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JP3323508B2 - Ｃｄ２３に対する結合物質 - Google Patents

Ｃｄ２３に対する結合物質

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JP3323508B2
JP3323508B2 JP51350896A JP51350896A JP3323508B2 JP 3323508 B2 JP3323508 B2 JP 3323508B2 JP 51350896 A JP51350896 A JP 51350896A JP 51350896 A JP51350896 A JP 51350896A JP 3323508 B2 JP3323508 B2 JP 3323508B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、炎症疾患、自己免疫疾患またはアレルギー
疾患の治療に使用することができる特定の結合物質に関
する。
CD23（FCεR II）は、リンパ球ホーミング受容体（ME
L−14）および内皮白血球接着分子−１（ELAM−１）を
も含むＣレクチンファミリーのII型分子である。これ、
IgEの低親和性受容体である。ヒトにおいては、濾胞樹
状細胞（follicular dendritic cells）、Ｂ細胞、Ｔ細
胞およびマクロファージを含む種々の型の造血細胞が、
その表面にCD23を発現する。CD23分子はまた、生物液体
中に可溶性の形で見い出されている。可溶性CD23（sCD2
3）分子は、膜貫通型（transmembrane）受容体のタンパ
ク質分解性切断により形成される。CD23は、細胞接着の
媒介、IgEおよびヒスタミン放出の調節、アポトーシス
からのＢ細胞の救出（rescue）および骨髄性細胞増殖の
調節を含む多面発現性の活性を有する。これらの機能的
な活性は、細胞結合性CD23またはsCD23（後者はサイト
カイン様に作用する）の特異的リガンドへの結合により
媒介される（Conrad,D.H.,Annu Rev Immunol 8,623−64
5（1990）;Deiespesse,G.ら,Adv Immunol 49,149−191
（1991）;Bonnefoy,J.Y.ら,Curr Opin Immunol 5,944−
947（1993））。
多くの炎症性疾患においてCD23の発現の増加が観察さ
れている。CD23は、慢性滑膜炎の患者からの滑液生検で
同定され、sCDは慢性関節リウマチの患者の血清および
滑液中で正常範囲を超える濃度で測定される（Bansal,
A.S.,Oliver,W.,Marsh,M.N.,Pumphrey,R.S.,およびWils
on,P.B.,Immunology 79,285−289（1993）;Hellen,E.
A.,Rowlands,D.C.,Hanse.,T.T.,Kitas,G.D.,およびCroc
ker,J.J.,Clin Pathol 44,293−296（1991）;Chomarat,
P.,Brioloay,J.,Banchereau,J.,およびMiossec,P.,Arth
ritis Rheum 86,234−242（1993）;Bansal,A.ら,Clin E
xp Immunol 89,452−455（1992）;Rezonzew,R.,およびN
ewkirk,M.M.,Clin Immunol Immunopathol 71,156−163
（1994））。さらに、慢性関節リウマチ患者の血清sCD2
3のレベルは、疾患の状態に関連し、血清のリウマチ因
子に相関する（Bansal,A.S.ら,Clin Exp Rheumatol 12,
281−285（1994））。慢性関節リウマチにおいては炎症
誘導性サイトカインが特に重要であると考えられ、関節
炎関節の破壊におけるTNF−αおよびIL−１βの中心的
な役割が推定されている（Brennan,F.M.,Chantry,D.,Ja
ckson,A.,Maini,R.,およびFeldman,M.,Lancet 2,244−2
47（1989）;Brennan,F.M.,Maini,R.M.,およびFeldman
M.,Br J Rheumatol 31,293−298（1992））。
また、CD23−CD21相互作用がIgE産生の制御にある役
割を果たすこと提唱されている（Flores−Romo L.ら,Sc
ience 261,1038−1041（1993）;Aubryら,Nature 358,50
5−507（1992））。
CD11bおよびCD11cは、多くの細胞−細胞および細胞−
マトリックス相互作用に参加する接着分子である。CD11
b/CD18およびCD11c/CD18（各々CD11bとCD18、およびCD1
1cとCD18の会合）は、CD54、フィブリノーゲン、第Ｘ因
子、LPS、Con Aおよびザイモサンを含む幾つかのリガン
ドに結合することが報告されている（Springer,T.A.,Na
ture 346,425−434（1990））。しかしこれらの結合分
子の役割は完全には理解されていない。CD11b/CD18およ
びCD11c/CD18はまた、各々MAC−１およびp150.95として
も知られている。これらは、β２インテグリンファミリ
ーのメンバーである（時にLeu−CAM、すなわち白血球細
胞接着分子として知られている）。このファミリーはま
た、そのメンバーにLFA−１を含む（CD11a/CD18として
も知られている）。
EP 0205405は、ヒト免疫グロブリンＥ結合因子（IgE
−BF）と交差反応するIgEのリンパ球細胞性受容体（FC
εＲ）に対するMab、およびその誘導体の開示を意図し
ている。
WO 93/04173は、FCEL（低親和性IgE受容体FCεR II）
またはFCEH（高親和性受容体FCεR I）の１つに結合す
ることができるが、他のFCELまたはFCEHには実質的に結
合することができないポリペプチドの開示を意図してい
る。FCELまたはFCEHに特異的なポリペプチドによるアレ
ルギー性疾患の治療が主張されている（FCEH特異的ポリ
ペプチドが、FCEHに交差反応することができず、ヒスタ
ミン放出を誘導することができない場合）。
EP 0269728は、ヒトリンパ球IgE受容体に対するMabの
開示を意図している。
EP 0259585は、ヒトＢリンパ球上のIgEの表面受容体
（FCεＲ）を認識するMabの開示を意図している。
WO 93/02108は、治療用途のための霊長類化（primati
sed）抗体の開示を意図している。
驚くべきことに本発明者らは、CD23に対する結合物質
が種々の疾患の治療または予防に、そして特に関節炎の
治療または予防に有用であることを発見した。本発明以
前に、CD23が記載された多くの論文が刊行されたにもか
かわらず、このような有用性を支持するようなデータは
提供されていない。
本発明により、炎症疾患、自己免疫疾患またはアレル
ギー疾患の治療または予防に使用するためのCD23に対す
る結合物質が提供される。
本結合物質は、CD23とこれに結合するリガンドとの間
の相互作用を阻止することにより機能する。このような
阻止効果を検討するためにインビトロ評価法、例えば放
射免疫測定法を使用することができる。
本結合物質は、単離された形で、または薬剤組成物の
一部として存在してよい。望ましくは滅菌された形で存
在する。一般にCD23に対して特異的な結合物質は、開示
される治療／予防に有用である。
本発明者らは、本発明の範囲内の結合物質が、炎症疾
患または自己免疫疾患の治療または予防においてインビ
ボで作用することを証明した。
これらの疾患の多くが、その性質や原因に関する長期
間の研究にもかかわらず有効な治療が困難であるかまた
は不可能であるため、この証明は非常に重要である。こ
れは特に、中年の人々をしばしば苦しめ、早すぎる時期
に仕事をあきらめさせる関節炎に関して当てはまる。関
節炎の有効な治療は、多くの研究グループの長年のゴー
ルである。
好適な結合物質は、抗体、その断片、または抗体若し
くはその断片からなる人工作成体、または抗体若しくは
その断片の結合を模倣するように設計された人工作成体
を含む。このような結合物質は、Dougallらにより検討
されている（Totech 12,372−379（1994）。
これらは、完全な抗体、Ｆ（ab'）２断片、Fab断片、
Fv断片、ScFv断片、他の断片、CDRペプチドおよび模倣
物を含む。これらは、当業者は入手／調製することがで
きる。例えば、Ｆ（ab'）２およびFab断片を入手するた
めに酵素消化を使用することができる（IgG分子に各々
ペプシンまたはパパイン切断を行うことにより）。以下
の説明中の「抗体」に関しては、上述の全ての可能性を
含むと解すべきである。
組換え抗体を使用してもよい。この抗体は、ヒト化し
てもよいし、またはキメラ化してもよい。
CDRがこの抗体の可変ドメインのフレームワークとは
異なる種から誘導されたヒト化抗体の典型的な調製法
は、EP−Ａ−0239400に開示されている。このCDRは、ラ
ットまたはマウスモノクローナル抗体から得ることがで
きる。改変された抗体の可変ドメインのフレームワーク
および定常ドメインは、ヒト抗体から得られる。このよ
うなヒト化抗体は、ヒトに投与された場合、ラットまた
はマウス抗体に対してヒトが起こす免疫応答に比較する
と無視できるほどの免疫応答しか誘発しない。
あるいは、この抗体は、例えばWO 86/01533に記載さ
れる型のキメラ抗体であってもよい。
WO 86/01533によるキメラ抗体は、抗原結合領域と非
免疫グロブリン領域からなる。この抗原結合領域は、抗
体軽鎖の可変ドメインまたは重鎖の可変ドメインであ
る。典型的には、このキメラ抗体は、軽鎖と重鎖の可変
ドメインの両方からなる。非免疫グロブリン領域は、そ
のＣ末端で抗原結合領域に縮合している。この非免疫グ
ロブリン領域は、典型的には非免疫グロブリンタンパク
質であり、酵素領域、既知の結合特異性を有するタンパ
ク質から得られる領域、タンパク毒素から得られる領
域、または実際に遺伝子により発現される任意のタンパ
ク質から得られる領域であってよい。キメラ抗体のこの
２つの領域は、切断可能なリンカー配列により接続する
ことができる。
この抗体は、ラットまたはマウスの可変領域（キメラ
抗体）またはCDR（ヒト化抗体）を有する、IgG1、IgG
2、IgG3、IgG4のようなヒトIgG;IgM;IgA;IgEまたはIgD
であってよい。
WO 93/02108に開示されるような、霊長類化法も使用
することができる。
当業者には理解されるであろうが、具体的な結合物質
が本明細書に記載される場合には、このような物質の誘
導体も使用することができる。「誘導体」という用語
は、記載される物質に比較して１つまたはそれ以上のア
ミノ酸の置換、欠失または挿入を有するが、同時に記載
される結合活性をなお有する、この物質の変種を含む。
好適にはこれらの誘導体は、特定した結合物質と実質的
に同一のアミノ酸配列を有する。
アミノ酸配列の同一性の程度は、「ベストフィット
（bestfit）」（SmithおよびWaterman,Advances in App
lied Mathematics,482−489（1981））などのプログラ
ムを使用することにより計算して、任意の２つの配列間
の類似性の最良のセグメントを見い出すことができる。
この配列は、SchwarzおよびDayhof（（1979）「タンパ
ク質の配列と構造のアトラス（Atlas of Protein Seque
nce and Structure）」,Dayhof,M.O.編,pp 353−358）
により記載されるような、アミノ酸類似性のマトリック
スを使用して達成されるスコアの最大化に基づく。
好適には配列同一性の程度は、少なくとも50％、さら
に好適には少なくとも75％である。少なくとも90％また
は少なくとも95％の配列同一性は、最も好適である。
それにもかかわらず、種々のアミノ酸が、タンパク質
のある種の性質を実質的に改変するか、またはこれに有
害な影響を与えることなく、しばしば類似の性質を有す
る他のアミノ酸に置換されるため、酸列同一性が高度で
あることは必ずしも必要ではないことは当業者には理解
されるであろう。これらは時折「保存的（conservativ
e）」アミノ酸変化と呼ばれる。すなわち、グリジン、
バリン、ロイシンまたはイソロイシンのアミノ酸は、し
ばしば相互に置換することができる（脂肪族ヒドロキシ
ル側鎖を有するアミノ酸）。しばしば相互に置換するこ
とができる他のアミノ酸は、以下のものを含む：フェニ
ルアラニン、チロシンおよびトリプトファン（芳香族側
鎖を有するアミノ酸）；リジン、アルギニンおよびヒス
チジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；アスパラギン
酸およびグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）；
アスパラギンおよびグルタミン（アミド側鎖を有するア
ミノ酸）；およびシステインおよびメチオニン（イオウ
含有側鎖を有するアミノ酸）。すなわち、「誘導体」と
いう用語はまた、その配列に比較して１つまたはそれ以
上のこのような「保存的」変化からなるアミノ酸配列の
変種をも含む。
本発明はまた、記載される結合活性をなお有する、結
合物質の断片または本発明の断片若しくはその誘導体の
断片も含む。好適な断片は、少なくとも10アミノ酸の長
さであるが、さらに長くてもよい（例えば、50または10
0アミノ酸長まで）。
本発明の結合物質は、関節炎、紅斑性狼瘡、橋本甲状
腺炎（Hashimoto thyroiditis）、多発性硬化症、糖尿
病、ブドウ膜炎、皮膚炎、乾癬、蕁麻疹、ネフローゼ症
候群、糸球体腎炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クロ
ーン病、シェーグレン症候群、アレルギー、喘息、鼻
炎、湿疹、GVH、COPD、インスリン炎、気管支炎（特に
慢性気管支炎）または糖尿病（特に１型糖尿病）を含
む、幾つかのヒトの疾患の治療または予防に有用である
と考えられる。
これらはまた、CD23と種々のリガンドの間、例えば、
CD23とCD21の間、CD23とCD11bの間、CD23とCD11cの間、
CD23と70〜85kDa内皮細胞タンパク質（これは76、80ま
たは85kDaの内皮細胞タンパク質）の間またはCD23と115
kDa内皮タンパク質（これは70〜85kDaの内皮タンパク質
に関連すると考えられる）の間の相互作用を研究するの
に有用であろう。上記相互作用の１つまたはそれ以上は
インビボで発生すると考えられる。これらの相互作用を
阻止することができる抗体または他の結合物質は、これ
らがサイトカインが媒介する炎症性作用を低下または軽
減するのに特に適していると考えられるため、特に好適
である。これらはまた、慢性リンパ性白血病のようなＢ
細胞悪性腫瘍、および有毛細胞白血病に対しても有用で
あろう。
本発明の結合物質は、慢性関節リウマチの治療または
予防における使用に特に適用可能である。理論に拘束さ
れるわけではないが、下記の可能性ある説明が提唱され
る： 慢性関節リウマチの炎症性滑膜において、マクロファ
ージはCD23とβ２インテグリンのCD11bおよびCD11cの両
者を発現して、この組織において同型の相互作用が起こ
りうる。さらに、滑膜を通しての可溶性CD23分子の拡散
およびインテグリンリガンドへのこれらの結合も可能で
ある。したがって、正の活性化ループに関与するCD23−
CD11b/CD11c相互作用がインビボで存在しえる。慢性関
節リウマチ患者に存在するならば、これは疾患の増悪お
よび慢性化の病因となる機構の一部を説明することがで
きるし、一旦関節に局在すると、マクロファージ自体
は、CD23分子、β２インテグリンのCD11bおよびCD11c、
並びに炎症誘導性サイトカインのTNF−α、IL−１βお
よびIL−６に関係する経路により炎症を維持し増悪させ
ることが可能であるという仮説を支持するであろう。
抗CD23療法の作用の代替機構には、IgE免疫応答の阻
止が関係するであろう。
以前に発表された研究では、抗CD23抗体によるラット
のインビボの治療が、恐らくIgEを産生するＢ細胞の完
全な分化に必要なCD23−CD21相互作用を阻止することに
より、IgE産生の抗原特異的阻害を引き起こすことが証
明された（Flores−Romoら,Science 261,1038−1041（1
993））。
本発明はまた、このような応答を阻止するCD23に対す
る結合物質も含む。
構造的に、CD21タンパク質は、短いコンセンサス繰り
返し（short consensus repeat）（SCR）と呼ばれる60
〜75アミノ酸の15（Mooreら，ヒトＢリンパ球のエプス
タインバーウイルスC3d受容体（２型補体受容体）をコ
ードするcDNAの分子クローニング,Proc Natl Acad Sci
USA 84:9194（1987））または16（Weisら,C3dおよびエ
プスタインバーウイルスのヒトＢリンパ球受容体の構造
並びにC3/C4結合タンパク質のファミリーの他のメンバ
ーへの関係,J.Exp Med 167:1047（1988））繰り返し単
位の細胞外ドメイン、これに続く膜貫通型ドメイン（24
アミノ酸）および34アミノ酸の細胞質内領域からなる。
細胞質外SCRの欠失を有するCD21突然変異体を使用して
（Carelら,C3d,g/エプスタインバーウイルス受容体（CR
2/CD21）リガンド結合、インターナリゼーション、およ
びウイルス感染に対する構造的な要求,J Biol Chem 26
5:12293（1990））、本発明者らは最近、CD23がCD21上
のSCR5〜８および１〜２に結合することを見い出した。
SCR5〜８へのCD23の結合は、Asn295および370上の糖質
に関わる、レクチン様の相互作用である。対照的に、SC
R1〜２へのCD23の結合は、タンパク質−タンパク質相互
作用である（Aubryら、CD23は、CD21上のＮ結合オリゴ
糖に関係する新規な機能性細胞質外ドメインと相互作用
する,J Immunol 152:5806（1994））。そこで本発明者
らは、CD21へのCD23の結合に及ぼす、そしてIL−４の存
在下でIg産生の調節に及ぼす、CD21の他のリガンド（EB
V、C3d,gおよびIFN−α）の効果を試験した。EBV粒子お
よびEBV由来のペプチドのみがCD21へのCD23の結合を阻
害することができた。さらに、EBVペプチドは、IgEおよ
びIgG4産生を選択的に減少させ、IgM産生を増加させ
た。これらのデータは、CD21上のEBV結合部位へのCD23
の結合が、IL−４の存在下でのヒトIg産生を選択的に調
節することを示す。
再び理論に拘束されるわけではないが、本発明によ
り、炎症誘導性サイトカインの新規生合成を抑制するこ
とにより有効な治療が達成されると考えられる。
これは、既に炎症組織に存在するサイトカイン分子を
単に直接中和するための従来の抗体の使用とは異なる。
多数の抗体、並びに抗体が治療において有用であると
言われる多数の可能性ある疾患をリストするが、可能性
ある多くの組合せについて完全な証拠またはデータを何
も提供しない、推論的な刊行物が存在することにも注意
すべきである。このような発表の１つは、WO 93/02108
であり、これは主に特定のキメラ抗体の産生に関するも
のである。
本発明は、本明細書に提供されるデータおよび説明に
より、ある種の疾患の治療または予防における有用性を
明らかに示す、特定の分子に対する結合物質を提供する
ことにより、このような刊行物とは明らかに区別され
る。
本発明の結合物質はまた、非IgE媒介性疾患を含む、
アレルギー性疾患の治療または予防に特に有用である。
これらは、潰瘍性大腸炎の治療および予防に使用するこ
とができる。これらはまた、クローン病の治療および予
防に使用することができる。
本発明の結合物質は、単独で、あるいはステロイド、
シクロスポリン、または抗リンパ球抗体のような抗体な
どの免疫抑制物質と組合せて、またはさらに好適には耐
性誘導性、抗自己免疫または抗炎症物質［例えばCD4＋
Ｔ細胞阻害物質（例えば、抗CD4抗体（好適には阻止性
または非涸渇性抗体）、抗CD8抗体、TNFアンタゴニスト
（例えば、抗TNF抗体またはTNF阻害物質（例えば、可溶
性TNF受容体）］、またはNSAIDのような物質と組合せて
使用することができる。
本結合物質は、滅菌済の薬剤学的に許容しうる組成物
の一部として通常供給されるであろう。この薬剤組成物
は、これを患者に投与する目的の方法により、任意の適
切な形であってよい。これは単位投薬形で提供されて
も、キットの一部として提供されてもよい。このような
キットは、普通（必須ではないが）使用説明書を含む。
結合物質の投与は、例えば、静脈内、筋肉内または皮
下投与のように、一般に非経口的に行われる。本結合物
質は、一般に注射または注入により投与される。この目
的のため結合物質は、薬剤学的に許容しうる担体または
希釈剤を含有する薬剤組成物に処方される。任意の適切
な担体または希釈剤（例えば、等張性食塩水）を使用す
ることができる。銅が誘発する切断を回避するため、金
属キレート化剤のような安定化剤を添加してもよい。適
切なキレート化剤は、EDTA、DTPAまたはクエン酸ナトリ
ウムであろう。
特に呼吸器疾患の治療には、これらを噴霧により経口
的にまたは鼻内に投与してもよい。
特に皮膚疾患の治療に使用するため、これらをクリー
ム剤または軟膏剤として処方することができる。
春季カタルのような疾患の治療に使用するため、目へ
の投与用に、これらを滴下剤などとして処方することが
できる。
注射のため、使用することができる賦形剤は、例え
ば、水、アルコール、ポリオール、グリセリン、および
植物油を含む。
本薬剤組成物は、保存剤、可溶化剤、安定化剤、湿潤
剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、着臭剤、塩類、緩衝化
剤、コーティング剤または抗酸化剤を含有してもよい。
これらはまた、他の臨床的に活性な薬剤を含有してもよ
い。
本発明の物質の適切な用量は、治療すべき疾患または
障害、投与の経路および治療すべき個人の年齢と体重な
どの要因により変化する。特定の用量に拘束されない
が、例えば非経口投与には、典型的な成人の治療には本
発明の結合物質（通常上述のように薬剤組成物の一部と
して存在する）0.01〜50mg/kgの１日用量が適切であろ
う。さらに適切には、用量は0.05〜10mg/kg（例えば0.1
〜2mg/kg）である。
この用量は、適宜繰り返し投与される。典型的には、
１週間に１〜７回の投与である。副作用が発生すれば、
投薬量及び／又は投薬頻度を減少させることができる。
このように薬剤組成物に組み込むための典型的な単位
用量は、少なくとも1mgの結合物質、適切には１〜1000m
gであろう。
本発明は、発明の範囲内にCD23に結合する特定の物質
が、炎症疾患、自己免疫またはアレルギー性疾患の治療
に有用であるかどうかを決定するための測定法を含み、
この測定法は、その物質が、CD23とCD11bの間の相互作
用、またはCD23とCD11cの間の相互作用、またはCD23とC
D21の間の相互作用、またはCD23と内皮細胞で発現され
る70〜85kDa（76kDa、85kDaまたは80kDaなど）若しくは
115kDaタンパク質の間の相互作用を阻止することができ
るかどうかを決定することからなる。
この測定法は、適切な分子を発現する細胞株を使用す
ることにより、化合物若しくは分子のスクリーニングに
使用することができる。好適には、CD11bがCD11b/CD18
としてこれらの測定法に使用され、そしてCD11cがCD11c
/CD18として使用される。CD11b/CD18とCD11c/CD18は細
胞表面上で同時発現することができる。
例えば、タンパク質−非タンパク質測定法（例えば、
化学物質または糖類とのタンパク質の相互作用の測
定）、タンパク質−タンパク質測定法またはタンパク質
−細胞測定法のような、任意の適切な測定法を使用する
ことができる。
ここで本発明を、添付した図面のみを参照しながら実
施例により説明する。図面中： 図１は、抗CD23抗体を使用したマウスの関節炎に対す
る予防処置の効果を示し； 図２は、抗体の複数回治療が使用される、確立した関
節炎に関する抗CD23抗体によるマウスの治療の効果を示
し； 図３は、単回治療が使用される、確立した関節炎に関
する抗CD23抗体によるマウスの治療の効果を示し； 図4a）およびｂ）は、複数回治療が使用される、確立
した関節炎に関するモノクローナル抗CD23抗体によるマ
ウスの治療の効果を示し； 図4c）およびｄ）は、複数回治療が使用される、確立
した関節炎に関するモノクローナル抗CD23抗体のＦ（a
b'）２およびFab断片によるマウスの治療の効果を示
し； 図5aは、CD14陽性単核血球へのCD23リポソームの結合
を示し； 図5bは、SDS−PAGEゲル上の種々のCD23親和性精製し
たタンパク質を示し； 図６は、ある種のモノクローナル抗体を使用して得ら
れる、活性化単球へのCD23リポソームの結合の阻害百分
率を示し； 図７は、種々のトランスフェクションした細胞へのCD
23リポソームの結合を示し； 図８は、CD23−CD11bおよびCD23−CD11c相互作用に及
ぼす種々の物質の効果を示し； 図９は、CD11bおよびCD11cへのCD23の結合により引き
起こされる、単球の亜硝酸産生および酸化的バースト
（oxidative burst）に及ぼす効果を示し；そして 図10は、CD11bおよびCD11cへの組換えCD23の結合が、
単球によるサイトカイン産生を特異的に増加させること
を示す。
実施例 （以下の実施例の幾つかにおいて「ip」、「id」および
「ｎ」という用語が使用される。これらは、各々「腹腔
内」、「皮内」および「動物の数」を意味する。） 実施例１ 抗CD23抗体を使用する関節炎に対するマウス
の予防的処理 オスのDBA/1マウス（８〜12週齢）を0.1mlのフェンタ
ニル／フルアニソール「ヒプノルム」（Fentanyl/Fluan
isol‘Hypnorm'）ipの1:10希釈物により鎮静化し、フロ
イント完全アジュバント（ディフコ（Difco））中で乳
化した100mgのウシII型コラーゲン（C II）を尾の基部
に皮内注射した。C IIの免疫の13日後に、プロテインＡ
−セファロース（バイオプロセッシング（Bio−Process
ing）、英国）を用いて精製したウサギ抗CD23 IgG（2mg
/マウス、ip）の単回注射により、試験マウスを処理し
た（ｎ＝16、■−−■）。この精製した抗CD23 IgGは、
３〜５％の特異的抗体を含有する。
この産生の詳細な説明は、Flores−Romo L.ら,Scienc
e 261 1038−1041（1993）に記載されている。簡単に述
べると、全長CD23のアミノ酸150〜321に対応する、ヒト
CD23の端を切り取った形に対して、ウサギポリクローナ
ル抗体を産生させた［Kikutaniら,Cell 47 657（198
6）］。この端を切り取ったポリペプチドは、大腸菌
（E.coli）で産生させて、イオン交換およびゲル濾過に
より大腸菌の洗浄したペレットから精製した。これは25
kDの分子量を持ち、精製後ウサギに注射した。生じた抗
血清は、組換えヒトCD23によるELISAおよびタンパク質
免疫ブロット法で試験して両方とも陽性であった。次に
IgG画分を、プロテインＡ−セファロース親和性クロマ
トグラフィーにより単離した。対照動物には、正常ウサ
ギ血清からプロテインＡで精製したIgG（2mg/マウス）
を投与した（ｎ＝17、●−−−●）。関節炎の臨床的徴
候の進展についてマウスを毎日観察した。疾患の重篤度
を、Williamsら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89 9784−978
8（1992）に記載されたように、０＝徴候なし、から、
３＝著しい腫脹、紅斑および運動障害、のスケールを使
用して、各足蹠でスコア付けした。肢の増大は、患部足
蹠の数を計測することにより評価した。（ａ）では両側
ｔ検定、（ｂ）ではノンパラメトリックなマン−ホイッ
トニー（Mann−Whitney）検定を使用する統計解析によ
り群を比較した；＊0.05≧ｐ＞0.01、＊＊0.01≧ｐ＞0.
005、＊＊＊0.005≧ｐ。
発症（発症の中央日＋標準誤差：試験群で20＋0.7、
対照群で20＋0.5）または発病率（両群で100％関節炎マ
ウス）に差は観察されず、このことは、抗CD23抗体によ
る処理が、Ｔ細胞増殖およびIgG抗コラーゲン抗体誘導
の時の疾患誘発に影響しなかったことを示している。し
かし総臨床スコアは、抗CD23抗体で処理したマウスで低
かった（図1a）。最も注目すべきは、抗CD23処理群にお
ける肢の増大の著しい抑制であった（図1b）。これらの
結果は、この疾患の長期の進行に及ぼす本処理の強力な
影響を示すものである。
実施例２ 確立した関節炎の処理（複数回処理） 実施例１に開示されたように関節炎を誘導し、マウス
は目に見える炎症の進展について毎日モニターした。臨
床的炎症の第１日目（１日目）および２日後（３日目）
に、ランダムに分類した３群のマウスに処理を行った。
試験マウスには、プロテインＡで精製した抗CD23 IgG
（200μg/注射、ｎ＝６、 400μg/注射、ｎ＝８、■−−■）を投与し；対照マウ
スには、プロテインＡで精製した正常ウサギIgG（200μ
g/注射、ｎ＝15、●−−−●）を投与した。疾患の重篤
度（図2a）は、実施例１に記載したように評価した。炎
症は、第１の足蹠の１日目から測径器（プロクテスト2T
（Proctest 2T）、クロエプリン・ランゲンメステクニ
ーク（Kroeplin Langenmesstechnik））を使用して、関
節炎になるまでの腫脹の増加量により評価した。両側ｔ
検定を用いて群を比較した（＊0.05≧ｐ＞0.01、＊＊0.
01≧ｐ＞0.005、＊＊＊0.0005≧ｐ）。
疾患の重篤度の著しい改善が見られ、これは用量依存
的である。抗CD23IgGの抗炎症性は、抗体処理を受けた
マウスの群における足蹠腫脹の低下により明白に証明さ
れる。
実施例３ 確立した関節炎の処理（単回処理） 関節炎の１日目に、2mg/マウスのプロテインＡで精製
した抗CD23 IgG（ｎ＝10、■−−■）、または精製した
正常ウサギIgG（ｎ＝10、●−−−●）で１回だけ処理
したことを除いて、実験計画は実施例２と同様であっ
た。臨床スコアおよび肢の増大は、実施例１のように評
価した。
１日目の１回の注射後得られた肢の増大に及ぼす有意
な効果は、関節の増大の点からみると、関節炎が既に確
立したときに投与される単回の注射が、さらなる疾患の
進行に対して保護するのに充分であることを示している
（図3b）。
実施例４ モノクローナル抗CD23による確立した関節炎
の処理 関節炎DBA/1マウスを実施例１に記載したように入手
した。臨床症状の最初の兆候があったとき、マウスをラ
ンダムに４群に分類して、１日目と３日目に３用量のCD
23に対するモノクローナル抗体（B3B4、D.Conrad教授、
リッチモンド、バージニア州、米国から提供を受けた
が、ファーミンゲン（Pharmingen）から入手可能であ
る。これはJ Immunol 138:1845−1851（1987）に報告さ
れている）で処理した;B3B4 25μg/注射、ｎ＝４、 B3B4 50μg/注射、ｎ＝４、■−−−■;B3B4 100μg/注
射、ｎ＝５、■−−■。対照のマウスにはPBS を投与した。臨床的スコアおよび１日目からの足蹠の厚
みの増加は、実施例２に記載したように評価した。
50μｇのB3B4モノクローナル抗体の腹腔内注射は、こ
の治療法を使用して得られる臨床スコアおよび患部足蹠
の数の有意な低下により示されるように、有効な治療と
して充分なものであった。これに反して、25μｇモノク
ローナル抗体で処理したマウスの疾患の重篤度は、50μ
g B3B4モノクローナル抗体で得られる治療効果を改善し
なかった（図４）。B3B4投与の用量依存的な抗炎症作用
は図4bに示すように、50または100μｇのモノクローナ
ル抗体B3B4のip注射を受けた群における、関節炎の足蹠
の腫脹は１日目から増大しなかった。他の臨床的測定で
観察されるものと同様に、疾患の発症後投与される25μ
ｇのモノクローナル抗CD23の用量では、治療的に有効で
はなく、足蹠腫脹の増大は対照と同様であった（図4
b）。同様に、確立した関節炎の重篤度の有意な低下
が、50μｇの親和性精製したポリクローナル抗CD23 IgG
による処理後に得られた（データは示していない）。
抗CD23抗体（モノクローナルとポリクローナルの両
方）による処理後の臨床的重篤度の改善は、関節炎足蹠
の組織学的検査により確認した。処理したマウスは、軟
骨と骨の破壊がはっきりしておらず、滑膜の内下層（su
blining layer）の細胞浸潤の著しい低下が見られ、疾
患の重篤度の低下を示した。さらには、抗CD23抗体で処
理した動物においては、対照マウスに比較すると損傷の
大きな関節が少なく（０％対94％）、一方正常な構造を
維持している関節の比率が有意に上昇した（80％対０
％）。
このことは、下記表１に示される： 表1:足蹠の組織病理所見：図４に示されるようにマウス
を処理し、関節を処理した。方法に記載されるように組
織学的調製物にスコア付けした。
この表は、抗CD23で処理したマウスまたは対照マウス
からとった関節の組織調製物の比較を示す。マウスは、
図４に記載したように処理した。
組織病理所見は下記のように評価した： 関節炎になる第１の肢を死後とりだし、10％（重量／
容量）緩衝化ホルマリン中で固定し、緩衝化ホルマリン
中のEDTA（5.5％）中で脱石灰化した。次に足蹠をパラ
フィンに包埋し、切片化してヘマトキシリンとエオシン
で染色した。以下の評価基準を用いて組織学的調製物
（３切片／足蹠）にスコア付けした：低度＝極くわずか
な滑膜炎、軟骨減量および分離した病巣に限定される骨
腐食；中度＝滑膜炎と腐食が存在するが関節の構造はそ
のまま；重度＝関節の構造の破壊を伴う広範な滑膜炎と
腐食。各切片の関節を評価して、正常、低度、中度また
は重度スコアを表す百分率を決定した。炎症は、測径器
（プロクテスト2T（Proctest 2T）、クロエプリン・ラ
ンゲンメステクニーク（Kroeplin Langenmesstechni
k））を使用して、処理の第１日目の足蹠の厚みに比べ
た足蹠の厚みの増加により評価した。
この処理の特異性を支持するさらなる証拠は、B3B4モ
ノクローナル抗体のFabおよびＦ（ab'）２断片で関節炎
マウスを処理することにより得られた。完全なIgG分子
よりは強力でないものの、B3B4のFabおよびＦ（ab'）２
断片はなお有効であり、このように抗体のFc部分は、こ
の活性に必須ではないことを示している（表２）。さら
には、CD72およびB220分子に対する抗体（両者ともＢリ
ンパ球で高度に発現される）は、ほとんど〜全く治療活
性を示さなかった（表２）。さらにTNF−α（Williams
ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 36:9784−9788（1992））
およびCD5（Plater−Zyberkら,Clin Exp Immunol 98:44
2−447（1994））に対する抗体との比較により、我々の
実験条件では、抗CD23抗体処理が最も有効であることが
判った（表２）。
表2:異なる治療法に対する応答の比較：マウスをII型コ
ラーゲンで免疫して、臨床的関節炎の１日目と３日目に
モノクローナル抗体のip注射により治療的に処理した。
５日目の臨床スコアの低下は、各実験で使用されるイソ
タイプ対照の百分率として計算した。
モノクローナル抗体およびその断片に関するさらなる
データは、図4cおよび4dに提供される。これらのデータ
は、下記プロトコールに基づく： オスの８〜12週齢のDBA/1マウスに、完全フロイント
アジュバントに乳化したウシII型コラーゲン100μｇをi
d注射する。
臨床症状の最初の兆候があったとき（±３週間後）、
マウスにモノクローナル抗体の下記調製物をip注射する
（注射は１日目と３日目）： B3B4全IgG2a 50μg/注射、ip、ｎ＝８ B3B4のFab 150μg/注射、ip、ｎ＝６ B3B4のＦ（ab'）２ 75μg/注射、ip、ｎ＝７ M6対照IgG2a 50μg/注射、ip、ｎ＝７ マウスを毎日点検し、各足蹠の臨床疾患の重篤度をス
コア付けした（最大／足蹠＝3;最大／マウス＝12）。臨
床疾患のスコア付けの結果は図4cに示す。
第１の関節炎の足蹠の腫脹は測径器を使用して追跡す
る。足蹠腫脹のスコア付けの結果は図4dに示す。
関節炎10日目にマウスを屠殺し、組織学的検査のた
め、関節炎になる第１の足蹠を切開し、固定して脱石灰
化した。
CD23とCD11bの間およびCD23とCD11cの間の相互作用 理論に拘束されるわけではないが、どのように抗CD23
抗体が前述の驚くべき結果を達成するかが充分に理解さ
れておらず、CD11bおよび／またはCD11cとのCD23の相互
作用に起因する可能性もある。実施例５〜10および添付
した図面（後述）がこれを説明する。これらの実施例に
おいて、蛍光リポソームに組み込まれた全長組換えCD23
は、CD11b/CD18またはCD11/CD18のいずれかをコードす
るcDNAでトランスフェクションされたCOS細胞に結合す
るが、CD11a/CD18を発現するトランスフェクション体に
は結合しないことが判った。このCD23−リポソームと、
CD11b/CD18またはCD11c/CD18でトランスフェクションし
たCOS細胞の間の相互作用は、各々抗CD11bまたは抗CD11
cにより、そして抗CD23モノクローナル抗体により特異
的に阻害された。このリガンド対合の機能的重要性は、
単球上のCD11bおよびCD11cを、組換えCD23または抗CD11
bおよび抗CD11cモノクローナル抗体のいずれかにより刺
激し、亜硝酸（NO2 -）、酸化生成物（H2O2）および炎症
誘導性サイトカイン（IL−１β、IL−６およびTNF−
α）の著しい増加を引き起こすことにより証明した。こ
れらのCD23が媒介する活性は、CD11b、CD11cおよびCD23
に対するモノクローナル抗体のFab断片により低下し
た。これらの結果は、表面接着分子のCD11bおよびCD11c
がCD23の受容体であり、この新規リガンド対合が単球の
重要な活性を調節することを証明している。
以下の説明で、実験計画および実施例５〜10（後述）
の根拠を簡単に説明する： 全単核血球を、蛍光リポソームに組み込んだ組換え全
長CD23と共にインキュベートして、フローサイトメトリ
ーにより解析した（Pochon,S.ら,J.Exp.Med.176,389−3
98（1992））。ある画分がCD23−リポソームに結合し
（実施例５、図5a）、次に二重染色によりこれがCD14陽
性細胞（すなわち単球）よりなることが証明された。単
球がCD23−リポソームに結合することができることを確
認するため、単核細胞を、CD14陽性およびCD14陰性細胞
集団にFACSでソートした（実施例５、図5a）。CD23−リ
ポソームは、CD14陽性細胞集団にのみ結合することが判
った（実施例５、図5a）。単球は、CD23の既知のリガン
ドである、膜IgEもCD21も発現しないことがわかったた
め（データは示していない）、単球がCD23の異なる受容
体を発現するかどうか研究した。単球を溶解して、親和
性カラムで精製した細胞抽出物を組換え可溶性CD23とカ
ップリングさせた。溶出した物質のSDS−PAGEおよび銀
染色分析により、80および160kDa分子量付近にバンドが
現われた（実施例５、図5b）。この範囲の分子量内の抗
原を認識し、かつ単球で発現することが報告されている
抗体を、単球へのCD23−リポソーム結合を阻害するその
能力についてFACSにより試験した（実施例６、図６）。
抗CD11bおよび抗CD11cモノクローナル抗体の両方が、種
々の強度で単球へのCD23−リポソーム結合を阻害した
（実施例６、図６）。抗CD13、抗CD49d、抗CD21（単球
で発現されない）および抗CD11a（接着分子のβ２イン
テグリンファミリーの第３のメンバー）は、有意な作用
がなかった（実施例６、図６）。MHCクラスＩ、クラスI
I、CD14およびCD45（その全てが単球で高度に発現され
る）に対する抗体も、CD23−リポソーム結合に及ぼすそ
の効果について試験した。しかしそのいずれも何らの効
果もなかった（データは示していない）。抗CD18モノク
ローナル抗体は、CD23結合を部分的に阻害した。これ
は、抗CD18 Mab結合によりCD11bおよびCD11c分子の立体
障害またはコンホメーション変化が誘導されたことによ
るものであろう。CD23親和性カラムから溶出した単球由
来のタンパク質は、抗CD11c（実施例５、図5b）および
抗CD11c/CD18抗体（データは示していない）に免疫反応
性であった。
CD11b/CD18およびCD11c/CD11bのα鎖がCD23の受容体
であることを確認するため、CD11bおよびCD11cをコード
する全長CDNAを一時的にCD18 cDNAと共にCOS細胞中に同
時トランスフェクションした。CD11b/CD18およびCD11c/
CD18を発現するトランスフェクション体は、CD11a/CD18
を発現するトランスフェクション体とは対照的に、両方
ともCD23−リポソームに結合することが判った（実施例
７、図７）。このことは、CD11aへの相同性と比較した
ときの、CD11bとCD11cの間の高い相同性により説明でき
るかも知れない。この相互作用の特異性は、抗CD11b、
抗CD11cおよび抗CD23モノクローナル抗体を使用するCD2
3−リポソーム結合の阻害により証明された。CD11b/CD1
8およびCD11c/CD18を発現するBHK細胞を使用して同じ結
果が得られた（データは示していない）。CD23相互作用
の特異性のさらなる証拠として、βサブユニットをコー
ドする遺伝子の突然変異によりβ２インテグリン発現を
欠いている、白血球接着欠損（Leukocyte Adhesion Def
iciency）患者からの活性化血液単球は、CD23−リポソ
ームに結合できなかった（データは示していない）。共
にこれらのデータは、正常ヒト単球およびトランスフェ
クション体上で、CD23がCD11bおよびCD11cと相互作用す
ることを証明している。
CD11bおよびCD11cは、多くの細胞−細胞および細胞−
マトリックス相互作用に関与する接着分子である。実施
例は、CD11b/CD18およびCD11c/CD18が、CD23に結合する
その能力により、さらなる接着機能を示すであろうこと
が示す。CD23は、CD23−リポソーム結合を用量依存的に
阻害する第Ｘ因子の能力により観察されるように、単球
上のCD11bまたはCD11cの表面発現に影響することなく
（データは示していない）、第Ｘ因子と近いかまたは同
一のエピトープを同定するようである（実施例８、図
８）。試験した他のリガンドはいずれも何ら効果がなか
った。CD23は、CD11bおよびCD11cとの相互作用におい
て、Ｃ型レクチンとして作用するであろう。EDTAは、CD
23結合に必要なCa2+のキレート化、および／またはCD11
bおよびCD11cへのリガンドの結合に必要な二価の陽イオ
ンのキレート化により、単球へのCD23の結合を低下させ
る（実施例８、図８）（Altieri,D.C.,J.Immunol.147,1
891−1898（1991））。CD23−CD11b/CD11c相互作用は、
単球へのCD23の結合を低下させるツニカマイシンの能力
（しかしノイラミニダーゼにはない）により観察される
ように、糖類（しかしシアル酸ではない）に関係するよ
うである。CD23は、細胞外にアミノ酸のトリプレット
（Asp、Gly、Arg）を有し（Kikutani,H.ら,Cell 47,867
−885（1986））、これらは逆向きでインテグリン受容
体の一般的な認識部位である。従って、このトリペプチ
ドに対するポリクローナル抗体を、単球へのCD23の結合
を阻害するその能力について試験した。阻害は観察され
ず、フィブリノーゲンで得られた阻害が存在しないこと
が確認された（実施例８、図８）。CD23のレクチンドメ
インで結合しているIgEは、単球へのCD23の結合を部分
的に阻害する（実施例８、図８）。これらの結果は、CD
23が、部分的に糖とタンパク質の構造を認識するＣ型レ
クチンとして作用するであろうことを示しており、これ
はCD21とのCD23の相互作用について観察されたことを暗
示している（Aubry,J−P.ら,J.Immunol.152,5806−5813
（1994））。
CD11bまたはCD11cとのCD23の相互作用の機能的重要性
を評価するために、我々は、CD23−CD11b/CD11c相互作
用が、単球を刺激して、酸化窒素、H2O2およびサイトカ
インのような炎症誘導性メディエーターを放出させるこ
とができるかどうかを検討した。組換え可溶性CD23、抗
CD11bまたは抗CD11c抗体を使用する接着で活性化される
正常単球の刺激は、NO2 -の生成を増大させたが、これ
は、NO経路の活性化を示している（Moncada,S.,Palmer,
R.M.J.およびHiggs,E.A.,Pharmacol.Rev.43,109−144
（1991））。亜硝酸の産生に及ぼすCD23の効果は、抗CD
23モノクローナル抗体のFab断片およびNOシンターゼ経
路の特異的阻害物質であるニトロアルギニンにより阻害
された（実施例９、図9a）。酸化的バースト（oxidativ
e burst）も、組換え可溶性CD23、抗CD11bおよび抗CD11
cモノクローナル抗体の全てが、単球における臭化エチ
ジウムへのヒドロエチジンの酸化を引き起こしたため、
CD11bおよびCD11cを介して調節されることが判った（実
施例９、図9b）。このことは、抗CD11bモノクローナル
抗体が、単球における酸化的バーストを誘導するという
知見を確認し、これを拡張する（Trezzini,C.,Schuepp,
B,Maly,F.E.およびJungi,T.W.,Bri.J.Haematol.77,16−
24（1991））。CD11bおよびCD11cへのCD23の結合は、血
液単球における早期の特異的なCa2+流動に関係していた
（データは示していない）。
活性化マクロファージは、炎症誘導性サイトカインの
重要な供給源であるため、我々は、単球によるこのよう
なサイトカインの産生に及ぼす組換え可溶性CD23並びに
抗CD11bおよび抗CD11cモノクローナル抗体の効果を評価
した。組換え可溶性CD23、抗CD11bおよび抗CD11cモノク
ローナル抗体は、IL−１β、IL−６およびTNF−αの強
力な刺激物質であった。再び、この誘導の特異性が、抗
CD11b、抗CD11cおよび抗CD23モノクローナル抗体のFab
断片を使用することにより証明された（実施例10、図1
0）。興味深いことに、IL−１およびTNF−αは、単球へ
のCD23−リポソームの結合の強力な誘導物質であったが
（データは示していない）、このことは、CD11bおよびC
D11cの刺激および調節による、サイトカインの自己分泌
ループの可能性を示唆している。
実施例５ ａ）CD23−リポソームはCD14陽性血液単核細胞に結合す
る（図5aを参照） 血液単核細胞を、抗CD14モノクローナル抗体（ベクト
ン・ディッキンソン（Becton Dickinson）、エレンボデ
ゲム（Erembodegem）、ベルギー）で染色し、続いてマ
ウスIgGおよびIgMに対するヒツジFITC結合Ｆ（ab'）２
抗体（バイオアート（Bioart）、メウドン（Meudon）、
フランス）（いずれもPBS、0.5％BSAおよび0.05％アジ
化ナトリウムで希釈した）で染色し、次にCD14陽性細胞
集団とCD14陰性細胞集団にFACSでソートした（FACStar
Plus、ベクトン・ディッキンソン（Becton Dickinso
n））。次に、分離した細胞を、0.5％BSA、0.1％アジ化
ナトリウム、2mM CaCl2、140mM NaCl、20mM Hepes、pH
7、で希釈したCD23−リポソームまたは対照（グリコホ
リンＡ）−リポソームで染色し、４℃で２時間インキュ
ベートした（Pochon,S.ら、J.Exp.Med.176 389−398（1
992））。洗浄後、細胞（5,000回／条件）をFACSで解析
した。
ｂ）CD23−親和性精製した血液単核細胞タンパク質の見
かけの分子量と、抗CD11cモノクローナル抗体との免疫
反応性（図5bを参照） 血液単核細胞の溶解物を、CD23カラムで親和性精製
し、溶出したタンパク質をSDS−PAGEで分離し、ニトロ
セルロースに移した。分子量マーカーを左に示す。ゲル
を銀染色した（左のレーン）。フィルターを、イソタイ
プの一致した抗体（中央のレーン）または抗CD11cモノ
クローナル抗体（BU−15、左のレーン）とインキュベー
トし、次にホースラディッシュペルオキシダーゼ重合ヤ
ギ抗マウス抗体（ケーピーエル（Kpl）;Gaithersburg、
マサチューセッツ州）でインキュベートした。
実施例６ 抗CD11bと抗CD11cモノクローナル抗体は、活性化血液単
核細胞に対するCD23−リポソームの結合を低下させる
（図６を参照） 単核細胞からフィコールにより単核細胞を濃縮し、2m
Mグルタミンおよび10％熱不活性化FCS（フローラボラト
リーズ（Flow laboratories）、アーバイン（Irvin
e）、スコットランド）を補足したRPMI1640（セロメッ
ド（Seromed）、ベルリン、ドイツ）中でプラスチック
に一晩付着させた。次に、活性化単核細胞を、異なるモ
ノクローナル抗体（αCD）またはイソタイプの一致した
対照（CTRL）（ベクトン・ディッキンソン（Becton Dic
kinson））（すべて10μg/mlで試験した）の存在下で、
CD23−リポソームとインキュベートした。抗CD11aモノ
クローナル抗体25.3とＢ−B15は、それぞれイムノテッ
ク（Immunotech）（ルリニー（Luriny）、フランス）と
セロテック（Serotec）（オックスフォード、英国）か
ら得た。抗CD11bモノクローナル抗体44はセロテック（S
erotec）から、mon.Gran1はジャンセン（Janssen）（Be
erse、ベルギー）から、Leu−15はベクトン・ディッキ
ンソン（Becton Dickinson）（エレンボデゲム（Erembo
degem）、ベルギー）から、そして（Bear−１）はセラ
ーラボ社（Sera−Lab Ltd.）（サセックス、GB）から得
た。抗CD11cモノクローナル抗体3.9は、セロテック（Se
rotec）から、SL9はセラーラボ社（Sera−Lab Ltd.）か
ら、Bu−15はザバインディングサイト（The Binding Si
te）（バーミンガム、英国）から得た。抗CD13（SJ1D
1）、抗CD18（BL5）、抗CD23（mAb25）および抗CD49d
（HP2.1）モノクローナル抗体は、イムノテック（Immun
otech）から得た。抗CD21モノクローナル抗体BL13はイ
ムノテック（Immunotech）から、OKB7はオーソ（Orth
o）から、そしてBU−33はMacLennan博士（バーミンガム
大学、英国）から、HB−５はATCCから、OKBTはオーソダ
イアグノスティックスシステム（Ortho Diagnostics Sy
stem Inc）（Raritan、ニュージャージー州）から得
た。抗CD14、抗CD3、抗CD16および抗CD20モノクローナ
ル抗体は、ベクトン・ディッキンソン（Becton Dickins
on）から得た。細胞はFACSで解析し、平均蛍光強度（MF
I）を測定した。代表的な実験のデータを示す。対照−
リポソームで染色した細胞のMFIは6.5であり、CD23−リ
ポソームで染色したものは84.5であった。算術直線MFI
値は、以下の式から計算した： 阻害％＝MFI×［（CD23−リポソーム）］−［（CD23−リポソーム）＋Mab］ ×100/（CD23−リポソーム） 実施例７ CD23−リポソームは組換えトランスフェクション体上の
CD11b/CD18とCD11c/CD18のα鎖に結合する（図７を参
照） CD11aをコードするcDNA（コルビ（Corbi）、A.L.,Mil
ler,L.J.,O'Connor,K.,Larson,R.S.＆ Springer,T.A.EM
BO J.6,4023−4028（1987））を、pCDNA1（インビトロ
ゲン（Invitrogen）、サンジエゴ、カリホルニア州）に
再クローン化した。CD11bのcDNA（Corbi,A.L.,Kishimot
o,T.K.,Miller,L.J.＆ Springer,T.A.J.Biol.Chem.263,
12403−12411（1988））とCD18（Kishimoto,O'Connor,
K.,Lee,A.,Roberts,T.M.＆ Springer,T.A.Cell 48,681
−690（1987））を、pCDM8（Seed,B.,Nature 329,840−
842（1987））に再クローン化した。ジーンパルサー（G
ene Pulser）装置（バイオラッド（Bio−Rad）、リッチ
モンド、カリホルニア州）と0.4cmのキュベットを用い
て、20mM Hepes（pH7.4）、150mM NaCl中で電気穿孔法
（260V、960μFD）により、20μｇ一定分割量のDNAをCO
S−７細胞（ATCC）中にトランスフェクションした。細
胞表面でβ２インテグリンを発現させるために、CD11
a、ｂまたはｃのCD18による同時トランスフェクション
を行なった。トランスフェクションの48時間後、COS細
胞を抗CD11a、抗CD11bおよび抗CD11cモノクローナル抗
体またはイソタイプの一致したモノクローナル抗体（対
照）で染色し、次にFITC標識ヒツジ抗マウス抗体で染色
した。10〜15％の細胞は、各モノクローナル抗体で染色
すると、CD11a、ｂ、ｃまたはCD18を発現することが証
明された。CD23−リポソームで染色する前に、CD18陽性
のトランスフェクションしたCOS細胞をFACSソーター解
析をして、β２インテグリンを発現する細胞の割合を増
加させた。次に、CD11a/CD18、CD11b/CD18およびCD11c/
CD18トランスフェクション体を、CD23−リポソーム（ト
レース２）または対照（グリコホリンＡ）−リポソーム
（トレース１）でインキュベートした。CD11bおよびCD1
1cとのCD23の相互作用の特異性は、それぞれ抗CD11b
（トレース４）、抗CD23（トレース５）および抗CD11c
（トレース６）モノクローナル抗体を用いて、CD11b/CD
18およびCD11c/CD18へのCD23−リポソームの阻害により
証明した。CD11a/CD18形質転換体上ではCD23−リポソー
ムの結合は観察されず、抗CD11aモノクローナル抗体の
影響は見られなかった（トレース３）。
実施例８ CD23−CD11b、CD11c相互作用の構造解析（図８を参照） （ａ）糖と２価陽イオンの関与 精製した活性化血液単核細胞を、ツニカマイシン（tu
nicamycin）（10μg/ml）で48時間処理したかまたは処
理せず、ノイラミニダーゼ（0.1単位/ml;いずれもベー
リンガーマンハイム（Boehringer−Mannheim）（マンハ
イム、ドイツ）から得た）で45分間処理した。次に細胞
を、EDTA（5mM;左上のパネル）、Ca2+またはMn2+（１〜
10mM;右上のパネル）の非存在下または存在下で、CD23
−リポソームまたは対照−リポソームでインキュベート
した。
（ｂ）第Ｘ因子は単核細胞へのCD23の結合を阻害する 精製した活性化血液単核細胞を、第Ｘ因子（0.1〜10
単位/ml;シグマ（Sigma））（左下パネル）、フィブリ
ノゲン（50μg/ml;シグマ（Sigma））、精製した組換え
ICAM−１（我々の研究室で作成した）、LPS（１μg/ml;
シグマ（Sigma））、ヒト血清オプソニン化ザイモザン
（１μg/ml;シグマ（Sigma））、IgE（50μg/ml;ザバイ
ンディングサイト（The Binding Site）（バーミンガ
ム、英国））、またはRGDペプチドに対するポリクロー
ナル抗体（1/500、ATCC）（右下パネル）の非存在下ま
たは存在下で、CD23−リポソームとインキュベートし
た。細胞をFACSで解析し、MFIを測定した。実施例６に
ついて阻害割合を計算した。
実施例９ 組換えCD23はCD11bとCD11cに結合することにより、単核
細胞による、a.亜硝酸塩生成物およびb.酸化的バースト
を特異的に増加させる 単核細胞を、組換え可溶性CD23（Graber P.ら、J.Imm
unol.Methods 149,215−226（1992））（50ng/ml）、抗
CD11a（クローン25.3）、抗CD11b（クローン44）、抗CD
11c（クローンBU−15）モノクローナル抗体（すべて10
μg/ml）の非存在下または存在下で、a.37℃で４日間、
b.一晩、インキュベートした。
産生したNO（図9aに示す）を評価するために、培養上
清を、NO、NO2 -およびNO3 -の安定な最終生成物につい
て、Greenら、Annu.Rev.Immunol.2 199−218（1984）に
従って測定した。NO2 -産生のCD23媒介増加の特異性は、
抗CD23モノクローナル抗体（mab25）（10μg/mlで試験
した）のFab断片によるNO2 -産生の阻害により、そして
ニトロアルギニン（Ｎ−Arg、1mM）（シグマ（Sigm
a））による阻害により、証明した。
活性化単核細胞を、ヒドロエチジン（hydroethidin
e）（モレキュラープローブズ（Molecular probes）、
ユージーン（Eugene）、オレゴン州）（0.3μg/ml）と3
7℃で30分間インキュベートし（Rothe G.ら、J.Leukoc.
Biol.47 440−448（1990））、FACSで解析した。刺激し
た単核細胞の赤い蛍光の増加率を、未処理単核細胞と比
較して示す（図9bを参照）。酸化的バーストを受けた単
核細胞は、未処理単核細胞と比較して赤い蛍光シグナル
が増加しており、ヒドロエチジンの臭化エチジウムへの
酸化を反映している（Lacal P.M.ら、Biochem.J.268 70
7−712（1990））。単核細胞単独のMFI値は、159±10で
あった。６回の実験の平均±標準偏差値を示す。単核細
胞の呼吸的バーストを誘導することが知られているConA
を、陽性対照として使用した、CD11bとCD11cとのCD23の
相互作用の特異性を、抗CD11b（クローン44）、抗CD11c
（クローンBU−15）および抗CD23（mAb25）モノクロー
ナル抗体のFab（10μg/mlで試験した）による、H2O2産
生のCD23媒介の増加の阻害により証明した。
実施例10 CD11bとCD11cへのCD23の結合は、単核細胞によるサイト
カイン産生を特異的に増加させる（図10を参照） 単核細胞を、組換え可溶性CD23（Graber P.ら、J.Imm
unol.Methods 149,215−226（1992））（50ng/ml）、抗
CD11a（クローン25.3）、抗CD11b（クローン44）、抗CD
11c（クローンBU−15）、抗CD23（mAb5−この抗体はイ
ムノテック（Immunotech）から入手可能である）の存在
下、または非存在下で、37℃で一晩インキュベートし
た。これはヨーロッパ特許出願EP−Ａ−0269728に記載
されている）モノクローナル抗体、ConA（すべて10μg/
ml）、LPS（1ng/ml）（シグマ（Sigma））またはPMA（5
ng/ml）（カルビオケム（Calbiochem）、ラホイア、カ
リホルニア州）で検討されている。特異的ELISAによ
り、培養物上清中のサイトカインを測定した。このELIS
Aの検出限界は、IL−１βについては0.05ng/ml（Ferrua
ら、J.Immunol.Methods 114 41−48（1988））、TNFα
については0.01ng/ml（Medgenix,Biotechnie,Rungis、
Ｆ）、およびIL−６については＜0.01ng/ml（Manieら、
Eur.Cytokine Netw.4 51−56（1993））である。CD11b
とCD11cとのCD23の相互作用の特異性を、抗CD11b（クロ
ーン４）、抗CD11c（クローンBU−15）および抗CD23（m
Ab25）モノクローナル抗体のFab（10μg/mlで試験し
た）による、サイトカイン産生のCD23媒介の増加の阻害
により証明した。４回の実験の平均±標準偏差値を示
す。
実施例11 可溶性ヒトCD23（25kD）から得られる組換え大腸菌
（E.coli）に対するモノクローナル抗体を、標準法に従
ってマウスで作成したが、脾臓細胞ではなくリンパ節を
使用した。これらは、インビトロでヒトCD23の活性を阻
止した。
実施例12 潰瘍性大腸炎 ３匹のタマリン（tamarin）サルに抗CD23Mabを投与す
ると、副作用はなく、主観的な便のスコアにおいて改善
が見られた。
投与量は４日毎に1mgを筋肉内注射により投与した。
実施例13 ここで報告したいずれの試験でも毒性作用は観察され
なかった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ９５１３４１５．１ (32)優先日 平成７年６月30日(1995．6．30) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） 前置審査 (73)特許権者 397009934 Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｈｏｕ ｓｅ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ａｖｅｎｕｅ Ｇｒｅｅｎｆｏｒｄ，Ｍｉｄｄｌｅｓ ｅｘ ＵＢ６ ０ＮＮ，Ｇｒｅａｔ Ｂ ｒｉｔａｉｎ (72)発明者 バンフォイ、ジーン − イヴ・マーセ ル・ポール スイス国、ジュネーブ、1228 プラン − レ − カテス、カーズ・ポスタル 674、シュマン・デ・オー 14、グラ クソ・ウェルカム・リサーチ・アンド・ ディベロップメント・エス・エー (56)参考文献 Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，1993 年，Ｖｏｌ．23，Ｐ．1739−1742 Ｓｃｉｅｎｃｅ，1993年，Ｖｏｌ. 261，Ｐ．1038−1041 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 39/395 A61K 45/00 ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】CD23に対する結合物質である抗CD23抗体又
    はその断片の、慢性関節リウマチ治療用薬剤の製造のた
    めの使用。
  2. 【請求項２】前記のCD23と、CD21、CD11b又はCD11cとの
    間の相互作用が阻害されることを特徴とする請求項１に
    記載の使用。
  3. 【請求項３】前記の抗体がヒト化又はキメラ化した抗体
    であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の使
    用。
  4. 【請求項４】前記の結合物質が、免疫抑制物質、寛容誘
    導性物質、抗自己免疫物質又は抗炎症物質と組合せられ
    ることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の使
    用。
  5. 【請求項５】前記の結合物質が、抗CD4抗体と組合せら
    れることを特徴とする請求項４に記載の使用。
  6. 【請求項６】少なくとも1mgの単位投薬量の、CD23に対
    する結合物質である抗CD23抗体又はその断片、及び薬剤
    的に許容される担体を含む慢性関節リウマチ治療用薬剤
    組成物。
  7. 【請求項７】１〜1000mgの単位投薬量を含む請求項６に
    記載の薬剤組成物。
  8. 【請求項８】前記の抗体がヒト化又はキメラ化している
    ことを特徴とする請求項６に記載の薬剤組成物。
  9. 【請求項９】前記の結合物質が、免疫抑制物質、寛容誘
    導性物質、抗自己免疫物質又は抗炎症物質と組合せられ
    ることを特徴とする請求項６〜８のいずれかに記載の薬
    剤組成物。
  10. 【請求項１０】前記の結合物質が、抗CD4抗体と組合せ
    られることを特徴とする請求項９に記載の薬剤組成物。
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