウムおよびKCLの過量投与により屠殺した。心臓を回収して、乳酸リンゲル液でフラッシュして、10から15分間潅流固定後、10％緩衝ホルムアルデヒドを用いて3日間、浸漬固定した。固定完了後、心臓を短軸に沿って厚さ7mmに薄切した。中央の2枚の切片をそれぞれほぼ同じ大きさに8分割して、心内膜および心外膜のサブセグメントにさらに切り分けた。心内膜および心外膜における局所心筋血流量の評価には、8検体の体側虚血域および8検体の中隔正常域の各サブセグメント測定値の平均値を用いた。さらに相対側副血流量を、虚血域／非虚血域（IZ／NIZ）血流量の割合として算出した。
病理組織学
注射用カテーテルを使用してのBM吸引物の注射が細胞の機械的損傷に関連するか否かを調べるために、新たにろ過したABM吸引物をインビボ試験とほぼ等しい注入圧で注射針から押出する前および押出した後に標準的BM塗抹標本を作製した。形態学的評価は、試験プロトコールについて盲検化された第三者の熟練技術者によって実施された。
注射用カテーテルを使用してのBM吸引物の注射が細胞の機械的損傷に関連するか否かを調べるために、新たにろ過したABM吸引物をインビボ試験とほぼ等しい注入圧で注射針から押出する前および押出した後に標準的BM塗抹標本を作製した。形態学的評価は、試験プロトコールについて盲検化された第三者の熟練技術者によって実施された。
病理組織学的検査は試料採取した心組織について実施した。予備試験において、厚さ7mmの短軸組織切片をUV灯下で検査して、蛍光標識域を特定した。特定した各領域を全層にわたる隣接する3ブロック（中央、右および左）に切り分けて、10％緩衝ホルムアルデヒドを用いて浸漬固定した。続いて、このような各ブロックを3部位に切り分けて、この内の2部位はヘマトキシリンエオジン（H&E）で染色して、1部位はPAS染色を施した。さらに、各動物の虚血域から新鮮な蛍光標識組織ブロック1検体を採取して、OCT化合物（Sakura Finetek USA Inc., Torrance, CA）に包埋して、液体窒素で凍結した。これらの瞬間凍結心筋組織の凍結切片を風乾して、アセトンで固定した。自動Dako免疫染色機（Dako, Carpenteria, CA）を用いて、イムノペルオキシダーゼ染色を施した。固有のペルオキシダーゼおよび非特異的な取り込みは0.3％ハイドロゲンペルオキシダーゼおよび10％オボアルブミンで遮断した。抗CD-34マウスモノクローナル抗体（Becton Dickinson, San Jose, CA）を一次抗体として使用した。結合抗体はビオチン化したヤギ抗マウスIgG抗体であり、三次抗体はホースラディッシュペルオキシダーゼと結合したストレプトアビジンであった。ジアミノベンジジン（DAB）をクロモゲンとして使用し、切片は1％メチルグリーンで対比染色した。脱水および透明化後、切片をマウントして、Nikon Labphot顕微鏡で鏡検した。
有効性試験において、虚血領域および非虚血領域から採取した全層にわたる1.5平方センチメートルの組織片をパラフィン切片用に加工した。各試料を、H&E、マッソン三色染料、および第VIII因子関連抗原で染色した。イムノペルオキシダーゼ染色を施したスライドは、内皮細胞集団および血管形成の密度を調べた。後者は、管腔の存在によって前者と識別された。血管増生（Vascularity）は、虚血および非虚血心筋の内層側1/2から採取して第VIII因子染色を施したスライドの顕微鏡写真5枚の試料を用いて評価した。内皮細胞の密度は、同一の顕微鏡写真のディジタル処理した画像を用いて評価した。内皮細胞集団の密度は、強度閾値法を用いてSigma-Scan Pro形態計測ソフトウェアにより求めた。相対内皮面積パーセント（内皮面積／心筋の検査面積）に加えて、各試料および各標本における総内皮面積を求めた。さらに総内皮面積は、検査した心筋の非梗塞（生存）面積の相対パーセントとしても算出した。三色染色を施した切片をデジタル化して、青色に着色したコラーゲンの専有面積および（正常な状態でコラーゲンを含む）心外膜の占有面積を除いた切片の総面積を、Sigma-Scan Proを用いて求めた。次に、梗塞面積を青色色素の専有面積として算出した。
手術データ
ABMまたはプラセボの心筋内注射に付随する、平均血圧、心拍数における何らかの急性の変化、または不整脈の誘発はなかった。血行力学的パラメータはいずれも、2つの群間で同等であった。対比較は、フォローアップ検査と比較した指標において各群内でほぼ等しい血行力学的パラメータを示したが、対照群におけるフォローアップ時の初期平均動脈血圧は高い値を示し（P＝0.03）、その後、歩行またはアデノシン注入時には差は認められなかった。
ABMまたはプラセボの心筋内注射に付随する、平均血圧、心拍数における何らかの急性の変化、または不整脈の誘発はなかった。血行力学的パラメータはいずれも、2つの群間で同等であった。対比較は、フォローアップ検査と比較した指標において各群内でほぼ等しい血行力学的パラメータを示したが、対照群におけるフォローアップ時の初期平均動脈血圧は高い値を示し（P＝0.03）、その後、歩行またはアデノシン注入時には差は認められなかった。
心筋機能
局所的心筋機能評価を下記の表Iに示す。非虚血域に対する虚血域（IZ／NIZ）の割合×100として示した安静時および歩行時の診療前相対分別壁肥厚率は、試験群間でほぼ等しかった（それぞれ、P＝0.86および0.96）。ABMの心筋内注射後4週に、安静時および歩行時における局所的壁肥厚の改善が認められ、これは側枝依存性虚血側壁の壁肥厚が〜50％増大したことに起因した。対照動物には顕著な変化は認められなかったが、フォローアップ時の歩行時に虚血域において壁肥厚の改善傾向が認められた。
局所的心筋機能評価を下記の表Iに示す。非虚血域に対する虚血域（IZ／NIZ）の割合×100として示した安静時および歩行時の診療前相対分別壁肥厚率は、試験群間でほぼ等しかった（それぞれ、P＝0.86および0.96）。ABMの心筋内注射後4週に、安静時および歩行時における局所的壁肥厚の改善が認められ、これは側枝依存性虚血側壁の壁肥厚が〜50％増大したことに起因した。対照動物には顕著な変化は認められなかったが、フォローアップ時の歩行時に虚血域において壁肥厚の改善傾向が認められた。
（表I）虚血壁の局所収縮性
心筋潅流データ
局所心筋潅流検査を下記の表IIに示す。安静時およびアデノシン注入時における診療前の相対的経壁心筋潅流、IZ／NIZに、投与群および対照群の間で差はなかった（それぞれ、P＝0.42および0.96）。ABM注入後4週に、安静時および歩行時における相対的局所経壁心筋潅流が著しく改善した。これは安静時（57％の増加、P＝0.08）およびアデノシン注入時（37％、P＝0.09）における虚血域の心筋潅流が絶対的に改善したことに起因し、非虚血域への絶対血流量には、安静時（35％の増加、P＝0.18）またはアデノシン注入時（25％の増加、P＝0.26）とも顕著な変化は見られなかった。虚血域に見られた局所心筋血流量の増加は安静時における心内膜（73％）および心外膜（62％）の局所的改善、ならびにアデノシン注入時におけるやや軽度の改善（双方の領域において40％）から構成された。4週の時点で、対照群は診療前の値に比べて、虚血域および非虚血域における経壁、心内膜または心外膜の潅流に差違を示さなかった。
局所心筋潅流検査を下記の表IIに示す。安静時およびアデノシン注入時における診療前の相対的経壁心筋潅流、IZ／NIZに、投与群および対照群の間で差はなかった（それぞれ、P＝0.42および0.96）。ABM注入後4週に、安静時および歩行時における相対的局所経壁心筋潅流が著しく改善した。これは安静時（57％の増加、P＝0.08）およびアデノシン注入時（37％、P＝0.09）における虚血域の心筋潅流が絶対的に改善したことに起因し、非虚血域への絶対血流量には、安静時（35％の増加、P＝0.18）またはアデノシン注入時（25％の増加、P＝0.26）とも顕著な変化は見られなかった。虚血域に見られた局所心筋血流量の増加は安静時における心内膜（73％）および心外膜（62％）の局所的改善、ならびにアデノシン注入時におけるやや軽度の改善（双方の領域において40％）から構成された。4週の時点で、対照群は診療前の値に比べて、虚血域および非虚血域における経壁、心内膜または心外膜の潅流に差違を示さなかった。
（表II）局所心筋潅流
病理組織学および血管増生の評価
ろ過した吸引物が注入用カテーテルを通過する前後にBM塗抹標本を検査した結果、構造は正常であり、巨大凝集物はなく、細胞フラグメントまたは細胞形状変形の証拠は認められなかった。注入後1日の病理組織学的検査の結果、フィブリンおよび散在性細胞浸潤を伴う炎症域を特徴とする急性病変が認められた。浸潤物は、形態学的にはBM浸潤物と区別することのできない単核細胞を特徴とした。細胞充実度は3および7日目に最大であり、その後、徐々に低下した。3週の時点で、0.2ml注射部位に比べて0.5ml注射部位に、より顕著な線維症が見られた。最大細胞浸潤物を示す切片について、BM由来始原細胞を識別するためにデザインされたCD-34イムノ染色を施した。全体として、細胞浸潤物の4から6％がCD-34に対して正の免疫反応を示すと推定された。
ろ過した吸引物が注入用カテーテルを通過する前後にBM塗抹標本を検査した結果、構造は正常であり、巨大凝集物はなく、細胞フラグメントまたは細胞形状変形の証拠は認められなかった。注入後1日の病理組織学的検査の結果、フィブリンおよび散在性細胞浸潤を伴う炎症域を特徴とする急性病変が認められた。浸潤物は、形態学的にはBM浸潤物と区別することのできない単核細胞を特徴とした。細胞充実度は3および7日目に最大であり、その後、徐々に低下した。3週の時点で、0.2ml注射部位に比べて0.5ml注射部位に、より顕著な線維症が見られた。最大細胞浸潤物を示す切片について、BM由来始原細胞を識別するためにデザインされたCD-34イムノ染色を施した。全体として、細胞浸潤物の4から6％がCD-34に対して正の免疫反応を示すと推定された。
両群における虚血領域の特徴として、斑点状壊死の小領域が検査した虚血心筋全体の10％より小さい領域を占めた。非虚血域は正常な心筋構造を示した。2群の組織形態計測学的特徴の変化を比較した。あらゆる血管の総占有面積、および直径が50μmより大きい血管の数に、差はなかった。しかし、非虚血域に対する虚血域（時に管腔を伴う内皮細胞）の第VIII因子について陽性に着色した総面積の比較は、2群間で差違を示した。ABM群では、側枝依存虚血域における総内皮細胞面積が非虚血域に見られた値よりも100％高く（面積 11.6±5.5対5.7±2.3％、P＝0.016）、これに対して対照群には有意差はなかった（面積 12.3±5.5対8.2±3.1％、P＝0.11）。しかし、あらゆる血管による専有面積％および50μmより大きい血管の数を含む血管増生のその他のパラメータは、両群とも、虚血域および非虚血域でほぼ等しかった。
実施例5
心筋虚血動物モデルにおける、GM-CSFの前投与によりインビボにおいて刺激した自家骨髄の効果
慢性心筋虚血は、左冠動脈回旋枝にアメロイド圧迫器を装着することによって16頭のブタにおいて作られた。アメロイド装着後4週目に当たる日の3日前に、8頭の動物に対してGM-CSFを連続3日間、皮下注射（1日当たり10μgの用量）した後、（4日目の、アメロイド装着後正確に4週目に）経心内膜注射カテーテルを用いて虚血域に新たに吸引したABMを経心内膜注射（動物１頭当たり2.4ｍｌ、１２箇所の注射）して、GM-CSF刺激を行っていない8頭の対照動物にはヘパリン添加生理食塩液を注射した。ベースラインおよび4週後に、局所収縮性（心筋肥厚％）を調べるために動物について安静時および歩行時の心エコー図を記録して、さらに安静時およびアデノシン注入時における側枝依存潅流を調べるためにミクロスフィア試験を実施した。ABM注射4週後、ABMを投与したブタでは側副血流（虚血域／正常域×100の割合として示す）が改善したが、対照動物では改善しなかった（ABM群：安静時85±11対72±16、P＝0.026；アデノシン注入時83±18対64±19、P＝0.06；対照群：安静時93±10対89±9、P＝0.31；アデノシン注入時73±17対75±8、P＝0.74）。同様に、収縮率はABMを投与したブタでは増加したが、対照動物では増加しなかった（ABM：安静時93±33対63±27、P＝0.009；歩行時84±36対51±20、P＝0.014；対照：安静時72±45対66±43、P＝0.65；歩行時70±36対43±55、P＝0.18）。
心筋虚血動物モデルにおける、GM-CSFの前投与によりインビボにおいて刺激した自家骨髄の効果
慢性心筋虚血は、左冠動脈回旋枝にアメロイド圧迫器を装着することによって16頭のブタにおいて作られた。アメロイド装着後4週目に当たる日の3日前に、8頭の動物に対してGM-CSFを連続3日間、皮下注射（1日当たり10μgの用量）した後、（4日目の、アメロイド装着後正確に4週目に）経心内膜注射カテーテルを用いて虚血域に新たに吸引したABMを経心内膜注射（動物１頭当たり2.4ｍｌ、１２箇所の注射）して、GM-CSF刺激を行っていない8頭の対照動物にはヘパリン添加生理食塩液を注射した。ベースラインおよび4週後に、局所収縮性（心筋肥厚％）を調べるために動物について安静時および歩行時の心エコー図を記録して、さらに安静時およびアデノシン注入時における側枝依存潅流を調べるためにミクロスフィア試験を実施した。ABM注射4週後、ABMを投与したブタでは側副血流（虚血域／正常域×100の割合として示す）が改善したが、対照動物では改善しなかった（ABM群：安静時85±11対72±16、P＝0.026；アデノシン注入時83±18対64±19、P＝0.06；対照群：安静時93±10対89±9、P＝0.31；アデノシン注入時73±17対75±8、P＝0.74）。同様に、収縮率はABMを投与したブタでは増加したが、対照動物では増加しなかった（ABM：安静時93±33対63±27、P＝0.009；歩行時84±36対51±20、P＝0.014；対照：安静時72±45対66±43、P＝0.65；歩行時70±36対43±55、P＝0.18）。
これらの結果は、GM-CSFを全身性に3日間投与することによってインビボにおいて予め刺激したABMのカテーテルによる経心内膜的移植は虚血心筋における側副潅流および心筋機能を増大させることができることを示していて、これらの所見はこのアプローチが最適な治療的血管形成を達成するための新しい治療方法である可能性があることを示唆している。
実施例6
ヒト患者の治療
骨髄（〜5ml）は、心臓処置の開始約60分前に防腐剤フリーのヘパリン添加ガラスシリンジ（新鮮骨髄1ml当たりヘパリン20単位）を用いて腸骨稜から吸引する。吸引した骨髄は直ちに300μおよび200μのステンレススチールフィルターを順次用いてマクロフィルターにかける。この処置は、熟練した血液学者が無菌条件下にて実施する。骨髄調製物の組織形態学が正常であることを確認するために、骨髄塗抹標本を検査する。
ヒト患者の治療
骨髄（〜5ml）は、心臓処置の開始約60分前に防腐剤フリーのヘパリン添加ガラスシリンジ（新鮮骨髄1ml当たりヘパリン20単位）を用いて腸骨稜から吸引する。吸引した骨髄は直ちに300μおよび200μのステンレススチールフィルターを順次用いてマクロフィルターにかける。この処置は、熟練した血液学者が無菌条件下にて実施する。骨髄調製物の組織形態学が正常であることを確認するために、骨髄塗抹標本を検査する。
心筋に物質を送達するための複数の任意の処置が使用できる。これらには、外科的アプローチ（例えば、注射針もしくはその他の送達器具の経胸壁切開もしくは経胸壁挿入、または胸腔鏡検査法によるものなど）、および複数の任意の経皮的処置によって達成できるような直接的な経心外膜送達が含まれる。以下は経皮的送達の一例である。次の例は送達の選択肢が実施例に述べられるカテーテルによる特定のプラットホーム系に限定されることを意味するものではなく、カテーテルによる任意のプラットホーム系を用いることができることが強調されるべきである。
経皮的冠動脈形成術のための標準的な処置を用いて、少なくともSFの誘導針シースを右または左大腿動脈に挿入する。動脈シースの挿入後、ヘパリンを投与して、LVのマッピングおよび処置のABM移植段階を通してACTを200から250秒間維持するために必要に応じて追加する。この要件の整合性を確認するために、処置の期間中30分を超えずに定期的に、さらに処置の終了時にACTを確認する。
NOGA-STAR（商標）カテーテルおよび注射カテーテルの誘導を補助するために標準的なRAO（右前斜位）および／またはLAO（左前斜位）方向にて左心室造影法を行い、このNOGA-STAR（商標）カテーテルを用いてLV電気機械的マップを得る。8F INJECTION-STARカテーテルを大腿動脈シースを介して大動脈弁まで逆行性に挿入する。先端を完全に屈曲させた後、丸い遠位先端部を静かに下降させて大動脈弁を通過させ、LV腔内に到達したら適宜伸展させる。
カテーテル（電磁気先端センサーが組み込まれている）は治療域（例えば、前方、側方、下方-後方、またはその他）の一箇所に位置づける。NOGA（商標）系の安全機能を利用して、注射針の挿入および注射は安定性シグナルが３より小さいLS値を示した時点で初めて許可される。新たに吸引されたABMの0.2ccの単回注入を2箇所までの治療域に対して経心内膜アプローチにより送達し、各注入部位間は5mmよりも接近しないものとする。注射部位の密度は、個々の患者のLV心内膜構造、およびカテーテルの変位または心室性期外収縮（PVC）を起こすことなく心内膜表面の安定位置に達することのできる技量に依存する。
新たに吸引したABMの虚血心筋への移植に伴って側副血流が改善して副作用を起こさないことは、複数の理由から臨床的に重要である可能性がある。上記の方法論は、有効かつ明らかに安全な方法で局所の血管形成反応を誘発するという骨髄の本来の能力を利用した方法である。このような血管形成方法は、現在検討されている他の多くの方法よりもおそらくコスト的に低いであろう。さらに、ウイルスベクターを用いた様々な遺伝子に基づくアプローチに伴う僅かな、しかし明らかに可能性のある毒性に関連する潜在的懸念が回避される。
本発明は、ABMは最も適した細胞供給源であり（例として内皮始原細胞が挙げられるが、骨髄の他の多くの細胞が血管形成効果に大きく寄与している可能性があることから、本発明はこのような細胞に限定されるものではない）、虚血性の心臓または四肢末梢のようなもう一つの組織に導入された際に例えば血管形成成長因子などの血管新生を促進して機能を回復するために必要なエレメントを分泌することができるという概念に基づく。患者自身の骨髄は、心筋および／または虚血性四肢など、動脈閉塞のために血液潅流が損なわれた虚血組織において治療的血管形成および／または筋形成を誘発するための重要な治療源として用いることができる。患者自身の骨髄を吸引して、即ち、ABM提供、本明細書に述べるように加工し、血管増殖を促進するために心筋および／または虚血四肢などの虚血組織および／または隣接する非虚血組織に直接注射する。
ABMおよび／または骨髄産物は、カテーテルによる経心内膜注入アプローチまたは外科的（開胸または胸腔鏡検査法による）経心外膜開胸アプローチのいずれかを用いることによって、心筋などの心臓の筋肉に注射される。これらの2種類の送達方法は、例えば心臓の筋肉および／または虚血四肢などの標的臓器組織における血管形成骨髄エレメントの取り込みおよび組込みを促進することによって同一の治療目標を達成するために用いることができる。
本発明に従って、ABM、骨髄細胞または血管形成促進物質を導入した骨髄細胞の有効量を治療のために投与する。経験を積んだ開業医によって評価される通り、投与される量は、意図する治療、治療される状態の程度、治療すべき領域の大きさおよび規模などを含む多くの要因に依存する。本発明に基づく治療に関して、典型的なプロトコールは、注射一回当たり約0.2から約0.5mlの量のABMを約12回から約25回投与し、合計約2.4から約6mlのABMが投与される。投与される各用量は、好ましくは約1から約2容量パーセントのヘパリン、またはクマジンのようなもう一つの血液抗凝固剤を含む。ABMが培養または刺激されていて、かつ／またはその他の医薬品などと併用して投与される場合、含まれるABMの量は各用量とほぼ同一とされるべきであり、かつ／または総ABM投与量は上記のようにほぼ同一でなければならない。各治療において投与されるABMの総細胞数は約107から5×108の水準でなければならない。
本発明のもう一つの態様において、血管形成遺伝子発現の至適化は、様々な血管形成刺激物質をABMと同時に投与することによって高めることができる。従って、本発明のABM移植は「独立した」治療物質として、または血管形成性成長因子の骨髄産生を高めて、さらに／または内皮細胞の増殖、移動および血管管腔形成を促進する何らかの薬剤、タンパク質もしくは遺伝子、またはその他の何らかの化合物もしくは診療と併用して注射される。「併用」物質は患者または標的組織に直接投与することもできれば、患者への骨髄の注射前にエキソビボにおいて骨髄とインキュベートすることもできる。これらの「併用」物質（これらの物質に限定されるものではないが）の例として、顆粒球-単球コロニー刺激因子（GM-CSF）、単球化学誘導タンパク質1（MCP-1）、EPAS1、または低酸素症誘導性因子-1（HIF-1）が挙げられる。骨髄の刺激は骨髄をタンパク質の形の因子に直接曝露することによって行われるか、あるいは骨髄細胞に関連遺伝子を持つベクターをトランスフェクトすることができる。例えば、骨髄に、HIF-1またはEPAS1導入遺伝子を持つプラスミドベクターまたはアデノウイルスベクターをトランスフェクトすることができる。血管形成因子の骨髄産生を増加させることのできる介入の一例として、エキソビボにおいて骨髄細胞を低酸素状態に曝露する。この介入は骨髄を用いて単独で、または上記の因子のいずれかと併用して使用することができる。これらの至適化方法は、心臓またはいずれかの末梢虚血組織への骨髄の直接注射前に血管内皮成長因子（VEGF）発現および／または血管形成活性を持つその他のサイトカインの産生を増加させるためにデザインされる。広義には、本発明は、骨髄刺激および／または骨髄もしくはその間質微細環境によるエキソビボもしくはインビボにおける血管形成性成長因子産生の刺激を惹起するために効果を示すようになる物質とABMの心筋内注射を含む。
患者への上記の治療方法の送達は、臨床状況に応じて変化する。例えば、治療抵抗性冠動脈疾患または虚血性末梢血管症患者は、骨髄穿刺処置およびその後の虚血組織もしくはその境界域および／または治療的血管形成および／または筋形成のための疾患組織への側枝または細胞供給源として用いることのできる正常組織に向けての心筋または四肢へのAMB移植の候補である。例えば、治療抵抗性冠動脈疾患または虚血性末梢血管症患者は、骨髄穿刺処置およびその後の虚血組織もしくはその境界域および／または治療的血管形成および／または筋形成のための疾患組織への側枝または細胞供給源として用いることのできる正常組織に向けての心筋または四肢へのAMB移植の候補である。この処置は、骨髄穿刺処置、骨髄の採取および加工、ならびにその後の、時にその送達剤形のエキソビボにおける刺激を伴う、虚血性もしくは非虚血性心筋および／または（四肢虚血のような）末梢虚血組織に注射されるべきABMまたはそのエレメント（患者自身の骨髄から単離される成長因子および／または細胞エレメント）の使用を伴う。骨髄は（クエン酸ナトリウムおよびEDTAを含む）標準的な抗凝固／抗凝集液中で保存されて、使用時まで無菌媒質中で4℃にて保存される。
使用する場合、残っている血餅または巨大凝集物が標的組織に注射されることを避けるために骨髄をろ過する。
時にその送達剤形のいずれかに刺激物質を含み、あるいは時に骨髄の血管新生作用を高めるためにデザインされる伝達遺伝子を持つベクターをトランスフェクトされている骨髄は、カテーテルによる経心内膜注入装置を用いて、または外科的（開胸）経心外膜開胸アプローチもしくは心外膜送達に備えるその他の何らかのアプローチを介して、心臓の筋肉に注射、即ち、治療的心筋血管形成または治療的筋形成として注射される。四肢虚血の治療の場合、骨髄は、時にその送達剤形のいずれかにおいてエキソビボまたはインビボの刺激を伴う、骨髄またはそのエレメントの脚の筋肉への直接注射によって伝達される。
治療部位当たりの注射液量は具体的な骨髄産物、ならびに虚血状態の程度および注射部位に応じて、おそらく注射部位当たり0.1から5.0ccの範囲である。総注射回数は、おそらく、治療1セッション当たり1から50注射箇所の範囲である。
実施例7
ブタ骨髄培養
骨髄細胞（BMC）は無菌条件下でブタから採取して防腐剤フリーのヘパリン（BM細胞1ml当たり20単位）に回収し、300μおよび200μのステンレススチールメッシュフィルターを順次用いてろ過した。続いて、BMCをFicoll-Hypaque密度勾配遠心分離によって単離して、T-75フラスコに接種して、長期培養培地（LTCM）（Stem Cell Tech, Vancouver, British Columbia, Canada）を用いて33℃、5％CO2にてT-75培養フラスコで一晩培養した。その後、培地を交換して、非付着細胞を洗い流した。付着した細胞（即ち、初期付着細胞）は主として単核細胞、内皮前駆細胞、またはその他の造血系譜の細胞である。lac-Z着色試験により、これらの細胞はマーカータンパク質の発現によってアデノウイルスに関して許容性であることが示されている。
ブタ骨髄培養
骨髄細胞（BMC）は無菌条件下でブタから採取して防腐剤フリーのヘパリン（BM細胞1ml当たり20単位）に回収し、300μおよび200μのステンレススチールメッシュフィルターを順次用いてろ過した。続いて、BMCをFicoll-Hypaque密度勾配遠心分離によって単離して、T-75フラスコに接種して、長期培養培地（LTCM）（Stem Cell Tech, Vancouver, British Columbia, Canada）を用いて33℃、5％CO2にてT-75培養フラスコで一晩培養した。その後、培地を交換して、非付着細胞を洗い流した。付着した細胞（即ち、初期付着細胞）は主として単核細胞、内皮前駆細胞、またはその他の造血系譜の細胞である。lac-Z着色試験により、これらの細胞はマーカータンパク質の発現によってアデノウイルスに関して許容性であることが示されている。
各シャーレにおけるBMCの播種密度は7×106/mlである。約7日で細胞が密集に達する時点で、細胞を0.25％トリプシンによって1対3に分割する。本試験には、3から8回継代細胞を使用した。
アデノウイルストランスフェクション
BMCは、先ず、シャーレに付着する初期付着細胞層の産生を考慮して6cmシャーレで3から14日間培養する。初回播種翌日に、非付着性細胞を洗い流す。続いて、初期付着細胞に、一つ以上のサイトカイン、成長因子、または転写因子であるHIP-1もしくはHIF-2などのようなその他の哺乳類血管形成促進因子をコードするベクターを接種する。この接種は、播種後3日から28日まで実施することができる。接種後約2時間ないし3日に、トランスフェクトした細胞からこのウイルスを洗浄除去する。その後、トランスフェクトした細胞は、心臓または脚の筋のような患者の標的組織に注射することができる。本発明は、その精神または中心的特性から逸脱しないその他の具体的剤形を態様とすることができる。従って、本発明に関する前出の説明はその例示的態様を開示するのみであり、他の変化は本発明の範囲内であることが企図される。従って、本発明は本明細書に詳細に述べられている特定の態様に限定されるものではない。より正確に言えば、添付する特許請求の範囲に対して、本発明の範囲および内容の指標であることの言及が行われるべきである。
BMCは、先ず、シャーレに付着する初期付着細胞層の産生を考慮して6cmシャーレで3から14日間培養する。初回播種翌日に、非付着性細胞を洗い流す。続いて、初期付着細胞に、一つ以上のサイトカイン、成長因子、または転写因子であるHIP-1もしくはHIF-2などのようなその他の哺乳類血管形成促進因子をコードするベクターを接種する。この接種は、播種後3日から28日まで実施することができる。接種後約2時間ないし3日に、トランスフェクトした細胞からこのウイルスを洗浄除去する。その後、トランスフェクトした細胞は、心臓または脚の筋のような患者の標的組織に注射することができる。本発明は、その精神または中心的特性から逸脱しないその他の具体的剤形を態様とすることができる。従って、本発明に関する前出の説明はその例示的態様を開示するのみであり、他の変化は本発明の範囲内であることが企図される。従って、本発明は本明細書に詳細に述べられている特定の態様に限定されるものではない。より正確に言えば、添付する特許請求の範囲に対して、本発明の範囲および内容の指標であることの言及が行われるべきである。
先行の具体的態様は本発明の実践を例証する。しかし、本発明の精神または添付する特許請求の範囲を逸脱することなく、当業者に既知である、または本明細書に開示されるその他の方法を用いることができることが理解されるべきである。
Claims (16)
- 以下の工程：
初期付着細胞の産生を促進するのに十分な期間にわたって適切な培養条件下においてインビトロで新鮮骨髄から細胞を生育させることにより、初期付着細胞を得る工程；
初期付着細胞に、低酸素症誘導性因子１（ HIF-1 ）、内皮 PAS ドメインタンパク質１（ EPAS1 ）、単球化学誘導タンパク質１（ MCP-1 ）および顆粒球 - 単球コロニー刺激因子（ GM-CSF ）、ならびにその組み合わせから選択される１つもしくは複数の組換え血管新生因子をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターをトランスフェクトする工程；および
トランスフェクトされた初期付着細胞を組換え血管新生因子の産生を促進するように生育させる工程；
を含む方法であって、トランスフェクション効率およびトランスフェクトされた初期付着細胞による組換え血管新生因子の産生が、新鮮骨髄からの新鮮細胞もしくは新鮮骨髄から細胞を生育させることにより得られる非付着性骨髄細胞を同様にトランスフェクトしたもののいずれかを代わりに用いて得られる場合と比べて高められる方法。 - 期間が、約 7 日から約 14 日である、請求項１記載の方法。
- 新鮮骨髄が、生育させる前にろ過される、請求項1記載の方法。
- ろ過によって約300μから約200μよりも大きい粒子が除去される、請求項3記載の方法。
- ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項1記載の方法。
- トランスフェクトした初期付着細胞を低酸素状態への曝露によって刺激する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- ポリヌクレオチドが、そのポリヌクレオチドに動作可能なように関連する転写調節領域をさらに含む、請求項 1 記載の方法。
- 以下を含む組成物：
低酸素症誘導性因子１（ HIF-1 ）、内皮 PAS ドメインタンパク質１（ EPAS1 ）、単球化学誘導タンパク質１（ MCP-1 ）および顆粒球 - 単球コロニー刺激因子（ GM-CSF ）、ならびにその組み合わせから選択される１つまたは複数の組換え血管新生因子をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターによりトランスフェクトされている、インビトロで自家骨髄細胞を生育させることにより得られる初期付着細胞；および
トランスフェクトされた初期付着細胞により発現された１つまたは複数の組換え血管新生因子。 - 組換え血管新生因子を含む調整済み培地をさらに含む、請求項 8 記載の組成物。
- 調整済み培地が、初期付着細胞により発現された１つまたは複数の天然の血管新生因子をさらに含む、請求項 9 記載の組成物。
- ポリヌクレオチドが、そのポリヌクレオチドに動作可能なように関連する転写調節領域をさらに含む、請求項 8記載の組成物。
- トランスフェクトした細胞が、低酸素状態への曝露によって刺激されている、請求項 8記載の組成物。
- 抗凝固剤をさらに含む、請求項 8記載の組成物。
- ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項 8記載の組成物。
- 虚血心筋または虚血四肢末梢筋における側副血管形成を高める、請求項 8 〜 14のいずれか一項記載の組成物。
- 虚血心筋または虚血四肢末梢筋における側副血管形成を高める薬剤の製造のための、請求項 8 〜 14のいずれか一項記載の組成物の成分の使用。
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