JP3764174B2 - 肺用組成物において使用するための亜鉛非含有のインスリン結晶 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、１０μｍ以下の直径を有する亜鉛非含有インスリン結晶、及びそのようなインスリン結晶を含有する肺投与に適した治療用粉末調合物に関する。
発明の背景
糖尿病は、真性糖尿病及び尿崩症のように、尿排泄が過剰なヒトにおける障害に対する一般的な用語である。真性糖尿病は、代謝障害であり、グルコース利用能が多少失われる。全人類の約２％が糖尿病に罹患している。
１９２０年代におけるインスリンの導入から、継続的な進歩が真性糖尿病の治療を改善してきた。極端な血糖レベルを回避するのを助けるために、糖尿病患者は、多くの場合、頻回注射療法を実施しており、それによりインスリンは各食事で管理されている。
インスリンは、通常、ｓ．ｃ．又はｉ．ｍ．注射により投与される。しかしながら、注射に付随する苦痛のために、鼻及び肺等からの代替の投与方法が、広汎に研究されている。インスリンの代替の投与経路の概要は、ダニエルセンら（Danielsenら、インスリン送達の新規経路及び方法、Childhood and Adolescent Diabetes(Ed. Kelnar),Chapman & Hall Medical, London 1994,pp.571-584）を参照されたい。
注射を回避するために、肺経路を介したインスリンの投与は代替方法となり得て、インスリンの注射の必要性がなく、内因性インスリンによく似た吸収プロフィールを提供することが可能である。
背景技術の説明
肺経路を介したインスリン投与は、水性溶液又は粉末製剤の何れかにより達成され得る。詳細な説明を、幾つかの参考文献に見ることができるが、最近の文献の１つはニーベン(Niven, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys,12(2&3):151-231(1995))による。前記概要に扱われている１つの側面は、タンパク調合物の安定性の問題であり、これは水性溶液は粉末の調合物よりも安定性が低いことによる。これまで、全ての粉末調合物は、主として非晶質として記述されてきた。
粘膜を介した吸収を促進するために有用である浸透増強剤の概要は、サヤニら(Sayaniら．Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Sys,13(1&2):85-184(1996))に見られる。
パットンら(Pattonら)の吸入治療システム、ＰＣＴ ＷＯ９５／２４１８３は、インスリン投与量をエアロゾル化する方法を権利請求しており、この方法は、乾燥粉末としてインスリンを提供することと、ガス流にある量の乾燥粉末を分散してエアロゾルを形成することと、後の吸入のためにチャンバー内にエアロゾルを捕捉することとを具備する。
インスリンが適切な吸収増強剤と組み合わされ、且つ適切な粒子サイズの粉末の形態で、より低い気道に導入された場合、ＵＳ特許第５，５０６，２０３号に記載される通り、それは、より低い気道での上皮細胞層を介しての吸収によって、直ちに全身系循環に入ることが分かった。インスリンを酸性のｐＨで溶解し、続いてｐＨ７．４に調整することと、及び真空濃縮、開放乾燥、噴霧乾燥又は凍結乾燥により該溶液を乾燥する前に、タウロコール酸ナトリウムを添加することとを具備する前記特許に記載された製造方法は、ヒトインスリンと吸収増強剤とを含有する粉末になる。該粉末は、主に非晶質であることが偏光顕微鏡下での観察により特徴付けられている。所望する粒子サイズの分布は、ジェットミル等の適切な微粉砕機で微粉砕することにより達成され、該成分は、微粉砕の前又は後に混合されてよい。この特許に記載される方法により得られた粉末の生物学的効果は、実質的に大量の増強剤が存在する場合のみに示される。
プラッツら(Platzら)の吸収治療システム、ＰＣＴ ＷＯ９６／３２１４９は、マンニトール及びクエン酸緩衝液、ｐＨ６．７を含有する溶液から亜鉛インスリンを乾燥したスプレーを記載している。吸気温度(inlet temperature)は、１２０から１２２℃、排気温度(outlet temprature)は８０−８１℃である。得られたインスリン粒子の質量メジアン空力径(mass median aerodynamic diameter; MMAd)は、１．３から１．５μｍであると測定された。
その学位論文(「インスリン結晶」、Munksgaard Publisher,1958,p.54-55)の中で、スクリクトクルール(Schlichtkrull)は、０．０１Ｍの酢酸ナトリウム及び０．７％〜０．１２Ｍの塩化ナトリウム及び０．１％のメチルパラヒドロキシベンゾエートを含有し、且つｐＨ７．０を有する溶液から再結晶した亜鉛を含まないブタインスリンの結晶化を記述している。得られた結晶は、１０−５０μｍの複屈折の見られない斜方晶系十二面体結晶であった。
ジャクソンは、ＵＳ特許第３，７１９，６５５号で、ブタ及びウシの粗インスリンを結晶化により精製する方法を記述している。亜鉛非含有のインスリン結晶は、ｐＨ８．２(範囲７．２−１０)で、０．５Ｍ(範囲０．２Ｍ−１Ｍ)のナトリウム、カリウム、リチウム又はアンモニウム塩の存在する中で結晶化することにより得られる。結晶化は、１Ｎの水酸化アルカリ金属又は１Ｎのアンモニアを０．５Ｎの酢酸中の粗インスリンの溶液に添加して、ｐＨを８．２にすることにより達成され得られる。またその代わりに、結晶化は、不純なインスリンの水性溶液をｐＨ８．２で、ナトリウムイオンが０．４５Ｍの濃度になるまで固体の塩化ナトリウムを添加することにより達成される。その結晶は、１８面体又は１２面体形態、即ち、立方結晶系に属する結晶であるらしい。
ベーカーら(Baker)、リリー(Lilly)、ＥＰ０ ７０９ ３９５ Ａ２(１９９４年１０月３１日出願)は、Ｌｙｓ^B28−Ｐｒｏ^B29ヒトインスリンの亜鉛非含有結晶化方法であり、金属カチオン又はアンモニウムイオンと保存剤とを含有した強力に緩衝された酸溶液のｐＨ値を、水酸化金属またはアンモニアにより、８．５から９．５に調整することを特徴とする方法を記載している。
肺投与用の所望するサイズのインスリン粒子を製造する公知の方法は煩わしいものであり、インスリンダスト(insulin dust)の問題が生じており、且つ設備投資金は多額にかかる。更に、インスリンは、幾つかの変性が生じそうな条件に曝される。従って、ＷＯ９６／３２１４９号は、５０℃から１００℃の範囲の温度で噴霧乾燥し、次に粒子の微粉砕を行ない、所望する粒子サイズを達成することを開示する。
更に、主に非晶質として記載されている公知の肺投与用の粉末調合物は、該乾燥粉末中で結合して凝集する傾向を有している。
発明の説明
定義
ここで使用される「増強剤」の表現は、インスリン、インスリン類似物又はインスリン誘導体の、肺の肺胞に並ぶ上皮細胞層を介した隣接する肺血管系への吸収を増強する、即ち、全身系へ吸収されるインスリン量を、増強剤の不在時の吸収量よりも高くする物質をいう。
本コンテクストでは、「粉末」の表現は、本質的に乾燥した粒子、即ち、水分含有量が約１０重量％以下、好ましくは６重量％、及び最も好ましくは４重量％以下である粒子の収集物をいう。
結晶の直径は、マーチン直径(Martin's diameter)として定義される。それは、無作為の方向で置かれた結晶を２つの等しい投影面積に分割する、接眼レンズの目盛りに対して平行な線の長さとして測定される。
発明の簡単な説明
本発明の目的は、肺送達のために適切なインスリン粉末であって、従来技術において記載された肺用インスリン粒子に比較して、乾燥粉末において結合し凝集する傾向が低減されたインスリン粉末を提供することである。
本発明に従うと、この目的は、直径１０μ以下を有する亜鉛非含有インスリン結晶を提供することにより達成される。
本発明の結晶は、更に、噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥及び開放乾燥により製造された本質的に同様な組成物の粉末よりもより良好な安定性プロフィールを示す。恐らく、これは、記載された他の方法により製造された粉末の非晶質状態によるものであろう。この手段により、２℃から８℃の間で貯蔵されなくてはならない、安定化剤を含有しない注射用ヒトインスリン製剤及び幾つかの非晶質インスリン粉末とは異なって、本発明の結晶を基礎とした粉末調合物は、室温で貯蔵することが可能となる。
更にその上、本発明のインスリン結晶を含有する治療用粉末調合物は、相当する非晶質粉末調合物に比べ、良好な流れ特性を示す。
好ましい態様
本発明の亜鉛非含有インスリン結晶は、これらの結晶形態が、優秀な流れ特性を有する溶解の容易な製品を生じることから、立方結晶系に属する結晶構造、好ましくは１８面体又は１２面体結晶形態で都合よく提供される。
該インスリン結晶の直径は、０．２から５μｍの範囲、好ましくは０．２から２μｍの範囲、より好ましくは０．５から１μｍの範囲で都合よく維持され、高い生物学的利用能及び適切な活性プロフィールが保証される。ＰＣＴ出願ＷＯ９５／２４１８３号及びＰＣＴ出願ＷＯ９６／３２１１４９を参照されたい。
好ましい態様において、使用されるインスリンは、ヒトインスリン、ウシインスリン又はブタインスリンからなる群より選択され、好ましくはヒトインスリンである。
もう１つの好ましい態様において、使用されるインスリンは、速効活性インスリン（rapid-acting insulin）、好ましくはｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、Ａｓｐ^B28ヒトインスリン又はＬｙｓ^B28Ｐｒｏ^B29ヒトインスリンからなる群より選択される。
もう１つの好ましい態様において、使用されるインスリンは、インスリン誘導体、好ましくはＢ２９-Ｎ^ε−ミリストイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎ^ε−パルミトイル−ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎ^ε−ミリストイルヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎ^ε−パルミトイルヒトインスリン、Ｂ２８−Ｎ^ε−ミリストイルＬｙｓ^B28Ｐｒｏ^B28ヒトインスリン、Ｂ２８−Ｎ^ε−パルミトイルＬｙｓ^B28Ｐｒｏ^B28ヒトインスリン、Ｂ３０−Ｎ^ε−ミリストイル−Ｔｈｙ^B29Ｌｙｓ^B30ヒトインスリン、Ｂ３０−Ｎ^ε−パルミトイル−Ｔｈｒ^B29Ｌｙｓ^B30ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎ^ε−（Ｎ−パルミトイル−γ−グルタミル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）−ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎ^ε−（Ｎ−リトコール−γ−グルタミル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、Ｂ２９−Ｎ^ε−（ω−カルボキシヘプタデカノイル）−ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリン、及びＢ２９−Ｎ^ε−（ω−カルボキシヘプタデカノイル）ヒトインスリンからなる群より選択され、より好ましくはＬｙｓ^B29（Ｎ−εアシル化）ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリンである。
インスリン誘導体は活性の開始が延長されており、従って、一般的に肺送達に関連して、血漿インスリンを非常に迅速に増加するように補償し得る。インスリンの型を慎重に選択することにより、本発明は、タイミングの調整、及び限定した時間の範囲内で所望する生物学的反応を得ることが可能である。
肺の刺激を避け、免疫学的反応を排除するために、使用するインスリンは、好ましくはクロマトグラフィーにより精製されたインスリン、例えば、ＭＣインスリン（ノボ）、シングルピークインスリン（Ｅ．リリー）及びＲＩインスリン（ノルディスク）等である。
好ましい態様において、本発明の亜鉛非含有インスリン結晶は、更に、フェノール化合物、好ましくはｍ−クレゾール若しくはフェノール、又はこれらの化合物の混合物の安定化量を含む。
本発明は、更に、上述した亜鉛非含有結晶を含有する肺投与に適切な治療学的な粉末調合物に関する。
好ましい態様において、この治療学的な粉末調合物は、更に、より低い気道におけるインスリンの吸収を増強する増強剤を含有する。
該増強剤は、都合よくは界面活性剤であり、好ましくは脂肪酸塩、胆汁酸塩又はリン脂質からなる群より選択され、より好ましくは胆汁酸塩である。
好ましい脂肪酸塩は、Ｃ_10-14脂肪酸の塩であり、例えば、カプリン酸ナトリウム、ラウリン酸ナトリウム及びミリスチン酸ナトリウム等である。
リゾホスファチジルコリンは、好ましいリン脂質である。
好ましい胆汁酸塩は、ウルソデオキシコール酸、タウロコール酸、グリココール酸、及びタウロジヒドロフシジン酸の塩である。更に好ましいのは、該増強剤がタウロコール酸塩、好ましくはタウロコール酸ナトリウムである本発明の粉末調合物である。
本発明の粉末調合物における増強剤に対するインスリンのモル分率は、好ましくは９：１から１：９であり、より好ましくは５：１から１：５の間であり、更により好ましくは３：１から１：３の間である。
本発明の粉末調合物は、任意に、肺投与に適するとして一般的に許容される担体又は賦形剤と組み合わせてもよい。担体又は賦形剤を添加する目的は、充填剤、安定化剤又は流れ特性の改善剤としてであってもよい。
適切な担体剤は、１）炭水化物、例えば、単糖類、例えば、フルクトース、ガラクトース、グルコース、ソルボース等；２）二糖類、例えば、ラクトース、トレハロース等；３）多糖類、例えば、ラフィノース、マルトデキストリン、デキストラン類；４）アルジトール、例えば、マンニトール、キシリトール等；５）無機塩、例えば、塩化ナトリウム等；６）有機塩、例えば、クエン酸ナトリウムアスコルビン酸ナトリウム等である。好ましい担体の群は、トレハロース、ラフィノース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、イノシトール、サッカロース、塩化ナトリウム及びクエン酸ナトリウムを含む。
本発明の結晶は、以下の手順に従って都合よく製造される：
ａ）ｐＨ７．０から９．５の間のｐＨ値を有するインスリン溶液を調製すること；
ｂ）前記溶液をアルカリ金属塩又はアンモニウム塩の溶液と混合すること；及び
ｃ）形成された結晶を回収すること。
アルカリ金属の塩及びアンモニウム塩は、好ましくはナトリウム、カリウム、リチウム若しくはアンモニアの塩酸塩又は酢酸塩からなる群より選択され、或いはその混合物であり、より好ましくは酢酸ナトリウムである。
形成された結晶の溶解度を抑えるために、インスリンの溶液及び／又はアルカリ金属の塩若しくはアンモニウム塩の溶液は、好ましくは、混合後に得られる溶液の５から２５％（ｖ／ｖ）に相当する量の水相溶性有機溶媒を含有する。
水相溶性有機溶媒は、好ましくはエタノール、メタノール、アセトン及び２−プロパノールからなる群より選択され、より好ましくはエタノールである。
結晶サイズの非常に均一な分布と、及び同じ結晶学的形態の結晶は、２つの溶液が２時間未満、好ましくは１時間未満、より好ましくは１５分間未満、更により好ましくは５分間未満の期間で混合された場合に得られる。
粉砕、超微粉砕、篩い分け及びその他のダストを生じる工程を用いずに、直接的に、均一なサイズの微小な亜鉛非含有結晶を得る操作による結晶化方法は、吸入用のインスリン粉末の製造における当該技術の現在の状態から大いに優先されるべきである。
混合後のインスリンの濃度は、好ましくは０．５％から１０％の間、より好ましくは０．５％から５％の間、更により好ましく０．５％から２％の間である。
混合後の塩濃度は、好ましくは０．２Ｍｋら２Ｍの間、より好ましくは約１Ｍである。
本発明の方法は、更に、洗浄工程［ここで、得られた結晶は、最終乾燥粉末に含まれるべき補助物質、好ましくは増強剤及び／又は炭水化物を含有し、任意に５−２５％のアルコール、好ましくはエタノール、５−５０ｍＭの保存剤、好ましくはフェノール、及び０．１−２Ｍの塩、例えば酢酸ナトリウム等を含有する溶液で洗浄される］を具備する。
本発明は、更に、以下の例により詳しく説明されるが、これにより限定されるべきであるとは解釈されるものではない。
例１
１Ｍの酢酸ナトリウム中での結晶化
２ｇの高純度ヒトインスリンを水中で２０％（ｖ／ｖ）のエタノールでの１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）の１００ｍｌに溶解する。この溶液に、１００ｍｌの２Ｍ酢酸ナトリウムを攪拌下で添加する。沈澱が直ちに形成する。室温での２日の後に、０．５から１μｍの間の直径を有する小型の結晶が顕微鏡で観察される。この結晶を−１０℃で遠心することにより回収し、氷冷した水中の１０％（ｖ／ｖ）のエタノールの２０ｍｌで１回洗浄し、遠心により単離し、凍結乾燥により乾燥した。得られた結晶を図１に示す。
例２
タウロコール酸ナトリウム塩の存在下での結晶化
１０ｍｇのヒトインスリン及び５ｍｇのタウロコール酸ナトリウム塩を、水中の２０％（ｖ／ｖ）のエタノール中での１０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）の５００μｌに溶解する。この溶液に、５００μｌの２Ｍ酢酸ナトリウムを添加する。１時間後及び２４時間後に、顕微鏡により、同様な外見の結晶、即ち、０．５から１μｍの間の直径を有する均一なサイズの結晶が観察された。この結晶を−１０℃で、水中の１０％（ｖ／ｖ）エタノールの１００μｌで３回洗浄し、真空下で乾燥した。この結晶のＨＰＬＣは、該洗浄により、インスリンの結晶からタウロコール酸ナトリウム塩が除去されたことが示された。
例３
Ｔｗｅｅｎ８０、bis(2-エチルヘキシル)スルホサクシネートナトリウム塩、キトサン、L-α-リゾホスファチジルコリンミリストイル及びポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートの存在下での結晶化
結晶化は、タウロコール酸ナトリウム塩を０．６％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ８０、０．５６％（ｗ／ｖ）bis(2-エチルヘキシル)スルホサクシネートナトリウム塩、０．３２％（ｗ／ｖ）キトサン、０．５２％（ｗ／ｖ）L-α-リゾホスファチジルコリンミリストイル、及び１％（ｗ／ｖ）ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートで各々置き換えたことを除いては、例２に記載した通りに実施した。全５例は、０．５から１μｍの間の直径を有する均一なサイズの結晶を生じた。
例４
１０％（ｖ／ｖ）のエタノール中での結晶化
結晶化は、ｐＨと酢酸ナトリウム濃度の４種類の組み合わせを使用して、１０％（ｖ／ｖ）エタノール中で例１に記載した通りに行なった：
４．１：ｐＨ７．５と１Ｍの酢酸ナトリウム
４．２：ｐＨ７．５と１．５Ｍの酢酸ナトリウム
４．３：ｐＨ９．０と１Ｍの酢酸ナトリウム
４．４：ｐＨ９．０と１．５Ｍの酢酸ナトリウム
４種類全ての組み合わせで、０．５から１μｍの間の直径を有する均一なサイズの結晶が得られた。
例５
１５％（ｖ／ｖ）のエタノール中での結晶化
結晶化は、ｐＨと酢酸ナトリウム濃度の６種類の組み合わせを使用して、１５％（ｖ／ｖ）エタノール中で行なった。
５．１：ｐＨ７．５と１Ｍの酢酸ナトリウム
５．２：ｐＨ７．５と１．５Ｍの酢酸ナトリウム
５．３：ｐＨ７．５と２Ｍの酢酸ナトリウム
５．４：ｐＨ９．０と１Ｍの酢酸ナトリウム
５．５：ｐＨ９．０と１．５Ｍの酢酸ナトリウム
５．６：ｐＨ９．０と２Ｍの酢酸ナトリウム
６種類全ての組み合わせで、０．５から１μｍの間の直径を有する均一なサイズの結晶が得られた。
例６
２０％（ｖ／ｖ）のエタノール中での結晶化
結晶化は、ｐＨと酢酸ナトリウム濃度の４種類の組み合わせを使用して２０％（ｖ／ｖ）エタノール中で行なった。
６．１：ｐＨ７．５と１Ｍの酢酸ナトリウム
６．２：ｐＨ７．５と１．５Ｍの酢酸ナトリウム
６．３：ｐＨ７．５と２Ｍの酢酸ナトリウム
６．４：ｐＨ９・０と１Ｍの酢酸ナトリウム
４種類全ての組み合わせで、０．５から１μｍの間の直径を有する均一なサイズの結晶が得られた。
例７
酢酸ナトリウムの緩慢な添加を用いた、２０％（ｖ／ｖ）のエタノール中での、ｐＨ７．５、８．０、８．５及び９．０での結晶化
結晶化は、２Ｍの酢酸ナトリウムを水中の２０％（ｖ／ｖ）のエタノールに溶解したことを除き、例１に記載の通りの溶液を使用して行なった。インスリン溶液のｐＨは、夫々７．５、８．０、８．５及び９．０に調整した。各添加の間には１０分間おきながら、酢酸ナトリウム溶液を１２アリクウォットで２時間に亘り添加した。４つのｐＨ値の全てにおいて、０．５から１μｍの間の直径を有する均一なサイズの結晶が得られた。
例８
タウロコール酸ナトリウム塩の存在下でのＬｙｓ^B29（ε−ミリストイル）ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリンの結晶化
１０ｍｇのＬｙｓ^B29（ε−ミリストイル）ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリンと、５ｍｇのタウロコール酸ナトリウム塩とを水中の２０％（ｖ／ｖ）エタノール中のｐＨ８．０の１０ｍＭトリス緩衝液の５００μｌに溶解する。この溶液に５００μｌの２Ｍの酢酸ナトリウムを添加する。１時間後及び２４時間後、顕微鏡により同様な外見の結晶、即ち、０．５から１μｍの間の直径を有した均一のサイズの結晶が見られる。該結晶を、−１０℃で水中の１０％（ｖ／ｖ）エタノールの３００μｌにより１回洗浄し、真空で乾燥した。該結晶のＨＰＬＣにより、該洗浄は、Ｌｙｓ^B29（ε−ミリストイル）ｄｅｓ（Ｂ３０）ヒトインスリンの結晶からタウロコール酸ナトリウム塩を除去したことを示された。

Claims (5)

1. 以下の工程を具備する亜鉛非含有インスリン結晶の製造方法；
   ａ）ｐＨ７．０から９．５を有する第一のインスリン溶液を調製することと；
   ｂ）前記第一の溶液を、アルカリ金属の塩又はアンモニウム塩の第二の溶液と混合すること、ここで、前記第一及び第二の溶液の何れかまたは両方が、エタノール、メタノール、アセトン、及び2-プロパノールから成る群より選択される水相溶性有機溶媒を、混合して得られる溶液中の前記有機溶媒の濃度が５から２５％（ｖ／ｖ）となる量で含有し、前記第一及び第二の溶液が、１５分間未満の期間内で混合されることと；及び
   ｃ）形成した結晶を回収すること。
2. 請求項１に記載の方法であって、前記アルカリ金属又はアンモニウムの塩が、ナトリウム、カリウム、リチウム若しくはアンモニアの塩酸塩又は酢酸塩からなる群より選択され、或いはその混合物であり、好ましくは酢酸ナトリウムである方法。
3. 請求項１又は２に記載の方法であって、混合後のインスリンの濃度が、０．５％から１０％の間、好ましくは０．５％から５％の間、より好ましくは０．５％から２％の間の濃度である方法。
4. 請求項１から３の何れか１項に記載の方法であって、混合後の前記塩の濃度が、０．２Ｍから２Ｍの間、好ましくは約１Ｍである方法。
5. 請求項１から４の何れか１項に記載の方法であって、更に、洗浄工程［ここで、得られた結晶は、最終乾燥粉末に含まれるべき補助物質、好ましくは増強剤及び／又は炭水化物を含有し、且つ任意に５−２５％のアルコール、好ましくはエタノール、５−５０ｍＭの保存剤、好ましくはフェノール、及び０．１−２Ｍの塩、例えば酢酸ナトリウム等を含有する溶液で洗浄される］を具備する方法。

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