JP3765983B2 - 病原菌およびロタウイルスが原因となる下痢を予防できるラクトバチルス菌株 - Google Patents

Description

【０００１】
本発明はラクトバチルス属の新規微生物に関し、これらの微生物は病原菌およびロタウイルスによりひき起こされる下痢の予防に有用である。特に本発明は摂取できる支持物質の製造のためにこの微生物の使用およびこの微生物を含む組成物に関する。
【０００２】
主要代謝成分として乳酸を産生する微生物は古くから知られている。これらの細菌はそれぞれ乳または乳加工工場に、生きている植物や腐朽植物に、またヒトおよび動物の腸に見出すことができる。「乳酸菌」と要約されるこれらの微生物はむしろ不均質性群を表わし、例えばラクトコッカス、ラクトバチルス、ストレプトコッカス、ビフィドバクテリウム、ペディオコッカス属などを含む。
【０００３】
乳酸菌は低ｐＨの利益を受ける食品の保存に、および腐敗菌の生育を阻害するその発酵活性中産生する発酵産物の作用に対し発酵剤として利用されてきた。このため、乳酸菌はチーズ、ヨーグルトおよび乳からの他の発酵乳製品のような各種の異る食品の製造に使用されている。
【０００４】
ごく最近乳酸菌は、ある種の菌株が摂取によりヒトおよび動物に有用な性質を示すことが分かったことで多大の注意を引いた。特にラクトバチルスまたはビフィドバクテリウム属の特定菌株は腸粘膜にコロニーを作り、かつヒトおよび動物の生活状態の維持に役立ちうることが分かった。
【０００５】
この点で、ヨーロッパ特許０７６８３７５号明細書は腸フローラに移植できかつ腸細胞に付着できるビフィドバクテリウム属の特定菌株を開示する。これらのビフィズス菌は免疫調節を助け、かつ病原菌が腸細胞に付着することを競合的に排除することができ、したがって個人の健康の維持に役立つことが報告されている。
【０００６】
最近の数年間、プロビオチック剤として乳酸菌の潜在的使用に対し研究が集中した。プロビオチックは、腸内の天然ミクロフローラを保持することにより個人の健康を増進する生育可能な微生物製剤であると考えられる。微生物製剤はその有効な微生物およびその作用様式が既知である場合、プロビオチックとして通常許容できる。プロビオチックは腸粘膜に付着し、腸管にコロニーを形成し、同様にその上に有害な微生物の付着を防止すると考えられる。これらの作用に対する決定的必要条件は、乳酸菌が適当かつ生育しうる形で腸粘膜に到達しなければならず、かつ胃腸管の上部で、特に胃で普通の低ｐＨの影響により破壊されないことにある。
【０００７】
この点で、ＷＯ９７／０００７８号明細書はこのようなプロビオチックとしてラクトバチルスＧＧ（ＡＴＣＣ ５３１０３）と呼ばれる特定の菌株を開示する。本微生物は食品に由来する過敏症反応を予防または治療する方法において特に使用され、この方法ではペプシンおよび／またはトリプシンにより加水分解処理された食品物質を受容者に投与するものである。選択されたラクトバチルス菌株は付着性およびコロニー形成性を示し、かつプロテアーゼ酵素系を示すとして記載され、投与される食品に含有されるタン白物質は特定のラクトバチルス菌株が分泌するプロテアーゼによりさらに加水分解される。この文献に記載の方法は、結局腸によりもはやアレルギー物質の実質量を示さないタン白物質を吸収することになる。
【０００８】
さらに、ヨーロッパ特許０５７７９０３号明細書にはヘリオバクター・ピロリの作用と関連する潰瘍の治療または予防処置用に意図された支持物質の製造に、潰瘍の発現に認知された原因であるヘリオバクター・ピロリに取って代る能力を有するような乳酸菌の使用について言及されている。
【０００９】
介在するＷＯ９９／２９８３３号明細書には、確定した大きさの３つのプラスミドをもつ特別の菌株、ＬＭＧＰ１７８０６が記載される。この菌株はサルモネラ・ティフィムリウムによる侵入から腸細胞を防止できることを記載する。
【００１０】
乳酸菌の特定菌株が有し得る有用な性質を認識して、ヒトおよび／または動物の生活状態に有利である付加的乳酸菌菌株に対する願望が業界にある。
従って、本発明の課題はヒトおよび／または動物に有利な新しい性質を示す付加的細菌菌株を供することである。
【００１１】
上記問題は新規微生物、すなわち下痢を起こす病原菌による腸のコロニー形成を予防しかつロタウイルスによる腸上皮細胞の感染を予防しうる特性を有するラクトバチルス属に属する乳酸菌を供することにより解決された。好ましい態様によれば、このラクトバチルス菌株は宿主生物の腸粘膜に付着することができ、そしてそこに本質的にコロニーを形成することができるものである。
【００１２】
別の好ましい態様によれば、このラクトバチルス菌株は０．４％までの胆汁酸塩の存在下で生育することができるので、容易に胃腸管を通過でき、本質的に活性のままでとどまることができる。
【００１３】
他の好ましい態様によれば、本乳酸菌はラクトバチルス・ラム、サスまたはラクチトバチルス・パラカゼイ、好ましくはラクトバチルス・パラカゼイから選択され、一層好ましくはラクトバチルス・パラカゼイＣＮＣＭ Ｉ−２１１６である。
【００１４】
本発明の微生物は次の性質を有することが分った。即ち、グラム陽性、カタラーゼ陰性、ＮＨ₃形成アルギニン陰性およびＣＯ₂産生陰性である。これらはＬ(＋)乳酸を産生し、約０．４％までの濃度の胆汁酸塩の存在下で生育でき、かつロタウイルスによる上皮細胞の感染を本質的に予防できる。
【００１５】
新規微生物は各種摂取可能な支持物質、例えば乳、ヨーグルト、カード、発酵乳、乳をベースとする発酵製品、発酵穀類をベースとする製品、乳をベースとする粉末、乳児用調製粉乳の製造に使用でき、約１０⁵ｃｆｕ／ｇ〜約１０¹¹ｃｆｕ／ｇの量で支持物質に含ませることができる。本発明において、各語ｃｆｕは「コロニー形成単位」を示し、寒天プレート上の微生物数により示される細菌細胞数として規定される。
本発明はまた上記特性を有する少なくとも１つのラクトバチルス菌株を含有する食品または医薬組成物を供する。
【００１６】
本発明の食品組成物の製造に対し、本発明による少なくとも１つのラクトバチルス菌株は適当な支持物質に約１０⁵ｃｆｕ／ｇ〜約１０¹¹ｃｆｕ／ｇ、好ましくは約１０⁶ｃｆｕ／ｇ〜約１０¹⁰ｃｆｕ／ｇ、一層好ましくは約１０⁷ｃｆｕ／ｇ〜約１０⁹ｃｆｕ／ｇの量で添加される。
【００１７】
医薬製剤の場合、製品は錠剤、細菌液体サスペンジョン、乾燥経口サプリメント、含水経口サプリメント、乾燥経管栄養または含水経管栄養などの形で製造することができ、そこに添加されるラクトバチルス菌株量は１０¹²ｃｆｕ／ｇまでの範囲、好ましくは約１０⁷ｃｆｕ／ｇ〜約１０¹¹ｃｆｕ／ｇ、一層好ましくは約１０⁷ｃｆｕ／ｇ〜約１０¹⁰ｃｆｕ／ｇである。
【００１８】
固体の腸における新規微生物の活性は当然用量依存である。すなわち、上記食品物質または医薬組成物を摂取することにより新規微生物の量が多い程、微生物の保護活性および／または治療活性は高い。新規微生物は人類および動物には有害でなくかつ最終的に乳児の排泄物から単離されるので、本質的に個体の腸の高割合が新規微生物によりコロニー形成できるようにその高量を添加できる。
【００１９】
図中、
図１は細菌菌株によるロタウイルス保護性を評価するために選別する細胞培養の概略図を示す。
図２は異る生育培地のＬ．カゼイ菌株ＣＮＣＭ Ｉ−２１１６（ＳＴ１１と呼ぶ）の酸性化を示す。
図３は１０℃で３０日間測定したＬ．カゼイ菌株ＳＴ１１の生存割合を示す。
図４はＳＴ１１の連続稀釈により細胞を培養した後骨髄由来のマウス付着細胞の１Ｌ−１２およびＩＬ−１０のｍＲＮＡパターンを示す。
図５はＩＬ−４産生が減少したことによるＴｈ２分化の結果を示す。
図６は培養ＳＴ１１細胞を、病原性大腸菌が上皮細胞に付着するのを防止する試験で使用された細胞培養実験結果の概畧を示す。
図７はＳＴ１１培養物の上澄液を、病原性大腸菌が上皮細胞に付着するのを阻止する試験で使用する細胞培養実験結果の概畧を示す。
図８は培養ＳＴ１１細胞を、サルモネラ・チフィムリウムが上皮細胞中に侵入するのを阻止する試験で使用する、細胞培養実験結果の概畧を示す。
図９はＳＴ１１培養物の上澄液を、サルモネラ・チフィムリウムが上皮細胞中に侵入するのを阻止する試験で使用する、細胞培養実験結果の概畧を示す。
【００２０】
本発明に導く広汎な研究中、発明者らは乳児排泄物を調査し、そこから多種の異る細菌菌株を単離した。これらの菌株は続いてロタウイルスおよび下痢を引き起こすことが既知の病原菌による上皮細胞の感染を防止するその能力を試験した。
【００２１】
ラクトバチルス、ラクトコッカス、ストレプトコッカスを含む数種の菌属の阻害活性を選別した。試験は本質的にヒトのウイルス性下痢の主要な病原体を表わす３つのロタウイルスセロタイプ（セロタイプＧ１、Ｇ３およびＧ４）および感染個体に下痢を起こす代表的病原性微生物として病原性大腸菌およびサルモネラ・チフィムリウムにより行なった。
【００２２】
各種乳酸菌はＭＲＳ、Ｈｕｇｏ−ＪａｇｏまたはＭ１７培地のような適当な培地でこれらの最適生育温度に相当する約３０°〜４０℃の温度で生育させた。定常生育に到達後、細菌は遠心分離して集め、生理的食塩水に再懸濁した。異る試験別に細菌細胞は冷凍貯蔵した（−２０℃）。
【００２３】
ロタウイルス試験
各種ロタウイルスのストックを集密的細胞単層の感染により調製した。ロタウイルスは感染前に培養した。細胞は２０の組織培養感染用量により感染させた。抗−ロタウイルス特性を評価するために、２つの異るプロトコルを適用した。１つのプロトコルによれば各種細菌菌株はロタウイルスとの直接の相互作用を試験し、一方第２プロトコルでは細菌は細胞性ロタウイルス受容体と相互作用する菌株を選別した。第１プロトコルは各細菌サスペンジョンを異るロタウイルス菌株と接触させ、ついで適当な培地で培養することを含んだ。その後、ウイルス−細菌混合物はヒト未分化結腸腺腫細胞ＨＴ−２９の細胞単層に適用し、そして培養を続けた。次にウイルス複製を試験した。第２プロトコルは先ず各細菌サスペンジョンをヒト未分化結腸腺腫細胞ＨＴ−２９の細胞単層と一緒に培養し、次にウイルスを添加するものである。連続培養後ウイルス複製を試験した。ロタウイルスの複製は感染細胞のロタウイルスタン白の組織−免疫学染色により容易に評価できる。ロタウイルスを単独接種した細胞と比較して、ロタウイルス＋指示細菌を接種した細胞カルチャーで感染細胞数が９０％まで減少した場合、ロタウイルスの阻害効果は供試細菌によるものとされた。
【００２４】
最初に単離した合計２６０種の細菌菌株のうち単に９種が本質的にロタウイルス複製を阻害することが分った。異る細菌はラクトバチルス属亜種ラムノサスまたはパラカゼイに属することが確かめられた。ブタペスト條約により寄託され、寄託番号ＮＣＣ２４６１（Ｉ−２１１６）を受けたラクトバチルス・カゼイＳＴ１１と命名された１菌株は、ロタウイルスによるヒト細胞の感染防止に非常に有効であることが分った。さらに、この特別の菌株は各種培地で酸性化を示すことから、すぐれた生育性を示す。本菌株はまた約１０℃の低温で貯蔵中生存割合に関しすぐれた性能を示し、これにより冷蔵条件で貯蔵される食品または医薬組成物に含まれるすぐれた候補対象になる。
【００２５】
抗−病原菌試験
抗−細菌性を評価するために、次のアプローチを選択した。１プロトコルによれば、本発明の培養ラクトバチルス菌株は腸細胞に下痢を起こす病原菌の付着または腸細胞中へのその侵入を防止するその能力について試験した。このため、腸細胞を病原菌および本発明の培養ラクトバチルス菌株と接触させ、付着または侵入の各割合を評価した。第２プロトコルによれば、本発明のラクトバチルス菌株の細胞培養物の上澄を病原性微生物と一緒に腸細胞に添加し、付着または侵入のそれぞれの割合を評価した。実験中、培養したラクトバチルスおよび上澄は腸細胞に付着および細胞中への侵入の双方の防止に非常に有効であることの証拠を示すことができ、これは新規微生物が分泌する代謝化合物が病原菌に関し抗−下痢活性に寄与しているらしいことを示している。
【００２６】
上記発見の他に、本菌株は意外なことに異る免疫メディエーターの合成にインパクトを有することで抗−アレルギー性も示すことも分った。
【００２７】
体液性免疫応答およびアレルギー反応はタイプ２フェノタイプ（Ｔｈ２）を有するＣＤ４⁺Ｔ細胞により媒介されることが一般に認められる。Ｔｈ２−細胞は高レベルのインターロイキン４（ＩＬ−４）、ＩｇＥ（アレルギー反応に含まれる主要な抗体クラスである）の分泌に必要なサイトカインを産生することで特徴づけられる。
【００２８】
Ｔｈ２細胞の分化はＩＦＮ−ｒ、ＣＤ４⁺Ｔ細胞の相互に排他的のＴＨ１サブセットから生ずる特別のサイトカインにより損なわれる。このＴＨ１細胞は順次インターロイキン１２（ＩＬ−１２）により強く誘発される。これと対照的にＩＬ−１０、別のサイトカインはＴＨ１細胞の増殖に強い抑制インパクトを有することが分ったから、免疫−抑制機作に役割を演ずると思われる。
【００２９】
要約すれば、ＩＬ−１２およびＩＬ−１０の双方はＴｈ１サブセットの発生に影響を与えることにより、ＣＤ４⁺Ｔ細胞の発生に強い調節効果を有する。ＩＬ−１２はＴｈ１分化の誘発に対し鍵となる調整サイトカインであるから、Ｔｈ２応答の発生を抑止する。従って、Ｔｈ２細胞を抑止する主な道は補助細胞によるＩＬ−１２合成の刺激に見られる。
【００３０】
ＬＰＳのようなグラム陰性菌のいくつかの成分はマクロファージおよび樹枝状細胞のような付着細胞に高レベルのＩＬ−１２を誘発することは周知である。一貫して、グラム陰性菌はＣＤ４⁺Ｔ細胞の分化をＴｈ１フェノタイプの方向に強くかたよらせることができることが分った。
【００３１】
本発明のラクトバチルス菌株の例として、微生物ＳＴ１１はＣＤ４⁺Ｔ細胞の分化の調節に含まれるサイトカインの誘導の潜在的な役割を試験した。特に、Ｔｈ２分化中のＣＤ４⁺Ｔ細胞のフェノタイプに及ぼすＳＴ１１の効果が研究された。
【００３２】
この点で骨髄由来のマウス付着細胞のこれら２つの調節サイトカインをコードするｍＲＮＡの合成を誘導するＳＴ１１の能力は４つの他のラクトバチルス菌株および対照のグラム陰性菌（大腸菌Ｋ１２）と比較した。ｍＲＮＡは１０⁹〜１０⁷ｃｆｕ／ｍｌの範囲の細菌の連続稀釈した細胞を６時間培養後、半定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。
【００３３】
すべてのラクトバチルス菌株は或る程度までＩＬ−１２ｍＲＮＡの転写を誘導できるが、ＳＴ１１は最強の誘導物質であることが分った。強いＰＣＲシグナルとして最低細菌用量でさえ検出できるからである。実際に、ＩＬ−１２ｍＲＮＡ転写を誘導するＳＴ１１の能力は大腸菌と同じくらい強かった。ＩＬ−１０ｍＲＮＡの誘導はＩＬ−１２ｍＲＮＡより一般に弱く、より高い細菌用量でのみシグナルは検出できた。それでもやはりＳＴ１１は他のラクトバチルスおよび大腸菌対照と比較してＩＬ−１０ｍＲＮＡの最強の誘導物質であった。
【００３４】
すなわち、ＳＴ１１はＣＤ４⁺Ｔ細胞の分化に含まれる免疫−調節サイトカインの誘導に有効であると思われる。ＩＬ−１２を誘導するその強い能力はＴｈ２応答を阻害する候補であり、その測定可能なＩＬ−１０の誘導は炎症性応答を防止できる。
【００３５】
上記知見の他に、ＳＴ１１がＴｈ２分化中のＣＤ４⁺Ｔ細胞に対する阻害効果およびＴｈ１機能に対するプラス効果を示すかどうかも測定された。十分に樹立した分化培養系が使用され、そこで前駆体ＣＤ４⁺Ｔ細胞はポリクローナル的に活性化させかつ培養培地に供された共通刺激（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌｉ）の型により、Ｔｈ１またはＴｈ２分化を経るように調節させた。Ｔｈ１／Ｔｈ２分化は７日の最初の培養中誘発され、その後細胞は培地単独を有する第２培養で２日間再刺激され、そして特異的フェノタイプ（Ｔｈ１またはＴｈ２）の獲得は上澄で生産されたサイトカインの型（ＩＦＮ−ｒ対ＩＬ−４）を測定することにより評価した。
【００３６】
ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドのマウスからの前駆体ＣＤ４⁺Ｔ細胞は中性条件下（１ｒｙ培養で培地単独）で活性化後優勢なＴｈ２フェノタイプ（２ｒｙカルチャー上澄の高ＩＬ−４、低ＩＦＮ−ｒ）に優先的に分化することが知られる。このフェノタイプは１ｒｙカルチャーのＩＬ−４にブロッキング性モノクロナール抗体を添加すると完全にＴｈ１パターン（高ＩＦＮ−ｒ、低ＩＬ−４）に復帰できた。
【００３７】
Ｔｈ２阻害に対しＳＴ１１の潜在的な役割を調査するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスからの精製前駆体ＣＤ４⁺Ｔ細胞は１ｒｙ培養中補助細胞として骨髄付着細胞の存在下で活性化させた。これらの細胞は培地単独で、または１ｍｇ／ｍｌ ＬＰＳ、または１０⁸ｃｆｕ／ｍｌ ＳＴ１１、または１０⁸ｃｆｕ／ｍｌの別のラクトバチルスの存在で共同培養した。この後細胞を洗浄し、ＣＤ４⁺Ｔ細胞はもう一度精製し、そして培地単独で２ｒｙ培養で再刺激させた。分化ＣＤ４⁺Ｔ細胞により生成されたサイトカインは２日後測定した。予期されたように、培地単独の存在下で分化した細胞は優勢なＴｈ２フェノタイプを示した。１ｒｙ培養にＳＴ１１を添加すると、ＩＬ−４の生産が８倍の減少となるように、Ｔｈ２分化の結果を調節した。この阻害はＬＰＳの存在下で分化した細胞から誘導された培養で観察されたものと同様の大きさのものであった。対照的に、他のラクトバチルス菌株はＩＬ−４量に測定可能なインパクトを有しなかった。興味あることに、ＩＦＮ−ｒ量は１ｒｙ培養でＳＴ１１の添加により増加しなかった。
【００３８】
要約すると、ＳＴ１１はＴｈ２分化を経るＣＤ４⁺Ｔ細胞によるＩＬ−４産生を特異的に損なったが、ＩＦＮ−ｒ分泌を有意に増加しなかった。ＳＴ１１がＩＦＮ−ｒ生産を増加しない事実はＩＬ−１０を誘導するその能力によるが、その結果抗−Ｔｈ２活性にも拘らず低炎症性インパクトを保持できる。
結果として、ＳＴ１１はすぐれた抗−Ｔｈ２プロフィルを有するラクトバチルス菌株であり、このプロフィルにより抗−アレルギー、プロビオチック活性を有する細菌としてその用途のすぐれた候補たらしめていることが分った。
【００３９】
本発明は例としてここに記載する。
培地および溶液
ＭＲＳ（ディフコ）、
Ｈｕｇｏ−Ｊａｇｏ（トリプトン ディフコ ３０ｇ／ｌ、酵母抽出物 ディフコ １０ｇ／ｌ、ラクトース ディフコ ５ｇ／ｌ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ５ｇ／ｌ、牛肉抽出物 ディフコ ２ｇ／ｌ、寒天 ディフコ ２ｇ／ｌ）、
Ｍ１７（ディフコ）、
Ｍ１９９（セロメッド）、
リンゲル液（オキソイド）、
ＰＢＳ（ＮａＣｌ ８ｇ／ｌ，ＫＣｌ ０．２ｇ／ｌ，Ｎａ₂ＨＰＯ₄ １．１５ｇ／ｌ，ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．２ｇ／ｌ）、
トリプトース ホスフェート ブロス（フロー）トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（セロメッド）。
ヒトロタウイルス Ｗａ（Ｇ１ セロタイプ）およびシミアン ロタウイルスＳＡ−１１（Ｇ３ セロタイプ）は、Ｐ．Ａ．オフィット、フィラデルフィア小児病院、米国から得た。ＤＳ−ＩｘＲＲＶ リアソルタント ウイルスはＡ．カピキアン、ＮＩＨ ベセスダ、米国から得た。セロタイプ４ヒト ロタウイルス ホチはＰ．バックマン、ミュンヘン大学、ドイツから得た。大腸菌ＤＡＥＣ Ｃ１８４５はワシントン大学、シアトルから得、かつ大腸菌ＪＰＮ １５はメリーランド大（米国）のワクチン開発センターから得た。サルモネラ・チフィムリウム菌株ＳＬ１３４４はスタンフォード大の微生物学部、米国から得た。
【００４０】
例１
乳児排泄物から乳酸菌の単離
新しい排泄物を生後１５〜２７日の健康な乳児１６人のおしめから集めた。１ｇの新しい排泄物は実験室に輸送するため嫌気条件下に置き、微生物分析は試料収集後２時間内にリンゲル液に連続稀釈し、選択培地に置くことにより行なった。ＭＲＳ寒天＋抗生物質（ホスフォマイシン ８０μｇ／ｍｌ、スルファメトキサゾール ９３μｇ／ｍｌ、トリメトプライム ５μｇ／ｍｌ）は３７℃、４８時間培養し、乳酸菌を単離するために使用した。コロニーをランダムに採取し、精製した。生理学的および遺伝的特徴づけを単離物について行なった。
【００４１】
例２
抗−ロタウイルス活性に対し細胞培養の菌株の試験
ラクトバチルス、ラクトコッカス、ストレプトコッカス属を含む数種の乳酸菌を選択し、細胞培養阻害試験で抗−ロタウイルス活性を示したものに対し試験した。ラクトコッカス属では２つの亜種（Ｌｃ．ラクチス亜種ラクチスおよびクレモリス）から成る単一種（Ｌｃ．ラクチス）により表わした。合計３０菌株を試験した。ストレプトコッカス属では４５菌株で１種（Ｓ．サーモフィラス）を表わした。ロイコノストックおよびプロピオニバクテリウム属では単一種（６菌株）を表わしたが、エンテロコッカスおよびスタフィロコッカス属では各２種で合計１７菌株を表わした。
全体で２６０個の菌株についてロタウイルス阻害活性を試験した。
第１プロトコル
３０μｌの細菌サスペンジョン（平均３×１０⁶細菌を含有）は１０％トリプトース ホスフェート ブロス（フロー）および５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（セロメッド）（ＨＴ−２９細胞の場合１：４に稀釈）および補充Ｍ１９９培地では１００μｌウイルスを補充した７０μｌ Ｍ１９９培地と混合した。ウイルス−細菌混合物は４℃で１時間および３７℃で１時間培養した。９６の穴を有する微量定量プレートの集密的細胞単層として生育するヒト未分化結腸腺腫細胞ＨＴ−２９の細胞はリン酸塩緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）で３回洗浄した。ウイルス−細菌混合物は細胞に適用し、微量定量プレートはＣＯ₂インキュベータ（ヘレウス）で１８時間培養した。ウイルスの複製は下記のように試験した。
第２プロトコル
３０μｌの細菌サスペンジョン（前記）は１０％ トリプトース ホスフェート ブロス（フロー）および５％ トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（セロメッド）（ＨＴ−２９細胞の場合１：４に稀釈）を補充した７０μｌ Ｍ１９９培地と混合し、そして微量定量プレートの細胞に直接適用した。３７℃で１時間培養後、補充したＭ１９９培地の１００μｌのウイルスを微量定量プレートの細胞に添加した。培養はＣＯ₂インキュベータ（ヘレウス）で１８時間継続した。ウイルスの複製は下記のように試験した。
ロタウイルス複製は下記のように感染細胞のロタウイルス タン白の組織−免疫染色により評価した。
感染１日後、細胞培養培地は微量定量プレートから捨て、細胞は無水エタノールで１０分固定した。エタノールは捨て、プレートは３回ＰＢＳ緩衝液で洗浄した。次にウサギに産生し（ローザンヌのＩＳＲＥＣ大学から得た）、ＰＢＳに１：２０００に稀釈した５０μｌの抗−ロタウイルス血清（主としてＶＰ６ タン白に向けられる）を各穴に添加し、穴の乾燥を防止するためにカバースリップをかぶせて３７℃で１時間培養した。抗血清はその後捨て、プレートはＰＢＳにより３回洗浄した。山羊に産生しかつペルオキシダーゼに結合した（ＧＡＲ−ＩｇＧ−ＰＯ、ノルディック）５０μｌの抗−ウサギ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗血清はＰＢＳに１：５００に稀釈して各穴に添加し、そしてプレートは３７℃で１時間培養した。血清は捨て、プレートはもう一度ＰＢＳにより３回洗浄した。次に１００μｌの次の基質混合物を各穴に添加した：１０ｍｌの０．０５Ｍトリス−塩酸塩（ｐＨ７．８）、１ｍｌのＨ₂Ｏ₂（３０％容、Ｈ₂Ｏに１：６００に稀釈、メルク）および２００μｌの３−アミノ−９−エチルカルバゾール（−８０℃で２００μｌ試料で貯蔵した０．１ｇ／１０ｍｌ エタノール、Ａ−５７５４、シグマ）。プレートは室温で少なくとも３０分インキュベートした。基質は捨て、穴は２００μｌのＨ₂Ｏを満たして反応を停止させた。感染細胞病巣は倒立顕微鏡（ダイアバート、レイツ）により計数した。
ごく少数の細菌菌株がロタウイルスと相互作用した。初めに選択した２６０個の細菌細胞のうち単に９個のみが少なくとも１つのプロトコルのロタウイルス複製を阻害した。ラクトバチルス・パラカゼイＮＣＣ２４６１（ＳＴ１１）はセロタイプ１ロタウイルス、セロタイプ３ロタウイルスＳＡ１１およびセロタイプ４ロタウイルスホチに対し非常に高い活性を示した。
【００４２】
例３
Ｃａｃｏ−２細胞の培養
（病原性）細菌阻害試験では、細胞系Ｃａｃｏ−２を腸のモデルとして使用した。この細胞系は例えば、ポーラリゼーション、腸酵素の発現、特別構造のポリペプチドの生産のような腸細胞に対し特有の特徴を提示する。
この細胞は３つの異る支持体、すなわち生育および増殖用にプラスチック皿で（２５ｃｍ²、コーニング）、付着試験では脱脂および滅菌した６個の穴を有するガラスプレート（２２×２２ｍｍ、コーニング）および阻害試験では２４個の穴を有するガラスプレート（コーニング）で生育させた。
培養２日後に培地（ＤＭＥＭ）を毎日変えた。使用前培地は１００Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン、１μｇ／ｍｌ アンホテリンおよび５６°で３０分不活性化した２０％ＦＣＳを補充した。培養は９０％空気と１０％ＣＯ₂を含む大気で３７℃で行なった。細胞は６日毎に分離した。細胞は０．２５％トリプシンおよび３ｍＭＥＤＴＡを含むｐＨ７．２のＰＢＳで処理して穴の壁から分離した。トリプシンの効果を中和するために、等容積のＦＣＳを生成細胞サスペンジョンに添加し、混合物は遠心分離し（１０００ｒｐｍで１０分）、ペレットは再び培養物に入れた。約３．５×１０⁵細胞を新しい培養びんに移し、集密的細胞単層を得るまで培養した。
【００４３】
例４
細菌の培養
ＳＴ１１：
細菌菌株は１５％グリセロールを含有するＭＲＳ培地に−２０℃で貯蔵した。菌株はＭＲＳに嫌気条件下で成育し、阻害試験に使用する前２４時間の間隔で新しい培地に２回移した。この試験では、２×１０⁹ｃｆｕ／ｍｌの濃度を使用した。
上澄は２０，０００ｒｐｍで１時間遠心分離して集め、得た上澄はその後細菌の存在を点検した。
大腸菌：
２つの大腸菌菌株、大腸菌ＤＡＥＣ Ｃ１８４５（拡散付着大腸菌）および大腸菌ＪＰＮ１５（ＥＰＥＣ、エンテロ・パソジェニック大腸菌）を使用した。
解凍後、最初の継代培養はＣＦＡ−ミュラーヒントン寒天培地で行ない、これは細菌による付着率を表現するのに適する。
各実験前に細菌細胞は３７℃で培養し、新しい培地への移送は各２４時間後に２回行なう。ＪＰＮ１５はアンピシリン耐性遺伝子を有するので、この抗生物質は生育中の選択に使用した。
サルモネラ：
サルモネラ・チフィムリウム菌株ＳＬ１３４４を実験に使用し、これはＬＢ培地に使用前生育した。
【００４４】
例５
大腸菌の阻害試験
新しい培地に第２継代培養後、病原菌菌株はＬＢ培地で１０μＣｉ／ｍｌのＣ¹⁴−アセテートを使用して放射性同位元素により標識した。この培地で菌株の培養は３７℃で１８時間行なった。
その後細菌サスペンジョンは遠心分離（１０４１ｇ、１５分）して、残留するＣ¹⁴−アセテートを含む上澄を除いた。ペレットを懸濁し、ＰＢＳで洗浄し、ついで細胞を１％無菌マンノースｍｌ当たり約１０⁸細胞の濃度で懸濁させた。マンノースは特別の付着を示さないことが分っている。
異る病原菌株（大腸菌）をＣａｃｏ−２細胞（３７℃、１０％ＣＯ₂、９０％空気）の単層と３時間接触させた。同じ実験は上澄（２０，０００ｒｐｍで４０分遠心分離して得た）を使用して行なった。
対照として病原菌はＳＴ１１または培養上澄のそれぞれを同時添加せずにＣａｃｏ−２単層と接触させた。
３時間の培養後、培地を変え、単層はＰＢＳで３回洗浄した。各洗浄工程は本質的にすべての非特異的付着を除くためにＰＢＳ溶液の２０×撹拌を含んだ。細胞はその後１ｍｌの炭酸ナトリウムを添加しそして３７℃で４０分培養して溶解した。均質化後、試料（２５０ｍｌ）は５ｍｌのシンチレーション流体（ヒオニック−フルオル パッカード）で稀釈し、計数した（パッカード２０００）。病原性細胞のＣａｃｏ−２細胞への付着率％は１００％（付着、又は例６の侵入）にセットした対照に対し計算した。
【００４５】
例６
サルモネラに対する阻害試験
サルモネラは表皮細胞に侵入しかつそこで増殖する細菌である。ＳＴ１１の阻害活性を測定するために、サルモネラ・チフィムリウム菌株ＳＬ１３４４を上記のように¹⁴Ｃ−アセテート含有培地で培養し、例５記載の実験を行なった。
培養後、Ｃａｃｏ−２細胞はＰＢＳで洗浄してすべての非付着細胞を除いた。その後ゲンタマイシン（２０μｇ／ｍｌ）を含有する培地を添加し、培養は３７℃で１時間継続した。ゲンタマイシンはすべての菌体外微生物が殺されるように腸細胞に入りこまない抗生物質であり、一方腸細胞に既に侵入したサルモネラは生き残こる。ＰＢＳにより２回細胞を洗浄後、細胞は無菌蒸留水を添加して溶解し、放射能は例４に記載のように測定した。
例５および６の結果は図６〜９に示す。培養ＳＴ１１細胞および培養上澄は下痢を起こす病原性微生物による腸細胞への付着および細胞中への侵入防止に非常に有効であった。
【００４６】
例７
ＳＴ１１の性質
ＳＴ１１は人工胃液中で培養した。人工胃液はペプシン（３ｇ／ｌ）を無菌生理的食塩水（０．５％ ｗ／ｖ）に懸濁し、ｐＨをそれぞれ２．０および３に濃ＨＣｌにより調整して製造した。ＳＴ１１は上記培地で量を変えて生育させ、微生物の耐性を測定した。
結果は表１に要約する。

ＳＴ１１は乳酸菌の属で開示した方法により規定された次の性質を有する（Ｅｄ．Ｂ．Ｊ．Ｂ．Ｗｏｏｄ ａｎｄ Ｗ．Ｈ．Ｈｏｌｚａｐｆｅｌ，Ｂｌａｃｋｉｅ Ａ＆Ｐ）。
−グラム陽性
−カタラーゼ陰性
−ＮＨ₃生成アルギニン陰性
−ＣＯ₂産生陰性
−Ｌ（＋）乳酸の産生
−約０．４％までの濃度の胆汁酸塩の存在で生育。
【００４７】
例８
各種条件下のＳＴ１１の生育
ＳＴ１１はシュクロース（０，０．５，１または２％）または大豆ペプトン（０．５％）またはグルコース（０．５％）を補充したトマトをベースとする培地（蒸留水に水和した４％トマト粉末）に異る期間３７℃で培養した。結果は図２に示す。
ＳＴ１１はさらに米粉（３％）、小麦粉（２％）およびシュクロース（３％）から成る培地に２．５％の量で添加し、４．４のｐＨに達するまで３７℃で培養した。冷却後、製品はビタミンＣを添加または添加せずに包装し、１０℃で貯蔵した。
【００４８】
例９
マウス付着細胞のＳＴ１１による１Ｌ−１２および１Ｌ１０−ｍＲＮＡの合成の誘導
８週令の特別の病原体を含まないＣ５７ＢＬ／６マウスの大腿骨および脛骨から骨髄を単離し、１０％牛胎児血清、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、１２ｍＭヘペス、０．０５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（すべての試薬はギブコから）を含有するＲＰＭＩ培地（ギブコ）に２×１０⁶細胞／ｍｌの濃度で、３７℃で１２時間、５％ＣＯ₂大気で培養した。非付着細胞は温かい培地で３回連続洗浄して捨て、残こる付着細胞を集め、１０⁶細胞／ｍｌの濃度で６時間細菌の存在または不存在下で培養した。６時間はＬＰＳの応答でマウス付着細胞によるサイトカインｍＲＮＡ合成の最適時点を表わすことは予め測定した。細菌は１０⁹〜１０⁷ｃｆｕ／ｍｌの範囲の異る濃度で添加した。細胞を生育し、上記のように貯蔵した。
６時間の培養期間の最後に、細胞は遠心分離により単離し、ＴＲＩｚｏｌ試薬キット（ｇｉｂｃｏＢＲＬ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１５５９６−０１８）を使用し、メーカーの教示に従って溶解した。総ＲＮＡはイソプロパノール沈澱により単離し、２００ｍＭトリスｐＨ８．３、２５ｍＭ ＫＣｌ、１μｇ／ｍｌオリゴｄ（Ｔ）₁₅（ベーリンガー マンハイム）、１ｍＭ ＤＤＴ（ベーリンガー マンハイム）、４ｍＭの各ｄＮＴＰ（ベーリンガー マンハイム）および４０Ｕ／ｍｌ Ｒｎａｓｉｎ（プロメガ）を含有する４０−μｌ反応容量で２００Ｕ逆転写酵素（スーパースクリプトＩＩ，ＢＲＬ）を使用して４２℃で９０分ｃＤＮＡに逆転写した。ＰＣＲプライマーおよび条件は既にコプフらが記載したものを使用した（ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン、１９９６年９月１日、１８４（３）、１１２７−３６）。ｃＤＮＡ量はハウスキーピング遺伝子（β−２−ミクログロブリン）に特異的プライマーを使用して試料内で標準化した。ＰＣＲ生成物は２％アガロースゲル上で分離し、バンドはＵＶ下で分析した。
図４に示すように、ＳＴ１１はもっとも強い１Ｌ−１２および１Ｌ−１０ｍＲＮＡの誘導を示し、これは積極的なコントロール（腸菌）で観察されたレベルに匹敵できるものであった。最低細菌濃度（１０⁷ｃｆｕ／ｍｌ）で最大の差が見られた。
【００４９】
例１０
ＳＴ１１による１Ｌ−４合成の抑制
ＣＤ４⁺Ｔ細胞はミルテニ・バイオテク（Ｃａｔ．Ｎｏ．４９２−０１）からＭｉｎｉＭＡＣＳキットを使用して特定病原体未感染のＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓から精製した。ＣＤ４⁺Ｔ細胞は１０％牛胎児血清、１ｍＭＬ−グルタミン、１２ｍＭヘペス、０．０５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ培地に２×１０⁵細胞／ｍｌの濃度で培養し、プレート−結合モノクローナル抗体と架橋結合することにより１週中活性化し、ＣＤ₃（クローン ２Ｃ１１）およびＣＤ２８（クローン３７．５１、双方の抗体はファーミンゲンから）を得た。この１ｒｙ培養中、ＣＤ４⁺Ｔ細胞は補助細胞として骨髄付着細胞（上記のように単離）と、および１０⁸ｃｆｕ／ｍｌ ＳＴ１１、または１０⁸ｃｆｕ／ｍｌ Ｌａｌ、または１ｍｇ／ｍｌ ＬＰＳと、または培地のみで同時培養した。この後、この細胞は洗浄し、ＣＤ４⁺Ｔ細胞はＭｉｎｉＭＡＣＳキット技術を使用してもう一度精製し、ついで培地のみを含有する２ｒｙ培養で再刺激した。分化ＣＤ４⁺Ｔ細胞により産生されたサイトカインは２日後サンドイッチＥＬＩＳＡ（エンドーゲンおよびファーミンゲンからのキット）を使用して上澄で測定した。
結果は図５に示す。培地のみの存在で分化した細胞は高レベルの１Ｌ−４を特徴とする優勢なＴｈ２フエノタイプを示した。１ｒｙ培養物にＳＴ１１を添加することにより、１Ｌ−４産生が８倍減少したように、Ｔｈ２分化の結果を強く調節した。この阻害はＬＰＳの存在で分化した細胞から誘導された培養物に認められるものと同様の大きさのものであった。これと対照的に、他のラクトバチルス菌株は１Ｌ−４レベルについて測定可能なインパクトを有しなかった。興味あることに、ＩＦＮ−ｒ量は１ｒｙ培養物にＳＴ１１を添加することにより増加しなかった。
上記から分かるように、本発明の菌株は微生物の有用な性質を利用して食品および／または医薬品キャリアの製造に十分に準備できる。
【００５０】
例１１
ＳＴ１１菌株はガテマラ市郊外のコンミュニティでこの地域の大部分の子供が経験する雨期の急性下痢疾病の媒介および体験に影響を与えるその能力に関し臨床試験を行なった。３５〜７０ヶ月令の合計２０３人の子供が研究に登録し、２９日の供与期間にわたって１０¹⁰の生菌（ＳＴ１１）の目標用量を受け、または何も（偽薬）受けなかった。試料および偽薬の双方をそれぞれ選択した子供は栄養不十分のため年令に対する体重および年令に対する身長で典型的不足があった。
学令前の子供の供与試験の開始前、安全評価は試験管内および生体内研究に基づいて行なった。試験管内研究では食品適用に使用する他のラクトバチルスと同様の抗生物質耐性パターンを示したが、生体アミンの形成、ムチンの分解および胆汁酸塩の脱結合の可能性はない。４２人の成人ボランティアを含む偽薬−調整臨床研究では、ＳＴ１１は十分に許容され、そして皷腸、１日の便通の回数および便の固さのような監視される可能性のある発現のうち悪影響を全く誘導せず、血清の急性期タン白量は潜在的炎症反応に関し何らの懸念も起こさなかった。
試料および偽薬はネスレの製品技術センターで小袋に包装し、ガテマラに冷凍して船積みした。各１０ｇの小袋はチョコレートフレーバ付与ビヒクルおよび０．２ｇのＳＴ１１（１０¹⁰ｃｆｕ）、または偽薬の場合、０．２ｇの粉乳から成っていた。チョコレートフレーバ付与ビヒクルはココア粉末、糖、大豆レシチン、バニラおよびシナモンから成るものであった。小袋は使用前２時間まで４°〜６℃で貯蔵した。使用前、小袋はネスレが供する、細菌汚染の全くない１００ｍｌの水に溶解しなければならなかった。
適用されたプロトコルによれば、下痢は２４時間中に３回以上の液体または未固形排泄の発生として規定された。下痢症状は下痢の証拠（２４時間中に３回の下痢排泄）を提示した場合として規定された。その合計期間（時間で）は最初の３回の指標便通時から最初の有形便通の出現まで、または２４時間排便のない期間までが計算された。「新しい」症状を有する子供では、前期症状の終るまで４８時間経過しなければならなかった。そうでなければ、同じ症状の継続が考えられ、その場合全体の期間が評価に使用される。２９日の観察期間中１回以上の実証された下痢の症状を経験するのは子供の場合であった。下痢症状の強さは産生した軟便の総回数を基準とした。症状のきびしさの要素は便通に血液、粘液または膿汁の存在、同時に伴なう発熱および嘔吐を包含する。２４時間に７回の便通の烈しさ、または診療所、健康センター、または病院で健康専門職による介在が必要の場合も症状をきびしいものとして分類する。
下痢の症状が監視系によって診断される場合、下痢便通は症状に対し可能な病因病原体を確認するため顕微鏡試験および培養を行なうため収集した。試験品は試料が赤痢である場合、ロタウイルス抗原、（ｇｉａｒｄｉａ，ａｎｄ Ｅ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）に対し、およびシゲラ、サルモネラ、アエロモナス、プレシオモナス・シゲロイデス、大腸菌、あるいはＶ．コレラに対し診断された。
試験期間中、製品試料は投与期間中に含まれる微生物の生存性を試験するため集めた。微生物は全試験中小袋中で生存可能な状態のままであり、試験の終了時にも小袋は水により再構成すると１０¹⁰の生存可能な微生物を含むことが分かった。
プロビオチック微生物を含有する試料は対照群（偽薬）と比較して下痢の発生を約３０％だけ減少できたことが試験により分かった。尚、また対照群は試料または偽薬のそれぞれを受けない通常の人以上に下痢発生数の減少を既に示した。この後者の発見は付加的の貴重な栄養と汚染のない水を受ける子供基準で一部説明できる。しかし、試験は現場で行われたので、ＳＴ１１は生体内の下痢の発生を疑いなく低減できることを明らかに誘導できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ロタウイルスに対し保護性を示す細菌菌株の細胞培養概略図である。
【図２】 異る培地におけるＬ．カゼイ ＳＴ１１菌株の酸性化を示す。
【図３】 １０℃、３０日間のＬ．カゼイ ＳＴ１１菌株の生存割合を示す。
【図４】 骨髄由来のマウス付着細胞の１Ｌ−１２および１Ｌ−１０のｍＲＮＡパターンを示す。
【図５】 １Ｌ−４産生の減少によるＴｈ２分化を示す。
【図６】 ＳＴ１１細胞による大腸菌の上皮細胞への付着阻害を示す。
【図７】 ＳＴ１１カルチャー上澄による大腸菌の上皮細胞への付着阻害を示す。
【図８】 ＳＴ１１細胞によるサルモネラ・チフィムリウムの上皮細胞への侵入防止を示す。
【図９】 ＳＴ１１カルチャー上澄によるサルモネラ・チフィムリウムの上皮細胞への侵入防止を示す。

Claims (8)

1. ラクトバチルス・パラカゼイＣＮＣＭ Ｉ−２１１６（ＮＣＣ２４６１）。
2. ラクトバチルス・パラカゼイＣＮＣＭ Ｉ−２１１６（ＮＣＣ２４６１）を含む、摂取できる支持物質。
3. ラクトバチルス・パラカゼイＣＮＣＭ Ｉ−２１１６（ＮＣＣ２４６１）は約１０⁵ｃｆｕ／ｇ〜約１０¹²ｃｆｕ／ｇ支持物質の量で支持物質に含まれる、請求項２に記載の摂取できる支持物質。
4. ラクトバチルス・パラカゼイＣＮＣＭ Ｉ−２１１６（ＮＣＣ２４６１）の培養物の上澄を含む、摂取できる支持物質。
5. 前記支持物質は、乳、ヨーグルト、カード、チーズ、発酵乳、乳をベースとする発酵製品、アイスクリーム、発酵穀類をベースとする製品、乳をベースとする粉末、乳児用調製粉乳から選択した食品組成物である、請求項２又は４に記載の摂取できる支持物質。
6. 支持物質は下痢と関連する疾病の治療および／または予防に使用する、請求項２から５のいずれか１項に記載の摂取できる支持物質。
7. ラクトバチルス・パラカゼイＣＮＣＭ Ｉ−２１１６（ＮＣＣ２４６１）又はその培養物の上澄を含有する、食品組成物又は医薬組成物。
8. 乳、ヨーグルト、カード、チーズ、発酵乳、乳をベースとする発酵製品、アイスクリーム、発酵穀物をベースとする製品、乳をベースとする粉末、乳児用調製粉乳、錠剤、細菌液体サスペンジョン、経口用乾燥サプリメント、経口用含水サプリメント、乾燥経管栄養又は含水経管栄養から選択する、請求項７に記載の組成物。

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