JP3529736B2 - ヘキサヒドロピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン代謝産物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、化合物２−アミノ
−Ｎ−［２−（３ａ（Ｒ）−ベンジル−２−メチル−３
−オキソ−２，３，３ａ，４，６，７−ヘキサヒドロ−
ピラゾロ−［４，３−ｃ］ピリジン−５−イル）−１−
（Ｒ）−ベンジル−オキシメチル−２−オキソ−エチ
ル］−イソブチルアミドの代謝産物、その医薬組成物、
ならびに減少した成長ホルモンレベルによる疾患の治療
に該代謝産物および該医薬組成物を使用する方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】成長ホルモン（ＧＨ）は下垂体から分泌
され、成長能を有する身体の全組織の成長を刺激する。
さらにＧＨは、身体の代謝過程に以下の基本的影響を及
ぼすことが知られている： （１）実質的に身体の全細胞におけるタンパク合成速度
の上昇； （２）身体の細胞における炭水化物使用速度の低下；な
らびに （３）遊離脂肪酸の移動性の向上およびそのエネルギー
としての使用。

【０００３】成長ホルモン産生の欠乏は、さまざまな医
学的障害を引き起こす。子供の場合、こびと症の原因と
なる。成人の場合、後天性ＧＨ欠乏の結果、除脂肪体重
が大きく減少し、同時に全体脂肪（特に体幹部の体脂
肪）が増加する。骨格筋ならびに心筋の量および筋力が
減少すると、運動能力が著しく低下する。骨密度も低下
する。外因性ＧＨを投与すると、これらの代謝変化の多
くが逆転することが示されてきた。この他の治療上の利
点は、ＬＤＬコレステロールが減少する点、および心理
的健康状態が改善される点などである。

【０００４】増加したＧＨレベルを所望する場合、通
常、外因性ＧＨの提供、またはＧＨの産生もしくは放出
を刺激する薬剤の投与により、問題点を解決してきた。
どちらの場合も、化合物はペプチジルの性質を有するた
め、注射により投与しなければならなかった。初期のＧ
Ｈは、遺体の下垂体抽出物から得ていた。このことは、
結果的に製品を高価なものにし、そして、下垂体源に関
連する疾患（例えばヤコブ−クロイツフェルト病）がＧ
Ｈ受容者に伝染しうるというリスクを伴っていた。最
近、組換え型ＧＨが入手可能になり、疾患が伝染するリ
スクはもはや皆無になった。しかしなお、これは非常に
高価な製品であり、注射または鼻内噴霧による投与を必
要とする。

【０００５】ほとんどのＧＨ欠乏は、ＧＨ放出の欠陥に
より引き起こされ、下垂体でのＧＨ合成の欠陥が主要原
因ではない。したがって、血清ＧＨレベルを正常化する
ための代替法は、そのソマトトロピン生成細胞（somato
trophs）からの放出を刺激することである。ＧＨ分泌の
増加はまた、脳および視床下部のさまざまな神経伝達物
質系を刺激または阻害することにより達成することもで
きる。結果的に、下垂体でのＧＨ分泌を刺激するための
合成ＧＨ放出剤の開発が推し進められており、これは高
価で不便なＧＨ代償療法に比べて優れた点をいくつか有
することができる。もっとも望ましい薬剤は、生理的調
節経路に従って作用することにより拍動性ＧＨ分泌を刺
激し、外因性ＧＨの投与による望ましくない副作用に関
連する過剰なＧＨレベルを、無傷の負のフィードバック
ループにより回避するであろう。

【０００６】ＧＨ分泌の生理学的および薬理学的刺激物
質には、アルギニン、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニ
ルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）、グルカゴン、バソプレシ
ン、およびインスリン誘発性低血糖症、ならびに睡眠お
よび運動などの活動が含まれる。これらは、何らかの形
で視床下部に作用して、おそらくソマトスタチン分泌を
減少させるか、または既知の分泌促進物質である成長ホ
ルモン放出因子（ＧＨＲＦ）もしくは未知の内因性ＧＨ
放出ホルモンの分泌を増加させるか、あるいはこれら３
つすべてを引き起こすことにより、間接的に下垂体から
ＧＨを分泌させる。

【０００７】ＧＨＦに関連する類似のペプチジル化合物
または米国特許第４，４１１，８９０号のペプチドな
ど、外因性ＧＨの放出を刺激する他の化合物が開発され
ている。これらのペプチドは、成長ホルモンに比べ著し
く小さいが、さまざまなタンパク分解酵素に対しなお感
受性を示す。ほとんどのペプチドの場合と同様に、これ
らを経口的に生体内利用できる可能性は低い。他のＧＨ
分泌促進物質は、とりわけ一般譲渡されたＰＣＴ国際出
願公開番号ＷＯ ９４／１３６９６号に開示されており
（その開示を本明細書中に参考として援用する）、式Ａ
に示すある種のＧＨ分泌促進物質に関連している：

【０００８】

【化９】

【０００９】

【発明が解決しようとする課題および課題を解決するた
めの手段】本発明は、式（Ｉ）の化合物の代謝産物

【００１０】

【化１０】 そのラセミ−ジアステレオマー混合物および光学異性
体、そのプロドラッグ、ならびに該代謝産物、ラセミ−
ジアステレオマー混合物、光学異性体、およびプロドラ
ッグの医薬的に受容しうる塩；その医薬組成物；そし
て、該代謝産物および医薬組成物を用いて、減少した成
長ホルモンレベルによる疾患状態を治療する方法を提供
する。

【００１１】本発明は、式（Ｉ）の化合物の代謝産物

【００１２】

【化１１】 そのラセミ−ジアステレオマー混合物および光学異性
体、そのプロドラッグ、ならびに該代謝産物、ラセミ−
ジアステレオマー混合物、光学異性体、およびプロドラ
ッグの医薬的に受容しうる塩、その医薬組成物；そし
て、該代謝産物および医薬組成物を用いて、減少した成
長ホルモンレベルによる疾患を治療する方法を提供す
る。

【００１３】本発明は、構造式（Ｉ）の化合物の代謝産
物を提供し、ここで該代謝産物は、好ましくはそのアセ
チル化誘導体、カルボキシル化誘導体、グルクロニド化
誘導体、およびヒドロキシル化誘導体を含む。

【００１４】好ましいアセチル化代謝産物誘導体は、化
合物：

【００１５】

【化１２】 そのラセミ−ジアステレオマー混合物および光学異性
体、そのプロドラッグ、ならびに該代謝産物、ラセミ−
ジアステレオマー混合物、光学異性体、およびプロドラ
ッグの医薬的に受容しうる塩である。ここで、該化合物
は［ＭＨ］⁺＝ｍ／ｚ ５４９を有する。

【００１６】好ましいカルボキシル化代謝産物誘導体
は、

【００１７】

【化１３】

【００１８】

【化１４】 からなる群より選択される化合物［式中、Ｒ¹は水素ま
たはメチルである］；そのラセミ−ジアステレオマー混
合物および光学異性体、そのプロドラッグ、ならびに該
代謝産物、ラセミ−ジアステレオマー混合物、光学異性
体、およびプロドラッグの医薬的に受容しうる塩であ
る。ここで： （ｉ）化合物（Ｉｂ）は［Ｍ＋Ｈ］⁺＝ｍ／ｚ ４６４
を有し； （ｉｉ）化合物（Ｉｃ）のＲ¹が水素である場合、該化
合物は［Ｍ＋Ｈ］⁺＝ｍ／ｚ ４３２を有し；そして （ｉｉｉ）化合物（Ｉｃ）のＲ¹がメチルである場合、
該化合物は［Ｍ＋Ｈ］⁺＝ｍ／ｚ ４４６を有する。

【００１９】好ましいグルクロニド化代謝産物誘導体
は、

【００２０】

【化１５】 からなる群より選択される化合物［式中、Ｒ¹は水素ま
たはメチルである］；そのラセミ−ジアステレオマー混
合物および光学異性体、そのプロドラッグ、ならびに該
代謝産物、ラセミ−ジアステレオマー混合物、光学異性
体、およびプロドラッグの医薬的に受容しうる塩であ
る。ここで： （ｉ）化合物（Ｉｄ）のＲ¹が水素である場合、該化合
物は［Ｍ＋Ｈ］⁺＝ｍ／ｚ５７８を有し；そして（ｉ
ｉ）化合物（Ｉｄ）のＲ¹がメチルである場合、該化合
物は［Ｍ＋Ｈ］⁺＝ｍ／ｚ ５９２を有する。

【００２１】好ましいヒドロキシル化代謝産物誘導体
は、

【００２２】

【化１６】

【００２３】

【化１７】 からなる群より選択される化合物［式中、Ｒ¹は水素ま
たはメチル、Ｒ²はメチルまたはＣＨ₂ＯＨ、およびＲ³
は水素またはメチルである］；そのラセミ−ジアステレ
オマー混合物および光学異性体、そのプロドラッグ、な
らびに該代謝産物、ラセミ−ジアステレオマー混合物、
光学異性体、およびプロドラッグの医薬的に受容しうる
塩である。ここで： （ｉ）化合物（Ｉｅ）のＲ¹が水素で、Ｒ²がメチルであ
る場合、該化合物は［Ｍ＋Ｈ］⁺＝ｍ／ｚ ４０２を有
し； （ｉｉ）化合物（Ｉｅ）のＲ¹およびＲ²がともにメチル
である場合、該化合物は［Ｍ＋Ｈ］⁺＝ｍ／ｚ ４１６
を有し； （ｉｉｉ）化合物（Ｉｅ）のＲ¹がメチルで、Ｒ²がＣＨ
₂ＯＨである場合、該化合物は［Ｍ＋Ｈ］⁺＝ｍ／ｚ ４
３２を有し； （ｉｖ）化合物（Ｉｅ）のＲ¹が水素で、Ｒ²がＣＨ₂Ｏ
Ｈである場合、該化合物は［Ｍ＋Ｈ］⁺＝ｍ／ｚ ４１
８を有し； （ｖ）化合物（Ｉｆ）のＲ³が水素である場合、該化合
物は［ＭＨ］⁺＝ｍ／ｚ５３８を有し； （ｖｉ）化合物（Ｉｆ）のＲ³がメチルである場合、該
化合物は［ＭＨ］⁺＝ｍ／ｚ ５５２を有し； （ｖｉｉ）化合物（Ｉｇ）のＲ¹が水素である場合、該
化合物は［ＭＨ］⁺＝ｍ／ｚ ５０８を有し； （ｖｉｉｉ）化合物（Ｉｇ）のＲ¹がメチルである場
合、該化合物は［ＭＨ］⁺＝ｍ／ｚ ５２２を有し；そ
して （ｉｘ）化合物（Ｉｈ）は［Ｍ＋Ｈ］⁺＝ｍ／ｚ ５２
２を有する。

【００２４】本発明の他の実施形態では、式（Ｉ）の化
合物の代謝産物は、実質的に純粋な状態または形状で存
在する。本発明はさらに： （ｉ）ヒトまたは他の動物の内因性成長ホルモンレベル
を増加させる方法であって、そのようなヒトまたは動物
に、有効量の式（Ｉ）の化合物の代謝産物、そのラセミ
−ジアステレオマー混合物もしくは光学異性体、そのプ
ロドラッグ、または前記代謝産物、ラセミ−ジアステレ
オマー混合物、光学異性体、もしくはプロドラッグの医
薬的に受容しうる塩を投与することを含む、前記方法； （ｉｉ）有効量の式（Ｉ）の化合物の代謝産物、そのラ
セミ−ジアステレオマー混合物もしくは光学異性体、そ
のプロドラッグ、または前記代謝産物、ラセミ−ジアス
テレオマー混合物、光学異性体、もしくはプロドラッグ
の医薬的に受容しうる塩を、動物に投与することを含
む、動物の骨粗しょう症を治療または予防する方法； （ｉｉｉ）成長ホルモンによって治療または予防するこ
とができる動物の疾患もしくは状態、好ましくはうっ血
性心不全、老化による脆弱、年齢に伴う行動体力の低
下、または肥満、を治療または予防する方法であって、
内因性成長ホルモンの放出促進に有効な量の式（Ｉ）の
化合物の代謝産物、そのラセミ−ジアステレオマー混合
物もしくは光学異性体、そのプロドラッグ、または前記
代謝産物、ラセミ−ジアステレオマー混合物、光学異性
体、もしくはプロドラッグの医薬的に受容しうる塩を、
動物に投与することを含む、前記方法； （ｉｖ）骨折の修復を促進する方法、手術後のタンパク
異化反応を弱化する方法、慢性疾患による悪液質および
タンパク喪失を減少させる方法、創傷治癒を促進する方
法、または熱傷患者もしくは大手術を受けた患者の回復
を促進する方法であって、そのような治療を必要とする
動物に、内因性成長ホルモンの放出促進に有効な量の式
（Ｉ）の化合物の代謝産物、そのラセミ−ジアステレオ
マー混合物もしくは光学異性体、そのプロドラッグ、ま
たは前記代謝産物、ラセミ−ジアステレオマー混合物、
光学異性体、もしくはプロドラッグの医薬的に受容しう
る塩を投与することを含む、前記方法； （ｖ）動物の筋力、運動性、皮膚の厚みの維持、代謝恒
常性を改善する方法であって、内因性成長ホルモンの放
出促進に有効な量の式（Ｉ）の化合物の代謝産物、その
ラセミ−ジアステレオマー混合物もしくは光学異性体、
そのプロドラッグ、または前記代謝産物、ラセミ−ジア
ステレオマー混合物、光学異性体、もしくはプロドラッ
グの医薬的に受容しうる塩を、動物に投与することを含
む、前記方法； （ｖｉ）動物の骨粗しょう症を治療または予防する方法
であって、ビスホスホネート化合物、好ましくはアレン
ドロネート、および式（Ｉ）の化合物の代謝産物、その
ラセミ−ジアステレオマー混合物もしくは光学異性体、
そのプロドラッグ、または前記代謝産物、ラセミ−ジア
ステレオマー混合物、光学異性体、もしくはプロドラッ
グの医薬的に受容しうる塩を、前記動物に投与すること
を含む、前記方法； （ｖｉｉ）動物の骨粗しょう症を治療または予防する方
法であって、エストロゲンまたはＰｒｅｍａｒｉｎ（登
録商標）と、式（Ｉ）の化合物の代謝産物、そのラセミ
−ジアステレオマー混合物もしくは光学異性体、そのプ
ロドラッグ、または前記代謝産物、ラセミ−ジアステレ
オマー混合物、光学異性体、もしくはプロドラッグの医
薬的に受容しうる塩を組み合わせたもの、および所望に
よりプロゲステロンを、前記動物に投与することを含
む、前記方法； （ｖｉｉｉ）ヒトまたは他の動物の成長ホルモンの内因
性産生または放出の増加に有用な医薬組成物であって、
式（Ｉ）の化合物の代謝産物、そのラセミ−ジアステレ
オマー混合物もしくは光学異性体、そのプロドラッグ、
または前記代謝産物、ラセミ−ジアステレオマー混合
物、光学異性体、もしくはプロドラッグの医薬的に受容
しうる塩、および医薬的に受容しうる担体、賦形剤また
は希釈剤を含む、前記医薬組成物； （ｉｘ）動物の内因性成長ホルモンレベルを増加させる
方法であって、式（Ｉ）の化合物の代謝産物、そのラセ
ミ−ジアステレオマー混合物もしくは光学異性体、その
プロドラッグ、または前記代謝産物、ラセミ−ジアステ
レオマー混合物、光学異性体、もしくはプロドラッグの
医薬的に受容しうる塩を含む有効量の組成物を、該動物
に投与することを含む、前記方法； （ｘ）成長ホルモンによって治療または予防することが
できる動物の疾患もしくは状態、好ましくはうっ血性心
不全、老化による脆弱、年齢に伴う行動体力の低下、ま
たは肥満、を治療または予防する方法であって、そのよ
うな治療を必要とする動物に、成長ホルモンの放出促進
に有効な量の、式（Ｉ）の化合物の代謝産物、そのラセ
ミ−ジアステレオマー混合物もしくは光学異性体、その
プロドラッグ、または前記代謝産物、ラセミ−ジアステ
レオマー混合物、光学異性体、もしくはプロドラッグの
医薬的に受容しうる塩を含む組成物を投与することを含
む、前記方法； （ｘｉ）骨折の修復を促進する方法、手術後のタンパク
異化反応を弱化する方法、慢性疾患による悪液質および
タンパク喪失を減少させる方法、創傷治癒を促進する方
法、または熱傷患者もしくは大手術を受けた患者の回復
を促進する方法であって、そのような治療を必要とする
動物に、成長ホルモンの放出促進に有効な量の、式
（Ｉ）の化合物の代謝産物、そのラセミ−ジアステレオ
マー混合物もしくは光学異性体、そのプロドラッグ、ま
たは前記代謝産物、ラセミ−ジアステレオマー混合物、
光学異性体、もしくはプロドラッグの医薬的に受容しう
る塩を含む組成物を投与することを含む、前記方法； （ｘｉｉ）筋力、運動性、皮膚の厚みの維持、代謝恒常
性の改善を必要とする動物におけるこれらの改善方法で
あって、成長ホルモンの放出促進に有効な量の、式
（Ｉ）の化合物の代謝産物、そのラセミ−ジアステレオ
マー混合物もしくは光学異性体、そのプロドラッグ、ま
たは前記代謝産物、ラセミ−ジアステレオマー混合物、
光学異性体、もしくはプロドラッグの医薬的に受容しう
る塩を含む組成物を、動物に投与することを含む、前記
方法；そして （ｘｉｉｉ）動物の骨粗しょう症を治療または予防する
方法であって、そのような治療を必要とする動物に、成
長ホルモンの放出促進に有効な量の、式（Ｉ）の化合物
の代謝産物、そのラセミ−ジアステレオマー混合物もし
くは光学異性体、そのプロドラッグ、または前記代謝産
物、ラセミ−ジアステレオマー混合物、光学異性体、も
しくはプロドラッグの医薬的に受容しうる塩を含む組成
物、および所望によりプロゲステロンを投与することを
含む、前記方法、を提供する。

【００２５】さらに、本発明の代謝産物は、ヒトを含む
動物種における式（Ｉ）の化合物の代謝挙動を評価する
ための標識または標準物質として有用である。

【００２６】

【発明の実施の形態】一般式（Ｉ）において特記しない
限り、本発明の代謝産物はすべて少なくとも１個の不斉
中心を有する。分子中に存在するさまざまな置換基の性
質によっては、さらに他の不斉中心が存在してもよい。
そのような各不斉中心は、２種の光学異性体を生成す
る。このような光学異性体（純粋な、または部分的に精
製した光学異性体を分離したもの）、そのラセミ混合物
またはジアステレオマー混合物はすべて、本発明の範囲
内に含まれると考える。

【００２７】本明細書および従属請求項を通して用いら
れる“プロドラッグ”という用語は、薬剤の前駆体であ
る化合物をさし、これは投与後に化学的または生理学的
過程（例えば、生理学的ｐＨになっているプロドラッグ
を、所望の薬剤形状に変換する）を経てｉｎ ｖｉｖｏ
で薬剤を放出する、。代表的プロドラッグは、例えば、
対応する遊離カルボン酸を放出する。本発明の代謝産物
のこのような加水分解型エステル形成残基は、遊離水素
原子が（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₁₂）アルカノ
イルメチル、（Ｃ₄−Ｃ₉）−１−（アルカノイロキシ）
エチル、５〜１０個の炭素原子を有する１−メチル−１
−（アルカノイロキシ）−エチル、４〜７個の炭素原子
を有するアルコキシカルボニルオキシメチル、５〜８個
の炭素原子を有する１−メチル−１−（アルコキシカル
ボニルオキシ）エチル、３〜９個の炭素原子を有するＮ
−（アルコキシカルボニル）アミノメチル、４〜１０個
の炭素原子を有する１−（Ｎ−（アルコキシカルボニ
ル）アミノ）エチル、３−フタリジル、４−クロトノラ
クトニル、γ−ブチロラクトン−４−イル、ジ−Ｎ，Ｎ
−（Ｃ₁−Ｃ₂）アルキルアミノ（Ｃ₂−Ｃ₃）アルキル
（β−ジメチルアミノエチルなど）、カルバモイル−
（Ｃ₁−Ｃ₂）アルキル、Ｎ，Ｎ−ジ（Ｃ₁−Ｃ₂）アルキ
ルカルバモイル−（Ｃ₁−Ｃ₂）アルキルおよびピペリジ
ノ−、ピロリジノ−、またはモルホリノ（Ｃ₁−Ｃ₂）ア
ルキルで置換されたカルボン酸代謝産物を含有するが、
これに限定されない。

【００２８】カルボン酸官能基のカルボキシル基をエス
テルとして誘導体化した本発明のプロドラッグは、反応
に対し不活性な溶媒（ＤＭＦなど）中の塩基（炭酸カリ
ウムなど）の存在下、約０℃〜約１００℃の温度で、カ
ルボン酸を適切なハロゲン化アルキルと約１〜約２４時
間混合することにより調製することができる。あるい
は、触媒的量の酸（濃硫酸など）の存在下、約２０℃〜
約１２０℃の温度で、好ましくは還流して、溶媒として
の適切なアルコールと該酸を約１〜約２４時間混合して
もよい。他の方法では、該酸を不活性溶媒（ＴＨＦな
ど）中で反応させ、これと同時に物理的（例えばディー
ン−スタークトラップ（Dean-Stark trap））または化
学的（例えばモレキュラーシーブ）手段により製造した
水を除去する。

【００２９】他の代表的プロドラッグは、代謝産物のヒ
ドロキシル置換基の遊離水素原子が、（Ｃ₁−Ｃ₆）アル
カノイロキシメチル、１−（（Ｃ₁−Ｃ₆）アルカノイロ
キシ）エチル、１−メチル−１−（（Ｃ₁−Ｃ₆）アルカ
ノイロキシ）エチル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシカルボニ
ルオキシメチル、Ｎ−（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシカルボニ
ルアミノメチル、スクシノイル、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルカノ
イル、α−アミノ（Ｃ₁−Ｃ₄）アルカノイル、アリール
アセチル、およびα−アミノアシル、またはα−アミノ
アシル−α−アミノアシル［α−アミノアシル部分は、
独立して、タンパク中にみられる天然に生じるＬ−アミ
ノ酸、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）₂、−Ｐ（Ｏ）（Ｏ（Ｃ₁−Ｃ
₆）アルキル）₂、またはグリコシル（例えば、炭水化物
のヘミアセタールのヒドロキシルの脱離により生じるラ
ジカル）のいずれかである］で置換されているアルコー
ルを放出する。

【００３０】アルコール官能基をエーテルとして誘導体
化した本発明のプロドラッグは、反応に対し不活性な溶
媒（ＤＭＦなど）中の塩基（炭酸カリウムなど）の存在
下、約０℃〜約１００℃の温度で、アルコールを適切な
臭化アルキルまたはヨウ化アルキルと約１〜約２４時間
混合することにより調製することができる。アルカノイ
ルアミノメチルエーテルは、米国特許第４，９９７，９
８４号に記載の方法に従い、反応に対し不活性な溶媒
（ＴＨＦなど）中の触媒的量の酸の存在下、アルコール
をビス−（アルカノイルアミノ）メタンと反応させるこ
とにより得ることができる。あるいは、これらの化合物
は、Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．が記載した方法
［Ｊ． Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍ．， ５９， ３５
３０（１９９４年）］に従い調製してもよい。

【００３１】一般的に、本発明の代謝産物の医薬的に受
容しうる酸付加塩は、例えば、有機酸および無機酸の両
方を用いて誘導される塩を含む。そのような酸の例は、
塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ギ酸、酢酸、トリフルオロ
酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、コハク酸、Ｄ−酒石
酸、Ｌ−酒石酸、マロン酸、メタンスルホン酸などであ
る。さらに、カルボン酸官能基を含有する代謝産物は、
ある種の無機対イオン、例えばナトリウム、カリウム、
リチウム、カルシウム、マグネシウムなどともに、なら
びに有機塩基とともに、塩基付加塩を形成することがで
きる。

【００３２】医薬的に受容しうる塩は、約１当量の代謝
産物をとり、これを約１当量の適切な対応する所望の酸
または塩基と接触させることにより形成してもよい。得
られる塩の後処理および単離は、本開示の観点からみて
当分野の技術者に周知の手段により、達成することがで
きる。

【００３３】式（Ｉ）の化合物の代謝産物、そのラセミ
−ジアステレオマー混合物および光学異性体、そのプロ
ドラッグ、ならびに該代謝産物、ラセミ−ジアステレオ
マー混合物、光学異性体、およびプロドラッグの医薬的
に受容しうる塩は、成長ホルモン分泌が下垂体レベルで
どのように調節されているかを理解するための優れた手
段として、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて有用である。これ
は、成長ホルモン分泌に影響を及ぼすと考えられる、ま
たはそのように知られている多くの因子（年齢、性別、
栄養的因子、グルコース、アミノ酸、脂肪酸ならびに断
食状態および非断食状態など）の評価における使用も含
む。さらに、本発明の代謝産物は、他のホルモンがどの
ように成長ホルモンの放出活性に影響するかを評価する
ために用いることができる。例えば、ソマトスタチンが
成長ホルモンの放出を阻害することは、すでに証明され
ている。

【００３４】式（Ｉ）の化合物の代謝産物、そのラセミ
−ジアステレオマー混合物および光学異性体、そのプロ
ドラッグ、ならびに該代謝産物、ラセミ−ジアステレオ
マー混合物、光学異性体、およびプロドラッグの医薬的
に受容しうる塩を、ｉｎ ｖｉｖｏでヒトを含む動物に
投与すると、成長ホルモンを放出させることができる。
該代謝産物は、成長ホルモン欠乏に関連する症状の治
療、食肉製造用の飼育動物における成長促進または飼料
効率向上による生肉の品質改良、乳牛の乳量増加、骨ま
たは創傷の治癒の改善、および生体器官の機能改善に使
用してもよい。本発明の代謝産物は、内因性成長ホルモ
ン分泌を誘発することにより、体組成を変化させ、成長
ホルモン依存性の他の代謝過程、免疫学的過程または発
育過程を修正する。例えば、本発明の代謝産物は、ニワ
トリ、シチメンチョウ、家畜動物（ヒツジ、ブタ、ウ
マ、ウシなど）、ペット動物（イヌ、ネコなど）に与え
てもよく、または養殖において成長促進およびタンパク
／脂肪比の向上のために用いることができる。さらに該
代謝産物は、下垂体に成長ホルモン放出能があるかを直
接決定するための診断手段として、ｉｎ ｖｉｖｏでヒ
トに投与することができる。例えば、該代謝産物をｉｎ
ｖｉｖｏで子供に投与してもよい。そのような投与の
前後に採取した血清試料を、成長ホルモンについてアッ
セイすることができる。これらの各試料中の成長ホルモ
ン量を比較することは、患者の下垂体の成長ホルモン放
出能力を直接決定するための手段となるであろう。

【００３５】本発明の代謝産物、そのラセミ−ジアステ
レオマー混合物および光学異性体、そのプロドラッグ、
ならびに該代謝産物、ラセミ−ジアステレオマー混合
物、光学異性体、およびプロドラッグの医薬的に受容し
うる塩は、経口、非経口（例えば筋肉内注射、腹腔内注
射、静脈内注射、皮下注射または埋込み）、経鼻、経
膣、経直腸、経舌下または局所の投与経路により投与す
ることができる。これらを、医薬的に受容しうる担体、
賦形剤、または希釈剤とともに製剤して、意図する各投
与経路に適した剤形を提供することができる。

【００３６】経口投与用の固体剤形は、例えば、カプセ
ル、錠剤、丸剤、粉末、および顆粒などであってよい。
そのような固体剤形では、活性化合物を、少なくとも１
種の医薬的に受容しうる不活性担体または希釈剤（スク
ロース、ラクトースまたはデンプンなど）と混合する。
そのような剤形はまた、通常業務と同様に、このような
不活性担体または希釈剤の他に別の物質（例えば、ステ
アリン酸マグネシウムなどの潤滑剤）を含んでいてもよ
い。カプセル、錠剤および丸剤の場合、剤形は緩衝剤を
含んでいてもよい。錠剤および丸剤はさらに、腸溶性コ
ーティングを用いて調製することもできる。

【００３７】経口投与用の液状剤形は、医薬的に受容し
うる乳濁液、溶液、懸濁液およびシロップなどであり、
これらにより形成したエリキシル剤は当分野で一般的に
用いられる不活性希釈剤（水など）を含有する。組成物
は、このような不活性希釈剤の他にアジュバント（湿潤
剤、乳化剤、懸濁化剤、甘味剤、香味剤、および芳香剤
など）を含んでいてもよい。

【００３８】非経口投与用の製剤は、滅菌した水性もし
くは非水性の溶液、懸濁液または乳濁液を含んでいても
よい。非水性溶媒または賦形剤の例は、プロピレングリ
コール、ポリエチレングリコール、植物油（オリーブ油
およびトウモロコシ油など）、ゼラチン、および注射可
能な有機エステル（オレイン酸エチルなど）を含む。こ
のような剤形はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分
散剤などのアジュバントを含んでいてもよい。これらの
製剤は、例えば、細菌を保持するフィルターを通す濾
過、組成物と殺菌剤の混合、組成物へのＸ線照射、また
は組成物の加熱により、滅菌することができる。これら
はまた、使用する直前に無菌水またはいくつかの他の無
菌注射剤に溶解することができる、無菌固体組成物の形
状で製造することもできる。

【００３９】本発明の代謝産物、そのラセミ−ジアステ
レオマー混合物および光学異性体、そのプロドラッグ、
ならびに該代謝産物、ラセミ−ジアステレオマー混合
物、光学異性体、およびプロドラッグの医薬的に受容し
うる塩を、リポソームのカプセルに入れ、これを静脈内
投与することができる。この意図での使用に適したリポ
ソームは脂質小胞を含有していてもよく、多層状脂質小
胞、超音波処理した小さな多重膜リポソーム、逆相蒸発
法リポソーム、大きな多重膜リポソームなどを含む。こ
こで、脂質小胞は、１種または複数のリン脂質（ホスホ
チジルコリン、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエ
リン、ホスホ乳酸など）により形成される。さらに小胞
は、コレステロールなどのステロール成分を含んでいて
もよい。

【００４０】経直腸または経膣投与用の組成物は、好ま
しくは坐剤である。この坐剤は、活性物質の他に賦形剤
（コカ、バター、または坐剤ワックスなど）を含んでい
てもよい。

【００４１】経鼻または経舌下投与用の組成物もまた、
当分野の技術者に周知の標準的賦形剤を用いて調製する
ことができる。所望量の活性成分を有するさまざまな医
薬組成物を調製するための他の方法が、当分野の技術者
には周知であり、あるいは本開示の観点からみて該技術
者に明らかになるであろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏ
ｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎ
ｙ， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡの第１８版（１９９０年）
を参照のこと。

【００４２】該代謝産物、そのラセミ−ジアステレオマ
ー混合物および光学異性体、そのプロドラッグ、ならび
に該代謝産物、ラセミ−ジアステレオマー混合物、光学
異性体、およびプロドラッグの医薬的に受容しうる塩の
投与量はさまざまであってよいが、その量は適切な投与
量を提供するものでなければならない。選択する投与量
は、所望の治療効果、投与経路および治療期間に依存す
る。通常、代表的投与量である約０．０００１〜約１０
０ｍｇ／ｋｇ体重／日を、ヒトおよび他の動物（例えば
ほ乳類）に投与すると、ＧＨ放出に効果を得ることがで
きる。

【００４３】好ましい投与量範囲は約０．０１〜約５．
０ｍｇ／ｋｇ体重／日であり、これを１回投与として、
または分割した複数回投与として投与することができ
る。本発明の方法に従った式（Ｉ）の化合物の代謝産物
に関する投与量は、本開示の利点を有する当分野の技術
者なら適切に選択することができる。通常、該化合物の
最適投与量に満たない低投与量で、治療を開始する。そ
の後、各状態において最適な効果を達成するまで、投与
量を段階的に増加させる。

【００４４】本発明は、別個に投与してもよい活性成分
の組合せを用いた、減少した成長ホルモンレベルによる
疾患状態の治療に関するので、本発明はまた、別個の医
薬組成物をキット形態内で組み合わせることに関する。
本発明に従うキットは、２種の別個の医薬組成物：式
（Ｉ）の化合物の代謝産物、そのラセミ−ジアステレオ
マー混合物もしくは光学異性体、そのプロドラッグ、ま
たは該代謝産物、ラセミ−ジアステレオマー混合物、光
学異性体、もしくはプロドラッグの医薬的に受容しうる
塩、および医薬的に受容しうる担体、賦形剤または希釈
剤を含む、第１の単位剤形；エストロゲン、プロゲステ
ロン、Ｐｒｅｍａｒｉｎ（登録商標）、またはビスホス
ホネート化合物（好ましくはアレンドロネート）、およ
び医薬的に受容しうる担体、賦形剤または希釈剤を含
む、第２の単位剤形；ならびに容器、を含む。容器は、
別個の医薬組成物を入れるために用いられ、例えば分割
されたボトルまたは分割されたフォイルパケット（foil
packet）を含むことができるが、別個の医薬組成物を
分割されていない単独の容器に入れてもよい。一般に、
キットには、別個の成分を投与するための使用説明書も
含まれる。キットの形態は、別個の成分が好ましくは異
なる剤形（例えば経口および非経口）で投与され、異な
る投与量で投与され、または、処方する医師が該組合せ
の各成分の滴定を所望する場合、特に有利である。

【００４５】このようなキットの一例には、いわゆるブ
リスターパックが含まれる。ブリスターパックは、包装
産業において周知のものであり、医薬の単位剤形（錠
剤、カプセルなど）の包装に幅広く用いられている。通
常、ブリスターパックは、フォイル（好ましくは透明な
プラスチック材料からなる）で被覆した比較的硬質材料
のシートを含む。包装工程において、プラスチックフォ
イルにくぼみを形成する。一般的に、くぼみは、ここに
入れる予定の錠剤またはカプセルの大きさおよび形状と
合致する。次に、錠剤またはカプセルをくぼみ内に置
き、比較的硬質材料のシートを、プラスチックフォイル
の、くぼみが形成された方向の反対側のフォイル表面に
シールする。結果的に、錠剤またはカプセルは、プラス
チックフォイルとシートの間のくぼみに密封される。好
ましくは、シートの強度は、くぼみに指圧（好ましくは
錠剤またはカプセルの使用者の指による）を加えること
により、ブリスターパックから錠剤またはカプセルを取
り出すことができるような強度である。このとき、シー
トのくぼみ位置に、開口部が生じる。その後、錠剤また
はカプセルを、生じた開口部から取り出すことができ
る。

【００４６】さらにパック表面には、例えば、錠剤また
はカプセル付近における数字またはこれに準ずる表示の
形態で、記憶補助手段（memory aid）を提供することが
望ましい。ここで、該表示は、前記剤形を摂取すべき処
方計画の日付に対応する。このような記憶補助手段の他
の例は、パック表面に、例えば以下の通り印刷したカレ
ンダーである（“第１週、月曜、火曜・・・他・・・。
第２週、月曜、火曜・・・”他）。他の応用例が容易に
見つかるであろう。“１日量”は、指定の日に摂取すべ
き１錠の錠剤またはカプセルか、または複数錠の錠剤ま
たはカプセルであってよい。また、式（Ｉ）の化合物の
代謝産物、そのラセミ−ジアステレオマー混合物もしく
は光学異性体、そのプロドラッグ、または該代謝産物、
ラセミ−ジアステレオマー混合物、光学異性体、もしく
はプロドラッグの医薬的に受容しうる塩を含む１日量
は、１錠の錠剤またはカプセルからなっていてよいが、
これとは逆に、エストロゲン、プロゲステロン、Ｐｒｅ
ｍａｒｉｎ（登録商標）、またはビスホスホネート化合
物（好ましくはアレンドロネート）を含む１日量は、複
数錠の錠剤またはカプセルからなることができる。記憶
補助手段は、これを反映する必要がある。

【００４７】本発明の他の具体的実施形態では、１日量
を１回に１種類ずつ、意図する使用順に分配するために
設計したパックを提供する。好ましくは、処方計画の服
薬順守をさらに促進するように、パックに記憶補助手段
を装備する。そのような記憶補助手段の一例は、分配す
べき１日量の数字を示す機械的カウンターである。その
ような記憶補助手段の他の例は、液晶表示器に連結した
電池式マイクロチップメモリー、または可聴合図信号
（audible reminder signal）である。この可聴合図信
号は、例えば、前回１日量を摂取した日付けを読み取
り、および／または次回の投与をいつ摂取すべきかを患
者に思い出させるものである。

【００４８】式（Ｉ）の化合物は、２−アミノ−Ｎ−
［２−（３ａ（Ｒ）−ベンジル−２−メチル−３−オキ
ソ−２，３，３ａ，４，６，７−ヘキサヒドロ−ピラゾ
ロ−［４，３−ｃ］ピリジン−５−イル）−１−（Ｒ）
−ベンジル−オキシメチル−２−オキソ−エチル］−イ
ソブチルアミドとしても知られ、前記一般譲渡された国
際特許出願公開番号第ＷＯ ９７／２４３６９号に開示
されている合成方法に従い調製することができる。

【００４９】

【実施例】 ¹⁴Ｃ−放射性標識化合物（Ｉ）の調製 ¹⁴ Ｃ−放射性標識化合物２−アミノ−Ｎ−［２−（３ａ
（Ｒ）−ベンジル−２−メチル−３−オキソ−２，３，
３ａ，４，６，７−ヘキサヒドロ−ピラゾロ−［４，３
−ｃ］ピリジン−５−イル）−１−（Ｒ）−ベンジル−
オキシメチル−２−オキソ−エチル］−イソブチルアミ
ドを、以下の合成スキームに従って調製した。

【００５０】

【化１８】 化合物（ｉｉ） テトラヒドロフラン（１５ｍｌ、水素化アルミニウムリ
チウムから蒸留）中の化合物（ｉ）（０．６６ｇ、３．
４ｍｍｏｌ、２当量）の溶液を−７８℃に冷却した。ｔ
ｅｒｔ−ブチルリチウム（１．７ｍｌ、２．６６ｍｍｏ
ｌ、１．５当量、ペンタン中に１．５Ｍ）を滴下して加
えた。茶色がかった橙色の濁った反応混合物を−７８℃
で１５分間撹拌した後、固体を液体窒素浴中で凍結し
た。その後、［¹⁴Ｃ］ＣＯ₂（９８．３ｍＣｉ、５７ｍ
Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を、減圧下で凍結した反応フラスコに
移し入れた。該反応物を−７８℃に加温し、１５分間撹
拌し、エタノール（５ｍｌ）で冷却し、室温に加温し
た。反応混合物を減圧濃縮し、エタノール（２０ｍｌ）
に溶解すると、９１．２ｍＣｉ（放射能回収率９３％）
の化合物（ｉｉ）が得られた。薄層クロマトグラフィー
分析（シリカゲル、１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ₃）
は、基準物質を示した。

【００５１】

【化１９】 化合物（ｉｉｉ） エタノール（２０ｍｌ）中の溶液としての粗生成物（ｉ
ｉ）（９１．２ｍＣｉ）を、濃硫酸（０．５ｍｌ）で処
理した。この少し黄色がかった透明の溶液を加熱還流
し、薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、１０％ Ｍ
ｅＯＨ／ＣＨＣｌ ₃）によりモニタリングした。反応混
合物を室温に冷却し、減圧濃縮した。残渣を水（２５ｍ
ｌ）に溶解した後、１Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨを７．
０にした。その後、水層をクロロホルムまたはクロロホ
ルム／イソプロパノール（９／１）で継続的に抽出し
た。有機層を合わせ、濃縮し、残渣をシリカゲルクロマ
トグラフィー（グラジエント、１０／０−９／１ クロ
ロホルム／メタノール） により精製すると、７１ｍＣ
ｉの化合物（ｉｉｉ）が得られた。

【００５２】

【化２０】 化合物１ エタノール（８ｍｌ）中の化合物（ｉｉｉ）（１５．６
ｍＣｉ、０．２７ｍｍｏｌ、１当量）の溶液に、ＢＯＣ
₂Ｏ（０．１２ｇ、０．５５ｍｏｌ、２当量）およびア
ルミナに担持したロジウムを加えた。反応物を排気し、
水素で逆流置換し（back-flushed）、水素採集袋（hydr
ogen balloon）を取り付けた後、薄層クロマトグラフィ
ー（３％ ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ₃）によりモニタリング
しつつ室温で撹拌した。反応完了と同時に反応混合物を
減圧濃縮し、残渣をシリカゲルのプラグを通して濾過し
（３％ ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ₃）、シリカゲルクロマト
グラフィー（２０％ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）により精
製すると、６．７１ｍＣｉの化合物１が得られた。

【００５３】

【化２１】 化合物２ テトラヒドロフラン（５ｍｌ）中の化合物１（９４．７
ｍＣｉ、１．６７ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム
（５８０ｍｇ、４．１９ｍｍｏｌ、２．５当量）および
臭化ベンジル（０．３０ｍｌ、２．５２ｍｍｏｌ、１．
５当量）を加えた。該溶液をＮ₂雰囲気下で２４時間６
０℃に加熱した後、この溶液を濾過し、減圧濃縮した。
残渣をシリカゲルグロマトグラフィー（１０％酢酸エチ
ル／ヘキサン）により精製すると、８５．８ｍＣｉの化
合物２が得られた。化合物３ メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（５ｍｌ）中の化合物
２（１１５．８ｍＣｉ、２．０５ｍｍｏｌ）の溶液に、
メチルヒドラジン（０．１３ｍｌ、２．４５ｍｍｏｌ、
１．２当量）および氷酢酸（０．１８ｍｌ、３．０７ｍ
ｍｏｌ、１．５当量）を加えた。該溶液をＮ₂雰囲気下
で２７時間、６０℃に加熱し、その後さらに０．１３ｍ
ｌのメチルヒドラジン（２．４５ｍｍｏｌ、１．２当
量）および０．１０ｍｌの氷酢酸（１．７５ｍｍｏｌ、
０．８５当量）を加えた。該溶液をＮ₂雰囲気下で１９
時間、６０℃に加熱した後、この溶液を冷却し、酢酸エ
チル（２０ｍｌ）を加えた。該溶液を飽和重炭酸ナトリ
ウム（２×５ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥
し、濾過し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルグロマト
グラフィー（２０％酢酸エチル／ヘキサン）により精製
すると、２２．４ｍＣｉの化合物３が得られた。

【００５４】

【化２２】 化合物４ ジクロロメタン（２ｍｌ）中の化合物３（３２．０ｍＣ
ｉ、０．５７ｍｍｏｌ）の溶液をＮ₂雰囲気下で０℃に
冷却し、トリフルオロ酢酸（０．４５ｍｌ、５．８４ｍ
ｍｏｌ、１０．２当量）を加えた。該溶液をＮ₂雰囲気
下、０℃で２時間撹拌し、その後さらに０．４５ｍｌの
トリフルオロ酢酸（５．８４ｍｍｏｌ、１０．２当量）
を加えた。該溶液をＮ₂雰囲気下、０℃でさらに４時間
撹拌した後、室温に加温した。該溶液をジクロロメタン
（１５ｍｌ）で希釈し、飽和重炭酸ナトリウム（２×８
ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減
圧濃縮すると、２４．９ｍＣｉの粗生成物４が得られ
た。該粗生成物を、直接次の反応に使用した。化合物５ ８：１ アセトン／水（３ｍｌ）中の化合物４（２４．
９ｍＣｉ、０．４４ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｌ−酒石酸
（７３ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ、１．１当量）を加え
た。該溶液をＮ₂雰囲気下で１７時間、５０℃に加熱し
た後、この溶液を０℃に冷却し、さらに２．５時間撹拌
した。該溶液を濾過し、固体を、冷却した８：１ アセ
トン／水（５×２ｍｌ）で洗浄した。該固体を室温の減
圧デシケーター内で１７時間乾燥すると、１６．３ｍＣ
ｉの化合物５が得られた。

【００５５】

【化２３】 化合物６ ジクロロメタン（２ｍｌ）中の化合物５（１．８ｍＣ
ｉ、０．０３ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ₂雰囲気下、−４
０℃で水酸化アンモニウム（０．０１ｍｌ、０．１５ｍ
ｍｏｌ）を加えた。該溶液を１時間撹拌した後、この溶
液を−４０℃で半融ガラス漏斗を通して濾過し、第２反
応容器に入れた。この溶液に、前記国際特許出願公開番
号第ＷＯ ９７／２４３６９号に記載の通りに調製した
化合物ｉｖ（３６ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ、３．０当
量）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール
（１３ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ、３．０当量）、および
１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカル
ボジイミドヒドロクロリド（１８ｍｇ、０．０９ｍｍｏ
ｌ、３．０当量）を加えた。該溶液を０℃に加温し、Ｎ
₂雰囲気下で３時間撹拌した。該溶液をジクロロメタン
（１０ｍｌ）で希釈し、水（２×６ｍｌ）で洗浄し、硫
酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮すると、１．８ｍＣｉ
の粗生成物６が得られた。

【００５６】

【化２４】 化合物７ ジクロロメタン中の化合物６（１１．３４ｍＣｉ、０．
２０ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ₂雰囲気下、０℃でトリフ
ルオロ酢酸（０．５０ｍｌ、６．５ｍｍｏｌ、３２当
量）を加えた。該溶液を７時間撹拌した後、これを室温
に加温した。さらに１時間撹拌した後、該溶液をジクロ
ロメタン（２０ｍｌ）で希釈し、飽和重炭酸ナトリウム
（２×５ｍｌ）、ブライン（５ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナ
トリウムで乾燥し、減圧濃縮した。残渣を２種のシリカ
ゲルグロマトグラフィー（１０％アセトン／酢酸エチ
ル、２％エタノール／ジクロロメタン）により精製した
後、酢酸エチル／ヘキサンから再結晶化させると、６．
１１ｍＣｉの化合物７が得られた。

【００５７】

【化２５】 化合物（Ｉ） 酢酸エチル（２６ｍｌ）中の¹⁴Ｃ−放射性標識化合物７
（４．８７ｍＣｉ、０．０９ｍｍｏｌ）および非¹⁴Ｃ−
放射性標識化合物７（９３２．６ｍｇ、１．８４ｍｍｏ
ｌ）の溶液に、メタノール（８ｍｌ）中のＬ−酒石酸
（２９０．３ｍｇ、１．９３ｍｍｏｌ、１．０当量）溶
液を加えた。溶媒を減圧下で減少させ、２０ｍｌの酢酸
エチルを加え、該溶液を８５℃で４時間還流した。該溶
液を１時間かけて室温に冷却した後、この溶液を濾過
し、固体を酢酸エチル（３×１０ｍｌ）で洗浄した。該
固体を室温の減圧デシケーター内で１７時間乾燥する
と、化合物（Ｉ）が１．１７ｇ得られた。代謝産物の単離 以下の手順を用いて、式（Ｉ）の化合物の代謝産物を、
ヒト、マウス、またはラットの尿および糞便試料から単
離した。ヒト被験者からの代謝産物の単離 （方法Ａ） 試験投与物質を、手動式ミルで粉砕した均質な粉末状の
¹⁴Ｃ−放射性標識化合物（酒石酸塩；比放射能＝４．７
３μＣｉ／ｍｇ、遊離塩基当量；放射化学的純度＞９
９．５％；化学的純度＞９９．５％）を水中に溶解する
ことにより調製した。その後、５．０μＣｉ／ｍｇの比
放射能を有する¹⁴Ｃ−放射性標識化合物を、２０ｍｇの
１回投与量で各被験者に経口投与した。

【００５８】年齢１８〜４５才の健康な男性のヒト被験
者４人が、試験に参加した。投与前の少なくとも１２時
間にわたり、被験者を継続的な医学的観察下に拘束し
た。被験者は全員、朝の投与前の少なくとも８時間、食
事を摂らなかった。実験条件を標準化するために、投与
後の最初の４時間は仰向けになることを控えるよう被験
者に求めた。被験者にはまた、化合物の投与後の最初の
４時間は食事を摂らないよう要請した。化合物の投与
は、２０ｍｇ（遊離塩基当量；１００μＣｉ／被験者）
の１回経口投与量で実施した。投与後、尿試料を８日間
（投与の０〜２４、２４〜４８、４８〜７２、７２〜９
６、９６〜１２０、１２０〜１４４、１４４〜１６８、
および１６８〜１９２時間後）にわたり採集した。尿試
料を十分に混合し、この期間中に排泄された尿の全容量
を記録した。便の採集は、投与時から投与後１９２時間
まで実施した。

【００５９】尿中の放射能は、液体シンチレーション計
数により測定した。尿中の全放射能を、各サンプリング
時について０．２ｍｌの３重アリコート（triplicate a
liquots）を直接定量した。試料をＥｃｏｌｉｔｅシン
チレーションカクテル（ＩＣＮ；Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓ
ａ、ＣＡ）（５ｍｌ）と混合し、Ｗａｌｌａｃ Ｌｉｑ
ｕｉｄ Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｃｏｕｎｔｅｒ
Ｍｏｄｅｌ ＃１４０９（Ｗａｌｌａｃ；Ｔｕｒｋ
ｕ、フィンランド）を用いて計数した。

【００６０】各サンプリング時に採集した便は、風袋を
量ったストマッカーバッグ（stomacher bags）に直接入
れ、水で水和した後、−２０℃で保存した。均質な便ス
ラリーを、ストマッカーを用いて調製した。各サンプリ
ング時に、便スラリーの総重量を記録した。各スラリー
の３重アリコート（５０〜１００ｍｇ）をオキシダイザ
ー用試料カップに量り入れ、一晩乾燥した後、燃焼させ
た。試料の酸化は、Ｐａｃｋａｒｄ Ｍｏｄｅｌ ３０
７オキシダイザー（Ｒ．Ｊ．Ｈａｒｖｅｙ Ｉｎｓｔｒ
ｕｍｅｎｔ Ｃｏｒｐ．； Ｄｏｗｎｅｒ’ｓ Ｇｒｏ
ｖｅ，ＩＬ）を用いて行った。遊離¹⁴ＣＯ₂をトラップ
し、シンチレーションカクテルを加え、試料を計数し
た。試料はすべて、内部クエンチカーブおよび２シグマ
値４（９５％信頼）を用いたＷａｌｌａｃカウンターで
計数した。試料の酸化過程を通して、燃焼効率は９５％
を超えていた。

【００６１】投与前の尿および便試料を計数し、各マト
リックスについてバックグラウンド計数率を決定した。
各マトリックスの放射能の量を、各被験者に投与した放
射能の総量に占める割合（％）として示した。定量の下
限（ＬＬＯＱ）を、バックグラウンドの２倍と考えた。

【００６２】各被験者について放射能レベルがもっとも
高かった尿試料をプールし、凍結乾燥により濃縮した。
残渣を、２００μｌのアセトニトリル：１０ｍＭギ酸ア
ンモニウム（１％ギ酸を含有）（１０：９０）中で再生
した。凍結乾燥および再生における放射能の回収率は、
８９〜１０５％であった。

【００６３】排泄した放射能レベルがもっとも高かった
便ホモジネートを、各サンプリング時の排泄容量／質量
に対応してプールした。プールした便ホモジネートをア
セトニトリル（３ｍｌ／ｇ）で２回洗浄して抽出し、窒
素蒸気下で一晩濃縮した。濃縮した便抽出物を、１００
μｌのアセトニトリル：１０ｍＭギ酸アンモニウム（１
％ギ酸）（１０：９０）中で再生し、その後分析した。
プールした便試料の抽出後の放射能回収率は、８９〜１
０９％であった。

【００６４】尿および便中の放射性標識物質を、逆相Ｈ
ＰＬＣにより分析した。ＨＰＬＣ系は、グラジエントポ
ンプおよび５００μｌフローセルを装備したβ−放射能
検出器（β−ＲＡＭ；ＩＮＵＳ；Ｔａｍｐａ，ＦＬ）か
らなっていた。クロマトグラフィーは、１０ｍＭギ酸ア
ンモニウム（１％ギ酸）（溶媒Ａ）およびアセトニトリ
ル（溶媒Ｂ）の混合物からなる移動相の二元グラジエン
ト（binary gradient）を用いて、Ｚｏｒｂａｘ（Ｐａ
ｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）Ｒｘ Ｃ−１８カラム（４．６
ｍｍ×１５０ｍｍ；５μｍ）で行った。流量は１．０ｍ
ｌ／ｍｉｎで、分離は室温で行った。全マトリックス中
の代謝産物の分離に使用するグラジエントを、以下のよ
うにプログラムした：溶媒Ａ：溶媒Ｂ；０〜３０分で９
０：１０を６０：４０に変化させる。次の注入を行う前
に、９０：１０ 緩衝液：アセトニトリルでカラムを１
０分間平衡化した。全マトリックスについて、カラムか
ら出てきたものの回収率は９５％を超えていた。マウスからの代謝産物の単離 （方法Ｂ） 試験投与物質は、先に記載したように¹⁴Ｃ−放射性標識
を施した２−アミノ−Ｎ−［２−（３ａ（Ｒ）−ベンジ
ル−２−メチル−３−オキソ−２，３，３ａ，４，６，
７−ヘキサヒドロ−ピラゾロ−［４，３−ｃ］ピリジン
−５−イル）−１−（Ｒ）−ベンジル−オキシメチル−
２−オキソ−エチル］−イソブチルアミド（酒石酸塩；
比放射能＝４．９７μＣｉ／ｍｇ、遊離塩基当量；放射
化学的純度＞９９．５％；化学的純度＞９９．５％）の
均質な粉末を、１００％ナノピュア水（nanopure wate
r）と混合することにより調製した。¹⁴Ｃ−放射性標識
物質を非標識材料で希釈し、２００ｍｇ／ｋｇ塩基当量
（１０〜１２μＣｉ／マウス）とした。

【００６５】物質収支を調べるために、１８匹のマウス
（約２５〜３０ｇ）に投与を行い、これらを代謝ケージ
に収容して（３匹／性／ケージ）、採集した尿および糞
の分離を容易にした。投与溶液を手で十分に混合し、渦
状に混合し（vortexes）、撹拌した。動物にはすべて一
晩餌を与えず、その後、各動物に２００ｍｇ／ｋｇ（遊
離塩基当量）の経口投与量の¹⁴Ｃ−放射性標識物質（１
０〜１２μＣｉ／マウス）を強制的に与えて経口投与を
行った。被験動物は、順化期間および試験期間を通し、
飼料に適宜近づくことができた。

【００６６】¹⁴Ｃ−放射性標識試験化合物を投与した
後、物質収支の調査および代謝産物の同定を行うため
に、予め重さを量っておいた試料容器に、尿および糞を
定量的に採集した。尿および糞は、投与直前ならびに投
与後０〜２４、２４〜４８、４８〜７２、７２〜９６、
９６〜１２０、１２０〜１４４および１４４〜１６８時
間の間隔で採集し、さらに加工、分析するまでは、−２
０℃で保存した。各サンプリング時にケージの洗浄液を
採集し、最後の洗浄はイソプロパノール／水（１：１）
で行った。試料を分析し、放射能を求め、代謝産物を同
定した。

【００６７】尿およびケージ洗浄液中の放射能は、各サ
ンプリング時について３重アリコートを直接定量した。
各サンプリング時に採集した糞は、水で水和し、均質な
スラリーにホモジナイズし、各サンプリング時について
記録した。各スラリーの３重アリコート（２５〜５０ｍ
ｇ）をオキシダイザー用試料カップに量り入れ、一晩乾
燥した後、燃焼させた。試料の酸化は、Ｐａｃｋａｒｄ
Ｍｏｄｅｌ ３０７オキシダイザーを用いて行った。
遊離¹⁴ＣＯ₂をトラップし、シンチレーションカクテル
を加え、試料を液体シンチレーション計数により計数し
た。試料はすべて、内部クエンチおよび２シグマ誤差≦
２％を用いて、または最長１０分間にわたり、計数し
た。

【００６８】投与前の尿および糞試料を計数し、各マト
リックスについてバックグラウンド計数率を決定した。
各マトリックスの放射能の量はμｇ当量／ｍｌで表し、
投与した投与物の比放射能を用いて算出した。定量の下
限（ＬＬＯＱ）を、バックグラウンド計数率の２倍と考
えた。

【００６９】尿および糞のホモジネート試料を、各サン
プリング時の排泄容量／質量に対応してプールし、排泄
された放射能が実質的に１００％になるようにした。プ
ールした尿は、３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して
沈殿物質を除去した後、直接分析した。プールした糞ホ
モジネートは、アセトニトリル（３ｍｌ／ｇ）で２回洗
浄して抽出し、窒素蒸気下で一晩濃縮した。

【００７０】代謝産物の定量は、β−ＲＡＭを用いたＨ
ＰＬＣで分離した各ピークの放射能を測定することによ
り実施した。ＨＰＬＣ系は、グラジエントポンプおよび
５００μｌフローセルを装備したβ−放射能検出器から
なっていた。クロマトグラフィーは、１％ギ酸を含有す
る１０ｍＭギ酸アンモニウム（溶媒Ａ）およびアセトニ
トリル（溶媒Ｂ）の混合物からなる移動相の二元グラジ
エントを用いて、Ｚｏｒｂａｘ Ｒｘ Ｃ−１８カラム
（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ；３μｍ）で行った。流量は
１．０ｍｌ／ｍｉｎ．で、分離は室温で行った。全マト
リックス中の代謝産物の分離に使用するグラジエント
を、以下のようにプログラムした：溶媒Ａ：溶媒Ｂ；０
〜３０分で９０：１０を６０：４０に変化させる。次の
注入を行う前に、９０：１０ 緩衝液：アセトニトリル
でカラムを１０分間平衡化した。ラットからの代謝産物の単離 （方法Ｃ） 試験投与物質は、先に記載したように¹⁴Ｃ−放射性標識
を施した２−アミノ−Ｎ−［２−（３ａ（Ｒ）−ベンジ
ル−２−メチル−３−オキソ−２，３，３ａ，４，６，
７−ヘキサヒドロ−ピラゾロ−［４，３−ｃ］ピリジン
−５−イル）−１−（Ｒ）−ベンジル−オキシメチル−
２−オキソ−エチル］−イソブチルアミド（酒石酸塩；
比放射能＝５．００μＣｉ／ｍｇ、遊離塩基当量；放射
化学的純度９９％）の均質な粉末を、１００％水と混合
することにより調製した。投与濃度は１．５ｍｇ／ｍｌ
（遊離塩基）であった。

【００７１】物質収支を調べるために、６匹のマウス
（３匹／性）に一晩餌を与えず、その後、１５ｍｇ／ｋ
ｇ（遊離塩基当量）の経口投与量の放射性標識試験化合
物を強制的に１回経口投与した。該動物を個別に代謝ケ
ージに収容し、試験期間を通して飼料および水に適宜近
づけるようにしておいた。

【００７２】 放射性標識試験化合物を投与する前日に、
投与前の尿および糞を全試験動物から採集し、これらの
マトリックスのバックグラウンド計数率を決定した。放
射性標識試験化合物の投与後、予め重さを量っておいた
試料瓶に、尿および糞を定量的に採集した。尿および糞
は、投与の０〜２４、２４〜４８、４８〜７２、７２〜
９６、９６〜１２０、１２０〜１４４および１４４〜１
６８時間後に採集した。

【００７３】尿中の全放射能は、液体シンチレーション
計数により３重で（各サンプリング時について０．０５
〜０．５０ｍｌのアリコート）直接的に定量した。試料
をＥｃｏｌｉｔｅシンチレーションカクテル（５ｍｌ）
と混合し、Ｗａｌｌａｃ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｃｉｎｔｉ
ｌｌａｔｉｏｎ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｍｏｄｅｌ ＃１４
０９を用いて計数した。各サンプリング時に採集した糞
は、風袋を量ったストマッカーバッグに直接入れ、水で
水和した後、−２０℃で保存した。均質な糞スラリー
を、ストマッカーを用いて調製した。各サンプリング時
に、糞スラリーの総重量を記録した。各スラリーの３重
アリコート（５０〜１００ｍｇ）をオキシダイザー用試
料カップに量り入れ、一晩乾燥した後、燃焼させた。試
料の酸化は、Ｐａｃｋａｒｄ Ｍｏｄｅｌ ３０７オキ
シダイザーを用いて行った。遊離¹⁴ＣＯ₂をトラップ
し、シンチレーションカクテルを加え、試料を計数し
た。試料はすべて、内部クエンチカーブおよび２シグマ
値４（９５％信頼）を用いたＷａｌｌａｃカウンターで
計数した。試料の酸化分析中の計数効率は、９５％を超
えていた。

【００７４】投与前の尿および糞試料を計数し、各マト
リックスについてバックグラウンド計数率を決定した。
各マトリックスの放射能の量はμｇ当量／ｍｌで表し、
投与した投与物の比放射能を用いて算出した。定量の下
限（ＬＬＯＱ）を、バックグラウンド計数率の２倍と考
えた。

【００７５】尿および糞中の放射性標識物質を、逆相Ｈ
ＰＬＣにより分析した。ＨＰＬＣ系は、グラジエントポ
ンプおよび５００μｌフローセルを装備したβ−放射能
検出器（β−ＲＡＭ、ＩＮＵＳ）からなっていた。クロ
マトグラフィーは、１０ｍＭギ酸アンモニウム（１％ギ
酸）（溶媒Ａ）およびアセトニトリル（溶媒Ｂ）の混合
物からなる移動相の二元グラジエントを用いて、Ｚｏｒ
ｂａｘ Ｒｘ Ｃ−１８カラム（４．６ｍｍ×１５０ｍ
ｍ；３μｍ）で行った。流量は１．０ｍｌ／ｍｉｎ．
で、分離は室温で行った。全マトリックス中の代謝産物
の分離に使用するグラジエントを、以下のようにプログ
ラムした：溶媒Ａ：溶媒Ｂ；０〜３０分で９０：１０を
３０：７０に変化させる。次の注入を行う前に、９０：
１０ 緩衝液：アセトニトリルでカラムを１０分間平衡
化した。グラジエント条件下において、変化していない
試験化合物の保持時間は１３．０分であった。

【００７６】尿および糞試料を、各サンプリング時の排
泄容量／質量に対応してプールし、排泄された放射能が
９０％を超えるようにした。プールした尿は、３５００
ｒｐｍで１０分間遠心分離して沈殿物質を除去した後、
直接分析した。プールした糞ホモジネートは、アセトニ
トリル（３ｍｌ／ｇ）で２回洗浄して抽出し、窒素蒸気
下で一晩濃縮した。濃縮した糞抽出物を、１００μｌの
９０：１０ １０ｍＭギ酸アンモニウム（１％ギ酸）／
アセトニトリル中に再生し、その後分析した。オンライ
ンの放射能検出器（β−ＲＡＭ）を用いて、プールした
各マトリックスについてラジオクロマトグラムを得た。
放射性ピークを積分することにより、各試料中の全放射
能の割合（％）として、各代謝産物の定量的評価を行っ
た。イヌからの代謝産物の単離 （方法Ｄ） 試験投与物質は、先に記載したように¹⁴Ｃ−放射性標識
を施した２−アミノ−Ｎ−［２−（３ａ（Ｒ）−ベンジ
ル−２−メチル−３−オキソ−２，３，３ａ，４，６，
７−ヘキサヒドロ−ピラゾロ−［４，３−ｃ］ピリジン
−５−イル）−１−（Ｒ）−ベンジル−オキシメチル−
２−オキソ−エチル］−イソブチルアミド（酒石酸塩；
比放射能＝５．００μＣｉ／ｍｇ、遊離塩基当量；放射
化学的純度＞９９％）の均質な粉末を、１００％ナノピ
ュア水中で非標識化合物と混合することにより調製し
た。投与濃度は３．５ｍｇ／ｍｌ（遊離塩基）であっ
た。

【００７７】４匹のビーグル犬（２匹／性）に、７ｍｇ
／ｋｇ（遊離塩基当量）の経口投与量の試験化合物を、
強制的に１回経口投与した。該動物には投与前に餌を与
えず、投与４時間後に標準的な食餌計画に戻した。動物
は、尿および糞を別個に採集できる代謝ケージに戻し
た。

【００７８】 投与前日に、投与前の尿および糞を全動物
から採集し、これらのマトリックスのバックグラウンド
計数率を決定した。放射性標識試験化合物の投与後、尿
および糞を、予め重さを量っておいた試料瓶およびスト
マッカーバッグにそれぞれ定量的に採集した。尿および
糞は、投与の０〜２４、２４〜４８、４８〜７２、７２
〜９６、９６〜１２０、１２０〜１４４および１４４〜
１６８時間後に採集した。

【００７９】尿および糞中の全放射能は、液体シンチレ
ーション計数により３回重で（各サンプリング時につい
て０．０５〜０．５０ｍｌのアリコート）直接的に定量
した。試料をＥｃｏｌｉｔｅシンチレーションカクテル
（５ｍｌ）と混合し、Ｗａｌｌａｃ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓ
ｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｍｏｄｅ
ｌ ＃１４０９を用いて計数した。各サンプリング時に
採集した糞は、風袋を量ったストマッカーバッグに直接
入れ、水で水和した後、−２０℃で保存した。均質な糞
スラリーを、ストマッカーを用いて調製した。各サンプ
リング時に、糞スラリーの総重量を記録した。各スラリ
ーの３重アリコート（５０〜１００ｍｇ）をオキシダイ
ザー用試料カップに量り入れ、一晩乾燥した後、燃焼さ
せた。試料の酸化は、Ｐａｃｋａｒｄ Ｍｏｄｅｌ ３
０７オキシダイザーを用いて行った。遊離¹⁴ＣＯ₂をト
ラップし、シンチレーションカクテルを加え、試料を計
数した。試料はすべて、内部クエンチカーブおよび２シ
グマ値４（９５％信頼）を用いたＷａｌｌａｃカウンタ
ーで計数した。試料の分析中、尿および糞試料中の ¹⁴Ｃ
の計数効率は、９５％を超えていた。

【００８０】投与前の尿および糞試料を計数し、各マト
リックスについてバックグラウンド計数率を決定した。
各マトリックスの放射能の量はμｇ当量／ｍｌで表し、
投与した投与物の比放射能を用いて算出した。定量の下
限（ＬＬＯＱ）を、バックグラウンド計数率の２倍と考
えた。

【００８１】尿および糞中の放射性標識物質を、逆相Ｈ
ＰＬＣにより分析した。ＨＰＬＣ系は、グラジエントポ
ンプおよび５００μｌフローセルを装備したβ−放射能
検出器（β−ＲＡＭ、ＩＮＵＳ）からなっていた。クロ
マトグラフィーは、１０ｍＭギ酸アンモニウム（１％ギ
酸）（溶媒Ａ）およびアセトニトリル（溶媒Ｂ）の混合
物からなる移動相の二元グラジエントを用いて、Ｚｏｒ
ｂａｘ Ｒｘ Ｃ−１８カラム（４．６ｍｍ×１５０ｍ
ｍ；３μｍ）で行った。流量は１．０ｍｌ／ｍｉｎ．
で、分離は室温で行った。全マトリックス中の代謝産物
の分離に使用するグラジエントを、以下のようにプログ
ラムした：溶媒Ａ：溶媒Ｂ；０〜３０分で９０：１０を
３０：７０に変化させる。次の注入を行う前に、カラム
を１０分間平衡化した。

【００８２】尿および糞試料を、各サンプリング時の排
泄容量／質量に対応してプールし、排泄された放射能が
ほぼ１００％になるようにした。プールした尿は、３５
００ｒｐｍで１０分間遠心分離して沈殿物質を除去した
後、直接分析した。プールした糞ホモジネートは、アセ
トニトリル（３ｍｌ／ｇ）で２回洗浄して抽出し、窒素
蒸気下で一晩濃縮した。濃縮した糞抽出物を、１００μ
ｌの９０：１０ １０ｍＭギ酸アンモニウム（１％ギ
酸）／アセトニトリル中に再生し、その後分析した。オ
ンラインの放射能検出器（β−ＲＡＭ）を用いて、プー
ルした各マトリックスについてラジオクロマトグラムを
得た。放射性ピークを積分することにより、各試料中の
全放射能の割合（％）として、各代謝産物の定量的評価
を行った。機器 尿および糞中の代謝産物のキャラクタリゼーションは、
ＳＣＩＥＸ ＡＰＩ２０００ ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ質量分
析計（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて行っ
た。ポストカラム流出液を分離し、イオンスプレーイン
ターフェイスを介してこれを５０μｌ／ｍｉｎ．の割合
で大気圧イオン化源に導入した。残った流出液をβ−Ｒ
ＡＭ検出器に誘導し、放射能および全イオンクロマトグ
ラムを並行して検出した。質量分析計の操作は正イオン
モードで行い、イオンスプレーインターフェイスは４５
００Ｖで操作した。衝突誘起解離（ＣＩＤ）試験は、衝
突エネルギー４０ｅＶ、衝突ガスの厚さ−３．０×１０
⁴分子／ｃｍ²でアルゴンガスを用いて実施した。代謝産物の同定 化合物２−アミノ−Ｎ−［２−（３ａ（Ｒ）−ベンジル
−２−メチル−３−オキソ−２，３，３ａ，４，６，７
−ヘキサヒドロ−ピラゾロ−［４，３−ｃ］ピリジン−
５−イル）−１−（Ｒ）−ベンジル−オキシメチル−２
−オキソ−エチル］−イソブチルアミドの合成標準物質
は、正イオンモードにおいてｍ／ｚ ５０６［Ｍ＋Ｈ］
⁺に分子イオン信号を生じる。ｍ／ｚ ５０６の衝突誘
起解離（ＣＩＤ）による生成イオンは、ｍ／ｚ ５８、
９１、２１５、２３５、２４４、２６３、および４２１
に主要イオンを生じた。ｍ／ｚ ２４４および２６３の
生成イオンは、α−メチルアラニル−Ｏ−ベンジルセリ
ン部分を分子の残部に連結するアミド結合の開裂による
ものと推論した。ｍ／ｚ ２６３および２４４のイオン
からさらにカルボニル基がとれると、それぞれｍ／ｚ
２３５および２１５のイオンになった。ｍ／ｚ ５８の
生成イオンは、アミド結合へのα−が開裂したα−メチ
ルアラニン部分であった。α−メチルアラニンがとれる
と、ｍ／ｚ４２１の生成イオンが形成した。ｍ／ｚ ９
１の生成イオンは、Ｏ−ベンジルセリンおよびベンジル
ピペリジン−ピラゾロン部分からのトロピリウムイオン
であった。代謝産物１ （方法Ａ）

【００８３】

【化２６】 代謝産物１の保持時間は、約７．０分であった。ｍ／ｚ
２３０のプリカーサーイオンスキャンにおいて、プロ
トン化分子イオンがｍ／ｚ ４０２で検出された。ｍ／
ｚ ４０２のＣＩＤによる生成イオンスペクトルは、ｍ
／ｚ ５８、９１、１３９、１４５、１８７、２０１、
および２３０に主要イオンを生じた。ｍ／ｚ ２３０の
生成イオンは、変化していない化合物で観察されたｍ／
ｚ ２４４の生成イオンより１４ａｍｕ小さく、ピラゾ
ロン部分でのＮ−脱メチル化に対応していた。ｍ／ｚ
１４５の生成イオンは、変化していない化合物で観察さ
れたｍ／ｚ ２３５の生成イオンより９０ａｍｕ小さ
く、Ｏ−ベンジルセリン部分でのＯ−脱ベンジル化に対
応していた。ｍ／ｚ ５８の生成イオンは、変化してい
ないα−メチルアラニンと一致していた。ｍ／ｚ ２０
１および１３９の生成イオンは、ｍ／ｚ ２３０の生成
イオンからそれぞれカルボニル基およびベンジル基がと
れることにより形成した。ｍ／ｚ ９１の生成イオンは
トロピリウムイオンであった。ｍ／ｚ １８７の生成イ
オンは、ベンゼン環およびピラゾロン部分を含有するピ
ペリジン環の一部が開裂することにより形成した。代謝産物２ （方法Ａ）

【００８４】

【化２７】 代謝産物２の保持時間は、約７．０分であった。ｍ／ｚ
２４４のプリカーサーイオンスキャンにおいて、プロ
トン化分子イオンがｍ／ｚ ４１６で検出された。これ
は、変化していない化合物より９０ａｍｕ小さかった。
ｍ／ｚ ４１６のＣＩＤによる生成イオンスペクトル
は、ｍ／ｚ ５８、９１、１４５、１５３、２０１、２
１５、２４４、および３３１に主要イオンを生じた。ｍ
／ｚ ２４４の生成イオンは、化合物の半分のベンジル
ピペリジン側が修飾されていないことを示唆していたの
で、９０ａｍｕの喪失分は分子のα−メチルアラニル−
Ｏ−ベンジルセリン側からとれていた。ｍ／ｚ ５８の
生成イオンは、変化していない化合物で観察され、α−
メチルアラニンに対応しており、修飾をセリン部分に限
定していた。ｍ／ｚ ３３１の生成イオンは、変化して
いない薬剤からのｍ／ｚ ４２１の生成イオンより９０
ａｍｕ小さく、Ｏ−ベンジルセリン部分のＯ−脱ベンジ
ル化を示唆していた。ｍ／ｚ ２０１の生成イオンは、
α−メチルアラニンおよびセリンを含有するアミドの開
裂により形成すると考えられる。ｍ／ｚ２１５および１
５３の生成イオンは、ｍ／ｚ ２４４からそれぞれカル
ボニルおよびベンジル基がとれることにより形成した。
ｍ／ｚ １４５の生成イオンは、分子からカルボニル基
を除いたもののα−メチルアラニル−Ｏ−ベンジルセリ
ン部分に対応していた。これは、Ｏ−脱ベンジル化によ
るベンジル基喪失の構造的帰属と一致していた。代謝産物３ （方法Ａ）

【００８５】

【化２８】 代謝産物３の保持時間は、約１７分であった。ｍ／ｚ
２３０のプリカーサーイオンスキャンにおいて、プロト
ン化分子イオンがｍ／ｚ ４３２で検出された。ｍ／ｚ
４３２のＣＩＤによる生成イオンスペクトルは、ｍ／
ｚ ９１、２０１、２３０、および３８６に主要イオン
を生じた。ｍ／ｚ ２０１および２３０の生成イオン
は、ベンジルピペリジン部分のＮ−脱メチル化と一致し
ていた。４６ａｍｕ（ｍ／ｚ ４３２−３８６＝ｍ／ｚ
４６）のニュートラルロスは、ギ酸の喪失に対応して
おり、α−メチルアラニン部分でのカルボン酸の存在と
一致していた。代謝産物４ （方法Ａ）

【００８６】

【化２９】 代謝産物４の保持時間は、約２２．０分であった。ｍ／
ｚ ２４４のプリカーサーイオンスキャンにおいて、分
子イオンがｍ／ｚ ４４６で検出された。ｍ／ｚ ４４
６のＣＩＤによる生成イオンスペクトルは、ｍ／ｚ １
２９、１５３、２１５、２４４、および３２９に主要イ
オンを生じた。ｍ／ｚ ２４４の生成イオンは、化合物
の変化していないベンジルピペリジン部分に対応してお
り、そしてｍ／ｚ ２１５および１５３の生成イオン
は、ｍ／ｚ ２４４のイオンからそれぞれカルボニルお
よびベンジル基がとれたものであった。ｍ／ｚ ２３９
の生成イオンは分子イオンからα−メチルアラニンがと
れたものであり、Ｏ−脱メチル化した代謝産物を示唆し
ていた。これは、他の修飾を、α−メチルアラニンに限
定していた。分子イオンに比べ、α−メチルアラニンは
３０ａｍｕ増大しており、カルボン酸であることを示唆
していた。代謝産物５ （方法Ａ）

【００８７】

【化３０】 代謝産物５の保持時間は、約１８．５分であった。ｍ／
ｚ ２３０のプリカーサーイオンスキャンにおいて、プ
ロトン化分子イオンがｍ／ｚ ４３２で検出された。ｍ
／ｚ ４３２のＣＩＤによる生成イオンスペクトルは、
ｍ／ｚ ９１、１２９、１３９、１８７、２０１、およ
び２３０に主要イオンを生じた。ｍ／ｚ２３０の生成イ
オンは、変化していない化合物のＮ−脱メチル化を示唆
していた。ｍ／ｚ １２９の生成イオンは、α−メチル
アラニン−セリン部分からギ酸がとれたものに対応して
おり、これはＯ−脱ベンジル化も起こっていた。この結
果、α−メチルアラニン部分は３０ａｍｕ増大してお
り、カルボン酸の形成と一致していた。この代謝産物
は、代謝産物３と類似していた。α−メチルアラニンが
カルボキシル化した結果、新規のキラル中心が生じたの
で、代謝産物３および代謝産物５はジアステレオマーで
ある。代謝産物６ （方法Ａ）

【００８８】

【化３１】 代謝産物６の保持時間は、約１４．８分であった。ｍ／
ｚ ２３０、２３５、または２４４のプリカーサーイオ
ンスキャンにおいて、この代謝産物の分子イオンは観察
されなかった。この代謝産物のプロトン化分子イオン
は、ｍ／ｚ ４６４になるように決定した。このこと
は、単離した代謝産物をジアゾメタンで処理すると、ｍ
／ｚ ４７８の分子イオンを有し、保持時間が約２３．
５分である、対応するメチルエステル誘導体を形成する
ことにより確認した。同様に、代謝産物６をエタノール
／ＨＣｌで処理すると、保持時間が約２６分である対応
するエチルエステル誘導体が形成した。該エチルエステ
ル共役物（conjugate）はｍ／ｚ ４９２で分子イオン
を生じ、これは変化していない代謝産物６より２８ａｍ
ｕ大きかった。

【００８９】ｍ／ｚ ４６４のＣＩＤによる生成イオン
スペクトルは、ｍ／ｚ ９１、１２９、１８７、および
２３３に主要イオンを生じた。ｍ／ｚ １２９の生成イ
オンは、α−メチルアラニンのカルボキシル化、および
Ｏ−脱ベンジル化を示唆していた。これは、該部分のベ
ンジルピペリジン部分にさらに３２ａｍｕを残してい
た。ベンジルピペリジン部分の修飾は、他の全代謝産物
では観察されたｍ／ｚ２４４および２３０の生成イオン
がないことによっても示唆された。残りの３２ａｍｕ
は、この部分への２個のヒドロキシル基の付加により説
明することができたが、ジヒドロキシル化部分になりう
るモノヒドロキシル化代謝産物は観察されなかった。単
純なジヒドロキシル化部分の欠如はさらに、ｍ／ｚ ２
７６（ｍ／ｚ ３２＋ｍ／ｚ ２４４）に対応する生成
イオンの欠如により明らかであった。

【００９０】ｍ／ｚ ２３３の生成イオンは、２つの過
程により形成した可能性があった。これは、セリン−ア
ラニン部分にピペリジン環の一部が付いたものに対応
し、また、ベンゼン環およびピラゾロンを含有する分子
の残部にも対応する可能性があった。これらのそれぞれ
からカルボン酸がとれると、ｍ／ｚ １８７の生成イオ
ンが形成する。ｍ／ｚ １８７の生成イオンをさらに、
より高いオリフィス部エネルギー１２０Ｖを用いてフラ
グメント化した。得られたｍ／ｚ １８７のＣＩＤによ
る生成イオンは、ｍ／ｚ ９１、１１５、および１２７
にイオンを生じた。ｍ／ｚ ９１の生成イオンの存在
は、トロピリウムイオンに対応し、ｍ／ｚ１８７がベン
ゼン環を含有することを示唆していた。これはさらに、
ｍ／ｚ １８７の生成イオンがピラゾロンおよびベンゼ
ン環を含有し、Ｎ−脱メチル化代謝産物から形成したこ
とを示唆していた。

【００９１】代謝産物６の単離画分をジアゾメタンで処
理すると、保持時間が２２．５分である生成物を生じ
た。ｍ／ｚ ４７８のＣＩＤによる生成イオンは、ｍ／
ｚ ９１、１８７、および２４７にイオンを生じた。ｍ
／ｚ ２４７の生成イオンは、ｍ／ｚ ２３３より１４
ａｍｕ大きく、メチルエステルの形成を示唆していた。
同様に、単離した代謝産物６をエタノール／ＨＣｌで処
理すると、ｍ／ｚ ４９２の分子イオンを有するエチル
エステル誘導体を生じた。ＣＩＤによる生成イオンは、
ｍ／ｚ １８７、２０３、２６１、および２８８にイオ
ンを生じた。ｍ／ｚ ２６１の生成イオンは、該代謝産
物で観察されたｍ／ｚ ２３３より２８ａｍｕ大きく、
カルボン酸の存在を示唆していた。これらの所見は、代
謝産物６の構造的帰属と一致していた。代謝産物７ （方法Ａ）

【００９２】

【化３２】 代謝産物７の保持時間は、約１９．５分であった。ｍ／
ｚ ２４４のプリカーサーイオンスキャンにおいて、プ
ロトン化分子イオンがｍ／ｚ ４３２で検出された。ｍ
／ｚ ４３２のＣＩＤによる生成イオンは、ｍ／ｚ ９
１、１１５、１５３、２１５、２４４、および３３１に
主要イオンを生じた。ｍ／ｚ ２４４の生成イオンは、
変化していない化合物でも観察され、化合物のベンジル
ピペリジン側の変化していない部分に対応していた。ｍ
／ｚ ３３１の生成イオンは、α−メチルアラニンから
ベンジル基を除いたものの喪失と一致しており、該代謝
産物がＯ−脱ベンジル化したことを示唆していた。残り
の１６ａｍｕは、α−メチルアラニンのヒドロキシル化
を示した。分子イオンは、変化していない薬剤より７４
ａｍｕ小さく、α−メチルアラニン部分の１箇所がヒド
ロキシル化したＯ−脱ベンジル化と推論した。ｍ／ｚ
１１５の生成イオンは、α−メチルアラニンで開裂した
α−メチルアラニン−セリン部分に対応していた。ｍ／
ｚ ２１５および２４４の生成イオンは、それぞれカル
ボニルおよびベンジル基の喪失に起因していた。代謝産物８および９ （方法Ａ）

【００９３】

【化３３】 代謝産物８および９の保持時間は、それぞれ約１５．０
分および約１５．８分であった。ｍ／ｚ ２３０のプリ
カーサーイオンスキャンにおいて、プロトン化分子イオ
ンがｍ／ｚ ４１８で検出された。ｍ／ｚ ４１８のＣ
ＩＤによる生成イオンスペクトルは両化合物で一致して
おり、ｍ／ｚ ９１、１１５、１３９、２０１、および
２３０に主要イオンを生じた。ｍ／ｚ １１５の生成イ
オンはセリン部分に対応しており、代謝産物がＯ−脱ベ
ンジル化したことを示唆していた。残りの１６ａｍｕ
は、α−メチルアラニンでのヒドロキシル化を示してい
た。α−メチルアラニンに２種のカルボキシル化代謝産
物誘導体があるという事実から、ヒドロキシル化は２個
のメチル基の一方で起こったと考えた。この部分がヒド
ロキシル化するとキラル中心が生じるので、２種のヒド
ロキシル化代謝産物がありえた。ｍ／ｚ ２０１および
２３０の生成イオンは、ベンジルピペリジンのＮ−脱メ
チル化を示唆していた。代謝産物１０および１１ （方法Ｃ）

【００９４】

【化３４】 代謝産物１０および１１の保持時間は、それぞれ約１
５．７分および約１６．５分であった。ｍ／ｚ ２４４
のプリカーサーイオンスキャンにおいて、ｍ／ｚ５４９
の分子イオンが両化合物で検出された。ｍ／ｚ ５４９
のＣＩＤスペクトルは両化合物で一致しており、ｍ／ｚ
９１、１７６、２４４、２６１、および２８９に主要
イオンを生じた。分子イオンは、変化していない化合物
より４３ａｍｕ大きく、保持時間も長かった。ｍ／ｚ
２４４の生成イオンは、化合物の半分のベンジルピペリ
ジン側が修飾されていないことを示唆していた。ｍ／ｚ
９１の生成イオンは、Ｏ−ベンジルセリン部分のベンジ
ル基が修飾されていないことを示唆していた。これらの
所見に基づき、α−メチルアラニン部分の第１級アミン
のアセチル化が示唆された。２種の代謝産物の存在は、
キラル中心の異性化に起因していた。代謝産物１２ （方法Ｃ）

【００９５】

【化３５】 代謝産物１２の保持時間は約７．９分であった。ｍ／ｚ
２３０のプリカーサーイオンスキャンにおいて、分子
イオンがｍ／ｚ ５０８で検出され、これは変化してい
ない薬剤より１２ａｍｕ大きかった。ｍ／ｚ ５０８の
ＣＩＤスペクトルは、ｍ／ｚ １７３、２３０、４０２
に主要イオンを示した。ｍ／ｚ ２３０の生成イオン
は、変化していない化合物のＮ−脱メチル化を示唆して
いた。ｍ／ｚ ４０２の生成イオンは、分子イオンから
１０６ａｍｕ喪失したものであり、これはヒドロキシル
化ベンジル基がとれたためであった。ｍ／ｚ １７３の
イオンは、ｍ／ｚ ４０２のイオンから分子のベンジル
ピペリジン部分がとれたもので、ヒドロキシル化ベンジ
ル部分の存在を裏付けるものでもあった。代謝産物１３ （方法Ｃ）

【００９６】

【化３６】 代謝産物１３の保持時間は約９．９分であった。ｍ／ｚ
２４４のプリカーサーイオンスキャンにおいて、分子
イオンがｍ／ｚ ５２２で検出された。該分子イオン
は、変化していない化合物の１箇所のヒドロキシル化と
一致していた。ｍ／ｚ ５２２のＣＩＤスペクトルは、
ｍ／ｚ １０７、１４５、１７３、２４４、２７９、３
３１、および４１６に主要イオンを示した。ｍ／ｚ ２
４４の生成イオンは、化合物の半分のベンジルピペリジ
ン側が修飾されていないことを示唆していた。ｍ／ｚ
２７９の生成イオンは、変化していない化合物より１６
ａｍｕ大きかった。ｍ／ｚ １０７、１７３、および４
１６の生成イオンが示唆するように、ヒドロキシル化部
位はα−メチルアラニル−Ｏ−ベンジルセリン部分のベ
ンジル基にあると思われた。ｍ／ｚ ４１６および１０
７の生成イオンはベンジル基の開裂を示しており、これ
はヒドロキシル化ベンジル基の喪失と一致していた。代謝産物１４ （方法Ｃ）

【００９７】

【化３７】 代謝産物１４の保持時間は約８．５分であった。ｍ／ｚ
２４４のプリカーサーイオンスキャンにおいて、分子
イオンがｍ／ｚ ５３８で検出された。変化していない
化合物より３２ａｍｕ大きいが、これは親化合物が２箇
所でヒドロキシル化したためと推論した。ＣＩＤスペク
トルは、ｍ／ｚ １２３、１７３、２４４、および３３
１に主要イオンを示した。ｍ／ｚ ２４４、３３１、お
よび１７３の生成イオンは、Ｏ−ベンジルセリン部分の
ベンジル基の修飾がとれたものであった。ｍ／ｚ １２
３のトロピリウム生成イオンも同様に、２箇所のヒドロ
キシル化と一致していた。代謝産物１５ （方法Ｃ）

【００９８】

【化３８】 代謝産物１５の保持時間は約１０．２分であった。ｍ／
ｚ ２４４のプリカーサーイオンスキャンにおいて、分
子イオンがｍ／ｚ ５５２で検出された。ＣＩＤスペク
トルは、ｍ／ｚ １３７、１７３、２１５、２４４、お
よび３３１に主要生成イオンを示した。代謝産物１４と
同様に、ｍ／ｚ ２４４および１７３の生成イオンは、
Ｏ−ベンジルセリン部分のベンジル基の修飾がとれたも
のであった。ｍ／ｚ １３７のトロピリウムイオンは、
２箇所のヒドロキシル化と一致しており、これに続き、
得られたカテコール誘導体は、カテコールＯ−メチルト
ランスフェラーゼによりメチル化される。代謝産物１６ （方法Ｂ）

【００９９】

【化３９】 代謝産物１６の保持時間は約３．２分であった。ｍ／ｚ
２３０のプリカーサーイオンスキャンにおいて、プロ
トン化分子イオンがｍ／ｚ ５７８で検出された。ｍ／
ｚ ５７８のＣＩＤスペクトルは、ｍ／ｚ ５８、１４
５、１７３、２０１、２１８、２３０、３１７、および
４０２に主要生成イオンを示した。ＣＩＤスペクトル
は、分子イオンが１７６ａｍｕ大きい点を除き、代謝産
物１と類似していた。これは、第二相反応のグルクロン
酸抱合によると推論した。ｍ／ｚ２１８に生成イオンが
あったが、これは代謝産物１にはみられず、グルクロニ
ドにＣ₂Ｈ₃Ｏが付いたものと推論した。これは、セリン
のヒドロキシル基へのグルクロニド化部位がとれたもの
であった。代謝産物１７ （方法Ｂ）

【０１００】

【化４０】 代謝産物１７の保持時間は約６．０分であった。ｍ／ｚ
２４４のプリカーサーイオンスキャンにおいて、分子
イオンがｍ／ｚ ５９２で検出された。ｍ／ｚ５９２の
ＣＩＤスペクトルは、ｍ／ｚ ５８、１４５、１７３、
２１５、２４４、３３１、および４１６に主要フラグメ
ントイオンを示した。代謝産物１６と同様に、該代謝産
物は１７６ａｍｕのニュートラルロスを有し、グルクロ
ン酸抱合を示唆していた。代謝産物１８ （方法Ａ）

【０１０１】

【化４１】 代謝産物１８の保持時間は約２３．５分であった。ｍ／
ｚ ２４４のプリカーサーイオンスキャンにおいて、プ
ロトン化分子イオンがｍ／ｚ ５２２で検出され、変化
していない化合物のモノヒドロキシル化を示唆してい
た。ｍ／ｚ ５２２のＣＩＤによる生成イオンスペクト
ルは、ｍ／ｚ ７４、９１、１５３、２１５、および２
４４に主要イオンを生じた。ｍ／ｚ ２４４の生成イオ
ンは、分子のベンジルピペリジン側が修飾されていない
ことを示唆しており、したがってヒドロキシル化をα−
メチルアラニル−Ｏ−ベンジルセリン部分に限定してい
た。ｍ／ｚ ７４の生成イオンは、変化していない薬剤
からのｍ／ｚ ５８のイオンより１６ａｍｕ大きく、こ
れはα−メチルアラニンに対応していた。下垂体性成長ホルモン分泌アッセイ 培養したラット下垂体細胞からのＧＨ分泌の刺激能を有
する化合物は、以下のプロトコルを用いて同定すること
ができる。この試験はまた、標準物質との比較による投
与レベルの決定にも有用である。

【０１０２】６週齢の雄Ｗｉｓｔａｒラットの下垂体か
ら、細胞を単離する。断頭後、下垂体前葉を取り出し
て、これをカルシウムまたはマグネシウムを含まない冷
却した無菌ハンクス液（ＨＢＳＳ）に入れる。組織を細
かく切り刻んだ後、ＨＢＳＳ中の１０Ｕ／ｍｌ細菌プロ
テアーゼ（ＥＣ ３．４．２４．４，Ｓｉｇｍａ Ｐ−
６１４１）を用いて、機械で補助された酵素分散を２サ
イクル行う。組織−酵素混合物を撹拌フラスコに入れ、
５％二酸化炭素雰囲気下、約３７℃で約３０分間にわた
り３０ｒｐｍで撹拌し、約１５分後および約３０分後に
１０ｍｌピペットを用いて手で粉砕する。この混合物を
２００ｘｇで約５分間遠心分離する。上澄み液にウマ血
清を加え、余剰のプロテアーゼを中和する。ペレットを
新鮮なプロテアーゼに再度懸濁し、前記条件下でさらに
３０分間撹拌し、手で粉砕し、最後に２３ゲージ針を通
過させる。再びウマ血清を加えた後、両消化物からの細
胞を合わせ、ペレット化（２００ｘｇで約１５分間）
し、洗浄し、培養液中に再度懸濁し、計数する。細胞
を、４８ウェルＣｏｓｔａｒ皿に６．０〜６．５×１０
⁴細胞／ｃｍ²で入れ、４．５ｇ／ｌグルコース、１０％
ウマ血清、２．５％ウシ胎仔血清、１％非必須アミノ
酸、１００Ｕ／ｍｌナイスタチン、および５０ｍｇ／ｍ
ｌ硫酸ゲンタマイシンを補足したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ
ＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−Ｍ
ＥＭ）中で３〜４日間平板培養した後、ＧＨ分泌につい
てのアッセイを実施する。

【０１０３】アッセイ直前に、培養ウェルを２回洗浄
し、その後、放出用培地（release medium）（ｐＨ
７．４の２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓで緩衝され、３７℃で
０．５％ウシ血清アルブミンを含有する、Ｄ−ＭＥＭ）
中で約３０分間平衡化する。試験化合物をＤＭＳＯに溶
解し、予め加温しておいた放出用培地中で希釈する。ア
ッセイは４重に行う。アッセイは、０．５ｍｌの放出用
培地（賦形剤または試験化合物を含む）を各培養ウェル
に加えることにより開始する。約３７℃で約１５分間イ
ンキュベーションを行った後、培養液を取り除いてこれ
を終了する。この培養液を２００ｘｇで約１５分間遠心
分離し、細胞物質を取り出す。上澄み液中のラット成長
ホルモン濃度を、ラット成長ホルモン対照標準調製物
（ＮＩＤＤＫ−ｒＧＨ−ＲＰ−２）、およびＤｒ．Ａ．
Ｐａｒｌｏｗ（Ｈａｒｂｏｒ−ＵＣＬＡＭｅｄｉｃａｌ
Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）から入手し
た、サルで産生させたラット成長ホルモン抗血清（ＮＩ
ＤＤＫ−ａｎｔｉ−ｒＧＨ−Ｓ−５）を用いて、標準的
ラジオイムノアッセイプロトコルにより定量する。他の
ラット成長ホルモン（１．５Ｕ／ｍｇ，＃Ｇ２４１４，
Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｌａｂｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃ
Ａ）をトレーサーとして使用するために、クロラミンＴ
法によりこれをヨウ素化して比放射能を３０μＣｉ／μ
ｇにする。サルＩｇＧ（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｃ
ａ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）＋ポリエチレングリコール
（分子量１００００〜２００００）に、ヤギ抗血清を最
終濃度４．３％まで加えることにより免疫複合体を得；
遠心分離により回収する。このアッセイの作用範囲は、
基本的レベルを超える０．０８〜２．５μｇラット成長
ホルモン／管である。活性化合物は、典型的には成長ホ
ルモン放出を１．４倍を越えて促進する。ラットにおける試験化合物の静脈内投与後の外因性刺激
による成長ホルモン放出のアッセイ ２１日齢の雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃ
ｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｗ
ｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を、局所動物飼育条件（２
４℃、明１２時間、暗１２時間周期）で約１週間順化
し、その後化合物を試験する。ラットはすべて、水およ
び市販用飼料（Ａｇｗａｙ Ｃｏｕｎｔｒｙ Ｆｏｏ
ｄ，Ｓｙｒａｃｕｓｅ，ＮＹ）に適宜近づくことができ
る。実験は、ＮＩＨ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃ
ａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ａｌ Ａｎｉｍａｌｓに従い実施する。

【０１０４】実験当日、試験化合物を、生理食塩液中に
１％エタノール、１ｍＭ酢酸、および０．１％ウシ血清
アルブミンを含む賦形剤に溶解する。各化合物は、ｎ＝
３で試験する。ラットの体重を測定し、ペントバルビタ
ールナトリウム（Ｎｅｍｂｕｔｏｌ，５０ｍｇ／ｋｇ体
重）の腹腔内注射により麻酔する。麻酔投与の１４分
後、尾の先端に傷を付け、血液をマイクロ遠心管に滴下
させることにより、血液試料を採取する（基準血液試
料、約１００μｌ）。麻酔投与の１５分後、尾静脈への
静脈内注射（総注射量１ｍｌ／ｋｇ体重）により、試験
化合物を投与する。血液試料はさらに、試験化合物の投
与の５、１０、および１５分後に尾から採取する。遠心
分離（１４３０ｘｇ、１０℃で１０分間）により血清を
分離するまでは、血液試料を氷上で保存する。血清成長
ホルモンを上記および以下に記載のようにラジオイムノ
アッセイにより測定するまでは、血清を−８０℃で保存
する。イヌにおける経口投与後の外因性刺激による成長ホルモ
ン放出のアッセイ 実験当日、適切な投与量の試験化合物を秤量し、水に溶
解する。各投与計画について、４匹のイヌに０．５ｍｌ
/kgの容量を強制的に投与する。投与前および投与の
０．０８、０．１７、０．２５、０．５、０．７５、
１、２、４、６、および８時間後に、リチウムヘパリン
を含有する２ｍｌバキュテイナーを用いて、血液試料
（２ｍｌ）を直接的な静脈穿刺により頚静脈から採取す
る。分析するまで、調製した血漿を−２０℃で保存す
る。イヌ成長ホルモンの測定 イヌ成長ホルモンの濃度を、イヌ成長ホルモン（ヨウ素
化するための抗原および対照標準調製物ＡＦＰ−１９８
３Ｂ）およびＤｒ．Ａ．Ｐａｒｌｏｗ（Ｈａｒｂｏｒ−
ＵＣＬＡ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔｏｒｒａ
ｎｃｅ，ＣＡ）から入手した、サルで産生させたイヌ成
長ホルモン抗血清（ＡＦＰ−２１４５２５７８）を用い
て、標準的ラジオイムノアッセイプロトコルにより定量
する。トレーサーは、イヌ成長ホルモンをクロラミンＴ
法によりヨウ素化して比放射能を２０〜４０μＣｉ／μ
ｇにすることにより製造する。サルＩｇＧ（Ｏｒｇａｎ
ｏｎ Ｔｅｋｎｉｃａ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）＋ポリエ
チレングリコール（分子量１００００〜２００００）
に、ヤギ抗血清を最終濃度４．３％まで加えることによ
り免疫複合体を得；遠心分離により回収する。このアッ
セイの作用範囲は、０．０８〜２．５μｇイヌ成長ホル
モン／管である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｐ 17/02 Ａ６１Ｐ 17/02 19/08 19/08 19/10 19/10 43/00 １０７ 43/00 １０７ Ｃ０７Ｄ 231/20 Ｃ０７Ｄ 231/20 471/04 １０５ 471/04 １０５Ａ (72)発明者 ジョン・ポール・オードンネル アメリカ合衆国コネチカット州06340, グロトン，イースタン・ポイント・ロー ド，ファイザー・グローバル・リサー チ・アンド・ディベロプメント (56)参考文献 特開 平６−263737（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 5/04 - 5/08 C07D 471/04 C07D 231/20 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (33)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式（Ｉ）の化合物の精製された代謝産物 【化１】 （式（Ｉ）の前記化合物の前記代謝産物は、そのアセチ
   ル化誘導体、カルボキシル化誘導体、グルクロニド化誘
   導体、またはヒドロキシル化誘導体、あるいは該アセチ
   ル化誘導体、カルボキシル化誘導体、グルクロニド化誘
   導体、もしくはヒドロキシル化誘導体のラセミ−ジアス
   テレオマー混合物、光学異性体またはプロドラッグであ
   るか、あるいは前記代謝産物、ラセミ−ジアステレオマ
   ー混合物、光学異性体またはプロドラッグの医薬的に受
   容しうる塩である。）
2. 【請求項２】 式（Ｉ）の前記化合物の前記代謝産物
   が、アセチル化誘導体、またはそのラセミ−ジアステレ
   オマー混合物もしくは光学異性体である、請求項１に記
   載の代謝産物。
3. 【請求項３】 前記アセチル化誘導体、またはその前記
   ラセミ−ジアステレオマー混合物もしくは光学異性体
   が、 （ｉ）１．０ｍｌ／ｍｉｎ．の流量、ならびに９０％→
   ３０％ Ａ、１０％→７０％ Ｂ［０→３０ｍｉｎ．］
   で、Ａが１０ｍＭギ酸アンモニウム／１％ギ酸およびＢ
   がアセトニトリルである二元グラジエントを使用する溶
   媒系、を用いた、４．６×１５０ｍｍ、粒径３μｍのＺ
   ｏｒｂａｘ Ｒｘ Ｃ−１８カラムから約１５．７分で
   溶出し；かつ［ＭＨ］⁺＝ｍ／ｚ ５４９を有する化合
   物；そして （ｉｉ）１．０ｍｌ／ｍｉｎ．の流量、ならびに９０％
   →３０％ Ａ、１０％→７０％ Ｂ［０→３０ｍｉ
   ｎ．］で、Ａが１０ｍＭギ酸アンモニウム／１％ギ酸お
   よびＢはアセトニトリルである二元グラジエントを使用
   する溶媒系、を用いた、４．６×１５０ｍｍ、粒径３μ
   ｍのＺｏｒｂａｘ Ｒｘ Ｃ−１８カラムから約１６．
   ５分で溶出し；かつ［ＭＨ］⁺＝ｍ／ｚ ５４９を有す
   る化合物、 からなる群より選択される化合物である、請求項２に記
   載の代謝産物。
4. 【請求項４】 前記アセチル化誘導体が、化合物： 【化２】 そのラセミ−ジアステレオマー混合物および光学異性
   体、そのプロドラッグ、ならびに前記化合物、ラセミ−
   ジアステレオマー混合物、光学異性体、およびプロドラ
   ッグの医薬的に受容しうる塩であって、該化合物が［Ｍ
   Ｈ］⁺＝ｍ／ｚ ５４９を有する、請求項２に記載の代
   謝産物。
5. 【請求項５】 式（Ｉ）の前記化合物の前記代謝産物
   が、カルボキシル化誘導体、またはそのラセミ−ジアス
   テレオマー混合物もしくは光学異性体である、請求項１
   に記載の代謝産物。
6. 【請求項６】 前記カルボキシル化誘導体、またはその
   前記ラセミ−ジアステレオマー混合物もしくは光学異性
   体が、 （ｉ）１．０ｍｌ／ｍｉｎ．の流量、ならびに９０％→
   ６０％ Ａ、１０％→４０％ Ｂ［０→３０ｍｉｎ．］
   で、Ａが１０ｍＭギ酸アンモニウム／１％ギ酸およびＢ
   がアセトニトリルである二元グラジエントを使用する溶
   媒系、を用いた、４．６×１５０ｍｍ、粒径５μｍのＺ
   ｏｒｂａｘ Ｒｘ Ｃ−１８カラムから約１４．８分で
   溶出し；かつ［Ｍ＋Ｈ］⁺＝ｍ／ｚ ４６４を有する化
   合物； （ｉｉ）１．０ｍｌ／ｍｉｎ．の流量、ならびに９０％
   →６０％ Ａ、１０％→４０％ Ｂ［０→３０ｍｉ
   ｎ．］で、Ａが１０ｍＭギ酸アンモニウム／１％ギ酸お
   よびＢがアセトニトリルである二元グラジエントを使用
   する溶媒系、を用いた、４．６×１５０ｍｍ、粒径５μ
   ｍのＺｏｒｂａｘ Ｒｘ Ｃ−１８カラムから約１７分
   で溶出し；かつ［Ｍ＋Ｈ］⁺＝ｍ／ｚ ４３２を有する
   化合物； （ｉｉｉ）１．０ｍｌ／ｍｉｎ．の流量、ならびに９０
   ％→６０％ Ａ、１０％→４０％Ｂ［０→３０ｍｉ
   ｎ．］で、Ａが１０ｍＭギ酸アンモニウム／１％ギ酸お
   よびＢがアセトニトリルである二元グラジエントを使用
   する溶媒系、を用いた、４．６×１５０ｍｍ、粒径５μ
   ｍのＺｏｒｂａｘ Ｒｘ Ｃ−１８カラムから約１８．
   ５分で溶出し；かつ［Ｍ＋Ｈ］⁺＝ｍ／ｚ ４３２を有
   する化合物；そして （ｉｖ）１．０ｍｌ／ｍｉｎ．の流量、ならびに９０％
   →６０％ Ａ、１０％→４０％ Ｂ［０→３０ｍｉ
   ｎ．］で、Ａが１０ｍＭギ酸アンモニウム／１％ギ酸お
   よびＢがアセトニトリルである二元グラジエントを使用
   する溶媒系、を用いた、４．６×１５０ｍｍ、粒径５μ
   ｍのＺｏｒｂａｘ Ｒｘ Ｃ−１８カラムから約２２．
   ０分で溶出し；かつ［Ｍ＋Ｈ］⁺＝ｍ／ｚ ４４６を有
   する化合物、 からなる群より選択される化合物である、請求項５に記
   載の代謝産物。
7. 【請求項７】 前記カルボキシル化誘導体が、 【化３】 【化４】 からなる群より選択される化合物、そのラセミ−ジアス
   テレオマー混合物および光学異性体、そのプロドラッ
   グ、ならびに前記代謝産物、ラセミ−ジアステレオマー
   混合物、光学異性体、およびプロドラッグの医薬的に受
   容しうる塩であって［式中、Ｒ¹は水素またはメチルで
   ある］： （ｉ）化合物（Ｉｂ）は［Ｍ＋Ｈ］⁺＝ｍ／ｚ ４６４
   を有し； （ｉｉ）化合物（Ｉｃ）のＲ¹が水素である場合、前記
   化合物は［Ｍ＋Ｈ］⁺＝ｍ／ｚ ４３２を有し；そして （ｉｉｉ）化合物（Ｉｃ）のＲ¹がメチルである場合、
   前記化合物は［Ｍ＋Ｈ］⁺＝ｍ／ｚ４４６を有する、 請求項５に記載の代謝産物。
8. 【請求項８】 式（Ｉ）の前記化合物の前記代謝産物
   が、グルクロニド化誘導体、またはそのラセミ−ジアス
   テレオマー混合物もしくは光学異性体である、請求項１
   に記載の代謝産物。
9. 【請求項９】 前記グルクロニド化誘導体、またはその
   前記ラセミ−ジアステレオマー混合物もしくは光学異性
   体が、 （ｉ）１．０ｍｌ／ｍｉｎ．の流量、ならびに９０％→
   ６０％ Ａ、１０％→４０％ Ｂ［０→３０ｍｉｎ．］
   で、Ａが１０ｍＭギ酸アンモニウム／１％ギ酸およびＢ
   はアセトニトリルである二元グラジエントを使用する溶
   媒系、を用いた、４．６×１５０ｍｍ、粒径３μｍのＺ
   ｏｒｂａｘ Ｒｘ Ｃ−１８カラムから約３．２分で溶
   出し；かつ［Ｍ＋Ｈ］⁺＝ｍ／ｚ ５７８を有する化合
   物；そして （ｉｉ）１．０ｍｌ／ｍｉｎ．の流量、ならびに９０％
   →６０％ Ａ、１０％→４０％ Ｂ［０→３０ｍｉ
   ｎ．］で、Ａが１０ｍＭギ酸アンモニウム／１％ギ酸お
   よびＢがアセトニトリルである二元グラジエントを使用
   する溶媒系、を用いた、４．６×１５０ｍｍ、粒径３μ
   ｍのＺｏｒｂａｘ Ｒｘ Ｃ−１８カラムから約６．０
   分で溶出し；かつ［Ｍ＋Ｈ］⁺＝ｍ／ｚ ５９２を有す
   る化合物、 からなる群より選択される化合物である、請求項８に記
   載の代謝産物。
10. 【請求項１０】 前記グルクロニド化誘導体が、化合
    物： 【化５】 そのラセミ−ジアステレオマー混合物および光学異性
    体、そのプロドラッグ、ならびに前記化合物、ラセミ−
    ジアステレオマー混合物、光学異性体、およびプロドラ
    ッグの医薬的に受容しうる塩であって［式中、Ｒ¹は水
    素またはメチルである］： （ｉ）化合物（Ｉｄ）のＲ¹が水素である場合、前記化
    合物は［Ｍ＋Ｈ］⁺＝ｍ／ｚ ５７８を有し；そして （ｉｉ）化合物（Ｉｄ）のＲ¹がメチルである場合、前
    記化合物は［Ｍ＋Ｈ］⁺＝ｍ／ｚ ５９２を有する、 請求項８に記載の代謝産物。
11. 【請求項１１】 式（Ｉ）の前記化合物の前記代謝産物
    が、ヒドロキシル化誘導体、またはそのラセミ−ジアス
    テレオマー混合物もしくは光学異性体である、請求項１
    に記載の代謝産物。
12. 【請求項１２】 前記ヒドロキシル化誘導体、またはそ
    の前記ラセミ−ジアステレオマー混合物もしくは光学異
    性体が、 （ｉ）１．０ｍｌ／ｍｉｎ．の流量、ならびに９０％→
    ６０％ Ａ、１０％→４０％ Ｂ［０→３０ｍｉｎ．］
    で、Ａが１０ｍＭギ酸アンモニウム／１％ギ酸およびＢ
    がアセトニトリルである二元グラジエントを使用する溶
    媒系、を用いた、４．６×１５０ｍｍ、粒径５μｍのＺ
    ｏｒｂａｘ Ｒｘ Ｃ−１８カラムから約７．０分で溶
    出し；かつ［Ｍ＋Ｈ］⁺＝ｍ／ｚ ４０２を有する化合
    物； （ｉｉ）１．０ｍｌ／ｍｉｎ．の流量、ならびに９０％
    →６０％ Ａ、１０％→４０％ Ｂ［０→３０ｍｉ
    ｎ．］で、Ａが１０ｍＭギ酸アンモニウム／１％ギ酸お
    よびＢがアセトニトリルである二元グラジエントを使用
    する溶媒系、を用いた、４．６×１５０ｍｍ、粒径５μ
    ｍのＺｏｒｂａｘ Ｒｘ Ｃ−１８カラムから約７．０
    分で溶出し；かつ［Ｍ＋Ｈ］⁺＝ｍ／ｚ ４１６を有す
    る化合物； （ｉｉｉ）１．０ｍｌ／ｍｉｎ．の流量、ならびに９０
    ％→６０％ Ａ、１０％→４０％Ｂ［０→３０ｍｉ
    ｎ．］で、Ａが１０ｍＭギ酸アンモニウム／１％ギ酸お
    よびＢがアセトニトリルである二元グラジエントを使用
    する溶媒系、を用いた、４．６×１５０ｍｍ、粒径５μ
    ｍのＺｏｒｂａｘ Ｒｘ Ｃ−１８カラムから約１９．
    ５分で溶出し；かつ［Ｍ＋Ｈ］⁺＝ｍ／ｚ ４３２を有
    する化合物； （ｉｖ）１．０ｍｌ／ｍｉｎ．の流量、ならびに９０％
    →６０％ Ａ、１０％→４０％ Ｂ［０→３０ｍｉ
    ｎ．］で、Ａが１０ｍＭギ酸アンモニウム／１％ギ酸お
    よびＢがアセトニトリルである二元グラジエントを使用
    する溶媒系、を用いた、４．６×１５０ｍｍ、粒径５μ
    ｍのＺｏｒｂａｘ Ｒｘ Ｃ−１８カラムから約１５．
    ０分で溶出し；かつ［Ｍ＋Ｈ］⁺＝ｍ／ｚ ４１８を有
    する化合物； （ｖ）１．０ｍｌ／ｍｉｎ．の流量、ならびに９０％→
    ６０％ Ａ、１０％→４０％ Ｂ［０→３０ｍｉｎ．］
    で、Ａが１０ｍＭギ酸アンモニウム／１％ギ酸およびＢ
    がアセトニトリルである二元グラジエントを使用する溶
    媒系、を用いた、４．６×１５０ｍｍ、粒径５μｍのＺ
    ｏｒｂａｘ Ｒｘ Ｃ−１８カラムから約１５．８分で
    溶出し；かつ［Ｍ＋Ｈ］⁺＝ｍ／ｚ ４１８を有する化
    合物； （ｖｉ）１．０ｍｌ／ｍｉｎ．の流量、ならびに９０％
    →３０％ Ａ、１０％→７０％ Ｂ［０→３０ｍｉ
    ｎ．］で、Ａが１０ｍＭギ酸アンモニウム／１％ギ酸お
    よびＢがアセトニトリルである二元グラジエントを使用
    する溶媒系、を用いた、４．６×１５０ｍｍ、粒径３μ
    ｍのＺｏｒｂａｘ Ｒｘ Ｃ−１８カラムから約８．５
    分で溶出し；かつ［ＭＨ］⁺＝ｍ／ｚ ５３８を有する
    化合物； （ｖｉｉ）１．０ｍｌ／ｍｉｎ．の流量、ならびに９０
    ％→３０％ Ａ、１０％→７０％Ｂ［０→３０ｍｉ
    ｎ．］で、Ａが１０ｍＭギ酸アンモニウム／１％ギ酸お
    よびＢがアセトニトリルである二元グラジエントを使用
    する溶媒系、を用いた、４．６×１５０ｍｍ、粒径３μ
    ｍのＺｏｒｂａｘ Ｒｘ Ｃ−１８カラムから約１０．
    ２分で溶出し；かつ［ＭＨ］⁺＝ｍ／ｚ ５５２を有す
    る化合物； （ｖｉｉｉ）１．０ｍｌ／ｍｉｎ．の流量、ならびに９
    ０％→３０％ Ａ、１０％→７０％ Ｂ［０→３０ｍｉ
    ｎ．］で、Ａが１０ｍＭギ酸アンモニウム／１％ギ酸お
    よびＢがアセトニトリルである二元グラジエントを使用
    する溶媒系、を用いた、４．６×１５０ｍｍ、粒径３μ
    ｍのＺｏｒｂａｘ Ｒｘ Ｃ−１８カラムから約７．９
    分で溶出し；かつ［ＭＨ］⁺＝ｍ／ｚ ５０８を有する
    化合物； （ｉｘ）１．０ｍｌ／ｍｉｎ．の流量、ならびに９０％
    →３０％ Ａ、１０％→７０％ Ｂ［０→３０ｍｉ
    ｎ．］で、Ａが１０ｍＭギ酸アンモニウム／１％ギ酸お
    よびＢがアセトニトリルである二元グラジエントを使用
    する溶媒系、を用いた、４．６×１５０ｍｍ、粒径３μ
    ｍのＺｏｒｂａｘ Ｒｘ Ｃ−１８カラムから約９．９
    分で溶出し；かつ［ＭＨ］⁺＝ｍ／ｚ ５２２を有する
    化合物；そして （ｘ）１．０ｍｌ／ｍｉｎ．の流量、ならびに９０％→
    ６０％ Ａ、１０％→４０％ Ｂ［０→３０ｍｉｎ．］
    で、Ａが１０ｍＭギ酸アンモニウム／１％ギ酸およびＢ
    がアセトニトリルである二元グラジエントを使用する溶
    媒系、を用いた、４．６×１５０ｍｍ、粒径５μｍのＺ
    ｏｒｂａｘ Ｒｘ Ｃ−１８カラムから約２３．５分で
    溶出し；かつ［Ｍ＋Ｈ］⁺＝ｍ／ｚ ５２２を有する化
    合物、 からなる群より選択される化合物である、請求項１１に
    記載の代謝産物。
13. 【請求項１３】 前記ヒドロキシル化誘導体が、 【化６】 【化７】 【化８】 からなる群より選択される化合物、そのラセミ−ジアス
    テレオマー混合物および光学異性体、そのプロドラッ
    グ、ならびに前記代謝産物、ラセミ−ジアステレオマー
    混合物、光学異性体、およびプロドラッグの医薬的に受
    容しうる塩であって［式中、Ｒ¹は水素またはメチル、
    Ｒ²はメチルまたはＣＨ₂ＯＨ、およびＲ³は水素または
    メチルである］： （ｉ）化合物（Ｉｅ）のＲ¹が水素で、Ｒ²がメチルであ
    る場合、前記化合物は［Ｍ＋Ｈ］⁺＝ｍ／ｚ ４０２を
    有し； （ｉｉ）化合物（Ｉｅ）のＲ¹およびＲ²がともにメチル
    である場合、前記化合物は［Ｍ＋Ｈ］⁺＝ｍ／ｚ ４１
    ６を有し； （ｉｉｉ）化合物（Ｉｅ）のＲ¹がメチルで、Ｒ²がＣＨ
    ₂ＯＨである場合、前記化合物は［Ｍ＋Ｈ］⁺＝ｍ／ｚ
    ４３２を有し； （ｉｖ）化合物（Ｉｅ）のＲ¹が水素で、Ｒ²がＣＨ₂Ｏ
    Ｈである場合、前記化合物は［Ｍ＋Ｈ］⁺＝ｍ／ｚ ４
    １８を有し； （ｖ）化合物（Ｉｆ）のＲ³が水素である場合、前記化
    合物は［ＭＨ］⁺＝ｍ／ｚ ５３８を有し； （ｖｉ）化合物（Ｉｆ）のＲ³がメチルである場合、前
    記化合物は［ＭＨ］⁺＝ｍ／ｚ ５５２を有し； （ｖｉｉ）化合物（Ｉｇ）のＲ¹が水素である場合、前
    記化合物は［ＭＨ］⁺＝ｍ／ｚ ５０８を有し； （ｖｉｉｉ）化合物（Ｉｇ）のＲ¹がメチルである場
    合、前記化合物は［ＭＨ］⁺＝ｍ／ｚ５２２を有し；そ
    して （ｉｘ）化合物（Ｉｈ）は［Ｍ＋Ｈ］⁺＝ｍ／ｚ ５２
    ２を有する、 請求項１１に記載の代謝産物。
14. 【請求項１４】 有効量の請求項１に記載の代謝産物、
    そのラセミ−ジアステレオマー混合物もしくは光学異性
    体、そのプロドラッグ、または前記代謝産物、ラセミ−
    ジアステレオマー混合物、光学異性体、もしくはプロド
    ラッグの医薬的に受容しうる塩を、ヒト以外の動物に投
    与することを含む、ヒト以外の動物の内因性成長ホルモ
    ンレベルを増加させる方法。
15. 【請求項１５】 有効量の請求項１に記載の代謝産物、
    そのラセミ−ジアステレオマー混合物もしくは光学異性
    体、そのプロドラッグ、または前記代謝産物、ラセミ−
    ジアステレオマー混合物、光学異性体、もしくはプロド
    ラッグの医薬的に受容しうる塩を、ヒト以外の動物に投
    与することを含む、ヒト以外の動物の骨粗しょう症を治
    療または予防する方法。
16. 【請求項１６】 内因性成長ホルモンの放出促進に有効
    な量の請求項１に記載の代謝産物、そのラセミ−ジアス
    テレオマー混合物もしくは光学異性体、そのプロドラッ
    グ、または前記代謝産物、ラセミ−ジアステレオマー混
    合物、光学異性体、もしくはプロドラッグの医薬的に受
    容しうる塩を、ヒト以外の動物に投与することを含む、
    成長ホルモンによって治療または予防することができる
    ヒト以外の動物の疾患もしくは状態を治療または予防す
    る方法。
17. 【請求項１７】 前記疾患または状態が、うっ血性心不
    全、老化による脆弱、年齢に伴う行動体力の低下、また
    は肥満である、請求項１６に記載の方法。
18. 【請求項１８】 骨折の修復を促進する方法、手術後の
    タンパク異化反応を弱化する方法、慢性疾患による悪液
    質およびタンパク喪失を減少させる方法、創傷治癒を促
    進する方法、またはヒト以外の熱傷患者もしくは大手術
    を受けたヒト以外の患者の回復を促進する方法であっ
    て、そのような治療を必要とするヒト以外の動物に、内
    因性成長ホルモンの放出促進に有効な量の請求項１に記
    載の代謝産物、そのラセミ−ジアステレオマー混合物も
    しくは光学異性体、そのプロドラッグ、または前記代謝
    産物、ラセミ−ジアステレオマー混合物、光学異性体、
    もしくはプロドラッグの医薬的に受容しうる塩を投与す
    ることを含む、前記方法。
19. 【請求項１９】 ヒト以外の動物の筋力、運動性、皮膚
    の厚みの維持、代謝恒常性を改善する方法であって、内
    因性成長ホルモンの放出促進に有効な量の請求項１に記
    載の代謝産物、そのラセミ−ジアステレオマー混合物も
    しくは光学異性体、そのプロドラッグ、または前記代謝
    産物、ラセミ−ジアステレオマー混合物、光学異性体、
    もしくはプロドラッグの医薬的に受容しうる塩を、前記
    動物に投与することを含む、前記方法。
20. 【請求項２０】 ヒト以外の動物の骨粗しょう症を治療
    または予防する方法であって、ビスホスホネート化合物
    および請求項１に記載の代謝産物、そのラセミ−ジアス
    テレオマー混合物もしくは光学異性体、そのプロドラッ
    グ、または前記代謝産物、ラセミ−ジアステレオマー混
    合物、光学異性体、もしくはプロドラッグの医薬的に受
    容しうる塩を、前記動物に投与することを含む、前記方
    法。
21. 【請求項２１】 前記ビスホスホネート化合物がアレン
    ドロネートである、請求項２１に記載の方法。
22. 【請求項２２】 ヒト以外の動物の骨粗しょう症を治療
    または予防する方法であって、エストロゲンまたはＰｒ
    ｅｍａｒｉｎ（登録商標）と、請求項１に記載の代謝産
    物、そのラセミ−ジアステレオマー混合物もしくは光学
    異性体、そのプロドラッグ、または前記代謝産物、ラセ
    ミ−ジアステレオマー混合物、光学異性体、もしくはプ
    ロドラッグの医薬的に受容しうる塩を組み合わせたも
    の、および所望によりプロゲステロンを、前記動物に投
    与することを含む、前記方法。
23. 【請求項２３】請求項１に記載の代謝産物、そのラセミ
    −ジアステレオマー混合物もしくは光学異性体、そのプ
    ロドラッグ、または前記代謝産物、ラセミ−ジアステレ
    オマー混合物、光学異性体、もしくはプロドラッグの医
    薬的に受容しうる塩；および医薬的に受容しうる担体、
    賦形剤または希釈剤を含む、医薬組成物。
24. 【請求項２４】 前記代謝産物が、そのアセチル化誘導
    体、カルボキシル化誘導体、グルクロニド化誘導体、ま
    たはヒドロキシル化誘導体、そのラセミ−ジアステレオ
    マー混合物もしくは光学異性体、そのプロドラッグ、あ
    るいは前記代謝産物、ラセミ−ジアステレオマー混合
    物、光学異性体またはプロドラッグの医薬的に受容しう
    る塩である、請求項２３に記載の組成物。
25. 【請求項２５】 有効量の請求項２３に記載の組成物を
    ヒト以外の動物に投与することを含む、ヒト以外の動物
    の内因性成長ホルモンレベルを増加させる方法。
26. 【請求項２６】 有効量の請求項２３に記載の組成物を
    ヒト以外の動物に投与することを含む、ヒト以外の動物
    の骨粗しょう症を治療または予防する方法。
27. 【請求項２７】 内因性成長ホルモンの放出促進に有効
    な量の請求項２３に記載の組成物をヒト以外の動物に投
    与することを含む、成長ホルモンによって治療または予
    防することができるヒト以外の動物の疾患もしくは状態
    を治療または予防する方法。
28. 【請求項２８】 前記疾患または状態が、うっ血性心不
    全、老化による脆弱、年齢に伴う行動体力の低下、また
    は肥満である、請求項２６に記載の方法。
29. 【請求項２９】 骨折の修復を促進する方法、手術後の
    タンパク異化反応を弱化する方法、慢性疾患による悪液
    質およびタンパク喪失を減少させる方法、創傷治癒を促
    進する方法、またはヒト以外の熱傷患者もしくは大手術
    を受けたヒト以外の患者の回復を促進する方法であっ
    て、そのような治療を必要とするヒト以外の動物に、内
    因性成長ホルモンの放出促進に有効な量の請求項２３に
    記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
30. 【請求項３０】 ヒト以外の動物の筋力、運動性、皮膚
    の厚みの維持、代謝恒常性を改善する方法であって、内
    因性成長ホルモンの放出促進に有効な量の請求項２３に
    記載の組成物を、前記動物に投与することを含む、前記
    方法。
31. 【請求項３１】 ヒト以外の動物の骨粗しょう症を治療
    または予防する方法であって、エストロゲンまたはＰｒ
    ｅｍａｒｉｎ（登録商標）および請求項２３に記載の組
    成物を組み合わせたもの、ならびに所望によりプロゲス
    テロンを、前記動物に投与することを含む、前記方法。
32. 【請求項３２】 第１の単位剤形中に、請求項１に記載
    の代謝産物、そのラセミ−ジアステレオマー混合物もし
    くは光学異性体、そのプロドラッグ、または該代謝産
    物、ラセミ−ジアステレオマー混合物、光学異性体、も
    しくはプロドラッグの医薬的に受容しうる塩、および医
    薬的に受容しうる担体、賦形剤または希釈剤；第２の単
    位剤形中に、エストロゲン、Ｐｒｅｍａｒｉｎ（登録商
    標）、プロゲステロン、またはビスホスホネート化合
    物、および医薬的に受容しうる担体、賦形剤または希釈
    剤；ならびに容器、 を含むキット。
33. 【請求項３３】 前記ビスホスホネート化合物がアレン
    ドロネートである、請求項３２に記載のキット。