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KR100419132B1 - 위·장 점막 부착성과 증식성, 내산성, 내담즙성 및헬리코박터 파일로리, 대장균 0157:h7에 대한 항균성이우수한 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이csk 01 - Google Patents

위·장 점막 부착성과 증식성, 내산성, 내담즙성 및헬리코박터 파일로리, 대장균 0157:h7에 대한 항균성이우수한 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이csk 01 Download PDF

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KR100419132B1
KR100419132B1 KR10-2000-0085232A KR20000085232A KR100419132B1 KR 100419132 B1 KR100419132 B1 KR 100419132B1 KR 20000085232 A KR20000085232 A KR 20000085232A KR 100419132 B1 KR100419132 B1 KR 100419132B1
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Abstract

본 발명은 새로운 유산균, 그의 항균물질, 그들의 제조방법 및 용도에 관한 것으로서, 상세하게는 돼지 위 점막 유래 유산균을 위염과 장염을 동반한 환자에게 복용시킨 후 회복된 사람의 변에서 유산균 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이 균주 (Lactobacillus paracasei subsp. paracaseiCSK 01)를 재분리하여, 균주의 성상에 대한 동정, 실험 동물을 이용한 위·소장 점막 부착 및 증식성 실험과, 실험동물 및 시험관 내 실험 등을 통해 본 발명 유산균주가 헬리코박터 파일로리 (H. pylori) 및 대장균 (E. coli) 0157:H7 에 대한 사멸성, 내산성, 내담즙성 등이 우수하여 위·장 점막에 상재할 수 있고 건위·정장 효과 및 각종 항균성이 높아 다양한 분야에 아주 유익하게 활용될 수 있으며, 국제적으로도 유산균의 기능적 실용화에서 경쟁력이 매우 높을 것으로 판단된다.

Description

위·장 점막 부착성과 증식성, 내산성, 내담즙성 및 헬리코박터 파일로리, 대장균 0157:H7에 대한 항균성이 우수한 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이 CSK 01{Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CSK 01}
본 발명은 새로운 유산균, 그의 항균물질 및 그들의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 돼지의 위점막 유래 유산균을 위염 및 장염 환자에게 복용시켜 회복된 환자의 변에서 분리한 유산균 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이 균주 (Lactobacillus paracasei subsp. paracaseiCSK 01) 및 이로부터 정제한 항균물질에 관한 것으로서, 상기 유산 균주는 위·장 점막 부착성, 증식성, 내산성, 내담즙성 및 항균성이 우수하여 다양한 기능성 식품 및 의약품에 유용하게 사용될 수 있다.
락토바실러스 속 균은 소화기관의 상피세포 표면에 렉틴(lectin) 물질이 많이 포함된 부위에 친화성이 높은데, 외부에서 체내에 도달한 유산균은 이런 부위에 부착·증식하며 체내에 토착화한 유산균 역시 이 친화성 부위에 집락을 형성한다.
상피세포에 토착화한 락토바실러스 속 균은 다양한 종류가 있으며 유산균 상호간 생존에 도움이 될 수 있게 공존하고 숙주에 유익한 기능으로 일관하는데 균종마다 역할이 달라 A균은 집락화, B균은 항균성 물질 분비, C는 강산성 유산 물질 분비, D는 소화활성 도모 등 균 종마다 각각의 특성을 가진 프로바이오틱스(probiotics) 작용이 있는 것으로 알려져 있다.
상기와 같은 특성을 갖는 락토바실러스 속 균과 관련하여 국제적으로 많은 연구가 경쟁적으로 이루어진 결과 식품제조, 의약품 등 다양한 분야에 적용되어 실용화되고 있으나 현재까지 국제적 연구 결과에서 얻어진 기능성 락토바실러스 속 균은 장, 변, 식품, 식품원료 등으로부터 유래되었기 때문에 소장 및 대장에 친화성을 가지는 반면 락토바실러스 속의 균종으로 제조한 식품을 복용하였을 경우 위액에 의해 거의 사멸하기 때문에 유산균으로서의 기능성 효과가 의문시되고 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서 위·장 점막 부착성, 증식성, 내산성, 내담즙성 및 항균성이 우수한 새로운 유산균주를 얻기 위하여, 본 발명자들은 돼지 위 유래 유산균을 위염과 장염을 동반한 환자에게 복용시킨 후 회복된 사람의 변에서 균주를 분리하고, 분리된 균주의 형태적, 생리학적 및 배양학적 특성을 조사하여 이 균주가 락토바실러스 파라카제이의 새로운 균주임을 확인하여 본 발명을 완성하였다.본 발명의 목적은 항균성이 우수한 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이 균주를 제공하는 것이다. 바람직하게, 헬리코박터 파일로리 및 대장균 0157:H7 등에 대한 항균성을 포함한다.또한, 본 발명의 목적은 상기에 더하여 내산성이 우수한 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이 균주를 제공하는 것이다.또한, 본 발명의 목적은 상기에 더하여 내담즙성이 우수한 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이 균주를 제공하는 것이다.또한, 본 발명의 목적은 상기에 더하여 위 점막에 부착하여 증식할 수 있는 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이 균주를 제공하는 것이다.또한, 본 발명의 목적은 상기에 더하여 소장 점막에 부착하여 증식할 수 있는 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이 균주를 제공하는 것이다.또한, 본 발명의 목적은 (1) 돼지 위 점막 유래의 유산균을 위염 및 소장염을 동반한 환자가 복용한 다음 (2) 완전히 회복된 환자의 변으로부터 다시 유산균을 분리하고 (3) 이로부터 균주를 동정하는 과정으로 구성되는 상기 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이 균주의 제조방법을 제공하는 것이다.본 발명은 상기 제조방법에 있어서, 균주의 동정을 위하여 서열번호 1과 2(표 2)의 프라이머를 이용하여 16S rRNA 서열분석을 수행하는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명은 균주의 동정을 위하여 RAPD 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 수행하여 공지의 균주와 비교하는 것을 특징으로 하는 제조방법을 제공한다.또한, 본 발명의 목적은 헬리코박터 파일로리 및 대장균 0157:H7 을 사멸시키거나 증식을 억제하는 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이 균주 CSK 01 로부터 분리, 정제한 항균물질을 제공하는 것이다.또한, 본 발명의 목적은 상기 균주의 유효성분을 함유하는 헬리코박터 파일로리에 의한 위염, 위궤양 그리고 대장균과 기타 장내병원성 세균에 의한 장염을 예방 및 치료하는 기능성 식품을 제공하는 것이다.또한, 본 발명의 목적은 상기 균주의 유효성분을 함유하는 헬리코박토 파일로리에 의한 위염, 위궤양 그리고 대장균과 기타 장내병원성 세균에 의한 장염을 예방 및 치료하는 의약품을 제공하는 것이다.
도 1a, 1b는 본 발명 유산균주(CSK 01)의 그람(gram) 염색상 형태 사진,
도 2는 본 발명 유산균주의 API KIT 50 CHL 당 분해 분석표,
도 3은 본 발명 유산균주의 마이크로바이얼 아이덴티피케이션 시스템(Microbial Identification System; Microbial ID, Inc., Newark, del., USA)의 자동 가스 크로마토그래피(Automated Gas Chromatography) 이용 나타난 균체 지방산 구성 성분 그림,
도 4는 본 발명 유산균주의 자동 가스 크로마토그래피 이용 나타난 균체 지방산 구성 성분 결과 분석표,
도 5a, 5b, 5c, 5d는 본 발명 유산균주의 바이오로그 GP 마이크로플레이트(Biolog GP Microplate; Biolog Cat. #1004) 이용 95개 탄소원에 대한 메타볼릭 핑거프린트(Metabolic Fingerprint) 분석표,
도 6은 본 발명 유산균주의 DNA 염기서열표,
도 7은 본 발명 유산균주의 16s rDNA의 DNA 염기서열에 의한 블라스트(BLAST) 결과표,
도 8은 락토바실러스 파라카제이-그룹-스패시픽 프라이머(Lactobacillus paracasei-group-specific primer) 이용 본 발명 유산균주와 락토바실러스속(Lactobacillus sp.) PCR 반응 비교 그림,
도 9는 본 발명 유산균주 DNA와 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이(JCM 8130) DNA의 염기서열 비교표,
도 10은 RP 프라이머 이용 본 발명 유산균주와 락토바실러스 스패시즈 RAPD-PCR 반응 비교 그림,
도 11은 CRA25 프라이머 이용 본 발명 유산균주와 락토바실러스 스패시즈 RAPD-PCR 반응 비교 그림,
도 12a, 12b는 본 발명 유산균주의 위 점막 부착성 및 증식성을 보여주는 그림,
도 13a, 13b는 본 발명 유산균주의 소장점막 부착성 및 증식성을 보여주는 그림,
도 14는 헬리코박터 파일로리(H. pylori)의 Balb/c 마우스 위점막 감염성을 보여주는 사진,
도 15는 본 발명 유산균주(CSK 01) Balb/c 감염 헬리코박터 파일로리 사멸성을 보여주는 사진,
도 16은 본 발명 유산균주 항균물질의 헬리코박터 파일로리 사멸성을 보여주는 사진,
도 17은 E. coli O157:H7의 Balb/c 소장점막 감염성을 보여주는 사진,
도 18은 본 발명 유산균주의 Balb/c 김염 E. coli O157:H7 사멸성을 보여주는 사진,
도 19는 본 발명 유산균주와 E. coli O157:H7 혼합배양에 의한 E. coli 사멸성을 보여주는 사진,
도 20은 본 발명 유산균주 항균물질의 E. coli O157:H7 사멸성을 보여주는 사진이다.
본 발명은 항균성이 우수한 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이 균주를 제공한다. 바람직하게는 헬리코박터 파일로리 및 대장균 0157:H7 등에 대한 항균성을 포함하는 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이 균주를 제공한다.본 발명은 상기 항균성을 가지는 유산균 균주를 얻기 위하여, 돼지 위 점막 유래의 유산균을 위염 및 소장염을 동반한 환자에게 복용시킨 다음 환자가 완전히 회복되면 환자의 변을 모아 다시 유산균을 분리한다. 또한,본 발명의 균주는 (1) API KIT 50 CHL 각종 당분해, (2) 균체 지방산 (cellular fatty acid) 구성 성분(composition) 분석, (3) 메타볼릭 핑거프린트 (metabolic fingerprint) 탄소원 이용성 분석 등을 이용하여 분석한다. 그 결과 상기 균주는 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이 (L. paracasei subsp. paracasei) 또는 락토바실러스 람노서스 (L. rhamnosus)로 동정되었다.또한, 본 발명은 균주의 동정을 위하여 서열번호 1과 2(표 2)의 프라이머를 이용하여 16S rRNA 서열분석을 수행하고, 이외에도 RAPD 중합효소 연쇄반응 (PCR) 등을 수행하여 공지의 균주와 비교한다.구체적으로, 상기 균주는 16s rDNA 서열 분석 (sequencing) 및 블라스트(BLAST) 이용한 염기서열 분석 등에서 99.9 % 이상 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이 (L.paracasei subsp. paracasei)에 속하는 것으로 확인되고, 락토바실러스 파라카제이 그룹 특이 프라이머 (specific primer) 이용한 PCR 반응에서 상기 균주 및 대조 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이(L. paracasei subsp. paracasei) 모두 300bp 분획이 동일하게 확인됨으로써 CSK 01 이 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이로 입증되었다.또한, 본 발명의 균주와 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이 (L. paracasei subsp. paracasei; JCM 8130)는 16s rDNA 서열분석 (sequencing)을 통한 비교에서 다음과 같은 염기서열의 차이를 보인다.861 : CSK 01 의 경우 G; JCM 8130 의 경우 T,1451 : CSK 01 의 경우 A; JCM 8130 의 경우 G이외에도, 락토바실러스 파라카제이 스패시즈 (L. paracasei sp.)의 RP 프라이머 (primer) PCR 반응에서 시험균 및 대조균에서 모두 약 850bp 위치는 일치하였으나 이외의 밴드에서 서로 다르며, CSK 01 균주는 락토바실러스 파라카제이 속 CRA25 프라이머 (L. paracasei sp.CRA25 primer) PCR 반응에서 약 980bp, 550bp 크기의 두 개의 밴드가 인정되었으나, 대조균은 이와 일치하지 않아 CSK 01 균주만의 특이성이 인정된다.또한, 본 발명은 상기 균주의 안전성을 입증하기 위하여, 균주 배양액 (5×109cfu/㎖)을 Balb/c 마우스에 0.3㎖ 및 그 2배인 0.6㎖ 를 구강으로 1일 1회, 10일간 투여한 다음 2개월 이상 안정성을 조사한다. 그 결과 시험 마우스 모두 육안적으로 건강을 유지하였고 각 장기 모두 정상이었으며, 위·소장 점막을 포함한 소화기관도 대조군과 유사함을 확인한다.본 발명은 내산성이 우수한 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이 균주를 제공한다. 구체적으로, 10% 스킴 밀크 (skim milk)에 염산을 첨가하여 pH 를 4.0에서 1.0 으로 조절한 용액에 본 발명의 균주를 접종한 다음 2일 및 4일 배양에서 각각 pH 1.5 에서도 증식능이 있어 내산성이 우수함을 확인한다.참고로, CSK 01 균주는 pH 1.5에서 유산균이 101cfu/㎖ 이하, pH 2.0에서 104∼5cfu/㎖ 수준으로 분리된다.또한, 본 발명은 상기에 더하여 내담즙성이 우수한 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이 균주를 제공한다. 구체적으로, 10% 스킴 밀크에 돼지 담즙을 첨가하여 4.0∼4.5% 로 조절한 용액에 본 발명의 균주를 접종한 다음 2일 및 4일 배양에서 각각 4.5% 에서도 증식능이 있으므로 내담즙성을 확인한다. 참고로, CSK 01 균주는 담즙 4.0∼4.5% 에서 102∼3cfu/㎖ 이하 수준으로 균이 분리된다.또한, 본 발명은 상기에 더하여 위 점막에 부착하여 증식할 수 있는 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이 균주를 제공한다. 구체적으로, 시험 마우스에 균주 배양액 0.3 ml 을 10일 동안 1일 1회 구강으로 투여하고 2개월이 경과한 다음 위 점액 1 g 을 얻어 균을 분리하고 7×108cfu/g 의 결과를 얻었으며, 전자현미경 관찰에서도 위 점막에 무수이 CSK 01 균주의 부착 및 증식이 확인된다.또한, 본 발명은 상기에 더하여 소장 점막에 부착하여 증식할 수 있는 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이 균주를 제공한다. 구체적으로, 시험 마우스에 균주 배양액 0.3 ml (7×109cfu/㎖)을 10일 동안 1일 1회 구강으로 투여하고 2개월이 경과한 다음 소장 점막을 절취하여 균을 분리하고 7×106cfu/g 의 결과를 얻었으며, 전자현미경 관찰에서도 소장 점막에 무수이 CSK 01 균주의 부착 및 증식을 확인한다.또한, 본 발명은 상기에 더하여 헬리코박터 파이로리를 사멸시키는 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이 균주를 제공한다. 구체적으로 헬리코박터 파이로리 배양액 0.3 ml을 시험 마우스에 1일 1회 5일간 구강으로 투여하고 3일이 지난 다음 감염 상태에서 균주 배양액 0.3 ml 을 10일 동안 1일 1회 구강으로 투여한 다음 위 점액에서 헬리코박터 파이로리는 분리되지 않고 CSK 01 균주만이 회수되어 전자현미경 관찰에서 위 점막에 CSK 01 균주만이 무수히 분포된 것을 확인한다.또한, 본 발명은 대장균을 사멸시키거나 증식을 억제하는 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이 균주를 제공한다.구체적으로, 대장균 배양액 0.3 ml 을 시험 마우스에 1일 1회 5일 동안 구강으로 투여하고 3일이 지난 다음 감염 상태에서 CSK 01 균주 배양액 0.3 ml 을 10일 동안 1일 1회 구강으로 투여하여 2개월이 경과한 다음 소장 점액에는 대장균이 분리되지 않고 CSK 01 균주만이 회수되며 전자현미경 관찰에서도 소장 점막 조직에 CSK 01 균주만이 수많이 분포되어 있어 대장균 사멸성을 확인한다.이 때. 헬리코박터 파이로리 (H.p)는 7×109cfu/㎖, 대장균 O157:H7 (E.c)은 3×109cfu/㎖ 을 1일 1회 5일간 투여하고, 3일이 경과한 다음 위 및 소장 점막에서 위 점막의 헬리코박터 파이로리는 7×107cfu/g, 소장 점막의 대장균은 7×104cfu/g 으로 감염되며, 이러한 마우스에 CSK 01 균주의 배양액 (5×109cfu/㎖)을 1일 1회 0.3㎖ 을 10일 동안 투여하고 2개월이 경과한 다음 헬리코박터 파이로리와 대장균은 분리되지 않는 반면 CSK 01 균주는 위 점액 1g 당 7×109cfu, 소장점액 1g 당 4×106cfu수준으로 분리된다.이외에도, 본 발명의 균주와 대장균의 균수를 비슷한 범위로 조절한 2개의 균주 배양액을 동시에 10% 스킴 밀크에 접종하고 5일 동안 배양하는 중 증식 양상이 배양 70시간 이내에 대장균은 완전히 사멸하는 반면 CSK 01 균주는 대장균에 전혀 영향을 받지 않고 증식하는 것을 확인한다.이에 본 발명자는 이 균주를 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이 CSK 01 (Lactobacillus paracasei subsp. paracaseiCSK 01)로 명명하고, 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 2000년 12월 8일자로 기탁하였다 (기탁번호 KCTC 0907 BP).상기 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이 CSK 01 샘플은 미생물 기탁의 국제적 인식에 대한 부다페스트 조약 및 조약하에 공표된 규정에 관련된 특허법 시행령 제4조의 규정에 따라 이들을 받을 권한이 법적으로 주어진 산업재산권 관련 관청 (특허청) 및 개인이 구입 가능하다.본 발명은 헬리코박터 파이로리 및 대장균 0157:H7 을 사멸시키거나 증식을 억제하는 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이 균주 CSK 01 로부터 분리, 정제한 항균물질을 제공한다.구체적으로, 헬리코박터 파이로리 배양액을 배지 전면에 도말하고 CSK 01 균주의 상기 항균물질을 흡수한 디스크를 중앙에 위치시키며 4일 동안 혐기적 배양으로 디스크 주위에 헬리코박터 파이로리가 완전히 사멸한 것을 확인한다. 이외에도 CSK 01 균주와 대장균을 혼합 배양한 상태에서 대장균의 사멸성을 실험한 결과 배양 40시간 이후부터 대장균이 현저히 사멸되는 것으로 확인한다.또한, 본 발명은 상기 균주 및 항균물질의 유효성분을 함유하는 헬리코박터 파이로리에 의한 위염, 위궤양, 십이지장염 그리고 대장균과 기타 장내 병원성 세균에 의한 소장염, 대장염 및 직장염 등에 대한 예방 및 치료하는 기능성 식품을 제공한다.또한, 본 발명은 상기 균주 및 항균물질의 유효성분을 함유하는 헬리코박토 파이로리에 의한 위염, 위궤양, 십이지장염 그리고 대장균과 기타 장내 병원성 세균에 의한 소장염, 대장염 및 직장염 등에 대한 예방 및 치료하는 의약품을 제공한다.이외에도, 본 발명의 균주와 항균물질은 기능성 식품으로서 유산균 발효유 각종 액상 제품, 유산균 생균 및 불활화 유산균 각종 분말제품, 유산균 생균 및 불활화 유산균을 첨가한 각종 분유제품, 유산균 발효 각종 치즈제품, 유산균 생균 및 불활화 유산균을 첨가한 각종 아이스제품 유산균 생균 및 불활화 유산균을 첨가한 각종 음료제품, 유산균 추출액을 첨가한 각종 음료제품 및 아이스제품 등의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.또한, 도포성 제품으로서 대장균성 피부염 도포에 적용하는 유산생균 및 불활화 유산균의 각종 수용제, 분말제, 크림제 등과 유산 생균 및 불활화 유산균으로부터 항균성분의 추출, 정제액을 이용한 각종 수용제, 분말제, 크림제 등 CSK 01 균주 또는 그 유효성분으로 하여 유용하게 사용될 수 있다.또한, 본 발명의 균주와 그의 유효성분을 의약품으로서 헬리코박터 파이로리에 의한 위염, 위궤양, 십이지장염 등과 대장균에 의한 소장염, 대장염, 직장염 등에 적용하는 유산 생균 및 불활화 유산균의 각종 수용제, 분말제 및 알약제 등과 유산생균 및 불활화 유산균으로부터 항균성 성분 추출, 정제액을 이용한 각종 수용제, 분말제, 알약제 등으로 유용하게 사용될 수 있다.본 발명은 돼지 위 유래 유산균을 위염과 장염을 동반한 환자에게 복용시킨 후 회복된 사람의 변에서 균주를 재분리된 유산균(Lactobacillus paracasei subsp. paracaseiCSK 01)에 관한 것이며, 균주의 성상에 대한 동정 실험, 실험동물을 이용한 위·소장 점막 부착성 실험, 실험동물 및 시험관 내 실험 등을 통해 본 발명 유산균주 CSK 01의 내산성, 내담즙성 및 헬리코박터 파이로리(H. pylori), 대장균 0157:H7(E. coli0157:H7)에 대한 사멸성 등이 하기 실시예와 같이 확인되었다.
이하 본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명하면 다음과 같다.
실시예 1
돼지위로부터 유산균 분리
1988∼1998년(10년) 기간에 도축장(부산, 진주, 수원, 전주 등)에서 도축되는 돼지의 위 부위를 채취(3,270두)하여 4℃에서 보관하면서 시료를 시험에 적용하였다.
돼지 위 점액 1g을 MRS 배지(broth)에 부유하여 37℃에서 24시간 배양한 배양액을 MRS 한천배지(agar)에 도말한 다음 37℃에서 3일간 배양한 후 한천배지(agar)상에 나타난 집락을 취하여 그람(gram) 염색상 형태, 당 분해능 등 균주의 성상에 대한 동정 실험을 하기와 같은 방법으로 실시한 결과 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.)임을 확인하였다.
실시예 2
유산균을 복용한 사람의 변에서 유산균 재분리
상기 실시예 1에서 분리된 유산균의 사람 체내에서의 친화성과 항균성을 알아보기 위하여 만성 위염과 장염을 동반한 환자 5명에게 아침 기상 직전과 저녁 취침 30분전의 공복시간에 각각 상기 유산균 100㎖를 2개월간 복용시킨 결과 복용 1개월 전·후에서 경과가 호전되는 것으로 나타났으며, 복용 후 2개월이 지난 후에는 복용 환자 모두가 회복되었다.
이 시점에서 복용 환자 5명의 변에서 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 유산균을 재분리하여 3∼5×107cfu/g 의 균을 얻었으며, 상기 실시예 1에서 분리된 균과 동일한 방법으로 균주의 성상에 대한 동정 실험을 한 결과 복용 유산균(실시예 1에서 분리된 균)과 특성이 일치하였으며, 이를 CSK 01 로 약칭한다.
상기 유산균주 CSK 01은 스킴 밀크(skim milk)가 10% 첨가된 균액 상태로 동결건조 시킨 후 -20℃에 보관하여 각종 특성 조사에 적용하였다.
실시예 3
분리 유산균(CSK 01)의 그람(gram) 염색상 형태
CSK 01을 그람 염색하여 염색상 형태를 알아본 결과 도 1a 및 도 1b에 도시된 바와 같이 그람양성을 나타내었고, 무포자 간균으로 1.0∼1.5㎛ 크기의 전형적인 유산 간균인 락토바실러스 속 형태였다.
또한 배양 특성은 MRS 한천배지(agar)에서 회백색 광택의 직경 2∼3㎜ 크기의 집락을 이루며 30℃ 보다 37℃에서 증식이 양호한 것으로 나타났다.
실시예 4
CSK 01 의 API KIT 50 CHL 시험 분석
CSK 01을 MRS 한천배지(agar)에서 37℃의 온도로 48시간동안 혐기적으로 배양한 균을 취하여 멕파랜드 2(McFarland 2)와 동일한 탁도로 서스펜션 미디엄(suspension medium)에 현탁하여 API 50 CHL 스트립 튜브(strip tube)에 접종한 후 미네랄 오일(mineral oil)로 상층을 덮은 다음, 37℃에서 48시간 동안 배양하면서 49가지의 당 분해능을 분석하였다.
표준 균주 락토바실러스 람노서스(L. rhamnous)와 CSK 01의 당분해능 분석 결과 락토바실러스 람노서스의 경우 베타-겐티오바이오즈(β-gentiobiose)와 글루코네이트(gluconate)에 각각 85%인 반면 CSK 01은 5%와 45%인 것으로 나타났다.
그리고 표준균주 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이(L. paracasei subsp. paracasei)와 CSK 01의 당 분해능 분석 결과 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이의 경우 알파-메탈-디-글루코시드(α-methyl-d-glucoside) 85%, 아미달린(amygdaline) 99%, 사카로즈(saccharose) 93%, 베타-겐티오바이오즈(β-gentiobiose) 85%, 글루코네이트(gluconate) 85%로 양성인 반면에 CSK 01은 각각 40%, 40%, 45%, 50%, 45%로 음성이었다.
따라서 각종 당 분해능을 API 아이덴티피케이션 소프트웨어 프로그램(API identification software program)으로 분석한 결과 도 2에 도시된 바와 같이 CSK 01은 락토바실러스 람노서스와 99.2%, 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이(L.paracasei subsp. paracasei)와 97.1%의 유사성을 가진 것으로 나타났다.
실시예 5
균체 지방산 구성성분(Cellular fatty acid composition) 분석
MRS 한천배지(agar)에서 37℃로 48시간동안 배양한 CSK 01 약 50㎎(수분 포함 중량)을 취하여 건조 세척(dry clean)한 13×100㎜의 테플론-라인드 스크류 캡 튜브(teflon-lined screw cap tube)에 넣고, 하기 시약(reagent) 1을 1㎖ 첨가하여 100℃에서 30분간 가수분해(saponification)하고, 하기 시약 2를 2㎖ 첨가하여 80℃에서 10분간 메틸레이션(methylation)한 다음 1.25㎖의 하기 시약 3으로 지방산을 추출(extraction)한 후, 실온에 정치한 다음 반응액이 2개의 층으로 분리되면 하층액을 제거하고 3㎖의 하기 시약 4를 첨가하여 5분간 염기 세척(base wash)하여 상등액 2/3 정도를 셉텀 캡트 샘플 바이얼(septum capped sample vial; 12×32㎜, Alltech Associates, Inc., IL, USA)로 옮겨 봉하여 시료로 사용하였다.
시약
시약 1 : 가수분해 시약(Saponification Reagent)
이온이 제거된 증류수 150㎖와 메탄올 150㎖의 혼합액에 수산화나트륨(ACS 공인) 45g을 넣고 다 녹을 때까지 저어 가수분해 시약을 제조하였다.
시약 2 : 메틸레이션 시약(Methylation Reagent)
6.00N 염산 325㎖와 메탄올(시약 등급) 275㎖를 혼합하여 메틸레이션 시약을 제조하였다.
시약 3 : 추출 용매(Extraction Solvent)
핵산(HPLC 등급) 200㎖에 메틸-3차 부틸 에테르(Methyl-tertiary butyl Ether) 200㎖를 혼합하여 추출 용매를 제조하였다.
시약 4 : 염기 세척액(Base wash)
이온이 제거된 증류수 900㎖에 수산화나트륨(ACS 공인) 10.8g을 용해시켜 염기 세척액을 제조하였다.
상기 실시예 5에서 지방산의 분석에는 후렉 패커드 시리즈 II 가스 크로마토그래피 모델 6890(Hewlett Packard series II gas Chromatography medel 6890; Microbial ID, Inc., Delaware, USA)을 이용하였으며, 세퍼레이션 컬럼(separation column)은 25㎖×0.22㎜×0.33m의 메틸 실리콘 퓨즈드 실리카 캐필러리 컬럼(methyl silica fused silica capillary column; HP 19091B-1020)을 사용하였다.
또한 팜스 프로파일(FAMEs profile)은 마이크로바이얼 아이덴티피케이션 시스템 소프트웨어(Microbial Identification System Software; Microbial ID, Inc., Delaware, USA)를 이용하였으며 스탠다드 칼리브레이션(standard calibration) 용액(Microbial ID., Delaware, USA)과의 비교에 의해 피크(peak)를 동정하고, 리텐션 타임(retention time), 피크(peak)의 면적 비율을 구하였다.
이 때 상기 가스 크로마토그래피의 분석 조건은, 캐리어 가스(Carrier Gas),수소(Hydrogen); 컬럼 헤드 압력(Column Head Pressure), 10psi; 스필트 레이셔( Split Ratio), 100:1, 스필트 밴트(Spilt Vent), 50㎖/min; 셉텀 퍼지(Septum Purge), 5㎖/min; FID 수소(hydrogen), 30㎖/min; FID 질소(Nitrogen), 30㎖/min; FiD 에어(Air), 400㎖/min; 초기 온도(Initial Temperature), 170℃; 프로그램 속도(Program Rate), 5℃/min; 최종 온도(Final Temp.), 270℃; FID 온도, 300℃; 인정션 포트(Injection Port), 250℃; 인정션 부피(Injection Volume), 2㎕이었다.
MIS 가스 크로마토그래피로 분석한 결과, 도 3 및 도4에 도시된 바와 같이 주요 지방산으로 C16:0, Sum in feature 7(C18:1 w7c), C18:1 w9c, Sum in feature 9(C19:0 cyclo w10c) 등이 분석되어 유산균 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.)에 속하는 것으로 나타났다.
실시예 6
메타볼릭 핑거프린트(Metabolic Fingerprint) 분석(BIOLOG)
CSK 01을 BLA(Biolog Lactic Acid Bacteria agar) 미디엄(medium)(Cat. #70004)에서 28∼35℃로 24시간 배양한 후 배양된 균체를 0.85% NaCl 20㎖에 현탁하여 590㎚에서 광 밀도(optical dencity)가 35∼42% 범위에 포함되게 한 후 150㎕씩 바이오로그 GP 마이크로플레이트(Biolog GP MicroPlate; Biolog Cat. #1004)의 96 웰(well)에 분주한 후 28∼35℃로 24시간 배양하였다.
그리고 4시간과 24시간 배양한 후의 반응을 리더(reader)를 이용하여 측정하고, 마이크로 릴리즈 3.50 소프트웨어(Micro release 3.50 software)를 이용하여 95개 탄소원 이용 패턴을 분석하였다.
상기 바이오로그 시스템은 95개의 탄소원 이용성을 분석하여 미생물의 동정과 분류에 응용하는 자동화 시스템으로 유산균중에서 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코쿠스(Lactococus), 페디오코쿠스(Pediococus)균의 동정과 분류에 이용할 수 있는 방법이며, 이와 같은 탄소원의 이용 패턴 분석에 의한 CSK 01 의 대사 특성을 분석한 결과 도 5a, 5b, 5c, 5d에 도시된 바와 같이 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus) 또는 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이(L. paracasei subsp. paracasei)로 분석되었다.
실시예 7
1. 토탈 게놈 DNA(Total genomic DNA)의 추출
시험균과 대조균의 염색체 DNA 분리를 헌터(Hunter; 1985)의 방법에 준하여 실시하였다.
즉, 보존균주를 10㎖의 배지에 접종하여 37℃에서 2∼3일 배양한 후 100㎖의 배지에서 대수기 말기까지 배양한 후 약 5g 정도의 균체에 10㎎의 리소자임(lysozyme)을 포함한 10㎖의 TE 완충액을 넣고 용균이 완전히 될 때까지(2∼3시간) 30℃에서 처리하였다.
용균된 용액에 1㎖의 20% SDS를 넣은 후 서서히 혼합한 다음 1.5㎖의 5M 염화나트륨과 페놀을 첨가하고 20분동안 상온에서 서서히 흔들어 준 다음, 3,500rpm에서 10분 동안 원심분리한 후 상층액을 취하여 동량의 클로로폼(chloroform)을 넣고 10분 동안 서서히 흔들어 준 다음, 상층액을 멸균된 100㎖의 비이커에 옮긴 후 동량의 이소프로판올(isopropanol)을 넣었다.
상온에서 5분 정도 방치한 후 옐로우 팁(yellow tip)으로 두 층사이에 형성된 염색체 DNA를 분리한 다음 분리된 DNA를 소량의 TE에 녹인 다음 리보핵산 분해효소(RNase) 20㎍/㎖을 넣고 50℃에서 1시간 반응시키고 프로테아제 K(protease K) 100㎍/㎖와, 100 mM 염화나트륨과 0.4% SDS를 넣고 37℃에서 1시간동안 반응시켰다.
상기 페놀 처리이후 과정부터 TE로 녹이는 과정까지 반복한 다음, 260㎚의 흡광도로 DNA농도를 정량하였다.
2. 16S rRNA 시퀀싱(sequencing) 분석
상기 제1단계에서 정량되어진 시험균주의 게놈 DNA(genomic DNA)를 중합효소 연쇄반응(PCR: polymerase chain reaction)을 실시하였다.
이 때, PCR은 앞서 분리한 하기 표 1의 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.)의 크로모조말 DNA(chromosomal DNA) 10㎍/㎕를 주형(template)으로 이용하였다.
본 발명 유산균주(CSK 01)의 동정에 공시한 표준 유산균주
표준 유산균주 기탁번호
락토바실러스 파라카제이락토바실러스 파라카제이락토바실러스 파라카제이락토바실러스 파라카제이락토바실러스 파라카제이락토바실러스 파라카제이락토바실러스 파라카제이락토바실러스 파라카제이락토바실러스 람노서스락토바실러스 람노서스락토바실러스 람노서스락토바실러스 람노서스락토바실러스 람노서스락토바실러스 람노서스 ATCC11582ATCC11974ATCC25302ATCC25598ATCC25599ATCC27092ATCC27216ATCC29599ATCC7469ATCC9595ATCC10863ATCC11981ATCC15820ATCC21052
그리고 PCR의 조성은 전체부피 100㎕에 1×reaction buffer, 즉 100mM 트리스-염산(Tris-HCl)(pH 8.3), 500mM 염화칼륨(KCl), 2mM 염화마그네슘(MgCl2), 0.2mM dNTP, 표 2에 나타낸 센스(sense) F9(서열번호 1)와 안티센스 프라이머(antisence primer) 1542R(서열번호 2)을 각각 200pmol, 탁 폴리머라제(Taq polymerase) 2.5 유니트(Unit)를 사용하였다.
본 발명 유산균주의 16S rRNA 시퀀싱 분석에 이용한 프라이머
프라이머 염기서열
16S Y2 5'-CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3'
para 5'-CACCGAGATTCAACATGG-3'
PCR에 대한 반응조건은 95℃에서 5분동안 디네이츄레이션(denaturation) 한 후, 95℃에서 1분간 디네이츄레이션(denaturation)하고, 60℃에서 1분간어닐링(annealing)한 후 72℃에서 2분간 익스텐션(extention)하는 과정으로 30 사이클(cycle)을 수행하였고, 마지막으로 72℃에서 10분간 포스트-익스텐션(post-extention) 한 후 15℃에서 보관하였다.
PCR 산물의 확인은 1% 아가로즈 겔(agarose gel) 전기영동을 이용하였으며 에티디움 브로마이드(ethhidium bromide)로 염색하였다.
예상되는 PCR 산물(1500bp)은 퀴아퀵 겔 익스트렉션 키트(Qiaquick gel extraction kit; Qiagen)를 이용하여 아가로즈 겔(agarose gel)로부터 일루젼(elusion) 한 후 pGEM-T 이지 벡터(Easy Vector)에 클로닝(LA1500/pGEM-T)하였다.
16S rRNA 염기서열 분석은 PCR에 의해 생성된 CSK 01의 16S DNA(position 9-1542)를 사용하였다.
즉 약 1500 염기쌍(base pair)인 PCR 산물을 pGEM-T 이지 벡터(Easy Vector)에 클로닝 한 후 염기서열 분석을 통해 확보하였다.
유전자 염기서열 결정은 얻어진 염기서열을 확인하기 위해 LA1500/pGEM-T는 위자드 플러스 미디프렙스 DNA 퓨리피케이션 시스템(WizardTMplus Midipreps DNA Purification System; Promega)을 이용하여 분리하고, LA1500bp 프래그먼트(fragment)를 (주)바이오넥스에 있는 자동 서열 분석기(automated sequence analyser, ALFexpressTM; Pharmacia Biotech)로 확인하였으며, 그 결과는 도 6(서열번호 3)과 같다.
실시예 8
블라스트(BLAST)를 이용한 염기서열 데이터 분석
유전자 염기서열 결정에 의하여 얻은 블라스트 프로그램(BLAST program; Altschul 등, 1990; http//www.ncbi.nih.gov/BLAST)을 이용하여 이미 알려진 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 몇 몇종 및 다른 속의 대표적인 종들의 16S rRNA 염기서열을 비교 분석하였고 상동성 값을 결정하였다.
계통수는 블라스트 소프트웨어(BLAST software)에서 얻어진 디스턴스(distance) 값으로부터 네이버-조이닝(neighbor-joining) 방법에 의하여 작성하였다.
얻어진 CSK 01의 16S rRNA 시퀀싱(sequencing)은 제7도와 같으며, 이에 기초한 분자 계통 분류학적 방법에 근거하여 본 발명 CSK 01가 락토바실러스 카제이 그룹(Lacobacillus casei group)에 속하며, 특히 99.9%의 상동성으로부터 락토바실러스 파라카제이(D79212)에 가장 높은 유연관계를 보이는 것으로 나타났다.
실시예 9
멀티플렉스(Multiplex) RAPD-PCR을 이용한 분석
약 10 염기쌍(base pair)의 아버트러리 프라이머(Arbitrary primer)를 이용하여 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 간의 타이핑(typing)을 할 수 있는 RAPD-PCR(Random amplifide polymorphic DNA-polymerase chain reaction)을 이용하여 시험균주를 분석하였다.
또한 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei)만을 특이하게 탐색할 수 있는 프라이머(primer)를 제작하여 락토바실러스 파라카제이 8종과 시험균주를 분석 비교하였다.
앞서 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.)의 크로모조말 DNA(chromosomal DNA) 10㎍/㎕를 주형으로 이용하여 RAPD-PCR을 하였다.
PCR의 조성은 전체부피 50㎕에 1×reaction buffer, 즉 100mM 트리스-염산(Tris-HCl; pH 8.3), 500mM 염화칼륨(KCl), 3mM 염화마그네슘(MgCl2), 0.2mM dNTP, 표 3에 나타낸 RP 프라이머(서열번호 4)와 CRA 25 프라이머(서열번호 5)를 각각 10pmol, 탁 폴리머라제(Taq polymerase) 1 유니트(Unit)를 사용하였다.
본 발명 유산균주의 RAPD 분석에 이용한 프라이머
프라이머 염기서열
RAPD RP 5'-CAGCACCCAC-3'
CRA25 5'-AACGCGCAAC-3'
PCR에 대한 반응조건은 94℃ 3분, 45℃ 45초, 72℃ 1분, 1 사이클(cycle); 94℃ 45초, 45℃ 45초, 72℃ 1분, 30 사이클(cycle); 마지막으로 94℃ 45초, 45℃ 45초, 72℃ 5분, 1 사이클(cycle), 72℃에서 8분간 포스트-익스텐션(post-extention)을 한 후 4℃에서 보관하였다.
PCR의 산물의 확인은 1.5% 아가로즈 겔(agarose gel) 전기영동을 이용하였으며, 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 밴드의 양상으로 타이핑(typing)하였다.
워드(Ward; 1999)의 방법에 따라 락토바실러스 파라카제이 및 락토바실러스 람노서스 등의 16S rRNA의 염기서열 중 이들 종만을 특이하게 검출할 수 있는 락토바실러스 파라카제이-그룹-스패시픽 프라이머(L. paracasei-group-specific primer)를 제조하여 PCR을 수행하였다.
락토바실러스 파라카제이만이 가지고 있는 유일한 염기서열을 시발체(para)로 하여 PCR을 실시한 결과, 도 8에 도시된 바와 같이(Lane 1, 17; 100bp DNA ladder, Lane 2; 시험균주, Lane 3-10; 락토바실러스 파라카제이, Lane 11-16; 락토바실러스 람노서스) 시험균주와 표준균주 락토바실러스 파라카제이에서 약 300bp의 밴드가 동일하게 확인되어 CSK 01은 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이(L. paracasei subsp. paracasei)종 임이 입증되었다.
이상과 같이 상기 실시예 3∼9의 본 발명 CSK 01의 생화학적 성상, 16S rRNA 시퀀싱(sequencing), PCR 반응 동정 분석 등의 실험 결과 본 발명 CSK 01은 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei)로 입증되었다.
실시예 10
CSK 01 DNA와 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이(JCM 8130) DNA 염기서열 비교
CSK 01 DNA와 JCM 8130 DNA 염기서열 비교 분석 결과 도 9에 도시된 바와 같이 CSK 01 염기서열(JCM 8130 염기서열) 861→G(T), 1451→A(G)에서 상이하였다.
실시예 11
RP 프라이머(primer) 이용 CSK 01과 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) RAPD-PCR 반응
시험균주와 대조군 균주를 RP 프라이머(primer)를 이용하여 RAPD-PCR을 실시한 결과 도 10에 도시된 바와 같이(Lane 1, 17; 100bp DNA ladder, Lane 2; 시험균주, Lane 3-10; 락토바실러스 파라카제이, Lane 11-16; 락토바실러스 람노서스) 워드(Ward; 1999)의 결과와 일치하는 대략 850bp의 밴드를 표준 락토바실러스 파라카제이와 시험균주에서 확인되어 같은 균종임이 입증되었으나 850 bp 이외 시험균주에서 나타난 밴드와 표준균주 밴드의 양상이 서로 달라 CSK 01의 특이성이 인정되었다.
실시예 12
CRA25 프라이머(primer) 이용 CSK 01과 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) RAPD-PCR 반응
시험균주와 표준균주를 각각 CRA 25 프라이머(primer)를 이용 RAPD-PCR을 실시한 결과 제11도에 도시된 바와 같이(Lane 1, 17; 100bp DNA ladder, Lane 2; 시험균주, Lane 3-10; 락토바실러스 파라카제이, Lane 11-16; 락토바실러스 람노서스) 시험균주에서 나타난 약 980bp, 550bp 밴드는 표준균주 락토바실러스 파라카제이에서 나타나지 않아 CSK 01의 고유성이 인정되었다.
이상과 같이 상기 실시예 10∼12에서 본 발명 CSK 01의 16S rRNA 시퀀싱(sequencing), RP 및 CRA 25 프라이머(primer) 이용 PCR 반응 분석에서 기존 균주와 일치되지 않는 유전자 분획을 가지는 CSK 01의 특이성이 입증되었다.
실시예 13
CSK 01의 마우스(Balb/c)에 대한 안전성
국립수의과학 검역원에서 무균적으로 사육하고 있는 2주령 Balb/C 마우스에 CSK 01의 10% 스킴 밀크(skim milk) 배양액(5×109cfu/㎖)을 적정 급여액인 0.3㎖와 그 2배인 0.6㎖를 구강을 통하여 1일 1회 10일간 투여 후 2개월간 안전성을 조사하였다.
배양액 0.3㎖, 0.6㎖를 급여한 시험군 모두 생존하였고, 육안적 관찰에서 정상으로 나타났다.
또한 부검결과 시험군의 실질장기(간장, 심장, 폐, 신장 등)와 소화기관(위, 소장, 대장)은 대조군과 차이가 없었고, 조사 장기 모두 정상이었다.
급여군의 위, 소장, 대장 점액을 MRS 한천배지(agar)에 도말 후 37℃에서 48시간 배양한 결과 하기 표 4에 도시된 바와 같이 무수한 유산균이 분리되었고 반면에 대조군에서는 분리되지 않았다.
본 발명 유산균주의 안전성
구분 급여량(㎖) 균수 공시수 급여기간 결 과
안전성 조사기관 폐사수 부검 소견 균회수
급여군 0.30.6 5×109cfu/g 20 10일 10일 급여 후2개월간 - *실질장기정상-간장, 신장,폐장, 심장*소화기관정상-위,소장,대장 *위,소장,대장모두 무수한유산균 분리
대조군 - - 10 - - - *실질장기정상-간장, 신장,폐장, 심장*소화기관정상-위,소장,대장 -
실시예 14
CSK 01의 내산성
10% 스킴 밀크(skim milk) 100㎖(pH 6.2)에 10N 염산을 첨가하여 각각 pH 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0로 조절한 배지에 CSK 01 배양액 1㎖(5×109cfu/㎖)을 접종한 다음, 4일간 배양하여 2일째와 4일째 배양액의 pH와 균수를 조사하여 하기 표 5에 나타내었다.
pH 1.0 배지의 경우 2일 배양에서 pH 1.0∼0.84로 변화되었고, 균은 분리되지 않았다.
pH 1.5 배지는 2일 배양에서 pH 1.5∼2.0으로 균수는 101cfu/㎖ 이하로 분리되었다.
pH 2.0 배지는 2일 배양에서 pH는 2.2∼2.5였고, 분리된 균수는 104∼5cfu/㎖였으며, pH 2.5인 경우 2일 배양에서 pH는 2.7∼3.0, 균수는 105∼6cfu/㎖이었다.
pH 3.0은 2일 배양한 후 pH 3.4∼3.6이었고 균수는 106∼7cfu/㎖로 분리되었다.
pH 3.5는 2일 배양했을 때 pH는 3.6∼3.7이었고 분리된 균수는 107∼8cfu/㎖이었다.
pH 4.0인 경우 pH는 4.5∼5.0, 균수는 ㎖당 108cfu이상이었다.
pH 별로 4일 배양했을 경우 pH와 분리된 균수는 2일 배양한 것과 거의 비슷한 수준으로 나타났다.
본 발명 CSK 01의 내산성
pH(10% 스킴 밀크 100㎖의 pH) 시료수 결 과
2일 배양 4일 배양
pH 변화 분리균수(cfu/㎖) pH 변화 분리균수(cfu/㎖)
1.0 5 0.84∼1.0 - 0.8∼0.9 -
1.5 5 1.5∼2.0 10∼50 1.3∼1.6 10∼30
2.0 5 2.2∼2.5 104∼5 2.2∼2.6 104∼5
2.5 5 2.7∼3.0 105∼6 2.7∼3.1 105∼6
3.0 5 3.4∼3.6 106∼7 3.5∼3.6 106∼7
3.5 5 3.6∼3.7 107∼8 3.6∼4.0 107∼8
4.0 5 4.5∼5.0 108이상 4.6∼5.0 108이상
대조(6.0) 5 5.8∼5.9 7×109 5.7∼5.9 7×109
실시예 15
CSK 01의 내담즙성
CSK 01의 내담즙성 시험은 10% 스킴 밀크(skim milk) 100㎖에 돼지 담즙(sig B8631, porcine)을 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5%의 농도로 조절한 후 CSK 01 배양액 1㎖(5×109cfu/㎖)을 접종한 다음 2일 및 4일 배양별로 MRS 한천배지(agar)상에 각각 4℃에 보관중인 MRS 배지(broth)로 배양액을 10×계단 희석한 후 희석액 1㎖ 도말하여 균수를 측정하였다.
균수는 1.0, 1.5, 2.0, 2.5% 담즙을 첨가한 배양액의 경우 ㎖당 107∼9cfu수준이었으며, 3.0, 3.5%는 ㎖당 105∼6cfu였고, 4.0, 4.5%인 경우 ㎖당 102~3cfu이하로 감소되어 내담즙성이 확인되었다.
담즙첨가 비율별로 4일 배양한 경우 하기 표 6에 도시된 바와 같이 2일 배양한 것과 균수가 거의 비슷하게 나타났다.
본 발명 유산균주의 내담즙성
담즙 첨가(%) 시료수 분리균수(cfu/㎖)
2일 배양 4일 배양
1.0 5 109이상 109이상
1.5 5 109이상 109이상
2.0 5 108수준 및 이상 107수준 및 이상
2.5 5 107수준 및 이상 106수준 및 이상
3.0 5 106수준 및 이상 105수준 및 이상
3.5 5 105수준 및 이상 104수준 및 이상
4.0 5 103수준 및 이상 103수준 및 이하
4.5 5 102수준 및 이하 102수준 및 이하
대조 5 5×109이상 5×109이상
실시예 16
CSK 01의 Balb/c 마우스의 위점막 부착 및 증식성
국립수의과학 검역원에서 무균적으로 사육하고 있는 2주령의 Balb/c 마우스 20수에 CSK 01의 48시간 배양액(7×109cfu/㎖) 0.3㎖을 10일간 1일 1회 구강으로 투여하였다.
급여 후 2개월이 경과 한 다음 위를 절취하여 위점액 1g을 4℃ 보관중인 MRS 배지(broth)에 10×계단희석한 후 희석액 1㎖을 MRS 한천배지(agar)에 도말한 다음 37℃, 48시간 배양에서 나타난 균수는 7×108cfu/g이었다.
또한 전자현미경(SEM)으로 관찰하기 위해서 위 일부를 절개하여 1M PBS(phosphate buffer saline; pH 7.2∼7.4)으로 신속하게 세척하고, 2∼3% 글루타르알데히드(Glutaraldehyde)/0.1M PBS 고정, 2∼3시간동안 4℃에서 보관한 후 동일 세척액으로 세척하고, 1% 오스뮴 테트록시드(osmium tetroxide)/0.1M PBS로후고정(4℃, 2시간)한 다음 에탄올 50, 70, 80, 90%에 각각 5분 그리고 100%에 20분간 탈수하였다.
그 다음에는 치환제 이소아밀 아세테이트(isoamyl acetate)로 치환하여 크리티컬 포인트 드라이어(critical point dryer)로 건조시킨 다음 이온(Ion)에 코팅시켜 전자현미경(Hitach, S-570)으로 관찰한 결과 도 12에 도시된 바와 같이 CSK 01이 위점막에 부착 및 증식하고 있는 것을 확인하였다.
실시예 17
CSK 01의 소장 점막 부착 및 증식성
CSK 01의 소장 점막부착 및 증식성은 위점막에서 전술한 균분리 및 전자현미경 이용법에 준하여 실시하였다.
그 결과 도 13a, 13b에 도시된 바와 같이 소장점액의 CSK 01의 유산균수는 g당 3×106cfu으로 분리되었고, 전자현미경 관찰에서도 소장점막에 부착 및 증식하고 있음을 확인하였다.
이상과 같이 상기 실시예 13∼17에서 본 발명 CSK 01의 Balb/c 의 마우스의 위 및 장점막에 부착·증식 능력을 가진 CSK 01의 내산성, 내담즙성이 규명되었다.
실시예 18
헬리코박터 파일로리(Halicobacter pylori)의 Balb/c 마우스에 대한 감염성
헬리코박터 파일로리는 부산 복음병원 미생물학실에서 환자로부터 분리 보관중인 헬리코박터 파일로리 121을 분양하여 이용하였다.
헬리코박터 파일로리 배양시에는 10% 칼프 세럼(calf serum)을 첨가한 뮐러-힌톤 배지(Mueller-Hinton broth), 혐기성(Gas pack 이용 Jar)에서 4일간 배양한 후, 10% 면양혈액배지에 도말하여 혐기성 상태에서 4일간 배양한 다음 그람음성, 굴곡형 나선형의 특징을 확인하고 4℃에 보관중인 10% 뮐러-힌톤 배지(Mueller-Hinton broth; MHB)와 유리구슬로 하비스트(harvest)하여 Balb/c 마우스 구강을 통하여 ㎖당 2×109cfu균액 0.3㎖을 1일 1회 5일간 투여한 후 3일이 경과한 다음 Balb/c 위를 절취하였다.
위점액 1g을 4℃에 보관중인 MHB로 10×계단 희석한 희석액 1㎖을 10% 배양 혈액배지에 도말한 결과 균수는 g당 7×107cfu수준에서 분리되었다.
그리고 전술한 방법으로 처리된 조직을 전자현미경으로 관찰한 결과 도 14에 도시된 바와 같이 위점막에 무수하게 균이 감염된 것으로 나타났다.
실시예 19
CSK 01의 Balb/c 마우스 감염 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 사멸성
헬리코박터 파일로리(H. pylori) 감염된 Balb/c 마우스에 CSK 01의 균액(5×109cfu/㎖)을 구강을 통하여 1일 1회 0.3㎖을 10일간 투여하였으며, 투여 후2개월이 경과한 다음에 위점막에 헬리코박터 파일로리 균의 존재를 전술한 방법으로 조사한 결과 헬리코박터 파일로리는 분리되지 않았으며, CSK 01을 전술한 방법으로 분리한 결과 1g당 1×109cfu수준이었다.
또한 상기 위점막을 전자현미경으로 관찰한 결과 도 15에 도시된 바와 같이 헬리코박터 파일로리는 관찰되지 않았으며, 급여 유산균만 무수히 위점막에 존재하는 것으로 나타났다.
실시예 20
CSK 01 항균물질의 헬리코박터 파일로리 사멸성
10% 스킴 밀크(skim milk)에 37℃에서 48시간동안 배양한 CSK 01 배양액 100㎖을 소니케이터(sonicator) 용기에 50㎖를 각각 분주한 후 4℃에 유지하면서 30초간 5회 반복 소니케이팅(sonicating; Sonical materrial, Vc×375)한 다음 초원심분리기 10,000G에서 30분간 원심분리한 후 상층액을 회수하였다.
이어서 황산암모늄(ammonium sulfate) 포화용액 80%에 부유하여 4℃에 24시간 방치한 다음에 원심분리한 후 침전액을 회수하여, 4℃ 보관 멸균 종류에 2배 희석한 다음 투석막(PGC 29-0593-37, MWCO. 10K)에 분주하고, 증류수를 이용하여 4℃에서 48시간 투석하였다.
상기에서 제조된 정제액을 다시 황산암모늄 포화용액 40%에 분주하여 4℃, 24시간 방치 후 10,000G로 원심분리한 다음 침전액을 회수하여 같은 방법으로 2배희석하여 4℃에서 48시간 투석한 정제액을 동결건조하였다.
동결 건조한 항균물질은 CSK 01의 10% 스킴 밀크(skim milk) 배양액을 소니케이팅(sonicating) 한 후 10,000G로 원심분리한 상층액에 2배로 희석하였다.
헬리코박터 파일로리 배양균액을 10% 칼프 세럼(calf serum)을 첨가한 뮐러-힌톤 한천배지(Mueller-Hinton agar) 전면에 도말한 후 항균물질을 흡수한 디스크(Disc)를 중앙에 위치시켜 혐기적으로 배양한 다음 억제 범위를 조사한 결과 도 16에 도시된 바와 같이 디스크(Disc) 주위에 완전히 헬리코박터 파일로리 증식이 억제된 것으로 나타났다.
실시예 21
대장균 O157:H7의 Balb/c 마우스 소장 점막 감염성
대장균 O157:H7은 경상대학교 수의학과 미생물학실에서 분양하여 이용하였다.
대장균 O157:H7을 BHI 배지(broth)에 접종한 후 37℃에서 18시간동안 배양한 후 멸균 생리식염수를 한천배지(agar)상에 분주, 유리구슬로 하비스트(harvest)하였으며, 멸균 생리식염수로 10×계단 희석하여 균수(3×109cfu/㎖)를 확인하였다.
균액을 Balb/c 구강을 통하여 0.3㎖씩 1일 1회 5일간 투여한 후 3일이 경과한 다음에 마우스의 소장부위를 절취하였다.
소장점액 1g을 멸균 생리식염수로 10×계단희석한 희석액 1㎖를 7% 배양 혈액배지에 도말한 다음 37℃, 18시간 배양한 결과 1g당 6×105cfu수준에서 균이 분리되었으며, 그람음성, 간상균, 대장균 O157:H7 항혈청 양성반응 등으로 대장균임을 확인하였다.
한편 소장점막 대장균의 생존을 전자현미경으로 확인한 결과 도 17에 도시된 바와 같이 소장점막에 많은 대장균이 부착, 증식하고 있음이 증명되었다.
실시예 22
CSK 01의 Balb/c 감염 대장균 O157:H7 사멸성
대장균 O157:H7에 감염된 Balb/c 마우스에 CSK 01을 1일 1회 10일간 구강을 통해 급여한 후 2개월이 경과한 다음 소장 부위를 절취하여 균을 분리하고 전자현미경으로 대장균 O157:H7 사멸성을 조사하였다.
소장점액 1g을 멸균 생리식염수로 10×계단 희석한 희석액 1㎖을 BHI 한천배지(agar)에 도말, 37℃에서 20시간 배양하여 균 존재 여부를 조사한 결과 대장균은 분리되지 않았으며, 전술한 방법으로 CSK 01 유산균은 1g당 4×105cfu수준으로 분리되었다.
한편 전자현미경으로 상기 소장부위를 관찰한 결과 도 18에 도시된 바와 같이 대장균 O157:H7은 나타나지 않았고 CSK 01 유산균만이 관찰되었다.
실시예 23
CSK 01과 대장균 O157:H7 혼합배양에 의한 대장균 사멸성
CSK 01 MRS 배양액 1㎖(2∼6×108cfu)와 대장균 BHI 배지(broth) 배양액 1㎖(2∼6×108cfu)에 포함된 균수를 상호 비슷한 수준으로 조절한 후, 동시에 멸균 10% 스킴 밀크(skim milk) 용액에 접종하여 37℃에서 5일간 배양하면서 배양 20시간 이후부터 CSK 01과 대장균의 균수를 조사하였다.
CSK 01은 MRS 한천배지(agar)에서, 대장균은 맥콘키 한천배지(MacConkey agar)에서 각각 배양균액 1㎖씩을 취하여 한천배지(agar)상에 도말한 후 균수를 조사하였다.
그 결과 도 19에 도시된 바와 같이 대장균의 균수는 배양 30시간 이후부터 감소하여 40시간에는 거의 사멸되는 경향이었으며, 배양 70시간에서는 완전 사멸되는 것으로 나타났다.
반면에 CSK 01은 배양 70시간 이후에도 균수(4×109cfu/㎖)가 거의 변화가 없었다.
실시예 24
CSK 01 항균물질의 대장균 O157:H7 사멸성
황산암모늄 포화용액으로 침전정제, 동결건조한 항균물질을 전술한 방법으로 희석(300㎎/㎖)하여 디스크(disc)에 20㎕ 흡수하였다.
BHI 배지(broth)에 배양한 대장균 균액을 트립틱 소이 한천배지(Tryptic soyagar)에 도말한 다음 중앙에 항균물질을 흡수한 디스크(disc)를 위치한 후 37℃에서 24시간동안 배양한 결과 도 20에 도시된 바와 같이 디스크(disc) 주위에 대장균의 증식 억제성이 확인되었다.
이상과 같이 상기 실시예 18∼24에서 본 발명 CSK 01의 Balb/c 마우스 위염균 헬리코박터 파일로리(Halicobacter pylori) 및 장염균 E.coli O157:H7에 대하여 사멸성을 가지는 항균능력이 입증되었다.
본 발명은 돼지 위 점막 유래 유산균을 위염과 장염을 동반한 환자에게 복용시킨 후 회복된 사람의 변에서 재분리한 유산균주인 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이 CSK 01(Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CSK 01)주에 관한 것으로서 CSK 01은 위·장 점막 부착성 및 증식성이 우수할 뿐 아니라 내산성과 내담즙성이 우수하여 위점막에 상재할 수 있는 유산균주이며, 건위·정장 효과 및 헬리코박터 파일로리(H. pylori), E. coli 0157:H7 등에 대한 항균성이 높아 각종 분야에 아주 유익하게 활용될 수 있다.
즉, 국제적으로 위·장 점막에 부착성이 강하고, 위염균인 헬리코박터 파일로리(H. pylori)를 사멸시킬 수 있는 유산균의 개발이 미진한 상태에서 본 발명은 다방면의 실용적 활용과 다양한 응용연구의 적용면에서 큰 역할이 기대된다.

Claims (7)

  1. 항균성이 우수한 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이 균주 CSK 01 (Lactobacillus paracasei subsp. paracasei: 기탁번호 : KCTC 907 BP)
  2. 제 1항에 있어서, 항균성은 헬리코박터 파이로리 및 대장균 0157:H7 에 대한 항균성을 포함하는 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이 균주 CSK 01.
  3. 제 1항에 있어서, 상기에 더하여 내산성, 내담즙성이 우수하고, 위 점막, 소장 점막에 부착하여 증식할 수 있는 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이 균주 CSK 01.
  4. (1) 돼지 위 점막 유래의 유산균을 위염 및 소장염을 동반한 환자가 복용한 다음 (2) 완전히 회복된 환자의 변으로부터 다시 유산균을 분리하고 (3) 이로부터 균주를 16S rRNA 서열분석 및 RAPD 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 수행하여 동정하는 과정으로 구성되는 제 1항의 락토바실러스 파라카제이 서브스패시즈 파라카제이 균주의 제조방법.
  5. 삭제
  6. 제 1항의 균주의 유효성분을 함유하는 헬리코박터 파이로리에 의한 위염, 위궤양 그리고 대장균과 기타 장내병원성 세균에 의한 장염을 예방 및 치료하는 기능성 식품.
  7. 제 1항의 균주의 유효성분을 함유하는 헬리코박토 파이로리에 의한 위염, 위궤양 그리고 대장균과 기타 장내 병원성 세균에 의한 장염을 예방 및 치료하는 의약품.
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