JP3439492B2 - ヒトヘルペスウイルス６型（ｈｈｖ−６）ｄｎａの検出及びサブタイプ識別方法 - Google Patents
ヒトヘルペスウイルス６型（ｈｈｖ−６）ｄｎａの検出及びサブタイプ識別方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトヘルペスウイルス
６型（ＨＨＶ−６）ＤＮＡの検出、並びにＨＨＶ−６の
サブタイプの識別を行う方法に関する。
６型（ＨＨＶ−６）ＤＮＡの検出、並びにＨＨＶ−６の
サブタイプの識別を行う方法に関する。
【０００２】
【従来の技術とその問題点】ヒトヘルペスウイルス６型
（以下、ＨＨＶ−６と称する）は、１９８６年にSaluhu
ddin等によって後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）患
者、及びリンパ球系疾患患者のリンパ球より第６番目の
ヘルペスウイルスとして分離され（1986, Science, 23
4, 596-601 ）、１９８８年、山西等によって突発性発
疹の原因ウイルスであることが明らかにされた（1988,
Lancet, 1065-1067 ）。
（以下、ＨＨＶ−６と称する）は、１９８６年にSaluhu
ddin等によって後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）患
者、及びリンパ球系疾患患者のリンパ球より第６番目の
ヘルペスウイルスとして分離され（1986, Science, 23
4, 596-601 ）、１９８８年、山西等によって突発性発
疹の原因ウイルスであることが明らかにされた（1988,
Lancet, 1065-1067 ）。
【０００３】ＨＨＶ−６は当初ヒト免疫不全ウイルス
（ＨＩＶ）陽性リンパ腫及びリンパ腺炎、又ＨＩＶ陰性
のリンパ腫より分離されており、又Ｂリンパ腫にＨＨＶ
−６ＤＮＡが見いだされるなど、何らかの血液系疾患に
関与している可能性が示唆されている。又、腎移植後、
ＨＨＶ−６抗体価が著名に上昇し、拒絶反応の起こった
患者リンパ球よりＨＨＶ−６が分離される等、臓器移植
後の拒絶反応との関係も示唆されている（1990, Transp
lantation, 49, 519〜522 ）。
（ＨＩＶ）陽性リンパ腫及びリンパ腺炎、又ＨＩＶ陰性
のリンパ腫より分離されており、又Ｂリンパ腫にＨＨＶ
−６ＤＮＡが見いだされるなど、何らかの血液系疾患に
関与している可能性が示唆されている。又、腎移植後、
ＨＨＶ−６抗体価が著名に上昇し、拒絶反応の起こった
患者リンパ球よりＨＨＶ−６が分離される等、臓器移植
後の拒絶反応との関係も示唆されている（1990, Transp
lantation, 49, 519〜522 ）。
【０００４】大多数の人においては、ＨＨＶ−６の感染
は、生後１年以内に成立することが抗体保有率に関する
調査より明らかとなっているが（1989 J. Clin. Microb
iol.27, 651-653 ）、ウイルスの感染経路はいまだ明ら
かではない。唾液からＨＨＶ−６が分離された、という
報告も見受けられる。
は、生後１年以内に成立することが抗体保有率に関する
調査より明らかとなっているが（1989 J. Clin. Microb
iol.27, 651-653 ）、ウイルスの感染経路はいまだ明ら
かではない。唾液からＨＨＶ−６が分離された、という
報告も見受けられる。
【０００５】最近、ＨＨＶ−６はＤＮＡの多型性から２
つのサブタイプに分けられており（1991 J. Clin. Micr
obiol 29, 367-372 ）、タイプ間での病原性の違い、細
胞親和性の違い、及び増殖性の違いといった生物学的性
状にどの様な差異があるか注目されている。これまで
に、ＡＩＤＳ患者や、リンパ球系疾患患者からはタイプ
ＡのＨＨＶ−６が主に分離されているが、Pruksannonda
等はＨＨＶ−６の初感染によって発熱したと思われる患
児から分離されたＨＨＶ−６は全てタイプＢであったと
報告している（1992, The New England Journal of Med
icine, 326, 1445-1550 ）。
つのサブタイプに分けられており（1991 J. Clin. Micr
obiol 29, 367-372 ）、タイプ間での病原性の違い、細
胞親和性の違い、及び増殖性の違いといった生物学的性
状にどの様な差異があるか注目されている。これまで
に、ＡＩＤＳ患者や、リンパ球系疾患患者からはタイプ
ＡのＨＨＶ−６が主に分離されているが、Pruksannonda
等はＨＨＶ−６の初感染によって発熱したと思われる患
児から分離されたＨＨＶ−６は全てタイプＢであったと
報告している（1992, The New England Journal of Med
icine, 326, 1445-1550 ）。
【０００６】このように、ＨＨＶ−６のタイピング、即
ち型の決定は種々の疾患との関連で興味深いものと考え
られる。ところが、従来ＨＨＶ−６のタイピングに利用
されていた方法は、分離したウイルスからＤＮＡを抽出
精製し、制限酵素によってウイルスＤＮＡを消化後、電
気泳動にかけ、その電気泳動パターンによって多型性を
調べるか、タイプＡ及びタイプＢそれぞれに特異的なモ
ノクローナル抗体を利用してウイルス感染細胞を蛍光抗
体法で染色することによって同定されてきた。しかしこ
れらの方法は、何れもウイルスの分離、培養等の操作を
伴うものであり、非常に時間と労力を必要とするばかり
か、ウイルスの分離ができなければ同定することは不可
能であった。
ち型の決定は種々の疾患との関連で興味深いものと考え
られる。ところが、従来ＨＨＶ−６のタイピングに利用
されていた方法は、分離したウイルスからＤＮＡを抽出
精製し、制限酵素によってウイルスＤＮＡを消化後、電
気泳動にかけ、その電気泳動パターンによって多型性を
調べるか、タイプＡ及びタイプＢそれぞれに特異的なモ
ノクローナル抗体を利用してウイルス感染細胞を蛍光抗
体法で染色することによって同定されてきた。しかしこ
れらの方法は、何れもウイルスの分離、培養等の操作を
伴うものであり、非常に時間と労力を必要とするばかり
か、ウイルスの分離ができなければ同定することは不可
能であった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】上述した様に、ＨＨＶ
−６のタイピングは、種々の疾患との関連で興味深いも
のと考えられるが、従来の技術は何れも細胞培養による
ウイルス分離を伴うものであり、非常に煩雑であった。
−６のタイピングは、種々の疾患との関連で興味深いも
のと考えられるが、従来の技術は何れも細胞培養による
ウイルス分離を伴うものであり、非常に煩雑であった。
【０００８】本発明は、上記問題を解決する為のＨＨＶ
−６タイプ特異的ＤＮＡを提供すること、及びＨＨＶ−
６タイピングの簡便な方法を提供することを目的とする
ものである。
−６タイプ特異的ＤＮＡを提供すること、及びＨＨＶ−
６タイピングの簡便な方法を提供することを目的とする
ものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者等は上記課題を
解決するために、ＨＨＶ−６タイプＢに属するＨＳＴ株
（K. Takahashiら、 J. Virol., 3161〜3163, 1989）の
前初期遺伝子の一つについてその塩基配列を決定し、既
報のＨＨＶ−６タイプＡに属するＵ１１０２株の同領域
の塩基配列（1991, J. Virol 65, 5381-5390）と比較し
た。その結果、ＨＳＴ株とＵ１１０２株の塩基配列の間
に特徴的な差異を見いだし、本発明を完成するに至っ
た。即ち、本発明者等がその塩基配列解析を行ったＨＳ
Ｔ株と、既報のＵ１１０２株の前初期遺伝子内におい
て、ＨＳＴ株にはＵ１１０２株には見られない新規の２
ヵ所のポリヌクレオチドの挿入が認められた（図１参
照）。１ヵ所は１０８ bp であり、もう１カ所は２２８
bp であった。それぞれの塩基配列を配列番号１及び２
としてそれぞれ後記配列表中に示した。
解決するために、ＨＨＶ−６タイプＢに属するＨＳＴ株
（K. Takahashiら、 J. Virol., 3161〜3163, 1989）の
前初期遺伝子の一つについてその塩基配列を決定し、既
報のＨＨＶ−６タイプＡに属するＵ１１０２株の同領域
の塩基配列（1991, J. Virol 65, 5381-5390）と比較し
た。その結果、ＨＳＴ株とＵ１１０２株の塩基配列の間
に特徴的な差異を見いだし、本発明を完成するに至っ
た。即ち、本発明者等がその塩基配列解析を行ったＨＳ
Ｔ株と、既報のＵ１１０２株の前初期遺伝子内におい
て、ＨＳＴ株にはＵ１１０２株には見られない新規の２
ヵ所のポリヌクレオチドの挿入が認められた（図１参
照）。１ヵ所は１０８ bp であり、もう１カ所は２２８
bp であった。それぞれの塩基配列を配列番号１及び２
としてそれぞれ後記配列表中に示した。
【００１０】新規の１０８ bp 及び２２８ bp ポリヌク
レオチド配列は、図２に示すＨＨＶ−６のタイピングの
結果からも明らかなように、タイプＢに属するＨＨＶ−
６株に特徴的な配列であると考えられる。
レオチド配列は、図２に示すＨＨＶ−６のタイピングの
結果からも明らかなように、タイプＢに属するＨＨＶ−
６株に特徴的な配列であると考えられる。
【００１１】従って、本発明は、配列番号１に示される
ヒトヘルペスウイルス６型由来のヌクレオチド配列若し
くは該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
又はその部分配列を提供する。本発明はまた、配列番号
２に示されるヒトヘルペスウイルス６型由来のヌクレオ
チド配列若しくは該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレ
オチド配列、又はその部分配列を提供する。
ヒトヘルペスウイルス６型由来のヌクレオチド配列若し
くは該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
又はその部分配列を提供する。本発明はまた、配列番号
２に示されるヒトヘルペスウイルス６型由来のヌクレオ
チド配列若しくは該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレ
オチド配列、又はその部分配列を提供する。
【００１２】本明細書中、「ＨＨＶ−６（サブ）タイプ
Ｂ」なる用語は、配列番号１及び２にそれぞれ示される
ポリヌクレオチド配列をウイルスＤＮＡ中に含むタイプ
のＨＨＶ−６に言及して使用する。また、「ＨＨＶ−６
（サブ）タイプＡ」なる用語は、そのようなポリヌクレ
オチド配列を共に含まないタイプのＨＨＶ−６に言及し
て使用する。
Ｂ」なる用語は、配列番号１及び２にそれぞれ示される
ポリヌクレオチド配列をウイルスＤＮＡ中に含むタイプ
のＨＨＶ−６に言及して使用する。また、「ＨＨＶ−６
（サブ）タイプＡ」なる用語は、そのようなポリヌクレ
オチド配列を共に含まないタイプのＨＨＶ−６に言及し
て使用する。
【００１３】それ故、ＨＨＶ−６のタイプＡとタイプＢ
の上記差異を利用することによって、例えば、タイプＢ
に特徴的なＤＮＡ配列をプローブとして用いるＤＮＡハ
イブリダイゼーションによって、ＨＨＶ−６のサブタイ
プ（Ａ及びＢ）を識別することができる。
の上記差異を利用することによって、例えば、タイプＢ
に特徴的なＤＮＡ配列をプローブとして用いるＤＮＡハ
イブリダイゼーションによって、ＨＨＶ−６のサブタイ
プ（Ａ及びＢ）を識別することができる。
【００１４】このように、本発明は、配列番号１に示さ
れるＨＨＶ−６由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌク
レオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその部分
配列をプローブとして使用するＤＮＡハイブリダイゼー
ションによってヒトヘルペスウイルス６型のサブタイプ
Ａ及びＢを識別する方法を提供する。
れるＨＨＶ−６由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌク
レオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその部分
配列をプローブとして使用するＤＮＡハイブリダイゼー
ションによってヒトヘルペスウイルス６型のサブタイプ
Ａ及びＢを識別する方法を提供する。
【００１５】本発明はまた、配列番号２に示されるＨＨ
Ｖ−６由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌクレオチド
配列に相補的なヌクレオチド配列又はその部分配列をプ
ローブとして使用するＤＮＡハイブリダイゼーションに
よってヒトヘルペスウイルス６型のサブタイプＡ及びＢ
を識別する方法を提供する。
Ｖ−６由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌクレオチド
配列に相補的なヌクレオチド配列又はその部分配列をプ
ローブとして使用するＤＮＡハイブリダイゼーションに
よってヒトヘルペスウイルス６型のサブタイプＡ及びＢ
を識別する方法を提供する。
【００１６】本発明はさらに、配列番号１及び２に示さ
れるＨＨＶ−６由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌク
レオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその部分
配列の両方をプローブとして使用するＤＮＡハイブリダ
イゼーションによってヒトヘルペスウイルス６型のサブ
タイプＡ及びＢを識別する方法を提供する。
れるＨＨＶ−６由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌク
レオチド配列に相補的なヌクレオチド配列又はその部分
配列の両方をプローブとして使用するＤＮＡハイブリダ
イゼーションによってヒトヘルペスウイルス６型のサブ
タイプＡ及びＢを識別する方法を提供する。
【００１７】ＤＮＡハイブリダイゼーションについて
は、Molecular Cloning, 1989 等に記載の技術が適用さ
れる。このとき、標識ＤＮＡの標識物質としては、酵素
（例えばアルカリホスファターゼ）、ラジオアイソトー
プ（例えば32Ｐ）等が使用される。
は、Molecular Cloning, 1989 等に記載の技術が適用さ
れる。このとき、標識ＤＮＡの標識物質としては、酵素
（例えばアルカリホスファターゼ）、ラジオアイソトー
プ（例えば32Ｐ）等が使用される。
【００１８】血液等のヒト検体中のＨＨＶ−６含有量が
少ない場合、例えば感染初期の場合には、前記１０８ b
p 及び２２８ bp 挿入領域をはさみ、タイプＡ及びＢに
共通な配列を持つプライマーセットを用いてポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行ってＤＮＡ増幅するならば、
ＰＣＲ産物の長さの違いから両タイプを識別することが
可能となる。
少ない場合、例えば感染初期の場合には、前記１０８ b
p 及び２２８ bp 挿入領域をはさみ、タイプＡ及びＢに
共通な配列を持つプライマーセットを用いてポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行ってＤＮＡ増幅するならば、
ＰＣＲ産物の長さの違いから両タイプを識別することが
可能となる。
【００１９】上記目的で使用し得るプライマーセットの
好適例を下記に列挙する。これらのプライマーセット
は、ＨＨＶ−６タイプＢのＤＮＡ上に存在する新規の１
０８bp及び２２８bpヌクレオチド配列近傍のＨＨＶ−６
タイプＡ及びタイプＢ ＤＮＡの共通配列の中から特定
的に選択したものである。実際にプライマーとして利用
される配列はプライマーセットの配列に示されたヌクレ
オチド配列の部分配列又は全配列である。また、下記に
列挙するヌクレオチド配列以外にも、決定された配列に
基づいて種々の可能な配列を選択し本発明の識別方法に
適用することも可能であろう。
好適例を下記に列挙する。これらのプライマーセット
は、ＨＨＶ−６タイプＢのＤＮＡ上に存在する新規の１
０８bp及び２２８bpヌクレオチド配列近傍のＨＨＶ−６
タイプＡ及びタイプＢ ＤＮＡの共通配列の中から特定
的に選択したものである。実際にプライマーとして利用
される配列はプライマーセットの配列に示されたヌクレ
オチド配列の部分配列又は全配列である。また、下記に
列挙するヌクレオチド配列以外にも、決定された配列に
基づいて種々の可能な配列を選択し本発明の識別方法に
適用することも可能であろう。
【００２０】プライマーセット−１
プライマーＩ：
５’−ＴＧＡＴＧＧＣＡＣＡＣＡＡＣＡＡＡＧＡＧＡＴ
ＧＴＣＣＡＡＴＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＣＣＡ−３’ ５’−ＡＡＧＣＡＧＡＴＧＡＡＴＣＡＡＡＴＣＴＴ−
３’ ５’−ＡＴＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＡＡＡＴＴＴＡＡＴ
ＴＡＣＴＧＣＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴ−３’ ５’−ＴＧＡＡＴＴＴＴＣＡＴＧＧＣＡＡ−３’ ５’−ＴＴＡＴＧＡＴＧＡＴＡＣＴＧＧＴＴＴ−３’ ５’−ＡＴＴＡＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＴ−３’ ５’−ＡＧＴＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＴＧＡＴ−３’ ５’−ＡＴＡＴＴＣＡＧＡＧＧＡＡＴＣＴＴＣＴＡＴＣ
ＧＡＡＴＣＴＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＣ−
３’ プライマーII： ５’−ＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＡＴＣＴＧＧＡ
ＧＡＡ−３’ ５’−ＴＧＧＡＴＡＣＡＴＴＴＴ−３’ ５’−ＴＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧＴ−３’ ５’−ＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣ−３’ ５’−ＣＴＧＴＣＴＧＣＴ−３’ ５’−ＴＡＣＡＣＡＧＴＴＡＧＧＧ−３’ ５’−ＡＧＧＧＣＣＧＣＣＣＡＧＡＴＣＴＧＴＣＡＣＴ
ＧＡＧＧＣＴＧＴＡＣ−３’ ５’−ＴＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＡＴＣＴＧＧＡＧＡＡＧ
ＧＡＧ−３’プライマーセット−２ プライマーＩ： ５’−ＴＴＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡ
ＴＣＣ−３’ ５’−ＡＡＡＡＴＧＴＡＴＣＣＡ−３’ ５’−ＡＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＡ−３’ ５’−ＧＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＴＣＣＡＡＡ−３’ ５’−ＡＧＣＡＧＡＣＡＧ−３’ ５’−ＣＣＣＴＡＡＣＴＧＴＧＴＡ−３’ ５’−ＧＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＣＡＧＡＴＣＴ
ＧＧＧＣＧＧＣＣＣＴ−３’ ５’−ＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＡＧＧ
ＧＡＡ−３’ プライマーII： ５’−ＡＴＣＡＴＴＴＣＴＧＡＴＡＴＴＡＡＡＧ−３’ ５’−ＧＡＧＴＧＡＴＣＡＧＴＴＴＣＡＴＡＡＣＣＡＡ
Ａ−３’ ５’−ＴＴＴＣＡＴＣＡＴＴＧＴＴＡＴＣＧＣＴＴＴＣ
ＡＣＴＣＴＣＡＴＡ−３’ ５’−ＴＧＣＡＡＴＧＴＡＡＴＣＡ−３’ ５’−ＴＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡＡＴＧＴＴＡＴＴＡＧＴ
ＴＣＴ−３’ ５’−ＴＴＧＣＴＡＡＡＴＧＧＴＧＴＡＴＴＣＴＣＡＴ
−３’ ５’−ＧＴＧＡＣＣＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡ−３’プライマーセット−３ プライマーＩ： ５’−ＴＧＡＴＧＧＣＡＣＡＣＡＡＣＡＡＡＧＡＧＡＴ
ＧＴＣＣＡＡＴＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＣＣＡ−３’ ５’−ＡＡＧＣＡＧＡＴＧＡＡＴＣＡＡＡＴＣＴＴ−
３’ ５’−ＡＴＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＡＡＡＴＴＴＡＡＴ
ＴＡＣＴＧＣＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴ−３’ ５’−ＴＧＡＡＴＴＴＴＣＡＴＧＧＣＡＡ−３’ ５’−ＴＴＡＴＧＡＴＧＡＴＡＣＴＧＧＴＴＴ−３’ ５’−ＡＴＴＡＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＴ−３’ ５’−ＡＧＴＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＴＧＡＴ−３’ ５’−ＡＴＡＴＴＣＡＧＡＧＧＡＡＴＣＴＴＣＴＡＴＣ
ＧＡＡＴＣＴＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＣ−
３’ プライマーII： ５’−ＡＴＣＡＴＴＴＣＴＧＡＴＡＴＴＡＡＡＧ−３’ ５’−ＧＡＧＴＧＡＴＣＡＧＴＴＴＣＡＴＡＡＣＣＡＡ
Ａ−３’ ５’−ＴＴＴＣＡＴＣＡＴＴＧＴＴＡＴＣＧＣＴＴＴＣ
ＡＣＴＣＴＣＡＴＡ−３’ ５’−ＴＧＣＡＡＴＧＴＡＡＴＣＡ−３’ ５’−ＴＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡＡＴＧＴＴＡＴＴＡＧＴ
ＴＣＴ−３’ ５’−ＴＴＧＣＴＡＡＡＴＧＧＴＧＴＡＴＴＣＴＣＡＴ
−３’ ５’−ＧＴＧＡＣＣＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡ−３’。
ＧＴＣＣＡＡＴＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＣＣＡ−３’ ５’−ＡＡＧＣＡＧＡＴＧＡＡＴＣＡＡＡＴＣＴＴ−
３’ ５’−ＡＴＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＡＡＡＴＴＴＡＡＴ
ＴＡＣＴＧＣＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴ−３’ ５’−ＴＧＡＡＴＴＴＴＣＡＴＧＧＣＡＡ−３’ ５’−ＴＴＡＴＧＡＴＧＡＴＡＣＴＧＧＴＴＴ−３’ ５’−ＡＴＴＡＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＴ−３’ ５’−ＡＧＴＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＴＧＡＴ−３’ ５’−ＡＴＡＴＴＣＡＧＡＧＧＡＡＴＣＴＴＣＴＡＴＣ
ＧＡＡＴＣＴＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＣ−
３’ プライマーII： ５’−ＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＡＴＣＴＧＧＡ
ＧＡＡ−３’ ５’−ＴＧＧＡＴＡＣＡＴＴＴＴ−３’ ５’−ＴＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧＴ−３’ ５’−ＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣ−３’ ５’−ＣＴＧＴＣＴＧＣＴ−３’ ５’−ＴＡＣＡＣＡＧＴＴＡＧＧＧ−３’ ５’−ＡＧＧＧＣＣＧＣＣＣＡＧＡＴＣＴＧＴＣＡＣＴ
ＧＡＧＧＣＴＧＴＡＣ−３’ ５’−ＴＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＡＴＣＴＧＧＡＧＡＡＧ
ＧＡＧ−３’プライマーセット−２ プライマーＩ： ５’−ＴＴＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡ
ＴＣＣ−３’ ５’−ＡＡＡＡＴＧＴＡＴＣＣＡ−３’ ５’−ＡＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＡ−３’ ５’−ＧＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＴＣＣＡＡＡ−３’ ５’−ＡＧＣＡＧＡＣＡＧ−３’ ５’−ＣＣＣＴＡＡＣＴＧＴＧＴＡ−３’ ５’−ＧＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＣＡＧＡＴＣＴ
ＧＧＧＣＧＧＣＣＣＴ−３’ ５’−ＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＡＧＧ
ＧＡＡ−３’ プライマーII： ５’−ＡＴＣＡＴＴＴＣＴＧＡＴＡＴＴＡＡＡＧ−３’ ５’−ＧＡＧＴＧＡＴＣＡＧＴＴＴＣＡＴＡＡＣＣＡＡ
Ａ−３’ ５’−ＴＴＴＣＡＴＣＡＴＴＧＴＴＡＴＣＧＣＴＴＴＣ
ＡＣＴＣＴＣＡＴＡ−３’ ５’−ＴＧＣＡＡＴＧＴＡＡＴＣＡ−３’ ５’−ＴＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡＡＴＧＴＴＡＴＴＡＧＴ
ＴＣＴ−３’ ５’−ＴＴＧＣＴＡＡＡＴＧＧＴＧＴＡＴＴＣＴＣＡＴ
−３’ ５’−ＧＴＧＡＣＣＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡ−３’プライマーセット−３ プライマーＩ： ５’−ＴＧＡＴＧＧＣＡＣＡＣＡＡＣＡＡＡＧＡＧＡＴ
ＧＴＣＣＡＡＴＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＣＣＡ−３’ ５’−ＡＡＧＣＡＧＡＴＧＡＡＴＣＡＡＡＴＣＴＴ−
３’ ５’−ＡＴＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＡＡＡＴＴＴＡＡＴ
ＴＡＣＴＧＣＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴ−３’ ５’−ＴＧＡＡＴＴＴＴＣＡＴＧＧＣＡＡ−３’ ５’−ＴＴＡＴＧＡＴＧＡＴＡＣＴＧＧＴＴＴ−３’ ５’−ＡＴＴＡＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＴ−３’ ５’−ＡＧＴＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＴＧＡＴ−３’ ５’−ＡＴＡＴＴＣＡＧＡＧＧＡＡＴＣＴＴＣＴＡＴＣ
ＧＡＡＴＣＴＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＣ−
３’ プライマーII： ５’−ＡＴＣＡＴＴＴＣＴＧＡＴＡＴＴＡＡＡＧ−３’ ５’−ＧＡＧＴＧＡＴＣＡＧＴＴＴＣＡＴＡＡＣＣＡＡ
Ａ−３’ ５’−ＴＴＴＣＡＴＣＡＴＴＧＴＴＡＴＣＧＣＴＴＴＣ
ＡＣＴＣＴＣＡＴＡ−３’ ５’−ＴＧＣＡＡＴＧＴＡＡＴＣＡ−３’ ５’−ＴＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡＡＴＧＴＴＡＴＴＡＧＴ
ＴＣＴ−３’ ５’−ＴＴＧＣＴＡＡＡＴＧＧＴＧＴＡＴＴＣＴＣＡＴ
−３’ ５’−ＧＴＧＡＣＣＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡ−３’。
【００２１】たとえば、上記プライマーセット−１を用
いた場合、そのＰＣＲ増幅産物の長さは、ＨＨＶ−６タ
イプＢ株ではタイプＡ株より１０８ bp 長くなる。ま
た、プライマーセット−２を用いた場合、タイプＢ株で
はタイプＡ株より２２８ bp 長くなる。またプライマー
セット−３を用いた場合、タイプＢ株ではタイプＡ株よ
り３３６ bp 長くなる。何れのプライマーセットを用い
た場合でもＨＨＶ−６タイプＢ株とタイプＡ株でのＰＣ
Ｒ産物の長さには大きな違いが生じるため、通常のアガ
ロースゲル電気泳動等のサイズ分析によって容易に両株
を識別することが可能である。
いた場合、そのＰＣＲ増幅産物の長さは、ＨＨＶ−６タ
イプＢ株ではタイプＡ株より１０８ bp 長くなる。ま
た、プライマーセット−２を用いた場合、タイプＢ株で
はタイプＡ株より２２８ bp 長くなる。またプライマー
セット−３を用いた場合、タイプＢ株ではタイプＡ株よ
り３３６ bp 長くなる。何れのプライマーセットを用い
た場合でもＨＨＶ−６タイプＢ株とタイプＡ株でのＰＣ
Ｒ産物の長さには大きな違いが生じるため、通常のアガ
ロースゲル電気泳動等のサイズ分析によって容易に両株
を識別することが可能である。
【００２２】従って、本発明は、上記プライマーセット
−１の中から各々一種ずつ選択されたプライマーＩ及び
IIの組合わせを用いて、検体中のヒトヘルペスウイルス
６型（ＨＨＶ−６）ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応を行
って該ＨＨＶ−６ＤＮＡを増幅した後、その増幅産物を
サイズ分析に掛けて、配列番号１に示されるＨＨＶ−６
由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌクレオチド配列に
相補的なヌクレオチド配列又はその部分配列を含有する
ＨＨＶ−６ＤＮＡと該配列を含有しないＨＨＶ−６ＤＮ
Ａとに分離して、ＨＨＶ−６のサブタイプＡ及びＢを識
別する方法を提供する。
−１の中から各々一種ずつ選択されたプライマーＩ及び
IIの組合わせを用いて、検体中のヒトヘルペスウイルス
６型（ＨＨＶ−６）ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応を行
って該ＨＨＶ−６ＤＮＡを増幅した後、その増幅産物を
サイズ分析に掛けて、配列番号１に示されるＨＨＶ−６
由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌクレオチド配列に
相補的なヌクレオチド配列又はその部分配列を含有する
ＨＨＶ−６ＤＮＡと該配列を含有しないＨＨＶ−６ＤＮ
Ａとに分離して、ＨＨＶ−６のサブタイプＡ及びＢを識
別する方法を提供する。
【００２３】本発明はまた、上記プライマーセット−２
の中から各々一種ずつ選択されたプライマーＩ及びIIの
組合わせを用いて、検体中のヒトヘルペスウイルス６型
（ＨＨＶ−６）ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応を行って
該ＨＨＶ−６ＤＮＡを増幅した後、その増幅産物をサイ
ズ分析に掛けて、配列番号２に示されるＨＨＶ−６由来
のヌクレオチド配列若しくは該ヌクレオチド配列に相補
的なヌクレオチド配列又はその部分配列を含有するＨＨ
Ｖ−６ＤＮＡと該配列を含有しないＨＨＶ−６ＤＮＡと
に分離して、ＨＨＶ−６のサブタイプＡ及びＢを識別す
る方法を提供する。
の中から各々一種ずつ選択されたプライマーＩ及びIIの
組合わせを用いて、検体中のヒトヘルペスウイルス６型
（ＨＨＶ−６）ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応を行って
該ＨＨＶ−６ＤＮＡを増幅した後、その増幅産物をサイ
ズ分析に掛けて、配列番号２に示されるＨＨＶ−６由来
のヌクレオチド配列若しくは該ヌクレオチド配列に相補
的なヌクレオチド配列又はその部分配列を含有するＨＨ
Ｖ−６ＤＮＡと該配列を含有しないＨＨＶ−６ＤＮＡと
に分離して、ＨＨＶ−６のサブタイプＡ及びＢを識別す
る方法を提供する。
【００２４】本発明はさらに、上記プライマーセット−
３の中から各々一種ずつ選択されたプライマーＩ及びII
の組合わせを用いて、検体中のヒトヘルペスウイルス６
型（ＨＨＶ−６）ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応を行っ
て該ＨＨＶ−６ＤＮＡを増幅した後、その増幅産物をサ
イズ分析に掛けて、配列番号１及び２に示されるＨＨＶ
−６由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌクレオチド配
列に相補的なヌクレオチド配列又はその部分配列を含有
するＨＨＶ−６ＤＮＡと該配列を含有しないＨＨＶ−６
ＤＮＡとに分離して、ＨＨＶ−６のサブタイプＡ及びＢ
を識別する方法を提供する。
３の中から各々一種ずつ選択されたプライマーＩ及びII
の組合わせを用いて、検体中のヒトヘルペスウイルス６
型（ＨＨＶ−６）ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応を行っ
て該ＨＨＶ−６ＤＮＡを増幅した後、その増幅産物をサ
イズ分析に掛けて、配列番号１及び２に示されるＨＨＶ
−６由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌクレオチド配
列に相補的なヌクレオチド配列又はその部分配列を含有
するＨＨＶ−６ＤＮＡと該配列を含有しないＨＨＶ−６
ＤＮＡとに分離して、ＨＨＶ−６のサブタイプＡ及びＢ
を識別する方法を提供する。
【００２５】ここで、ポリメラーゼ連鎖反応について
は、公知の技術が適用され、また、サイズ分析において
は、アガロースゲル電気泳動等の技術が使用され、これ
らの方法は特定のものに限定されない。
は、公知の技術が適用され、また、サイズ分析において
は、アガロースゲル電気泳動等の技術が使用され、これ
らの方法は特定のものに限定されない。
【００２６】既にＨＨＶ−６のタイプが明らかにされて
いる１３株を用いて、上記プライマーセット−２を用い
てＰＣＲを行ったところ、各タイプに特徴的な長さのバ
ンドがそれぞれ確認され、本発明によってＨＨＶ−６の
タイピングが可能であることが明らかとなった（図２参
照）。
いる１３株を用いて、上記プライマーセット−２を用い
てＰＣＲを行ったところ、各タイプに特徴的な長さのバ
ンドがそれぞれ確認され、本発明によってＨＨＶ−６の
タイピングが可能であることが明らかとなった（図２参
照）。
【００２７】ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ量が十分
な場合、アガロースゲル電気泳動後、エチジウムブロマ
イドで染色し、ＤＮＡを確認できるが、臨床検体等でＨ
ＨＶ−６ ＤＮＡ量が少ない検体においては、ＰＣＲ後
でもエチジウムブロマイド染色では特異的なバンドを確
認できない場合がある。その様な場合、サザンブロッテ
ィングの後、上記プライマーセット中のポリヌクレオチ
ドをプローブとして、ハイブリダイゼーション法によっ
てＨＨＶ−６ ＤＮＡの存在を同定することができる。
これらプライマーセット中のポリヌクレオチド配列は、
タイプＡ及びＢの双方に共通な配列であるため、どちら
のタイプのＨＨＶ−６ ＤＮＡでも検出することができ
る。一方、配列番号１に示されるポリヌクレオチド配列
若しくはその相補的配列の一部又は全部をプローブとし
て用いた場合、このポリヌクレオチド配列はタイプＡの
ＨＨＶ−６ ＤＮＡには存在しない配列であるため、タ
イプＢのＨＨＶ−６ ＤＮＡとのみハイブリダイズす
る。ここで、プライマーセット−１または−３を用いて
ＰＣＲを行った場合、タイプＢ特異的なプローブは配列
番号１に示されるポリヌクレオチド配列若しくはその相
補的配列の一部又は全部が利用される。又、プライマー
セット−２又は−３を用いた場合、タイプＢ特異的なプ
ローブは配列番号２に示されるポリヌクレオチド配列若
しくはその相補的配列の一部又は全部が利用される。
な場合、アガロースゲル電気泳動後、エチジウムブロマ
イドで染色し、ＤＮＡを確認できるが、臨床検体等でＨ
ＨＶ−６ ＤＮＡ量が少ない検体においては、ＰＣＲ後
でもエチジウムブロマイド染色では特異的なバンドを確
認できない場合がある。その様な場合、サザンブロッテ
ィングの後、上記プライマーセット中のポリヌクレオチ
ドをプローブとして、ハイブリダイゼーション法によっ
てＨＨＶ−６ ＤＮＡの存在を同定することができる。
これらプライマーセット中のポリヌクレオチド配列は、
タイプＡ及びＢの双方に共通な配列であるため、どちら
のタイプのＨＨＶ−６ ＤＮＡでも検出することができ
る。一方、配列番号１に示されるポリヌクレオチド配列
若しくはその相補的配列の一部又は全部をプローブとし
て用いた場合、このポリヌクレオチド配列はタイプＡの
ＨＨＶ−６ ＤＮＡには存在しない配列であるため、タ
イプＢのＨＨＶ−６ ＤＮＡとのみハイブリダイズす
る。ここで、プライマーセット−１または−３を用いて
ＰＣＲを行った場合、タイプＢ特異的なプローブは配列
番号１に示されるポリヌクレオチド配列若しくはその相
補的配列の一部又は全部が利用される。又、プライマー
セット−２又は−３を用いた場合、タイプＢ特異的なプ
ローブは配列番号２に示されるポリヌクレオチド配列若
しくはその相補的配列の一部又は全部が利用される。
【００２８】従って、プライマーセット−１，−２又は
−３を用いてＰＣＲを行った後、これらプライマーセッ
ト中のポリヌクレオチド配列の何れか一種の一部又は全
部をプローブとしてＨＨＶ−６ ＤＮＡの存在を確認し
た後、配列番号１又は２に示したポリヌクレオチド配列
若しくはその相補的配列の何れか一種の一部又は全部を
プローブとしてＨＨＶ−６タイプＢを同定することによ
り、ＨＨＶ−６のタイピングを行うことができる。もち
ろん、多量のＨＨＶ−６ ＤＮＡが利用できる場合に
は、ＰＣＲの過程を省略して直接上記ポリヌクレオチド
配列をプローブとして組み合わせることにより、ＨＨＶ
−６のタイピングが可能である。
−３を用いてＰＣＲを行った後、これらプライマーセッ
ト中のポリヌクレオチド配列の何れか一種の一部又は全
部をプローブとしてＨＨＶ−６ ＤＮＡの存在を確認し
た後、配列番号１又は２に示したポリヌクレオチド配列
若しくはその相補的配列の何れか一種の一部又は全部を
プローブとしてＨＨＶ−６タイプＢを同定することによ
り、ＨＨＶ−６のタイピングを行うことができる。もち
ろん、多量のＨＨＶ−６ ＤＮＡが利用できる場合に
は、ＰＣＲの過程を省略して直接上記ポリヌクレオチド
配列をプローブとして組み合わせることにより、ＨＨＶ
−６のタイピングが可能である。
【００２９】あるいは、ＨＨＶ−６タイプＡとＢのＤＮ
Ａ塩基配列の違いを利用して、タイプＡ特異的プローブ
及びタイプＢ特異的プローブを設定し、これらのプロー
ブの認識部位を含むＨＨＶ−６ＤＮＡのＰＣＲ産物に対
してハイブリダイゼーションを行えば、タイプの判別が
可能である。このための有効なプローブの例として、次
のものが挙げられる。
Ａ塩基配列の違いを利用して、タイプＡ特異的プローブ
及びタイプＢ特異的プローブを設定し、これらのプロー
ブの認識部位を含むＨＨＶ−６ＤＮＡのＰＣＲ産物に対
してハイブリダイゼーションを行えば、タイプの判別が
可能である。このための有効なプローブの例として、次
のものが挙げられる。
【００３０】タイプＡ特異的プローブ：
(1) ５’−ＧＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＧＣＧＧＣＣＴＣ
ＣＡＧ−３’、 タイプＢ特異的プローブ： (2) ５’−ＴＡＡＡＴＣＣＡＴＴＡＣＴＧＧＣＣＴＴ
ＧＡＡ−３’。
ＣＡＧ−３’、 タイプＢ特異的プローブ： (2) ５’−ＴＡＡＡＴＣＣＡＴＴＡＣＴＧＧＣＣＴＴ
ＧＡＡ−３’。
【００３１】従って、本発明は、上記ヌクレオチド配列
(1) 及び(2) 若しくはこれらの配列に相補的なヌクレオ
チド配列、又はその部分配列からなる、それぞれタイプ
Ａ及びタイプＢに特異的な各ヌクレオチド配列を独立に
少なくとも１つずつプローブとして用いて、検体中のヒ
トヘルペスウイルス６型ＤＮＡとハイブリダイゼーショ
ンすることによって、ヒトヘルペスウイルス６型のサブ
タイプＡ及びＢを識別する方法をも提供する。
(1) 及び(2) 若しくはこれらの配列に相補的なヌクレオ
チド配列、又はその部分配列からなる、それぞれタイプ
Ａ及びタイプＢに特異的な各ヌクレオチド配列を独立に
少なくとも１つずつプローブとして用いて、検体中のヒ
トヘルペスウイルス６型ＤＮＡとハイブリダイゼーショ
ンすることによって、ヒトヘルペスウイルス６型のサブ
タイプＡ及びＢを識別する方法をも提供する。
【００３２】本発明によれば、下記のヌクレオチド配
列： (1) ５’−ＴＧＡＴＧＧＣＡＣＡＣＡＡＣＡＡＡＧＡ
ＧＡＴＧＴＣＣＡＡＴＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＣＣＡ−
３’ (2) ５’−ＡＡＧＣＡＧＡＴＧＡＡＴＣＡＡＡＴＣＴ
Ｔ−３’ (3) ５’−ＡＴＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＡＡＡＴＴＴ
ＡＡＴＴＡＣＴＧＣＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴ−３’ (4) ５’−ＴＧＡＡＴＴＴＴＣＡＴＧＧＣＡＡ−３’ (5) ５’−ＴＴＡＴＧＡＴＧＡＴＡＣＴＧＧＴＴＴ−
３’ (6) ５’−ＡＴＴＡＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＴ−３’ (7) ５’−ＡＧＴＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＴＧＡＴ−
３’ (8) ５’−ＡＴＡＴＴＣＡＧＡＧＧＡＡＴＣＴＴＣＴ
ＡＴＣＧＡＡＴＣＴＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧ
ＡＣ−３’ (9) ５’−ＴＴＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＡＧＧＧ
ＡＡＡＴＣＣ−３’ (10) ５’−ＡＡＡＡＴＧＴＡＴＣＣＡ−３’ (11) ５’−ＡＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＡ−３’ (12) ５’−ＧＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＴＣＣＡＡＡ−
３’ (13) ５’−ＡＧＣＡＧＡＣＡＧ−３’ (14) ５’−ＣＣＣＴＡＡＣＴＧＴＧＴＡ−３’ (15) ５’−ＧＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＣＡＧＡ
ＴＣＴＧＧＧＣＧＧＣＣＣＴ−３’ (16) ５’−ＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣ
ＡＧＧＧＡＡ−３’ (17) ５’−ＡＴＣＡＴＴＴＣＴＧＡＴＡＴＴＡＡＡＧ
−３’ (18) ５’−ＧＡＧＴＧＡＴＣＡＧＴＴＴＣＡＴＡＡＣ
ＣＡＡＡ−３’ (19) ５’−ＴＴＴＣＡＴＣＡＴＴＧＴＴＡＴＣＧＣＴ
ＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＴＡ−３’ (20) ５’−ＴＧＣＡＡＴＧＴＡＡＴＣＡ−３’ (21) ５’−ＴＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡＡＴＧＴＴＡＴＴ
ＡＧＴＴＣＴ−３’ (22) ５’−ＴＴＧＣＴＡＡＡＴＧＧＴＧＴＡＴＴＣＴ
ＣＡＴ−３’ (23) ５’−ＧＴＧＡＣＣＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡ−
３’ 若しくは該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配
列、並びに配列番号１及び２に示されるヌクレオチド配
列若しくはその相補的配列又はその部分配列からなる群
から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列をプ
ローブとして用いるＤＮＡハイブリダイゼーションによ
って、ＨＨＶ−６ ＤＮＡを検出することも可能であ
り、従って、本発明はＨＨＶ−６ ＤＮＡの検出方法も
提供する。
列： (1) ５’−ＴＧＡＴＧＧＣＡＣＡＣＡＡＣＡＡＡＧＡ
ＧＡＴＧＴＣＣＡＡＴＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＣＣＡ−
３’ (2) ５’−ＡＡＧＣＡＧＡＴＧＡＡＴＣＡＡＡＴＣＴ
Ｔ−３’ (3) ５’−ＡＴＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＡＡＡＴＴＴ
ＡＡＴＴＡＣＴＧＣＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴ−３’ (4) ５’−ＴＧＡＡＴＴＴＴＣＡＴＧＧＣＡＡ−３’ (5) ５’−ＴＴＡＴＧＡＴＧＡＴＡＣＴＧＧＴＴＴ−
３’ (6) ５’−ＡＴＴＡＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＴ−３’ (7) ５’−ＡＧＴＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＴＧＡＴ−
３’ (8) ５’−ＡＴＡＴＴＣＡＧＡＧＧＡＡＴＣＴＴＣＴ
ＡＴＣＧＡＡＴＣＴＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧ
ＡＣ−３’ (9) ５’−ＴＴＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＡＧＧＧ
ＡＡＡＴＣＣ−３’ (10) ５’−ＡＡＡＡＴＧＴＡＴＣＣＡ−３’ (11) ５’−ＡＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＡ−３’ (12) ５’−ＧＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＴＣＣＡＡＡ−
３’ (13) ５’−ＡＧＣＡＧＡＣＡＧ−３’ (14) ５’−ＣＣＣＴＡＡＣＴＧＴＧＴＡ−３’ (15) ５’−ＧＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＣＡＧＡ
ＴＣＴＧＧＧＣＧＧＣＣＣＴ−３’ (16) ５’−ＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣ
ＡＧＧＧＡＡ−３’ (17) ５’−ＡＴＣＡＴＴＴＣＴＧＡＴＡＴＴＡＡＡＧ
−３’ (18) ５’−ＧＡＧＴＧＡＴＣＡＧＴＴＴＣＡＴＡＡＣ
ＣＡＡＡ−３’ (19) ５’−ＴＴＴＣＡＴＣＡＴＴＧＴＴＡＴＣＧＣＴ
ＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＴＡ−３’ (20) ５’−ＴＧＣＡＡＴＧＴＡＡＴＣＡ−３’ (21) ５’−ＴＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡＡＴＧＴＴＡＴＴ
ＡＧＴＴＣＴ−３’ (22) ５’−ＴＴＧＣＴＡＡＡＴＧＧＴＧＴＡＴＴＣＴ
ＣＡＴ−３’ (23) ５’−ＧＴＧＡＣＣＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡ−
３’ 若しくは該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配
列、並びに配列番号１及び２に示されるヌクレオチド配
列若しくはその相補的配列又はその部分配列からなる群
から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列をプ
ローブとして用いるＤＮＡハイブリダイゼーションによ
って、ＨＨＶ−６ ＤＮＡを検出することも可能であ
り、従って、本発明はＨＨＶ−６ ＤＮＡの検出方法も
提供する。
【００３３】
【実施例】以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこ
れらの実施例に限定されない。
れらの実施例に限定されない。
【００３４】実施例１
ａ）ＤＮＡの抽出
ヒト末梢血単核球培養細胞にＨＨＶ−６を感染させ、培
養後、感染細胞を遠心により収集する。感染細胞沈渣に
細胞溶解用緩衝液（10mM Tris-HCl (pH8.0), 150mM NaC
l, 0.4% SDS, 10mM EDTA, 1mg/ml Proteinase K ）を
０．４ml加え、６５℃で一夜（又は５６℃で３時間）イ
ンキュベートする。インキュベーション後、フェノール
／クロロホルム（１：１）混合液を２００μｌ加え、激
しく振盪し、遠心処理によって液を２層に分離し、上部
の水層を回収する。同操作を更に２回繰り返し行った
後、３００μｌのクロロホルムを加え激しく振盪し、更
に遠心処理を行った後上部の水層を回収する。同操作を
更にもう一度繰り返す。最終的に回収した水層に１０μ
ｇの酵母ｔＲＮＡと３倍量のエタノールを加え、−７０
℃、１時間以上静置する。遠心処理によってＤＮＡを沈
殿させた後、沈渣を８０％エタノールで洗浄、風乾し、
０．５×ＴＥ（5mM Tris-HCl (pH8.0), 0.5mM EDTA）に
溶解し、ＰＣＲ用サンプルとした。
養後、感染細胞を遠心により収集する。感染細胞沈渣に
細胞溶解用緩衝液（10mM Tris-HCl (pH8.0), 150mM NaC
l, 0.4% SDS, 10mM EDTA, 1mg/ml Proteinase K ）を
０．４ml加え、６５℃で一夜（又は５６℃で３時間）イ
ンキュベートする。インキュベーション後、フェノール
／クロロホルム（１：１）混合液を２００μｌ加え、激
しく振盪し、遠心処理によって液を２層に分離し、上部
の水層を回収する。同操作を更に２回繰り返し行った
後、３００μｌのクロロホルムを加え激しく振盪し、更
に遠心処理を行った後上部の水層を回収する。同操作を
更にもう一度繰り返す。最終的に回収した水層に１０μ
ｇの酵母ｔＲＮＡと３倍量のエタノールを加え、−７０
℃、１時間以上静置する。遠心処理によってＤＮＡを沈
殿させた後、沈渣を８０％エタノールで洗浄、風乾し、
０．５×ＴＥ（5mM Tris-HCl (pH8.0), 0.5mM EDTA）に
溶解し、ＰＣＲ用サンプルとした。
【００３５】ｂ）ＰＣＲによるＨＨＶ−６ ＤＮＡ
上記サンプルを用いてＰＣＲを行った（ＰＣＲに関して
は、例えば、R. K. Saiki ら、Science, 230, 1350(198
5)参照）。ＨＨＶ−６としてはＨＳＴ株とＵ１１０２株
を用いて行った。また、プライマーとしては以下のオリ
ゴヌクレオチドを使用した。
は、例えば、R. K. Saiki ら、Science, 230, 1350(198
5)参照）。ＨＨＶ−６としてはＨＳＴ株とＵ１１０２株
を用いて行った。また、プライマーとしては以下のオリ
ゴヌクレオチドを使用した。
【００３６】プライマーＡ：５’−ＴＴＣＴＣＣＡＧＡ
ＴＧＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＴＣＣ−３’ プライマーＢ：５’−ＧＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡ
ＣＡＧＡＴＣＴＧＧＧＣ−３’ プライマーＣ：５’−ＣＡＴＣＡＴＴＧＴＴＡＴＣＧＣ
ＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣ−３’ プライマーＤ：５’−ＴＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡＡＴＧＴ
ＴＡＴＴＡＧＴＴＣＴ−３’ ＰＣＲを行うに当っては、上記プライマーの組み合わせ
としてＡとＣ、ＡとＤ、ＢとＣ及びＢとＤの組み合わせ
でそれぞれ行った。
ＴＧＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＴＣＣ−３’ プライマーＢ：５’−ＧＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡ
ＣＡＧＡＴＣＴＧＧＧＣ−３’ プライマーＣ：５’−ＣＡＴＣＡＴＴＧＴＴＡＴＣＧＣ
ＴＴＴＣＡＣＴＣＴＣ−３’ プライマーＤ：５’−ＴＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡＡＴＧＴ
ＴＡＴＴＡＧＴＴＣＴ−３’ ＰＣＲを行うに当っては、上記プライマーの組み合わせ
としてＡとＣ、ＡとＤ、ＢとＣ及びＢとＤの組み合わせ
でそれぞれ行った。
【００３７】ＰＣＲの反応条件は、サンプル１〜１０μ
ｌを用い、終濃度が10mM Tris-HCl(pH8.3), 1.5mM MgC
l2 , 0.01％ゼラチン，dNTP 200μＭ，各プライマー５
０ｐＭ，Ｔａｑポリメラーゼ 2.5単位となるように各組
成を加え、最終５０μｌとして９０℃ １分、６０℃
２分、７２℃ ３分のサイクルを２５サイクル繰り返し
ＰＣＲを行った（図３）。増幅産物をアガロースゲル電
気泳動に掛けてサイズにより分析した。
ｌを用い、終濃度が10mM Tris-HCl(pH8.3), 1.5mM MgC
l2 , 0.01％ゼラチン，dNTP 200μＭ，各プライマー５
０ｐＭ，Ｔａｑポリメラーゼ 2.5単位となるように各組
成を加え、最終５０μｌとして９０℃ １分、６０℃
２分、７２℃ ３分のサイクルを２５サイクル繰り返し
ＰＣＲを行った（図３）。増幅産物をアガロースゲル電
気泳動に掛けてサイズにより分析した。
【００３８】図３に示すように、４組のプライマー何れ
の組み合わせにおいてもＵ１１０２株のＰＣＲ産物はＨ
ＳＴ株のＰＣＲ産物に比較してその長さが明らかに短
く、両株を容易に判別することができた。
の組み合わせにおいてもＵ１１０２株のＰＣＲ産物はＨ
ＳＴ株のＰＣＲ産物に比較してその長さが明らかに短
く、両株を容易に判別することができた。
【００３９】実施例２
ａ）ＤＮＡの抽出
ＨＨＶ−６としてタイプＡであることが知られているＵ
１１０２株及びＧＳ株（1986, Science, 234, 596-601
）、タイプＢであることが知られているＨＳＴ株（K.
Takahashiら、 J. Virol., 3161〜3163, 1989）、Ｚ２
９株（1988, J. Infect. Dis, 157, 1271-1273）及びＥ
ｎｄｅｒｓ株とタイプＡに特異的なモノクローナル抗体
とタイプＢに特異的なモノクローナル抗体の両方に反応
することからタイプＡとタイプＢの中間型と考えられて
いるＤＡ株を用いてＰＣＲによって各タイプを識別でき
るかどうか検討を行った。又その他、臨床検体として国
内の突発性発疹急性期患者の末梢血から分離されたＯＫ
Ｃ株、ＮＫＴ株、１０３株、１０１株、Ｉｎｏｕｅ株及
びＫｉｔａｈａｒａ株とＨＨＶ−６と一部相同性がある
といわれているＨＨＶ−７（1990, Proc. Natl. Acad.
Sci, 87, 748-752）についても検討した。ＤＮＡの抽出
は、実施例１に述べた方法に準拠して行った。
１１０２株及びＧＳ株（1986, Science, 234, 596-601
）、タイプＢであることが知られているＨＳＴ株（K.
Takahashiら、 J. Virol., 3161〜3163, 1989）、Ｚ２
９株（1988, J. Infect. Dis, 157, 1271-1273）及びＥ
ｎｄｅｒｓ株とタイプＡに特異的なモノクローナル抗体
とタイプＢに特異的なモノクローナル抗体の両方に反応
することからタイプＡとタイプＢの中間型と考えられて
いるＤＡ株を用いてＰＣＲによって各タイプを識別でき
るかどうか検討を行った。又その他、臨床検体として国
内の突発性発疹急性期患者の末梢血から分離されたＯＫ
Ｃ株、ＮＫＴ株、１０３株、１０１株、Ｉｎｏｕｅ株及
びＫｉｔａｈａｒａ株とＨＨＶ−６と一部相同性がある
といわれているＨＨＶ−７（1990, Proc. Natl. Acad.
Sci, 87, 748-752）についても検討した。ＤＮＡの抽出
は、実施例１に述べた方法に準拠して行った。
【００４０】ｂ）ＰＣＲによるＨＨＶ−６のタイピング
上記各ＨＨＶ−６より抽出したＤＮＡをサンプルとして
ＰＣＲを行った。ＰＣＲは実施例１で示した方法に従っ
て行い、またプライマーとしては実施例１で示したプラ
イマーのＡとＣの組合わせを用いて行った。結果を図２
に示した。
ＰＣＲを行った。ＰＣＲは実施例１で示した方法に従っ
て行い、またプライマーとしては実施例１で示したプラ
イマーのＡとＣの組合わせを用いて行った。結果を図２
に示した。
【００４１】プライマーＡとＣの組み合わせでは、タイ
プＢのＨＳＴ株は５５４ bp のＰＣＲ産物を生じ、タイ
プＡのＵ１１０２株では３２６ bp のＰＣＲ産物を生じ
る。図２から明らかなようにタイプＢに属するＺ２９
株、及びＥｎｄｅｒｓ株は何れも同じタイプＢのＨＳＴ
株と同じ泳動位置にバンドが検出され、一方タイプＡに
属するＧＳ株は同じタイプＡのＵ１１０２株と同じ泳動
位置にバンドが検出され、本発明の方法を用いることに
よってＨＨＶ−６のタイピングが可能であることが検証
された。又両タイプの中間型と考えられていたＤＡ株で
は３２６ bp のバンド以外に５５４ bp 付近に弱いバン
ドが検出され、このことから、ＤＡ株は中間型ではなく
両タイプのウイルスが混在している可能性が考えられ
た。
プＢのＨＳＴ株は５５４ bp のＰＣＲ産物を生じ、タイ
プＡのＵ１１０２株では３２６ bp のＰＣＲ産物を生じ
る。図２から明らかなようにタイプＢに属するＺ２９
株、及びＥｎｄｅｒｓ株は何れも同じタイプＢのＨＳＴ
株と同じ泳動位置にバンドが検出され、一方タイプＡに
属するＧＳ株は同じタイプＡのＵ１１０２株と同じ泳動
位置にバンドが検出され、本発明の方法を用いることに
よってＨＨＶ−６のタイピングが可能であることが検証
された。又両タイプの中間型と考えられていたＤＡ株で
は３２６ bp のバンド以外に５５４ bp 付近に弱いバン
ドが検出され、このことから、ＤＡ株は中間型ではなく
両タイプのウイルスが混在している可能性が考えられ
た。
【００４２】また、国内の突発性発疹患者からの分離株
は全てＨＳＴ株と同じタイプＢであった。ＨＨＶ−７は
本法では検出されなかった。
は全てＨＳＴ株と同じタイプＢであった。ＨＨＶ−７は
本法では検出されなかった。
【００４３】実施例３
ａ）ＤＮＡの抽出
ＨＨＶ−６としてタイプＡであることが知られているＵ
１１０２株とタイプＢであることが知られているＨＳＴ
株を用い、それぞれ実施例１で述べた方法に準拠してＤ
ＮＡの抽出を行った。
１１０２株とタイプＢであることが知られているＨＳＴ
株を用い、それぞれ実施例１で述べた方法に準拠してＤ
ＮＡの抽出を行った。
【００４４】ｂ）プローブの調製
配列番号１に示される配列を利用したプローブは、その
配列内に、５’−ＧＴＡＧＡＡＴＡＴＴＴＡＡＡＡＴＡ
ＣＡＴＧＧＡＡＧ−３’及び５’−ＧＴＴＴＧＴＡＡＧ
ＴＴＴＴＴＧＴＣＴＴＧＴＴＧＧＧ−３’の一組のプラ
イマーを設定し、実施例１で示したＰＣＲ法によりＤＮ
Ａを増幅し、その増幅産物をランダムプライマーＤＮＡ
ラベリングキット（宝酒造）を用いて32Ｐ標識すること
によって調製した。
配列内に、５’−ＧＴＡＧＡＡＴＡＴＴＴＡＡＡＡＴＡ
ＣＡＴＧＧＡＡＧ−３’及び５’−ＧＴＴＴＧＴＡＡＧ
ＴＴＴＴＴＧＴＣＴＴＧＴＴＧＧＧ−３’の一組のプラ
イマーを設定し、実施例１で示したＰＣＲ法によりＤＮ
Ａを増幅し、その増幅産物をランダムプライマーＤＮＡ
ラベリングキット（宝酒造）を用いて32Ｐ標識すること
によって調製した。
【００４５】配列番号２に示される配列を利用したプロ
ーブは、その配列内に、５’−ＡＣＡＡＣＡＡＧＡＣＡ
ＴＴＴＴＧＣＴＴＡＣＡＧＣＣ−３’及び５’−ＧＡＴ
ＴＣＡＣＴＡＧＡＣＴＴＴＣＴＡＣＡＧＣＴＣＣ−３’
の一組のプライマーを設定し、実施例１で示したＰＣＲ
法によりＤＮＡを増幅し、その増幅産物をランダムプラ
イマーＤＮＡラベリングキット（宝酒造）を用いて32Ｐ
標識することによって調製した。
ーブは、その配列内に、５’−ＡＣＡＡＣＡＡＧＡＣＡ
ＴＴＴＴＧＣＴＴＡＣＡＧＣＣ−３’及び５’−ＧＡＴ
ＴＣＡＣＴＡＧＡＣＴＴＴＣＴＡＣＡＧＣＴＣＣ−３’
の一組のプライマーを設定し、実施例１で示したＰＣＲ
法によりＤＮＡを増幅し、その増幅産物をランダムプラ
イマーＤＮＡラベリングキット（宝酒造）を用いて32Ｐ
標識することによって調製した。
【００４６】ｃ）ＰＣＲ及びサザンブロットハイブリダ
イゼーション 上記各ＨＨＶ−６より抽出したＤＮＡをサンプルとして
ＰＣＲを行った。プライマーとしては配列番号１に示さ
れる配列を含む領域の増幅には５’−ＧＡＧＧＡＡＴＣ
ＴＴＣＴＡＴＣＧＡＡＴＣＴＡＴＣＣ−３’及び５’−
ＴＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＡＴＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧ
−３’の組み合わせを用いた。又配列番号２に示される
配列を含む領域の増幅には、実施例１で示したプライマ
ーのＡとＣの組み合わせを用いて行った。ＰＣＲは実施
例１で示した方法に従って行った。
イゼーション 上記各ＨＨＶ−６より抽出したＤＮＡをサンプルとして
ＰＣＲを行った。プライマーとしては配列番号１に示さ
れる配列を含む領域の増幅には５’−ＧＡＧＧＡＡＴＣ
ＴＴＣＴＡＴＣＧＡＡＴＣＴＡＴＣＣ−３’及び５’−
ＴＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＡＴＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧ
−３’の組み合わせを用いた。又配列番号２に示される
配列を含む領域の増幅には、実施例１で示したプライマ
ーのＡとＣの組み合わせを用いて行った。ＰＣＲは実施
例１で示した方法に従って行った。
【００４７】ＰＣＲによって増幅した産物は、１％アガ
ロースゲル内で電気泳動した後、ＤＮＡをナイロン膜
（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋；Ａｍｅｒｓｈａｍ製）に転写し
た。転写した膜を２％ＳＤＳ、３％スキムミルクを含む
６×ＳＳＰＥ（０．９Ｍ ＮａＣｌ，６ｍＭ ＥＤＴ
Ａ，０．０６Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
４））中６５℃、６時間行った後、同液中に32Ｐ標識し
たプローブを加えた液と交換し、更に６５℃、１６時間
ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーシ
ョン終了後、膜を２×ＳＳＰＥで室温２０分洗浄し、更
に２×ＳＳＰＥで６５℃、２０分洗浄を２回、０．２×
ＳＳＰＥで６５℃、２０分洗浄を２回行った。洗浄後の
膜をＸ線フィルムとコンタクトし、フィルムを感光させ
ることによってプローブのハイブリダイゼーションの有
無を確認した。
ロースゲル内で電気泳動した後、ＤＮＡをナイロン膜
（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋；Ａｍｅｒｓｈａｍ製）に転写し
た。転写した膜を２％ＳＤＳ、３％スキムミルクを含む
６×ＳＳＰＥ（０．９Ｍ ＮａＣｌ，６ｍＭ ＥＤＴ
Ａ，０．０６Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
４））中６５℃、６時間行った後、同液中に32Ｐ標識し
たプローブを加えた液と交換し、更に６５℃、１６時間
ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーシ
ョン終了後、膜を２×ＳＳＰＥで室温２０分洗浄し、更
に２×ＳＳＰＥで６５℃、２０分洗浄を２回、０．２×
ＳＳＰＥで６５℃、２０分洗浄を２回行った。洗浄後の
膜をＸ線フィルムとコンタクトし、フィルムを感光させ
ることによってプローブのハイブリダイゼーションの有
無を確認した。
【００４８】図４には、配列番号１に示される配列を含
む領域のＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動後のエチ
ジウムブロマイド染色図（Ａ）及び該配列をもとに作製
したＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションの結果
（Ｂ）を示した。
む領域のＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動後のエチ
ジウムブロマイド染色図（Ａ）及び該配列をもとに作製
したＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションの結果
（Ｂ）を示した。
【００４９】図５には、配列番号２に示される配列を含
む領域のＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動後のエチ
ジウムブロマイド染色図（Ａ）及び該配列をもとに作製
したＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションの結果
（Ｂ）を示した。
む領域のＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動後のエチ
ジウムブロマイド染色図（Ａ）及び該配列をもとに作製
したＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションの結果
（Ｂ）を示した。
【００５０】何れの場合においても、配列番号１及び２
に示される各配列をもとに作製したプローブは共に、タ
イプＢに属するＨＳＴ株のＤＮＡとのみハイブリダイズ
し、タイプＡであるＵ１１０２株のＤＮＡとはハイブリ
ダイズしなかった。従って、これら配列番号１及び２に
示されるＤＮＡ配列をプローブとして利用することによ
り、ＨＨＶ−６のタイピングが可能である。
に示される各配列をもとに作製したプローブは共に、タ
イプＢに属するＨＳＴ株のＤＮＡとのみハイブリダイズ
し、タイプＡであるＵ１１０２株のＤＮＡとはハイブリ
ダイズしなかった。従って、これら配列番号１及び２に
示されるＤＮＡ配列をプローブとして利用することによ
り、ＨＨＶ−６のタイピングが可能である。
【００５１】実施例４
ａ）ＤＮＡの抽出
ＨＨＶ−６としてタイプＡであることが知られているＵ
１１０２株およびタイプＢであることが知られているＨ
ＳＴ株、またタイプ不明の臨床分離株１及び２の感染ヒ
ト末梢血単核球培養細胞よりＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ
の抽出は実施例１に述べた方法に準拠して行った。
１１０２株およびタイプＢであることが知られているＨ
ＳＴ株、またタイプ不明の臨床分離株１及び２の感染ヒ
ト末梢血単核球培養細胞よりＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ
の抽出は実施例１に述べた方法に準拠して行った。
【００５２】ｂ）ＰＣＲによるＤＮＡの増幅及びドット
ブロット 上記各ＨＨＶ−６より抽出したＤＮＡをサンプルとして
ＰＣＲを行った。ＰＣＲは実施例１で示した方法に従っ
て行い、またプライマーとしては実施例１で示したプラ
イマーのＡとＣの組み合わせを用いて行った。これらの
ＰＣＲ産物をナイロンメンブレンフィルター（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋）に０．５μｌずつ載
せ、０．４Ｎ ＮａＣｌで２０分間処理した後、６×Ｓ
ＳＰＥで中和した。
ブロット 上記各ＨＨＶ−６より抽出したＤＮＡをサンプルとして
ＰＣＲを行った。ＰＣＲは実施例１で示した方法に従っ
て行い、またプライマーとしては実施例１で示したプラ
イマーのＡとＣの組み合わせを用いて行った。これらの
ＰＣＲ産物をナイロンメンブレンフィルター（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋）に０．５μｌずつ載
せ、０．４Ｎ ＮａＣｌで２０分間処理した後、６×Ｓ
ＳＰＥで中和した。
【００５３】ｃ）アルカリフォスファターゼ標識ＤＮＡ
プローブの調製 ＨＨＶ−６タイプ特異的酵素標識プローブとしては、
５’−ＧＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＧＣＧＧＣＣＴＣＣＡＧ
−３’を有するオリゴヌクレオチドをタイプＡに特異的
なプローブ、５’−ＴＡＡＡＴＣＣＡＴＴＡＣＴＧＧＣ
ＣＴＴＧＡＡ−３’を有するオリゴヌクレオチドをタイ
プＢに特異的なプローブとして用いるため、これらをＡ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＤＮＡ ｓ
ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（３８１Ａ）を用いて合成し、ア
ミノリンクIIを用いてその５’末端にアミノ基を付加し
た。アミノ基を付加したＤＮＡをＥＭＣＳ［Ｎ−（ε−
Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉ
ｎｉｍｉｄｅ］を用いてマレイミド化し、一方アルカリ
フォスファターゼは２−Ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅを
用いてＳＨ基を付加した。両者を混合反応させることに
よりアルカリフォスファターゼ標識ＤＮＡプローブを作
製した。
プローブの調製 ＨＨＶ−６タイプ特異的酵素標識プローブとしては、
５’−ＧＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＧＣＧＧＣＣＴＣＣＡＧ
−３’を有するオリゴヌクレオチドをタイプＡに特異的
なプローブ、５’−ＴＡＡＡＴＣＣＡＴＴＡＣＴＧＧＣ
ＣＴＴＧＡＡ−３’を有するオリゴヌクレオチドをタイ
プＢに特異的なプローブとして用いるため、これらをＡ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＤＮＡ ｓ
ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（３８１Ａ）を用いて合成し、ア
ミノリンクIIを用いてその５’末端にアミノ基を付加し
た。アミノ基を付加したＤＮＡをＥＭＣＳ［Ｎ−（ε−
Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉ
ｎｉｍｉｄｅ］を用いてマレイミド化し、一方アルカリ
フォスファターゼは２−Ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅを
用いてＳＨ基を付加した。両者を混合反応させることに
よりアルカリフォスファターゼ標識ＤＮＡプローブを作
製した。
【００５４】ｄ）ハイブリダイゼーション
ｂ）で作製したメンブレンフィルターを２×ＳＳＰＥ、
０．１％ＳＤＳで室温で５分間洗浄、更に２×ＳＳＰ
Ｅ、０．１％ＳＤＳを用いて４０℃、５分間の洗浄を３
回行った。ハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＰ
Ｅ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．５％ＳＤＳ、１％
Ｃａｓｅｉｎ）を用いて５０℃、３０分間ブロッキング
を行い、次にｃ）で調製した酵素標識プローブ２種のう
ち１種を加え（アルカリフォスファターゼの最終濃度
０．１μｇ／ｍｌ）、５０℃で１時間ハイブリダイゼー
ションを行った。ハイブリダイゼーション終了後１×Ｓ
ＳＣ、１％ＳＤＳを用いて４０℃で５分間の洗浄を２
回、１×ＳＳＣ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用
いて４０℃で５分間の洗浄を２回、１×ＳＳＣを用いて
室温で５分間の洗浄を２回行った。アルカリフォスファ
ターゼ基質反応液（0.3M Tris−HCl 、0.1M NaCl、50
mM MgCl2 （pH 9.8））を加え、室温で５分間インキュ
ベートした後、ＮＴＢ溶液［７０％ Ｎ’Ｎ−Ｄｉｍｅ
ｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅにＮＴＢ（Ｎｉｔｒｏ Ｔ
ｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ Ｂｌｕｅ）を７５ｍｇ／ｍｌの
濃度に溶解したもの］を３３μｌ／７．５ｍｌ、ＢＣＩ
Ｐ溶液［100 ％Ｎ’Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍ
ｉｄｅにＢＣＩＰ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ
−３−Ｉｎｄｏｒｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅを５０ｍｇ／
ｍｌの濃度に溶解したもの］を２５μｌ／７．５ｍｌ加
え、３７℃で２時間反応させた。
０．１％ＳＤＳで室温で５分間洗浄、更に２×ＳＳＰ
Ｅ、０．１％ＳＤＳを用いて４０℃、５分間の洗浄を３
回行った。ハイブリダイゼーション溶液（５×ＳＳＰ
Ｅ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．５％ＳＤＳ、１％
Ｃａｓｅｉｎ）を用いて５０℃、３０分間ブロッキング
を行い、次にｃ）で調製した酵素標識プローブ２種のう
ち１種を加え（アルカリフォスファターゼの最終濃度
０．１μｇ／ｍｌ）、５０℃で１時間ハイブリダイゼー
ションを行った。ハイブリダイゼーション終了後１×Ｓ
ＳＣ、１％ＳＤＳを用いて４０℃で５分間の洗浄を２
回、１×ＳＳＣ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用
いて４０℃で５分間の洗浄を２回、１×ＳＳＣを用いて
室温で５分間の洗浄を２回行った。アルカリフォスファ
ターゼ基質反応液（0.3M Tris−HCl 、0.1M NaCl、50
mM MgCl2 （pH 9.8））を加え、室温で５分間インキュ
ベートした後、ＮＴＢ溶液［７０％ Ｎ’Ｎ−Ｄｉｍｅ
ｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅにＮＴＢ（Ｎｉｔｒｏ Ｔ
ｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ Ｂｌｕｅ）を７５ｍｇ／ｍｌの
濃度に溶解したもの］を３３μｌ／７．５ｍｌ、ＢＣＩ
Ｐ溶液［100 ％Ｎ’Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍ
ｉｄｅにＢＣＩＰ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ
−３−Ｉｎｄｏｒｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅを５０ｍｇ／
ｍｌの濃度に溶解したもの］を２５μｌ／７．５ｍｌ加
え、３７℃で２時間反応させた。
【００５５】結果を図６に示した。図６のＡではタイプ
Ａに特異的なプローブをＢではタイプＢに特異的なプロ
ーブを用いた。またＰＣＲ産物の１はＵ１１０２株、２
はＨＳＴ株、３は臨床分離株１、４は臨床分離株２を示
している。図に示す通り、タイプＡ特異的プローブはＵ
１１０２株のＰＣＲ産物とハイブリダイズするが、ＨＳ
Ｔ株とはハイブリダイズせず、またタイプＢ特異的プロ
ーブはＨＳＴ株とハイブリダイズするがＵ１１０２株と
はハイブリダイズしなかった。これらのプローブを用い
ることにより、ＰＣＲ産物をサザンブロットすることな
く、ドットブロットを行うことによって簡便かつ迅速に
タイプを識別することが可能である。また、この方法に
より、臨床分離株１はタイプＡ、臨床分離株２はタイプ
Ｂであることが判明した。
Ａに特異的なプローブをＢではタイプＢに特異的なプロ
ーブを用いた。またＰＣＲ産物の１はＵ１１０２株、２
はＨＳＴ株、３は臨床分離株１、４は臨床分離株２を示
している。図に示す通り、タイプＡ特異的プローブはＵ
１１０２株のＰＣＲ産物とハイブリダイズするが、ＨＳ
Ｔ株とはハイブリダイズせず、またタイプＢ特異的プロ
ーブはＨＳＴ株とハイブリダイズするがＵ１１０２株と
はハイブリダイズしなかった。これらのプローブを用い
ることにより、ＰＣＲ産物をサザンブロットすることな
く、ドットブロットを行うことによって簡便かつ迅速に
タイプを識別することが可能である。また、この方法に
より、臨床分離株１はタイプＡ、臨床分離株２はタイプ
Ｂであることが判明した。
【００５６】
【発明の効果】ＨＨＶ−６のタイピングは、種々の疾患
との関連で興味深いものと考えられるが、これまでその
タイピングには数週間以上の時間を必要としていた。本
発明によって臨床検体からＨＨＶ−６ ＤＮＡの存在の
有無を判定することができるばかりか、そのタイピング
を簡便且つ迅速に行うことが可能となり、臨床医学、基
礎医学等の分野で極めて有効な研究手段が提供されたも
のと考えられる。
との関連で興味深いものと考えられるが、これまでその
タイピングには数週間以上の時間を必要としていた。本
発明によって臨床検体からＨＨＶ−６ ＤＮＡの存在の
有無を判定することができるばかりか、そのタイピング
を簡便且つ迅速に行うことが可能となり、臨床医学、基
礎医学等の分野で極めて有効な研究手段が提供されたも
のと考えられる。
【００５７】
配列番号：１
配列の長さ：１０８
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic DNA
配列
AATGTAGAAT ATTTAAAATA CATGGAAGTA CAATCTCCTA CTGATAATAA TACTCCCACC 60
CCATCAAAGA ACAATGAATC CCCAACAAGA CAAAAACTTA CAAACATA 108
配列番号：２
配列の長さ：２２８
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic DNA
配列
GGTCTGAACA ACAAGACATT TTGCTTACAG CCCCGATCAA AGGTCACAGA CAAAAGAAAG 60
GATTCAGGAA AAAGGTTCTA ACTCCAAGTG TACCGAAACG CTTCCTTGTA TGACCTTTAC 120
CGACTCAGCA ACTCCTGTCA AAAGTCATGA TGCAATTCAG GATACTTTAA ATCCAGAAAG 180
TAAAATAGAC AAAGAATTGG GAGCTGTAGA AAGTCTAGTG AATCTATG 228
Ｔ
【図１】ＨＨＶ−６ Ｕ１１０２株と比較される、ＨＳ
Ｔ株ゲノム上の新規１０８ bp及び２２８ bp ヌクレオ
チド配列部位を示す。
Ｔ株ゲノム上の新規１０８ bp及び２２８ bp ヌクレオ
チド配列部位を示す。
【図２】タイプＡ及びＢのいずれかに属する１３種類の
ＨＨＶ−６株と２種類のＨＨＶ−７株について、各ウイ
ルスＤＮＡのＰＣＲ増幅後、アガロースゲル電気泳動に
掛けて得られた、サイズによりサブタイプの識別が可能
であることを示す泳動写真である。
ＨＨＶ−６株と２種類のＨＨＶ−７株について、各ウイ
ルスＤＮＡのＰＣＲ増幅後、アガロースゲル電気泳動に
掛けて得られた、サイズによりサブタイプの識別が可能
であることを示す泳動写真である。
【図３】４種類のプライマーセットを用いてＨＳＴ株と
Ｕ１１０２株のＤＮＡの各ＰＣＲを実施した後、アガロ
ースゲル電気泳動に掛けて得られた、サイズによりサブ
タイプの識別が可能であることを示す泳動写真である。
Ｕ１１０２株のＤＮＡの各ＰＣＲを実施した後、アガロ
ースゲル電気泳動に掛けて得られた、サイズによりサブ
タイプの識別が可能であることを示す泳動写真である。
【図４】配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む
領域のＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動後のエチジ
ウムブロマイド染色図（Ａ）、及び、該配列をもとにし
て作製したＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション
の結果（Ｂ）を示す写真である。
領域のＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動後のエチジ
ウムブロマイド染色図（Ａ）、及び、該配列をもとにし
て作製したＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション
の結果（Ｂ）を示す写真である。
【図５】配列番号２に示されるヌクレオチド配列を含む
領域のＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動後のエチジ
ウムブロマイド染色図（Ａ）、及び、該配列をもとにし
て作製したＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション
の結果（Ｂ）を示す写真である。
領域のＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動後のエチジ
ウムブロマイド染色図（Ａ）、及び、該配列をもとにし
て作製したＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション
の結果（Ｂ）を示す写真である。
【図６】タイプＡに特異的なプローブ（Ａ）又はタイプ
Ｂに特異的なプローブ（Ｂ）を用いるハイブリダイゼー
ションによってサブタイプ識別を実施した結果を示すド
ットブロット写真である。
Ｂに特異的なプローブ（Ｂ）を用いるハイブリダイゼー
ションによってサブタイプ識別を実施した結果を示すド
ットブロット写真である。
【符号の説明】
１ Ｕ１１０２株、
２ ＨＳＴ株、
３ 臨床分離株
４ 臨床分離株
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，Ｖｏｌ．29（２），ｐ．367−372
（1991)
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．65
（10），ｐ．5381−5390（1991)
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．63
（７），ｐ．3161−3163（1989)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12Q 1/68
C12N 15/09 - 15/90
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＣＡ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／Ｗ
ＰＩＤＳ（ＳＴＮ)
Claims (9)
- 【請求項１】 配列番号１に示されるヒトヘルペスウイ
ルス６型由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌクレオチ
ド配列に相補的なヌクレオチド配列又は少なくとも１５
塩基対の長さを有するその部分配列から成るＤＮＡ。 - 【請求項２】 配列番号２に示されるヒトヘルペスウイ
ルス６型由来のヌクレオチド配列若しくは該ヌクレオチ
ド配列に相補的なヌクレオチド配列又は少なくとも１５
塩基対の長さを有するその部分配列から成るＤＮＡ。 - 【請求項３】 請求項１記載のヌクレオチド配列又は少
なくとも１５塩基対の長さを有するその部分配列から成
るＤＮＡをプローブとして使用するＤＮＡハイブリダイ
ゼーションによってヒトヘルペスウイルス６型のサブタ
イプＡ及びＢを識別する方法。 - 【請求項４】 下記のヌクレオチド配列の少なくとも１
２塩基対の長さを有する部分配列又は全配列よりなるプ
ライマーＩ及びII： プライマーＩ： ５’−ＴＧＡＴＧＧＣＡＣＡＣＡＡＣＡＡＡＧＡＧＡＴ
ＧＴＣＣＡＡＴＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＣＣＡ−３’ ５’−ＡＡＧＣＡＧＡＴＧＡＡＴＣＡＡＡＴＣＴＴ−
３’ ５’−ＡＴＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＡＡＡＴＴＴＡＡＴ
ＴＡＣＴＧＣＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴ−３’ ５’−ＴＧＡＡＴＴＴＴＣＡＴＧＧＣＡＡ−３’ ５’−ＴＴＡＴＧＡＴＧＡＴＡＣＴＧＧＴＴＴ−３’ ５’−ＡＴＴＡＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＴ−３’ ５’−ＡＧＴＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＴＧＡＴ−３’ ５’−ＡＴＡＴＴＣＡＧＡＧＧＡＡＴＣＴＴＣＴＡＴＣ
ＧＡＡＴＣＴＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＣ−
３’ プライマーII： ５’−ＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＡＴＣＴＧＧＡ
ＧＡＡ−３’ ５’−ＴＧＧＡＴＡＣＡＴＴＴＴ−３’ ５’−ＴＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧＴ−３’ ５’−ＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣ−３’ ５’−ＴＡＣＡＣＡＧＴＴＡＧＧＧ−３’ ５’−ＡＧＧＧＣＣＧＣＣＣＡＧＡＴＣＴＧＴＣＡＣＴ
ＧＡＧＧＣＴＧＴＡＣ−３’ ５’−ＴＴＣＣＣＴＧＧＣＡＣＡＴＣＴＧＧＡＧＡＡＧ
ＧＡＧ−３’ の中から各々一種ずつ選択されたプライマーの組合わせ
を用いて、検体中のヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ
−６）ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応を行って該ＨＨＶ
−６ＤＮＡを増幅した後、その増幅産物をサイズ分析に
掛けて、請求項１記載のヌクレオチド配列又はその部分
配列を含有するＨＨＶ−６ＤＮＡと該配列を含有しない
ＨＨＶ−６ＤＮＡとに分離して、ＨＨＶ−６のサブタイ
プＡ及びＢを識別する方法。 - 【請求項５】 請求項２記載のヌクレオチド配列又は少
なくとも１５塩基対の長さを有するその部分配列から成
るＤＮＡをプローブとして使用するＤＮＡハイブリダイ
ゼーションによってヒトヘルペスウイルス６型のサブタ
イプＡ及びＢを識別する方法。 - 【請求項６】 下記のヌクレオチド配列の少なくとも１
２塩基対の長さを有する部分配列又は全配列よりなるプ
ライマーＩ及びII： プライマーＩ： ５’−ＴＴＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡ
ＴＣＣ−３’ ５’−ＡＡＡＡＴＧＴＡＴＣＣＡ−３’ ５’−ＡＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＡ−３’ ５’−ＧＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＴＣＣＡＡＡ−３’ ５’−ＣＣＣＴＡＡＣＴＧＴＧＴＡ−３’ ５’−ＧＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＣＡＧＡＴＣＴ
ＧＧＧＣＧＧＣＣＣＴ−３’ ５’−ＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＧＡＴＧＴＧＣＣＡＧＧ
ＧＡＡ−３’ プライマーII： ５’−ＡＴＣＡＴＴＴＣＴＧＡＴＡＴＴＡＡＡＧ−３’ ５’−ＧＡＧＴＧＡＴＣＡＧＴＴＴＣＡＴＡＡＣＣＡＡ
Ａ−３’ ５’−ＴＴＴＣＡＴＣＡＴＴＧＴＴＡＴＣＧＣＴＴＴＣ
ＡＣＴＣＴＣＡＴＡ−３’ ５’−ＴＧＣＡＡＴＧＴＡＡＴＣＡ−３’ ５’−ＴＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡＡＴＧＴＴＡＴＴＡＧＴ
ＴＣＴ−３’ ５’−ＴＴＧＣＴＡＡＡＴＧＧＴＧＴＡＴＴＣＴＣＡＴ
−３’ ５’−ＧＴＧＡＣＣＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡ−３’ の中から各々一種ずつ選択されたプライマーの組合わせ
を用いて、検体中のヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ
−６）ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応を行って該ＨＨＶ
−６ＤＮＡを増幅した後、その増幅産物をサイズ分析に
掛けて、請求項２記載のヌクレオチド配列又はその部分
配列を含有するＨＨＶ−６ＤＮＡと該配列を含有しない
ＨＨＶ−６ＤＮＡとに分離して、ＨＨＶ−６のサブタイ
プＡ及びＢを識別する方法。 - 【請求項７】 請求項１記載のヌクレオチド配列又は少
なくとも１５塩基対の長さを有するその部分配列と請求
項２記載のヌクレオチド配列又は少なくとも１５塩基対
の長さを有するその部分配列の両方をプローブとして使
用するＤＮＡハイブリダイゼーションによってヒトヘル
ペスウイルス６型のサブタイプＡ及びＢを識別する方
法。 - 【請求項８】 下記のヌクレオチド配列の少なくとも１
２塩基対の長さを有する部分配列又は全配列よりなるプ
ライマーＩ及びII： プライマーＩ： ５’−ＴＧＡＴＧＧＣＡＣＡＣＡＡＣＡＡＡＧＡＧＡＴ
ＧＴＣＣＡＡＴＣＣＴＧＡＣＡＴＣＴＣＣＡ−３’ ５’−ＡＡＧＣＡＧＡＴＧＡＡＴＣＡＡＡＴＣＴＴ−
３’ ５’−ＡＴＧＴＧＡＡＴＴＧＴＡＡＡＡＡＴＴＴＡＡＴ
ＴＡＣＴＧＣＣＧＣＣＡＡＡＡＡＴ−３’ ５’−ＴＧＡＡＴＴＴＴＣＡＴＧＧＣＡＡ−３’ ５’−ＴＴＡＴＧＡＴＧＡＴＡＣＴＧＧＴＴＴ−３’ ５’−ＡＴＴＡＡＡＣＣＴＴＴＡＡＣＴ−３’ ５’−ＡＧＴＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＴＧＡＴ−３’ ５’−ＡＴＡＴＴＣＡＧＡＧＧＡＡＴＣＴＴＣＴＡＴＣ
ＧＡＡＴＣＴＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧＡＣ−
３’ プライマーII： ５’−ＡＴＣＡＴＴＴＣＴＧＡＴＡＴＴＡＡＡＧ−３’ ５’−ＧＡＧＴＧＡＴＣＡＧＴＴＴＣＡＴＡＡＣＣＡＡ
Ａ−３’ ５’−ＴＴＴＣＡＴＣＡＴＴＧＴＴＡＴＣＧＣＴＴＴＣ
ＡＣＴＣＴＣＡＴＡ−３’ ５’−ＴＧＣＡＡＴＧＴＡＡＴＣＡ−３’ ５’−ＴＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡＡＴＧＴＴＡＴＴＡＧＴ
ＴＣＴ−３’ ５’−ＴＴＧＣＴＡＡＡＴＧＧＴＧＴＡＴＴＣＴＣＡＴ
−３’ ５’−ＧＴＧＡＣＣＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡ−３’ の中から各々一種ずつ選択されたプライマーの組合わせ
を用いて、検体中のヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ
−６）ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応を行って該ＨＨＶ
−６ＤＮＡを増幅した後、その増幅産物をサイズ分析に
掛けて、請求項１及び２記載のヌクレオチド配列又はそ
の部分配列を共に含有するＨＨＶ−６ＤＮＡと該配列を
含有しないＨＨＶ−６ＤＮＡとに分離して、ＨＨＶ−６
のサブタイプＡ及びＢを識別する方法。 - 【請求項９】 下記のヌクレオチド配列： ５’−ＧＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＧＣＧＧＣＣＴＣＣＡＧ
−３’及び ５’−ＴＡＡＡＴＣＣＡＴＴＡＣＴＧＧＣＣＴＴＧＡＡ
−３’ 若しくは該ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配
列又は少なくとも１５塩基対の長さを有するその部分配
列からなる、それぞれタイプＡ及びタイプＢに特異的な
各ヌクレオチド配列から成るＤＮＡを独立に少なくとも
１つずつプローブとして用いて、検体中のヒトヘルペス
ウイルス６型ＤＮＡとハイブリダイゼーションすること
によって、ヒトヘルペスウイルス６型のサブタイプＡ及
びＢを識別する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31141692A JP3439492B2 (ja) | 1992-10-27 | 1992-10-27 | ヒトヘルペスウイルス６型（ｈｈｖ−６）ｄｎａの検出及びサブタイプ識別方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31141692A JP3439492B2 (ja) | 1992-10-27 | 1992-10-27 | ヒトヘルペスウイルス６型（ｈｈｖ−６）ｄｎａの検出及びサブタイプ識別方法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002218713A Division JP3833152B2 (ja) | 2002-07-26 | 2002-07-26 | ヒトヘルペスウイルス６型（ｈｈｖ−６）ｄｎａの検出及びサブタイプ識別方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06133799A JPH06133799A (ja) | 1994-05-17 |
| JP3439492B2 true JP3439492B2 (ja) | 2003-08-25 |
Family
ID=18016943
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31141692A Expired - Fee Related JP3439492B2 (ja) | 1992-10-27 | 1992-10-27 | ヒトヘルペスウイルス６型（ｈｈｖ−６）ｄｎａの検出及びサブタイプ識別方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3439492B2 (ja) |
-
1992
- 1992-10-27 JP JP31141692A patent/JP3439492B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．２９（２），ｐ．３６７−３７２（１９９１） |
| Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．６３（７），ｐ．３１６１−３１６３（１９８９） |
| Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．６５（１０），ｐ．５３８１−５３９０（１９９１） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06133799A (ja) | 1994-05-17 |
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