JP3634358B2 - タンパク質に基づく輸送系 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、タンパク質に基づく輸送系（protein−based delivery system）、特に、ヒトまたは動物の体内の標的部位に対する外来物であってカプシドで包まれた外来物の輸送系に関する。
【０００２】
【従来の技術】
活性が要求される体内の部位に対して外来物（foreign moiety）を標的化することについて増々関心が高まってきている。薬剤、特に、望ましくない副作用をもたらす薬剤を、作用すべき部位へ輸送することは重要である。その他の多くの分子種、例えば、ポリヌクレオチド（アンチセンスまたはリボザイム）、代謝補因子または画像診断剤（imaging agent）等は特有の方法によって部位（多くの場合は、特定の細胞）へ輸送される。
【０００３】
このような系の一例は、次の文献に記載されている：ウー（Wu）ら、J.Biol.Chem.、第263巻、第14621頁〜第14624頁;WO−Ａ−9206180号明細書。これらの文献においては、遺伝子治療に有用な核酸を、標的細胞表面上においてアシアログリコプロテインレセプターによって認識されるガラクトースに結合したポリリシンと複合化させる技術が開示されている。しかしながら、細胞毒性剤の輸送の場合のように、被輸送部がこのような挙動を示すような輸送系を満足に利用できない場合が多い。従って、生物学的に活性な外来物を広範囲にわたって標的化し得る融通性を有する別の輸送系を開発することが要請されている。
【０００４】
係属中の英国特許出願第9114003.8号および同第9201372.1号各明細書には、エピトープ種に対する供与系としてファージMS−２のコートタンパク質を修飾する技術が開示されており、該供与系は、修飾されたコートタンパク質配列を含んでいてもよく、また、システイン残基と随意の別のスペーサーを介してコートタンパク質に結合させてもよい。これらの特許出願は、MS−２とこれと類似のファージのコートタンパク質が、大腸菌のような細菌ホストにおいて、RNAをほとんど含まない中空ファージ粒子としてクローン化されて発現される機能に基礎をおくものである。
【０００５】
ロマニウク（Romaniuk）らは、MS−２コートタンパク質とRNAゲノムとの関係について報告している［バイオケミストリー、第26巻、第1563〜第1568頁（1987年）参照］。RNAを含まないコートタンパク質アセンブリーは大腸菌内においては生産されないが、自然感染におけるカプチドの形成は、RNAゲノム配列中の19塩基のステム−ループ（翻訳オペレーター）とコートタンパク質の相互作用によって誘発されることが明らかにされている。
【０００６】
タルボト（Talbot）らは、19塩基配列とその変異配列を合成し、コートタンパク質による認識と結合について検討している［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第18巻（第12号）、第3521頁〜第3528頁（1990年）参照］。翻訳オペレーターRNAシグナルは、より大きなゲノムRNA内にステム−ループ構造として存在するだけでなく、該19塩基の短フラグメントとして認識されることが判明している。このフラグメントは、組換えコートタンパク質と特異的に結合してその周囲に自己集合することによって、RNAフラグメントの多重コピーを含む組換えカプシドを形成させる機能を有する。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
この発明は、タンパク質に基づく輸送系、特に、ヒト または動物の体内の標的部位に対する外来物であってカ プシドで包まれた外来物の輸送系を提供するためになさ れたものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、ファージMS−２もしくはその同族ファージのコートタンパク質のアミノ酸配列もしくはカプシド形成能を保有するその修飾配列または十分なカプシド形成能を保有する該配列もしくはその修飾配列を有するカプシドを含有し、該カプシドの少なくとも一部が、ファージMS−２もしくはその同族ファージのゲノムに対する外来物を含む輸送係が提供される。
【０００９】
【発明の実施の形態】
外来物は、カプシド形成の翻訳オペレーターとして機能するMS−２もしくはその同族ファージのRNAゲノム配列または翻訳オペレーター機能を保有する該配列の変異配列の一部に結合させるのが適当である。このRNAゲノム配列はフィールス（Fiers）によって初めて明確にされた［ネイチャー、第260巻、第500頁〜第517頁（1976年）参照］。本願の発明者は、翻訳オペレーターとして機能するためには、19−塩基ステム−ループ（レプリカーゼ遺伝子のスタートに対して−15〜＋４の塩基）またはその変異体、特に、シチジンが−５位で置換された変異体が最小限必要であることを究明した［タルボトら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第18巻（第12号）、第3521頁〜第3528頁（1990年）参照］。外来物はオペレーター配列に直接結合してもよく、あるいは、スペーサ−、例えば、一連のウリジン残基（６個が適当である）を介して結合させることによって、外来物がオペレーターの機能を確実に妨げないようにしてもよい。
【００１０】
この発明の好ましい態様によれば、コートタンパク質のアミノ酸配列は、標的部分（targeting moiety）が結合するのに適した部位を提供するように修飾される。本発明には、標的部分が結合し得る部位を有するカプシド、および標的部分が既に結合したカプシドが包含される。
【００１１】
コートタンパク質のアミノ酸配列はファージMS−２から誘導するのが好ましいが、大腸菌の体内で複製される同族のRNA−ファージ、例えば、ファージR17、fr、GA、ＱβおよびSP等から誘導してもよい。ファージMS−２と類似の物理的構造を有するこの種のRNA−ファージは、一部に化学的変異を含むコートタンパク質のアミノ酸残基を有しており、MS−２コートタンパク質が常套の手段によって修飾された変異体である。現在のところ、カプシドの集合には実質上完全なコートタンパク質が必要であると考えられているが、カプシドの形成能を有する限り、欠失および／または挿入があってもよい。このような修飾配列を有するタンパク質も本発明の範囲内に包含される。
【００１２】
MS−２ファージ粒子の三次元構造に関する研究報告が知られている［ヴァレガード（Valegard）ら、ネイチャー、第345巻、第36頁〜第41頁（1990年）］。この研究データから次のことが知られている。まず第一に、コートタンパク質の構造は、他の全ての球状のRNAウイルスサブユニット（これらの構造は現在知られている）に見出されている８本鎖β−バレルモチーフとは無関係である。第二に、コートタンパク質は準等価なサブユニット間の接触挙動を示すが、各々のタンパク質コンフォーマー（protein conformer）の固定を補助する他の手段、例えば、ポリペプチドの伸張アーム等は存在しない。
【００１３】
コートタンパク質の構造は、３つの領域に分けて考察することができる。これらの領域は、一般的な意味でのドメインではなく、独立した折りたたみユニットによって表すことができる。これらの領域は残基１〜20であり、該残基は、大部分の末端部の放射状構造を形成するβ−へアピン構造を構成する。この領域には残基21〜94が接続しており、これらの残基は、準等価なコンフォーマー間の配座の唯一の主要な相違がみられる部位である「FG−ループ」を含む５本のβ−鎖を形成する。これらのβ−鎖には、相互にかみ合ってコートタンパク質のサブユニットのダイマーを固定する２本のα−らせん（残基95〜125）が接続する。ヴァレガードらは、MS−２ウイルスの物理的構造のみに注目しており、該ウイルスの作用機構は解明していない。
【００１４】
同時に係属中の英国特許出願第9114003.8号明細書には、コートタンパク質のＮ−末端が突出したβ−ヘアピン内へシステイン残基を導入する方法が開示されている（この場合、Ｎ−末端が突出したβ−ヘアピンの外側に存在するシステイン残基は除去される）。このようにして導入された残基は、標的部分が結合するのに好ましい部位を提供する。得られたコートタンパク質のこのような修飾は、アミノ酸残基１〜20の領域においておこなわれる。アミノ酸残基の番号付けは、フィールスの文献［ネイチャー、第260巻、第500頁〜第507頁（1976年）］に記載されているMS−２の全コートタンパク質配列に基づくものである。システイン残基は、ヘアピン領域の中央部またはその付近に導入するのが好ましい。システインは、コートタンパク質のグリシン残基13と14の領域へ導入するのが好ましい。β−ヘアピンの外側にある除去されるべきシステイン残基は46と101の位置に存在する。これらの残基の除去は、常套のいずれかの遺伝子工学の技術を用いておこなえばよいが、部位特異的変異誘発法の利用が適当である。
【００１５】
不要なシステイン残基の好ましい除去法においては、MS−２コートタンパク質の２種の変異体（一方はcys46の位置で単独で変異され、他方はcys101の位置で単独で変異される）を、部位特異的変異誘発のため常用されている標準的な技術によって調製し、これに伴うcDNA配列を標準的な発現ベクター内へ導入した後、該ベクターを制限酵素を用いる消化処理に付すことによって、cys46変異部位を有するDNAフラグメントとcys101変異部位を有するDNAフラグメントを別々に調製し、次いでこれらのフラグメントを結合させることによって、二重に変異したコートタンパク質cDNAを得る。得られた二重変異cDNAを標準的な方法を用いる部位特異的変異誘発処理に付すことによって、システイン残基をβ−ヘアピン領域へ導入する。
【００１６】
カプシドで包んだ部分を標的化し得るコートタンパク質の別の修飾法は、同時係属中の英国特許出願第9201372.1号明細書に記載のように、MS−２コートタンパク質の突出したβ−ヘアピン内にペプチド配列を挿入するプロセスを含んでいてもよい。
【００１７】
システイン残基または別の修飾部位は、他のスペーサ−部分を介在させるか、または介在させないで標的部分に結合させることができる。このような標的部分の一例はガラクトース残基である。ガラクトース残基を使用することによって、カプシドと特異的細胞表面のレセプターを相互作用させ、カプシド内の外来物を特異的細胞の方向および／または該細胞内部へ輸送させることができる。標的部分になり得る別の例は、他の細胞表面のレセプターリガンドまたはモノクローナル抗体である。標的部分に対する適当なレセプターはアシアログリコプロテインレセプターおよびメラニン細胞刺激ホルモンに対するレセプターである。
【００１８】
所望により使用する適当なスペーサー部分は、露出したシステインのチオール基と結合する市販のヘテロ二価性架橋剤から選択される。このような架橋剤としては、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシ−スルホスクシンイミドエステル、Ｎ−スクシンイミジル−（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエートおよびＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート等が例示される。架橋剤は標的部分の種類と大きさに応じて選定すればよい。より大きな分子種の場合には、立体障害を最小にするために、より長い架橋部分が必要となる。架橋剤は最初にシステイン残基と架橋してもよく、あるいは最初に標的部分と架橋してもよい。
【００１９】
あるいは、適当なヘテロ二価性化学試薬、例えば、Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（SATA）を用いることによって、チオール基もしくは他の誘導可能な基を野生型のMS−２コートタンパク質の中空カプシド内へ導入してもよい。
【００２０】
カプシド内に保有された外来物は広範囲に変化させることができるものであり、遺伝子、遺伝子フラグメント、リボザイム、アンチセンスメッセージ、またはアンチセンス遺伝子療法もしくは標的細胞の選択的死滅化のために使用される細胞毒性剤や化学療法剤等が例示される。
【００２１】
外来物がカプシド内に保有される態様は所望の放出特性によって左右される。標的部位で放出させるためには、例えば、細胞の局在化およびレセプターを仲介とするエンドサイト−シスによるインターナリビーションをおこなうのに広く利用されている適切な条件を設定することが重要である。
【００２２】
カプシドを得るためには、まず第一に、中空MS−２カプシドを、例えば、同時係属中の英国特許出願第9201372.1号明細書に記載の方法により、大腸菌の体内でコートタンパク質cDNAを有するベクターを発現させることによって調製するのが適当である。MS−２カプシドは野生型のMS−２コートタンパク質であってもよく、あるいは、例えば、同時係属中の英国特許出願第9114003.8号明細書に記載の方法により、システイン部位の導入によって修飾されていてもよい。
【００２３】
次いで、該カプシドは、例えば、酸性のpH条件下（例えば、酢酸を用いて調整する）で分解させた後、より高いpH条件下において（例えば、pH7）、RNA配列と外来物の周囲のコートタンパク質の再形成体内で翻訳オペレーターとして機能するRNA配列に結合した所望の外来物の存在下で再形成させるのが適当である。例えば、尿素の存在下において、別の分解法を用いてもよい。外来物を含むカプシドは、該外来物をカプシド内へランダムに取込むことによって得てもよい。
【００２４】
RNA配列は、完全なMS−2RNAゲノムから生化学的な方法によって得てもよい。あるいは、RNA配列は化学的な合成法、例えば、ウスマン（Usman）らの方法［J.Am.Chem.Soc.、第109巻、第7845頁〜第7854頁（1987年）参照］によって得てもよい。化学的な合成法は、いずれのスペーサーも容易に付加させてこれを輸送されるべき外来物に結合させることができるので好ましい。
【００２５】
MS−２およびその同族ファージを供与系として使用することによっていくつかの利点が得られる。中空コートタンパク質カプシドは大腸菌の体内において、比較的高い収率で容易に発現させることができ、生成物は容易に精製できる［マスチコ（R.A.Mastico）ら、J.Gen.Virol.第74巻、第541頁〜第548頁（1993年）参照；この文献の記載内容は本明細書の一部を成す］。形成されたカプシドは温度、pHおよびイオン強度の変化に対してかなりの安定性を示す。
【００２６】
【実施例】
本発明を実施例によってさらに説明する。
（Ａ）MS−２コートタンパク質カプシドの調製
MS−２のコートタンパク質は、ファージMS−２を増殖させ、RNAを精製させた後、オリゴヌクレオチドプライマーによって誘発された逆転写によって一本鎖cDNAを生成させ、これをオリゴプライマーとクレノウポリメラーゼを用いて二本鎖cDNAに変換させることによって調製した。このcDNAをサブクローン化することによって、コートタンパク質を誘発性タックプロモーターの制御下におく発現ベクターpGLW11を得た［スミス（Smith、M.C.M）、クザプレウスキ（Czaplewski、L.G.）、ノース（North A.K.）、バウムベルク（Baumberg、S.）およびストックレイ（Stockley、P.G）、Mol.Microbiol.、第３巻、第23頁〜第28頁（1989年）参照］。
【００２７】
以下の手順に従って、pGLW11発現ベクターは大腸菌の体内で発現させることによって細胞タンパク質を生成させ、これを精製した後、確認した。
標準的な実験用の大腸菌の菌株を、組換えMS−２コートタンパク質遺伝子を有する発現プラスミドを用いて形質転換させた（アンピシリン耐性）。該形質転換体の高濃度培地内での急速培養は、培養物のO.D.₆₀₀の値が0.4〜0.6になったときに、イソプロピル−β−チオガラクトシド（IPTG）を最終濃度が1mMになるまで添加することによって誘発させた。細胞を一夜増殖させた後、遠心分離によって収集し、これを中性の緩衝液に再懸濁させ、該細胞を音波処理によって溶解させ、次いで、遠心分離によって、発現された組換え生成物を含有する上澄と細胞砕片を分離させた。上澄みを硫酸アンモニウム沈殿法によって分別し、ペレット状の生成物を緩衝液に再懸濁させた後、ショ糖密度勾配法、ゲル濾過クロマトグラフィーまたは免疫親和性クロマトグラフィーを用いることにより、サイズに基づいて精製した（マスチコら、1993年）。カプシド形態で得られた生成物は、氷酢酸を２容積添加することによって分解させた。
【００２８】
（Ｂ）RNAゲノムオリゴヌクレオチドの調製
下記の文献に記載された方法に従い、2'−シリル−保護ホスホラミダイトを出発物質として使用する固相化学合成法によって４種のオリゴヌクレオチドを調製した：ウスマンら、J.Am.Chem.Soc.、第109巻、第7845頁〜第7854頁（1987年）；タルボトら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第18巻（第12号）、第3521頁〜第3528頁（1990年）。
【００２９】
（ａ）−５位にシスチジンが導入されたMS−２のRNAゲノムのヌクレオチド−15〜＋４を有するオリゴヌクレオチド、即ち、翻訳オペレーターを包囲する配列（以下、「MS−2C」で表示する）、
（ｂ）モデル外来物として5'ビオチン残基を有するMS−2C、
（ｃ）上記（ａ）のオリゴヌクレオチドの5'末端に結合した６個のウリジン残基を有するオリゴヌクレオチド（以下、「MS−２＋6U」で表示する）であって、さらに5'ビオチン残基を外来物として含むオリゴヌクレオチド、
（ｄ）HIV−1 Tatタンパク質に対するmRNAの最初の22個のヌクレオチドに対して相補的な、即ち、アンチセンスな22個のデオキシヌクレオチドの3'エクステンションを有する以外は上記（ａ）のヌクレオチドと同様のオリゴヌクレオチド。
【００３０】
上記の（ｂ）と（ｃ）におけるビオチン基は次の様にして導入した：
「DMT ビオチン−C6−PA」［ケンブリッジ・リサーチ・バイオケミカルズ社（チェシャー、英国）の市販品；ジメトキシトリチル−保護ビオチン−C6−スペーサー−ホスホラミデート試薬］500mgを無水アセトニトリル0.6mlに溶解させた。「MS−2C」＋ビオチンおよび「MS−2C＋6U」＋ビオチンの合成は、アプライド・バイオシステムズ社製の391型DNAシンセサイザーを使用し、１マイクロモルのスケールでおこなった。
ビオチンを用いた合成の結果は次の通りである。
【００３１】
【表１】

【００３２】
４種の合成法で得られた固形支持体を清浄なガラス瓶に移した後、HPLC用メタノールにアンモニアを飽和させた溶液を用いて、室温で24時間処理した。上澄みを別のガラス瓶に移した後、窒素ガス流を用いて乾燥させた。
得られたペレットを、THFにフッ化ｔ−ブチルアンモニウムを加えた溶液中に再懸濁させ、該懸濁液を室温で24時間インキュベートした後、等容量の1M酢酸アンモニウム溶液を用いて反応を停止させた。
【００３３】
脱保護反応を停止させた後、ファーマシア（Pharmacia）NAP25カラムを用いて脱塩処理をおこなった。このカラムを0.2X TBE 25mlを用いて平衡化させた後、試料2.0mlをカラムに添加し、フラクション0.5mlを捕集した。全試料が溶離した後、カラムを上記のようにして再び平衡化させ、次いで試料の残りの半分の脱塩処理をおこなった。各々のRNAオリゴヌクレオチドに対しては新たなカラムを使用した。
【００３４】
各々の生成物のサイズは、3'放射能標識およびポリアクリルアミドシークエンシングゲルを用いるクロマトグラフィーを用いて確認した。オートラジオグラフィーには、予期された移動度を有する単一の顕著な放射性種が記録された。
【００３５】
（Ｃ）オリゴヌクレオチド−ビオチンとMS−2C−アンチ −Tatの存在下でのカプシドの再構築
前記の（Ａ）に記載のようにして分解したMS−２カプシドの再構築を、以下の条件において、pHを2.4から7.0に高くすることによっておこなった。いずれの場合も、オビジン−フルオレセイン錯体［ピアス・ユオロプ社（Pierce Europe BV）（オランダ）の市販品］の存在下でおこなった。
ｉ）MS−２コートタンパク質のみ（オリゴヌクレオチド不存在）
ii）MS−２コートタンパク質＋「MS−2C」
iii）MS−２コートタンパク質＋「MS−2C＋6U−ビオチン」
iv）MS−２コートタンパク質＋「MS−2C＋ビオチン」
【００３６】
得られたカプシドをHPLCゲル濾過カラムを用いて分離させ、結果を図１〜図６に示す。図１は、分解と再構築処理に付さなかった野生型のMS−２カプシドを用いて得られたトレースを示し、図２は分子量基準を示す。約19分後に溶離したピークは構築されたMS−２カプシドに対応する。図３〜図６はそれぞれ混合物ｉ）、ii）、iii）およびiv）に対して得られたトレースを示す。ｉ）はわずかのカプシドの形成を示すのみであり、また、ii）は予期されたように、非常に多くのカプシドの形成を示したが、iii）とiv）は、ビオチニル化したオリゴヌクレオチドと錯体を形成するアビジン−フルオレセインの存在下においてカプシド形成能が保有されることを示す。
【００３７】
図３、図４および図５のカプシドのピークに対応するフラクション、即ち、ｉ）、ii）およびiii）並びに次の混合物ｖ）中のフルオレセインに起因する蛍光強度を測定することによって、アビジン−フルオレセイン−ビオチン錯体がカプシド内に存在することが確認された：
【００３８】
ｖ）MS−２コートタンパク質＋「MS−2C＋6U−ビオチン」と「MS−2C（ビオチン不含）との1:1混合物＋アビジン−フルオレセイン錯体
結果を図７に示す。iii）は、カプシドに対応するフラクション中に蛍光が存在することを示すが、非ビオチニル化オリゴヌクレオチドを用いてビオチニル化オリゴヌクレオチドを1:1に希釈したｖ）は強度の低下した蛍光の存在を示した。このことは、アビジン−ビオチン錯体がカプシド内に存在することを示すものである。
【００３９】
MST WTカプシドを、下記の方法によって、「MS−2C−アンチ−Tat」を用いて再構築した。
ａ）再構築
MS2 WT CPを常法によって精製し、遠心分離処理（35k rpm、４℃、６時間）によって10mg/mlまで濃縮した。MS2（10mg/ml）0.4mlを氷酢酸0.8mlに添加し、氷上で30分間保持した。沈殿物を遠心分離（6500rpm、４℃、20分間）によって除去し、上澄みを、1mM酢酸で平衡化したNAP−25カラムを通した。タンパク質とオリゴヌクレオチドを10×TMK緩衝液（100mM Tris、80mM KClおよび10mM MgCl₂）と混合し、氷上で１時間保持した。MS2 CPをMS−2C−アンチ−Tat溶液に分子比180:1〜2:1で添加し、混合物を37℃で１時間インキュベートした後、室温で６時間インキュベートした。再構築したカプシドは４℃で２週間安定であった。
【００４０】
ｂ）再構築したカプシドの分析
再構築した粒子が試験オリゴヌクレオチドをカプシドで包んでいることを確認するために、前述のようにして、HPLCゲル濾過クロマトグラフィーによってカプシドを他の成分から分離した。カプシドに対応するピークをフェノールを用いて抽出し、核酸をエタノールを用いて沈殿させ、沈殿物を³²Pで放射能標識した後、変性ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動処理に付した。この結果、出発物と同じ移動度を有する核酸フラグメントがHPLCカラムから回収され、このことはカプシドによる包囲を示すものである。最後に、前記のようにして、透過型電子顕微鏡を用いて再構築粒子を調べたところ、導入したコートタンパク質のバルクは、野生型ファージと類似のサイズと対称性を有するカプシドに再構築されたことが判明した。
【００４１】
（Ｄ）真核細胞トランスフェクション
ヒトのヒーラー細胞を、ウシ胎児血清を10％補充したダルベッコ変性イーグル培地中で増殖させた。トランスフェクションの24時間前に、該細胞をフラスコ75cm²あたり１×10⁶細胞の割合で塗布した。培地はトランスフェクションの30分前に交換した。
【００４２】
細胞のトランスフェクションは、リン酸カルシウム−DNA共沈物（２）0.5ml中にLTR Cat5μｇとpSVTat（１）５μｇを加えた試料を用いておこなった。16時間後、細胞をPBSを用いて洗浄した後、新鮮な培地を添加した。細胞は24時間インキュベートした後、収集した。TatによるLTRCatの転写促進は、TatmRNAの最初の22個の塩基に対して特異的なアンチセンスのオリゴを用いておこなった。該オリゴをMS2 RNAステムループ（−15〜＋４）の3'端に付着させることによって、オリゴを包囲するカプシドの再構築をおこなった。
（5'−ACA−UGA−GGA−UUA−CCC−AUG−Ｕ−−TAC−CTC−GGT−CAT−CTA−GGA−TTG−3'）
【００４３】
（Ｅ）システインもしくはチオールで修飾されたコート タンパク質カプシド
システインで修飾したMS−２コートタンパク質を以下の様にして調製した。
部位特異的変異誘発と標準的な技法を用いて、コートタンパク質の46と101の位置においてアミノ酸変異体を形成させた。
セリンによって置換された46位にシステインを有するか、またはセリンによって変換された101位にシステインを有する変異体を選択した。
各々の単一変異体DNAを大腸菌の体内において発現させることによって自己構築能を確認した。
【００４４】
前記の工程（Ａ）によるser46単一変異体を標準的なコートタンパク質発現ベクターｐtacACP内へ導入し、Sa c IとXba I制限酵素を用いて消化させ、得られた長骨格フラグメントを子ウシの腸ホスファターゼを用いて処理し、次いで、アガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲルを用いて精製した後、電気溶離と沈殿処理に付した。
ser101変異体を、ホスファターゼ処理を省略する以外は前記と同様にして処理した。コートタンパク質遺伝子のＣ−末端部分を有する比較的小さなフラグメントをゲル電気泳動法によって精製した。
【００４５】
変異されたcys46部位を有する大きなフラグメントおよび変異された101部位を有する小さなフラグメントを標準的な方法によって結合させた。得られた組換え分子を使用して、大腸菌TG1をアンピシリン耐性に形質転換させ、二重変異をDNAシークエンシングによってチェックした。
【００４６】
上記の工程（Ｂ）からの二重変異体ser46/101コートタンパク質cDNAを、標準的なサブクローニング法によってM13シークエンシングベクター内へ導入し、部位特異的変異誘発用の１本鎖鋳型を形成させた後、ヌクレオチドホスホチオエートに基づく市販の部位特異的変異誘発用プロトコールに従って、システイン残基をgly14に導入した。このようにして、変異されたcys14ser46/101コートタンパク質cDNAを得た。
【００４７】
単離された変異cDNAを大腸菌の体内で発現させることによって、組換えタンパク質のカプシド形成能を確認した。標準的な方法に従って、前記（Ｃ）によるcys14ser46/101コートタンパク質cDNAを発現ベクターpTAC−CP内へ導入し、得られたプラスミドを用いて大腸菌の菌株TG1を形質転換させた。次いで、cys14ser46/101コートタンパク質を以下のプロトコールに従って調製した。
【００４８】
形質転換プレートから採取した単一コロニーの培養物（培地：アンピシリンを100μg/ml含有する2TY培地）５×5mlを37℃で約４時間増殖させた後、アンピシリン含有2TY培地を含むフラスコ（５×500ml）内に接種し、該培養物を30℃で増殖させた。培養物のOD₆₀₀が約0.45になったとき、IPTG 1mM添加することによってタンパク質の生産を誘導させた。細胞を一夜増殖させた後、ベックマンJA14ローターを用いる遠心分離処理に付した（3krpm、30分間、４℃）。
【００４９】
得られたペレットを、Hepes 50mM、NaCl 100mM、ジチオトレイトール（DTT）10mM、EDTA5mMおよびフェニルメチルスルホニルフルオライド（PMSF）1mM含有する溶液中に再懸濁させた後、細胞を音波処理によって溶解させた。細胞の溶解物をベックマンJA20ローターを用いる遠心分離処理に付し（15k、20分間、４℃）、上澄みをNAP−25カラム（ファーマシア）を通過させた後、緩衝液をpH7.0の20mM NAPi（リン酸ナトリウムを主成分とする緩衝液）にと交換した。NAPカラムからのフラクションを1ml捕集し、MS−２コートタンパク質含有フラクション（フラクション２〜５を含む）をアンチ−MS−２コートタンパク質免疫親和性カラムに加え、穏やかな攪拌下において、試料を室温で１時間結合させた。
【００５０】
カラムを20mM NaPi（pH7）で洗浄した後、さらに、10mM NaPi/100mM NaCl（pH7）を用いて洗浄した。20mM酢酸/200mM NaCl（pH約2.7）20mlを用いて試料を溶離させ、最初の4mlを捕集した。
1M Tris・HCl（pH9）を用いる滴定によって、pHを直ちに７〜7.4に調整し、混合物をベックマンSW,55Tiローターを用いる延伸分離処理に付した［30k rpm、一夜（約15時間）、４℃］。上澄みをデカントした後、MS−２タンパク質ペレットを少量の所望の緩衝液に再懸濁させた。
【００５１】
得られた均一なcys14修飾カプシドを、以下の（Ｆ）に記載の活性ガラクトース試薬に対する反応性試験に供した。
免疫親和性に基づいて精製したcys14修飾カプシドのSDS−PAGEは、予期された分子量を有する実質上単一の成分を示した。この結果を図８に示す。レーン「ａ」はcys14修飾カプシドを示し、レーン「ｂ」および「ｃ」はそれぞれ、免疫親和性によって精製した野生型カプシドおよびショ糖密度勾配法によって精製した野生型カプシドを示し、レーン「ｄ」は分子量基準を示す。
【００５２】
図９は免疫親和性によって精製したcys14修飾カプシドの電子顕微鏡写真である。野生型コートタンパク質によって形成された粒子と類似する粒子の構築が認められる。
【００５３】
以下の方法に従い、SATAのようなヘテロ二価性試薬を用いることによって、構築された野生型カプシド内ヘチオール基を導入することもできる。
Ｎ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオアセテート（SATA;ピアス・イムノテクノロジー社の市販品）をジメチルホルムアミド（DMF）0.5mlに振盪下で完全に溶解させ、アリコート20μｌを４℃で保存した。接合の直前に、精製したMS2 WT CPを、0.05Mリン酸塩緩衝液（PB）（pH7.5）を用いて平衡にしたNAP−25カラムを通した。MS2 CP（1mg/ml）1mlをSATA20μｌと混合し、混合物を室温で１時間放置した（SATA:MS2＝50:1）。この溶液を、調整直後のヒドロキシルアミン−HCl（H₂O 0.5mlに25mg加えた溶液）0.1mlを用いて室温での脱アセチル化処理を２時間おこなった。MS2誘導体は、0.1M PB（pH7.5）で平衡化したNAP−25カラム上での脱塩処理によって試薬と副生成物から分離した。
【００５４】
野生型のMS2コートタンパク質に導入されたSATA基の化学量論量は以下に説明するようなDTNBを用いる修飾または標準的な方法による³H−ヨード酢酸によって決定した。この結果により、CPモノマーあたり約２個の新しいチオールがSATA修飾によって導入されたことが判明した。両方の新たなチオールは、以下に説明するように、活性ガラクトースを用いる処理によって完全に修飾された。
【００５５】
（Ｆ）システインまたはSATA修飾したタンパク質と活性 ガラクトースとの反応
cys14修飾MS−２カプシドの反応性を試験するために、ハロゲン−活性ガラクトースを次のようにして調製した。
水（4ml）とエタノール（6ml）との混合液にｐ−アミノフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドを0.54g（２ミリモル）加えた溶液に、無水ヨード酢酸0.9g（2.5ミリモル）を室温において攪拌下で添加した。２時間後、反応物を濃縮乾燥させ、残渣をエーテルで洗浄した（２×10ml）。エタノールを用いて再結晶させることによって、針状生成物（mp158〜160℃）を0.7g得た（収率80％）。
【００５６】
cys14修飾カプシドと活性ガラクトースとの反応は、遊離の−SH基との反応においてOD₄₁₂に特徴的な吸収を示すエルマン試薬（ジチオニトロベンゾエート、DTNB）を用いて評価した。図10は遊離のシステインとDTNBとの反応に対する対照曲線を示す。この対照曲線は、試料100μｌ、100mM Na₂HPO₄（pH8）（緩衝液１）1mlあたりDTNBを4mg含有する溶液100μｌおよび緩衝液5mlを用いて得たものである。DTNBを添加後、混合物を室温で15分間放置してからOD₄₁₂の値を記録した。
【００５７】
図11は、システイン（4mM）を１〜10mMの活性ガラクトースと混合し、室温で１時間放置した後、アリコート100μｌにつき、上記のようにしてDTNBを用いて評価することによって得られた曲線を示す。
【００５８】
cys14修飾コートタンパク質を以下の様にしてDTNBと反応させた。
精製したcys14修飾カプチドを、EDTAを1mM含有する緩衝液１に再懸濁させた（最終濃度:400μg/ml）。下記の１）〜３）の実験をおこなった。
１）タンパク質試料100μｌ、5mMは活性ガラクトース100μｌ
２）タンパク質試料100μｌ、緩衝液１ 90μｌ、5mM活性ガラクトース10μｌ
３）タンパク質試料100μｌ、緩衝液１ 100μｌ
【００５９】
各々の試験液は室温で１時間攪拌した後、該試験液に、エタノール1mlあたりDTNBを4mg含有する溶液200μｌを攪拌下で添加した。15分後にOD₄₁₂を記録した。得られた結果を以下の表２に示す。遊離のチオールの数は、ガラクトース試薬との接触時間が長くなるにつれて減少する。このことは、cys14カプシドがガラクトースと共に誘導されたことを示す。同様の結果が、SATAで修飾された野生型カプシドを用いたときにも得られた。
【００６０】
【表２】

【００６１】
（Ｇ）cys14修飾コートタンパク質と免疫原性ペプチド との結合
精製したcys14修飾カプチドを以下に記載のようにしてHA10に結合させた。HA10は、ヒトの病原体インフルエンザウイルスの血球凝集素から誘導されたノナペプチドエピトープを包囲する10−merペプチド配列であって、Ｎ−末端システイン残基エクステンションを有し、その９−mer配列YPYDVPDYAは、ウイルソンらによって、抗原決定基の１つを有することが確認されている［モレキュラー・アンド・セル・バイオロジー、1988年５月、第2159頁〜第2165頁、およびセル、第37巻、第767頁〜第778頁（1984年）参照］。この方法には、ジスルフィド結合を形成させる最初の架橋工程が含まれ、ジスルフィド結合は次いで酸化される。
【００６２】
以下の試薬を使用して４種の試験反応混合物を調製した：
cys14修飾カプシド（「cysブリッジ」）２μｇ（約３μｌ）
1M Tris・HCl（pH8）＋10mM EDTA（「緩衝液２」）１μｌ
HA9ペプチド（「ペプチド」）17μｇ
２−メルカプトエタノール（「βME」）１μｌ
【００６３】
以下の４種の試験混合物を調製した。各々の混合物は水を用いて全量が10μｌになるように調製した。
１）cysブリッジ＋緩衝液２＋βME
２）cysブリッジ＋緩衝液２
３）cysブリッジ＋緩衝液２＋βME＋ペプチド
４）cysブリッジ＋緩衝液２＋ペプチド
【００６４】
試験混合物を室温で１時間インキュベートした後、0.37Mテトラチオン酸ナトリウムと1.6M亜硫酸ナトリウムとの混合物１μｌを添加した。該添加混合物は、モアヘッド（Morehead）らの方法［Biochem.、第23巻、第2500頁（1984年）参照］に従って調製した後、直ちに使用した。得られた混合物を室温で一夜放置した。
【００６５】
これらの混合物はPAGEシェガー（Shaegger）系を用いて分析した後［シェガーら、Anal.Biochem.、第166巻、第368頁〜第379頁（1987年）参照］、転移緩衝液［39mMグリシン、48mM Tris、0.1％（w/v）ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）および20％メタノールを含有する緩衝液］を用いるバイオラット・ウエスタン（Bio−Rat Western）ブロッティング装置を使用することによってニトロセルロース紙上にブロットした（転移時間:1時間/450mA）。
【００６６】
Tween20（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）を含有するリン酸塩で緩衝化した塩類液（PBS）［PBS1リットルあたりTween20を3ml含有する］を用いてブロットを洗浄して平衡化させた。次いで、ブロットを、上記のTween20を含有するPBSにウシ血清アルブミン（BSA）を0.5％（w/v）添加した溶液35mlと共に37℃で１時間インキュベートし、上記のTween20を含有するPBS200mlを用いて６×５分間洗浄した後、上記Tween20を含有するPBSにBSAを0.5％（w/v）添加した溶液35mlおよびマウス抗−HA9モノクローナル抗体［バルコア社（バークレイ、米国）からの入手品］100μｌと共に４℃で一夜インキュベートした。
【００６７】
次いで、上記のTween20含有PBS200mlを用いて洗浄した後（６×５分間）、上記のTween20含有PBSにBSAを0.5％（w/v）添加した溶液35mlおよびヤギ抗マウスIgGセイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）接合体50μｌと共に30分間インキュベートした。上記のTween20を含有するPBS200mlを用いてさらに洗浄し（６×６分間）、ゲルをルミノールウエスタンブロッティング試薬［アメルシャム（Amersham）社製］を用いて励起させて可視化した。
【００６８】
この結果、抗−HA9抗体と交差反応した試料４）に対応するレーンには単一のバンドのみが現れたが、これは予想された結果であり、試料１）〜３）は負の対照である。従ってこれらの方法を使用することによって、線状ペプチドフラグメントをcys14カプシドに結合させることが可能となる。
【００６９】
（Ｈ）cys14修飾コートタンパク質と酵素または標的リ ガンドタンパク質との共有結合架橋
前記（Ｆ）に記載のようにして精製したcys14修飾カプシドを、以下の方法により、マレイミド基を介して酵素セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）に共有結合的に結合させた。
HRP−マレイミド接合体（ピアスユオロプ社、オランダ国）、cys14修飾カプシドおよびβMEを使用して下記の試料混合物を調製した。各々の試料は、100mM NaPi（pH7.2）を用いて全量が100μｌになるように調製した。
【００７０】
１）HRP−マレイミド20μｇ＋βME1μｌ
２）cys14修飾カプシド20μｇ＋βME1μｌ
３）cys14修飾カプシド20μｇ＋HRP−マレイミド20μｇ
試料３）は室温で１時間放置した後、βMEを添加することによって、残存するチオールを失活させた。次いで、試料１）〜３）はPW3000カラム（２×30cm）上でのHPLC濾過クロマトグラフィーによって分画した［100mM NaPi（pH7.2）、流速:0.5ml/分］。
【００７１】
１分後の溶離フラクション0.5mlについて、HRP活性を市販のキット（ピアスユオロプ社製ABTS試薬）を用いて検定した。酵素活性は、溶液の410nmにおける吸光度の増大を観測することによって決定した。この結果、試料３）のcys14構築物のOD₂₈₀ピークに対応するフラクションについては、バックグラウンド準位に対して著しい増大がみられた。
【００７２】
（Ｉ）SATA修飾MS2 WT CPとマレイミド−活性化HRPと の結合
マレイミド−活性化HRP（1mg/ml）をピアスユオロプ社から購入した。SATA修飾MS2 1mlをHRP0.1mgと室温で６時間反応させた後、４℃で保存した。HPLCゲル濾過カラムを通した試料について、HRPの酵素検定および抗−CP抗体を用いるウエスタンブロット法によって接合効率を決定した。カプシドとHRP間の共有結合架橋の形成はいずれの測定法によっても裏付けられた。
【００７３】
（Ｊ）SATA修飾MS2 WT CPとマイレミド活性化トラン スフェリン（TF）との結合
MS2を、前述の方法に従い、SATAを用いて修飾した。TFは次の様にして活性化させた。TF1mgを0.05M PB（pH7.5）0.5mlに溶解させ、一方、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−SMCC）0.5mgをPB 30μｌに溶解させた。２種類の溶液を混合した溶液を、穏やかに振盪させながら、37℃で30分間保持した。沈殿物を４℃での４分間の遠心分離処理（3krpm）によって分離させ、上澄みを、0.05M PB中で平衡化したNAP−25カラムを通した。
【００７４】
節接合体は次の様にして調製した。MS2−SATA（0.75mg/ml）1mlを窒素ガスを吹き込んだマレイミド−活性化TF溶液（0.44mg/ml）1mlに加え、これを室温で６時間放置した後、４℃で保存した。試料の分析は、上述のようにして、HPLCクロマトグラフィーおよび抗−CP抗体と抗−トランスフェリン抗体を用いるウエスタンブロット法によっておこなった。カプシドとトランスフェリン間の共有結合架橋の形成はいずれの分析法によっても裏付けられた。
【００７５】
（Ｋ）MS−２の細胞侵入（cell entry）
前記（Ａ）に記載のようにして調製した野生型の組換えMS−２ RNA−中空カプシドをウサギのポリクロナール抗−MS−２血清と反応させた後、通常は、マウスのマクロファージと共に１時間インキュベートした。該マクロファージは、エンドサイト−シスされる細胞表面レセプターを介して免疫錯体のFc部分に結合することによって作用する。この実験は、エンドサイト−シスによるMS−２粒子の細胞侵入を確認するためにおこなわれた。このマクロファージをブラスチック製ブロック内に包埋させた後、薄い切片を切出し、種々の染色処理に付した。
【００７６】
結果を図12〜図15に示す。図12および図13は染色されたセクションにおいて、300Åの粒子（MS−カプシド）が明瞭に認められる。図14および図15は、抗−MS−２抗体（写真中の黒点の部分）を染色する抗−ウサギペルオキシダーゼを用いて処理した類似のセクションを示す。300Åの凝集体およびそれ以上のサイズを有する凝集体はいずれも強く染色されている。最後のパネルにおいては、リソソーム内での錯体のその後の解離から予想されたように、細胞内の染色部は明瞭に分散している。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例で得られたカプシドをHPLCゲル濾過カラ ムで分離させたときのトレースを示すものであって、分 解と再構築処理に付さなかった野生型のMS−２カプシド の場合を示す。
【図２】実施例で得られたカプシドをHPLCゲル濾過カラ ムで分離させたときのトレースを示すものであって、分 子量基準を示す。
【図３】実施例で得られたカプシドをHPLCゲル濾過カラ ムで分離させたときのトレースを示すものであって、混 合物ｉ）に対して得られた場合を示す。
【図４】実施例で得られたカプシドをHPLCゲル濾過カラ ムで分離させたときのトレースを示すものであって、混 合物ii）に対して得られた場合を示す。
【図５】実施例で得られたカプシドをHPLCゲル濾過カラ ムで分離させたときのトレースを示すものであって、混 合物iii）に対して得られた場合を示す。
【図６】実施例で得られたカプシドをHPLCゲル濾過カラ ムで分離させたときのトレースを示すものであって、混 合物iv）に対して得られた場合を示す。
【図７】混合物ｉ）、ii）、iii）およびｖ）中のフル オレセインに起因する蛍光強度とフラクションナンバー との関係を示すグラフである。
【図８】免疫親和性に基づいて精製したcys14修飾カプ シドのSDS−PAGEを示す。
【図９】免疫親和性に基づいて精製したcys14修飾カプ シドの電子顕微鏡写真である。
【図１０】実施例（Ｆ）におけるシステインの濃度とOD との関係を示すグラフである。
【図１１】実施例（Ｆ）におけるガラストース試薬の濃 度とODとの関係を示すグラフである。
【図１２】実施例（Ｋ）において調製したマクロファー ジ薄片の染色後の電子顕微鏡写真の一例である。
【図１３】実施例（Ｋ）において調製したマクロファー ジ薄片の染色後の電子顕微鏡写真の一例である。
【図１４】実施例（Ｋ）において調製したマクロファー ジ薄片の染色後の電子顕微鏡写真の一例である。
【図１５】実施例（Ｋ）において調製したマクロファー ジ薄片の染色後の電子顕微鏡写真の一例である。

Claims (13)

1. 体内の標的部位へ外来物を輸送するための 輸送系であって、
   （ｉ） バクテリオファージMS−２もしくは同族ファー ジのコートタンパク質から形成されるカプシドを含有 し、
   （ii） 該外来物が、該外来物が結合したRNA配列によ って該カプシド内に結合され、
   （iii） 該RNA配列が該カプシドの形成に対して翻訳オ ペレーターとして機能することができ、
   （iv） 該RNA配列が、ファージMS−２もしくは翻訳オ ペレーター機能を保有するその変異体のRNAゲノムオリ ゴヌクレオチド配列または同族ファージ中のこれと同等 な配列のレプリカーゼ遺伝子のスタートに対して−15〜 ＋４の塩基を少なくとも含有する、該輸送系。
2. 同族ファージがR17、fr、GA、ＱβまたはS Pである請求項１記載の輸送系。
3. 外来物が、ＲNAゲノムオリゴヌクレオチド配列に直接的もくしはスペーサーを介して間接的に結合した請求項１または２記載の輸送系。
4. 変異体が、−５位の塩基がシチジンによって置換された変異体である請求項１から３いずれかに記載の輸送系。
5. コートタンパク質のアミノ酸配列が、標的性部分が結合するのに適した部位を提供するように修飾された請求項１から４いずれかに記載の輸送系。
6. 部位がシステイン残基を含む請求項５記載の輸送系。
7. システイン残基が、コートタンパク質のＮ−末端突出β−ヘアピンに導入された請求項６記載の輸送系。
8. 標的性部分が、コートタンパク質に直接的もしくは間接的に結合した請求項５から７いずれかに記載の輸送系。
9. 標的性部分がガラクトースを含む請求項８記載の輸送系。
10. 外来物が、遺伝子、遺伝子フラグメント、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、細胞毒性剤および化学療法剤から選択される請求項１から９いずかに記載の輸送系。
11. （ｉ）ファージMS−２もしくは同族ファージのコートタンパク質アミノ酸配列の少なくとも十分なカプシド形成性の部分のカプシドまたはその修飾カプシドを分解させ、次いで、（ii）カプシド形成に対して翻訳オペレーターとして機能し得るファージMS−２もしく同族ファージまたは翻訳オペレーター機能を保有する該ファージの変異体のRNAゲノムオリゴヌクレオチド配列の、レプリカーゼ遺伝子のスタートに対して−15〜＋ ４の塩基に直接的もしくは間接的に結合した外来物の存在下で前記カプシドを再構築させることを含む、請求項１から10いずれかに記載の輸送系の調製法。
12. カプシドの分解を、酸性pH条件下でおこなう請求項11記載の方法。
13. カプシドの再構築を、増大させたpH条件下でおこなう請求項11または12記載の方法。

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